細胞培養改良的製作方法

2023-09-13 09:47:10 3

專利名稱：細胞培養改良的製作方法
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背景技術：
重組DNA技術已提供了使得能夠用於包括治療、診斷、農業及研究目的各種應用的量的蛋白質生產方法。
重組蛋白生產的目標之一是優化細胞培養基和條件以獲得最大量的蛋白及最有效的生產方式。任何改良(包括增量改良)均可具有龐大的經濟效益。在醫藥工業中，優化用於疾病治療的生物製品的蛋白質生產是有利的，因為在大規模生產生物製品時任何改良均可具有顯著影響。因此，仍需要最大化來自表達醫藥用生物蛋白的細胞培養的蛋白質生產。
通常，哺乳動物細胞培養基基於市售培養基配方，包括，例如，DMEM或Ham氏F12。通常，培養基配方並未充分富集(enriched)以支持細胞生長及生物蛋白表達的增加。仍需要改良細胞培養基、添加劑及用於改良蛋白生產的細胞培養方法。
發明概述 本發明提供用於改良細胞培養尤其哺乳動物細胞培養中的蛋白表達的方法及組合物。本發明涉及改良細胞培養基，包括用於蛋白表達和細胞生長的培養基和經優化用於蛋白表達的細胞培養生產培養基。
本發明也包括用於在哺乳動物細胞培養中高蛋白表達的最佳化方法和培養基。具體而言，最優化細胞培養基用於在哺乳動物細胞培養物(例如CHO細胞)中表達抗體。也提供通過添加補充溶液(例如含有水解產物的溶液及濃縮基礎培養基溶液)促進蛋白生產的改良補料分批方法及組合物。
本發明提供用於哺乳動物細胞培養中的不含鹽的改良基礎生長培養基。本發明包括包含A部分、B部分及C部分的無血清細胞培養基，其中A部分基本上由排除下列組份的經修飾基礎培養基組成碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；B部分基本上由無機鐵來源組成；且C部分包含重組生長因子、緩衝劑、滲透壓調節劑、能量來源及至少兩種不同的非動物水解產物。
在一個實施方案中，A部分進一步包含非鐵金屬離子、維生素或二者組合。在一個實施方案中，B部分的無機鐵來源為檸檬酸鐵，例如約100-150mg/L或0.1-1mM終溶液濃度的檸檬酸鐵。在另一個實施方案中，B部分的無機鐵來源為檸檬酸鐵，例如約122.5mg/L或0.5mM終溶液濃度的檸檬酸鐵。
在一個實施方案中，C部分的重組生長因子選自胰島素或重組類似物、IGF-1及胰島素與IGF-1的組合，例如約4mg/L至13mg/L胰島素或其重組類似物。
在一個實施方案中，排除於經修飾的基礎培養基之外的緩衝劑為HEPES緩衝劑。
在一個實施方案中，C部分的緩衝劑包含磷酸鹽緩衝劑、HEPES及碳酸氫鈉，例如約0.1至3g/L碳酸氫鈉、約0.1至3g/L HEPES。在一個實施方案中，C部分的緩衝劑包含1.6g/L碳酸氫鈉和/或約1.8g/L HEPES。在一個實施方案中，磷酸鹽緩衝劑包含約0.01至0.5g/L磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉。
在另一個實施方案中，C部分進一步包含天冬醯胺、穀氨醯胺或穀氨醯胺和天冬醯胺。
在一個實施方案中，C部分的滲透壓調節劑為NaCl，例如約1.0至6.5g/L NaCl。
在一個實施方案中，C部分的能量來源為單糖，例如葡萄糖(如D-葡萄糖)、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一個實施方案中，本發明的細胞培養基包含至多約7.0g/L的葡萄糖。
在另一個實施方案中，本發明的細胞培養基包含C部分的至少兩種不同的非動物源水解產物，該類水解產物為植物源水解產物和既非動物源也非植物源的水解產物。可用於本發明的植物源水解產物的實例為大豆源水解產物。既非動物源也非植物源的水解產物的實例為酵母源水解產物。
在一個實施方案中，本發明的細胞培養基進一步包含甲氨喋呤。在一個實施方案中，細胞培養基進一步包含約100nM至5000nM的甲氨喋呤。
在另一個實施方案中，細胞培養基進一步包含細胞保護劑或表面活性劑。可用於本發明細胞培養基的表面活性劑的實例為甲基纖維素或pluronic多元醇，例如Pluronic F-68。在一個實施方案中，細胞培養基包含約0.1-5g/L Pluronic F-68。在一個實施方案中，細胞培養基包含約1.0g/L Pluronic F-68。
在本發明的另一個實施方案中，細胞培養基進一步包含L-穀氨醯胺。
在一個實施方案中，細胞培養基的pH值範圍為7.1至7.3。
在另一個實施方案中，本發明的細胞培養基的滲透壓在約320至450mOsm/kg範圍內。
本發明包括無血清細胞培養基，該培養基包含下列各物質基礎培養基；約8-12ml/kg或116-126mg/L檸檬酸鐵；約2-6mg/kg重組人胰島素；約2-5g/kg無水葡萄糖；約0.1-0.5g/kg L-穀氨醯胺；約1-3g/kg碳酸氫鈉；約0.01-0.05g/kg NaH2PO4·H2O；約0.4-0.5g/kgNa2HPO4·7H2O；及約1.0-3.0g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基包含基礎培養基；約10.0ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；約4.0mg/kg重組人胰島素；約3.5g/kg無水葡萄糖；約0.29g/kgL-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約0.03g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43-0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；及約2.0g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基基本上由下列物質組成基礎培養基；約10.0ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；約4.0mg/kg重組人胰島素；約3.5g/kg無水葡萄糖；約0.29g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約0.03g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43-0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；及約2.0g/kg酵母源水解產物。
本發明進一步提供基本由下列各物質組成的無血清細胞培養基基礎培養基；約8-12ml/kg或116-126mg/L檸檬酸鐵；約2-6mg/kg重組人胰島素；約2-5g/kg無水葡萄糖；約0.1-0.5g/kg L-穀氨醯胺；約1-3g/kg碳酸氫鈉；約0.01-0.05g/kg NaH2PO4·H2O；約0.4-0.5g/kgNa2HPO4·7H2O；及約1.0-3.0g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養物基本上由下列各物質組成基礎培養基；約8-12ml/kg或116-126mg/L檸檬酸鐵；約2-6mg/kg重組人胰島素；約2-5g/kg無水葡萄糖；約0.1-0.5g/kg L-穀氨醯胺；約1-3g/kg碳酸氫鈉；約0.01-0.05g/kg NaH2PO4·H2O；約0.4-0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；及約1.0-3.0g/kg酵母源水解產物。
在一個實施方案中，細胞培養基進一步包含約2.50mL/kg的甲氨喋呤。
本發明也包括一種用於生產蛋白的方法，其包含在本發明的培養基中培養包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；並且將培養物轉移至細胞培養生產培養基中，這樣可生產蛋白。
在一個實施方案中，該蛋白為抗體，包括(例如)D2E7(阿達木單抗)。
本發明進一步提供包含下列各物質的無血清細胞生產培養基排除下列組份的經修飾的基礎培養基；碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.5至0.7g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.5至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.4至0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；約8至12g/kg酵母源水解產物；及約60至70g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基基本由排除下列組份的經修飾基礎培養基組成碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.5至0.7g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.5至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；約0.4至0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；約8至12g/kg酵母源水解產物；及約60至70g/kg植物源水解產物。在另一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含基礎培養基；約10.0ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.4至2.5g/kg NaCl；約1.0g/kg Pluronic F-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；約10.7g/kg酵母源水解產物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
本發明進一步提供包含下列各物質的無血清細胞生產培養基排除下列組份的經修飾的基礎培養基；碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約3至5mL/kg或6至8mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至2g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.1至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.4至0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；約0.4至0.5g/kg L-天冬醯胺一水合物；約2至6g/kg酵母源水解產物；及約2至4g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基基本由下列各物質組成排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約3至5mL/kg或6至8mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至2g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.1至2g/kgPluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.4至0.5g/kgNa2HPO4·7H2O；約0.4至0.5g/kg L-天冬醯胺一水合物；約2至6g/kg酵母源水解產物；及約2至4g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基包含經修飾的基礎培養基；約10.0ml/kg或122.45mg/kg檸檬酸鐵；約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重組人類胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.8至0.9g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.6至2.7g/kgNaCl；約1.0g/kg PluronicF-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kgNa2HPO4·7H2O；約0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；約4.0g/kg酵母源水解產物；及約2.6g/kg植物源水解產物。
本發明也包括包含下列各物質的無血清細胞培養基排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至10ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約3至5mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.8至0.9g/kg L-穀氨醯胺；約0.3至0.5g/kg L-天冬醯胺一水合物；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kgHEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.5至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.1至1.0g/kg Na2HPO4·7H2O；約2至6g/kg酵母源水解產物；及約2至4g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基基本由下列各物質組成排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至10ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約3至5mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.8至0.9g/kg L-穀氨醯胺；約0.3至0.5g/kg L-天冬醯胺一水合物；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.5至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；約0.1至1.0g/kg Na2HPO4·7H2O；約2至6g/kg酵母源水解產物；及約2至4g/kg植物源水解產物。在另一個實施方案中，細胞培養基包含經修飾的基礎培養基；約10ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.87至0.88g/kg L-穀氨醯胺；約0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.67至2.68g/kg NaCl；約1.0g/kg Pluronic F-68；約0.03至0.04g/kgNaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；約4.0g/kg酵母源水解產物；及約2.6g/kg植物源水解產物。
本發明包括包含下列各物質的無血清細胞培養基基礎細胞生長培養基；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約2至6mg/kg重組人胰島素；約150至250g/kg無水葡萄糖；約0.1至0.5g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；及約5至15g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基基本由下列各物質組成基礎細胞生長培養基；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約2至6mg/kg重組人胰島素；約150至250g/kg無水葡萄糖；約0.1至0.5g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；及約5至15g/kg酵母源水解產物。在另一個實施方案中，細胞培養基包含基礎細胞生長培養基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約4mg/kg重組人胰島素；約200g/kg無水葡萄糖；約0.29至0.30g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；及約11g/kg酵母源水解產物。在另一個實施方案中，蛋白為抗體，包括(例如)完全人抗體、抗IL-12抗體，例如ABT-874。
本發明也包括包含下列各物質的無血清細胞培養基基礎細胞生長培養基；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約2至6mg/kg重組人胰島素；約1至3g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；及約1至4g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基基本由下列各物質組成基礎細胞生長培養基；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約2至6mg/kg重組人胰島素；約1至3g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；及約1至4g/kg酵母源水解產物。在另一個實施方案中，細胞培養基包含基礎細胞生長培養基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約4mg/kg重組人胰島素；約1.5g/kg無水葡萄糖；約0.29至0.30g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；及約2g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養基的pH值為約7.10至7.30，滲透壓在約300至340mOSm/kg的範圍內。在另一個實施方案中，細胞培養基包含至少8g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，使用細胞培養在哺乳動物細胞(例如CHO細胞)中生產的蛋白為抗體，包括，例如，抗IL-12抗體或抗EPO-R抗體，例如ABT-874。
本發明進一步提供包含下列各物質的細胞培養基排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約2.5至4.5mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.5至1g/kg L-穀氨醯胺；約0.1至1g/kg L-天冬醯胺一水合物；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kgHEPES；約1至4g/kg NaCl；約0.1至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；約2至6g/kg酵母源水解產物；及約2至6g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，本發明細胞培養基基本由下列各物質組成排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約2.5至4.5mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.5至1g/kg L-穀氨醯胺；約0.1至1g/kg L-天冬醯胺一水合物；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kgHEPES；約1至4g/kg NaCl；約0.1至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；約2至6g/kg酵母源水解產物；及約2至6g/kg植物源水解產物。在另一個實施方案中，細胞培養基包含經修飾的基礎培養基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.87至0.88g/kg L-穀氨醯胺；約0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.67g/kg NaCl；約1.0g/kg Pluronic F-68；約0.03至0.04g/kgNaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；約4.0g/kg酵母源水解產物；及約2.6g/kg植物源水解產物。
本發明也包括包含下列各物質的細胞培養生產培養基經修飾以去除下列組份的經修飾基礎培養基；碳酸氫鈉、HEPES緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kgL-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約1至3g/kg NaCl；約0.5至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；約8至12g/kg酵母源水解產物；及約6至8g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，本發明細胞培養生產培養基基本由下列各物質組成經修飾以去除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、HEPES緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約1至3g/kg NaCl；約0.5至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；約8至12g/kg酵母源水解產物；及約6至8g/kg植物源水解產物。在另一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含經修飾的基礎培養基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.45g/kg NaCl；約1.0g/kg Pluronic F-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；約10.7g/kg酵母源水解產物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
本發明另一方面為包含下列各物質的細胞培養生產培養基排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約1至3g/kg NaCl；約0.1至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；約12至16g/kg酵母源水解產物；及約8至10g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基基本由下列各物質組成排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約1至3g/kg NaCl；約0.1至2g/kg Pluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；約12至16g/kg酵母源水解產物；及約8至10g/kg植物源水解產物。在另一個實施方案中，本發明細胞培養生產培養基包含經修飾的基礎培養基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.45g/kgNaCl；約1.0g/kg Pluronic F-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；約14.2至14.3g/kg酵母源水解產物；及約9.2至9.3g/kg植物源水解產物。
在一個實施方案中，細胞培養基的pH為約6至8。在另一個實施方案中，細胞培養基的pH約7.10至7.20。
在一個實施方案中，細胞培養基的滲透壓約350至450mOsm/kg。在另一個實施方案中，細胞培養基的滲透壓約373至403mOsm/kg。
本發明的細胞培養基可進一步包含甲氨喋呤。在一個實施方案中，細胞培養基進一步包含例如約1-10mL/kg甲氨喋呤。在另一個實施方案中，細胞培養基進一步包含例如約2.50mL/kg甲氨喋呤。
在一個實施方案中，在細胞培養物中表達的蛋白為抗體或其抗原結合片段。在一個實施方案中，該抗體或其抗原結合片段為抗-TNFα抗體或抗-EPO-R抗體。在另一個實施方案中，抗-TNFα抗體或其抗原結合片段為完全人類抗TNFα抗體，包括，例如，完全人類抗-TNFα抗體D2E7(阿達木單抗)。在又另一個實施方案中，該抗體或其抗原結合片段為抗-IL-12或抗-IL-18抗體，包括完全人類抗-IL-12或抗-IL-18抗體。
本發明也包括一種用於生產蛋白(例如抗體或其抗原結合部分)的方法，其包含在本文所呈現的細胞培養基中培養包含編碼蛋白(例如抗體)的核酸的哺乳動物細胞。在一個實施方案中，細胞培養基為細胞培養生產培養基。可使用本發明方法及組合物生產的抗體或其抗原結合片段的實例包括抗IL-18抗體、抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體及抗EPO受體(EPO-R)抗體。
在一個實施方案中，本發明進一步包含從本文所述細胞培養生產培養基中分離蛋白。
在一個實施方案中，本發明的細胞培養基及方法用於培養哺乳動物細胞，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本發明也包括本文所述任何細胞培養基中的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本發明亦提供用於在哺乳動物細胞培養物(例如CHO細胞)中生產蛋白的改良補料分批方法和相關細胞培養基。本發明一方面為生產蛋白的補料分批方法，其包含在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及通過在一時段內向細胞培養物中添加水解產物富集(enrichment)溶液和基礎富集溶液而向哺乳動物細胞饋料，其中水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物；這樣可生產蛋白。
在一個實施方案中，基礎富集溶液包含濃縮基礎培養基。在另一個實施方案中，基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖。在另一個實施方案中，基礎培養基為PF CHO。
在一個實施方案中，水解產物富集溶液包含非衍生自植物或動物的第一水解產物和第二植物源水解產物。在一個實施方案中，非衍生自植物或動物和植物源的水解產物為酵母源水解產物。在一個實施方案中，植物源水解產物為大豆源水解產物。
在一個實施方案中，所生產的蛋白為抗體或其抗原結合部分。可用於本發明的分批補料方法的抗體或其抗原結合部分的實例包括抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體及抗EPO受體(EPO-R)抗體。
本發明包括產生抗TNFα抗體(包括，例如完全人類抗TNFα抗體，如阿達木單抗)的分批補料方法，其包含在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼抗-TNFα抗體的核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；並通過在一時段內向細胞培養物中添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液而向CHO細胞補料，其中基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖，且其中水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物；這樣可生產抗-TNFα抗體。
本發明包括生產抗-TNFα抗體的分批補料方法，其包含在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼抗-TNFα抗體的核酸的CHO細胞，該細胞培養生產培養基包含至少1-5g/L例如2.0g/L的葡萄糖，其中通過按需要向細胞培養生產培養基中添加葡萄糖以維持至少1-5g/L例如2.0g/L的葡萄糖濃度來控制葡萄糖濃度；並且通過在一時段內向細胞培養物中添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液而向CHO細胞補料，其中基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖，且其中水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物；這樣可生產抗-TNFα抗體。
在一個實施方案中，本發明包括進一步回收抗-TNFα抗體。
在又另一個實施方案中，在約32至38℃範圍內(例如35℃)的溫度下培養細胞培養物。
在一個實施方案中，使細胞培養生產培養基的溶氧維持在20-65％之間，例如約30％溶氧。
在一個實施方案中，在整個培養過程中維持細胞培養生產培養基的滲透壓不超過500mOsm。
在一個實施方案中，水解產物富集溶液包含非衍生自植物或動物的第一水解產物及第二植物源水解產物。在另一個實施方案中，非衍生自植物或動物和植物源水解產物的水解產物為酵母源水解產物。在另一個實施方案中，植物源水解產物為大豆源水解產物。在一個實施方案中，水解產物富集溶液基本由下列各物質組成約50至280g/kg，例如250至280g/kg大豆源水解產物及約75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解產物。在一個實施方案中，水解產物富集溶液包含約50至280g/kg，例如250至280g/kg大豆源水解產物及約75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解產物。
在一個實施方案中，基礎培養基為PF CHO。
在一個實施方案中，基礎富集溶液的pH值約9.0至10.5。
在另一個實施方案中，分批補料方法的時段在約9至15天之間或為約12天。
在另一個實施方案中，於該時段中以下各日中至少一日將基礎富集溶液添加至細胞培養生產培養基中第4日、第6日、第9日及第11日。在一個實施方案中，於該時段中第4日、第7日或第4日和第7日將水解產物富集溶液添加至細胞培養生產培養基中。
在另一個實施方案中，分批補料方法進一步包含根據pH值線性斜坡(linear ramp)調節細胞培養生產培養基的pH值，其中該pH值線性斜坡包含自約6.5-8(例如，7.1至7.2之間)的pH值起始且產生約6.5-7.0(例如6.9)的最終pH值。在一個實施方案中，至少在約24小時的時間段內調節pH值線性斜坡。在另一個實施方案中，至少在約48小時的時間段內調節pH值線性斜坡。在另一個實施方案中，在約72小時的時間段內調節pH值線性斜坡。
本發明也包括在分批補料方法中使用本文所述的細胞培養基，例如包含下列各物質的細胞培養生產培養基排除下列組份的經修飾基礎培養基；碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至10ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；約1至3g/kg碳酸氫鈉；約1至3g/kg HEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.1至2g/kgPluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.1至0.1g/kgNa2HPO4·7H2O；約8至12g/kg酵母源水解產物；及約6至8g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含經修飾的基礎培養基；約10.0ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kgL-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.45g/kgNaCl；約1.0g/kg Pluronic F-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；約10.7g/kg酵母源水解產物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
本發明也提供生產抗-IL12抗體(例如完全人類抗-IL12抗體(如ABT-874))的分批補料方法，其包含在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼抗體的核酸的CHO細胞；通過在一時段內向細胞培養物中添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液向CHO細胞補料，其中基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖，且其中水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物；這樣可產生抗-IL12抗體。
在一個實施方案中，水解產物富集溶液進一步包含葡萄糖。
在一個實施方案中，本發明也包括回收抗-IL12抗體。
在一個實施方案中，在約32至38℃範圍內(例如約33℃)的溫度下培養細胞培養物。
在本發明的一個實施方案中，將細胞培養生產培養基的溶氧維持在20-65％之間，例如約40％溶氧。
在另一個實施方案中，細胞培養生產培養基的pH值約6.7至7.2。
在本發明的另一個實施方案中，水解產物富集溶液包含非衍生自植物或動物的水解產物和植物源水解產物。在一個實施方案中，非衍生自植物或動物的水解產物為酵母源水解產物。在另一個實施方案中，植物源水解產物為大豆源水解產物。在另一個實施方案中，水解產物富集溶液基本由下列各物質組成約50至225g/kg，例如150至180g/kg大豆源水解產物、約75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解產物及約1至5g/L，例如2至3g/L葡萄糖。在另一個實施方案中，水解產物富集溶液包含約50至225g/kg，例如150至180g/kg大豆源水解產物、約75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解產物及約1至5g/L，例如2至3g/L葡萄糖。在一個實施方案中，基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖。
在另一個實施方案中，基礎富集溶液的pH值約9.7，滲透壓約1400至1500mOsm。在另一個實施方案中，基礎富集溶液中的基礎培養基為PF CHO。
在一個實施方案中，分批補料方法的時段在14-15天之間。
在一個實施方案中，自該時段的第5日起，每隔一天將基礎富集溶液添加至細胞培養生產培養基中。
在本發明的一個實施方案中，自該時段的第6日起始，每天將基礎富集溶液添加至細胞培養生產培養基中。在另一個實施方案中，自該時段的第5日起始，每天將基礎富集溶液及水解產物富集溶液添加至細胞培養生產培養基中。
本發明也包括在分批補料方法中使用本文所述的細胞培養基，例如包含下列各物質的細胞培養生產培養基排除下列組份的經修飾基礎培養基；碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約5至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；約1至2g/kg碳酸氫鈉；約1至2g/kg HEPES；約2至3g/kg NaCl；約0.1至2g/kgPluronic F-68；約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；約0.1至1g/kgNa2HPO4·7H2O；約6至12g/kg酵母源水解產物；及約6至8g/kg植物源水解產物。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.45g/kg NaCl；約1.0g/kgPluronic F-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kgNa2HPO4·7H2O；約10.7g/kg酵母源水解產物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
在一個實施方案中，本發明以大規模培養細胞方法為特點。在一個實施方案中，大規模細胞培養大於約10L。在另一個實施方案中，大規模細胞培養為約13L。
本發明也提供組合補料溶液，因為這些溶液可在一種溶液中提供養分組合所以是有利的。本發明包括包含下列各物質的組合補料溶液葡萄糖；基礎培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物。本發明也包括基本由下列各物質組成的組合補料溶液葡萄糖；基礎培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物。
在一個實施方案中，補料溶液的pH值約6.0至8.0。
在一個實施方案中，組合補料溶液包含約100至250g/kg葡萄糖。在一個實施方案中，組合補料溶液包含胺基酸天冬醯胺，例如約1.0至15.0g天冬醯胺；或約3.0至5.0g/kg天冬醯胺。
在一個實施方案中，組合補料溶液中的至少兩種不同的非動物源水解產物為植物源水解產物和既非動物源也非植物源的水解產物。在一個實施方案中，非動物源或植物源水解產物為酵母源水解產物。在一個實施方案中，植物源水解產物為大豆源水解產物。
在一個實施方案中，組合補料溶液包含為PF-CHO或DMEM/F12培養基的基礎培養基。在一個實施方案中，基礎細胞培養基為經修飾的基礎培養基且排除以下組份碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑、穀氨醯胺和葡萄糖。
在另一個實施方案中，組合補料溶液進一步具有小於約15NTU的濁度。
本發明以維持細胞培養生產培養基的穩定葡萄糖含量的方法為特點，其包含添加本文所述的組合補料溶液。
本發明的另一方面為製造包含下列各物質的組合補料溶液的方法基礎培養基、葡萄糖及至少兩種不同的非動物源水解產物，其包含將葡萄糖與基礎細胞培養基組合至溶液中；將a)溶液的pH值調節至約9.5至10.5；將至少兩種不同的非動物源水解產物添加至b)溶液中；並調節c)溶液的pH值，這樣組合補料溶液的pH值約6.5至7.5。在一個實施方案中，步驟c)包含添加既非以動物源也非植物源的第一水解產物和第二植物源水解產物。在一個實施方案中，非動物源或植物源水解產物為酵母源水解產物。在另一個實施方案中，植物源水解產物為大豆源水解產物。
本發明進一步提供增加由哺乳動物細胞培養物生產的蛋白(例如抗體或其抗原結合部分)的方法。本發明提供由哺乳動物細胞培養物生產至少約1.5g/L抗體的方法，其包含在細胞培養生產培養基中培養包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及向細胞培養生產培養基中添加pH值約6.7至7.2的組合補料溶液，其中該組合補料溶液包含葡萄糖、基礎細胞培養基、除穀氨醯胺以外的胺基酸及至少兩種不同的非動物源水解產物，這樣可生產至少約1.5g/L抗體。在一個實施方案中，生產至少2g/L抗體。在另一個實施方案中，生產至少4g/L抗體。在另一個實施方案中，生產至少5g/L抗體。在另一個實施方案中，本發明提供用於產生約6g/L抗體的方法。
在一個實施方案中，組合補料溶液包含約100至250g/kg葡萄糖。
本發明也提供用於增加哺乳動物細胞培養物所生產抗體的滴度的方法，其包含在細胞培養生產培養基中培養包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及向細胞培養生產培養基中添加pH值約6.7至7.2的組合補料溶液，其中該組合補料溶液包含葡萄糖、基礎細胞培養基、除穀氨醯胺以外的胺基酸及至少兩種不同的非動物源水解產物；這樣所產生抗體的滴度比根據步驟a)且排除步驟b)培養的對照哺乳動物細胞培養物高至少50％。在一個實施方案中，所生產的抗體滴度比對照物高至少100％。在另一個實施方案中，所生產的抗體滴度比對照物高至少150％。
在一個實施方案中，當細胞密度達到每毫升至少2.0×106個細胞時添加組合補料溶液。在一個實施方案中，當細胞密度達到每毫升約3.5×106個細胞時添加組合補料溶液。
本發明進一步提供在哺乳動物細胞培養物中生產蛋白(例如抗體或其抗原結合部分)的方法，其包含在細胞培養生產培養基中培養包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及使用反饋控制系統來監控細胞培養生產培養基中的代謝指示劑水平，藉此將組合補料溶液添加至細胞培養生產培養基中，其中在該反饋控制系統所測定的時間點將組合補料溶液添加至細胞培養生產培養基中，這樣以生產抗體。在一個實施方案中，代謝指示劑為葡萄糖或穀氨醯胺。在另一個實施方案中，補料溶液為包含下列各物質的組合補料溶液葡萄糖；基礎細胞培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物。在一個實施方案中，抗體為抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體及抗-EPO受體(EPO-R)抗體。
在一個實施方案中，使用本發明方法生產至少1.5g/L滴度的抗體。在另一個實施方案中，生產至少2g/L的滴度。
在本發明的一個實施方案中，組合補料溶液包含約3.0至12.5g/kg天冬醯胺。
在本發明的一個實施方案中，組合補料溶液包含約100至200g/kg葡萄糖。
在另一個實施方案中，本發明進一步包含監控細胞培養基中的葡萄糖含量，使得葡萄糖水平維持於約0.25與20.0g/L之間。在一個實施方案中，使用自動取樣裝置監控葡萄糖水平。
在一個實施方案中，使用本文公開的方法和組合物生產的抗體或其抗原結合部分選自抗-TNFα抗體、抗-IL-18抗體、抗-EPO-R抗體及抗IL-12抗體。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合部分為完全人類抗體。在一個實施方案中，抗-TNFα抗體為D2E7(阿達木單抗)。在一個實施方案中，抗IL-18抗體為ABT-325。在一個實施方案中，抗IL-12抗體為ABT-874。
本發明也提供測定在哺乳動物細胞培養物中生產蛋白的補料曲線的方法，其包含在細胞培養生產培養基中培養包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及使用反饋控制系統監控細胞培養生產培養基中的代謝指示劑，藉此將組合補料溶液添加至細胞培養生產培養基中，其中將組合補料溶液添加至細胞培養生產培養基中以達到目標代謝指示劑設定點；及測定每天添加至細胞培養生產培養基中的組合補料溶液的量，這樣以測定補料曲線。
在一個實施方案中，代謝指示劑為葡萄糖或穀氨醯胺。
本發明也包括在哺乳動物細胞培養物中生產蛋白的分批補料方法，其包含根據使用本發明方法測定的補料曲線將組合補料溶液添加至哺乳動物細胞培養物中。
本發明的另一方面為包括丁酸鈉和/或N-乙醯半胱氨酸的改良細胞培養基。本發明以在哺乳動物細胞培養物中生產抗體使得抗體滴度為至少300mg/L的方法為特點，該方法包含在細胞培養生產培養基中培養包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；向細胞培養基中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合，其中添加丁酸鈉至終濃度約0.1mM至10mM且添加N-半胱氨酸至終濃度約1mM至80mM；這樣以生產至少300mg/L滴度的抗體。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約100mg/L。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約200mg/L。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約250mg/L。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約300mg/L。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約400mg/L。
本發明也提供在哺乳動物細胞培養物中生產抗體，使得抗體滴度至少比對照哺乳動物細胞培養物高10％的方法，該方法包含a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及b)向細胞培養基中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合，其中添加丁酸鈉至終濃度約0.1mM至10mM且添加N-乙醯半胱氨酸終濃度至約1mM至80mM，使得抗體滴度至少比對照物高10％，其中對照哺乳動物細胞培養包含步驟a)且排除步驟b)。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養物改良至少29％。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養物改良至少40％。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養物改良至少70％。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養物高至少90％。
在一個實施方案中，在哺乳動物細胞培養物的生長期向哺乳動物細胞培養物中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合。
在一個實施方案中，在培養時間的第4天與第7天之間向哺乳動物細胞培養物中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合。
在一個實施方案中，在培養時間的第0天向哺乳動物細胞培養物中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合。
在另一個實施方案中，丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至10mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至8.0mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至3.0mM丁酸鈉。
在一個實施方案中，N-乙醯半胱氨酸的終濃度為約20mM至60mM。在一個實施方案中，N-乙醯半胱氨酸的終濃度為約10mM。在一個實施方案中，N-乙醯半胱氨酸的終濃度為約8mM。
本發明進一步提供與對照哺乳動物細胞培養物相比使哺乳動物細胞培養物的壽命延長至少35％的方法，該方法包含a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及b)將約1mM至80mM N-乙醯半胱氨酸添加至細胞培養基中，使得哺乳動物細胞培養物的壽命與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少35％，其中對照哺乳動物細胞培養包含步驟a)且排除步驟b)。
在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的壽命與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少約45％。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的壽命與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少約55％。
在一個實施方案中，本發明方法包含將終濃度為約8mM的N-乙醯半胱氨酸添加至細胞培養生產培養基中。
在一個實施方案中，抗體或其抗原結合部分選自抗-TNFα抗體、抗-IL-18抗體(例如ABT-325)及抗IL-12抗體。
本發明提供包含A部分、B部分及C部分的無血清細胞培養基，其中A部分基本由排除下列組份的經修飾基礎培養基組成碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；B部分基本由無機鐵來源組成；且C部分包含重組生長因子、緩衝劑、滲透壓調節劑、能量來源及至少兩種不同的非動物水解產物。在一個實施方案中，C部分基本由下列各物質組成重組生長因子；緩衝劑；滲透壓調節劑；能量來源；及至少兩種不同的非動物水解產物。
本發明也提供包含下列各物質的無血清細胞培養生產培養基維生素含量降低且排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.45g/kg NaCl；約1.0g/kg Pluronic F-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；約10.7g/kg酵母源水解產物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
本發明也提供包含下列各物質的無血清細胞培養基維生素含量降低且排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約150g/kg無水葡萄糖；約5.0g/kg L-天冬醯胺一水合物；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約65g/kg酵母源水解產物；及約41g/kg植物源水解產物。
本發明進一步提供包含下列各物質的無血清細胞培養基維生素含量降低且排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約200g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kg HEPES；約2.45g/kg NaCl；約1.0g/kgPluronic F-68；約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；約0.43至0.44g/kgNa2HPO4·7H2O；約10.7g/kg酵母源水解產物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
本發明也提供改良培養基的以下實施方案。本發明包括用於培養CHO細胞以表達重組生物製品的改良培養基，其包含A、B和C部分，其中A部分包含水、胺基酸、維生素及其他輔因子；B部分包含無機鐵來源；且C部分包含重組生長因子、緩衝劑、滲透壓調節劑、能量來源、非鐵金屬離子、水解產物及附加試劑。
在一個實施方案中，C部分包含碳酸氫鈉、HEPES、磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉、氯化鈉、Pluronic F-68及葡萄糖。在另一個實施方案中，添加1.5g/L碳酸氫鈉。在另一個實施方案中，添加1.8g/L HEPES。在另一個實施方案中，添加0.1-0.5g/L磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉。在另一個實施方案中，添加1g/L至6.5g/L氯化鈉。在另一個實施方案中，添加1.0g/L Pluronic F-68。在一個實施方案中，添加1g/L至7g/L葡萄糖。在一個實施方案中，維生素選自PABA(對氨基苯甲酸)、生物素、D-Ca泛酸鹽(維生素B5)、葉酸、內消旋肌醇、煙醯胺、Pyrodoxine(維生素B6)、核黃素(維生素B2)、硫胺素(維生素B1)和氰鈷胺(Cyanocobalamin)(維生素B12)。在另一個實施方案中，其他輔因子選自脂因子、醇胺、胺基酸和肽。在另一個實施方案中，脂因子選自氯化膽鹼及磷脂醯膽鹼。在另一個實施方案中，醇胺為乙醇胺。在一個實施方案中，胺基酸選自天冬醯胺、穀氨醯胺及腐胺。
在一個實施方案中，肽為穀胱甘肽。在一個實施方案中，添加0.4mg/L至1.65mg/L穀胱甘肽。
在另一個實施方案中，B部分的無機鐵來源為檸檬酸鐵。在一個實施方案中，添加10mL/L或122mg/L檸檬酸鐵。在另一個實施方案中，使檸檬酸鐵保持122mg/L的濃度。在一個實施方案中，重組生長因子為胰島素或重組類似物、IGF-1或胰島素與IGF-1的組合。在一個實施方案中，添加4mg/L至13mg/L胰島素或重組類似物。在另一個實施方案中，添加25ng/L至150ng/L IGF-1。在另一個實施方案中，添加50ng/L至100ng/L IGF-1。在另一個實施方案中，將25ng/L至150ng/L IGF-1添加至胰島素中。在一個實施方案中，將50ng/L至100ng/L IGF-1添加至胰島素中。
在另一個實施方案中，滲透壓調節劑選自NaCl、KCl、KNO3。在一個實施方案中，添加0g/L至10g/L滲透壓調節劑。在另一個實施方案中，添加0g/L至6.5g/L滲透壓調節劑。
在另一個實施方案中，能量來源為單糖，例如葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麥芽糖、甘露糖、半乳糖及果糖。在一個實施方案中，添加1.0g/L至7.0g/L葡萄糖。在另一個實施方案中，添加1.5g/L至5.0g/L葡萄糖。
在另一個實施方案中，以氯化物和硫酸鹽的形式添加非鐵金屬離子。在一個實施方案中，非鐵金屬離子選自鉀、鎂、銅、硒、鋅、鎳、錳、錫、鎘、鉬酸鹽、釩酸鹽及矽酸鹽。在一個實施方案中，緩衝劑選自碳酸鹽、氯化物、硫酸鹽和磷酸鹽。在一個實施方案中，緩衝劑選自NaHCO3、CaCl2、MGSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、C3H3O3Na和稱作HEPES的N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸]。
在本發明的一個實施方案中，添加至培養基中的附加試劑之一為甲氨喋呤。在一個實施方案中，甲氨喋呤用於使表達抗-IL-18、抗-IL-12、抗-TNFα(例如完全人類抗-TNFα)或抗EPO-R抗體的CHO細胞的生長。在一個實施方案中，添加100mM至5000nM。在一個實施方案中，向培養基中添加500nM甲氨喋呤。在一個實施方案中，添加100nM甲氨喋呤。在一個實施方案中，添加5000nM甲氨喋呤。
在本發明的另一個實施方案中，附加試劑之一為細胞保護劑，例如甲基纖維素或pluronic多元醇(例如Pluronic F-68)。在一個實施方案中，添加0.5g/L至1.0g/L甲基纖維素。在一個實施方案中，添加0.5g/L至1.0g/L Pluronic F-68。在一個實施方案中，添加0.7g/L至1.2g/L Pluronic F-68。
在另一個實施方案中，將A部分的pH增加至最大pH值10。在一個實施方案中，在添加水解產物之後將A部分的pH降低至最小值7.0。
本發明也提供用於表達完全人類抗-TNFα抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10.0ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；2mL/kg或4.0mg/kg重組人胰島素；3.5g/kg無水葡萄糖；0.292g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；0.031g/kg NaH2PO4·H2O；0.436g/kgNa2HPO4·7H2O；2.0g/kg水解產物；及2.50mL/kg甲氨喋呤。
本發明也提供用於表達完全人類抗-TNF-α抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10.0ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；7.0g/kg無水葡萄糖；0.584g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kg HEPES；2.45g/kg NaCl；1.0g/kg PluronicF-68；0.031g/kg NaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；10.7g/kg水解產物；6.92g/kg植物蛋白腖(Phytone peptone)；及2.50mL/kg甲氨喋呤。
本發明也包括用於表達完全人類抗-TNF-α抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；3.88mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；7.0g/kg無水葡萄糖；0.876g/kg L-穀氨醯胺；0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kgHEPES；2.67g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kgNaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；10.7g/kg水解產物；6.92g/kg植物蛋白腖；及2.50mL/kg甲氨喋呤。
本發明進一步提供用於表達完全人類抗-TNF-α抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；3.88mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；7.0g/kg無水葡萄糖；0.876g/kg L-穀氨醯胺；0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；1.6g/kg碳酸氫鈉；1g/kgHEPES；2.67g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kgNaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；4.0g/kg水解產物；2.6g/kg植物蛋白腖；及2.50mL/kg甲氨喋呤。
本發明的另一方面為用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；3.88mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；7.0g/kg無水葡萄糖；0.876g/kg L-穀氨醯胺；0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kg HEPES；2.675g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kg NaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；4.0g/kg酵母源水解產物；2.579g/kg植物蛋白腖；及2.50mL/kg甲氨喋呤。
本發明提供用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；7.0g/kg無水葡萄糖；0.584g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kg HEPES；2.45g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kg NaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；10.7g/kg酵母水解產物；及6.92g/kg植物蛋白腖。
本發明提供用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含150.0g/kg無水葡萄糖；5.0g/kg L-天冬醯胺一水合物；65.0g/kg酵母水解產物；及41.0g/kg植物蛋白腖。
本發明也提供用於表達抗-IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；200.0g/kg無水葡萄糖；0.584g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kg HEPES；2.45g/kg NaCl；1.0ml/kg Pluronic F-68；0.031g/kg NaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；10.7g/kg酵母水解產物；及6.92g/kg植物蛋白腖。
本發明包括用於表達抗-IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；2mL/kg或4mg/kg重組人胰島素；3.5+1.5g/kg無水葡萄糖；0.292g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；2g/kg酵母水解產物；及0.25mL/kg甲氨喋呤。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；2mL/kg或4mg/kg重組人胰島素；3.5+1.5g/kg無水葡萄糖；0.292g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；11g/kg酵母水解產物；及0.250mL/kg甲氨喋呤。
本發明包括用於表達抗-IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；2mL/kg或4mg/kg重組人胰島素；200g/l無水葡萄糖；0.292g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；8g/kg酵母水解產物；及0.250mL/kg甲氨喋呤。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；3.88mL/kg或7.76mg/L重組人胰島素；7.0g/l無水右旋糖；0.876g/L L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/L HEPES；2.67g/L NaCl；1.0g/L Pluronic；0.031g/LNaH2PO4·H2O；0.436g/L Na2HPO4·7H2O；4.0g/L酵母粉(yeastolate)；2.579g/L植物蛋白腖；0.05mL/kg甲氨喋呤；3.5mL/L 2N NaOH；及2.91g/L 2N HCl；其產生7.10至7.20的終pH值及373至403mOsmo/kg的終滲透壓。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；13mg/L重組人胰島素；7.0g/l無水右旋糖；0.584g/L L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/LHEPES；2.45g/L NaCl；1.0g/L Pluronic；0.031g/L NaH2PO4·H2O；0.436g/L Na2HPO4·7H2O；10.7g/L酵母粉；6.92g/L植物蛋白腖；0.05mL/kg甲氨喋呤；5.67mL/L 2N NaOH；及2.5g/L 2N HCl；其產生7.10至7.20的終pH值和373至403mOsmo/kg的終滲透壓。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；4mg/kg重組人胰島素；1.5g/kg無水右旋糖；0.292g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；2.0g/L酵母粉；及0.25mL/kg甲氨喋呤；其產生7.10至7.30的終pH值和300至340mOsmo/kg的終滲透壓。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；13mg/kg重組人胰島素；7.0g/kg無水右旋糖；0.584g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kg HEPES；2.45g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kgNaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；10.7g/L酵母粉；及6.92g/kg植物蛋白腖；5.67mL/kg NaOH；及2.5mL/kg HCl；其產生7.10至7.20的終pH值和373至403mOsmo/kg的終滲透壓。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；7.76mg/kg重組人胰島素；7.0g/l無水右旋糖；0.876g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kgHEPES；2.67g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kgNaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；4.0g/L酵母粉；及2.579g/L植物蛋白腖；0.05mL/L甲氨喋呤；3.5mL/kg NaOH；及2.91mL/kgHCl；其產生7.10至7.20的終pH值和373至403mOsmo/kg的終滲透壓。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；13mg/kg重組人胰島素；7.0g/l無水右旋糖；0.584g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kgHEPES；2.45g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kgNaH2PO4·H2O；0.436g/kg Na2HPO4·7H2O；10.7g/L酵母粉；及6.92g/L植物蛋白腖；0.05mL/L甲氨喋呤；5.67mL/kg NaOH；及2.5mL/kgHCl；其產生7.10至7.20的終pH值和373至403mOsmo/kg的終滲透壓。
本發明包括用於表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養基，其包含10ml/kg或122mg/kg檸檬酸鐵；13mg/kg重組人胰島素；7.0g/l無水右旋糖；0.584g/kg L-穀氨醯胺；1.6g/kg碳酸氫鈉；1.8g/kgHEPES；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kg NaH2PO4·H2O；0.436g/kgNa2HPO4·7H2O；14.27g/L酵母粉；9.23g/L植物蛋白腖；0.05mL/L甲氨喋呤；8.95mL/kg NaOH；及4.1mL/kg HCl；其產生7.10至7.20的終pH值及373至403mOsmo/kg的終滲透壓。
本發明也提供通過增加終滴度增加CHO細胞系生產IgG1抗體的生產率的方法，其包含添加丁酸鈉；及添加N-乙醯半胱氨酸。在一個實施方案中，IgG1抗體為抗-IL-18。在一個實施方案中，通過終滴度的增加測量生產率的增加。在一個實施方案中，通過添加0.1mM至10mM濃度的丁酸鈉達到終滴度的增加。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.1mM至8.0mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.1mM至3.0mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.125mM至2.0mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.125mM。在一個實施方案中，終滴度增加10-80％。在一個實施方案中，終滴度增加20-60％。在一個實施方案中，終滴度增加35-55％。在一個實施方案中，終滴度增加40％。在一個實施方案中，通過添加0.1mM至10mM濃度的N-乙醯半胱氨酸達到改良的細胞培養物壽命。在一個實施方案中，細胞培養物壽命增加5-50％。
本發明也提供通過增加終滴度增加CHO細胞系生產IgG1抗體的生產率的細胞培養基，其包含SR-371；和丁酸鈉。在一個實施方案中，IgG1抗體為抗-IL-18。在一個實施方案中，通過增加10-80％的終抗-IL-18滴度測量生產率增加。在一個實施方案中，通過增加20-60％的終抗-IL-18滴度測量生產率增加。在一個實施方案中，通過增加35-55％的終抗-IL-18滴度測量生產率增加。在一個實施方案中，通過增加40％的最終抗-IL-18滴度測量生產率增加。在一個實施方案中，所添加的丁酸鈉濃度為0.125mM至8.0mM。在一個實施方案中，所添加丁酸鈉的濃度為0.2mM至3.0mM。在一個實施方案中，所添加丁酸鈉的濃度為0.3mM至2.0mM。在一個實施方案中，所添加丁酸鈉的濃度為0.125mM。在一個實施方案中，所添加N-乙醯半胱氨酸的濃度為0mM至10mM。在一個實施方案中，所添加N-乙醯半胱氨酸的濃度為5mM至10mM。在一個實施方案中，平均終滴度增加5-50％。在一個實施方案中，平均終滴度增加15-35％。在一個實施方案中，平均終滴度增加25-35％。
附圖簡述

圖1圖解描述了作為接種活細胞密度的函數的ABT-874生長滴度。第15日的滴度結果與補料活細胞密度強烈相關。對以上數據的多項式擬合(polynominal fit)表明最佳補料密度約為每毫升3.5×106個細胞。過程參數為pH＝6.9；T＝35℃；DO＝40％；4X培養基中的接種比率為1∶5或1∶4；在特定密度下以初始體積1％開始補料歷時10天。
發明詳述 I.定義 儘管本申請案中所使用的術語為本領域的標準術語，但本文中提供某些術語的定義以確保申請專利範圍含義的清晰性和確定性。
如本文所使用，術語″抗體″意指包含由四條多肽鏈組成的免疫球蛋白分子，其中兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈以雙硫鍵互聯。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域組成，CH1、CH2和CH3。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。可將VH及VL區進一步細分為高變區(稱作互補決定區(CDR))，其與稱作骨架區(FR)的更保守區域散布。各VH和VL由三個CDR和四個FR組成，其按照以下次序自氨基端至羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可使用本發明方法及組合物生產的抗體實例包括腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(也稱作抗-TNFα抗體)、白介素(IL)-12抗體(也稱作抗-IL-12抗體)、白介素(IL)-18抗體(也稱作抗-IL 18抗體)和EPO/R抗體(本文中一稱作抗-EPO/R抗體)。可使用本發明生產TNFα抗體更詳細地描述於美國專利第6090382號、第6258562號和第6509015號中，其各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明也可用於生產抗體片段。如本文所用，術語抗體的″抗原結合部分″或「抗原結合片段」(或簡單地″抗體部分″)指保留了與抗原(例如hTNFα)結合的能力和特異性的抗體的一個或多個片段。已顯示全長抗體片段可執行抗體的抗原結合功能。術語抗體的″抗原結合部分″涵蓋的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在鉸鏈區由雙硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，其由VH或VL結構域組成；(vi)分離的互補決定區(CDR)；及(vii)雙重可變結構域(DVD)抗體。此外，儘管Fv片段的兩個結構域(VL和VH)由分離基因編碼，但可使用重組方法通過合成接頭使它們接合，該合成接頭使其能夠成為單一蛋白鏈，其中VL與VH區配對以形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird等，(1988)Science 242423-426；及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。該等單鏈抗體也涵蓋於術語抗體的″抗原結合部分″中。也涵蓋其他形式的單鏈抗體，例如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL結構域表達於單一多肽鏈上，但使用因過短而不允許兩個結構域在同一個鏈上配對的接頭，藉此迫使該等結構域與另一條鏈的互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448；Poljak等，(1994)Structure 21121-1123)。可通過本發明方法生產的抗體部分的實例更詳細地描述於美國專利第6090382號、第6258562號、第6509015號，其各自以全文引用的方式併入本文。使用本發明方法及組合物生產的抗體片段或部分也包括於本發明範疇內。
如本文所用，術語″重組人抗體″意欲包括通過重組方式製備、表述、生產或分離的所有人抗體，例如使用轉染至宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體；自重組、組合人類抗體庫(下文進一步描述)分離的抗體；自轉移了人類免疫球蛋白基因的動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor等，(1992)Nucl.Acids Res.206287)；或通過涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式製備、表達、生產或分離的抗體。該等重組人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變和恆定區。然而，在某些實施方案中，體外誘變該等重組人類抗體(或當使用轉移了人類Ig序列的動物時，體內體細胞誘變)且因此，重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列為儘管衍生自人類生殖系VH和VL序列且與其相關，但可能並非天然存在於體內人類抗體生殖系譜系中的序列。
如本文所用，″經分離抗體″意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如特異性結合至hTNFα的經分離抗體基本上不含特異性結合除hTNFα以外的抗原的抗體)。然而，特異性結合hTNFα的經分離抗體可與其他抗原(例如來自其他物種的TNFα分子)具有交叉反應性。此外，經分離抗體可基本上不含其他細胞材料和/或化學物質。
術語″基礎培養基″指能夠支撐細胞生長的任何培養基。基礎培養基供應標準無機鹽，例如鋅、鐵、鎂、鈣和鉀，以及痕量元素、維生素、能量來源、緩衝劑系統和必需胺基酸。基礎培養基的實例包括但不限於達氏經修飾伊氏培養基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(DMEM)、DME/F12、極限必需培養基(MEM)、基礎培養基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-極限必需培養基(α-MEM)、Glasgow氏極限必需培養基(G-MEM)、PF CHO(SAFC Biosciences)和Iscove氏經修飾杜氏培養基。
如本文所使用，術語″經修飾基礎培養基″指排除、減低或增加至少一種標準成份、組份或養分(即本領域已知的經典配方基礎培養基中發現的至少一種成份、組份或養分)的基礎培養基。如″經修飾基礎培養基″的上下文中所用的術語″經修飾″也可指基礎培養基內個別組份之間比例的變化。在本發明的優選實施方案中，經修飾基礎培養基排除至少一種以下組份碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸鈉(磷酸二氫鈉及/或磷酸氫二鈉)、滲透壓調節劑、表面活性劑和葡萄糖，例如單糖葡萄糖。
如本文所使用，術語″細胞培養基″、″培養基″和″培養基配方″指使細胞在多細胞生物體或組織外部的人造體外環境中維持、生長、繁殖或擴增的營養溶液。可優化細胞培養基以用於特定細胞培養用途，該細胞培養基包括，例如，經配製以促進細胞生長的細胞培養生長培養基或經配製以促進重組蛋白生產的細胞培養生產培養基。術語養分、成份和組份可於本文中互換使用，指構成細胞培養基的組成成分。
如本文所使用，術語″細胞培養生產培養基″或″生產培養基″指經設計用於細胞培養物生產期的細胞培養基。在優選的實施方案中，生產培養基經設計用於生產期中的重組蛋白表達。本文(包括實施例部分的表2-7)提供生產培養基的實例。
如本文所使用，術語″分批補料細胞培養″和″分批補料培養″指起初向培養容器中供應細胞(優選哺乳動物動物)和培養基並在培養期間連續或以離散增量向培養物中補入附加培養養分，在培養終止前具有或不具有周期細胞和/或產物收集的細胞培養。
″分批補料方法″指向分批補料細胞培養物中供應附加養分的方法。舉例而言，分批補料方法可包含根據預定補料程序在給定時段內添加補充培養基。
如本文所使用，術語″補料″指接種後向培養物中進行的任何物質的任何添加。補料可為一或多次添加。
如本文所使用，術語″補料溶液″、″補料培養基″和″補入培養基″指含有在接種後某時起始向培養物中添加的一種或多種養分的培養基。在一個實施方案中，補料溶液為包含下列各物質的組合補料基礎培養基和至少一種水解產物，例如大豆源水解產物、酵母源水解產物或兩種類型水解產物的組合。在本發明的另一個實施方案中，補料溶液可僅包括基礎培養基，例如濃縮基礎培養基，或可僅包括水解產物或濃縮水解產物。
如本文所使用，術語″反饋控制系統″指監控給定參數的方法，藉此添加附加試劑或進行細胞培養物的環境修飾以滿足所需參數設定點。在一個實施方案中，所給定參數為哺乳動物細胞培養物的葡萄糖含量，藉此使用葡萄糖含量來確定應於何時將補料溶液(例如組合補料溶液)添加至細胞培養物中。可使用反饋控制系統維持使哺乳動物細胞培養物中蛋白生產最佳化所需要的營養組份。
如本文所使用，術語″補料曲線″指以補料溶液(例如組合補料溶液)補充哺乳動物細胞培養物的時間表。優選使用反饋控制系統產生補料曲線。
可使用″基因工程″方法(例如用重組病毒進行病毒感染、轉染、轉化或電穿孔)使細胞經″基因工程設計″以在將允許表達多肽的重組核酸序列導入細胞時表達特定多肽或蛋白。參見，例如Kaufman等，(1990)，Meth.Enzymol.185487-511；Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等編輯(Wiley & Sons，New York，1988，且每季更新)。用於表達相關蛋白的基因工程細胞和/或細胞系的方法和載體為本領域技術人員熟知。基因工程技術包括但不限於表達載體、靶向同源重組和基因活化(參見，例如Chappel，美國專利第5272071號)以及通過基因工程轉錄因子進行的轉錄活化(參見，例如Segal等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(6)2758-63)。多肽任選在異源控制元件(例如天然狀態不引導該多肽生產的啟動子)控制下表達。舉例而言，啟動子可為引導哺乳動物多肽表達的強病毒啟動子(例如CMV，SV40)。宿主細胞可或不可正常生產該多肽。舉例而言，宿主細胞可為經基因工程設計以生產人類多肽的CHO細胞，意指已將編碼人類多肽的核酸導入CHO細胞中。
或者，宿主細胞可為經基因工程設計以生產水平增加的通常僅以極低含量存在的人類多肽(例如通過用強病毒啟動子替代內源性啟動子)的人類細胞。
如本文所使用，″生長期″指經培養細胞快速分裂並且數量增加的時段。在生長期中，一般可在培養基中和經設計以使細胞增殖最大化的條件下培養細胞。
術語″水解產物″包括任何酶消化物，尤其是通過用至少一種能夠使物質組份分解為簡單形式(例如分解為包含單糖或雙糖和/或單肽、二肽或三肽的製劑)的酶處理待萃取物質(例如植物組份或酵母細胞)而製備的特定類型的萃取物。″水解產物″可進一步被酶消化，例如木瓜酶，和/或由自體分解、熱解和/或胞漿溶解形成。在本發明的優選實施方案中，水解產物並非由動物來源製備，即非動物源。優選的非動物源水解產物實例包括植物源水解產物，例如大豆源水解產物，及既非衍生自植物也非衍生自動物來源的水解產物，例如酵母源水解產物。
術語″水解產物富集溶液″和″水解產物富集培養基″指含有水解產物或水解產物組合(即自不同來源萃取的水解產物)作為添加至細胞培養物中的主要成份的培養基。例如，可將水解產物富集溶液添加至細胞培養物中以增強蛋白生產。類似地，術語″基礎富集溶液″和″基礎富集培養基″指含有基礎培養基(或基礎培養基組合)作為主要成份的培養基。在一個實施方案中，將水解產物富集溶液或基礎富集溶液或兩種富集溶液的組合添加至細胞培養物中以增加細胞培養物在蛋白生產中的生產率。
如果在含有附加試劑或改變的蛋白生產工藝參數的培養物中生產的多肽量超過在不含有附加試劑或改變的蛋白生產工藝參數的相同培養物中生產的多肽量，則通過添加附加試劑或改變蛋白生產工藝的參數″增加″了蛋白生產。改變蛋白生產工藝的實例包括但不限於添加培養基添加劑，增加補充培養基的量，變化培養溫度及細胞培養的氧濃度。可使用補充溶液(例如補料溶液)向細胞培養物提供附加試劑。
術語″成份″指任何可用於細胞培養基中以維持或促進細胞增殖增長的化合物(無論其為化學來源或生物來源)。術語″組份″、″養分″及″成份″可交替使用且均意指該類化合物。用於細胞培養基的典型成份包括胺基酸、鹽、金屬、糖、脂質、核酸、激素、維生素、脂肪酸、蛋白及其類似物。促進或維持細胞離體培養的其他成份可由本領域技術人員在本發明範疇內根據特定需要加以選擇。
如本文所使用，術語″接種″指向培養基中添加細胞以起始培養。
″生產期″指細胞生產最大量的重組多肽或蛋白的時段。生產期的特徵在於細胞分裂少於生長期中的細胞分裂，且也包括使用經設計以使多肽生產最大化的培養基和培養條件。
″重組多肽″或″重組蛋白″為由基因工程方法生產的多肽或蛋白。在優選的實施方案中，通過在細胞培養物中培養表達該類蛋白的細胞獲得重組蛋白。
″過渡期″意指″生長期″與″生產期″之間的細胞培養時段。在過渡期中，可將培養基和環境條件由經設計以使增殖最大化的培養基和條件轉變為經設計以使多肽生產最大化的培養基和條件。
本發明提供通過哺乳動物(例如中國倉鼠卵巢(CHO))細胞培養物生產蛋白(優選重組蛋白，例如抗體)的新穎組合物和方法。本文所述的細胞培養基及方法已用於重組蛋白生產，尤其是重組(完全人類、人源化或嵌合)單克隆抗體的生產。培養基和方法已經多種抗體產品修飾以併入可增加哺乳動物(例如CHO)細胞的生長和生產率的各種改良和進步。下文詳細提供本發明的改良組合物和方法的各方面。
II.所關注蛋白 一般而言，本發明方法和組合物適用於生產重組蛋白。重組蛋白為通過基因工程方法生產的蛋白。根據本發明方法和組合物生產的尤其優選蛋白為以蛋白為主的治療劑，也稱作生物製品。優選地，該蛋白作為細胞外產物分泌。
可使用本發明方法和組合物生產的蛋白包括但不限於抗體或其片段。可通過本領域中已知的許多技術來操做編碼免疫球蛋白分子的DNA以產生能夠編碼重組蛋白(例如單鏈抗體、親和力增強的抗體或其他以抗體為主的多肽)的DNA(參見，例如Larrick等，1989，Biotechnology 7934-938；Reichmann等，1988，Nature 332323-327；Roberts等，1987，Nature 328731-734；Verhoeyen等，1988，Science2391534-1536；Chaudhary等，1989，Nature 339394-397，均以參考形式並於本文)。生產完全人類抗體(例如使用轉殖基因動物製備，且任選在活體外進一步修飾者)以及人源化抗體的重組細胞也可用於本發明。術語人源化抗體也涵蓋單鏈抗體。參見，例如Cabilly等，美國專利第4816567號；Cabilly等，歐洲專利第0125023 B1號；Boss等，美國專利第4816397號；Boss等，歐洲專利第0120694B1號；Neuberger，M.S.等，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等，歐洲專利第0194276B1號；Winter，美國專利第5225539號；Winter，歐洲專利第0239400B1號；Queen等，歐洲專利第0451216B1號；及Padlan，E.A.等，EP0519596A1，均以參考形式並於本文。舉例而言，本發明可用於生產免疫特異性辨識特異細胞靶標的人類和/或人源化抗體，該類特異細胞靶標例如任一上述蛋白、人類EGF受體、her-2/neu抗原、CEA抗原、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD5、CD11a、CD18、NGF、CD20、CD45、CD52、Ep-cam、其他癌細胞表面分子、TNFα、TGF-b1、VEGF、其他細胞因子、α4β7整合素(integrin)、IgE、病毒蛋白(例如巨細胞病毒)。可使用本發明組合物和方法生產的抗體的實例包括但不限於抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體和抗-EPO受體(EPO-R)抗體。在一個實施方案中，抗-TNFα抗體為完全人類抗-TNFα抗體，例如阿達木單抗/D2E7(參見美國專利第6090382號，其以參考的方式並於本文；

Abbott Laboratories)。在一個實施方案中，抗-IL-12抗體為完全人類抗-IL-12抗體，例如ABT-874(Abbott Laboratories；參見美國專利第6914128號，其以參考方式並於本文)。在一個實施方案中，抗-IL-18抗體為完全人類-IL-18抗體(例如ABT-325)，例如也可參見US 20050147610A1中描述的抗體。在一個實施方案中，抗-EPO/R(亦稱作ABT-007)抗體為完全人類抗體，如以引用的方式併入本文的美國專利公開案第US 20060018902A1號中所描述者。
可使用本發明方法和組合物生產的蛋白類型的另一實例包括融合蛋白。融合蛋白為融合至異源蛋白或肽的蛋白或結構域或蛋白(例如可溶性胞外結構域)。該類融合蛋白的實例包括以含有免疫球蛋白分子部分的融合物表達的蛋白；以含有拉鏈部分的融合蛋白表達的蛋白；及新穎多功能蛋白，例如細胞因子和生長因子融合蛋白(即GM-CSF及IL-3、MGF及IL-3)。WO 93/08207及WO 96/40918描述了被稱作CD40L的分子各種可溶性寡聚物形式的製備，分別包括免疫球蛋白融合蛋白和拉鏈融合蛋白；其中所論述的技術可應用於其他蛋白。另一種融合蛋白為重組TNFR:Fc，也稱作依那西普(entanercept)。依那西普(或

Amgen/Wyeth)為p75 TNFα受體胞外部分的兩個分子的二聚體，各分子由融合至人類IgG1的232胺基酸Fc部分的235胺基酸TNFR衍生的多肽組成。實際上，任何分子均可表現為融合蛋白，包括但不限於細胞受體分子的胞外結構域、酶、激素、細胞激素、免疫球蛋白分子部分、拉鏈結構域和表位。
III.本發明的細胞培養基 本發明提供用於生產或表達重組蛋白(例如抗體)的哺乳動物細胞培養的細胞培養基。本文所述各種細胞培養基可獨立或共同地用於改良細胞培養，包括增加蛋白生產和延長細胞壽命。
在優選的實施方案中，本發明的細胞培養基為無血清的，意指培養基不含血清(例如胎牛血清(FBS)、馬血清、山羊血清或本領域技術人員已知的其它衍生自動物的血清)。
在第一方面，本發明提供包括全部或部分經修飾基礎培養基的哺乳動物細胞培養基。經修飾基本細胞培養基可衍生自本領域已知的標準基礎細胞培養基。適當的基礎培養基包括但不限於杜氏經修飾伊氏培養基(DMEM)、DME/F12、極限必需培養基(MEM)、基礎培養基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-極限必需培養基(α-MEM)、Glasgow氏極限必需培養基(G-MEM)、PF CHO及Iscove氏經修飾杜氏培養基。可用於本發明的基礎培養基的其他實例包括BME基礎培養基(Gibco-Invitrogen；也可參見Eagle，H(1965)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.89，36)；杜氏經修飾Eagle培養基(DMEM，粉末)(Gibco-Invitrogen(#31600)；也可參見Dulbecco and Freeman(1959)Virology 8，396；Smith等(1960)Virology 12，185.Tissue CultureStandards Commitee，In Vitro 62，93)；CMRL 1066培養基(Gibco-Invitrogen(#11530)；也可參見Parker R.C.等(1957)SpecialPublications，N.Y.Academy of Sciences，5，303)。
可修飾基礎培養基以移除存在於標準基礎培養基中的特定非營養組份，例如各種無機和有機緩衝劑、表面活性劑和氯化鈉。如本文所述，從基礎細胞培養基移除該類組份可使剩餘營養組份的濃度增加並改良總細胞生長和蛋白表達。此外，根據細胞培養條件的要求可將省略的組份添加回含有經修飾基礎細胞培養基的細胞培養基中。如下所述，已發現從基礎細胞培養基分離特定成份(即添加經修飾基礎細胞培養基作為細胞培養基中的成份)，且隨後將成份添加回細胞培養基中作為分離成份會提供對細胞培養物生長和蛋白生產有利的特性。
本發明的經修飾基礎培養基排除任何(或所有)以下成份碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖。這些成份常見於市售基礎細胞培養基中。
可通過市售培養基服務(例如SAFC PharmaTM)完成組份(例如碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和/或單糖葡萄糖)的排除。本領域技術人員將了解在一個實施方案中可使用市售細胞培養基服務(即定製培養基服務)獲得經修飾基礎培養基。定製培養基服務的實例可由以下公司提供例如，SAFC(原JRH Bioscience)、

Atlanta

及Lonza。
或者，本領域普通技術人員可根據製造基礎細胞培養基的標準方法製備本發明經修飾基礎細胞培養基，其中省略了本文所述的特定成份(參見例如Freshney(2005)Culture of Animal CellsA Manual ofBasic Technique；BD Bionutrients Technical Manual，(2006)，第三版；Jenkins編輯(1999)，Animal Cell Biotechnology，Methods and Protocols，Humana Press；Doyle and Griffiths編輯，(1997)Essential TechniquesMammalian Cell Culture，John Wiley and Sons；Butler編輯(1991)Mammalian Cell BiotechnologyA Practical ApproachOxford UniversityPress；Darling及Morgan(1994)Animal CellsCulture and Media，JohnWiley and Sons；Freshney編輯(1992)，Animal Cell CultureA PracticalApproach(第2版)，Oxford University Press；Pollard及Walker(1997)，Basic Cell Culture Protocols(第2版)，Humana Press，(Part of theMethods in Molecular Biology series，第75卷)，其各以參考形式並於本文)。
在一個實施方案中，本發明的細胞培養基含有經修飾的基礎細胞培養基；鐵來源(優選為無機的，例如檸檬酸鐵)；重組生長因子；緩衝劑；表面活性劑；滲透壓調節劑；能量來源；及至少兩種不同的非動物水解產物。此外，經修飾的基礎細胞培養基任選可含有胺基酸、維生素或胺基酸與維生素的組合。
如本文所使用，術語″鐵″意指用以補充培養基的衍生自非動物的鐵來源。細胞培養基中的鐵來源優選為無機的。鐵來源優選為無機的且包括(例如)鐵鹽和亞鐵鹽，例如檸檬酸鐵或硫酸亞鐵。優選螯合鹽，例如檸檬酸鐵和檸檬酸鐵銨。然而，也可使用並非自動物來源分離的其他鐵來源，例如提供等量鐵的化學鐵螯合劑或重組蛋白鐵載劑。可使用的鐵螯合化合物包括但不限於鐵螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(β-胺基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、甲磺酸去鐵胺、二巰基丙醇、二乙撐三胺五乙酸(DPTA)和反-1，2-二胺基環己烷-N，N，N′，N′-四乙酸(CDTA)以及檸檬酸鐵螯合劑和硫酸亞鐵螯合劑。尤其優選的鐵來源為檸檬酸鐵，其優選以0.1-1mM濃度存在於終體積細胞培養基中。在另一個實施方案中，檸檬酸鐵的濃度為100-150mg/L，例如122mg/L。上述mM(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0)和mg/L(例如100、110、120、130、140和150)的中間數也可為本發明的一部分。
可包括於細胞培養基中的生長因子的非限制性實例為胰島素或其重組類似物、IGF-1及胰島素與IGF-1的組合。尤其優選的重組生長因子為胰島素或其重組類似物，其優選以約4mg/L至13mg/L的濃度存在於終體積細胞培養基中。上述胰島素濃度的中間數也可為本發明的一部分，例如4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5和13。
細胞培養基也可包括緩衝劑。在一個優選的實施方案中，緩衝劑自經修飾的基本細胞培養基中排除而作為分離組份添加至細胞培養基中(也向其中添加經修飾的基礎細胞培養基)。用於細胞培養基中的緩衝劑為本領域已知。細胞培養基中可包括的緩衝劑的非限制性實例為磷酸鹽緩衝劑、HEPES和碳酸氫鈉。在一個實施方案中，碳酸氫鈉作為緩衝劑添加至細胞培養基中，終濃度約0.1-3g/L。在一個實施方案中，碳酸氫鈉作為緩衝劑添加至細胞培養基中，終濃度約1.6g/L。在一個實施方案中，HEPES作為緩衝劑添加至細胞培養基中，終濃度0.1-3g/L。在另一個實施方案中，HEPES作為緩衝劑添加至細胞培養基中，終濃度1.8g/L。在一個實施方案中，將磷酸鹽緩衝劑(例如磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉)添加至細胞培養基中，其終濃度介於0.01與0.5g/L之間。上述濃度的中間數也為本發明的一部分，例如碳酸氫鈉或HEPES的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、2.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0或磷酸鹽緩衝劑的濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.36、0.38、0.4、0.42、0.44、0.46、0.48和0.5g/L。
包括緩衝劑以幫助將細胞培養基維持在期望的pH。在一個實施方案中，細胞培養基的pH在6.0至8.0、6.5至7.5、及7.1至7.2之範圍內。這些pH值中間數(例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9及8.0)以及本文所述的所有其他數值也為本發明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的範圍也包括於本發明範疇內。
細胞培養基也可包括滲透壓調節劑，例如NaCl。在一個實施方案中，將NaCl添加至細胞培養基中，終濃度在約1.0至6.5g/L之間。在一個實施方案中，細胞培養基的滲透壓在260至450mOsmo/kg的範圍內。在一個實施方案中，細胞培養基的滲透壓在320至450mOsmo/kg的範圍內。所述NaCl濃度和mOsmo/kg值的中間數(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6和6.5的NaCl濃度和260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450的mOsmo/kg範圍)以及本文所述所有其他數值也為本發明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的範圍也包括於本發明範疇內。
本發明的細胞培養基中也可添加能量來源。優選地，能量來源為單糖。可用於細胞培養基中的單糖實例包括葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一個實施方案中，將葡萄糖添加至細胞培養基中，最終濃度約3.5-7.0g/L。在一個實施方案中，將葡萄糖添加至細胞培養基中，終濃度不大於7.0g/L。在一個實施方案中，將葡萄糖添加至細胞培養基中，終濃度約7.0g/L。上述葡萄糖濃度的中間數(例如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.2、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8和7)以及本文所述所有其他數值也為本發明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的範圍也包括於本發明範疇內。
本發明細胞培養基的一個重要成份為添加的水解產物。本發明的細胞培養基可包括源自單一來源(例如酵母或大豆)的水解產物，或可包括水解產物的組合(例如酵母與和豆源水解產物)。優選地，用於本發明細胞培養基的水解產物為非動物源的。非動物源水解產物的實例包括植物源水解產物和非植物源水解產物，例如酵母源水解產物、Tryprone、酪蛋白水解產物、酵母萃取物、或經木瓜酶消化的大豆蛋白腖。用於本發明培養基的水解產物可商業購買，包括例如來自例如Quest International，Norwich，N.Y.，OrganoTechnie，S.A.France，Deutsche Hefewerke GmbH，Germany，或DMV Intl.Delhi，N.Y.來源的HyPep 1510.RTM.、Hy-Soy.RTM.、Hy-Yeast 412.RTM.和Hi-Yeast444.RTM.。酵母萃取物和大豆水解產物的來源公開於WO 98/15614、WO 00/03000、WO 01/23527和美國專利第5741705號中。也可用於本發明的酵母源水解產物的實例包括TC酵母粉(BD Diagnostic)和酵母粉UF(SAFC Biosciences)，而植物源水解產物的實例包括大豆水解產物UF(SAFC Biosciences)和

大豆水解產物(HyClone Media)。
在一個實施方案中，本發明的細胞培養基進一步包括穀氨醯胺，例如L-穀氨醯胺。L-穀氨醯胺的適當來源可為各種商業來源，例如Gibco(目錄號25030-081)。
本發明的細胞培養基(包括下文實例部分描述的細胞培養基)可任選包括甲氨喋呤。在用於培養CHO細胞的細胞培養基中，甲氨喋呤用量的實例包括約100nM至5000nM甲氨喋呤。上述甲氨喋呤摩爾濃度的中間數(例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800和500nM)以及其他中間數也為本發明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的範圍也包括於本發明範疇內。
在大規模生物反應器中，CHO細胞特別易受容器內氣體噴射和葉輪混合所產生的剪切力的影響。因此，本發明的細胞培養基也可任選包括細胞保護劑。如本文所使用，術語″細胞保護劑″意指保護真核細胞免受損害的物質。例如，該損害可由剪切力或生物反應容器中的氣泡噴射效應引起。為使細胞損害的發生降至最低，培養基最好含有細胞保護劑，例如甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙烯醇或pluronic多元醇。其中，優選Pluronic.RTM.(多元醇，BASF Wyandotte Corp.)多元醇F68，因為其不像聚乙烯醇，其為無毒物質且不像聚乙二醇，其並不幹擾下遊純化。
本發明的細胞培養基也可包括非鐵金屬離子。非鐵金屬離子的實例包括但不限於氯化物和硫酸鹽、鉀、鎂、銅、硒、鋅、鎳、錳、錫、鎘、鉬酸鹽、釩酸鹽和矽酸鹽。
本發明的細胞培養基也可包括維生素和酶輔因子。該類維生素和酶輔因子的實例包括但不限於PABA(對氨基苯甲酸)、維生素K(生物素)、維生素B5(D-泛酸鈣)、葉酸、內消旋肌醇、煙醯胺(菸酸醯胺)、維生素B6(鹽酸吡多辛(PyrdoxineHCl))(及鹽酸吡哆醛(PyrodoxalHCl))、維生素B2(核黃素)、維生素B1(硫胺素)和維生素B12(氰鈷胺素(cyanocobalamin))。或者，可向培養基中添加維生素C(L-抗壞血酸)。也可添加氯化膽鹼，通常認為其為維生素但也可作為脂質因子。
此外，本發明的細胞培養基也可包括脂質樣因子。脂質因子的實例包括氯化膽鹼和磷脂醯膽鹼。也可包括脂質生產助劑，例如醇胺(例如乙醇胺)。
在本發明的方法和組合物中，優選在無血清培養基中培養細胞。應用於培養基的術語″無血清″包括不含有血清(例如胎牛血清)的任何哺乳動物細胞培養基。
本發明範疇內也包括本文所述的任何改良細胞培養基中的哺乳動物細胞，例如CHO細胞。
在本發明的一方面提供為生產特定抗體而優化的細胞培養基配方。優選配方的實例包括用於表達下列抗體的CHO細胞生長或蛋白生產的細胞培養基抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體和抗-EPO受體(EPO-R)抗體。
本發明中包括表達抗-TNFα抗體(包括完全人類抗-TNFα抗體)的哺乳動物細胞(例如CHO細胞)的細胞培養基。在優選的實施方案中，完全人類抗-TNFα抗體為阿達木單抗(也稱作D2E7及

Abbott Laboratories)。阿達木單抗(包括核酸和胺基酸序列)的特徵描述於美國專利第6090382中，其以參考形式並於本文。可通過在細胞培養生長培養基中培養包含編碼蛋白(例如阿達木單抗)的核酸的哺乳動物細胞(例如CHO細胞)，將細胞培養物轉移至細胞培養生產培養基中且將蛋白從細胞培養生產培養基中分離生產阿達木單抗。
在一個實施方案中，本發明提供為包含編碼阿達木單抗的核酸的CHO細胞而優化的細胞培養生長培養基。為表達阿達木單抗的CHO細胞而優化的無血清細胞培養生長培養基的配方包括基礎培養基；檸檬酸鐵(例如約8-12ml/kg，約10.0ml/kg或122mg/L)；重組人胰島素(例如約2-6mg/kg，約4.0mg/kg)；無水葡萄糖(例如約2-5mg/kg，約3.5g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.29g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；及酵母源水解產物(例如約2.0g/kg)。為表達阿達木單抗的CHO細胞而優化的無血清細胞培養生長培養基的另一實例包括以下成份排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10.0ml/kg或122.45mg/kg)；重組人胰島素(例如約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg)；無水葡萄糖(例如約7.0g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.8至0.9g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；HEPES(例如約1.8g/kg)；NaCl(例如約2.6至2.7g/kg)；Pluronic F-68(例如約1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；L-天冬醯胺一水合物(例如約0.45g/kg)；酵母源水解產物(例如約4.0g/kg)；及植物源水解產物(例如約2.6g/kg)。表達阿達木單抗的細胞培養生長培養基可進一步包括甲氨喋呤，例如約2.50mL/kg。
在一個實施方案中，本發明提供為表達抗體(包括，例如，人類抗-TNFα抗體(例如阿達木單抗)或紅細胞生成素受體(EPO/R)抗體)的CHO細胞而優化的細胞培養生產培養基。抗-EPO/R抗體的實例描述於美國專利公開案第20040071694號中，其以參考形式並於本文。為表達抗體(例如阿達木單抗或抗-EPO/R抗體)的CHO細胞而優化的無血清細胞培養生產培養基配方包括排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10.0ml/kg或122.45mg/L)；重組人胰島素(例如約6.0mL/kg或12mg/kg)；無水葡萄糖(例如約7.0g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.58至0.59g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；HEPES(例如約1.8g/kg)；NaCl(例如約2.4至2.5g/kg)；Pluronic F-68(例如約1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；酵母源水解產物(例如約10.7g/kg)；及植物源水解產物(例如約6.9至7.0g/kg)。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基具有介於約7.1至7.2範圍內的pH值及介於373至403mOSm/kg範圍內的滲透壓。
本發明的另一方面涉及使由CHO細胞生產的抗-白介素-12(IL-12)抗體(例如完全人類IL-12抗體)的生產最優化的細胞培養基。在優選的實施方案中，完全人類抗-IL12抗體為ABT-874。ABT-874(包括核酸和胺基酸序列)的特點描述於美國專利第6914128號中，其以參考文獻的形式並於本文。
在一個實施方案中，為表達ABT-874的CHO細胞生長而優化的無血清細胞培養生長培養基包括下列各物質排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10ml/kg或122.45mg/L)；重組人胰島素(例如約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg)；無水葡萄糖(例如約7.0g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.87至0.88g/kg)；L-天冬醯胺一水合物(例如約0.45g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；HEPES(例如約1.8g/kg)；NaCl(例如約2.67至2.68g/kg)；約PluronicF-68(例如1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；酵母源水解產物(例如約4.0g/kg)；及植物源水解產物(例如約2.6g/kg)。
在一個實施方案中，用於表達ABT-874的無血清細胞培養生產培養基包括下列各物維生素含量降低且排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10ml/kg或122.45mg/L)；重組人胰島素(例如約6.5mL/kg或13mg/kg)；無水葡萄糖(例如約7.0g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.58至0.59g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；HEPES(例如約1.8g/kg)；NaCl(例如約2.45g/kg)；PluronicF-68(例如約1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；酵母源水解產物(例如約10.7g/kg)；及植物源水解產物(例如約6.9至7.0g/kg)。
在一個實施方案中，本發明提供表達抗體(例如抗-IL12及抗-EPO/R抗體)的CHO細胞的無血清細胞培養生長培養基，其包含下列各物質基礎培養基；檸檬酸鐵(例如約10ml/kg或122.45mg/L)；重組人胰島素(例如約4mg/kg)；無水葡萄糖(例如約1.5g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.29至0.30g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；及酵母源水解產物(例如至少約2g/kg)。在一個實施方案中，表達抗體(例如抗-IL-12及抗-EPO/R抗體)的CHO細胞的細胞培養生長培養基具有約7.10至7.30的pH值及約300至340mOsmo/kg的滲透壓。細胞培養基也可含有酵母源水解產物(例如至少約8g/kg)。
本發明的另一方面涉及為由CHO細胞生產抗白介素18(IL-18)抗體(例如完全人類IL-18抗體)的生產而優化的細胞培養基。可使用本發明方法和組合物生產的完全人類IL-18抗體的實例描述於PCT公開案WO 01/058956中，其以參考形式並於本文。
在一個實施方案中，為CHO細胞中IL-18抗體生產而優化的細胞培養生長培養基包括下列成份排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑的單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10ml/kg或122.45mg/L)；重組人胰島素(例如約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg)；無水葡萄糖(例如約7.0g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.87至0.88g/kg)；L-天冬醯胺一水合物(例如約0.45g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；HEPES(例如約1.8g/kg)；NaCl(例如約2.67g/kg)；Pluronic F-68(例如約1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；酵母源水解產物(例如約4.0g/kg)；及植物源水解產物(例如約2.6g/kg)。用於表達完全人類IL-18抗體的細胞生長的細胞培養基可具有7.10至7.20的pH值及373至403mOsmo/kg的滲透壓。上述數值(例如所述胰島素、pH或滲透壓值)的中間數也為本發明的一部分。
為CHO細胞中IL-18抗體生產而優化的細胞培養生產培養基實例包括下列成份經修飾的基礎培養基，其經修飾以去除下列組份碳酸氫鈉、HEPES緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10ml/kg或122.45mg/L)；重組人胰島素(例如約6.0mL/kg或12mg/kg)；無水葡萄糖(例如約7.0g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.58至0.59g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；HEPES(例如約1.8g/kg)；NaCl(例如約2.45g/kg)；PluronicF-68(例如約1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；酵母源水解產物(例如約10.7g/kg)；及植物源水解產物(例如約6.9至7.0g/kg)。用於生產完全人類抗-IL-18抗體的細胞培養生產培養基的另一實例包括排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10ml/kg或122.45mg/L)；重組人胰島素(例如約6.5mL/kg或13mg/kg)；無水葡萄糖(例如約7.0g/kg)；L-穀氨醯胺(例如約0.58至0.59g/kg)；碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg)；HEPES(例如約1.8g/kg)；NaCl(例如約2.45g/kg)；Pluronic F-68(例如約1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如約0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如約0.43至0.44g/kg)；酵母源水解產物(例如約14.2至14.3g/kg)；及植物源水解產物(例如約9.2至9.3g/kg)。生產完全人類IL-18抗體的CHO細胞的細胞培養基可具有7.10至7.20的pH值及373至403mOsmo/kg的滲透壓。上述數值(例如所述胰島素、pH或滲透壓值)的中間數也為本發明的一部分。
除實施例部分所述的示例性培養基以外，下文也描述了與改良抗體生產分批補料方法和補充培養基相關的本發明範疇內的培養基的其它實例。
本發明培養基可用於通過使培養基或其組份與所有或部分細胞群接觸來實現適當細胞培養。可通過混合、添加、組合、接種或攪拌一或多種細胞與一或多種化合物、溶液、培養基等而使培養基與細胞接觸。亦可通過(例如)″補料″以替代或補充下文更詳細描述的培養細胞的培養基而使培養基與細胞一次性、以增量形式或以逐步方式接觸。
IV.用於改良蛋白生產的方法和組合物 本發明方法或組合物涉及哺乳動物細胞培養。在一個實施方案中，所使用的哺乳動物細胞為CHO細胞。
已描述將DNA導入哺乳動物細胞中的既定方法。Kaufman，R.J.，Large Scale Mammalian Cell Culture，1990，第15-69頁。使用市售試劑(例如陽離子脂質試劑LipofectamineTM、lipofectamineTM-2000或lipofectamineTM-plus(可購自Invitrogen))的附加方案可用以轉染細胞。Feigner等人(1987).，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417。此外，用塗漬了核酸的顆粒進行電穿孔或轟擊可用以使用程序轉染哺乳動物細胞，例如下列文獻中的程序A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Fitzpatrick-McElligott(1992)，Biotechnology(NY)10(9)1036-40。可使用本領域已知方法(例如對細胞毒性藥物的抗性)進行穩定轉化子的選擇。Kaufman等人((1990)，Meth.Enzymology 185487-511)描述了若干選擇機制，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)抗性。DHFR選擇的適當宿主菌株可為缺失DHFR的CHO菌株DX-B11。Urlaub及Chasin(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220。可將表達DHFR cDNA的質粒導入菌株DX-B11中且只有含有質粒的細胞可於適當選擇培養基中生長。可併入表達載體中的可選擇標記的其他實例包括賦予抗生素(例如G418及勻黴素B)抗性的cDNA。可基於對這些化合物的抗性選擇含有載體的細胞。
已顯示可改良哺乳動物表達載體的異源基因表達的附加控制序列包括下列元件衍生自CHO細胞的表達加強序列元件(EASE)(Morris等，Animal Cell Technology，第529-534頁(1997)；美國專利第6312951B1號、第6027915號和第6309841B1號)及來自腺病毒2的三聯前導序列(TPL)和VA基因RNA(Gingeras等(1982)，J.Biol.Chem.25713475-13491)。病毒來源的內部核糖體進入位點(IRES)序列使得雙順反子mRNA有效翻譯(Oh和Sarnow(1993)，CurrentOpinion in Genetics and Development 3295-300；Ramesh等人(1996)，Nucleic Acids Research 242697-2700)。異源cDNA以雙順反子mRNA部分(後面為篩選標記的基因(例如DHFR))表達的部分已顯示可改良宿主的轉染能力和異種cDNA的表達(Kaufman等人(1990)，Methods in Enzymol.185487-511)。採用雙順反子mRNA的示例性表達載體為Mosser等，Biotechniques 22150-161(1997)描述的pTR-DC/GFP及Morris等，Animal Cell Technology，第529-534頁(1997)描述的p2A5I。
Mosley等人已描述了一種可用的高表達載體pCAVNOT((1989)，Cell 59335-348)。可如Okayama及Berg所公開經((1983)，Mol.Cell.Biol.3280)構建用於哺乳動物宿主細胞中的其他表達載體。適用在C127鼠類乳腺上皮細胞中哺乳動物cDNA的穩定高水平表達的系統可大體上如Cosman等人所述構建((1986)，Mol.Immunol.23935)。Cosman等人描述的可用高表達載體PMLSV N1/N4((1984)，Nature312768)已保藏為ATCC 39890。其它可用的哺乳動物表達載體描述於EP專利第-A-0367566號和WO 01/27299A1。載體可衍生自反轉錄病毒。可添加異源信號序列替代天然信號序列，該類異源信號序列例如以下序列之一美國專利第4965195號中描述的IL-7信號序列；Cosman等人描述的IL-2受體信號序列(Nature 312768(1984))；EP專利第0367566號描述的IL-4信號肽序列；美國專利第4968607號中描述的IL-1受體型信號肽；及EP專利第0460846號中描述的II型IL-1受體信號肽。
可在真核細胞中重組生產多肽且優選由適合於細胞培養物中生長的宿主細胞分泌。用於本發明的宿主細胞優選為哺乳動物細胞。該類細胞也可經基因工程改造表達所關注基因，可為適合於細胞培養物中生長的哺乳動物生產細胞和/或可為同源細胞株。常用於工業中的該類細胞的實例為VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤細胞株(例如NSO、NS1)、PC12、WI38細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，該類細胞廣泛地用於生產數種複合重組多肽，例如細胞激素、凝血因子和抗體(Brasel等(1996)，Blood882004-2012；Kaufman等(1988)，J.Biol Chem 2636352-6362；McKinnon等(1991)，J Mol Endocrinol 6231-239；Wood等(1990)，J.Immunol.1453011-3016)。缺乏二氫葉酸還原酶(DHFR)的突變細胞株(Urlaub等(1980)，Proc Natl Acad Sci USA 774216-4220，其以參考形式並於本文)DXB11和DG-44為合乎需要的CHO宿主細胞株，因為有效DHFR可選擇和可擴增基因表達系統使得該類細胞中高水平表達重組多肽(Kaufman R.J.(1990)，Meth Enzymol 185537-566，其以參考形式並於本文)。此外，這些細胞易於作為粘附或混懸培養物操縱且顯示相對優良的遺傳穩定性。CHO細胞和其中表達的重組多肽已被廣泛地特性研究且已經管理機構許可用於臨床商業製造。也可使用生產抗體的雜交瘤細胞株實踐本發明方法。製造雜交瘤的方法為本領域熟知。參見例如Berzofsky等，Paul編輯，Fundamental Immunology，第2版，第315-356頁，347-350，Raven Press Ltd.，New York(1989)。衍生自上述細胞系的細胞株也適用於實踐本發明。
用編碼重組蛋白的多聚核苷酸序列轉化適當的哺乳動物宿主細胞(例如CHO細胞)後，鑑定並分離顯示穩定表達重組蛋白的細胞。可根據本領域的已知方法，通過將適當DNA載體轉染至二氫葉酸還原酶缺乏(DHFR-)的中國倉鼠卵巢細胞(CHO AM-1/D，美國專利第6210924號)中，隨後分離且檢測顯示最高重組蛋白表達的個別純系而完成重組蛋白的穩定表達。基於小規模旋轉器和較大規模生物反應器中的生長和生產，選擇特定細胞株作為生產重組蛋白的細胞株。
可通過本領域熟知的方法(例如，通過在不含血清的條件下於96和/或24孔板中進行多輪限制性稀釋)，使用本發明細胞培養基克隆生產最高含量重組蛋白的細胞。基於各種懸浮容器中的生產和生長特徵來選擇克隆。可進行酶免疫測定法(EIA)選擇生產最高水平重組蛋白的克隆。可通過使克隆在介於100ml至高達3L範圍內的各種振蕩器或旋轉燒瓶及生物反應器中的生長來測量生長特徵(包括倍增時間和密度)。選擇最佳克隆(例如可在培養物中達到最高密度的最快倍增時間的克隆)且選擇其作為用於重組蛋白生產的細胞系。在一個實施方案中，重組蛋白生產用於商業目的且使用大規模生物反應器進行。
通常，在組織培養板(例如10cm培養板、96孔培養板等)或其他粘附培養(例如微載體珠)和懸浮培養(例如滾瓶中)，在無菌、溫度受控和大氣條件下進行細胞培養。培養物可在搖瓶、小規模生物反應器和/或大規模生物反應器中生長。生物反應器為用以培養細胞的裝置，在生物反應器中可監測、調節並控制環境條件，例如溫度、空氣、攪拌和/或pH值。本發明方法(包括分批補料方法)和組合物可用於大規模哺乳動物細胞培養，例如10L、11L、12L、13L、14L等。在一個實施方案中，本發明的大規模細胞培養方法和組合物適用於CHO細胞培養和抗體生產。
根據本發明，在促進所關注多肽(可為抗體或重組多肽)生產的條件下培養哺乳動物宿主細胞。本領域技術人員可選擇使用本文所述的一或多種經研發以使特定培養宿主細胞中的細胞生長、細胞活力和/或重組多肽生產最大化的細胞培養基。或者，本發明方法和組合物可與市售細胞培養基組合使用。
哺乳動物細胞的適當培養條件為本領域已知(參見例如Animalcell cultureA Practical Approach，D.Rickwood編，Oxford universitypress，New York(1992))且可與的本發明的改良方法組合。可以懸浮狀態或附著至固體基質上培養哺乳動物細胞。此外，也可(例如)在具有或不具有微載體的流體化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶、搖瓶或攪拌槽生物反應器中培養哺乳動物細胞且以分批、分批補料、連續、半連續或灌注模式進行。
根據本發明的方法可用以改良單一階段和多階段培養過程中的重組多肽生產。在單一階段過程中，將細胞接種至培養環境中且在單一生產期間採用所公開的方法。在多階段過程中，在兩個或兩個以上不同階段中培養細胞。舉例而言，首先可在生長期，在使細胞增殖和活力最大化的環境條件下培養細胞，接著在使多肽生產最大化的條件下將其轉移至生產期。生長期和生產期可在一或多個過渡期之後或被一或多個過渡期所分離。在多階段過程中，至少可在生產期中採用本發明方法。
為達成理解而非限制目的，本領域技術人員應理解蛋白生產的細胞培養和培養周期可包括三種通用類型即，連續培養、分批培養和分批補料培養。在連續培養中，例如，在培養期間向細胞提供新鮮培養基補充物(即補入培養基)，同時每日移除舊培養基且(例如)每日或連續收集產物。在連續培養中，可每日添加並可連續(即點滴或灌注)添加補入培養基。對於連續培養而言，可如需要將細胞保持於培養物，只要細胞保持存活並且維持環境和培養條件即可。
在分批培養中，最初在培養基中培養細胞且在培養周期中或在培養周期結束前不移除、替代也不補充該培養基，即不用新鮮培養基向細胞″補料″。在培養周期結束時，收集所需產物。
對於分批補料培養而言，通過在培養周期中每日(或連續地)一或多次用營養溶液補充培養基，即在培養期間用補入培養基對細胞″補料″，延長培養周期時間。分批補料培養可包括如下所述的各種補料方案和次數，例如每日、每隔一日、每兩日等、每日一次以上或每日少於一次等。此外，可用補入培養基對分批補料培養物連續補料。接著，在培養/生產周期結束時收集所需產物。本發明優選涵蓋分批補料細胞培養物，其中使用可增加蛋白生產並可延長蛋白生產期的優化補料溶液進行補料。
改良分批補料培養物水解產物和基礎富集溶液 本發明的一方面為使用改良分批補料方法和補充基礎溶液及水解產物溶液組合增加蛋白生產的方法和組合物。改良分批補料方法部分基於添加兩種富集溶液(即水解產物富集溶液和基礎富集溶液)，該類富集溶液在蛋白生產時段中添加至細胞培養基中。用於本發明的分批補料方法的水解產物富集溶液包含並非衍生自植物或動物的第一水解產物和第二植物源水解產物。並非衍生自植物或動物且並為植物源水解產物的水解產物的實例為酵母源水解產物。可用於水解產物富集溶液中的植物源水解產物的實例為大豆源水解產物。基礎富集溶液包括基礎培養基，例如PF CHO、天冬醯胺和葡萄糖，且水解產物富集溶液包括至少兩個不同的非動物源水解產物。在一定時段中以一定時間間隔(例如在11-15天的時段中以每日時間間隔)將水解產物和基礎富集溶液添加至細胞培養物中，且可於同一日或不同日添加。
本發明表徵了一種生產抗-TNFα抗體(例如阿達木單抗/D2E7)的分批補料方法，其包含在介於32至38℃範圍內的培養溫度下在細胞培養物中培養包含編碼抗-TNFα抗體的核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一個實施方案中，培養溫度為35℃。向CHO細胞補入水解產物富集溶液和基礎富集溶液以處理(例如解決或校正)營養缺乏以使生產率最大化。將水解產物和基礎富集溶液添加至細胞培養物中。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含介於20與65％之間的溶氧，例如約30％溶氧。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基含有蛋白生產所需的葡萄糖含量，例如至少約1-5g/L葡萄糖。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含約1.5-2.5g/L葡萄糖。在另一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含約2g/L葡萄糖。在整個蛋白生產培養過程中，可通過按需要向細胞培養生產培養基中添加葡萄糖以維持所給定濃度(例如至少約2.0g/L葡萄糖)來控制葡萄糖濃度。在一個實施方案中，用於抗-TNFα抗體的分批補料方法的水解產物富集溶液基本由下列各物組成約50-280g/L大豆源水解產物(包括其間的範圍和數值，例如，100-225，50-225，225-275和265g/L)和約75-300g/L酵母源水解產物(包括其間的範圍和數值，例如，100-250，150-200，145-175和165g/L)。
為用於在CHO細胞中生產抗-TNFα抗體(例如阿達木單抗/D2E7)的分批補料方法而優化的基礎富集溶液具有約9.0至10.5的pH值(包括其間的範圍和數值，例如，9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5)。添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液的時段在9至15天之間，例如12天。在一個實施方案中，在該時段以下各日的至少一日將基礎富集溶液添加至細胞培養基中第4日、第6日、第9日和第11日，且在該時段的第4日、第7日或第4日和第7日將水解產物富集溶液添加至細胞培養基中。
在另一備選實施例中，用於生產抗-TNFα抗體(例如阿達木單抗/D2E7)的分批補料方法可包括根據pH值線性斜坡(包含自約6.5-8(例如，7.1至7.2)的pH值起始且產生最終約6.9的pH值)調節細胞培養基的pH值。在一個實施方案中，在至少約24小時、48小時或72小時的時段內調節pH值線性斜坡。
本發明也涉及生產抗-IL12抗體(例如ABT-874)的分批補料方法，其包含在介於32至38℃(例如33℃)範圍內的培養溫度下在細胞培養物中培養包含編碼抗-IL12抗體的核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。用於IL-12抗體生產的水解產物富集溶液也可含有葡萄糖。在一個實施方案中，在約6.9的pH值下培養CHO細胞。向CHO細胞補入水解產物富集溶液和基礎富集溶液以維持營養缺乏，以使生產率最大化。將水解產物和基礎富集溶液添加至細胞培養物中。在一個實施方案中，細胞培養生產培養基包含介於20與65％之間的溶氧，例如約40％溶氧。在一個實施方案中，用於抗-IL12抗體的分批補料方法的水解產物富集溶液基本由下列各物組成約50-280g/L大豆源水解產物(包括其間的範圍和數值，例如，100-225、50-225、255-275和165g/L)、約75-300g/L酵母源水解產物(包括其間的範圍和數值，例如，100-250、150-200、145-175和165g/L)和約2.4g/L葡萄糖。為用於在CHO細胞中表達抗-IL12抗體(例如ABT-874)的分批補料方法而優化的基礎富集溶液具有約9.7的pH值及約1480mOsm的滲透壓。添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液的時段在14至15天之間，例如12天。在一個實施方案中，在該時段的第5日起每隔一天將基礎富集溶液添加至細胞培養生產培養基中，且在該時段的第6日起每天將水解產物富集溶液添加至細胞培養生產培養基中。或者，可在該時段的第5日起始每天將基礎富集溶液和水解產物富集溶液添加至細胞培養生產培養基中。
穩定、高濃度補料溶液 本發明一方面涉及與用於改良蛋白生產率的改良、穩定高濃度補料溶液相關的方法和組合物。改良補料溶液可用於在抗體生產中補充細胞培養生產培養基。補料溶液包括葡萄糖(例如100至250g/kg)；基礎培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸，例如天冬醯胺(例如1.0至15.0g/kg；3-12.5g/kghuo 3-5g/kg)；以及至少兩種不同的非動物源水解產物。此外，補料溶液具有約6.0至7.5的pH值。兩種不同的非動物源水解產物可包括植物源水解產物，例如大豆源水解產物，和並非動物源或植物源的水解產物，例如酵母源水解產物。本領域中已知的任何基礎培養基均可用於改良補料溶液，包括但不限於PF CHO或DMEM/F12培養基。也可使用經修飾的基礎培養基。在一個實施方案中，基礎細胞培養基排除以下組份碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑、穀氨醯胺和葡萄糖。改良補料溶液為穩定的，具有小於約15NTU的濁度。本發明也包括通過添加補料溶液維持細胞培養生產培養基的穩定葡萄糖含量。上述範圍值的中間數也為本發明的一部分，例如，3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8和5g/kg天冬醯胺。
本發明也包括一種用於製造包含葡萄糖和至少兩種不同非動物源水解產物的補料溶液的方法。製造補料溶液的方法包括將葡萄糖與基礎細胞培養基組合為組合溶液並將組合溶液的pH值調節至約9.5至10.5。接著，將至少兩種不同的非動物源水解產物添加至溶液中並再次調節pH值，使得所得補料溶液具有約6.5至7.5的pH值。上述範圍值的中間數也為本發明的一部分，例如，6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5的pH。
本發明的補料溶液可用以完成自哺乳動物細胞培養物生產高含量重組蛋白，例如生產抗體。在一個實施方案中，本發明涉及由哺乳動物細胞培養物生產至少約4g/L抗體的方法，其包含在細胞培養生產培養基中培養包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞。接著，將pH值約6.7至7.0的補料溶液添加至細胞培養生產培養基中。補料溶液包括葡萄糖(例如約100至200g/kg)；基礎細胞培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物。在一個實施方案中，該方法可生產至少約4g/L抗體，至少約5g/L抗體；至少約6g/L抗體。上述範圍值的中間數也為本發明的一部分，例如，1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.55g/L抗體。
通過使用pH值約6.7至7.0並包括下列組份的補料溶液葡萄糖；基礎細胞培養基；約除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物，可增加自哺乳動物細胞培養物生產的抗體滴度。在一個實施方案中，將補料溶液添加至包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞的細胞培養生產培養基中，致使比不添加補料溶液培養的對照哺乳動物細胞培養物增加至少50％。在一個實施方案中，添加補料溶液會生產比對照物增加至少100％的滴度。在一個實施方案中，添加補料溶液會產生比對照物增加至少150％的滴度。可將補充補料溶液在特定細胞濃度下添加至細胞培養物中，例如當細胞密度達到每毫升2.0×106個細胞或當細胞密度達到每毫升約3.5×106個細胞時。以上範圍的中間數以及本文中所引用的所有其他數均為本發明的一部分。使用上述值的任何組合作為上限和/或下限的數值範圍包括於本發明範疇內。
由於本發明的分批補料方法用以處理(例如解決或校正)生產蛋白(例如抗體)的特定細胞培養物的營養要求，因此監控特定成份是有利的。可監控的成份包括任何代謝指示劑，即細胞代謝指示劑。在一個實施方案中，本發明的分批補料方法包含監控細胞培養基中的葡萄糖水平，包括監控葡萄糖水平以使其維持於0.25-20g/L之間。在一個實施方案中，葡萄糖水平維持在0.5至5.5g/L之間，或4.0-5.5g/L。通過監控葡萄糖水平，可間接監控細胞代謝。如以下實例3中所述，可將葡萄糖用作代謝指示劑。在一個實施方案中，可基於葡萄糖水平以營養組份(例如水解產物)補充細胞培養物。監控葡萄糖含量的方法為本領域已知並可包括使用自動取樣裝置進行監控。可使用的代謝指示劑的另一實例為穀氨醯胺。以上範圍的中間數以及本文中所引用的所有其他數均為本發明的一部分。使用上述值的任何組合作為上限和/或下限的數值範圍包括於本發明範疇內。
反饋控制系統可用以監控細胞培養生產培養基中的代謝指示劑水平。在一個實施方案中，為了滿足所需參數設定點(例如預定葡萄糖水平)，如反饋控制系統所測定將組合補料溶液添加至細胞培養生產培養基中。
反饋控制系統也可用以測定給定哺乳動物細胞培養物和所關注蛋白生產的補入曲線。在一個實施方案中，確定用於在哺乳動物細胞培養物中生產蛋白的補入曲線的方法包含在細胞培養生產培養基中培養包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；使用反饋控制系統監控細胞培養生產培養基中的代謝指示劑，藉此將補料溶液(例如組合補料溶液)添加至細胞培養生產培養基中。將補料溶液添加至細胞培養生產培養基中以達到目標代謝指示劑設定點，例如葡萄糖水平。根據細胞培養結論，測定每天添加至細胞培養生產培養基中的補料溶液的量並提供應於何時將補料溶液添加至細胞培養物中的補入曲線。一旦確立補入曲線，則不再需要監控生產所關注蛋白的給定哺乳動物細胞培養物的代謝指示劑。
N-乙醯半胱氨酸和丁酸鈉方法及組合物 如上所述，本發明的細胞培養方法可有利達到增加抗體滴度。用於達到在哺乳動物細胞培養物中的蛋白生產率的本發明另一方面為通過向細胞培養基中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合。在一個實施方案中，本發明涉及通過向細胞培養基中添加丁酸鈉(例如0.1mM至10mM)、N-乙醯半胱氨酸(例如1mM至80mM)或其組合而生產抗體的方法。在一個實施方案中，抗體滴度至少約100mg/L；至少約150mg/L；或至少約200mg/L；至少約250mg/L；至少約300mg/L；至少約350mg/L；或至少約400mg/L。
本發明也涉及通過向細胞培養基中添加丁酸鈉(例如終濃度0.1mM至10mM)、N-乙醯半胱氨酸(例如終濃度1mM至80mM)或其組合(對照物相應地缺乏丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合)而在哺乳動物細胞培養物中生產抗體，從而使得抗體滴度比對照哺乳動細胞培養物改良至少10％的方法。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養物改良至少29％；比對照哺乳動物細胞培養物改良至少40％；比對照哺乳動物細胞培養物改良至少70％；或比對照哺乳動物細胞培養物高至少90％。可在哺乳動物細胞培養物的生長期中向哺乳動物細胞培養物中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合。在一個實施方案中，在培養時間的第4日與第7日之間向哺乳動物細胞培養物中添加丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合。在一個實施方案中，以介於5mM至80mM的終濃度(例如20-60mM或約10mM)單獨添加N-乙醯半胱氨酸或與丁酸鈉組合。
本發明也涉及通過向細胞培養基中添加約0.1mM至10mM N-乙醯半胱氨酸(對照物缺少此添加)使得哺乳動物細胞培養物的壽命與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少約45％的方法。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養物的壽命與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少約35％；或與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少約55％。
應注意，本文所描述的細胞培養基和改良培養方法可獨立或彼此組合使用。
在使用本發明方法和組合物進行培養後，接著可回收或收集所得表達蛋白。此外，可使用已知方法將自該培養物或組份(例如自培養基或細胞萃取物或體液)純化或部分純化蛋白。分級分離程序包括但不限於過濾、離心、沉澱、相分離、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用層析(HIC，使用例如苯基醚、丁醚或丙醚的樹脂)、HPLC或上述步驟的一些組合。
舉例而言，多肽純化可包括含有將結合至多肽的試劑的親柱；在該類親和樹脂(例如刀豆球蛋白A瓊脂糖、HEPARIN-TOYOPEARL(層析介質)或Cibacrom blue 3GA SEPHAROSE(瓊脂糖顆粒))上進行的一個或多個柱層析步驟；包括洗脫的一個或多個步驟；和/或免疫親和層析。可以促進純化的形式表達多肽。舉例而言，其可表達為融合多肽，例如麥芽糖結合多肽(MBP)、穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX)的融合多肽。表達且純化該類融合多肽的試劑盒可分別購自New England BioLab(Beverly，Mass.)、Pharmacia(Piscataway，N.J.)和InVitrogen。可用表位標記多肽且隨後使用針對該表位的特定抗體純化。一種該表位FLAG(表位標記)購自Kodak(New Haven，Conn.)。也可能將包含多肽結合多肽(例如結合至重組蛋白的單克隆抗體)的親和柱用於親和力純化所表達多肽。其他類型的親和純化步驟可為蛋白A或蛋白G柱，其中親和試劑結合至含有Fc結構域的蛋白。可使用常規技術將多肽自親和柱移除，例如在高鹽洗脫緩衝劑中並接著在低鹽緩衝劑中透析以供使用或根據所使用的親和基質改變pH值或其他組份；或可使用親和部分的天然底物競爭性移除。在一個實施方案中，根據US申請案第11/732918號(以參考形式並於本文)所述方法純化使用本發明方法和組合物生產的抗體。
所需的最終純度取決於多肽的預期用途。本發明方法和組合物適用於所關注蛋白的治療用途。因此，當預期在活體內給予多肽時，需要相對較高的純度。在該情況下，將多肽純化，使得在通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析時不能檢測到對應於其他多肽的多肽條帶。相關領域技術人員應理解，由於差異糖基化、差異翻譯後加工及其類似技術，通過SDS-PAGE可觀測到多個對應於多肽的條帶。最優選地，將本發明多肽純化至大體均質，如通過SDS-PAGE進行分析時的單一多肽條帶所指示。可通過銀染、考馬斯藍染色或(如果多肽經放射性標記)通過放射自顯影目測多肽條帶。
本發明也任選涵蓋進一步配製蛋白。術語″配製″意指蛋白可經緩衝液交換、殺菌、大體積包裝和/或包裝以用於最後使用者。該類組合物可包含與其他組份(例如生理學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑)組合的有效量蛋白。術語″生理學上可接受″意指不幹擾活性成份的生物活性有效性的無毒材料。
應注意，關於本文所引用的數值，以上範圍的中間數以及本文所引用的所有其他數值為本發明的一部分。使用上述數值的任何組合作為上限和/或下限的數值範圍包括於本發明範疇內。
實施例 以下實施例舉例說明用於培養哺乳動物細胞的改良方法和組合物，包括用於在哺乳動物細胞中表達生物製品的改良方法和組合物。下文揭示用以培養中國倉鼠卵巢(CHO)細胞以表達各種重組生物製品的改良生化成分確定的培養基。此外，也舉例說明在以各種形式和規模運作的生物反應器中，含有相同組份但具有不同組份平衡且經富集以使更多細胞生長和產物表達增加的大規模培養細胞的培養基。
實施例1培養哺乳動物細胞的改良培養基 通常，哺乳動物(例如中國倉鼠卵巢(CHO))細胞培養基基於市售培養基配方，例如DMEM、Ham氏F12或這些類型培養基的組合。為了在哺乳動物細胞中生產蛋白，細胞培養基必須充分富集以支持細胞生長和生物製品產品表達的增加。以下實施例描述用於培養哺乳動物細胞(即中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)以表達包括抗體的各種重組生物製品的改良生化成分確定的培養基。
缺乏二氫葉酸還原酶[dhfr(-)]的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞適合在不存在血清或任何其他衍生自動物來源的材料下以懸浮狀態生長。細胞在不存在次黃嘌呤和胸苷下，在從商業來源JRH PF-CHO(目錄號67147)獲得的成分確定細胞培養基中生長。儘管細胞系並不缺乏穀氨醯胺合酶，但仍向培養基中添加額外的穀氨醯胺。
使用本領域熟知的分子生物技術生成表達生物製品(例如給定標靶的抗體)的CHO細胞系。簡而言之，使用本領域熟知的方法將能夠表達所關注抗體並能夠表達dhfr酶基因的表達載體導入CHO細胞中。通過在次黃嘌呤和胸苷存在下篩選細胞獲得所關注的經轉染細胞。在濃度不斷增加的甲氨喋呤中進一步培養所篩選的轉化子以擴增經轉染基因並增加所表達蛋白的產率。下文描述用以培養CHO細胞的改良細胞培養基。
實施例1.1中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養的培養基 一般而言，用於培養CHO細胞的培養基配方由命名為A部分、B部分及C部分的三個部分組成。A部分為基礎培養基並包含水、胺基酸、維生素、無機金屬鹽、微量元素、乙醇胺、腐胺、表面活性劑、丙酮酸鈉、穀胱甘肽和2-巰基乙醇。B部分包含無機鐵來源；且C部分包含重組生長因子、緩衝劑、滲透壓調節劑、能量來源、各種非鐵金屬離子、表面活性劑和水解產物。培養基組份大部分為無機的或來自重組來源並且經高度純化。培養基不含有來自動物來源的蛋白、脂質和碳水化合物。複合水解產物從經高度加工的酵母和植物來源獲得。
培養基的A部分包括不含蛋白的CHO(PF CHO)培養基(JRH-SAFC Biosciences；JRH目錄號67147-也稱作原始A部分)。因此，A部分包括基礎培養基，該基礎培養基包括水、胺基酸和維生素。選擇基礎培養基(PF CHO)將其修飾並再調配以支持細胞生長和所表達蛋白生產率的進一步增加。修飾PF CHO以去除特定組份，包括碳酸氫鈉、HEPES緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖(經修飾PF CHO在本文中稱作經修飾A部分(也稱作JRH目錄號67411))。也進行這些修飾以促進大規模生物反應器中細胞培養過程條件的改良。
B部分組份(JRH)由獨立添加的濃縮檸檬酸鐵溶液組成。B部分組份的濃度在所有CHO細胞培養方案中均保持恆定。
C部分組份包括生長因子(例如胰島素)、胺基酸穀氨醯胺、TC酵母粉和大豆水解產物植物蛋白腖、保持選擇壓力必需的甲氨喋呤及在製備期間用於在培養基水合後調節pH值的鹼NaOH和酸HCl。
改良細胞培養基配方由如下製成。首先，最初使CHO細胞在從JRH獲得的PF-CHO培養基(SAFC-JRH目錄號67147)中生長。如下所述，將PF-CHO培養基(目錄號67147)進一步修飾以與CHO細胞株一起使用。該經修飾培養基由JRH以新目錄號67411命名。修飾的目標是使細胞培養基的A部分濃度增加，以致滲透壓和pH值不受影響。製造商(JRH)也聲明原始A部分(目錄號67147)不具有碳酸氫鈉、穀氨醯胺並不含蛋白質(不添加胰島素或其他蛋白或肽生長因子)。當證明有效時，將這些省略的組份獨立添加至67147和67411A部分配方中，特別用於CHO細胞系。這些成為下文如C部分更詳細描述的組份中的一些。
表1原始細胞培養基配方(A部分67147)和經修飾細胞培養基配方(經修飾的A部分67411)的比較


CHO細胞培養的細胞培養基A部分 如上所述，改良細胞培養基的A部分含有修飾型基礎培養基，即PF-CHO培養基。獲自JRH的PF-CHO培養基(目錄號67147)為通過從A部分去除緩衝劑碳酸氫鈉、HEPES及磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑氯化鈉、表面活性劑Pluronic F-68以及單糖葡萄糖而加以修飾。取決於特定細胞培養方案的需要，將這些組份以各種濃度添加回A部分中。這使得緩衝劑濃度保持穩定，並使表面活性劑濃度保持低於對細胞造成毒性的水平，同時使得可操縱滲透壓和碳底物水平用於增加細胞生長和增加的抗體生產。一旦將這些組份從原始JRH A部分配方分離，則如經修飾細胞培養基(經修飾PF CHO-在表1中稱作#67411)所示，可促進JRH A部分中剩餘組份濃度的增加，從而使細胞生長和由抗體滴度所測定的抗體表達有所增加。不需改變培養基體積，即可使經修飾A部分粉末(67411)配方的單個組份(包括胺基酸、維生素、微量元素和其他各種組份)比例增加至原始調配方濃度的四倍。上文表1描述了使用67147的原始A部分配方與使用67411的修飾配方的比較。
就定義而言，原始JRH PF CHO基礎培養基(目錄號67147)為不含有穀氨醯胺且不含有碳酸氫鈉的PF CHO基礎培養基。1部分中葡萄糖的原始濃度為1.5mg/L。
CHO細胞培養的細胞培養基的B部分 細胞培養基的B部分組份包含濃縮檸檬酸鐵溶液，其與獲自JRH的PF-CHO培養基的B部分相同(目錄號67147)並獨立添加。
將無機鐵來源(例如鐵鹽和亞鐵鹽，尤其是檸檬酸鐵和硫酸亞鐵)添加至基礎培養基(即A部分或經修飾A部分)中。儘管添加了少量硫酸亞鐵(0.2-0.8mg/L)和無水硝酸鐵(0.025-0.11mg/L)，但優選螯合鹽(例如檸檬酸鐵)。檸檬酸鐵作為液體補充物以較大濃度添加並作為PF-CHO B部分包括於細胞培養基中。儘管可改變其他培養基組份的濃度並具有更大的濃度範圍，但保持122mg/L單一濃度的檸檬酸鐵。這是由於引起細胞損害的超氧化物和自由基的形成以及基礎培養基中不期望化合物的形成。
CHO細胞培養的細胞培養基的C部分 細胞培養基C部分主要由下列各物質組成重組生長因子、緩衝劑、滲透壓調節劑、能量來源和水解產物。在研發過程中添加至細胞培養基中且不包括於胺基酸、維生素和輔因子、無機鹽及緩衝劑、微量元素或礦物質的通常分組中的額外化合物在上表1中描述為″C部分″。關於下表1中所提及的C部分，應注意可獨立或組合添加C部分中所鑑別的成份。
重組生長因子 以介於4-13mg/L濃度範圍內的肽激素胰島素或重組類似物添加至細胞培養基中。IGF-1也可以50-100ng/L的濃度替代或補充添加至細胞培養基中的胰島素。
滲透壓調節劑 各種細胞培養基的滲透壓在260mOsm至460mOsm的範圍內。使用鹽尤其是NaCl、KCl和KNO3調節滲透壓；儘管所有胺基酸和水解產物有助於大幅改變滲透壓。
能量來源 培養基中最多的單糖為葡萄糖(D-葡萄糖)並按需要補充。細胞培養基中的起始濃度在3.5至7.0g/L的範圍內。亦可補充其他糖作為代謝物或作為剪切力保護劑，其可包括麥芽糖、甘露糖、半乳糖或果糖。
水解產物 認為水解產物為游離胺基酸以及二肽和三肽的額外來源。
pH值維持(緩衝劑) 使用各種緩衝劑將細胞培養基的pH值維持於6.5至7.5的範圍內。用於培養基中的無機緩衝劑(或緩衝系統)包括碳酸鹽(NaHCO3)、氯化物(CaCl2)、硫酸鹽(MgSO4)和磷酸鹽(NaH2PO4及Na2HPO4)。有機緩衝劑也包括丙酮酸鈉(C3H3O3Na)和也稱作HEPES的N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸]。
穀氨醯胺 穀氨醯胺也包括於C部分中，因為原始A部分和經修飾A部分均將其省略。穀氨醯胺包括於C部分中，例如在含有原始A部分的細胞培養基中為0.2至0.4(0.29)g/L；在含有經修飾A部分的細胞培養基中為0.3至0.7，例如0.58(參見上表1)。
CHO細胞培養的細胞培養基的其他組份 以下提供可添加至細胞培養基中的額外組份。應注意，可添加的額外組份不限於以下提供的實施例。
額外肽 將0.4至1.65mg/L有助於維持內質網結構和CHO細胞系特異性生長的腐胺HCl鹽添加至基礎培養基中。
以0.5至2.0mg/L添加穀胱甘肽(三肽)。添加2-巰基乙醇至3.6mg/L，作為維持巰基的還原劑並結合、傳送各種金屬如銅。其還原脫氫抗壞血酸和胱氨酸並再生抗壞血酸和半胱氨酸。
甲氨喋呤 產品線之間的甲氨喋呤濃度有所不同，取決於預期達到的最終擴增水平。使用2mM濃度的儲備溶液，添加體積和終濃度為對於抗-IL-12和抗-EPO-R，0.250mL/kg導致最終為500nM；對於抗-IL-18，0.5mL/kg導致最終為100nM，最後對於抗-TNFα，2.5mL/kg導致最終為5000nM。
細胞保護劑/表面活性劑 該實施例中描述的培養基用於在所有規模的反應器、燒瓶和旋轉燒瓶中，在產生較大剪切力的攪拌及噴射下使CHO細胞以懸浮狀態生長。為使細胞損害降至最低，添加濃度為每升培養基大約1g的細胞保護劑(如pluronic多元醇，尤其為Pluronic F-68)。也使用小於和等於1g/L的其他剪切力緩和劑(包括甲基纖維素)和高達每升克量的不同濃度的特定水解產物和植物萃取物。
胺基酸 細胞培養基具有如本文所述的胺基酸含量範圍。以高於其他胺基酸的起始濃度添加兩種胺基酸(天冬醯胺和穀氨醯胺)，因為它們在CHO細胞培養過程中快速變為限制養分。具體而言，天冬醯胺在基礎培養基中約0.4-0.5g/kg。
儘管天冬醯胺為A部分的組份(包括原始和經修飾PF CHO)，但通過將其補充至細胞培養基中增加天冬醯胺的濃度。
細胞培養基能夠支持極低初始密度的CHO歷時數天生長至超過每毫升1.0×107個細胞，取決於目標組份濃度及所需培養基的細胞效應。CHO過程額外包括稍後部分所述的生長期和生產期，以及所需不同範圍的組份。然而，細胞培養基配方比例和一致性保持相同。
CHO細胞培養基的最終製備 製備改良細胞培養基需要以特定次序添加各種組份，同時在特定時間使用鹼或酸調節pH值。隨著A部分基本濃度的增加，添加NaOH形式的鹼以輔助配方中胺基酸溶解至最大pH值10。隨著水解產物的添加，使用HCl形式的酸使pH值下降至最小值7.0。若需要，使用NaOH或HCl溶液完成至特定pH值的進一步調節。
以下實施例描述了基於上文用於各種特定抗體表達的細胞培養基。
實施例1.2用於培養表達抗-TNFα抗體的CHO細胞的細胞培養基 在表2所述的細胞培養基中培養表達抗TNFα的完全人類抗體(即阿達木單抗；D2E7)的CHO細胞株。
表2用於培養表達完全人抗-TNFα抗體的CHO細胞的細胞培養基
實施例1.3用於培養表達IL-12抗體的CHO細胞的培養基組合物 在表3所述的生長培養基中培養表達完全人類抗-IL-12抗體的CHO細胞系。
表3用於培養表達完全人類抗-IL12抗體(ABT-874)的CHO細胞培養基

參考上文，關於不含鹽並維生素減少的經修飾基礎培養基，維生素量相對於以上描述為RM-003的未經修飾基礎培養基，或相對於以上描述為RM-230的經修飾不含鹽基礎培養基減少了三分之一。因此，如上所述，維生素減少的基礎培養基具有RM-003和RM-230的三分之一的維生素量。當使用上表中所給出量時，培養基中維生素的終濃度與使用RM-003或RM-230相比降低至三分之一。然而，應注意如果需要的話則使用了RM-230的生產和補料培養基也可使用。
實施例1.4用於培養表達IL-18和EPO/R抗體的CHO細胞培養基組合物 表4提供了用以表達抗-LI-18和抗-EPO/R抗體的生長和生產培養基的概述。關於表達該類抗體的培養基的額外詳述可見於表5(抗-IL-18)和表6(抗-EPO/R)。
表4用於培養表達完全人類抗-IL-18和抗-EPO/R抗體的CHO細胞培養基
在生長培養基2xP(SR-371)中培養表達IL-18的CHO細胞系，且稍後在生產培養基3xP(SR-372)中生產抗體，最終滴度為大約1g/L。高滴度過程使用4xP(SR-382)作為生產培養基以達到約2g/L的終滴度。用於抗-EPO/R生產的生產培養基與SR-286相同，但將1xP培養基(SR-274)用於細胞生長。所有培養基均描述於表4和5中。
實施例1.5用於在哺乳動物細胞中生產抗體的細胞培養過程 將以上公開的培養基開發為兩個用於兩個培養哺乳動物(即CHO)細胞計劃的生產平臺。使用與如上表2-4中所述經修飾的生產培養基相似的(僅用於細胞培養的溫度有所不同)培養基組合物開發第一平臺。此平臺用於生產抗-IL-18抗體以及生產抗紅細胞生成素受體(抗EPO/R)。進一步強化營養組份的第二培養基平臺用於生產高滴度抗-IL-18，以達到更高的體積抗體生產率。
如先前所述，所有抗體(包括抗-IL-12、抗-IL-18和抗-EPO/R抗體)均為由經轉染dhfr(-)CHO細胞系表達的完全人類IgG1抗體。這些細胞系以懸浮狀態培養且不需牛來源血清或其他動物來源材料的幫助。
為生產抗-IL-18抗體，在生長培養基(本文中稱作SR-371)中培養表達抗-IL-18的CHO細胞系。培養基SR-371用於支持具有中等細胞生長的較高細胞生產率。一旦細胞密度達到轉移標準，則將細胞轉移至生產培養基(SR-372)中以起始生產階段。
表5抗-IL18過程A中培養基組成 生長培養基SR-371用於種子馴養(seed train)和種子反應器中。生產培養基SR-372用於3000升的生產生物反應器中。
在整個培養中將溫度維持在35℃。當細胞培養物葡萄糖水平低於2g/L時，添加額外4g/L的葡萄糖。
將類似過程用於抗-EPO/R抗體生產。然而，將貧養培養基(leanermedium)(SR-274)用於種子馴養中的細胞生長。將培養基SR-286(用於Humira生產的相同培養基)用於抗-EPO/R抗體的生產階段(表6)。生長培養基SR-274用於種子馴養和種子反應器中。生產培養基SR-286用於3000升的生產生物反應器中。
表6抗-EPO/R過程中培養基的組成 生長培養基SR-274用於旋轉燒瓶、Wave袋、100L種子生物反應器Z-4605和在3000L生產生物反應器Z-3600中初始階段的575L培養中。生產培養基SR-286僅用於3000L生產生物反應器Z-3600中。
生產培養基SR-286和SR-372由表5和6所列出的類似培養基組份組成，但含有不同水平的MTX(SR-286為0nM且SR-372為100nM)。
研發抗-IL18生產的改良過程以獲得較高生產率。這一新過程(過程B)引入延長細胞培養壽命並增加抗體體積生產率的新培養基。生產培養基(SR-382)在生產階段中使用的養分量不同於先前的生產培養基。SR-382的完全組成描述於表7中。在抗-IL18生產的新過程中，儘管在種子馴養期間仍在培養基SR-371中培養細胞，但培養基SR-372用於生產階段前一個步驟的種子生物反應器中。接著，在生產階段在培養基SR-382中培養細胞，將溫度從35℃轉變至33℃以延長細胞培養壽命，從而延長培養基SR-382對細胞的作用。
生長培養基SR-371用於旋轉燒瓶、Wave袋好100升種子生物反應器中。短程填充培養基(Short-fill medium)SR-372用於3000升生產生物反應器中的初始階段的575升培養中。生產培養基SR-382僅用於3000升生產生物反應器中。
表7抗-IL18過程B的培養基組成 富集該培養基中的養分以進一步提供CHO細胞生長和抗體生產的能量來源及構建組份。在過程B中，儘管在種子馴養期間仍在培養基SR-371中培養細胞，但培養基SR-372用於在生產階段前一個步驟的種子生物反應器中。接著，在生產階段於培養基SR-382中培養細胞，將溫度從35℃轉變至32℃以延長細胞培養壽命，從而延長培養基SR-382對細胞的作用。
過程A抗-IL18細胞和抗-EPO/R細胞在培養基SR-372和培養基SR-286中的性能 在培養基SR-371中培養表達抗-IL18的細胞，該培養基具有100nM MTX以累積用於生產階段的細胞質量。培養基SR-371用於支持具有中等細胞生長的較高細胞生產率。表8展示生產抗-IL18的CHO細胞在3000L生產生物反應器中的代表性生產生長概況。以培養基SR-372使用此過程(過程A)，可獲得高達1g/L的終滴度。
表8在培養基372中生產抗-IL18抗體(過程A) 將除MTX水平以外與培養基372共有相同配方的培養基286用於抗-EPO/R生產。儘管較低細胞密度通常在生產階段獲得，但通過使用培養基SR-286作為生產培養基來達到較高生產率使得細胞能夠以3000L規模生產高達1.8g/L的抗體。如表9所概述，觀測到合理細胞生長。實驗室規模結果和3000L運行結果證實該培養基可增加細胞單位生產率並觀測到高達1.9g/L的終滴度。這些結果表明具有類似配方的培養基(表1和2中的SR-372和SR-286)支持大規模CHO細胞培養中的優良細胞生長和高抗體生產率。
表9於培養基286中產生抗EPO/R抗體 過程B用培養基SR-382的過程B中抗-IL 18細胞的性能 培養基SR-382是用於抗-IL-18抗體生產的延長分批過程中的最富集培養基。過程B包括在生產階段或短程填充階段之前在種子馴養中使用培養基SR-371並在種子生物反應器中使用SR-372。細胞生長與生產階段培養基SR-372中的細胞生長相比為中等的。然而，由於溫度轉變，使用培養基SR-382獲得高達2.5g/L的終滴度。
基於表明表達抗-IL18細胞的細胞單位生產率隨著生產培養基中養分增加而成比例增加的研究來研發培養基SR-382。培養基SR-382為提供細胞生長與終滴度增加之間平衡的最佳培養基。儘管最大細胞密度僅達到每毫升5.9×106個細胞，但細胞單位生產率增加兩倍。與溫度轉變組合來延長細胞培養持續時間，如表10所示達到高達2.2g/L的終滴度。
表10在培養基SR-382中生產抗-IL18抗體(過程B) 實施例2用於表達抗體的改良分批補料方法和補料溶液 以分批模式運行的生物反應器的廢培養基分析表明特定胺基酸的耗竭。即使未經量測，但此發現也暗示其他培養基組份的耗竭，其可導致額外營養缺乏。為補償這些可能的缺乏，添加養分溶液。在工程設計領域中，該方法一般稱作分批補料。
就操作觀點而言，使用濃縮補料溶液是便利的。以下實施例描述添加化學成分確定的基礎培養基(PF CHO，目錄號67411-50L)和複合水解產物(例如酵母粉和植物蛋白腖)的高度濃縮溶液。經測定該對水解產物展現與其濃度比率相關的生產率增加協同效應。
實施例2.1阿達木單抗分批補料方法 初始阿達木單抗(Humira/D2E7)過程由3天過程組成，其中去除培養基並連續補充八次。通過用水解產物酵母粉替代培養基中的水解產物Primatone並通過使用新反應器參數來研發改良分批補料方法。改良分批補料方法持續大約12天。
通過再調配基礎培養基(PFCHO)並添加新水解產物(即植物蛋白腖)進一步改良初始分批過程的生產率。將含有培養基調配物的該水解產物用於以上稱作SR-286的方法中(參見表2)。也研究反應器操作參數，使可以鑑別運行整個阿達木單抗生產過程的最佳溫度。
每日從反應器實驗獲得的樣本分析突顯一些潛在的營養缺乏。對於阿達木單抗分批過程的情況而言，通過補入25x濃縮PFCHO溶液和水解產物酵母粉(yeastolate)及植物蛋白腖的33x溶液處理潛在的營養缺乏。水解產物為複合組份，其表現出與濃度比率相關的協同效應。將該比率維持在高度濃縮33x型中。
實驗計劃 實驗目標為比較新分批補料方法與兩種分批對照方法(溫度轉變37→33℃相對於恆定溫度35℃)。
分批補料修飾為 1.基於胺基酸缺乏補入25x基礎培養基富集(PFCHO溶液)。
2.以一定時間間隔補入33x水解產物富集溶液使得培養基滲透壓決不超過440mOsm(可引起細胞生長和生存力降低的條件)。
3.反應器溫度設定點始終為35℃。
此實驗的對照為 a)相同反應器以當前培養基(SR-286)並在對照分批方法參數(對照條件包括反應器以溫度轉變和線性pH斜坡運行SR-286培養基)下操作，命名為對照#1；及 b)相同反應器以當前培養基(SR-286)並在除操作溫度始終為35℃以外的所有當前分批方法參數下操作，命名為對照#2。
材料 工作體積為13L的Braun ED反應器； 使用Working Cell Bank WCB970513-6的中試工廠接種物(Pilot PlantInoculum)AFI915A； 3XP11Y7P基礎培養基溶液(SR-286)； 基礎培養基富集溶液(25x)(PF CHO溶液)； 水解產物富集溶液(33x)； 葡萄糖補料注射(feed shot)(200g/L)(葡萄糖溶液)； 用於控制pH的0.5N氫氧化鈉溶液。
溶液製備 1.生產培養基(參見上文表2中所述的SR-286溶液記錄) 2.2kg PFCHO富集溶液(25x)(基本富集溶液) 按照以下次序在恆定攪拌下並在各添加步驟後混合10分鐘製備

3.1Kg水解產物富集溶液(33x) 按照以下次序在恆定攪拌下並在各添加步驟後混合10分鐘製備
方法 反應器操作 為接種反應器，根據Humira種子馴養方法的描述使小瓶解凍並擴增。在反應器中生長後，抽排反應器至3.62L以刺激短程填充階段。接著，用生產培養基(SR-286)將反應器注滿至13L水平。
以下列參數操作反應器 a)攪拌70RPM； b)溫度35℃； c)pH值線性斜坡自pH 7.16起始，經72小時至pH 6.90； d)溶氧30％； e)當葡萄糖含量低於2.0g·L-1時，向反應器中補入195g 200g/L的葡萄糖溶液。
補入時間表 以下描述表示用於向阿達木單抗批料中添加額外養分(即補充基礎培養基)和水解產物的補入時間表 表11阿達木單抗分批補料方法的補入時間表
結果 比較對照方法#1和#2與改良分批補料方法的結果(以及預期改良)描述於表12和13中。如表12所示，在恆定溫度下使用改良分批補料方法，添加增強的富集基礎培養基和水解產物富集溶液增加阿達木單抗生產率。
表12比較阿達木單抗分批補料方法 表13使用阿達木單抗分批補料方法預期結果的比較 實施例2.2ABT-874分批補料方法 關於以上提及的阿達木單抗改良分批補料方法，每日從以分批模式運行ABT-874的反應器獲得的樣本的分析突出了胺基酸耗竭。同樣，通過使用25x PFCHO溶液和濃縮33x水解產物溶液解決該缺乏。
最初通過替代培養基中的水解產物並導入新的反應器參數為D2E7(阿達木單抗)研發ABT-874分批過程。此外，如D2E7(阿達木單抗)的情況，再調配基礎培養基並添加新的水解產物。將該培養基配方作為SR-286用於當前的D2E7方法中(參見上表2)。
實驗計劃 實驗目標為比較對照分批過程和以下分批補料條件，二者均從先前鑑別出胺基酸耗竭時起始 a)交替補入基礎培養基富集25x PFCHO和33x水解產物富集溶液； b)每日補入基礎培養基富集25x PFCHO和33x水解產物富集溶液。
該實驗的對照包括以當前培養基(SR-286)並在對照分批過程參數(SR-286培養基，具有溫度轉變和線性pH值斜坡)下操作的相同反應器。
材料 工作體積為13L的Braun ED反應器； Working Cell Bank W990107-J695； 3XP11Y7P基礎培養基溶液(SR-286-111899-1)； PFCHO-0-500-HG2Y生長培養基； 基礎培養基富集溶液(25x)； 水解產物富集溶液(33x)； 0.5N氫氧化鈉溶液。
溶液製備 1.生產培養基(參見SR-286溶液記錄) 2.25x PFCHO溶液(基礎富集溶液描述於先前實施例中；但使用462g葡萄糖溶液替代葡萄糖粉末，因此最終重量為2170g)。
注意每次添加1％初始體積的以上溶液將增加 a)與原始3x濃度相比，PFCHO濃度增加0.25x； b)天冬醯胺增加75mg·L-1； c)葡萄糖濃度增加2.1g·L-1； ·pH值增加約0.10個pH單位。
3.33x水解產物溶液(描述於先前實施例中，添加2.40g·L-1葡萄糖) 注意添加1％初始體積的以上溶液將增加 a)與原始分批濃度相比，TC酵母粉濃度增加2.65g/L(0.33x)。
b)與原始分批濃度相比，植物蛋白腖濃度增加1.65g/L(0.33x)。
方法 為接種反應器，根據ABT-874種子馴養方法的描述使小瓶解凍並擴增。在反應器中生長後，將反應器抽排至4.06升(如表13所述，運行名稱為B9013-ED2和B9014-ED3)以刺激短程填充。接著，用常規生產培養基(SR-286)將反應器注滿至13L水平。
根據以下參數操作反應器 a)攪拌70RPM； b)溫度33℃； c)pH 6.90； d)溶氧40％。
表13ABT-874的補入時間表
結果 比較改良分批補料方法的結果描述於下文表14和15中。
表14分批補料方法結果 表15分批補料方法結果 實施例3用於增加分批補料培養物的體積生產率的穩定組合補料溶液 以下實施例描述調配穩定高濃度補料溶液的新穎方法，該補料溶液包括兩種水解產物、至少一種除穀氨醯胺以外的胺基酸、糖和化學成分確定的培養基。所得補料溶液能夠增加生產重組蛋白的哺乳動物細胞系的體積生產。最後，提出基於葡萄糖濃度的反饋控制而研發的分批補料方法的加速方法。
材料和方法 組合補料含有水解產物細菌培養用TC酵母粉(RM-216)(BDDifco 255771)和植物蛋白腖(BD Difco 2922450)加葡萄糖、L-天冬醯胺一水合物(Sigma-Aldrich)、還原形式的DMEM/F12(去除NaCl、磷酸鹽、pH值指示劑和其他非必需組份；Invitrogen 12500)或Ex-CellPFCHO(A)-S1(經修飾的缺乏)w/o穀氨醯胺、w/o NaHCO(JRHBiosciences 67411-500L35470)。
為製備溶液，使用具有PMQ004D2過濾包的Millipore Milli-Q過濾水。使用實驗室電磁攪拌器將材料溶解在特定質量的水中。在添加各組份後，在併入下一組份前視覺驗證完全溶解。
當適用時，則使用HACH 2100P攜帶型濁度計(Hach Co.Loveland，CO)定量濁度。人眼偵測濁度的閾值約為15NTU(散射濁度單位)。
在1.5L的操作體積於3L Applikon生物反應器中進行生物反應器實驗，通過經由級聯空氣和氧氣流控制pH值、溫度、攪拌和氧。用Cedex(Innovatis AG，Bielefeld，Germany)進行細胞計數。使用YSI2700(YSI Inc.，Yellow Springs，OH)測定葡萄糖、乳酸鹽並在一些情況下也用Nova Bioprofile 400(Nova Biomedical Corp.，Waltham，MA)測定額外代謝物。使用ABL 5血液氣體分析儀(Radiometer A/S，Copenhagen，

Denmark)驗證氧(pO2)、二氧化碳(pCO2)的平衡分壓及pH值。
實施例3.1使用PFCHO作為基礎培養基製備穩定組合補料 單一高濃度補料可促進細胞培養分批補料生產，因為其降低所需添加物的體積和數量。然而，這是比較複雜的，因為PFCHO粉末必須在pH值大於9.00時溶解。此外，水解產物在中性pH值條件下為可溶的。因此，嘗試將兩種組份在中性或高pH值下簡單混合將會導致(非溶解)粉末混懸液。如文獻中所報導，″完全優化的補料通常以支持一種以上導入速率和補料pH值(例如由於溶解度的原因)的兩種或兩種以上分離溶液存在″[1]。
組合補料穩定性實驗 如下表所述，已確定添加水解產物可使PFCHO濃度在較長時間段保持穩定。依次向約700g水中添加組份，量為20g Kg-1PFCHO、7.5g Kg-1天冬醯胺、21g Kg-1葡萄糖、22g Kg-1酵母粉和14g Kg-1植物蛋白腖，且最後添加水以達到1Kg的最終重量。將溶液混合併接著用HCl 2.0N將其pH值降至目標pH值。在下表中，通過肉眼視覺觀測來測定濁度。
表16終pH值對不同組合補料配方的
由表16可知，最小濁度為2)和3)pH 6.75和7.25。注意，2)及3)即使在接近24小時後也不變混濁。基於這些結果，顯然由於達到低濁度，水解產物使溶液中的PFCHO穩定。
只要水解產物使所得混合物穩定，則可將植物蛋白腖和酵母粉於pH值10.0添加至PFCHO溶液中；接著使整個混合物降至目標pH值。此添加次序將去除尤其在混合較大體積時不穩定的使PFCHO溶液保持pH值8.0下的不穩定步驟。
為測試先前假設，我們用分別含有20和7.5g·Kg-1PFCHO和天冬醯胺配方測試該新的添加次序。將所得溶液X-1分開，且使其降至pH 7.0、6.75、6.5和6.25。如可從下圖中觀測，證明這些溶液是穩定的 表17.不同pH值時配方X-1的濁度概況(NTU)
三小時後，最少混濁溶液pH值為6.5。濁度明顯減少(尤其對於pH值7.0而言)是由於一些微粒沉降。
葡萄糖作為穩定劑 測試添加200g Kg-1葡萄糖作為穩定劑的配方(參見表18)。
表18.經稀釋的D2E7補料溶液

依次稱重並添加組份。應降低水的初始質量以達到1Kg最終質量。
如可從下表中觀測，證明該溶液在一定pH值範圍內穩定數小時 表19.組合補料濁度讀數(NTU)對時間和pH值的函數
使用包含葡萄糖的經修飾組合補料溶液表達兩種不同抗體，即阿達木單抗(D2E7)和抗-IL-18抗體ABT-325。
穩定D2E7產生的組合補料溶液 如果添加至生物反應器中的調配物體積是以最低濃度組份(即PFCHO)計算，則需要添加極大量補料來匹配已個別評估的量。因此，較高濃度為研發有效補料配方的下一步驟。該溶液稱作D2E7組合補料溶液並描述於下表中。
表20.D2E7組合補料溶液

依次稱重並添加組份。應降低水的初始質量以達到1Kg最終質量。
測試含有200、150和100g Kg-1葡萄糖的配方。如下表可見，這些溶液也具有數個小時內的穩定濁度。表21顯示添加葡萄糖會降低溶液濁度。
表21.作為葡萄糖濃度函數的D2E7組合補料溶液濁度時間曲線
如表21所示，提高葡萄糖水平會減低溶液濁度。基於濁度水平認為這些不同配方可為過濾實驗所接受。
穩定ABT-325生產的組合補料溶液 為獲得穩定ABT-325組合補料，根據用於D2E7組合補料的方法製備50L當前配方，如表22所示。
表22.ABT-325組合補料溶液

依次稱重並添加組份。應降低水的初始質量以達到1Kg最終質量。
如可從下表中觀測，在製備時，溶液維持大約20-30NTU的濁度水平 表23.ABT-325組合補料的濁度
根據D2E7方法製備50L ABT-325配方組合補料溶液以測試製備方法的可擴縮性和適用性。如上所示，溶液保持穩定四小時。
應注意，以上實施例中所提及的PF CHO培養基對應於實施例1的細胞培養基中所提及的經修飾PF CHO(經修飾A部分)。
實施例3.2使用DMEM-F12作為基礎培養基製備穩定組合補料 如先前實施例中所描述，可製造含有PFCHO和兩種水解產物以及葡萄糖的穩定組合補料溶液。以下實施例證實此方法可應用於任何基礎補料配方並產生穩定的組合補料溶液。
修飾DMEM-F12(一種可公開獲得的培養基配方)使其與組合補料製劑相容，此處命名為DMEM-F12m。去除以下組份NaCl、NaHCO3、NaH2PO4·H2O、Na2HPO4、D-葡萄糖、HEPES、Na·次黃嘌呤、酚紅、L-穀氨醯胺和胸苷。根據實施例3.0和3.1中所述方法製備與D2E7和ABT-325補料配方匹配的組合補料。最終組份和配方次序見下表 表24.DMEM-F12組合補料
依次稱重並添加組份以達到1Kg最終質量。
補料I及II在製備後可維持12NTU或更小的濁度4小時以上。
實施例3.3歸因於組合補料添加的細胞生長和生產率增強 為評估以上組合補料的生長和滴度促進特徵，使用ABT-874細胞(表達抗-IL-12完全人類IgG1抗體)。該CHO細胞系通常在細胞培養基SR-383(2X，具有500nM mtx)中培養。
對於這些實驗而言，將細胞傳代至DMEM/F12至少5代，直至經恆定生長速率觀測到適應。在35℃和5％CO2的恆溫箱中，在Thermolyne攪拌盤上以70rpm攪拌旋轉培養物。在接種之前即刻從維持培養物中獲取所需量的細胞懸浮液。將細胞離心，丟棄上清液並將沉澱重懸於新鮮、預溫的培養基中以獲得4×105/mL的接種密度。
將細胞培養物於旋轉器中擴增直至生成足以用於生物反應器接種的體積，以在1.5L Applikon生物反應器中達到1∶5的分流比。反應器運行條件為pH 6.9、35℃、150rpm且溶氧水平為40％飽和。所有生物反應器實驗均一式兩份。在運行過程中，每隔一天給予細胞三次初始反應器體積1％的組合補料快速注射。
使用兩種組合補料可極大地增強細胞培養物的生長。在CF I情況下，與對照物的13天相比，儘管培養僅持續10天，但達到雙倍峰值細胞密度。對於CF II情況，與對照物相比，峰值細胞密度幾乎為三倍，而培養的持續時間類似。就終滴度而言，觀測到更顯著的效應。DMEM/F12培養基的滴度大約為41mg/L，相比之下，CF I的為188，CF II的為434。不同補料溶液對最大細胞密度、培養時間、滴度和單位生產率的影響概述於下表中 表25.DMEM-F12m組合補料的性能
實施例3.4經由添加組合補料的高滴度細胞培養過程 較高滴度使得需要較少生產運行即可滿足給定總產量。以下實施例描述在分批補料方法中生產平均約4g/L滴度的ABT-874分批補料大規模過程。此外，培養基和組合補料的進一步改良使可達到超過6g/L的滴度水平。
材料和方法 使用ABT-874抗體產品線作為模型系統。
補料溶液製備 根據先前所述方法製備補料溶液。使用兩種天冬醯胺濃度，即5.0或7.5g·Kg-1。製備方法見下表 表26.ABT-874組合補料製備
稱重並添加組份以達到1Kg最終質量。
使用實驗室電磁攪拌器在強烈渦旋下將材料溶解於特定質量的水中。在添加各組份後，在併入下一組份之前視覺驗證完全溶解直至步驟5。然而，這對於步驟6和7是不可能的。對於這兩個步驟，認為將粉末併入溶液中足以進行至最終HCl添加。
過程培養基篩檢 為獲得基線性能資料，進行以3X分批補料(FB)3000L作為對照物，以原型4X FB方法和非補入(擴展分批EB)3X和4X條件為特徵的實驗。具體而言，已提出較高培養基濃度會在培養物生長過程中產生初始停滯；然而，擴展分批(EB)3X或4X方法未觀測到顯著停滯。
如預期，對於3X及4X方法而言，補料補充可產生較高滴度。然而，如果補料(即分批補料)，則觀測到4X方法的顯著生長抑制。小規模實驗的胺基酸分析顯示，即使在補料後仍存在胺基酸天冬醯胺和穀氨醯胺的完全耗竭。為此，增加總補料時間和組合補料中的天冬醯胺的量。總之，確定4X FB方法可能達到比EB方法或3X FB對照物更高的終滴度。因此，將其選為起始點以供進一步研發。
3X分批補料方法(對照物)與4X分批補料方法之間的差異描述於表27中並在下文中更詳細描述。
補入起始時的活細胞密度 已觀測到在極低細胞密度下起始補料傾向於抑制細胞生長並最終抑制終滴度。因此，預期由於細胞飢餓，過度延遲補料將引起體積生產率的損失。
為研究以上假設，進行若干實驗以確定於不同活細胞密度下補料的重要性。將這些實驗的組合結果繪於圖1描述的圖中。如圖1所見，第15日的滴度顯示出對補料起始日活細胞密度的強依賴性。對數據點的三級多項式擬合顯示在3.5×106個細胞·ml-1的補入密度下可預期第15日達到最大滴度。
重現性 6g·L-1方法的過程條件描述於下表27中並定義為從SR-383短程填充運行(pH 7.0，DO＝30％，37℃)1∶4分流直至5.0×106個活細胞/ml細胞密度的接種。反應器運行條件為pH 69、T＝35℃、DO＝40％。當細胞達到3.5×106個細胞/ml的活細胞密度時起始補料，持續10天，每天快速推注添加由初始反應器重量1％組成的組合補料，。
4g·L-1方法的過程條件描述於下表27中。
表27.4和6gL-1ABT-874細胞培養方法的要點

實施例3.5經由葡萄糖反饋控制使用組合補料的分批補料 反饋控制允許在對系統本質行為的理解非常有限的情況下靶向給定參數的設定點。以此方式，可維持標靶的設定點與系統可能經受的任何幹擾或改變均無關。由於哺乳動物細胞培養物代謝的複雜性，產生可允許預測培養給定軌跡的綜合模型需要大量工作。然而，需要研發能夠供應葡萄糖以維持目標葡萄糖水平的取樣方法(例如通過使用自動取樣)。這使得可以去偶化給定葡萄糖濃度(或其他代謝物)的效應並提供研究組合補料中不同比率葡萄糖對不同培養物的影響的方式。效應去偶化指維持所給定葡萄糖水平的效應，與之相對的是在組合補料中使用不同量葡萄糖的效應。
材料和方法 使用兩種不同抗IL-12抗體(ABT-874和1D4.7)的產品線作為模型系統。
選擇自動取樣(即YSI 2700 Bioprocess Analyzer)作為監控細胞培養基中葡萄糖含量的方式。通過將YSI 2730監控器和控制附件附連接至YSI 2700 Bioprocess Analyzer(參見YSI Life Sciences；YellowSprings，OH)上建立在線自動取樣裝置。該取樣裝置由固持兩個管的泵組成。第一個管具有兩條分支，一條收集來自生物反應器的樣本且第二條泵出消毒劑以維持無菌。樣本一經獲得，則將其泵入外室中，吸管(sipper)自外室中獲取樣本以供實際分析。使用縱穿泵的第二個管來收集進入廢料容器中的排出物。控制在線取樣附件的若干參數，例如取樣時間間隔和TPU(每單位誤差的時間，其對應於基於所測量的相對於設定點偏移的補入泵運行時間)。
使用15針連接器將泵連接至YSI。將對應於YSI中的葡萄糖探針(白色-7，黑色-11)的針連接至泵中的TTL開/關針(8)，並將來自YSI(1-5)之一接地針之一連接至泵的15針連接器的底盤。通過由YSI設定菜單將泵打開和關閉來測試連接。所使用的泵管為MasterflexCFLEX 082。
表28反饋初始實驗設定 將YSI1-A25反應器控制於4.9g/L葡萄糖。4.9g/L的葡萄糖控制起始於第2日，使用4小時的取樣時間間隔直至第8日。在第8日，將取樣時間間隔降低至2小時，並再次設置YSI自動裝置設定點以抹去PID記憶。由相對於設定點的突增引起的波動在第8日顯著降低。因此，確定2小時的取樣時間間隔對於這些條件而言為最佳的。第2日至第8日的平均突增為0.43g/L且平均負向尖峰為0.31g/L，其中相對於設定點的波動誤差為約8％。另一方面，第8日至第13日的平均突增為0.08g/L且平均負向尖峰為0.09g/L，其中波動誤差為約2％。
使用組合補料控制葡萄糖濃度 經由經驗方法定義向生物反應器中的培養物中補入組合補料溶液的時間表。測試不同補入量以及不同補入時間，直至發現可行的分批補料方案。理想地，組合補料的補入時間表應滿足給定培養物的特定要求。
鑑於以上考慮，基於細胞培養物需要，例如通過使用葡萄糖作為營養要求指示劑來提供組合補料是有利的。以此方式，反饋控制系統可用以1)測試具不同葡萄糖濃度的不同補料；和2)使用所生成的補料概況在較大規模培養中進行人工補料。
下表概述了使用生產1D4.7mAb的細胞系的兩種不同的反應器操作模式。參考實驗(表29中稱作基線)說明在1.5L Applikon生物反應器中在pH 6.9、T＝35℃、DO＝40％下運行的SR-372培養基中的擴展分批過程的典型滴度性能。在相同條件加上反饋控制下運行YSI實驗以供應含有100、150或200g·L-1葡萄糖的組合補料。
表29.使用組合補料的反饋控制性能 表29中可見，使用各種組合補料的反饋系統極大地改良了抗體的終滴度。
通過稱重每天供應的組合補料的量獲得來自實驗(如先前實驗)的補料概況。典型補料概況見下表 表30.由反饋控制生成的典型補料曲線(1D4.7抗體的曲線) 即使在無反饋控制系統的情況下也可手動進行以上流程以向反應器補料。通過這一方式可成比例增加補料時程。
結果概述 已顯示利用水解產物和化學成分確定的基礎培養基的混合物的分批補料方法可增加哺乳動物細胞培養物中所分泌的mAb的最終滴度。
此外，也證實了能夠生產以下穩定組合補料的方法 表31.穩定組合補料

描述於表31中的組合補料用MilliQH2O起始(高達750g)製成。如上所述，將成份添加至水中至1000g的最終重量(組合補料的總重量)。此外，也顯示組合補料溶液可增加細胞培養物壽命、活細胞密度峰值和單位生產率。證實使用組合補料的細胞培養物分批補料方法能夠達到所分泌單克隆抗體的高達6g·L-1的滴度水平。也顯示以上組合補料可增加細胞培養物的細胞密度。
最後，也顯示了採用反饋控制系統和不同組合補料的方法能夠增加滴度水平。該方法可用以通過快速生成補料時間表而加速細胞培養方法的進展。
參考文獻 1.Whitford，W.G，Fed-Batch Mammalian Cell Culture in Bioproduction.BioProcess International，2006.30-40。
2.YSI Incorporated.(1998)YSI 2700 Select Biochemistry AnalyzerUser′s Manual。
3.YSI Incorporated.(1998)YSI 2730 Monitor and Control AccessoryUser′s Manual。
4.Watson Marlow Pumps.101F，101U User′s Manual。
實施例4應用丁酸鈉和N-乙醯半胱氨酸以增加生產抗IL-18的CHO細胞系的生產率 本發明涵蓋一種增加生產抗體(例如抗IL-18)的CHO細胞系的生產率的新穎方法。更具體而言，以下實施例涉及通過向細胞培養基中添加化學物質來增加最終抗體(例如抗IL-18)滴度。下文使用示例性抗體即IL-18抗體描述細胞活力和抗體滴度的改良。
細胞系和培養基 用於以下實施例的抗IL-18抗體為IL-18的完全人類IgG1抗體(Ab)。在以上實施例1的表4中所述的生長培養基SR-371中培養表達抗IL-18的CHO細胞系。細胞系的生產培養基也描述於以上實施例1中，即SR-372(用於旋轉燒瓶中的培養)和SR-382(用於生物反應器中的培養)。
在旋轉燒瓶中進行的實驗的培養條件 所有旋轉燒瓶實驗均執行一式兩份。在35℃和5％CO2的恆溫箱中，在Thermolyne攪拌盤上以80rpm攪拌旋轉培養物。在接種之前即刻從維持培養物中獲取所需量的細胞混懸液。將細胞離心，丟棄上清液並將沉澱重懸於新鮮、預溫的培養基中以獲得4×105/mL的接種密度。
實施例4.1丁酸鈉對在生長培養基中培養的生產抗IL-18的CHO細胞系的生長和生產率的影響 為測定丁酸鈉的濃度範圍，在含有各種濃度丁酸鈉的SR-371中進行第一實驗。實驗在具有70mL工作體積的100mL旋轉燒瓶中進行。從通過將1.101g丁酸鈉溶解於10mL MilliQ水中並經0.2μm過濾器過濾滅菌而製備的1M儲備溶液添加丁酸鈉。將溶液儲存在-20℃下。
在培養開始時(第0天)，以0mM、0.125mM、0.5mM和1mM的濃度添加丁酸鈉。在該實施例及以下所有實施例中，用自動細胞計數器(Cedex，Innovatis，Germany)測定細胞密度和活力。表32顯示了培養期間的活細胞密度，表33描述了培養期間的活力。實驗進行12天。
表32培養期間的活細胞密度 活細胞密度[105/ml] 表33培養期間的活力 活力[％] 顯而易見，丁酸鈉影響細胞生長和活力。儘管在0.125mM的丁酸鹽濃度時對細胞生長和生存力並無明顯影響，但0.5mM丁酸鹽對細胞生長存在明顯影響，導致較低的最大細胞密度。0.5mM丁酸鈉在5天培養時間後影響活力。1mM濃度的丁酸鈉完全抑制細胞生長，且活力自第0天起持續降低。
表34顯示了培養期間的抗IL-18滴度。在該實施例及以下所有實施例中，通過Poros A HPLC測定法來測定抗IL-18濃度。
滴度[mg/L] 表34(上表)培養期間的抗IL-18滴度 含有0.125mM丁酸鹽的培養物的平均最終滴度為352mg/L，未經處理對照物的平均最終滴度為257mg/L。在該濃度經丁酸鹽處理可使最終滴度增加40％。
實施例4.2丁酸鈉對在SR-372中培養的生產抗IL-18的CHO細胞系的生長和生產率的影響 表達抗IL-18的CHO細胞系適合在SR-372中生長以排除培養物從SR-371分流至SR-372的任何可能效應。用適合在SR-372中生長的細胞進行的所有實驗均在具有180mL工作體積的250mL旋轉燒瓶中進行。應用上述在標題為″在旋轉燒瓶中進行的實驗的培養條件″的章節列出的條件進行培養。
設計實驗以在細胞處於對數生長期的中期和後期添加丁酸鹽。因為每個細胞的丁酸鹽濃度較低，所以稍後添加丁酸鹽與在第0日添加相比可能引起對細胞的較低應力並產生改良的細胞生長和較高的IVC(IVC(活細胞積分)定義為相對於培養時間的活細胞密度的積分)。在第4日和第5日添加0.5mM和2mM濃度的丁酸鹽。將實驗進行12天。表4顯示了培養期間的活細胞密度，表5為培養期間的活力。第4日僅添加2mM丁酸鈉會導致活力與對照物相比有所降低，其他條件不影響活力。
表35培養期間的活細胞密度 活細胞密度[105/mL] 表36培養期間的活力 活力[％] 表37揭示了培養期間的抗IL-18滴度。在第5日添加2mM丁酸鈉導致與對照相比增加29％(分別為317mg/L對245mg/L)。細胞生長在這些條件下並未受到顯著抑制(參見表35)。
滴度[mg/L] 表37(上表)培養期間的抗IL-18滴度 實施例4.3丁酸鈉對在3L生物反應器中的SR-382中培養的生產抗IL-18的CHO細胞系的生長和生產率的影響 以下實施例證實通過將丁酸鈉應用於大規模(即3L生物反應器)抗IL-18過程B(參見章節1.5)會導致最終抗-IL-18滴度增加。此過程在3L Applikon生物反應器中進行。種子馴養在SR-371中進行直至短程填充階段(SR-372)。在具有10L工作體積的20L Biowave袋中刺激短程填充階段。研究丁酸鈉對抗IL-18過程B的生長和生產率的影響的實驗在具有1.5L工作體積的3LApplikon生物反應器中進行。以1125mL SR-382填充各生物反應器並通過添加375mL來自含有SR-372中的抗IL-18細胞的Biowave袋的細胞懸浮液而接種。
在實施例4.2中，通過在細胞處於中間至後對數生長期時(其為旋轉燒瓶中的第5日)添加丁酸鹽來達到滴度增加。之前，3L生物反應器中抗IL-18產生過程的中間至後對數生長期為培養時間的第7日。在該實施例中，選擇第7日向培養物中添加丁酸鈉，以確保在中間至後對數生長期中添加丁酸鹽。
在第7日在添加至培養物中之前即刻通過將4.404g丁酸鈉溶解於200mL MilliQ水中而製備200mM濃度的丁酸鈉儲備溶液。經由0.22μm過濾器過濾對該溶液進行滅菌。
用5個生物反應器進行實驗。在各自活力低於50％時終止各生物反應器運行。將兩個生物反應器用作對照(抗IL-18過程B)。在培養時間的第7日將濃度分別為0.3mM、1mM和3mM的丁酸鈉添加至其他3個生物反應器中。表38顯示了培養期間的活細胞濃度，表39顯示了培養期間的活力。
活細胞密度[105/ml] 表38(上表)培養期間的活細胞密度 活力[％] 表39(上表)培養期間的活力 由於反應器5中的高初始CO2濃度，對照培養物在反應器5中的生長慢於複製物(反應器2)中的生長。在培養時間的第16日終止反應器2(先前在抗IL-18生產過程中所觀測)，在第17日終止反應器5。3mM濃度的丁酸鈉(反應器4)影響細胞生長和活力。丁酸鹽添加後兩天細胞開始死亡。1mM丁酸鹽不影響細胞生長和活力(反應器1)，第16日終止反應器運行。細胞生長與反應器2中的對照物相比非常類似。0.3mM的丁酸鹽使培養時間延長2天(反應器3)。表40顯示了培養期間的抗IL-18滴度。
滴度[mg/L] 表40(上表)培養期間的抗IL-18滴度 反應器2(代表抗IL-18過程B)中培養物的最終滴度(第16日)為2325g/L。反應器5中的最終滴度為1589g/L。該較低的滴度可能是由於由培養基中的高初始CO2濃度引起的較差細胞生長。在第7日添加1mM和3mM丁酸鹽產生比對照物(反應器2)低的最終滴度。在第7日添加0.3mM丁酸鹽會在第17日產生2561g/L的滴度，其與對照物相比增加10％。該滴度為在抗IL-18過程中達到的最高滴度。
實施例4.4N-乙醯半胱氨酸(10mM、20mM、40mM、80mM)對在SR-372中培養的生產抗IL-18的CHO細胞系的生長和生產率的影響 N-乙醯半胱氨酸可保護哺乳動物細胞免於細胞死亡。作為抗氧化劑，其可直接還原活性氧中間體。通過去乙醯基作用，可將其轉化為半胱氨酸並增加細胞內穀胱甘肽水平。穀胱甘肽可清除活性氧中間體並在將過氧化氫還原為水時充當底物。
該實施例證實N-乙醯半胱氨酸的抗IL-18滴度增加效應。實驗在具有180mL工作體積的250mL旋轉燒瓶中進行。培養基為SR-372。在實驗之前，如實施例4.2中所述使細胞預適應在SR-372中生長。如以上″在旋轉燒瓶中進行的實驗的培養條件″中所述應用旋轉培養條件。
通過在加熱攪拌盤上將16.32g N-乙醯半胱氨酸溶解於100mLMilliQ水中來製備1M N-乙醯半胱氨酸儲備溶液。藉由經0.22μm過濾器過濾對儲備溶液進行滅菌。在實驗開始前一天，將N-乙醯半胱氨酸添加至SR-372中以獲得0mM、10mM、20mM、40mM及80mM的濃度。如以上″在旋轉燒瓶中進行的實驗的培養條件″所述，通過將細胞自CHO抗IL-18維持培養物中離心起始實驗。當各自活力低於50％時終止各旋轉培養。
N-乙醯半胱氨酸濃度為20mM、40mM和80mM時細胞不可能生長。表41和表42分別顯示了在0mM N-乙醯半胱氨酸及10mM N-半胱氨酸中細胞生長的培養期間活細胞密度和活力的比較。
活細胞密度[105/mL] 表41(上表)培養期間的活細胞密度 活力[％] 表42(上表)培養期間的活力 在培養時間的第11日終止對照培養(無N-乙醯半胱氨酸)，而以10mM N-乙醯半胱氨酸進行的培養可延長直至第16日。最初，10mMN-乙醯半胱氨酸會影響細胞生長和活力並且導致活力降低直至第3日。接著，活力開始增加。在10mM N-乙醯半胱氨酸中生長的培養物的最大細胞密度與對照物相比較低。表43證實最終抗-IL-18滴度藉由N-乙醯半胱氨酸而增加。
滴度[mg/L] 表43(上表)培養期間的抗IL-18滴度 對照培養物的平均最終滴度為243.2mg/L，在10mM N-乙醯半胱氨酸中生長的培養物的平均最終滴度為418mg/L。其與對照物相比增加72％。
實施例4.5N-乙醯半胱氨酸(1mM、2mM、4mM、8mM)對在SR-372中培養的生產抗-IL-18的CHO細胞系的生長和生產率的影響 如實施例4.4中所述，在第0日添加濃度為10mM的N-乙醯半胱氨酸可延長培養時間並使最滴度增加。然而，在該濃度下，細胞活力最初會降低。基於實施例4.4的結果，使用實施例4.4中所測試的N-乙醯半胱氨酸濃度的十分之一設計實驗。該旋轉燒瓶實驗的條件與實施例4.4中相同。添加0mM(對照物)、1mM、2mM、4mM和8mM濃度的N-乙醯半胱氨酸。
表44顯示培養期間的活細胞密度，表45顯示培養期間的活力。
表44(上表)培養期間的活細胞密度 表45(上表)培養期間的活力 在10天培養時間後終止對照培養(0mM N-乙醯半胱氨酸)。N-乙醯半胱氨酸可延長培養物的壽命。在14天培養後終止在8mM N-乙醯半胱氨酸中生長的培養物。在N-乙醯半胱氨酸中生長的培養物與對照物相比具有較低的最大細胞密度。
表46顯示N-乙醯半胱氨酸對最終抗-IL-18滴度的影響。
滴度[mg/L] 表46(上表)培養期間的抗-IL-18滴度 對照培養物的平均最終抗-IL-18滴度為245mg/L(與實施例4.4中的243mg/L非常類似)。在8mM N-乙醯半胱氨酸中生長的培養物的最終抗-IL-18滴度為481mg/L。其與對照物相比增加了96％。
等效物 本領域技術人員將認識到或能夠僅使用常規實驗來辨識本文所述本發明特定實施方案的許多等效物。該類等效物意欲涵蓋於以下權利要求中。本申請案全文中所引用的所有參考文獻、專利和公開專利申請案的內容以引用的方式並於本文。
權利要求
1.包含A部分、B部分和C部分的無血清細胞培養基，其中
a)A部分基本由排除下列組份的經修飾基礎培養基組成碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；
b)B部分基本由無機鐵來源組成；及
c)C部分包含重組生長因子；緩衝劑；滲透壓調節劑；能量來源；及至少兩種不同的非動物源水解產物。
2.權利要求1的細胞培養基，其中A部分進一步包含非鐵金屬離子、維生素或兩者的組合。
3.權利要求1的細胞培養基，其中B部分的無機鐵來源為檸檬酸鐵。
4.權利要求3的細胞培養基，其包含約122.5mg/L或0.5mM終溶液濃度的檸檬酸鐵。
5.權利要求1的細胞培養基，其中C部分的重組生長因子選自胰島素或重組類似物、IGF-1、和胰島素與IGF-1的組合。
6.權利要求5的細胞培養基，其包含約4mg/L至13mg/L的胰島素或其重組類似物。
7.權利要求1的細胞培養基，其中所述經修飾的基礎培養基中所排除的緩衝劑為HEPES緩衝劑。
8.權利要求1的細胞培養基，其中C部分的緩衝劑包含磷酸鹽緩衝劑、HEPES和碳酸氫鈉。
9.權利要求8的細胞培養基，其包含約1.6g/L碳酸氫鈉。
10.權利要求8的細胞培養基，其包含約1.8g/L HEPES。
11.權利要求8的細胞培養基，其中所述磷酸鹽緩衝劑包含約0.01至0.5g/L的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉。
12.權利要求1的細胞培養基，其中C部分進一步包含天冬醯胺、穀氨醯胺、或穀氨醯胺和天冬醯胺。
13.權利要求1的細胞培養基，其中C部分的滲透壓調節劑為NaCl。
14.權利要求13的細胞培養基，其包含約1.0至6.5g/L NaCl。
15.權利要求1的細胞培養基，其中C部分的能量來源為單糖。
16.權利要求15的細胞培養基，其中所述單糖選自葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。
17.權利要求16的細胞培養基，其中所述葡萄糖為D-葡萄糖。
18.權利要求17的細胞培養基，其包含至多約7.0g/L葡萄糖。
19.權利要求1的細胞培養基，其中C部分的至少兩種不同的非動物源水解產物為植物源水解產物和既非動物源也非植物源的水解產物。
20.權利要求19的細胞培養基，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
21.權利要求19的細胞培養基，其中所述既非動物源也非植物源的水解產物為酵母源水解產物。
22.權利要求1-21中任一項的細胞培養基，其進一步包含甲氨喋呤。
23.權利要求22的細胞培養基，其包含約100nM至5000nM甲氨喋呤。
24.權利要求1-21中任一項的細胞培養基，其進一步包含細胞保護劑或表面活性劑。
25.權利要求24的細胞培養基，其中所述表面活性劑為甲基纖維素或pluronic多元醇。
26.權利要求25的細胞培養基，其中所述pluronic多元醇為Pluronic F-68。
27.權利要求26的細胞培養基，其包含約1.0g/L Pluronic F-68。
28.權利要求1-21中任一項的細胞培養基，其進一步包含L-穀氨醯胺。
29.權利要求1-21中任一項的細胞培養基，其中pH在7.1至7.3的範圍內。
30.權利要求1-21中任一項的細胞培養基，其中滲透壓在320至450mOsm/kg的範圍內。
31.一種用於生產蛋白的方法，其包含在權利要求1-21中任一項的細胞培養基中培養哺乳動物細胞。
32.權利要求31的方法，其中所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
33.權利要求31或32的方法，其中所述蛋白為抗體。
34.權利要求33的方法，其中所述抗體選自抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體和抗-EPO受體(EPO-R)抗體。
35.一種無血清細胞培養基，其包含
a)基礎培養基；
b)約8-12ml/kg或116-126mg/L檸檬酸鐵；
c)約2-6mg/kg重組人胰島素；
d)約2-5g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1-0.5g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1-3g/kg碳酸氫鈉；
g)約0.01-0.05g/kg NaH2PO4·H2O；
h)約0.4-0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；及
i)約1.0-3.0g/kg酵母源水解產物。
36.權利要求35的細胞培養基，其包含
a)基礎培養基；
b)約10.0ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；
c)約4.0mg/kg重組人胰島素；
d)約3.5g/kg無水葡萄糖；
e)約0.29g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
g)約0.03g/kg NaH2PO4·H2O；
h)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；及
i)約2.0g/kg酵母源水解產物。
37.權利要求35或36的細胞培養基，其進一步包含約2.50mL/mg甲氨喋呤。
38.一種用於產生蛋白的方法，其包含
a)在權利要求35或36的培養基中培養包含編碼該蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及
b)將(a)的培養物轉移至細胞培養生產培養基中，
以生產所述蛋白。
39.權利要求38的方法，其進一步包含自所述細胞培養生產培養基分離所述蛋白。
40.權利要求38的方法，其中所述蛋白為抗體。
41.權利要求40的方法，其中所述抗體為D2E7(阿達木單抗)。
42.一種無血清細胞培養生產培養基，其包含
a)排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；
b)約8至12ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
c)約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.5至0.7g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至2g/kg碳酸氫鈉；
g)約1至2g/kg HEPES；
h)約2至3g/kg NaCl；
i)約0.5至2g/kg Pluronic F-68；
j)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.4至0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約8至12g/kg酵母源水解產物；及
m)約60至70g/kg植物源水解產物。
43.權利要求42的細胞培養生產培養基，其中所述細胞培養基包含
a)約10.0ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
f)約1.8g/kg HEPES；
g)約2.4至2.5g/kg NaCl；
h)約1.0g/kg Pluronic F-68；
i)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
j)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
k)約10.7g/kg酵母源水解產物；及
l)約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
44.權利要求42或43的細胞培養生產培養基，其具有約7.10至7.20的pH。
45.權利要求42或43的細胞培養生產培養基，其具有約373至403mOsm/kg的滲透壓。
46.一種無血清細胞培養基，其包含
a)排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；
b)約8至12ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
c)約3至5mL/kg或6至8mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1至2g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至2g/kg碳酸氫鈉；
g)約1至2g/kg HEPES；
h)約2至3g/kg NaCl；
i)約0.1至2g/kg Pluronic F-68；
j)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.4至0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約0.4至0.5g/kg L-天冬醯胺一水合物；
m)約2至6g/kg酵母源水解產物；及
n)約2至4g/kg植物源水解產物。
47.權利要求46的細胞培養基，其中該細胞培養基包含
a)約10.0ml/kg或122.45mg/kg檸檬酸鐵；
b)約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.8至0.9g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
f)約1.8g/kg HEPES；
g)約2.6至2.7g/kg NaCl；
h)約1.0g/kg Pluronic F-68；
i)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
j)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
k)約0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；
l)約4.0g/kg酵母源水解產物；及
m)約2.6g/kg植物源水解產物。
48.權利要求42-27中任一項的細胞培養基，其進一步包含約2.50mL/kg甲氨喋呤。
49.一種用於生產蛋白的方法，其包含在權利要求42-47中任一項的細胞培養基中培養包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞。
50.權利要求49的方法，其中所述哺乳動物細胞為CHO細胞。
51.權利要求49的方法，其中所述蛋白為抗體。
52.權利要求51的方法，其中所述抗體為抗-TNFα抗體或抗-EPO-R抗體。
53.權利要求52的方法，其中所述抗-TNFα抗體為完全人類抗-TNFα抗體。
54.權利要求53的方法，其中所述完全人類抗-TNFα抗體為D2E7(阿達木單抗)。
55.一種無血清細胞培養基，其包含
a)排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；
b)約8至10ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約3至5mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.8至0.9g/kg L-穀氨醯胺；
f)約0.3至0.5g/kg L-天冬醯胺一水合物；
g)約1至2g/kg碳酸氫鈉；
h)約1至2g/kg HEPES；
i)約2至3g/kg NaCl；
j)約0.5至2g/kg Pluronic F-68；
k)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
l)約0.1至1.0g/kg Na2HPO4·7H2O；
m)約2至6g/kg酵母源水解產物；及
n)約2至4g/kg植物源水解產物。
56.權利要求55的細胞培養基，其包含
a)約10ml/kg或122mg/L檸檬酸鐵；
b)約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.87至0.88g/kg L-穀氨醯胺；
e)約0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；
f)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
g)約1.8g/kg HEPES；
h)約2.67至2.68g/kgNaCl；
i)約1.0g/kg Pluronic F-68；
j)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約4.0g/kg酵母源水解產物；及
m)約2.6g/kg植物源水解產物。
57.權利要求55或56的細胞培養基，其進一步包含甲氨喋呤。
58.一種無血清細胞培養基，其包含
a)基礎細胞生長培養基；
b)約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約2至6mg/kg重組人胰島素；
d)約150至250g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1至0.5g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至2g/kg碳酸氫鈉；及
g)約5至15g/kg酵母源水解產物。
59.權利要求58的細胞培養基，其包含
a)約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約4mg/kg重組人胰島素；
c)約200g/kg無水葡萄糖；
d)約0.29至0.30g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；及
f)約11g/kg酵母源水解產物。
60.權利要求58或59的細胞培養基，其進一步包含甲氨喋呤。
61.一種用於產生蛋白的方法，其包含在權利要求55-60中任一項的細胞培養基中培養包含編碼所述蛋白的核酸的哺乳動物細胞。
62.權利要求61的方法，其中所述蛋白為抗體。
63.權利要求62的方法，其中所述哺乳動物細胞為CHO細胞。
64.權利要求63的方法，其中所述核酸編碼完全人類抗-IL-12抗體。
65.權利要求64的方法，其中所述完全人類抗-IL-12抗體為ABT-874。
66.一種無血清細胞培養基，其包含
a)基礎細胞生長培養基；
b)約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約2至6mg/kg重組人胰島素；
d)約1至3g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至2g/kg碳酸氫鈉；及
g)約1至4g/kg酵母源水解產物。
67.權利要求66的細胞培養基，其包含
a)約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約4mg/kg重組人胰島素；
c)約1.5g/kg無水葡萄糖；
d)約0.29至0.30g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；及
f)約2g/kg酵母源水解產物。
68.權利要求66或67的細胞培養基，其進一步包含甲氨喋呤。
69.權利要求66或67的細胞培養基，其具有約7.10至7.30的pH。
70.權利要求66或67的細胞培養基，其具有約300至340mOsm/kg的滲透壓。
71.權利要求66或67的細胞培養基，其包含至少8g/kg酵母源水解產物。
72.一種用於生產蛋白的方法，其包含在權利要求62-65中任一項的細胞培養基中培養包含編碼所述抗體的核酸的哺乳動物細胞。
73.權利要求72的方法，其中所述蛋白為抗體。
74.權利要求72的方法，其中所述哺乳動物細胞為CHO細胞。
75.權利要求72的方法，其中所述核酸編碼抗-IL-12抗體或抗-EPO-R抗體。
76.權利要求75的方法，其中所述完全人類抗-IL-12抗體為ABT-874。
77.一種細胞培養基，其包含
a)排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；
b)約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約2.5至4.5mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.5至1g/kg L-穀氨醯胺；
f)約0.1至1g/kg L-天冬醯胺一水合物；
g)約1至2g/kg碳酸氫鈉；
h)約1至2g/kg HEPES；
i)約1至4g/kg NaCl；
j)約0.1至2g/kg Pluronic F-68；
k)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
l)約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；
m)約2至6g/kg酵母源水解產物；及
n)約2至6g/kg植物源水解產物。
78.權利要求77的細胞培養基，其包含
a)約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.87至0.88g/kg L-穀氨醯胺；
e)約0.45g/kg L-天冬醯胺一水合物；
f)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
g)約1.8g/kg HEPES；
h)約2.67g/kg NaCl；
i)約1.0g/kg Pluronic F-68；
j)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約4.0g/kg酵母源水解產物；及
m)約2.6g/kg植物源水解產物。
79.權利要求77或78的細胞培養基，其具有約7.10至7.20的pH。
80.權利要求77或78的細胞培養基，其具有約373至403mOsm/kg的滲透壓。
81.一種細胞培養生產培養基，其包含
a)經修飾的基礎培養基，其經修飾以去除下列組份碳酸氫鈉、HEPES緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；
b)約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至2g/kg碳酸氫鈉；
g)約1至2g/kg HEPES；
h)約1至3g/kg NaCl；
i)約0.5至2g/kg Pluronic F-68；
j)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約8至12g/kg酵母源水解產物；及
m)約6至8g/kg植物源水解產物。
82.權利要求81的細胞培養生產培養基，其包含
a)約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
f)約1.8g/kg HEPES；
g)約2.45g/kg NaCl；
h)約1.0g/kg Pluronic F-68；
i)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
j)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
k)約10.7g/kg酵母源水解產物；及
l)約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
83.權利要求80或81的細胞培養生產培養基，其具有約7.10至7.20的pH。
84.權利要求80或81的細胞培養生產培養基，其具有約373至403mOsm/kg的滲透壓。
85.一種細胞培養生產培養基，其包含
a)排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；
b)約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約4至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至2g/kg碳酸氫鈉；
g)約1至2g/kg HEPES；
h)約1至3g/kg NaCl；
i)約0.1至2g/kg Pluronic F-68；
j)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約12至16g/kg酵母源水解產物；及
m)約8至10g/kg植物源水解產物。
86.權利要求85的細胞培養生產培養基，其包含
a)約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
f)約1.8g/kg HEPES；
g)約2.45g/kg NaCl；
h)約1.0g/kg Pluronic F-68；
i)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
j)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
k)約14.2至14.3g/kg酵母源水解產物；及
l)約9.2至9.3g/kg植物源水解產物。
87.權利要求81-86中任一項的細胞培養生產培養基，其進一步包含甲氨喋呤。
88.一種用於產生抗體的方法，其包含在權利要求81-86中任一項的細胞培養生產培養基中培養包含編碼所述抗體的核酸的哺乳動物細胞。
89.權利要求88的方法，其中所述哺乳動物細胞為CHO細胞。
90.權利要求88的方法，其中所述核酸編碼抗-IL-18抗體。
91.權利要求35、36、42、43、46、47、55、56、77、78、81、82、85或86中任一項的細胞培養基，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
92.權利要求1-30、35-37、42-48、55-60、66-71及81-87中任一項的細胞培養基中的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
93.一種用於生產蛋白的分批補料方法，其包含
a)在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼所述蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及
b)通過在一時段內向所述細胞培養物中添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液對哺乳動物細胞補料，
其中所述水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物，
以產生所述蛋白。
94.權利要求93的方法，其中所述基礎富集溶液包含濃縮的基礎培養基。
95.權利要求93的方法，其中所述基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖。
96.權利要求94或95的方法，其中所述基礎培養基為PF CHO。
97.權利要求93-96中任一項的方法，其中所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
98.權利要求93-96中任一項的方法，其中所述蛋白為抗體。
99.權利要求98的方法，其中所述抗體選自抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體和抗-EPO受體(EPO-R)抗體。
100.權利要求93-96中任一項的方法，其中所述水解產物富集溶液包含非衍生自植物或動物的第一水解產物和第二植物源水解產物。
101.權利要求100的方法，其中所述非衍生自植物或動物和植物源的水解產物為酵母源水解產物。
102.權利要求101的方法，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
103.一種用於生產抗-TNFα抗體的分批補料方法，其包含
a)在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼該抗-TNFα抗體的核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；及
b)通過在一時段內向所述細胞培養物中添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液對CHO細胞補料，
其中所述基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖，且
其中所述水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物，
以產生該抗-TNFα抗體。
104.一種用於生產抗-TNFα抗體的分批補料方法，其包含
a)在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼該抗-TNFα抗體的核酸的CHO細胞，所述細胞培養生產培養基包含至少2.0g/L葡萄糖，其中如需要通過向所述細胞培養生產培養基中添加葡萄糖以維持至少2.0g/L的葡萄糖濃度來控制葡萄糖濃度；及
b)通過在一時段內向所述細胞培養物中添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液對CHO細胞補料，
其中所述基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖，且
其中所述水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物，
以產生該抗-TNFα抗體。
105.權利要求103或104的方法，其進一步包含回收所述抗-TNFα抗體。
106.權利要求103或104的方法，其中在約32至38℃範圍內的溫度培養所述細胞培養物。
107.權利要求106的方法，其中所述培養溫度為約35℃。
108.權利要求103或104的方法，其中所述細胞培養生產培養基的溶氧維持在20至65％之間。
109.權利要求108的方法，其中所述細胞培養生產培養基的溶氧維持在約30％。
110.權利要求103或104的方法，其中在整個培養期間維持所述細胞培養生產培養基的滲透壓不超過500mOsm。
111.權利要求103或104的方法，其中所述水解產物富集溶液包含非衍生自植物或動物的第一水解產物和第二植物源水解產物。
112.權利要求111的方法，其中所述非衍生自植物或動物和植物源的水解產物為酵母源水解產物。
113.權利要求112的方法，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
114.權利要求103或104的方法，其中所述水解產物富集溶液基本由下列物質組成約50至280g/kg大豆源水解產物；和約75至300g/kg酵母源水解產物。
115.權利要求103或104的方法，其中所述基礎培養基為PFCHO。
116.權利要求103或104的方法，其中所述基礎富集溶液具有約9.0至10.5的pH。
117.權利要求103-116中任一項的方法，其中所述時段在約9至15天之間。
118.權利要求117的方法，其中所述時段為約12天。
119.權利要求103-116中任一項的方法，其中在所述時段以下各日的至少一日將所述基礎富集溶液添加至該細胞培養生產培養基中第4日、第6日、第9日和第11日。
120.權利要求103-116中任一項的方法，其中在所述時段的第4日、第7日或第4日和第7日將所述水解產物富集溶液添加至該細胞培養生產培養基中。
121.權利要求103-116中任一項的方法，其進一步包含根據pH線性斜坡調節細胞培養生產培養基的pH，其中所述pH線性斜坡包含自約7.1至7.2的pH起始並產生約6.9的終pH。
122.權利要求121的方法，其中在至少約24小時的時段中調節所述pH線性斜坡。
123.權利要求121的方法，其中在至少約48小時的時段中調節所述pH線性斜坡。
124.權利要求121的方法，其中在約72小時的時段中調節所述pH線性斜坡。
125.權利要求103或104的方法，其中所述細胞培養生產培養基包含
a)排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；
b)約8至10ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至3g/kg碳酸氫鈉；
g)約1至3g/kg HEPES；
h)約2至3g/kg NaCl；
i)約0.1至2g/kg Pluronic F-68；
j)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.1至0.1g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約8至12g/kg酵母源水解產物；及
m)約6至8g/kg植物源水解產物。
126.權利要求125的方法，其中所述細胞培養生產培養基包含
a)約10.0ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
f)約1.8g/kg HEPES；
g)約2.45g/kg NaCl；
h)約1.0g/kg Pluronic F-68；
i)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
j)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
k)約10.7g/kg酵母源水解產物；及
l)約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
127.權利要求103-126中任一項的方法，其中所述哺乳動物細胞為CHO細胞。
128.權利要求103-126中任一項的方法，其中所述細胞培養為大規模細胞培養。
129.權利要求128的方法，其中所述大規模細胞培養大於約10L。
130.權利要求128的方法，其中所述大規模細胞培養為13L。
131.權利要求103-126中任一項的方法，其中所述抗-TNFα抗體為完全人類抗-TNFα抗體。
132.權利要求131的方法，其中所述抗-TNFα抗體為阿達木單抗。
133.一種用於生產抗IL12抗體的分批補料方法，其包含
a)在包含細胞培養生產培養基的細胞培養物中培養包含編碼該抗體的核酸的CHO細胞，
b)通過在一時段內向該細胞培養物中添加水解產物富集溶液和基礎富集溶液對CHO細胞補料，
其中所述基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖，且
其中所述水解產物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產物，
以產生該抗-IL12抗體。
134.權利要求133的方法，其中所述水解產物富集溶液進一步包含葡萄糖。
135.權利要求133的方法，其進一步包含回收該抗-IL12抗體。
136.權利要求133的方法，其中在介於約32至38℃範圍內的溫度培養所述細胞培養物。
137.權利要求133的方法，其中所述培養溫度為約33℃。
138.權利要求133的方法，其中所述細胞培養生產培養基的溶氧維持在20-65％之間。
139.權利要求138的方法，其中所述細胞培養生產培養基的溶氧維持在約40％。
140.權利要求133的方法，其中所述細胞培養生產培養基具有約6.7至7.2的pH。
141.權利要求133的方法，其中所述水解產物富集溶液包含非衍生自植物或動物的水解產物和植物源水解產物。
142.權利要求141的方法，其中所述非衍生自植物或動物的水解產物為酵母源水解產物。
143.權利要求142的方法，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
144.權利要求133的方法，其中所述水解產物富集溶液基本上由下列物質組成約50至225g/kg大豆源水解產物、約75至300g/kg酵母源水解產物和約2至3g/L葡萄糖。
145.權利要求133的方法，其中所述基礎富集溶液包含基礎培養基、天冬醯胺和葡萄糖。
146.權利要求145的方法，其中所述基礎富集溶液具有約9.7的pH及約1400至1500mOsm的滲透壓。
147.權利要求145的方法，其中所述基礎富集溶液中的基礎培養基為PF CHO。
148.權利要求133-147中任一項的方法，其中所述時段在14-15天之間。
149.權利要求133-147中任一項的方法，其中自所述時段中的第5日起始，每隔一天將所述基礎富集溶液添加至所述細胞培養生產培養基中。
150.權利要求133-147中任一項的方法，其中自所述時段中的第6日起始，每天將所述水解產物富集溶液添加至所述細胞培養生產培養基中。
151.權利要求133-147中任一項的方法，其中自所述時段中的第5日起始，每天將所述基礎富集溶液及所述水解產物富集溶液添加至所述細胞培養生產培養基中。
152.權利要求133-147中任一項的方法，其中所述細胞培養生產培養基包含
a)排除下列組份的經修飾基礎培養基碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；
b)約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；
c)約5至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；
d)約5至9g/kg無水葡萄糖；
e)約0.1至1g/kg L-穀氨醯胺；
f)約1至2g/kg碳酸氫鈉；
g)約1至2g/kg HEPES；
h)約2至3g/kg NaCl；
i)約0.1至2g/kg Pluronic F-68；
j)約0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；
k)約0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；
l)約6至12g/kg酵母源水解產物；及
m)約6至8g/kg植物源水解產物。
153.權利要求152的方法，其中所述細胞培養生產培養基包含
a)約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；
b)約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；
c)約7.0g/kg無水葡萄糖；
d)約0.58至0.59g/kg L-穀氨醯胺；
e)約1.6g/kg碳酸氫鈉；
f)約1.8g/kg HEPES；
g)約2.45g/kg NaCl；
h)約1.0g/kg Pluronic F-68；
i)約0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；
j)約0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；
k)約10.7g/kg酵母源水解產物；及
l)約6.9至7.0g/kg植物源水解產物。
154.權利要求133-153中任一項的方法，其中所述細胞培養為大規模細胞培養。
155.權利要求154的方法，其中所述大規模細胞培養大於10L。
156.權利要求154的方法，其中所述大規模細胞培養為約13L。
157.權利要求133-156中任一項的方法，其中所述抗-IL12抗體為完全人類抗-IL-12抗體。
158.權利要求157的方法，其中所述完全人類抗-IL-12抗體為ABT-874。
159.一種組合補料溶液，其包含
a)葡萄糖；
b)基礎培養基；
c)除穀氨醯胺以外的胺基酸；及
d)至少兩種不同的非動物源水解產物，
其中該補料溶液具有約6.0至8.0的pH。
160.權利要求159的組合補料溶液，其包含約100至250g/kg葡萄糖。
161.權利要求159的組合補料溶液，其中所述胺基酸為天冬醯胺。
162.權利要求160的組合補料溶液，其包含約1.0至15.0g天冬醯胺。
163.權利要求161的組合補料溶液，其包含約3.0至5.0g/kg天冬醯胺。
164.權利要求159的組合補料溶液，其中所述至少兩種不同的非動物源水解產物為植物源水解產物和既非動物源也非植物源水解產物。
165.權利要求164的組合補料溶液，其中所述非動物源或植物源的水解產物為酵母源水解產物。
166.權利要求164的組合補料溶液，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
167.權利要求159的組合補料溶液，其中所述基礎培養基為PF-CHO或DMEM/F12培養基。
168.權利要求159的組合補料溶液，其中所述基本細胞培養基為經修飾的基礎培養基且排除下列組份碳酸氫鈉、緩衝劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調節劑、表面活性劑、穀氨醯胺和葡萄糖。
169.權利要求159-168中任一項的組合補料溶液，其進一步具有小於約15NTU的濁度。
170.一種用於維持細胞培養生產培養基中穩定葡萄糖水平的方法，其包含添加權利要求159-168中任一項的組合補料溶液。
171.一種用於製造包含基礎培養基、葡萄糖和至少兩種不同的非動物源水解產物的組合補料溶液的方法，其包含
a)將葡萄糖和所述基本細胞培養基混合成溶液；
b)將a)溶液的pH調節至約9.5至10.5；
c)將所述至少兩種不同的非動物源水解產物添加至b)溶液中；及
d)調節c)溶液的pH以使所述組合補料溶液具有約6.5至7.5的pH。
172.權利要求171的方法，其中步驟c)包含添加非動物源或植物源的第一水解產物和第二植物源水解產物。
173.權利要求172的方法，其中所述非動物源或植物源的水解產物為酵母源水解產物。
174.權利要求172的方法，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
175.一種用於自哺乳動物細胞培養物生產至少約1.5g/L抗體的方法，其包含
a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞；及
b)向該細胞培養生產培養基中添加pH約6.7至7.2的組合補料溶液，其中所述組合補料溶液包含葡萄糖；基礎細胞培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物，
以產生至少約1.5g/L的該抗體。
176.權利要求175的方法，其中所述組合補料溶液包含約100至250g/kg葡萄糖。
177.權利要求175的方法，其中生產至少2g/L的所述抗體。
178.權利要求175的方法，其中生產至少4g/L的所述抗體。
179.權利要求175的方法，其中生產至少5g/L的所述抗體。
180.權利要求175的方法，其中生產約6g/L的所述抗體。
181.一種用於增加從哺乳動物細胞培養物生產的抗體的滴度的方法，其包含
a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞；及
b)向所述細胞培養生產培養基中添加pH約6.7至7.2的組合補料溶液，其中所述組合補料溶液包含葡萄糖；基礎細胞培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物，
從而使所產生抗體的滴度比根據步驟a)且排除步驟b)所培養的
對照哺乳動物細胞培養物高至少50％。
182.權利要求181的方法，其中所產生抗體的滴度比所述對照高至少100％。
183.權利要求181的方法，其中所產生抗體的滴度比所述對照高至少150％。
184.權利要求175-183中任一項的方法，其中在細胞密度達到每毫升至少2.0×106個細胞時添加所述組合補料溶液。
185.權利要求175-183中任一項的方法，其中在細胞密度達到每毫升約3.5×106個細胞時添加所述組合補料溶液。
186.一種用於在哺乳動物細胞培養物中生產蛋白的方法，其包含
a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼該蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及
b)使用反饋控制系統監控所述細胞培養生產培養基中的代謝指示劑水平，藉此將組合補料溶液添加至所述細胞培養生產培養基中，其中在該反饋控制系統所測定的時間點將所述組合補料溶液添加至所述細胞培養生產培養基中，
以產生該抗體。
187.權利要求186的方法，其中所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
188.權利要求186或187的方法，其中所述代謝指示劑為葡萄糖或穀氨醯胺。
189.權利要求186或187的方法，其中所述補料溶液為包含下列的組合補料溶液葡萄糖；基礎細胞培養基；除穀氨醯胺以外的胺基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產物。
190.權利要求186或187的方法，其中所述蛋白為抗體。
191.權利要求190的方法，其中所述抗體選自抗-TNFα抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體和抗-EPO受體(EPO-R)抗體。
192.權利要求190或191的方法，其中以至少1.5g/L的滴度生產所述抗體。
193.權利要求190或191的方法，其中以至少2g/L的滴度生產所述抗體。
194.權利要求175-185及189中任一項的方法，其中所述組合補料溶液包含約3.0至12.5g/kg天冬醯胺。
195.權利要求175-185及189中任一項的方法，其中所述至少兩種不同的非動物源水解產物包含植物源水解產物和非動物源或植物源的水解產物。
196.權利要求195的方法，其中所述非動物源或植物源的水解產物為酵母源水解產物。
197.權利要求195的方法，其中所述植物源水解產物為大豆源水解產物。
198.權利要求175-185及189中任一項的方法，其中所述組合補料溶液包含約100至200g/kg葡萄糖。
199.權利要求175-185及189中任一項的方法，其進一步包含監控所述細胞培養基中的葡萄糖水平，從而將所述葡萄糖水平維持在約0.25與20.0g/L之間。
200.權利要求199的方法，其中用自動取樣裝置監控所述葡萄糖水平。
201.權利要求175-185中任一項的方法，其中所產生的抗體選自抗-TNFα抗體、抗-IL-18抗體和抗-IL-12抗體。
202.權利要求191或201的方法，其中所述抗-TNFα抗體為D2E7(阿達木單抗)。
203.權利要求191或201的方法，其中所述抗-IL-18抗體為ABT-325。
204.權利要求191或201的方法，其中所述抗-IL-12抗體為ABT-874。
205.一種測定在哺乳動物細胞培養物中生產蛋白的補料曲線的方法，其包含
a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞；及
b)使用反饋控制系統監控所述細胞培養生產培養基中的代謝指示劑，藉此將組合補料溶液添加至所述細胞培養生產培養基中，其中將所述組合補料溶液添加至所述細胞培養生產培養基中以達到目標代謝指示劑設定點；及
c)測定每天添加至所述細胞培養生產培養基中的組合補料溶液的量，
以測定補料曲線。
206.權利要求205的方法，其中所述代謝指示劑為葡萄糖或穀氨醯胺。
207.一種用於在哺乳動物細胞培養物中生產蛋白的分批補料方法，其包含根據權利要求205的補料曲線將組合補料溶液添加至所述哺乳動物細胞培養物中。
208.一種用於在哺乳動物細胞培養物中生產抗體以使該抗體的滴度為至少100mg/L的方法，該方法包含
a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞；
b)將丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合添加至所述細胞培養基中，其中將丁酸鈉添加至終濃度約0.1mM至10mM且將N-乙醯半胱氨酸添加至終濃度約1mM至80mM，
這樣以至少100mg/L的滴度生產所述抗體。
209.權利要求208的方法，其中所述抗體滴度為至少約100mg/L。
210.權利要求208的方法，其中所述抗體滴度為至少約200mg/L。
211.權利要求208的方法，其中所述抗體滴度為至少約250mg/L。
212.權利要求208的方法，其中所述抗體滴度為至少約300mg/L。
213.權利要求208的方法，其中所述抗體滴度為至少約400mg/L。
214.一種用於在哺乳動物細胞培養物中生產抗體以使所述抗體的滴度至少比對照哺乳動物細胞培養物高10％的方法，該方法包含
a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞；及
b)將丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合添加至所述細胞培養基中，其中將丁酸鈉添加至終濃度約0.1mM至10mM且將N-乙醯半胱氨酸添加至終濃度約1mM至80mM，
以使所述抗體的滴度比對照物高至少10％，其中所述對照哺乳動物細胞培養包含步驟a)且排除步驟b)。
215.權利要求214的方法，其中所述哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比所述對照哺乳動物細胞培養物提高至少29％。
216.權利要求214的方法，其中所述哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比所述對照哺乳動物細胞培養物提高至少40％。
217.權利要求214的方法，其中所述哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比所述對照哺乳動物細胞培養物提高至少70％。
218.權利要求214的方法，其中所述哺乳動物細胞培養物的抗體滴度比所述對照哺乳動物細胞培養物高至少90％。
219.權利要求208-218中任一項的方法，其中在所述哺乳動物細胞培養物的生長期中將丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合添加至所述哺乳動物細胞培養物中。
220.權利要求208-218中任一項的方法，其中在培養時間的第4日與第7日之間將丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合添加至所述哺乳動物細胞培養物中。
221.權利要求208-218中任一項的方法，其中在培養時間的第0日將丁酸鈉、N-乙醯半胱氨酸或其組合添加至所述哺乳動物細胞培養物中。
222.權利要求208-218中任一項的方法，其中丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至10mM。
223.權利要求208-218中任一項的方法，其中丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至8.0mM。
224.權利要求208-218中任一項的方法，其中丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至3.0mM的丁酸鈉。
225.權利要求208-218中任一項的方法，其中N-乙醯半胱氨酸的終濃度為約20mM至60mM。
226.權利要求208-218中任一項的方法，其中N-乙醯半胱氨酸的終濃度為約10mM。
227.權利要求208-218中任一項的方法，其中N-乙醯半胱氨酸的終濃度為約8mM。
228.一種使哺乳動物細胞培養物的壽命與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少35％的方法，該方法包含
a)在細胞培養生產培養基中培養包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞；及
b)將約1mM至80mM N-乙醯半胱氨酸添加至所述細胞培養基中，使得哺乳動物細胞培養物的壽命與對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少35％，其中所述對照哺乳動物細胞培養包含步驟a)且排除步驟b)。
229.權利要求228的方法，其中所述哺乳動物細胞培養物的壽命與所述對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少約45％。
230.權利要求228的方法，其中所述哺乳動物細胞培養物的壽命與所述對照哺乳動物細胞培養物相比延長至少約55％。
231.權利要求228-230中任一項的方法，其包含將終濃度約8mM的N-乙醯半胱氨酸添加至細胞培養生產培養基中。
232.權利要求208-231中任一項的方法，其中所述抗體選自抗-TNFα抗體、抗-IL-18抗體和抗-IL-12抗體。
233.權利要求232的方法，其中所述抗-IL-18抗體為ABT-325。
全文摘要
本發明描述在哺乳動物細胞培養物中生產重組蛋白例如抗體的改進方法和組合物。此外，本發明提供改良細胞培養基，包括改良生產培養基、補料溶液和組合補料，其可用於提高哺乳動物細胞培養物中的蛋白生產率。
文檔編號C12N5/00GK101663390SQ200780041909
公開日2010年3月3日 申請日期2007年9月13日 優先權日2006年9月13日
發明者I·A·布拉, J·C·馬杜克, J·C·范, C·史丘茲, N·A·洛依, D·F·布魯頓, J·麥因泰爾, 張幼翔, T·希沃斯特 申請人:艾博特公司