高純度牛胰蛋白酶的製備方法

2023-09-21 21:04:45 2

專利名稱：高純度牛胰蛋白酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及高純度牛胰蛋白酶的製備方法。
背景技術：
胰蛋白酶(trypsin，EC3. 4. 21. 4)為蛋白酶的ー種。在脊椎動物體內作為消化酶而起作用。該酶在胰臟是作為酶的前體-膜蛋白酶原而被合成的。隨胰液分泌到小腸中，受腸激酶，或胰蛋白酶的作用成為活化胰蛋白酶。膜蛋白酶是肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)殘基中的羧基側切斷，酶切作用專ー性強。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起到活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的胺基酸排列中，它成為不可缺少的工具。一、胰蛋白酶有廣泛的用途I.作為藥物應用於臨床由於胰蛋白酶能消化溶解變性蛋白，對未變性的蛋白質無作用，因此，能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易於引流排除，加速創面淨化，促進肉芽組織新生，此外還有抗炎症作用。臨床上用於膿胸、血胸、外科炎症、潰瘍、創傷性損傷、瘻管所造成的局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用於呼吸道疾病。注射用也可用於治療毒蛇咬傷。2.作為降解酶應用於藥品、食品エ業胰蛋白酶因為其對蛋白質具有很強的降解能力而在蛋白類藥品、食品的加工中有著很廣泛的用途。如在透明質酸製備過程中去除蛋白質，在酒類和飲料的澄清、畜血蛋白的水解、胰蛋白腖製備、大豆肽的製備等方面也具有廣泛的應用價值。3.作為生物試劑應用於研究開發胰蛋白酶不僅在醫藥領域有著重要的應用價值，而且在實驗室研究開發中也被廣泛使用。例如在原代細胞培養中胰蛋白酶消化法是獲得單個細胞最經典的方法。該方法利用胰蛋白酶能夠破壞基質和粘附蛋白的能力而將細胞與基質、細胞與細胞相互剝離，從而最大限度地去除原有組織的特性。再有就是利用胰蛋白酶蛋白的能力用於分析與蛋白結合 的藥物研究。4.作為工具酶應用於基因工程胰蛋白酶具有專ー性裂解賴氨酸和精氨酸羧基形成的肽鍵的功能，因此在基因エ程蛋白活化中具有重要應用。如在基因工程人胰島素製備過程中胰蛋白酶可作用於胰島素原B鏈和A鏈之間的Arg殘基，得到Arg (B31)-人胰島素。ニ、現有胰蛋白酶的製備エ藝現狀胰蛋白酶的來源大多為牛、豬、羊等動物的胰臟，早期也有採用提取完胰島素後的豬或者是牛的胰液的，經過無菌處理後使用，然後進行提取、純化後製備胰蛋白酶。分離純化方法一般為溶劑浸提後採用沉澱法製備粗酶原，活化後採用離子交換層析、沉澱等方法純化(中國專利從胰渣中提取及純化胰蛋白酶的方法，申請號200510030396. 5 ;重慶醫科大學學報，1995，=305-307 ;青海醫藥雜誌，2000，4 :56_57)。因為胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶很難分開，這樣的方法一般在產品中會混有胰凝乳蛋白酶，導致產品純度不夠，使酶切作用專ー性降低，難以用於高純度醫藥產品的製備和生產。因此製備高純度胰蛋白酶越來越引起生物化學家和生物製藥企業的重視。三、本發明希望解決的技術問題本發明希望在現有技術的基礎上，經過科學的、紮實的研發工作，從大量的詳實的科研數據中精選並提供一種簡單的エ藝方法，得到高純度的胰蛋白酶。

發明內容
本發明的目的是製備高純度的胰蛋白酶。並為促進其在醫藥衛生、藥品食品加工領域中更廣泛的應用奠定基礎。本發明從牛胰臟中採用溶劑提取、鹽析沉澱和離子交換層析法製備牛胰蛋白酶，其純度高於一般方法製備的產品。本發明的技術方案是首先採用溶劑牛胰臟勻漿進行提取，離心製備粗酶液，然後採用分級沉澱法製備胰蛋白酶原粗品，再採用超濾法對粗酶原進行純化，繼續採用層析法製備得到胰蛋白酶原，最後對胰蛋白酶原進行活化後超濾濃縮，即得到高純度胰蛋白酶。·本發明的技術方案如下本發明提供了一種從動物胰臟中製備高純度胰蛋白酶的方法，包括如下步驟(I)、取動物胰臟，先進行組織破碎，加入至少2倍體積的提取劑，該提取劑是pH 3以上的無機或有機酸，提取至少12小時；(2)、提取後的樣品進行離心，收集上清液體；(3)、將上清液加入鹽析沉澱劑進行沉澱，至沉澱不再析出，得到的沉澱即為粗酶原I ;(4)、用磷酸緩衝液溶解粗酶原I，用超濾膜超濾，從超濾開始隨時監測透過液A28tl值，至A28(i〈0. 5時停止超濾，濃縮樣品至提取劑體積的1/10左右，得到粗酶原II ；(5)、將粗酶原II上到已平衡好的離子交換層析柱上，上樣過程隨時監測流出液A28。值,用Buffer A平衡3-5倍柱體積，再用等比例的Buffer A和Buffer B,加O. 1-0. 4mol氯化鈉，進行線性洗脫，流速2-5ml/min，隨時監測流出液A28tl值；收集樣品，於容器中測量體積和A28tl值，得到樣品III，於2-8°C保存備用；該Buffer A為IOm mo I檸檬酸與O. Imol氯化鈉混合得到的pH為4. 00 ± O. 02的緩衝液；Buffer B為IOm mo I檸檬酸與O. 4mol氯化鈉混合得到的pH為4. 00 ±O. 02的緩衝液；Buffer A和Buffer B優選為5倍柱體積的Buffer A 和 5 倍柱體積 Buffer B ；(6)、樣品III調pH至鹼性後，加氯化鈣進行活化，測A28tl值隨時檢測活力至活力升至最高吋，調PH值至酸性，終止活化，檢測Typsin (即，胰蛋白酶)活力及Chymotrypsin(即，胰凝乳蛋白酶)活力；測48。值，此為樣品IV，於2-8°C保存備用；(7)、將樣品IV用準備好的3-10K超濾膜濃縮，此過程隨時監測透過液A-值，然後用Buffer L將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液即為成品；該Buffer L為IOm mo I朽1樣酸。上述步驟中，所述的監測A28tl的目的是為了檢測溶液中的雜質蛋白是否已除盡，若A28tl值小於O. 5，就可以判斷雜蛋白已基本除盡。本發明所涉及的Buffer A、Buffer B、Buffer L的具體配製和組成如下
BufferA 配製10m mo I 朽1 樣酸 +0. Imol 氯化鈉 pH 4. 00 ± O. 02計算所需Imol梓檬酸的體積(ml)=0· 01 XV配製體積(ml) +1所需4mol氯化鈉的體積(ml)=0· IXV配製體積(ml) +4。BufferB 的配製10m mo I 朽1 檬酸 +0. 4mol 氯化鈉 pH :4. 00 ± O. 02計算所需Imol梓檬酸的體積(ml)=0· 01 XV配製體積(ml) +1
所需4mol氯化鈉的體積(ml)=0. 4XV配製體積(ml) +4。Buffer L :10m mo I梓檬酸；計算所需Imol梓檬酸的體積(ml)=0. 01 X V配製體積(ml) I。用適當容器裝3/4配製體積的純化水，用量筒量取所需體積的Imol檸檬酸加到容器中，攪拌均勻後定容到配製體積，攪拌均勻後備用。用適當容器取3/4配製體積的純化水，量取計算量的Imol檸檬酸母液和4mol氯化鈉母液於容器中，攪拌均勻，用2mol氫氧化鈉調pH值4. 00±0. 02，定容到配製體積，重新測PH值並調至4. 00±O. 02，隨時監測pH值為4. 00±O. 02直至穩定，攪拌均勻備用。本發明人經研究發現，在採用溶劑提取和沉澱法製備粗酶後，先不活化，而是採用層析法可以先將胰蛋白酶原與胰凝乳蛋白酶原分離，再進行活化，得到胰蛋白酶。該エ藝製備方法得到的胰蛋白酶純度高，催化作用專ー性強，適合作為藥物使用或用於藥品、食品加ェ等。上述步驟5中，所述的於容器中測量體積的目的是為了便於計算收率。本發明的上述方法中，所述提取劑體積優選為胰臟體積的2-6倍；該提取劑優選為O. 1-0. 15mol/l的硫酸或鹽酸或2_4%的三氯こ酸；該提取劑的提取時間優選為12-36小時。本發明所述的製備胰蛋白酶的方法中，所述步驟(3)中採用的鹽析沉澱劑為溶解度超過200g/L的無機鹽，或pH 3以下的酸；優選為硫酸。本發明所述的製備胰蛋白酶的方法中，所述是步驟(3)優選為採用鹽析沉澱劑沉澱進行分級沉澱處理；即，在上清液中依序加入20%、40%濃度的鹽析沉澱劑進行分級沉澱。該分級沉澱的優點在於，可使產物純度更高。本發明所述的製備胰蛋白酶的方法中，所述步驟(4)中採用的超濾膜為3k_10k的超濾膜，優選IOk的超濾膜。所述步驟(7)所採用超濾膜為3K超濾膜。本發明所述的製備胰蛋白酶的方法中，所述步驟(5)為酶原在活化之前上陽離子交換層析，離子交換介質為SP樹脂。SP的英文Saturated polyester plastic,可譯為飽和聚酯塑料，在本發明中指樹脂材料，即SP樹脂；平衡緩衝液為Buffer A,洗脫液為BufferA (5倍柱體積)和Buffer B (5倍柱體積)，加O. 1-0. 4mol氯化鈉線性梯度洗脫，上樣過程中監測流出液A28tl值 I至胰凝乳蛋白酶活力 I至chymotrypsin活力< O. 2之間的樣品，於適當容器中準確測量體積和A28tl值,得樣品III,於2-8 °C保存備用；(6)、樣品III調pH 8. 10，加氯化鈣活化一定時間，測A28tl值隨時檢測活力至活力升至最高時，用鹽酸調pH值2. 80,終止活化,檢測trypsin活力及chymotrypsin活力。測A280值，此為樣品IV，於2-8°C保存備用；(7)、將樣品IV用準備好的超濾膜濃縮至一定體積，此過程隨時監測透過液A28tl值，再用Buffer L將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液，即為成品。其中步驟(I)提取劑為硫酸或三氯こ酸，優選採用三氯こ酸。優選地，本發明採用新鮮、剝去脂肪及結締組織的牛胰臟5. Okg (按4臺離心機計算，隨離心機增多相應增加),用絞肉機絞碎,將絞過的牛胰臟放入高速組織搗碎機中，加入適量配製好的O. 1-0. 15mol硫酸或2-4%的三氯こ酸，搗碎後倒進提取容器中，再加至4倍體積O. 1-0. 15mol硫酸溶液或2-4%的三氯こ酸用攪拌器開始攪拌、計時提取24小吋。步驟(3)離心後上清液採用硫酸銨鹽析或酸沉澱，其中優選的為硫酸銨鹽析。離心後的樣品，按242g/L加硫酸銨達到35-45%飽和度。攪拌溶解後，繼續攪拌30分鐘，放置24小時後，(離心9500轉，IOmin, 4°C )，離心後將上清用四層紗布過濾至不鏽鋼桶中，再次離心收集上清,沉澱棄去。離心後的鹽析上清,按205g/L加硫酸銨達到70%飽和度。攪拌溶解後，繼續攪拌30分鐘，放置24小時後，(離心9500轉，IOmin, 4°C )，收集沉澱，上清棄去，沉澱即為膜蛋白酶原粗製品。·步驟(4)對第(3)步製備的酶原採用IOK超濾膜超濾，濃縮樣品體積至1-2L，カロIOmM檸檬酸buffer至樣品體積3倍左右，繼續超濾重複此操作步驟三次(從超濾開始隨時監測透過液A28tl值)，最後濃縮樣品體積至IL左右，除去進ロ壓力用IOmM檸檬酸buffer將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液至適當容器中。樣品攪拌均勻，用2mol氫氧化鈉調pH值4. 00±0. 02,準確測定體積和A28tl值,此為樣品II。步驟(5)將樣品II上陽離子交換層析，離子交換介質為SP樹脂。平衡緩衝液為Buffer A,洗脫液為Buffer A (5倍柱體積)+Buffer B (5倍柱體積)，加O. 1-0. 4mol氯化鈉線性梯度洗脫，上樣過程中監測流出液48(|值 I至胰凝乳蛋白酶活力< O. 2之間的樣品。步驟(6)粗酶原樣品III在SP層析後活化。活化過程為用氫氧化鈉調pH至8. 0-8. 5，加O. IM ニ水氯化鈣活化，然後用鹽酸調pH至2. 5-3. O終止活化。步驟(7)所用超濾膜為3K超濾膜。本發明的有益效果是原料易得，成本低廉，方法簡單易操作，得到的胰蛋白酶活力相對於雜質胰凝乳蛋白酶活力高。經本申請人按常規測定方法檢測，檢測例為本發明實施例得到的胰蛋白酶，對比例為現有方法製得或市售的胰蛋白酶，相比之下，按照傳統方法製得的胰蛋白酶活力與胰凝乳蛋白酶活力比值一般低於20，而按照本發明改進的方法得到的胰蛋白酶活力與胰凝乳蛋白酶活力比值均高於50，最高的達到1000，篇幅所限，對比實驗所採用方法參見公知方法，過程和數據也可參見實施例後所附方法，必要時可提供實驗記錄進行佐證。該對比數據和結果顯示本發明帶來的有益效果是令人驚喜的。本發明的エ藝方法得到的產品在醫藥衛生、藥品食品エ業中有廣闊的應用前景。


圖f圖3均為本發明的層析圖，其中，橫坐標是流出液的體積，単位為ml，縱坐標是吸收度，單位mAu相當於毫Au。
具體實施方式
下面以具體實施例對本發明作進ー步的說明，但並不影響本發明的保護範圍。實施例I以下步驟均在2-8°C環境進行溶液的配製A. O. 125mol 硫酸的配製取一定量2_8°C的純化水，用IOmol濃硫酸配製，攪勻後2_8°C放置備用。計算所需IOmol 濃硫酸的體積(ml)=0. 125XVK$IJ#i/p(ml) +10B. Buffer L 配製10m mo I 朽1 樣酸 計算所需Imol梓檬酸的體積(ml)=0· 01 XV配製體積(ml) +1用適當容器裝3/4配製體積的純化水，用量筒量取所需體積的Imol檸檬酸加到容器中，攪拌均勻後定容到配製體積，攪拌均勻後備用。C. Buffer A 配製IOm mo I 朽1 樣酸 +0. Imol 氯化鈉 pH :4. 00 ± O. 02計算所需Imol梓檬酸的體積(ml)=0· 01 XV配製體積(ml) +1所需4mol氯化鈉的體積(ml) =0. IXV配製體積(ml) +4用適當容器取3/4配製體積的純化水，量取計算量的Imol檸檬酸母液和4mol氯化鈉母液於容器中，攪拌均勻，用2mol氫氧化鈉調pH值4. 00±0. 02，定容到配製體積，重新測PH值並調至4. 00±O. 02，隨時監測pH值為4. 00±O. 02直至穩定，攪拌均勻備用。D. BufferB 的配製10m mo I 朽1 樣酸 +0. 4mol 氯化鈉 pH :4. 00 ± O. 02計算所需Imol梓檬酸的體積(ml)=0· 01 XV配製體積(ml) +1所需4mol氯化鈉的體積(ml)=0. 4XV配製體積(ml) +4用適當容器取3/4配製體積的純化水，量取計算量的Imol檸檬酸母液和4mol氯化鈉母液於容器中，攪拌均勻，用2mol氫氧化鈉調pH值4. 00±0. 02，定容到配製體積，重新測PH值並調至4. 00±O. 02，隨時監測pH值為4. 00±O. 02直至穩定，攪拌均勻備用。I. I提取取新鮮、剝去脂肪及結締組織的牛胰臟5. Okg (按4臺離心機計算，隨離心機增多相應增加),用絞肉機絞碎,將絞過的牛胰臟放入高速組織搗碎機中，加入適量配製好的O. 125mol硫酸,搗碎後倒進提取容器中，再加至4倍體積O. 125mol硫酸溶液用攪拌器開始攪拌、計時提取24小吋。I. 2離心攪拌提取後的樣品冷庫放置24小時後離心。將攪拌均勻的溶液加入500ml離心瓶中，用架盤天平平衡好後對稱裝進Beckman離心機中，(離心4500轉，IOmin,4°C, JA-10轉子)離心後將上清用四層紗布過濾至20升不鏽鋼桶中，累計離心收集上清，沉澱棄去。I. 340%鹽析離心後的樣品，按242g/L加硫酸銨達到40%飽和度。攪拌溶解後，繼續攪拌30分鐘，放置24小時後，(離心9500轉，IOmin,4°C, JA-10轉子)，離心後將上清用四層紗布過濾至20升不鏽鋼桶中，累計離心收集上清，沉澱棄去。I. 470%鹽析離心後的40%鹽析上清，按205g/L加硫酸銨達到70%飽和度。攪拌溶解後，繼續攪拌30分鐘，放置24小時後，(離心9500轉，IOmin, 4°C, JA —10轉子)，收集沉澱，上清棄去，沉澱即為胰蛋白酶原粗製品，即為樣品I。I. 5樣品超濾A.超濾膜的準備安裝好IOK超濾膜，用純化水把超濾膜衝至中性並用IOmM檸檬酸buffer潤膜後備用。B.樣品的準備樣品I按10ml/g加IOmM朽1檬酸buffer溶解,用Beckman離心機離心(9500轉，15min)，上清用300目篩網過濾，收集於適當容器中，於2_8°C保存備用。C.超濾用IOK超濾膜濃縮樣品體積至1-2L，加IOmM檸檬酸buffer至樣品體積3倍左右，繼續超濾重複此操作步驟三次(從超濾開始隨時監測透過液A28tl值)，最後濃縮樣品體積至IL左右，除去進ロ壓力用IOmM檸檬酸buffer將膜中樣品衝出，直至回流液『。值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液至適當容器中。
D.樣品調pH值將超濾後的樣品攪拌均勻，用2mol氫氧化鈉調pH值4. 00±0. 02，準確測定體積和A28tl值，此為樣品II，於2-8°C保存備用。(取一半的樣品直接活化後進行IOK超濾，此為樣品III，其餘直接進行SP樹脂層析純化，此為按照傳統方法製備得到的樣品IV。)E.超濾後樣品活化樣品II調pH8. 10，加稱量好的ニ水氯化鈣，攪拌溶解後，用2mol氯氧化鈉調pH值8. 10±0· 02，然後計時，測A28tl值隨時檢測活力至活力升至最高，速度緩慢時，用鹽酸調pH值2. 80,終止活化,檢測trypsin活力及chymotrypsin活力。(trypsin酶及chymotrypsin酶的活性檢測方法見附件I)F.超濾活化後樣品用IOK超濾膜超濾，加IOmM檸檬酸buffer至樣品體積3倍左右，超濾重複此操作步驟三次(從超濾開始隨時監測透過液A28tl值)，最後濃縮樣品體積至IL左右，除去進ロ壓力用IOmM檸檬酸buffer將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液至適當容器中，此為樣品III。1.6SP 層析 A:A.層析柱的準備用三次以上者需要重新裝柱，裝柱高度視需要而定。B.層析柱的平衡用Buffer A平衡3-5倍柱體積，線性流速40-50cm/h。C.上樣將樣品III上到已平衡好的SP層析柱上，上樣量按400D/L計算，上樣過程中隨時監測流出液A28tl值，上樣結束後用Buffer A平衡至流出液A28tl值降至O. 5以下。D.梯度平衡好後用Buffer A (5倍柱體積)+Buffer B (5倍柱體積)，進行O. 1-0. 4mol氯化鈉線性梯度洗脫，隨時監測流出液A28tl值。E.樣品收集收集樣品A28tl > I至chymotrypsin活力 I至chymotrypsin活力 20h，沉澱棄去。注意從計時提取到離心結束不得超過90分鐘。2. 3沉降靜止20小時後的上清觀察混濁度，如果上清為白色的混懸液開始離心(9500轉，15min，4°C )，收集離心所得沉澱即為酸沉澱，如上清不是白色的混懸液繼續沉降直至變為白色的混懸液方可離心。2. 3酶原的製備2. 3. I透析袋的清洗 將透析袋從Im mo I EDTA (pH :8. 00)的貯存液中取出，用純化水衝洗乾淨後即可使用。2. 3. 2離心對放置20小時的粗製備液進行離心(9500轉，15min，4°C )棄去上清，
沉澱稱重。2. 3. 3透析將沉澱按10ml/g的比例加入O. 05M HCL，攪拌使其成均勻的混懸液，然後裝進透析袋紮緊封ロ放進O. 05M HCL的塑料桶中透析除鹽，不斷更換塑料桶中透析液至透析袋中的樣品溶解(使總透析液體積至少為樣品體積的100倍)，直到透析袋中樣品由乳白色變為澄清。透析完全已溶解的酶原移到IOL不鏽鋼桶中，此為樣品I，裝樣品的透析袋先用純化水衝洗乾淨，然後放入lmmol EDTA(pH :8. 00)中2_8°C保存備用。2. 4樣品超濾2.4. I超濾膜的準備安裝好IOK超濾膜，用純化水把超濾膜衝至中性並用IOmM檸檬酸buffer潤膜後備用。2. 4. 2樣品的準備將透析好的樣品I收集於IOL不鏽鋼桶中，用2mol氫氧化鈉調pH值為5. 60±O. 02,用Beckman離心機離心(4500轉，15min),上清用300目篩網過濾，收集於適當容器中，於2-8°C保存備用。2. 4. 3超濾用IOK超濾膜濃縮樣品體積至1-2L，加Buffer L至樣品體積3倍左右，繼續超濾重複此操作步驟三次(從超濾開始隨時監測透過液A28tl值)，最後濃縮樣品體積至IL左右，除去進ロ壓力用Buffer L將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液至適當容器中。2. 4. 4樣品調pH值將超濾後的樣品攪拌均勻，用2mol氫氧化鈉調pH值4. 00±0. 02，準確測定體積和A28tl值，此為樣品II，於2-8°C保存備用。(取一半的樣品直接 活化後進行IOK超濾，此為樣品III，其餘直接進行SP樹脂層析純化，此為按照傳統方法製備得到的樣品IV。)2. 4. 5超濾後樣品活化樣品II調pH8. 10，加氯化鈣進行活化，緩慢將稱量好的ニ水氯化鈣加入樣品內，攪拌溶解後，用2mol氯氧化鈉調pH值8. 10±0. 02，然後計時，測A28tl值隨時檢測活力至活力升至最高時，用鹽酸調PH值2. 80，終止活化，檢測trypsin活力及chymotrypsin活力。(trypsin酶及chymotrypsin酶的活性檢測方法見附錄I)2. 4. 6超濾活化後樣品用IOK超濾膜超濾，加IOmM檸檬酸buffer至樣品體積3倍左右，超濾重複此操作步驟三次(從超濾開始隨時監測透過液A28tl值)，最後濃縮樣品體積至IL左右，除去進ロ壓力用IOmM檸檬酸buffer將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液至適當容器中，此為樣品III。 2. 5 純化
SP 層析 A:A.層析柱的準備用三次以上者需要重新裝柱，裝柱高度視需要而定。B.層析柱的平衡用Buffer A平衡3_5倍柱體積,線性流速40_50cm/h。C.上樣將樣品III上到已平衡好的SP層析柱上，上樣量按400D/L計算，上樣過程中隨時監測流出液A28tl 值，上樣結束後用Buffer A平衡至流出液A28tl值降至O. 5以下。D.梯度平衡好後用Buffer A (5倍柱體積)+Buffer B (5倍柱體積)，進行O. I-ο. 4mol氯化鈉線性梯度洗脫，隨時監測流出液A28tl值。E.樣品收集收集樣品A28tl > I至chymotrypsin活力 I至chymotrypsin活力 20h，沉澱棄去。3. 375%鹽析離心後的樣品，按492g/L加硫酸銨達到75%飽和度。攪拌溶解後，繼續攪拌30分鐘，放置2小時後，(離心9500轉，IOmin,4°C, JA —10轉子)，收集沉澱上清棄去，鹽析沉澱即為胰蛋白酶原粗製品，即為樣品I。3. 4樣品超濾A.超濾膜的準備安裝好IOK超濾膜，用純化水把超濾膜衝至中性並用IOmM檸檬酸buffer潤膜後備用。
B.樣品的準備鹽析沉澱按10ml/g加IOmM朽1檬酸buffer溶解,用Beckman離心機離心(4500轉，15min)，上清用300目篩網過濾，收集於適當容器中，於2_8V保存備用。C.超濾用IOK超濾膜濃縮樣品體積至1-2L，加IOmM檸檬酸buffer至樣品體積3倍左右，繼續超濾重複此操作步驟三次(從超濾開始隨時監測透過液A28tl值)，最後濃縮樣品體積至IL左右，除去進ロ壓力用IOmM檸檬酸buffer將膜中樣品衝出，直至回流液『。值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液至適當容器中。D.樣品調pH值將超濾後的樣品攪拌均勻，用2mol氫氧化鈉調pH值4. 00±0. 02，準確測定體積和A28tl值，此為樣品II，於2-8°C保存備用。(取一半的樣品直接活化後進行IOK超濾，此為樣品III，其餘直接進行SP樹脂層析純化，此為按照傳統方法製備得到的樣品IV。)E.超濾後樣品活化樣品II調pH8. 10，加氯化鈣進行活化，緩慢將稱量好的ニ水氯化鈣加入樣品內，攪拌溶解後，用2mol氯氧化鈉調pH值8. 10±0. 02，然後計時，測A28tl值隨時檢測活力至活力升至最高，速度緩慢時，用鹽酸調PH值2. 80，終止活化，檢測trypsin活力及chymotrypsin活力。(trypsin酶及chymotrypsin酶的活性檢測方法見附錄I)F.超濾活化後樣品用IOK超濾膜超濾，加IOmM檸檬酸buffer至樣品體積3倍左右，超濾重複此操作步驟三次(從超濾開始隨時監測透過液A28tl值)，最後濃縮樣品體積至IL左右，除去進ロ壓力用IOmM檸檬酸buffer將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液至適當容器中，此為樣品III。3.5SP 層析 A:A.層析柱的準備用三次以上者需要重新裝柱，裝柱高度視需要而定。B.層析柱的平衡用Buffer A平衡3_5倍柱體積,線性流速40_50cm/h。C.上樣將樣品III上到已平衡好的SP層析柱上，上樣量按400D/L計算，上樣過程·中隨時監測流出液A28tl值，上樣結束後用Buffer A平衡至流出液A28tl值降至O. 5以下。D.梯度平衡好後用Buffer A (5倍柱體積)+Buffer B (5倍柱體積)，進行
O.I-ο. 4mol氯化鈉線性梯度洗脫，隨時監測流出液A28tl值。E.樣品收集收集樣品A28tl > I至chymotrypsin活力< I. O之間的樣品,檢測無合格樣品。層析圖暫欠奉。SP 層析 B:A.層析柱的平衡用Buffer A平衡3-5倍柱體積,線性流速40_50cm/h。B.上樣將樣品II上到已平衡好的SP層析柱上，上樣量按400D/L計算，上樣過程中隨時監測流出液A28tl值，上樣結束後用Buffer A平衡至流出液A28tl值降至O. 5以下。C.梯度平衡好後用Buffer A (5倍柱體積)+Buffer B (5倍柱體積)，進行
O.1-0. 4mol氯化鈉線性梯度洗脫，隨時監測流出液A28tl值。D.樣品收集收集樣品A28tl > I至chymotrypsin活力< O. 2之間的樣品，於適當容器中準確測量體積和A28tl值，此為樣品V，於2-8°C保存備用。層析圖見圖3。3. 6酶原的活化以下trypsin酶的活性檢測方法見附錄I活化樣品V調pH 8. 10，加氯化鈣進行活化，緩慢將稱量好的ニ水氯化鈣加入樣品內，攪拌溶解後，用2mol氯氧化鈉調pH值8. 10±0. 02，然後計時，測A28tl值隨時檢測活力至活力升至最高，速度緩慢時，用鹽酸調PH值2. 80，終止活化，檢測trypsin活力及chymotrypsin活力。測A28tl值,此為樣品VI, 2_8で保存備用。3. 7 3K 超濾A.超濾膜的準備 安裝好10K超濾膜，用純化水把超濾膜衝至中性並用IOmM檸檬酸buffer潤膜後備用。B.超濾將樣品VI用準備好的超濾膜濃縮至2L左右，此過程隨時監測透過液A28tl值，然後用Buffer L將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於0. 5，合併濃縮液和衝洗液即為成品。檢測trypsin活力及chymotrypsin活力並測A28tl值。3. 8超濾膜的再生及貯存A :用0. Imol NaOH洗膜取2mol NaOH的母液500ml加到20L不鏽鋼桶中用純化水定容到10升，攪拌均勻，加熱到35-45°C，開始用鹼洗膜。當用pH試紙檢測透過液和回流液PH值為鹼性後再循環3(Γ60分鐘。
B :用純化水衝洗膜至回流液和透過液pH試紙檢測pH值為中性。C :用O. Olmol NaOH存膜取2mol NaOH的母液50ml加到20L不鏽鋼桶中用純化水定容到10升攪拌均勻，加熱到35-45°C，開始用鹼存膜。用pH試紙檢測透過液和回流液PH值為鹼性後再循環30分鐘即可。存完後蓋好上下封ロ平放於包裝盒中，2-8°C環境貯存，備用。3. 9實驗結果經測定先活化後層析的樣品IV酶活力結果為trypsin活力212. 5U/mg,chymotrypsin活力20. 4U/mg。先層析後活化的樣品VII酶活力結果為trypsin活力240. 4U/mg, chymotrypsin活力0. 14U/mg。後者純度遠遠高於前者，是前者的數倍。 trypsin酶濃度及活性的檢測I. trypsin 底物的配製I. I trypsin 底物緩衝液的配製O. 0115mol CaCl2+0. 046mol TrispH:8. 10±0· 02計算需IMTris 的體積為體積(ml)=V(ml) X0. 046 + 2需Imol CaCl2 體積(ml) =V (ml) X O. 0115將取出的IM Tris和IM CaCl2分別加入IOOOml的燒杯中，再加入3/4配製體積的純化水(2-8°C)，校正pH計，用4M HCl調pH值為8. 10±O. 02，定容到所配製的體積，裝於三角燒瓶中，並用石蠟膜封好後備用。L 2 配製 O. Olmol TAME :用天平稱取固體TAME量(g) 378.9X0. 01 XV所_體積(L)，加入2_8°C的約2/3配製體積的純化水，攪拌溶解，然後定容到所配製的體積，攪勻後2-8°C放置。2. Chymotrypsin 底物的配製2. I 底物緩衝液的配製0. 08mol Tris+0. Imol CaCl2 pH :7· 80±0· 02計算需Imol Tris 的體積(ml) =V(ml) X0. 08需Imol CaCl2 的體積(ml) =V (ml) X0. I將取出的Imol Tris和Imol CaCl2分別加入IL燒杯中，再加入3/4配製體積的純化水，攪拌均勻，校正pH計，用4mol鹽酸調pH值為7. 80±O. 02，定容到所配製的體積，裝於三角燒瓶中，並用石蠟膜封好備用。2. 2 配製 O. 00107mol BTEE 計算需固體BTEE 的量(g) =313. 36X0. 00107XV(ml)/100050%甲醇溶液的配製取甲醇的量(ml) =1/2X配製體積V，將取好的甲醇加純化水定容至配製體積，即得50%甲醇溶液，混勻後備用。稱取所需固體BTEE的量，加入50%甲醇溶液中，攪拌溶解後於2_8°C保存備用。3.濃度及活性的檢測3. I打開分光光度計，預熱30分鐘左右，於280nm下用純化水作空白調「O」再調「100」。3. 2 trypsin酶濃度的測定用pipette吸出一定量的trypsin放入比色皿中，按稀釋倍數加入一定量的純化水混合搖勻，用分光光度計測定其A28tl值。根據公式計算出trypsin酶濃度。
trypsin 酶濃度(mg/ml) =A280 XO. 73. 3trypsin酶活性的測定將分光光度計的波長調為247nm，用吸球吸取配好的底物緩衝液2. 6ml，放入4ml的比色皿中，再加入O. OlM TAME O. 3ml混合均勻作空白設置O點，然後加入稀釋好的酶
O.Iml混勻，立即放入分光光度計中，記時3分鐘內的變化值。trypsin酶的活力單位計算公式如下
權利要求
1.一種從動物胰臟中製備高純度胰蛋白酶的方法，包括如下步驟 (1)取動物胰臟，先進行組織破碎，加入至少2倍體積的提取劑，該提取劑是pH3以上的無機或有機酸，提取至少12小時； (2)提取後的樣品進行離心，收集上清液體； (3)將上清液加入鹽析沉澱劑進行沉澱，至沉澱不再析出，得到的沉澱即為粗酶原I; (4)用磷酸緩衝液溶解粗酶原I，用超濾膜超濾，從超濾開始隨時監測透過液A28tl值，至A280<0. 5時停止超濾，濃縮樣品至提取劑體積的1/10左右，得到粗酶原II ； (5)將粗酶原II上到已平衡好的離子交換層析柱上，上樣過程隨時監測流出液A28tl值，用Buffer A平衡3-5倍柱體積，再用Buffer A和Buffer B加O. 1-0. 4mol氯化鈉，進行線性洗脫，流速2-5ml/min，隨時監測流出液A28tl值；收集樣品，於容器中測量體積和A28tl值，得到樣品III,於2-8°C保存備用；該Buffer A為IOm mo I朽1檬酸與O. Imol氯化鈉混合得到的pH為4. 00 ± O. 02的緩衝液；Buffer B為IOm mo I檸檬酸與O. 4mol氯化鈉混合得到的pH為4. 00 + 0. 02的緩衝液； (6)樣品III調pH至鹼性後，加氯化鈣進行活化，測A280值，隨時檢測活力至活力升至最高時，調PH值至酸性，終止活化，檢測胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力；測48(|值，此為樣品IV，於2-8°C保存備用； (7)將樣品IV用準備好的3-10K超濾膜濃縮，此過程隨時監測透過液A28tl值，然後用Buffer L將膜中樣品衝出，直至回流液A28tl值小於O. 5，合併濃縮液和衝洗液，即得；該Buffer L 為 IOm mo I 朽1 樣酸。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的提取劑為O.1-0. 15mol/l的硫酸或鹽酸或2-4%的三氯こ酸。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(3)中採用的鹽析沉澱劑為溶解度超過200g/L的無機鹽，或pH 3以下的酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的鹽析沉澱劑為硫酸。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(3)為採用鹽析沉澱劑沉澱進行分級沉澱處理，該分級沉澱處理為在上清液中依序加入20%、40%濃度的鹽析沉澱劑進行分級沉澱。
6.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(4)採用的超濾膜為3k-10k的超濾月吳。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述步驟(5)為酶原在活化之前上陽離子交換層析，離子交換介質為SP樹脂，平衡緩衝液為Buffer A,洗脫液為5倍柱體積的BufferA和5倍柱體積的Buffer B,加O. 1-0. 4mol氯化鈉進行線性梯度洗脫，上樣過程中監測流出液A28tl值 I至胰凝乳蛋白酶活力< O. 2之間的樣品。
8.根據權利要求I所述的製備胰蛋白酶的方法，其特徵在於所述步驟(6)粗酶原樣品III在離子交換層析後，用氫氧化鈉調節至鹼性，再加氯化鈣進行活化，該活化的過程為用氫氧化鈉調pH至8. 0-8. 5,加O. Imol ニ水氯化|丐活化,然後用鹽酸調pH至2. 5-3. O終止活化。
9.根據權利要求I所述的製備胰蛋白酶的方法，其特徵在於所述步驟(7)所用超濾膜為3K超濾膜。
10.根據權利要求I所述的製備胰蛋白酶的方法，其特徵在於所述動物胰臟包括豬、牛、羊的動物的胰臟。
全文摘要
本發明提供了一種從動物胰臟中製備高純度胰蛋白酶的方法，包括加入提取劑提取、離心、加入鹽析沉澱劑沉澱、溶解、超濾、離子交換層析柱、調pH至鹼性加氯化鈣活化、調pH值至酸性終止活化，檢測胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力、測A280值、超濾膜濃縮、監測透過液直至A280值小於0.5、合併濃縮液和衝洗液即為高純度胰蛋白酶；本發明的工藝製備方法得到的胰蛋白酶純度高，催化作用專一性強。
文檔編號C12N9/76GK102676484SQ20121017130
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者冷春生, 李淑楠, 賈冰 申請人:通化東寶藥業股份有限公司