交聯型豬脫細胞真皮片的製作方法

2023-09-21 14:11:55

專利名稱：交聯型豬脫細胞真皮片的製作方法
技術領域：
本發明涉及燒傷和整形所用人體皮膚真皮替代物。
臨床大面積燒傷患者切痂創面常採用自體刃厚皮網狀皮、郵票狀皮、自體-異體皮鑲嵌和微粒皮移植術。由於缺乏真皮成份，術後易發生瘢痕增生和攣縮畸形，增加後期整形的難度。複合皮(Composite Skin，CS)的誕生為解決上述問題帶來了希望。其中真皮支架可分為天然皮膚真皮和人工合成真皮替代物兩種，人工合成的真皮替代物的先進性無可置疑，但製備複雜、價格昂貴、抗感染力差，且通透性、抗感染力和結構成分等均不及天然皮膚真皮。由於人的異體皮受到人權、司法、宗教信仰和傳染性疾病等限制，因而要提高現階段大面積燒傷切/削痂和切疤創面的植皮的質量，防止供皮區瘢痕增生，宜加強(培養的)自體表皮與異種豬真皮重組複合皮的研製和應用。
異種豬皮在組織配型(HLA I型/II型)上與人體相差懸殊，且真皮內殘留的附件上皮細胞、微血管內皮細胞(mVEC)、淋巴細胞(LC)等細胞成分具有很強的抗原性，是人體產生免疫排斥反應的主要原因，研究證實，經戊二醛等交聯處理的附帶基底膜成分的異體真皮與自體表皮片或刃厚皮複合移植後，真皮-表皮連接再生迅速，表皮貼附、生長和成熟均較快，組織炎生反應輕，異體真皮支架不易被降解，複合皮表面平整，近似正常皮膚。
因此，本發明研製的豬脫細胞真皮片(pig cen-removed derma1 sheets，P-CRDS)是具有抗原性低，含有基底膜成分，利於(培養)自體表皮細胞生長的理想的異種無細胞真皮片或真皮基質。經交聯後臨床應用於燒傷切/削痂創面和整形患者的切疤的創面上，既可作複合皮的真皮支架用，也可作生物敷料應用。p-CRDS有望取代人脫細胞真皮片(h-CRDS)，有廣泛的應用前景。
本發明的優點1.豬真皮來源充分、價廉，製作較人真皮容易，無人權或司法方面的爭議，商品化容易；2.經胰蛋白酶等特定處理的脫細胞真皮片便於保存和運輸，有較完整的基底膜和細胞外基質的形態結構。
3.用消毒液或Co60照射可以殺B肝等傳染性病毒和各類致病菌，消除生物製品臨床應用的後顧之憂；4.交聯型豬脫細胞真皮片抗原性低，複合移植後炎症反應輕，不易被降解，皮片表面平整，無瘢痕增生，發揮真皮支架作用。
本發明的技術方案選擇健康白豬活殺後洗刷去毛，剝取全厚皮塊，去脂肪後反取約0.1-0.4mm厚的皮片，在0.25％胰蛋白酶複合消化液內4℃、16～24小時，揭去表皮，真皮網狀打孔後於0.1～0.2％戊二醛水溶液內或3～5％甲醛(福馬林)-乙醇混合液內交聯5～20分鐘，反覆浸泡和衝洗，裝袋封口Co60照射或入75％酒精內保存備用。組織學證實p-CRDS是含基底膜成分膠原網絡的無細胞真皮片或無細胞真皮基質。
具體實施例方式(1)實驗室24孔板內，p-CRDS經DMEM浸泡24小時後，在p-CRDS表皮面接種正常人成纖維細胞和人表皮角朊細胞，細胞均貼壁生長，與培養板直接接種的上述細胞對比，經MTT檢測結果證實，角朊細胞貼壁、生長快，而成纖維細胞生長較慢(P＜0.05)。證明p-CRDS對細胞低毒或無毒副作用，且能促進人表皮角朊細胞的貼壁生長和抑制成纖維細胞的增生。
(2)豬移植實驗選健康小白豬(50公斤)為p-CRDS供體，一次性反取厚度約0.2mm，處理方法同上，採用進口0.2％戊二醛交聯的條件見實驗分組。
實驗分組CS中p-CRDS設未經戊二醛交聯即零處理(0-CS)組、5分鐘交聯(5-CS)組、10分鐘交聯(10-CS)組、20分鐘交聯(20-CS)組和40分鐘交聯(40-CS)組，以OT移植為對照組，每組移植6例。
移植方法選擇10公斤左右的健康小白豬3頭，於脊柱兩側製成4.0cm×8.0cm全層皮膚創面上下各3塊，間隔2cm。取皮鼓反取0.1mm左右的自體刃厚皮，在止血清潔的創面上，先移植p-CRDS，其上重疊移植自體刃厚皮(OT)。對照組在創面上單純移植OT，各組皮片移植部位均等，皮片移植後分別打包包紮，彈力網套固定。
觀察和皮片成活判斷標準以術後2周時的觀察記錄為準，表皮和真皮成活95％以上者視為全部成活，40％以下者為未成活，二者之間為部分成活。數據作Ridit分析。術後2周首次打開創面，除2例40-CS和1例20-CS成活較差(部分成活)外，餘各組皮片均完全成活。至術後5周時，CS表面光滑，創面輕度收縮，各組皮片面積檢測結果未見明顯差異(t，P＞0.05)。組織學(HE)和免疫組化(vwF和VIII因子相關抗原)觀察。CS移植後其自體刃厚皮OT早期血供來自於p-CRDS的網孔。在網孔內可見豐富的微小血管和結締組織，是創基向OT提供營養的「橋」或「蒂」。部分CS移植後出現脫痂和OT層皮膚附件上皮細胞二次上皮化現象，與臨床中厚、全厚皮移植或皮瓣轉移後，因血運欠佳產生痂下(表皮壞死的幹痂)癒合十分相似。此現象在40-CS組多見。0-CS組p-CRDS與自身組織融合迅速，5周時已難以分瓣，其中成纖維細胞(Fb)、mVEC和LC密集，與OT組相近，其它各組在p-CRDS的基底膜與OT交界面上水腫明顯，p-CRDS四周的自體組織中微小血管豐富，尤以網孔「蒂」部和皮下組織層明顯。p-CRDS內自體Fb、mVEC和LC數量隨戊二醛交聯時間延長而逐漸減少(t，P＜0.05)。因此該指標可反映戊二醛交聯作用對p-CRDS佔位性的影響。
(3)臨床應用20例大面積燒傷患者，於第1、2次手術時，以四肢非功能部位為複合皮移植部位，受體年齡1-63(25.3±18.2)歲，燒傷面積10-91(45.3±27.8)％，於傷後5-60天之內作複合皮移植。
設p-CRDS+自體刃厚皮複合皮(p-CS)實驗組，並以h-CRDS+自體刃厚皮複合皮(h-CS)、單純自體薄中厚皮(TS)和OT組為對照。
選擇切痂殘剝痂和整形切疤創面，經充分止血和清洗，以徒手取皮刀取患者0.1mm以內的刃厚皮片(以頭皮來源為主)，製成篩狀。CS植移方法同上。每塊移植面積在12.0-80.0(30.5±17.1)cm2之間，一次移植1～3塊，共27塊，其中p-CS19塊，h-CS18塊，TS和OT移植條件一致，三者眥鄰。移植術後5天，CS與OT和TS一樣，已初步建立血運，表皮紅潤，4周的網孔已上皮化。至術後6個月，p-CS和h-CS地樣未見明顯排異反應，皮片表面平滑，接近正常皮膚色澤，無不適感，而TS和OT表面癢痛感明顯，外觀潮紅，且OT表面高低不平，出現瘢痕增生。CS與TS和OT移植皮片成活率(判斷標準同上)見下表。早期組織學觀察與豬複合皮移植實驗較為一致，對少數未經戊二醛交聯的p-CRDS重組複合皮，經半年以上的觀察不能防止局部瘢痕增生和攣縮，p-CRDS雖然早期建立血運較快，但其淋巴細胞浸潤明顯，組織降解迅速。複合皮組中，成活較差的病例與p/h-CRDS厚，戊二醛交聯的濃度高、時間長(＞40分鐘)和複合皮移植時機較晚(＞1個月)、肉芽創面感染嚴重有關。
附表p-CS與h-CS和OT、TS移植後成活率比較組別塊數完全成活(％) 部分成活(％) 未成活(％)p-CS12 9(75.0) 1(8.3) 2(16.7)h-CS20 13(65.0) 3(15.0) 4(20.0)TS 32 28(87.5) 4(12.5) 0(0)OT 32 30(93.75)2(6.25) 0(0)動物實驗和臨床應用結果說明①p-CRDS可以作為(培養)自體表皮片或OT移植的載體，複合皮手術一次完成，有良好的研究和應用價值；②p-CRDS有一定的佔位性，但通過控制戊二醛等交聯濃度和時間可完全避免；③和h-CRDS一樣，p-CRDS對移植床要求較OT組和TS組高，不適合晚期肉芽創面或感染嚴重的創面；④p-CRDS有和h-CRDS一樣的厚度要求(0.1～0.3mm之間)，太薄則製作困難，遠期效果難以保證，太厚則易導致移植失敗。
權利要求
1.交聯型豬脫細胞真皮片，其特徵是選擇健康白豬活殺後洗刷去毛，剝取全厚皮塊，去脂肪後反取約0.1-0.4mm厚的皮片，在0.25％胰蛋白酶等複合消化液內4℃、16～24小時，揭去表皮，真皮網狀打孔後於0.1～0.2％戊二醛水溶液或3～5％甲醛-乙醇混合液內交聯5～20分鐘，反覆浸泡和衝洗，裝袋封口Co60照射或入75％酒精內保存備用。
2.根據權利要求1所述的交聯型豬脫細胞真皮片，其特徵是所述的豬脫細胞真皮片臨床應用於燒傷切/削痂創面和整形患者的切疤的創面上，既可作複合皮的真皮支架用，也可作生物敷料應用。
全文摘要
交聯型豬脫細胞真皮片,涉及燒傷和整形所用人體皮膚真皮替代物。經胰蛋白酶和戊二醛等處理過的豬脫細胞真皮片是含有基底膜成分和膠原網絡支架作用的無細胞真皮片,具有抗原性低,利於(培養)表皮生長,與自體刃厚表皮重組移植後無明顯排異反應,外觀平坦,無瘢痕增生和攣縮,且來源充足,製作簡便,價廉,無司法和人權爭議等優點。是臨床燒傷(特別是大面積燒傷)和整形切疤患者複合移植應用的理想真皮替代物和生物製品。
文檔編號A61L27/00GK1266716SQ99115729
公開日2000年9月20日 申請日期1999年3月12日 優先權日1999年3月12日
發明者姜篤銀, 陳壁, 徐明達 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院