抗-幹擾素α的抗體的製作方法

2023-09-21 23:40:10

專利名稱：抗-幹擾素α的抗體的製作方法
背景技術：
發明領域本發明總體上涉及中和性抗-IFN-α單克隆抗體的產生和特性鑑定，這些抗體對各種IFN-α亞型具有廣譜反應性。本發明還涉及這些抗-IFN-α抗體在診斷與治療與IFN-α的表達增加相關疾病，特別是自身免疫病如胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和全身性紅斑狼瘡(SLE)中的應用。
相關技術的描述幹擾素-α(IFN-α)雖然幹擾素最初發現的是它們的抗病毒活性，但隨後的研究闡明了與這些強力細胞因子有關的多種調節活性。I型幹擾素形成了一個細胞因子的古老家族，包括IFN-α，IFN-β，IFN-δ，IFN-ω以及IFN-τ(Roberts等人，J.InterferonCgtokine Res.18805-816)。他們由內含子的基因編碼並且廣泛分布於脊椎動物中。其中IFN-β在靈長目和齧齒動物中由單一基因編碼，在鼠類和人體中各發現了10種和15種以上的不同的IFN-α亞型。其他I型幹擾素更有限，比如，豬的IFN-δ，牛和羊的IFN-τ，牛和人的IFN-ω。因此，人I型幹擾素包括IFN-α家族中的多個成員，以及IFN-β和IFN-ω家族的單個成員。所有I型IFN看來都只結合一個受體，該受體含有至少兩個跨膜蛋白質。另一方面，II型幹擾素由一個成員IFN-γ代表，並且結合一個獨特的受體。
儘管所有的I型IFN，包括IFN-α，都顯示出抗病毒和抗增殖活性而因此有助於控制病毒感染和腫瘤(Lefevre等人，Biochimie 80779-788；Horton等人，Cancer Res.594064-4086；Alexenko等人，J.Interferon CytokineRes.17769-779；Gresser，J.Leukoc.Biol.61567-574)，但也有幾種自身免疫疾病與IFNα的表達增加有關，最顯著的是胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和全身性紅斑狼瘡(SLE)。
I型糖尿病，也就是自身免疫糖尿病或胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，是一種自身免疫疾病，該疾病的特徵是自身應性T淋巴細胞所引起的胰腺β細胞的選擇性破壞。(Bach，Endocr.Rev.15516-542；Castano和Eisenbarth，Annu.Rev.Immunol.8647-679；Shehadeh和Lafferty，Diabetes Rev.1141-151)。IDDM的病理學非常複雜，涉及遺傳易感性宿主中的後成動(可能是病毒感染)，胰腺β細胞和免疫系統之間的相互反應。許多細胞因子，包括IFN-α和IFN-γ，參與了人體與此病動物模型中的IDDM病理過程(Campbell等人，J.Clin.Invest.87739-742；Huang等人，Diabetes 44658-664；Rhodes和Taylor，Diabetologia 27601-603)。例如，已有報告說患IDDM病人的β細胞內存在胰Ifn-αmRNA表達和免疫反應性IFN-α(Foulis等人，Lancet 21423-1427；Huang等人，同上；Somoza等人，J.Immunol.1531360-1377)。IFN-α表達與人胰島內主要組織相容性複合物(MHC)IA類抗原的高表達有關(Foulis等人 同上；Somoza等人同上)。在自身免疫性糖尿病的兩種齧齒動物模型(易於患糖尿病的DPBB大鼠和鏈佐星處理的小鼠)中，胰島內Ifn-αmRNA的表達先於胰島炎和糖尿病(Huang等人，Immunity 1469-478)。此外攜帶雜交性人胰島素啟動子-Ifn-α構建物的轉基因小鼠發生了伴有胰島炎的胰島素分泌過少糖尿病(Stewart等人，Science 2601942-1946)。
看來胰島細胞在對潛在的致糖尿病性刺激如病毒能夠激發胰島炎過程的反應中局部表達了IFN-α。與IFN-α作為誘導劑的作用相一致，已顯示它能誘導人胰島內皮細胞產生細胞間粘連分子-1(ICAM-1)和HLAIa類分子，這會導致胰島炎時白細胞的滲出。(Chakrabarti等人.J.Immunol.157-522-528)。此外，通過誘導胰島內抗原提呈細胞上的共刺激分子ICAM-1和B7.2，IFN-α促進了T細胞的激活(Chakrabarti等人，Diabetes 451336-1343.1996)。這些研究集合在一起表明β細胞早期表達IFN-α在自身免疫性糖尿病的發病中可能是關鍵性的。雖然有許多報告提示IFN-γ涉及齧齒動物模型中IDDM的發生，但是該細胞因子的表達與人IDDM之間相關性很差。只是在所選出的具有明顯淋巴細胞滲入胰島的一組患者的胰島中，可能發現表達IFN-γ的細胞。而在不按此標準所選的患者組中沒有發現IFN-γ表達與人IDDM之間的明顯關係。
根據全身性紅斑狼瘡(SLE)病人IFN-α表達水平的增加，IFN-α也涉及SLE的病理過程(Ytterberg和Schnitzer，Arthritis Rheum.25401-406；Shi等人，Br.J.Dermatol.117155-159)。令人感興趣的是目前IFN-α正用於治療癌症與病毒感染，如B肝或C肝病毒感染引起的慢性肝炎。與IFN-α水平增高激發自身免疫病的觀察相一致，已報導接受IFN-α治療的病人中表現出自身免疫失調(如IDDM，SLE以及自身免疫性甲狀腺炎)明顯增加。例如，研究表明長期使用IFN-α作為抗病毒療法會引起IDDM(Waguri等人，DiabetesRes.Clin.Pract.2333-36；Fabris等人，J.Hepatol.28514-517)或SLE(Garcia-Porrua等人，Clin.Exp.Rheumatol.16107-108)。用IFN-α療法治療柯薩奇病毒B(CBV)感染，也與IDDM的引起相關(Chehadeh等人，J.Infect.Dis.1811929-1939)。類似地，在用IFN-α治療的癌症患者中有多個病例報告發現IDDM或SLE(Ronnblom等人，J.Intern.Med.227207-210)。
抗體療法隨著一些單克隆抗體(mAb)被批准於人體或者作後期臨床試驗考核，使用單克隆抗體作為治療已獲得了越來越多的接受。1986年美國食品和藥品署(FDA)第一個批准的mAb是用於治療同種異體移植排斥的抗-CD3(OKT3)。此後，mAb領域的前進步伐大為加速，尤其是1994年起，導致另外7個mAb被批准用於人體治療。這些包括1994年用於治療冠狀血管成形術併發症的ReoPro，1997年用於預防同種異體移植排斥反應的Zenapax(抗-CD25)，1997年用於治療B細胞非霍奇金淋巴瘤的Rituxan(抗-CD20)，1998年，最初用於治療Cyohn’s病並且隨後，在1999年用於治療風溼性關節炎的Infliximab(抗-TNF-α)，1998年用於預防同種異體移植排斥反應的Simulect(抗-CD25)，1998年用於治療呼吸道感染的Synagis(抗呼吸合胞病毒的-F蛋白質)，以及1998年用於治療HER2過度表達性轉移性乳腺癌的Herceptin(抗-HER2/neu)(Glennie和Johnson，Immunol.Today 21403-410)。
抗-IFN-α抗體經單克隆抗體治療幹預得以緩解的疾病狀態態包括所有那些靶抗原病理學水平得以改善的疾病。例如，能中和SLE患者血清中存在的和在IDDM中胰島表達的IFN-α的抗體，是治療帳幹預這些疾病的潛在候選物。這也可用於(具有IFN-α表達潛在性增加和起病因作用的其它自身免疫性疾病)的治療性幹涉。在人IDDM(Foulis等人，Lancet 21423-1427；Huang等人，Diabets 44658-664；Somoza等人，J.Immunol.1531360-1377)和人SLE(Hooks等人，Arthritis Rheumatism 25396-400；Kim等人，Clin.Exp.Immunol.70562-569；Lacki等人，J.Med.2899-107；Robak等人，ArchivumImmunologiae et Therapiae Experimentalis 46375-380；Shiozawa等人，Arthritis Rheumatism 35417-422；yon Wussow等人，RheumatologyInternational 8225-230)二者中，看起來疾病都與IFN-α有關，但與IFN-β或IFN-γ無關。因而，抗幹擾素mAb在IDDM或SLE中的幹預要求對大多數(如果不是所有的)的IFN-α亞型產生特異性中和而不引起IFN-β或IFN-γ的任何明顯性中和。保留後兩種幹擾素的活性完整也可能有利於保留明顯的抗病毒活性。
雖然已有描述說一些mAb對一定範圍的重組人IFN-α亞型顯示了反應活性，但發現只能中和所分析的重組IFN-α亞型的有限亞組或者對激活的外周血白細胞產生的IFN-α亞型混合物無中和能力(Tsukui等人，Microbiol.Immunol.301129-1139；Berg，J.Interferon Res.4481-491；Meager和Berg，J.Interferon Res.6729-736；US Patent No.4,902,618和EPpublication No.0,139,676 B1)。
因此對不僅能結合大多數，優選所有的IFN-α亞型而且能中和這些亞型同時不幹擾其它幹擾素生物功能的抗-IFN-α抗體有很大需發明簡述本發明以一種單克隆抗體的開發為基礎，該單克隆抗體在實驗中發現能中和所有7種受測試的不同的重組人IFN-α亞型和兩種天然人IFN-α亞型的獨立的合併物。
一方面，本發明提供了一種抗體人IFN-α單克隆抗體，該抗體能結合至少人IFN-α亞型IFN-α1，IFN-α2，IFN-α4，IFN-α5，IFN-α8，IFN-α10以及IFN-α21並中和其生物活性。另一方面，本發明提供了一種能結合所有人IFN-α亞型並中和其生物活性的抗人IFNα單克隆抗體。本發明的抗體能顯著降低或者消除該人IFN-α的生物活性。在一個實例中，本發明的抗體能中和目標人IFN-α的生物活性至少60％或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％。在另一實例中，這種中和人IFN-α生物活性的單克隆抗體不中和人IFN-β的相應生物活性。
目標人IFN-α的生物活性可以是IFNAR2結合活性。在一具體實施例中，本發明提供的抗人IFN-α單克隆抗體能夠結合所有的或基本上所有的人IFN-α亞型並阻斷IFNAR2結合活性至少60％或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％。在另一實施例中本發明提供一種抗人IFN-α單克隆抗體，它能結合每種人IFN-α亞型1、2、4、5、8、10和21並阻斷I FNAR2結合活性的至少60％或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％。在另一實施例中，該抗人IFN-α單克隆抗體不與人IFN-β交叉反應。
目標人IFN-α的生物活性可以是抗病毒活性。在一個實施例中，抗人IFN-α抗體能與所有的或基本上所有的人IFN-α亞型結合併中和其抗病毒活性。在另一實施例中，該抗人IFN-α單克隆抗體能結合每種人IFN-α亞型1、2、4、5、8、10和21並中和其抗病毒活性。一具體實施例中，本發明提供的抗人IFN-α單克隆抗體能夠結合所有的或基本上所有的人IFN-α亞型並中和其抗病毒活性的至少60％或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％。還有另一實施例中本發明提供的抗人IFN-α單克隆抗體能結合每種人IFN-α亞型1、2、4、5、8、10和21並中和其抗病毒活性的至少60％或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％。還有另一實施例中，這種中和人IFN-α的抗病毒活性的單克隆抗體不中和人IFN-β的抗病毒活性。
此抗體可以是小鼠，人源化或人抗體。此抗體可以是小鼠抗人IFN-α單克隆抗體9F3或它的人源化版本如版本13(V13)或其嵌合形式。本發明的範圍還包括能結合與小鼠抗人IFN-α單抗9F3或其人源化或嵌合形成基本上相同的IFN-α表位的抗體。例如，用於這一目的的參考抗體是2001年1月18日存放在ATCC的的登錄號No.PTA-2917的小鼠雜交瘤細胞系9F3.18.5產生的抗-IFN-α抗體。在另一實施例中，本發明提供了小鼠或鼠/人嵌合性抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體含有如圖5A(SEQ ID NO1)所示的小鼠輕鏈可變結構域胺基酸序列和/或圖5B(SEQ IDNO2)所示的小鼠重鏈可變結構域胺基酸序列。在另一實施例中本發明提供了人源化抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體含有如圖5A(SEQ ID NO3)所示的人源化輕鏈可變結構域胺基酸序列和/或圖5B(SEQ ID NO5)所示的人源化重鏈可變結構域胺基酸序列。
還提供了一種抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體能結合人IFN-α亞型1，2，4，5，8，10和21上的基本上相同表位，這些表位可被小鼠抗人IFN-α單克隆抗體9F3或其人源化或嵌合形式所結合。本文還提供了抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體能與小鼠抗人IFN-α單克隆抗體競爭與每種人IFN-α亞型1，2，4，5，8，10和21相結合。
也提供了編碼本文所述任一抗體的分離的核酸分子，含有該分離的核酸分子的載體，被該核酸分子轉化的宿主細胞和產生此抗體的方法，該方法包括在該核酸分子表達的條件下培養此宿主細胞以產生此抗體並任選地從此宿主細胞回收此抗體。此抗體可以是IgG類和亞型如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。本發明的範圍也包括抗體片段如Fv，scFv，Fab，F(ab『)2和Fab』片段。
另一方面，本發明提供抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈或其片段，它們包含以下CDR(如Kabat等人所定義，Sequences of Proteind of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD，第1-3卷)(a)式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO7)的L1；(b)式YASNLES(SEQ ID NOB)的L2；以及(C)式QHSWGIPRTF(SEQ ID NO9)的L3。本發明範圍也包括抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈片段的輕鏈可變結構域，本發明的範圍還包括抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈多肽，該多肽含有小鼠/人嵌合性輕鏈可變結構域胺基酸序列或整個嵌合性輕鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO.PTA-2880的XAIFNCHLpDR1載體所編碼。本發明的範圍還包括抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈多肽，該多肽含有人源化輕鏈可變結構域胺基酸序列或整個人源化輕鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO.PTA-2882的VLV30-IgG載體所編碼。
另一方面，本發明提供抗人IFN-α單克隆抗體重鏈或其片段，它們含有下述CDR(a)式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO10)的H1；(b)式SINPDYDITNYNQRFKG(SEQ IDNO11)的H2；以及(c)式WISDFFEY(SEQ ID NO12)的H3。本發明範圍也包括抗人IFN-α單克隆抗體重鏈片段的重鏈可變結構域，本發明的範圍還包括抗人IFN-α單克隆抗體重鏈多肽，該多肽含有小鼠/人嵌合性重鏈可變區胺基酸序列或整個嵌合性重鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO.PTA-2883的XAIFNChHpDR2載體所編碼。本發明的範圍還包括抗人IFN-α單克隆抗體重鏈多肽，該多肽含有人源化重鏈可變區胺基酸序列或整個人源化重鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存登錄號為NO.PTA-2881的VHV30-IgG2載體所編碼。
另一方面，本發明提供了抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體包含(A)至少一條輕鏈或其片段，它們含有如下CDR(a)式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO7)的L1；(b)式YASNLES(SEQ ID NO8)的L2；以及(C)式QHSWGIPRTF(SEQ ID NO9)的L3；(B)至少一條重鏈或其片段，它們含有如下CDR(a)式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO10)的H1；(b)式SINPDYDITNYNQRFKG(SEQ ID NO11)的H2；以及(c)式WISDFFEY(SEQID NO12)的H3；此抗體可以是含有兩個二硫鍵連接的抗體重鏈-輕鏈對的均質四聚體結構。本發明的範圍具體包括線形抗體，小鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體。還提供一種嵌合性抗體，該抗體包含小鼠/人嵌合性輕鏈可變區胺基酸序列或整個嵌合性輕鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC2001年1月9日保持的登錄號為NO.PTA-2880的XAIFNChLpDR1載體所編碼；和(2)小鼠/人嵌合性重鏈可變區胺基酸序列或整個嵌合性重鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為並獲專利NO.PTA-2883的XAIFNChLpDR2載體所編碼。本文還提供一種人源化抗體，該抗體包含人源化的輕鏈可變區胺基酸序列或整個人源化輕鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO.PTA-2882的VLV30-IgG載體所編碼；和(2)人源化的重鏈可變區胺基酸序列或整個人源化重鏈多肽胺基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號為NO.PTA-2881的VHV30-IgG2載體所編碼。
還有一方面，本發明提供了含有有效量的本發明抗體與藥學上可接受運載體相混合的藥物組合物。
還有一方面，本發明提供了診斷與細胞中IFN-α表達相關狀態的方法，該方法包括使抗-IFN-α抗體接觸細胞並檢測IFN-α的存在。
還有一方面，本發明提供了治療患者與IFN-α表達相關的疾病或狀態的方法，該方法包括給予患者有效量的抗-IFN-α抗體。該患者是哺乳動物，優選病人。該疾病是自身免疫性疾病，如胰島素依賴性糖尿糖(1DDM)；全身性紅斑狼瘡(SLE)，或自身免疫性甲狀腺炎。
圖表簡述

圖1表示用於產生抗人IFN-α單克隆抗體的策略的簡圖。
圖2表示能中和重組IFN-α亞型譜系但不能中和重組IFN-β的小鼠抗人IFN-αmAb(9F3)。測試了在mAb 9F3濃度增加時所示IFN，抑制腦心肌炎病毒在A549細胞內的生長。所述數據為在mAb 9F3缺乏時用所示IFN獲得的病毒生長抑制活性的百分比。
圖3A-3B顯示了白細胞幹擾素(Sigma)(圖3A)和淋巴母細胞幹擾素(NIH參考品Ga23-901-532)(圖3B)的中和作用。在圖3A中，將20000IU/ml(實心柱)或5000IU/ml(空白柱)的白細胞幹擾素(Sigma Product No.I-2396)與空白對照物(只有緩衝液)(以「-」表示)，10g/ml小鼠IgG對照物(以「mIgG」表示)，或10g/mlmAb9F3(以「9F3」表示)一起培育。測試諸稀釋液顯示，殘餘活性的量結果以一式二份測定的平均值表示。在圖3B中，測定了在所示濃度的mAb 9F3存在或不存在下，淋巴母細胞幹擾素在10(實心柱)或3(空白柱)IU/ml時的作用。較高的細胞病變效應表明幹擾素活性下降。所示結果為一式二份測定的平均值。
圖4描述了電泳遷移率變化試驗(EMSA)的結果，表明IFN-α誘生了ISGF3/ISRE複合物以及9F3 mAb能阻止該複合物的形成。在存在或缺乏25ng/ml濃度的人IFN-α2或IFN-β時用10g/ml濃度的9F3 mAb(以「9F3」表示)或小鼠IgG對照抗體(以「IgG」表示)進行了EMSA。
圖5A顯示了小鼠9F3(小鼠SEQ ID NO1)、人源化9F3版本13(V13，SEQ IDNO3)和共有的人可變區輕鏈κ亞基I族(huκI，SEQ ID NO；4)的輕鏈可變區的胺基酸序列的排列對比。CDR(L1，SEQ ID NO7；L2，SEQ ID NO8；以及L3 SEQID NO9)以下劃線突出顯示。殘基編號按照Kabat等人，(1991)同上，用星號標明小鼠9F3和V13序列之間的差異，以及9F3和HuKI序列之間的差異。
圖5B顯示了小鼠9F3(小鼠SEQ ID NO2)、人源化9F3版本13(V13，SEQ IDNO5)和共有的人可變區重鏈亞基III(huIII，SEQ ID NO；6)的重鏈可變區的胺基酸序列的排列對比。CDR(H1，SEQ ID NO10；H2，SEQ ID NO11；以及H3，SEQID NO12)以下劃線突出顯示。殘基編號按照Kabat等人，(1991)同上，用星號標明小鼠9F3和V13序列之間的差異，以及9F3和huIII序列之間的差異。
圖6顯示初始mAb 9F3(左圖)和嵌合蛋白質CH8-2(右圖)對受腦心肌炎(EMC)病毒攻擊的A549細胞中重組IFN-α亞型抑制病毒生長的中和活性。
圖7描述了人源化9F3版本13的模型。VL和VH結構域的骨架顯示為同緞帶。CDR以白色表示並作標記(L1，L12，L3，H1，H2，H3)。框架側鏈從人到小鼠的轉換以白色表示並了殘基編號。
優選實施例的詳細描述A.定義除非另有說明，本文所用的技術與科學術語具有本發明所屬領域普通技術人員共同理解的相同含義。見，例如Singleton等人，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology第二版，J.Wiley Sons出版(New York，NY 1994)；Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs HarborPress(Cold Springs Harbor，NY 1989)。為了本發明的目的，下述術語定義如下。
如本文所用，術語「I型幹擾素」定義為包括任何哺乳動物的自然序列的I型幹擾素的所有亞型，包括幹擾素-α，幹擾素-β，幹擾素-δ，幹擾素-ω和幹擾素-τ。類似的，術語「人I型幹擾素」定義為包括自然序列的I型人幹擾素的所有亞型，包括人幹擾素-α，幹擾素-β和幹擾素-ω種類並且它們能結合一共同的細胞受體。
除非另外提供解釋。本文所用術語「幹擾素-α」，「IFN-α」，「人幹擾素-α」，「人IFN-α」以及「hIFN-α」是指自然序列的人α幹擾素的所有種類，包括自然序列的人幹擾素-α的所有亞型。自然的(自然序列)人幹擾素-α包含23種或更多密切相關的蛋白質，這些蛋白質由具有高度結構同源性的獨特基因所編碼(Weissmann和Weber，Prog..Vucl.Acid Res.Mol.Biol，33251；J.Interferon Res，13443-444；Roberts等人J.Interferon CytokineRes.18805-816).人IFN-α基因包含兩個亞家族。第一亞家族包括至少14個有功能的非等位基因，包括編碼IFN αA，(IFN-α2)，IFN-αB(IFN-α8)，IFN-αC(IFN-α10)，IFN-αD(IFN-α1)，IFN-αE(IFN-a22)，IFN-αF(IFN-α21)，IFN-αG(IFN-α5)and IFN-αH(IFN-α14)的基因，以及至少具有80％同源性的擬基因。第二亞家族，αII或T，至少包含5個擬基因和1個功能性基因(本文以「IFN-αII1」或「IFN-T」表示)，該功能基因表現出與IFN-a基因70％的同源性(Weissmann和Weber同上)。
本文所用術語「第一種人幹擾素-α(hIFN-α)受體」，「IFN-αR」，「hIFNAR1」、「IFNARI」和「Uze鏈」是指由Uze等人，Cell，60225-234(1990)所克隆的557個胺基酸的受體蛋白質，包括409個殘基的胞外結構域，21個殘基的跨膜結構域，以及100個殘基的胞內結構域，如Uze等人的229頁圖5所示。上述術語還包括IFNAR1的片段，該片段含有IFNAR1的胞外結構域(ECD)或(ECD的片段)。
本文所用術語「第二種人幹擾素-α(hIFN-α)受體」，「IFN-αβR」，「hIFNAR2」，「IFNAR2」和「Novick鏈」是指由Domanski等人，J.Biol.Chen，3721606-21611(1995)所克隆的515個胺基酸的受體蛋白質，包含217個殘基胞外結構域，21個殘基跨膜結構域，和250個殘基胞內結構域，如Domanski等人在21608頁圖1所示。上述術語還包含IFNAR2的片段，該片段含有IFNAR2的胞外結構域(ECD)或(ECD的片段)，以及IFNAR2的可溶形式，如與免疫球蛋白序列融合的IFNAR2 ECD，例如下述的IFNAR2 ECD-IgG。
與I型幹擾素，IFN-a或其它多肽相連的術語「自然序列」，是指與相應的自然衍生的多肽具有相同胺基酸序列的多肽，不論它的製備方式如何。這樣的自然序列多肽可從自然中分離得到或通過重組和/或合成方法或其組合產生。術語「自然序列」具體包含該全長多肽的自然產生的截短或分泌形式(如，胞外結構域序列)，自然產生的變體形式(如交替剪接形式)和自然產生的等位變體。「聚合酶鏈反應」或「PCR」指一種過程或技術，在其中微量的核酸RNA和/或DNA的特定片段，如1987年7月28日公開的美國專利號NO.4,683,195中所述那樣被擴增。通常地，需要獲得感興趣的區域兩端或之外的序列信息，這樣可設計出寡核苷酸引物；這些引物的序列與待擴增模板的相反鏈相同或相似。兩種引物的5『末端核苷酸可與所擴增材料的兩末端重合。PCR可用於擴增特定的RNA序列，整個基因組DNA的特定DNA序列，全細胞DNA轉錄的cDNA，噬菌體或質粒序列，等等，見Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51263(1987)；Erlich，主編，PCRTechnology(Stockton Press，NY，1989).本文所用的PCR是一種(但不是僅有的)核酸聚合酶反應方法的一種例子，用於擴增測試的核酸樣品，其包括用已知核酸作為引物和核酸聚合酶來擴增或產生核酸的特定片段。
「抗體」(Ab)和「免疫球蛋白(Ig)」是具有相同結構特徵的糖蛋白。抗體表現出對特定抗原的結合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子，。例如，後一種多肽由淋巴系統低水平產生，骨髓瘤則可高水平產生。
「自然抗體和免疫球蛋白」通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，包含兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與一條重鏈相連，而且不同的免疫球蛋白同種型重鏈之間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也具有有規律相間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈一端為可變區(VH)，隨後是多個恆定區。每條輕鏈一端(VL)為可變區另一端為一恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一恆定區相連，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基形成了輕鏈和重鏈可變區之間的界面(Chothia等人，J.Mol.Biol.186651；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.824592；Chothia等人，Nature 342877-883)。
術語「可變」指如下情況抗體中可變區的某些部分在序列上極其不同，用於各個特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻分布於抗體的整個可變區中。它集中存在於輕鏈和重鏈可變區內稱謂互補決定域(CDR)或高變區的3個區段中。可變區中具有較高保守性的部分稱為框架區(FR)。每條天然輕鏈和重鏈的可變區都含有4個FR區，大部分採取β摺疊構形，與3個CDR相連；3個CDR形成環狀連接，有時形成β摺疊結構的一部分。每條鏈的CDR通過FR區緊密靠近，並與另一鏈的CDR一起構成抗體的抗原結合位點(見Kabat等人，同上)。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但表現出各種效應器功能，如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性。
抗體的木瓜蛋白質酶消化產生兩段相同的抗原結合片段，(稱為「Fab」片段，各具有一個抗原結合部分)和一殘餘的「Fc」片段，其名稱反映其易於結晶的能力。胃蛋酶處理產生F(ab』)2片段，其具有兩個抗原結合位點仍能交連抗原。
「Fv」是含有完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv中，該區域由非無共價鍵緊密聯接的輕鏈和重鏈可變區的二聚體組成。在單鏈Fv中，重鏈和輕鏈可變區可通過一柔性肽接頭共價連接，因而輕鏈和重鏈能以類似於雙鏈Fv中的「二聚體」結構相連。正是在這種構形中每個可變區的3個CDR互相作用確定了VH-VL二聚體表面的抗原結合位點。6個CDR共同賦予了抗體的抗原結合特異性。然而，儘管親和力低於完整的結合位點，一個可變區(或只含有對抗原特異的3個CDR的Fv的一半)仍然能識別並結合抗原。
Fab片段也含有輕鏈的恆定區和重鏈第一恆定區(CH1)。Fab『片段不同於Fab段的在於其包括了抗體鉸鏈區一個或多個半胱氨酸的重鏈CH1區羧基未端的幾個殘基。Fab』-SH指恆定區的半胱氨酸具有自由巰基的Fab』。F(ab』)2抗體片段最初產生為成對的Fab』片段，此成對Fab』段之間有鉸鏈半胱氨酸。其他抗體片段的化學交聯也是已知的。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的輕鏈可根據它們恆定區的胺基酸序列分成兩個明顯不同的類型之一，稱為κ和λ。
根據重鏈恆定區胺基酸序列，免疫球蛋白可分為不同類。有五大類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，這些類中的幾種可進一步分成亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ和μ。免疫球蛋白不同類的亞基結構和三維構形是眾所周知的。
術語「抗體」包括完整的免疫球蛋白的所有類和亞類。術語「抗體」也包括抗體片段。術語「抗體」尤其包括含抗體片段克隆的單克隆抗體，。
「抗體片段」包含完整抗體的一部分，其含有完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab，Fab『，F(ab』)和Fv片段；雙抗體(diabodies)；包括單鏈Fv(ScFv)分子的單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
本文所用術語「單克隆抗體」指從基本上均質的抗體群獲得的抗體(或抗體片段)，如，該均質抗體所含的抗體群除了可能自然產生的極少量突變外其他都相同。單克隆抗體具有高度特異性，只針對一個抗原位點。另外，與通常包括針對不同決定族(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製品相反，每種單克隆抗體只針對於抗原上的一個決定簇。除了它們的特異性，單克隆抗體的優點是可通過雜交瘤培養來合成，而且不會汙染其它免疫球蛋白。修飾詞「單克隆」表明該抗體的特徵是從基本上的質的抗體群獲得的，而不是通過任何特別方法構建成為所需的抗體產品。例如，可通過Kohler等人，Nature，256495(1975)最先描述的雜交瘤方法製備或用重組DNA方法(見，如美國專利號NO.4,816,567)製備用於本發明的單克隆抗體。「單克隆抗體」還包括含有抗體片段的抗原識別和結合位點的克隆(Fv克隆)，例如採用Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人J.Mol.Biol，222581-597(1991)中所述技術從噬菌體抗體文庫中分離獲得。
本文單克隆抗體尤其包括「嵌合性」抗體(免疫球蛋白)，此抗體中的重鏈和/或輕鏈部分與一種特定動物的或屬於某特定類或亞類抗體所衍生的抗體中相應序列相同或相似，而該鏈的其餘部分與另一種動物或屬於另一類或亞類抗體所衍生的抗體以及這些抗體的片段中相應序列相同或相似，只要他們表現出所需的生物活性授於Cabilly等人的美國專利號NO.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl，Acad.Sci.US，816851-6855))。
非人(如小鼠)抗體的「人源化」形式是嵌合性的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，Fab，Fab』，F(ab』)2或抗體的其它抗原結合序列)，其中含有從非人免疫球蛋白衍生的最小序列。人源化抗體大部分是人免疫球蛋白(受者抗體)；其中部分或全部的受者互補決定區(CDR)的殘基，被來自非人動物(供者抗體)(如大鼠、小鼠或家兔)的具有所需特異性、親和性和活性的殘基所取代。有些情況中，人免疫球蛋白的Fv構架區(FR)殘基被相應的非人殘基所取代。另外，人源化抗體可含有在受者抗體中或輸入的CDR或框架序列中都沒有的殘基。可進行這些修飾以進一步精細化和優化抗體的性能。總之，人源化抗體基本上至少含有1個，典型地2個可變區，其中CDR區全部或基本全部對應於非人免疫球蛋白的CDR區，而FR區全部或基本全部是人免疫球蛋白序列的FR區。較佳地，人源化抗體還至少含有免疫球蛋白恆定區的一部分，通常為人免疫球蛋白恆定區的一部分。更多細節見Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等人Nature，332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)；and Clark，Immunol.Today 21397-402(2000).人源化抗體包括PrimatizedTM。其中該抗體的抗原結合區域衍生自用感興趣抗原免疫的獼猴產生的抗體衍生。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的VH和VL區，其中這些區域以單一多肽鏈存在。通常，scFV多肽還包含VH和VL區之間的多肽接頭，這使scFV形成抗原結合的所需結構。對於scFv的綜述可見Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore編.Springer-Verlag，NewYork，269-315頁(1994)，Dall』Acqua和Carter，Curr，Opin，.Struct.Biol.8443-450(1998)和Hudson，Curr.Opin，Immunol.11548-557(1999)。
術語「雙抗體」指具有2個抗原結合位點的小抗體片段，該片段含有在同一多肽鏈(VH-VL)中的相連的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。採用的接頭短至不允許同一鏈上的兩個區域之間形成配對，而迫使此二結構域與另一條鏈的互補結構域配對從而產生兩個抗原結合位點。關於雙抗體的有更多描述，例如，見EP 404，097；WO 93/1116l；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad Sci，USA，906444-6448(1993)。
「分離的」抗體是已經鑑定與其天然環境成分相分離的和/或回收的抗體。其天然抗體環境的汙染成分是可能會干擾該抗體的診斷或治療應用的物質，可包括酶，激素以及其它蛋白質或非蛋白質溶質。在優選實施例中，可提純該抗體至(1)純度用Lowry方法測定抗體重量點95％以上，最好點重量99％以上，(2)提純至足夠獲得N-未端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的水平(使用轉杯式測序儀)，或(3)用考馬斯藍，或優選銀染色在還原或非還原條件下，用SDS-PAGE測定為均一性。由於沒有抗體天然環境的至少一種成分，分離的抗體包括重組細胞中原位產生的抗體。然而一般情況下，分離的抗體將經過至少一步純化步驟製備。
「中和性抗體」指一種抗體分子，該抗體分子能消除或顯著降低其所結合的靶抗原的效因器功能。因此，「中和性」抗IFN-α抗體能消除或顯著降低效因器的功能，如IFN-α的受體結合功能或對細胞反應的誘導。
對於本發明的目的，可監測抗-IFN-α抗體中和IFN-α的受體活化活性的能力，例如，在1995年6月1日公開的WO95/14930中所述的激酶受體活化(KIRA)試驗中，測定候選抗體降低IFNAR1/R2受體複合物的酪氨酸磷酸化(由於配體結合而致)。
對於本發明的目的，優選通過監測對IFN-α抗病毒活性的中和作用，測試抗-IFN-α抗體中和IFN-α的細胞應答誘導能力，如Kawade，J.InterferonRes.161-70(1980)，或Kawade和Watanabe，J.Interferon Res.4571-584(1984)，或Youesfi等人，Am，J，Clin，Pathol.83735-740(1985)所述，或通過在電泳遷移率變化試驗中，測試抗IFN-α抗體中和IFN-α激活信號分子，幹擾素-刺激因子3(ISGF3)，結合於幹擾素刺激反應元件(ISRE)衍生的寡酸苷酸的能力，如Kurabayashi等人Mol.Cell Biol.156386(1995)所述。
「顯著」降低指降低靶抗原(如IFN-α)的效因器功能(如受體，IFNAR2)結合和/或誘導細胞應答)至少60％，或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％。優選本文所定義的「中和性」抗體能中和IFN-α抗病毒活性的至少60％，或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％，如Kawade(1980)，同上或Yousefi(1985)，同上的抗病毒試驗所測定的那樣。在另一優選實施例中，本文所用「中和性」抗體由於與IFN-α結合，能降低IFNAR1/IFNAR2受體複合物的酪氨酸磷酸化至少60％，或至少70％，較佳至少75％，更佳至少80％，再佳至少85％，還要佳至少90％，還要更佳至少95％，最佳至少99％，如上述參考文獻KIRA試驗所測定的那樣。在一個特別優選實施例中，本文所用的中和性抗IFN-α抗體能中和全部，或基本全部的IFN-α亞型而不能中和IFN-β。在本文中，術語「基本上全部」指中和性抗IFN-α抗體能至少中和IFN-α1，IFN-α2，IFN-α4，IFN-α5，IFN-α8，IFN-α10，以及IFN-α21。
對於本發明的目的，抗IFN-α抗體阻斷IFN-α與受體結合的能力，定義在為競爭結合試驗中某濃度的抗體降低或消除IFN-α與IFNAR2結合的特性或能力，與此試驗中同等濃度的無關對照抗體對IFN-α結合IFNAR2的效果相比較。優選，與無關對照抗體相比，阻斷性抗IFN-α抗體降低IFN-α與IFNAR2的結合至少50％，或至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少99％。
對於本發明的目的，可用常規競爭試驗測定抗IFN-α抗體阻斷IFN-α結合IFNAR2的能力，如AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratoty，Harlow David Lane編(1988)所述。例如，可改進下述例2所述IFN-α結合ELISA試驗以採用在抗IFN-α抗體和可溶性IFNAR2之間的競爭結合。這一試驗按以下步驟進行在微量滴定板上包被IFN-α，將該包被板與混合了所選濃度的標記的IFNAR2 ECD人IgG Fc融合蛋白質的未標記抗IFN-α抗體或未標記對照抗體的連續的稀釋液一起培育，檢測各培育混合液中的信號，然後比較各抗體稀釋液顯示的信號測量結果。
在一具體優選實施例中，本文所用的阻斷性抗IFN-α抗體能阻斷全部或基本全部IFN-α亞型的IFNAR2-結合而不與IFN-β交叉反應。在本文中，術語「基本全部」指阻斷性抗IFN-α抗體將至少阻斷IFN-α1，IFN-α2，IFN-α4，IFN-α5，IFN-α8，IFN-α10，以及IFN-α21的IFNAR2結合。在一具體優選實施例中，本發明的阻斷性抗IFN-α抗體將阻斷所有已知的IFN-α亞型與IFNAR2的結合。
術語「表位」用於指蛋白質抗原上的(單可隆或多可隆)抗體結合位點。
可通過「表位作用」鑑定與特定表位結合的抗體。本領域有許多已知方法可用於作圖和特徵鑑定蛋白質上表位的位置，包括分辨抗體-抗原複合物的晶體結構，競爭試驗，基因片段表達試驗，和合成肽為基礎的試驗，例如，見Harlow和Lane的第11章，Using Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999所述。競爭試驗本文上下文都有討論。根據基因片段表達試驗，將編碼該蛋白質的開放可讀框隨機地或通過特定的遺傳構建而片段化，並測定該蛋白質的表達片段與所測抗體的反應活性。例如，在放射性胺基酸存在下，可用PCR產生基因片段然後在體外轉錄並翻譯為蛋白質。再用免疫沉澱和凝膠電泳測定該抗體與放射性標記的蛋白質片段的結合。採用展示在噬菌顆粒表面的隨機肽序列大文庫(噬菌體文庫)也可鑑定某些表位。或者，可在簡單結合試驗中測試結合於測試抗體的重疊肽片段的確定文庫。後一種方法適合於確定5到15個胺基酸的線形表位。
能結合於「基本上相同表位的抗體」，可作為參比抗體，當兩種抗體識別相同或空間重疊的表位時。測定兩表位與相同或空間重疊的表位是否結合的應用最廣泛和快速的方法，是使用標記抗原或標記抗體的競爭試驗，該試驗可有各種不同形式的布局。通常，將抗原固定在96孔平板上，用放射性或酶標記測量未標記抗體阻斷標記抗體結合的能力。
本文所用術語胺基酸或胺基酸殘基，指天然存在的L胺基酸或指下文所述變體的D胺基酸。本文使用通常所用的表示胺基酸的1字母和3字母縮寫(BruceAlberts等人，Molecular Biology of The Cell，Garland Publishing，Inc.，NewYork(第三版1994)。
本文所用關於多肽序列的「百分比(％)胺基酸序列相同性」，定義為在排列序列和導入缺口(如需要)，以獲得最大百分比的序列相同性而不將任何保守性替換看作部分序列相同性後候選序列中的胺基酸殘基與某序列中的胺基酸殘基相同的百分比。可以各種方法獲得排列對比以測定胺基酸序列相同性的百分比這在本領域技術之內，例如，可採用公眾可獲得的計算機軟體如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域那些技術人員可確定測量排列對比的適當參數，包括需要獲得被比較序列全長的最大排列對比的算法。為此目的，如下文所述使用序列對比電腦程式ALIGN-2，可獲得胺基酸序列相同性的百分比。ALIGN-2序列對比電腦程式由Genentech，公司製作，其原代碼與使用者文件已在美國版權辦公室，華盛頓特區，20559登記備案，它在美國版權登記處登記號為NO.TXU510087。ALIGN-2程序可通過Genentech，公司.，(舊金山南部，加利佛尼亞)公開獲得，而ALIGN-2程序的原代碼和其使用指南在國際專利申請出版物2000年7月6日的WO2000/39297中公布。ALIGN-2程序應編制為在UNLX作業系統上使用，較佳地是數字UNLX V4.0 D。所有的序列對比參數由ALIGN-2程序設置且不變。
用於本文目的，某給定胺基酸序列A對某給定胺基酸序列B的胺基酸序列相同性百分比(或者描述為某給定胺基酸序列A具有或含有與某給定胺基酸序列B的胺基酸序列相同性百分比)計算如下
100乘以分數X/Y其中X是在A和b的程序性對比中，經序列排列對比程序ALIGN-2評價為相同性匹配的胺基酸殘基數目，而Y是B中的胺基酸殘基總數。可以理解胺基酸序列A的長度不等同於胺基酸序列B的長度時，A對B的胺基酸序列相同性百分比並不等於B對A的胺基酸序列相同性百分比。除非另有特別說明，本文所用的所有胺基酸序列相同性百分比數值均如上所述獲自採用ALIGN-2序列對比的電腦程式。然而，胺基酸序列相同性百分比也可採用序列對比程序NCBI-BLAST2測定(Altschul等人，Nucleric Acids Res.253389-3402(1997))。NCBI-BLAST2序列對比程序可從http//www.ncbi.mlm，nih.gov下載。NCBI-BLAST2使用一些檢索參數，其中對預設值設置的所有的這些檢索參數，包括，例如，無屏蔽＝是，鏈＝全部，期望的事物出現＝10，最低複雜性長度＝15/5，多遍e值＝0.01，多遍常數＝25，最終空格排列對比逐漸消失＝25以及評分(scoring)矩陣＝BLOSUM62。
在採用NCBI-BLAST2作胺基酸序列對比的情況下，某給定胺基酸序列A對某給定胺基酸序列B的胺基酸序列相同性百分比(或者描述為給定胺基酸序列A具有或含有與給定胺基酸序列B的胺基酸序列相同性百分比)計算如下100乘以分數X/Y其中X是在A和B的程序性對比中，經序列排列對比程序NCBI-BLAST2評價為相同性匹配的胺基酸殘基數目，而Y是B中的胺基酸殘基總數。可以理解胺基酸序列A的長度不等同於胺基酸序列B的長度時，A對B的胺基酸序列相同百分比並不等於B對A的胺基酸序列相同性百分比。
當核酸被放置在與另一核酸序列功能性相關的位置上時，是「操作性相連接」的。例如，如果表達為參與某多肽分泌的前蛋白時，應將前序列或分泌前導序列的DNA與該多肽的DNA操作性相連接；如果要影響某序列轉錄，應將啟動子或增強子與該編碼序列操作性相連接。或者如果要使某序列定位而易於翻譯，應將核糖體結合位點與該編碼序列操作性相連接。通常「操作性連接」指所連接的DNA序列是毗鄰的，如果是分泌性前導序列，應是毗鄰且在讀碼框內。然而，增強子不需要毗鄰，可在方便的限制性位點上通過連接反應即實現此種連接。如果沒有這樣的位點，可按常規方法採用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
術語「疾病狀態」指細胞或整個哺乳動物的一種生理狀態，該狀態中發生了細胞或身體功能，系統或器官功能的中斷，停止或失調。
術語「有效量」指治療哺乳動物的疾病，失調或有害生理狀態的藥物有效量。在本發明中，「有效量」的抗IFN-α抗體可以降低減緩或延遲自身免疫失調症如IDDM或SLE；降低，防止或抑制(即，某種程度的減緩優選停止)自身免疫失調症如IDDM或SLE的發生；和/或某種程度上減輕一種或多種與自身免疫失調症如IDDM或SLE有關的症狀。
在本發明方法中，術語「控制」和其語法異體詞，是指對有害狀態(即生理狀態，如自反應T細胞的產生和自身免疫性的發生)的防止，部分或完全抑制，降低，延遲或減緩。
「治療」指治療性處理和預防或防止措施。需要治療者包括那些已患有疾病和那些易患疾病或那些必須預防疾病者。對於本發明的目的，有益的或所需的結果包括，但不限於，緩解症狀，減輕疾病程度，穩定(即不惡化)疾病狀態，延遲或減緩疾病的發展，好轉或減輕疾病狀態，減輕(無論部分或全部)，無論是可檢測或不可檢測。「治療」還指與不接受治療的預期存活相比的延長存活。需要治療者包括那些已患疾病或失調症和那些易患疾病或那些必須預防疾病者。
「藥物學上可接受的」運載體、賦形劑，或穩定劑是在所用的劑量和濃度下對接觸其的細胞或哺乳動物無毒的那些。生理上可接受的運載體常常是水溶性的PH緩衝溶液。生理上可接受的運載體的實例包括緩衝液，如磷酸鹽，檸檬酸和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；小分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯燒酮；胺基酸，如甘氨酸，穀氨醯胺，天冬醯胺，精氨酸，或賴氨酸；單糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑，如TweenTM，聚乙二醇(PEG)，和PluronicsTM。
治療對象「哺乳動物」指任何種類的哺乳動物，包括人，家養動物和家畜，和動物園動物，競賽用或寵物動物，如狗，馬，貓，牛等。優選的哺乳動物是人。
B.進行本發明的方法1抗體的產生(i)多克隆抗體製備多克隆抗體的方法是本領域已知的。可在哺乳動物體中產生多克隆抗體，例如，一次或多次注射某免疫製劑和(如果需要)佐劑。通常，可通過多處皮下或腹膜內注射將該免疫製劑和/或佐劑注射入哺乳動物體內。可採用的是將該免疫製劑與已知在被免疫接種的動物體中具有免疫原性的蛋白質偶聯。可採用的佐劑例子包括弗氏佐劑和MPL-TDM。
在另一優選實施例中，可用各種，優選所有的IFN-α亞型的混合物免疫接種動物，以產生對IFN-α諸亞型具有廣泛反應活性的抗IFN-α抗體。在另一優選實施例中，用人IFN-α諸亞型的混合物免疫接種動物，這些亞型存在於仙臺病毒所誘導的伯基特淋巴瘤細胞(Namalva細胞)分泌的人淋巴母細胞幹擾素中，如下文例l所述那樣。該人淋巴母細胞幹擾素的合適製品可從Sigma chemical companySt.Louis Mo購得(產品號No.1-9887)(ii)單克隆抗體單克隆抗體可用雜交瘤方法(最初由Kohler等人，Nature 256495(1975)所述)製備，或用重組DNA法(美國專利號NO 4,816,567)製備。
在雜交瘤方法中，將小鼠或其他合適的宿主動物，如倉鼠或獼猴，按如上所述進行免疫接種以誘導產生或能產生抗體的淋巴細胞，該抗體能與免疫接種所用的蛋白質特異性結合。或者，體外進行淋巴細胞免疫接種。然後以合適的融合劑(如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，59-103頁[Academic Press，1996]。
將如此製得的雜交瘤細胞接種在合適的培養基中培育，培養基優選含有1種或多種能抑制未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，該雜交瘤細胞的培養基通常將包括次黃嘌呤，氨基蝶呤，和胸苷(HAT培養基)，其中的物質能阻止HGPRT缺陷性細胞的生長。
優選的骨髓瘤細胞是那些能有效融合，能支持選出的抗體生成細胞穩定性高水平產生抗體，且對培養基如HAT培養基敏感的骨髓細胞。其中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由MOP-21和MC-11小鼠腫瘤衍生的骨髓細胞(可從美國加利福尼亞聖地牙哥Salk Institute Cell Distribution中心購得)和SP-2或X63-Ag8-653細胞(可從the American Type Collection，Rockcville，Maryland USA購得)也報導了。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系來產生人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.1333001.(1984)；Brodeur等，單克隆抗體產生的技術和應用，51-63頁，Marcel Dekker，Inc.，New York，)。
測定有雜交瘤細胞生長的培育液是否產生了針對該抗原的單克隆抗體。優選用免疫沉澱法或體外結合試驗(如放射免疫試驗(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA))測定雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性。
例如單克隆抗體的結合親和力可用Scatchard分析法(Mvnson等人AnalBiochem.107220(1980))測定。
鑑定到產生具有所需特異性，親和力，和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，可將該細胞用有限稀釋法亞克隆並用標準方法培養(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，59-103頁Academic Press，1996)。為此目的的合適培育基包括，如DMEM或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞也可在動物體內作為腹水瘤生長。
通過常規的免疫球蛋白純化方法，如A蛋白瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法，凝膠電泳，透析或親和層析法，可將亞克隆分泌的單克隆抗體適當地從培育基中，腹水中，或血清中分離出來。
用常規方法(如，採用能與單克隆抗體重鏈和輕鏈的編碼基因特異性結合的寡核苷酸探針)，不難將編碼單克隆抗體的DNA分離出來並測序。雜交瘤細胞可作為此種DNA的優選來源。一旦分離出來可將，該DNA置入表達載體中，然後染入宿主細胞如大腸桿菌細胞，猴COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞中，以獲得在重組宿主細胞中的單克隆抗體的合成，也可修飾此DNA，例如，用人重鏈和輕鏈恆定區的編碼序列取代同源小鼠序列(Morrison等人，Proc.Nat.Acad，Sci.816851或者將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接。按此方式製備具有本文抗IFN-α單克隆抗體的結合特異性的「嵌合性」或「雜交」抗體。
通常用這種非免疫球蛋白多肽取代本發明抗體的恆定區或取代本發明抗體的一個抗原結合位點的可變區，以產生一種嵌合性二價抗體，該抗體含有一個對IFN-α特異性的抗原結合位點和對一個不同抗原有特異性的另一抗原結合位點。
也可採用已知的合成蛋白質化學方法(包括那些涉及交連劑的方法)體外製備嵌合性或雜交抗體。例如，採用二硫交換反應或形成硫醚鍵來構建免疫毒素。用於此目的的適合試劑包括亞胺硫醇鹽和甲基-4巰基丁醇-rimidate。
抗體的重組製備將在下文更詳細描述。
(iii)人源化抗體人源化抗體通常具有從非人類來源引入其中的一個或多個胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常稱作「輸入」殘基，該殘基通常取自「輸入」的可變區。人源化可用Winter及其同事的方法通過用齧齒動物的CDR或CDR序列取代人抗體的相應序列來進行(Jones等人，Nature 321522-525；Riechman等人，Nature332323-327；Verhoeyen等人，Science 2391534-1536；Clark，Immunol.Today 21397-402)。
因此，這樣的「人源化」抗體是嵌合性抗體(Cabilly，同上)，其中基本上不到一個完整的人可變區被非人動物的相應序列所取代。實踐中，人源化抗體通常是人抗體中的一些CDR殘基和可能一些FR殘基被齧齒動物抗體的同功能部位的殘基所取代。
重要的是待人源化的抗體保留了對抗原的高度親和力以及其它有利的生物特性。為了達到這一目標，根據優選的方法，利用親代與人源化序列的三維模型通過分析親代序列和不同概念的人源化產物過程，製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為本領域技術人員所熟悉。闡述並演示所選的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構型結構的電腦程式市場有售。視查這些演示得以分析候選免疫球蛋白序列的殘基在功能中的可能作用，如，分析能影響免疫球蛋白與其抗原結合能力的殘基。這樣，可從共有序列和輸入序列中選出FR殘基並組合從而獲得所需的抗體特性，如對靶抗原的親和力增加。總之，CDR殘基直接並最根本地參與了對抗原結合的影響。進一步詳述見美國專利No.5821337。
(iv)人抗體由於缺乏合適的人骨髓瘤細胞系，使用相同技術產生人mAb的嘗試受到阻礙。用雜交骨髓瘤(小鼠*人雜交骨髓瘤)作為融合伴侶(Kozbor，J.Immuno.1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Production Techniques andAoolications，51-63頁，Marcel DEKKER，Inc.，New York，1987)獲得了最好結果。
或者，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使人抗體分泌細胞無限增殖。然而，EBV感染細胞難於克隆而且通常只產生相對低得率的免疫球蛋白(James和Bell，J.Immunol.Methods 1005-40)將來，通過導入轉化基因的確定組合可能獲得人B細胞的無限增殖化。最近證明端粒酶催化亞基與SV40大T瘦蛋白和H-ras致癌等位基因一起表達導致正常人上皮細胞和成纖維細胞的致癌性轉變突出了這種可能性(Hahn等人，Naature 400464-468)現在，已能夠產生轉基因動物(如小鼠)這些動物(經免疫接種)產生沒有內源免疫球蛋白產物的人類抗體文庫(Jakobobvits等人，NATURE 362255-258；Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93；Fishwild等人，Nat.Biotechnol.[4845-851919960；Mendez等Nat.Genet，15146-156(1995)；Gru，JImmunol Methods 23111-23；Tomizuka等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97722-727；綜述見Little等人，.Innunol.Today 21364-370)例如，已有描述說在嵌合性和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合性缺失導致完全抑制內源抗體的產生(Jakobovits等人，Proc.Natl.Scad.Sci.USA902551-2555)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這類種系突變小鼠中導致了抗原攻擊後人抗體的產生Jakobovits等Nature，362255-258.1993)。
Meudez等人(Nature Genetics 15146-156)已製備了一種轉基因小鼠，命名為「XenoMouseII」，當受到抗原攻擊時，它會產生高親和力的人抗體。這可通過將兆鹼基的人重鏈和輕鏈基因座位種系整合引入上述缺失的活性JH區段的小鼠體內而獲得。XenoMouseII含有1,020Kb的人重鏈基因座(約含有66個VH基因，完整的DH合JH區以及3個不同的恆定區μ，δ，γ)，還含有800Kb的人K基因座(含有32個VK基因，JK區段，和CK基因)。這些小鼠產生的抗體與人抗體在所有方面看都極為相似，包括基因重排，組裝，以及所有組分。由於缺失內源JH區段阻止了小鼠基因座的基因重排人抗體優先於內源抗體而表達。
Tomizuka等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727).最近描述了通過在一種內源性IgH和IgK基因座被滅活的小鼠品種導入兩個獨立的人染色體片段(hcFS)一個含有整個Ig重鏈基因座(IgH，約1.5Mb)而另一個含有整個K輕鏈(IgK，約2Mb)，產生了一種雙轉移染色體(TC)小鼠。這些小鼠產生了抗原的人抗體應答反應而無小鼠抗體。此TC技術使得能夠在小鼠或其他動物中進行兆鹼基的複雜的基因座或基因簇(如編碼T細胞受體，主要組織相容性複合體，P450簇等)的人源化。該方法的另一優點是不需要克隆大的基因座。其顯著優點是因為即使使用酵母人工染色體含有整個Ig基因座的兆鹼基大小的DNA片段的克隆仍然難以進行。(Peterson等人.Trends Genat.1361-66；Jacobovits，Cvrr Biol.4761-763).此外，已知人IgH基因座的恆定區含有難於克隆的序列(Kang和Cox，Genomics 35189-195)。
另外，可採用噬菌體展示技術從未免疫接種供體的免疫球蛋白可變(V)區基因文庫體外產生人抗體和抗體片段(McCafferty等人，Mature 348552-553；綜述見Kipriyanov和Litlle，Mol.Biotechnol.12173-201；Hoogenboom和Chames.Immunlo.Today 21371-378)。根據這一技術，可將抗體V區基因框內克隆入絲狀噬菌體如M13或fd的大或小包膜蛋白質基因中，並在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基於抗體功能特性的選擇也導致了顯示這些特性的抗體的編碼基因的選擇。因而，噬菌體模擬了B細胞的部分特性。噬菌體展示可以多種形式進行(綜述見Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3564-571；Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12422-455；Dall』Acqua和Carter，Curr.Opin.Struct.Biol.8443-450；Hoogenboom和Chames，Immunol，Today 21371-378).V基因區段的一些來源可用於噬菌體展示。Clackson等(Nature352624-628，1991)從免疫小鼠脾臟獲得的V基因小隨機組合文庫中分離得到抗噁唑酮抗體的多樣性陣列。按照Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597，或Griffiths等人EMBO J.12725-734(1993).所述技術可構建未經免疫的人供體的V基因文庫和分離得到針對抗原(包括自身抗原)的多樣性陣列的抗體。在天然免疫應答中，抗體基因高速積聚突變(體細胞突變)。導入的某些變化將賦予更高的親和力，在隨後的抗原攻擊期間展示高親和力表面免疫球蛋白的B細胞優先複製和分化。採用稱為「鏈改組」的技術可以模擬這一自然過程(Marks等人，Bio/Techol.10779-783)。在該方法中，噬菌體展示獲得的「原代」人抗體的親和力可通過隨後用未經免疫供體的V區基因的天然存在的變體文庫置換重鏈和輕鏈V區基因而改進。這一技術得以產生具有nM範圍親和力的抗體和抗體片段。製備極大噬菌體抗體文庫的方法(也稱為「母體全文庫」)已由Waterhouse等人Nucl.Acids Res.212265-2266(1993)所描述，而且已報導了從此種大噬菌體文庫中直接分離得到高親和力的人抗體，見Griffiths等人，EMBO J.133245-3260(1994)。基因改組也可用於從齧齒動物中衍生出人抗體，其中該人抗體具有與起始齧齒動物抗體類似的親和力和特異性。根據這一方法，也稱為「表位印記法」，用人V區基因文庫取代，噬菌體展示技術獲得的鼠抗體重鏈或輕鏈V區基團，產生了鼠-人嵌合體。經抗原選擇導致分離得到能恢復功能性抗原結合位點的人可變區，如，表位控制的(印記)伴侶選擇。重複這一過程以取代其餘的鼠V區，獲得了人抗體(見PCT專利申請WO 93/06213，公布於1993年4月1日)。與傳統的CDR移植人源化齧齒動物抗體不同的是，該技術提供了完整的人抗體，該抗體沒有齧齒動物來源的框架或CDR殘基。
(V)雙特異性抗體雙特性異抗體是對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體(優選人或人源化抗體)。在本例中，結合特異性的其中一種是對IFN-α的而提供了中和抗體，而另一種是對其它任何抗原。
本領域已知製備雙特異性抗體的方法。傳統上，雙特異性抗體的重組產生基於兩條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello.Nature 305537-539)。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分類，這些雜交瘤(混血瘤)產生了10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。此種正確分子的純化(通常以親和層析法進行)相當麻煩且產量低。類似方法公開於PCT申請出版物NO.WO 93/08829中(1993年5月13日出版)，和Traunecker等人，EMBO J.103655-3659(1991)。
根據一種不同而且更優選的方法，將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區或與免疫球蛋白恆定區序列融合。優選與至少含有鉸鏈區，CH2和CH3區的免疫球蛋白恆定區配合。優選在至少一個融合物中存在含有輕鏈結合必須位點的重鏈第一恆定區(CHI)可將編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA和。如果需要的話編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體中，共轉染入合適的宿主生物中。當所用三條多肽鏈以不相等比率構建時，該方法在實施中為調節此三條多肽片段的互相比例提供了很大靈活性。然而，當至少兩條多肽鏈以相同比例表達以產生高得率或此比例沒有特別意義時，可以將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。在該方法的一個優選實施例中，該雙特性抗體一臂上為具有第一種結合特性的雜交免疫球蛋白重鏈，而另一臂上為雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二種結合特異性)。已發現，由於免疫球蛋白輕鏈只存在於該雙特性分子的一半中這提供了容易的分離方法，這種不對稱結構有利於從不需要的免疫球蛋白鏈混合物中分離中所需的雙特異性組合物。
產生雙特異抗體的更多細節見，例如Suresh等人，Methods in Enzymology121，210(1986)。
(VI)異質偶聯抗體異質偶聯抗體也在本發明範圍之內。異質偶聯抗體含有兩個共價連接的抗體。例如，已提出這樣的抗體可將免疫系統細胞靶向不良細胞(美國專利號NO.4,676,980)，和治療HIV感染(PCT申請出版物WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。可用方便的交連方法製備異質偶聯抗體。適合的交連劑是本領域所熟知和並與一些交連技術一起公開於美國專利號NO.4,676,980中。
(VII)抗體片段在某些實施例中，中和性抗IFN-α抗體(包括小鼠，人和人源化抗體，以及抗體變體)是一種抗體片段。已發展了各種技術來製備抗體片段。傳統上通過完整抗體的蛋白酶消化衍生這些片段(見，Morimoto等人J.Biochem.Biophys.Methods24107-117和Brennan等人.，Science 22981。然而，這些片段現在可用重組突主細胞直接生產(綜述見Hudson，Curr.Opin.Immunol.11548-557；Little等人Immunol.Today 21364-370)。例如，可從大腸桿菌直接回收Fab』-SH片段並化學偶聯形成F(ab』)2片段(Carter等人.，Bio/Technology 10163-167)。在另一實施例中，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進F(ab』)2分子的裝配來形成F(ab』)2。根據另一方法，Fv，Fab或F(ab』)2片段可從重組宿主細胞培育中直接分離得到。熟練從業者知道製備抗體片段的其它技術。
(VIII)抗體的胺基酸序列變體考慮了本文所述抗IFN-α抗體的胺基酸序列修飾。例如，可能需要改善的抗體的結合親和力和/或其他生物特性。通過在編碼抗IFN-α抗體鏈中的核酸中導入合適的核苷酸變化或通過肽合成，製備抗IFN-α抗體的胺基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，缺失，和/或插入和/或取代抗IFN-α抗體的胺基酸序列內的一些殘基。製作缺失、插入，和取代的任何組合以獲得最終結構，只要該最終結構具有所需特性。胺基酸變化也可能改變抗IFN-α抗體的翻譯後加工，如改變糖基化位點的數目或位置。
中和性抗IFN-α抗體的某些殘基或區域(優選的誘變位置)的常用鑑定方法稱為「丙氨酸掃描誘變法」如Cunningham and Wells Science，2441081-1085(1985)所述。要鑑定的殘基或靶殘基組(如帶電殘基，精氨酸，天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，和穀氨酸)用中性或負電荷胺基酸替代(最優選是丙氨酸或聚丙氨酸)以影響胺基酸與抗原的相互作用。然後那些對於取代表現出功能敏感的胺基酸位置通過在取代位點進一步導入其它突變體而轉細化。這樣，雖然預先確定了導入胺基酸序列突變的位點，但不需要預先確定突變本身的性質。例如為了分析某給定位點的突變性能，在靶密碼子或區域進行丙氨酸掃描或隨機誘變並篩選具有所需活性的表達的抗IFN-α抗體變體。
胺基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端的融合(長度範圍從一個殘基到包含100個或更多殘基的多肽)以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。未端插入的例子包括具有N未端甲硫醯殘基的抗IFN-α中和性抗體，或與一表位尾融合的抗體。抗IFN-α抗體分子的其他插入性變體包括與能增加抗體的血清半衰期的酶或多肽抗體的N或c未端融合。
另一類變體是胺基酸取代變體。這些變體在中和性抗IFN-α抗體分子中至少有一個胺基酸殘基被去除並在其位置插入了一個不同的殘基。取代誘變的最有利位置包括高變區。但也考慮FR的交替。保守性取代見表1題頭為「優選的取代物」。如果這些取代導致生物活性改變，那麼可，見表1中稱為「示範性取代」，或如下文所述參見胺基酸分類導入更多的實質性變化並篩選產物。
表一
選擇(a)取代區多肽主鏈的結構，例如片層或螺旋構型，(b)靶位點上分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小的作用明顯不同的取代，進行抗體生物特性的實質性修飾。根據共同的側鏈性質，將天然存在的殘基分成以下幾組(1)疏水的正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，頡氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；(2)中性疏水的半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；(3)酸性的天冬氨酸，穀氨酸，；(4)鹼性的天冬醯胺，穀氨醯胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族的色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
(7)非保守性取代需要將這些類別之一的一個成員換成另一類別的成員不參與維持中和性抗IFN-α抗體正確構型的任何半胱氨酸殘基也可被取代(通常用絲氨酸)以改善該分子的氧化穩定性並防止異常交連。相反，可向抗體加入半胱氨酸鍵以改善其穩定性(尤其當抗體是如FV片段的抗體片段時)。
特別優選的取代變體類型包括取代親代抗體(如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘基。通常，為進一步發展，產生的所選變體將具有改進的生物活性(相對於產生它們的親代抗體而言)。產生這樣的取代變體的方便方法是通過噬菌體展示的親和力成熟。簡單而言，可進行幾個高變區位點(如6-7位點)的突變以在各個位點產生所有可能的氨基取代。如此產生的抗體變體作為融於包裹在每個顆粒中的M13基因III產物，以單價形式從絲狀噬菌體顆粒中展示。然後如本文所述篩選噬菌體展示的變體的生物活性(如，拮抗劑活性)。為了鑑定進行修飾的候選高變區位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑑定對抗原結合有明顯貢獻的高變區殘基。或者，或另外，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑑定抗體和IFN-α之間的接觸點可能是有利的。根據本文所述技術，這種接觸殘基和相鄰殘基是取代的候選者。一旦產生這樣的變體，如本文所述掃描變體組和在一個或多個相關試驗中選出具有優良特性的抗體來進一步開發。
(IX)糖基化變體抗體在它們的恆定區保守位置上糖基化。(Jefferis和Lund，Chem.Immunol.65111-128；Wright和Morrison，Biotechnol.1526-32)。免疫球蛋白的寡糖側鏈影響蛋白質的功能(Boyd等人.，Mol.Immunol.321311-1318；Wittwe和Howard，Biochem.294175-4180)，和在能影響糖蛋白構型和提供三維表面的糖蛋白部分之間的分子內相互作用(Jefferis和Lund，同上，；Wyss和Wagner，Current Opin.Biotdch.7409-419-6)。寡糖也能根據特導性識別結構將給定的糖蛋白靶向某些分子。例如，已有報導說在半乳糖基化的IgG中，其寡糖部分翻轉出-CH2內部間隔，使未端N-乙醯葡糖胺殘基可結合甘露糖結合蛋白質(Malhotra等人.，Nature Med.1237-243)。從中國全鼠卵巢(CHO)細胞主生的CAMPATH-1H(識別人淋巴細胞的CDW52抗原的重組人源化鼠單克隆IgG1抗體)中去除寡糖的糖肽酶，導致補體介導的裂解(CMCL)完成減低(Boyd等人Mol.Immunol.321311-1318，而使用神經氨酸酶選擇性去除唾液酸殘基不會引起DMCL的損失。也已報導抗體的糖基化會影響依賴於抗體的細胞毒性(ADCC)。特別地，根據報導，具有四環素調節的β-(1，4)-N乙醯葡糖胺轉移酶III(GnTIII)(一種催化等分GLCNAc形成的糖基轉移酶)表達的CHO細胞，具有改進的ADCC活性(Umana等Meture Biotech，17176-180，1999)。
通常抗體的糖基化是N連接或O連接。N連接指糖部分結合於天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何胺基酸)是糖部分與天冬醯胺側鏈的酶促結合的識別序列。這樣，在多肽中存在這些三肽序列之一產生了潛在的糖基化位點。O連接糖基化是指糖乙酸半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一結合於羥賴氨酸，最常見的是絲氨酸或蘇酸，雖然也可用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸)。
抗體的糖基化變體是抗體的糖基化模式被改變的變體。改變意味著抗體中缺失一個或多個糖分子部分，在抗體中加入一個或多個糖分子部分，改變糖基化組成(糖基化模式)和糖基化程度，等等。
通過改變胺基酸序列可方便地實現將糖基化位點加入抗體中，使其包含一個或多個上述的三肽序列(對於N連接糖基化位點)。也可在原抗體序列中加入或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基進行這種改變(對於O連接糖基化位點)。類似地，改變抗體的天然糖基化位點內的胺基酸也可實現糖基化的消除。
通過改變核酸序列通常可改變胺基酸序列。用本領域已知的各種的方法製備抗-IFNα抗體的胺基酸序列變體的編碼核酸分子。這些方法包括但不限於，從天然來源中(天然存在的胺基酸序列變體中)分離，或通過對抗-IFN抗體的先前製備的變體或非變體的寡酸苷酸介導(或定點)的誘變、PCR誘變和盒式誘變來製備。
也可不改變胺基酸序列或核苷酸序列而改變抗體的糖基化(包括糖基化模式)。糖基化主要取決於用於表達抗體的宿主細胞。由於作為潛在治療劑使用的表達重組糖蛋白(如抗體)的細胞類型極少為天然細胞，可以預見抗體糖基化模式的明顯變異(見Hse等人J Biol.Chem，2729062-9070.1997)除了選擇宿主細胞外，在抗體重組產生過程中影響糖基化作用的因素包括生長方式，培養基配方，培養密度，氧合作用，PH值，純化方案等。業已提出各種方法在具體宿主生物體中獲得糖基化模式的改變，(包括導入或過度表達參與寡糖產生中的某些酶(美國專利No.5,047,335；5,510,261；和5,278,229)。糖基化，或某些類型的糖基化，可從糖蛋白中經過酶促反應而消除，例如使用內切糖苷酶H(EndoH)。此外，可以基因改造重組宿主細胞，如，製造加工某些類型多糖的缺陷。這些以及類似技術是本領域熟知的。
可採用常規的糖類分析技術(包括凝集素層析，NMR，質譜，高效液相層析，凝膠滲透層析，單糖組分分析，順序酶消化，以及使用高PH離子交換層析根據電荷分離寡糖的HPAEC-PAD)不難分析抗體的糖基化結構。為了分析目的而釋放寡糖的方法也是已知的，包括但不限於酶處理(通常用肽N糖苷酶F/內β半乳糖苷酶進行)，用harsh鹼性環境消除以主要釋放O連接結構，以及用無水肼釋放N連接和O連接寡糖的化學方法。
(X)抗體的其它修飾本文所公開的中和性抗IFN-α抗體也可配製成免疫脂質體。含此抗體的脂質體可用本領域已知的方法製備，如Epstein等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688；Hwang等人，.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030(1980)；以及美國專利No.4,485,045和4,544,545.所述。具有增加的血循環期的脂質體公開於美國專利NO 5,013,556中。
用含有磷脂醯膽鹼，膽固醇和磷脂醯乙醇胺聚乙二醇衍生物(PEG-PE)的脂質組合物進行反相蒸發方法可產生特別有用的脂質體。將脂質體擠壓通過確定孔徑的濾器以產生具有所需直徑的脂質體。如Martin等人.，J.Biol.Chem.257286-288(1982)所述通過鏈間二硫鍵反應，可將本發明抗體的Fab片段與脂質體偶聯。可任選地在該脂質體中含有化療劑(如阿酶素)。見Gabizon等人J.NationalCancer Inst.81(19)；1484(1989)。
通過將抗體與一種前藥活化酶偶聯，此酶能將前藥(如肽化療劑，見Wo81/01145)轉變成活性藥物，也可在在ADEPT中應用本發明的抗體。見，例如，WO88/07378和美國專利NO4,975,278。
用於ADEPT的免疫偶聯物的酶組分包括能作用於前藥的酶，此酶能將前藥轉變成顯示所需生物特性的更活躍形式。
本發明方法中使用的酶包括但不限於，用於將含磷酸鹽的前藥轉變成游離藥物的鹼性磷酸酶；用於將含硫酸鹽前藥轉變為游離藥物的芳基硫酶；用於將無毒5-氟胞嘧啶轉變成抗癌藥物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫氨酶；用於將含肽的前藥轉變為游離藥物的蛋白酶，例如serratia蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)；用於轉變含D-胺基酸取代前藥的D-丙氨醯羧肽酶；用於將糖基化的前藥轉變為游離藥物的糖類裂解酶，如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；用於轉變β-內醯胺衍生藥物為游離藥物的β內醯胺酶；青黴素醯胺酶，如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶；用於將藥物在其氨基氮分別用苯氧乙醯或苯乙醯基團衍生而轉變為游離藥物。另外具有酶活性的抗體，在本領域稱為「抗體酶」，可用於將本發明的前藥轉變為游離藥物，見(見Massey，Nature328457-458(1987))。抗體-酶偶聯物可按本文所述方法製備，將抗體酶輸送給所需的細胞群。
可用本領域熟知的技術將酶與中和性抗IFN-α抗體共價結合，如使用上述的異質雙功能交聯劑。另外，用本領域熟知的重組DNA技術可構建融合蛋白質，該蛋白質至少含有與本發明酶的功能活性部分相連的本發明抗體的抗原結合區(見Neuberger等人，Nature 312604-608)。
在本發明的某些實施例中，可能需要採用抗體片段而不是完整的抗體。在此情況下，可能需要修飾抗體片段以增加其血清半衰期。例如這可通過在抗體片段中摻入一補救性受體結合表位(如，通過在抗體片段內合適區域的突變，或在肽屬中摻入該表位，然後與抗體片段末端之一或中間融合，如，通過DNA或肽合成)而實現。見1996年10月17日公布的MO 96/32478。
通常，補救性受體結合表位構成一個區域，其中Fc區的一個或二個環上的一個或多個胺基酸殘基被轉移到該抗體的類似位置，甚至更優選Fc區的一個或二個環上的3個或多個殘基被轉移，更優選此表位取自(如IgG)的FC區的的CH2結構域並且轉移到此抗體的CH1，CH3或VH區或1個以上的這些區域中。或者，此表位取自FC區的CH2結構域並且轉移到該抗體片段的CL區或VL區或這二個區。
中和性抗IFN-α抗體的共價修飾也包括在本發明範圍之內。如果需要，可通過化學合成或抗體的酶促裂解或化學裂解製備。用能夠與所選側鏈或N端或C端殘基反應的有機衍生試劑與此抗體的靶胺基酸殘基反應，將其它類型的抗體共價引入此分子中。典型的多肽共價修飾在美國專利5,534,615中有描述，參考文獻中。抗體共價修飾的優選類型包括以美國專利(4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337。中所述方式與各種非蛋白性聚合物之一相連，如聚乙二醇，聚丙二醇，或聚氧化烯。
2、篩選具有所需特性的抗體產生抗體的技術上文已有描述，具有所需的廣泛的中和特性的抗IFN-α抗體可用本領域已知方法來鑑定。
結合試驗例如，將候選抗體與一種或多種IFN-α亞型，或各種IFN-α亞型的陣列或混合物一起培育，並監測結合和IFN-α生物活性的中和，可在IFN-α結合試驗中鑑定本發明的中和性抗IFN-α抗體。可採用純化的IFN-α多肽進行此結合試驗。在一實施例中，該結合試驗是競爭性結合試驗，其中評價在IFN-α結合方面候選抗體與一個已知抗IFN-α抗體競爭的能力。此試驗可以不同方式進行，包括ELISA形式，也在下列實施例中闡述。如下所述，也可用BIAcoreTM生物傳感器試驗監測候選抗體的IFN-α結合。
可採用本領已知的任何合適的競爭結合試驗來特徵鑑定候選抗IFN-α單克隆抗體與小鼠抗人IFN-α單克隆抗體9F3競爭結合某具體IFN-α種類的能力。常規競爭試驗在A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和David Lane主編(1988)中有所描述。在另一實施例中，可利用候選抗體與9F3抗體之間的IFN-α結合競爭改進如下例2所述的IFN-α結合性ELISA試驗。該試驗按如下方法進行在微量滴定板上包被IFN-α，用與所選濃度的標記9F3抗體相混合的未標記抗IFN-α抗體或未標記對照抗體的系列稀釋液，培育已包被的滴定板，檢測並測量9F3抗體標記物的信號，然後比較抗體的不同稀釋液所顯示的信號測量結果。
抗病毒試驗例如，如Kawade，J.Interferon Res.161-70(1980)，or Kawade和Watanabe，J.Interferon Res.4571-584(1984).所述，通過監測IFN-α的抗病毒活性的中和，可測定候選抗體中和IFN-α生物活性的能力。簡而言之將與候選抗體的不同稀釋液預先混合的固定濃度的IFN-α，加入到人羊膜衍生FL細胞中，並用適當的病毒(如新培斯病毒)測定候選抗體中和IFN-α的抗病毒活性的能力。用國際參考品人IFN-α(NIHGa23-901-527)測定，以國際單位(IU)表示滴定度。
如果某一濃度的候選抗體在同等濃度對照抗體存在下比所測定的抗病毒活性抑制度線水平抑制了更多的抗病毒活性，那麼認為該候選抗IFN-α抗體能夠抑制所選IFN-α亞型的抗病毒活性。任選地，在抗病毒活性試驗中與在同等濃度對照抗體存在下所測的基線活性相比，某一濃度候選抗IFN-α抗體將抑制所選IFN-α亞型的抗病毒活性的至少約60％，或至少約70％，較佳至少約75％，或更佳至少約80％，或再佳至少約85％，或還要佳至少約90％，或還要更佳至少約95％，或再佳至少約99％。如果候選抗體的任何濃度不顯示比在同等濃度對照抗體存在下所測抗病毒活性抑制基線水平更多的抗病毒活性抑制度，那麼認為該候選抗IFN-α抗體不能抑制所選IFN-α亞型的抗病毒活性。
在一個優選實施例中，滴定在抗病毒感染性試驗中所用的每種幹擾素至一濃度，該濃度提供與IFN-α標準品預選單位數所誘導的相同水平的病毒生長抑制。該濃度的作用是提供受測試幹擾素的標準化單位。為了評價抗IFN-α抗體抑制不同IFN-α亞的抗病毒活性的能力，對每種待測試IFN-α亞型測定了抗IFN2抗體抑制具體IFN-α亞型抗病毒活性(滴定至提供標準化活性單位的濃度)50°的有效濃度(EC50)。
在一個實施例中，如下例1所述進行抗病毒中和試驗。簡而言之，在96孔微量滴定板上培養A549細胞至密度5×105個A549細胞/孔。在37℃以100∶1的總體積將0.2單位/ml的所選IFN-α亞型(標準化至0.2單位/ml的NIH參考標準品重組人IFN-α2)與候選IFN-α抗體的送到稀釋液培育1小時。然後將100∶1體積比的抗體/幹擾素培育混合物加入到微量滴定板的各孔的5×105A549細胞和100∶1的培育基中，各孔中獲得最終100單位/ml的IFN-α濃度。37℃培育該細胞培養混合物24小時。然後用2×105pfu的腦心肌炎(EMC)病毒攻擊並37℃再培育24小時。培育後，用可視顯微鏡檢或結晶紫染色測定細胞活力。對每個待檢測的IFN-α亞型測定候選IFN-α抗體抑制試驗中具體IFN-α亞型抗病毒活性50％的有效濃度(EC50)。
在本發明的一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞型表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50高達約20g/ml，或高達約10g/ml，或高達約5g/ml，或高達約4g/ml，或高達約3g/ml，或高達約2g/ml，或高達約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞型表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.1g/ml至約20g/ml，從約0.1g/ml至約10g/ml，從約0.1g/ml至約5g/ml，從約0.1g/ml至約4g/ml，從約0.1g/ml至約3g/ml，從約0.1g/ml至約2g/ml，從約0.1g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞型表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.2g/ml至約20g/ml，從約0.2g/ml至約10g/ml，從約0.2g/ml至約5g/ml，從約0.2g/ml至約4g/ml，從約0.2g/ml至約3g/ml，從約0.2g/ml至約2g/ml，從約0.2g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞型表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.3g/ml至約20g/ml，從約0.3g/ml至約10g/ml，從約0.3g/ml至約5g/ml，從約0.3g/ml至約4g/ml，從約0.3g/ml至約3g/ml，從約0.3g/ml至約2g/ml，從約0.3g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞類表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.4g/ml至約20g/ml，從約0.4g/ml至約10g/ml，從約0.4g/ml至約5g/ml，從約0.4g/ml至約4g/ml，從約0.4g/ml至約3g/ml，從約0.4g/ml至約2g/ml，從約0.4g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞類表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.5g/ml至約20g/ml，從約0.5g/ml至約10g/ml，從約0.5g/ml至約5g/ml，從約0.5g/ml至約4g/ml，從約0.5g/ml至約3g/ml，從約0.5g/ml至約2g/ml，從約0.5g/ml至約1g/ml的。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞類表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.6g/ml至約20g/ml，從約0.6g/ml至約10g/ml，從約0.6g/ml至約5g/ml，從約0.6g/ml至約4g/ml，從約0.6g/ml至約3g/ml，從約0.6g/ml至約2g/ml，從約0.6g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞類表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.7g/ml至約20g/ml，從約0.7g/ml至約10g/ml，從約0.7g/ml至約5g/ml，從約0.7g/ml至約4g/ml，從約0.7g/ml至約3g/ml，從約0.7g/ml至約2g/ml，從約0.7g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞類表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.8g/ml至約20g/ml，從約0.8g/ml至約10g/ml，從約0.8g/ml至約5g/ml，從約0.8g/ml至約4g/ml，從約0.8g/ml至約3g/ml，從約0.8g/ml至約2g/ml，從約0.8g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞類表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約0.9g/ml至約20g/ml，從約0.9g/ml至約10g/ml，從約0.9g/ml至約5g/ml，從約0.9g/ml至約4g/ml，從約0.9g/ml至約3g/ml，從約0.9g/ml至約2g/ml，從約0.9g/ml至約1g/ml。
在本發明的另一個方面中，在上述A549細胞EMC病毒抑制試驗中，對受測試IFN-α亞類表現出抗病毒活性中和作用的抗IFN-α抗體，將顯示對各受測試IFN-α亞型的EC50從約1g/ml至約20g/ml，從約1g/ml至約10g/ml，從約1g/ml至約5g/ml，從約1g/ml至約4g/ml，從約1g/ml至約3g/ml，從約1g/ml至約2g/ml。
(i)交叉阻斷試驗為了篩選能與感興趣抗體所結合的IFN-α表位相結合的抗體，可進行如「抗體、實驗室手冊」Cold Spring Habor Laboratory，Harlow和Darid Lene主編，1988。所述的常規交叉阻斷試驗。或者，或此外，可用本領域已知的方法進行表位作圖。例如，可用Fendly等人.，Cancer Research 501550-158(1990)所述的競爭結合分析測定於本發明單克隆抗體結合的IFN-α表位。在另一個例子中，在微量滴定板上用直接螢光進行交叉阻斷研究。此方法中，使用已建立的方法(Wofsy等人.Select Methods in Cellular Immunology，287頁，Mishel和Schiigi編SanFranciscoW.J.Freeman Co.(1980))，將感興趣的單克隆抗體與異硫氰基螢光素(FITC)偶聯。微量滴定板的孔用所選IFN-α包被將包被孔與，(1)FITC標記的感興趣單克隆抗體和(2)未標記的受試單克隆抗體的混合物一起培育，並且定量測定各孔的螢光以確定此抗體所顯示的交叉阻斷水平。如果與無關單克隆抗體對照相比每個孔阻斷了50％或更多的結合，認為該單克隆抗體針對一同共表位。
在細胞為基礎的生物試驗中所獲結果然後可在動物中測試，如小鼠模型，和人臨床實驗，若需要，可將已鑑定具有所需特性的鼠單克隆抗體轉變成嵌合抗體，或用本領域所熟知的技術人源化，包括「基因轉變誘變」方法，如美國專利N0.5,821,337中所述，本文參考引用該完整專利。本文的特定抗IFN-α抗體的人源化也在下列實例中描述。
(ii)噬菌體展示方法可利用組合文庫鑑定本發明抗IFN-α抗體，以篩選具有所需活性的合成性抗體克隆原則上，篩選含有展示與噬菌體包膜蛋白融合的抗體可變區(Fv)的各種片段(如，Fab，F(ab』)等)的噬菌體的噬菌體文庫，選出合成性抗體克隆。用所需抗原的親和層析淘選這樣的噬菌體文庫。表達能與所需抗原結合的Fv片段的克隆體被抗原吸附並因而與文庫中的非結合性克隆相分離。然後從抗原上洗脫結合性克隆，可另加n輪抗原吸附/洗脫循環進一步富集。通過設計合適的抗原篩選方法以選出感興趣的噬菌體克隆然後如Kabat等人(1991)，同上所述採用此感興趣嗜菌體克隆的Fc序列構建全長的抗IFN-α抗體克隆，可獲得本發明任何IFN-α抗體。
噬菌體展示文庫的構建抗體的抗原結合結構域由輕(VL)鏈和重(VH)鏈的兩個各含有約110個胺基酸的可變(V)結區構成，二者都有高變環或互補決定區(CDR)。如Winter等人.，Ann.Rev.Immunol，12433-455(1994)所述，可變區可在噬菌體上功能性展示；或者作為單鏈Fv(scFv)片段，其中VH和VL通過一條短而靈活的肽共價相連，或者作為D(ab』)2片段，其中二片段分別與恆定區融合併且非共價互相作用。如本文所用，scFv編碼噬菌體克隆和Fab或F(ab』)2編碼噬菌體克隆都稱為「Fv噬菌體克隆」或「Fv克隆」。
動物的原初文庫(抗原攻擊前的文庫)提供了能與基本上任何非自身分子以中等親和力(Kd-1約為106-107M-1)結合的抗體。抗體結合位點的序列多樣性在種系發生中不直接編碼但以組合方式由V基因區段組裝。在人重鏈中，從不到50個VH基因區段中取得前兩個高變環(H1和H2)，與D區段和JH區段聯合產生第三個高變環(H3)。在人輕鏈中，從不到約30個V8和不到約30個V6區段中取得前兩個高變環(L1和L2)和第三個(L3)的大部分以完成第三個高變環(L3)。
幹細胞系中V基因區段的每種組合性重排產生了表達單個VH-VL組合的B細胞。免疫接種引發了B細胞製造組合，結合免疫原的B細胞增值(克隆擴大)並分泌相應抗體。然後通過誘變和選擇(稱為親和力成熟)過程這些天然抗體成熟至高度親和力(Kd為109-10M-1)。此後，通常取出這些細胞以製備雜交瘤並產生高親和力的單克隆抗體。
如Winter等人Ann.Rev.Immunol，12433-455(1994)所述，在此法三步中，VH和VL基因文庫可通過聚合酶鏈反應(PCR)分別克隆並在噬菌體文庫中隨機重組，然後搜尋抗原結合克隆。免疫接種來源的文庫提供了對免疫原的高親和力抗體，而不需要構建雜交瘤。另外，如Griffiths等人EMBO J.12725-734(1993)所述，可將該原文庫克隆以提供對廣泛範圍的非自身和自身抗原的人抗體的一種來源。最後，如Hoogenboom Winter.J.Mol.Biol.，227381-388(1992)所述，通過克隆自幹細胞的未經重排的V或VIII基因區段，並採用含有隨機序列的PCR引物以在體外編碼CDR3高變區並完成重排，也可合成製得原初文庫。
噬菌體展示模仿3B細胞。通過與小包膜蛋白PIII融合使用絲狀噬菌來展示抗體片段。如Marks等人J.Mol.Biol.222581-597(1991)所述，抗體片段可作為單鏈Fv片段展示，其中VH和VL區通過一靈活的多肽接頭連接在同一多肽鏈上，或如Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.，194133-4137(1991)所述，作為Fab(包括F(ab』)2)片段展示，其中一條鏈與PIII融合而另一條分泌入細菌宿主細胞周質中，在那兒組裝成Fab-包膜蛋白質結構，通過取代一些野生型包膜蛋白在噬菌體表面展示。當抗體片段與PIII的N端融合時，此噬菌體有傳染性。然而，如果切下PIII的N未端結構域並與第二結構域形成融合，此噬菌體無傳染性，而野生型PIII必須通過輔助噬菌體提供。
可將噬菌體的PIII融合物和其它蛋白質全部編碼在同一噬菌體複製子中或不同複製子上。使用兩個複製子時，在質粒(含有噬菌體複製起點的質粒)上編碼PIII融合物。如，Vieira和Messing，Meth.Enzymol，1533-11(1987)所述，用提供所有噬菌體蛋白質(包括PIII)但由於缺乏起始點在與質粒競爭中自身難以被包裝的輔助噬菌體(如M13K07)通過「挽救」，將質粒包入噬菌體顆粒中。在一優選方法中，如Bass等人Proteins，8309-314(1990)和WO 92/09690(PCT/US9I/09133公布於1992年6月11日)所述，設計噬菌體展示系統，使得重組噬菌體可在(允許不多於微量的噬菌體顆粒在顆粒表面展示一個以上拷貝的Fv一包膜蛋白融合物)條件下在宿主細胞中。
總之，從人或動物收穫的免疫細胞中獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果需要偏性選擇抗IFN-α克隆的文庫，可用IFN-α免疫接種該對象以產生抗體應答，並回收脾細胞和/或循環性B細胞外周血淋巴細胞(PBL)用於文庫構建。在一優選實施例中，在具有功能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內源抗體產生系統)的轉基因小鼠中產生抗人IFN-α抗體應答而獲得偏性選擇抗人IFN-α克隆的人抗體基因片段文庫，因而IFN-α免疫接種產生的B細胞可產生抗IFN-α的人序列抗體。在另一優選實施例中，為了產生(包括生成對IFN-α諸亞型具有廣泛反應活性的抗IFN-α抗體的B細胞)抗體應答用不同的優選所有的IFN-α亞型的混合物免疫接種動物。在另一優選實施例中，如下例1所述，用存在於人淋巴母細胞幹擾素(由仙臺病毒誘生的伯基特淋巴瘤細胞(Namalva細胞)分泌)中的人IFN-α諸亞型混合物免疫接種動物。此種人淋巴母細胞幹擾素的適用製品可從SigmaChemical Compay，St.Louis，MO購得。
用適當的篩選方法分離表達IFN-α特異性膜結合抗體的B細胞，如用IFN-α親和層析分離細胞或使細胞吸附於螢光色素標記的IFN-α，然後用螢光激活細胞分選法(FACS)，可獲得抗IFN-α反應活性細胞群的進一步富集。
或者，使用未免疫供體的脾細胞和/或B細胞或其它PBL，提供可能的抗體文庫的更好提呈，並且也得以使用IFN-α無抗原性的動物(人或非人)構建抗體文庫。為了體外摻入抗體基因構建物的文庫，收穫該對象的幹細胞以提供編碼未重排抗體基因區段的核酸。感興趣的免疫細胞可從各種動物獲得，如人、小鼠、大鼠、兔、luprine、犬貓、豬、牛、馬、鳥類等。
可從感興趣的細胞回收編碼抗體可變基因區段(包括VH和或VL區段)的核酸並擴增。如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，863833-3837(1989)所述在重排VH和VL基因文庫過程中，分離淋巴細胞的基因組DNA或mRNA然後用匹配於重排VH和VL的5』和3』端的引物進行聚合酶鏈反應(PCR)，可獲得所需的DNA，然後製得用於表達的多樣性V基因文庫。如Orlandi等人，(1989)和Ward等人，Nature，341544-546(1989)所述，用編碼成熟V結構域的外顯子5』端上的後引物和基於J區段內的前引物，可從cDNA和基因組DNA中擴增此V基因。然而，如Jones等人，Biotechnol，988-89(1991)所述，對於cDNA擴增後引物也可基於前導外顯子，而如Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci，(USA)，86；5728-5732(1989)所述，前引物也可基於恆定區。如Orlandi等人，(1989)或者Sastry等人(1989)所述，為了將互補性最大化，可在引物中摻入簡併性。優選地，如Marks等人，J.Mol.Biol，222；581-597(1991)中方法所述或如Orum等人，Nucleic AcidsRes.，214491-4498(1993)方法所述，採用針對各V基因家族的PCR引物以擴增存在於免疫細胞核酸樣品中所有可得的VH和VL使該文庫多樣性最大化。如Orlandi等人(1989)所述，為了將擴增的DNA克隆入表達載體，可將稀有的限制性位點引入PCR引物一端中作為標記，或如Clackson等人Nature，352624-628(1991)所述，用標記的引物進一步擴增PCR。
合成性重排的V基因文庫可在體外由V基因區衍生。大部分的人VH基因區段已被克隆與排序(Tomlison等人，J.Mol.，Biol.，227776-798(1992)所報導)，以及作圖(Matsuda等人，Nature Genet.，388-94(1993)所報導)；這些克隆的區段(包括H1和H2環的所有主要構象)用編碼不同序列和長度的H3環的PCR引物可產生多樣性VH基因文庫(如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381-388(1992)所述)。用位於單個長度的長H3環中的所有序列多樣性也可製備VH文庫(Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894457-4461(1992)所述)。人V6和V8區段已被克隆和測序(Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，231456-1461(1993)報導)並可用於製取合成性輕鏈文庫。以VH和VL摺疊範圍和L3以及H3長度為基礎的合成性V基因文庫，將編碼大量的結構多樣性的抗體。V基因編碼DNA經擴增之後，種系V基因區段可按照Hoogenboon和Winter，J.Mol.Biol 227381-388(1992)所述方法體外重排。
以幾種方法將VH和VL基因文庫聯合在一起，可構建抗體片段的文庫。每一種文庫可構建在不同載體中，在體外重組這些載體，如Hogrefe等人，Gene，128119-126(1993)所述，或體內組合感染，例如Waterhouse等人，Nucl.AcidsRes.，212265-2266(1993)所述的loxP系統。體內重組法利用Fab片段的二鏈性質來克服大腸桿菌轉化效率所帶來的文庫大小限制。分別克隆原初VH和VL文庫，一個克隆入質粒而另一個克隆入噬菌體載體。然後用含質粒的細菌感染噬菌體將兩文庫聯合使得每個細胞都含有不同的組合而且文庫大小隻受所存在細胞數量的限制(約1012克隆)兩載體都含有體內重組的信號使得VH和VL基因被重組於一個複製子上而且共同包裝入噬菌體毒粒中。這些巨大文庫提供了大量有良好親和力(Kd-1為約10-8M)的多樣性抗體。
另外，可將這些文庫一次克隆至同一載體中，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，887978-7982(1991)。或用PCR組裝起來，然後克隆，如Clackson等人，Nature 352624-628(1991)所述。PCR組裝也可用於將VH和VLDNA與編碼一柔性肽臂的DNA相連接以形成一個單鏈FV(scFV)文庫。在另一技術中，「細胞內PCR組裝」用於在淋巴細胞中通過PCR組合VH和VL基因，然後克隆所連接的基因文庫(如Embleton等人，Nucl.Acids Res.，203831-3837(3992)所述)。
原初文庫(或者天然或者合成的)所產生的抗體可能具有中度親和力(Kd-1為約10-6~10-7M-1)，但通過構建和重選擇次級文庫也可在體外模仿親和力成熟(如Winter等人(1994)，同上所述)。例如使用易錯聚合酶(Leung等人，Technique，111-15(1989)報導)以Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)的方法或以Gram等人，Proc.Natl.Acad，Sci USA.893576-3580(1992)的方法可在體外隨機引入突變。此外，通過在所選個體的Fv克隆中隨機突變一個或多個CDR，如採用帶有跨越感興趣CDR的隨機序列的引物作PCR，並篩選更高親和力的克隆可進行親和成熟過程。WO 9607754(公開於1996年3月14日)描述了在免疫球蛋白輕鏈的互補決定區中誘導突變產生輕鏈基因文庫的方法。另一有效方法是重組用非免疫供體天然存在的V區變體文庫噬菌體展示選出VH或VL結構域，並通過幾輪鏈改組篩選更高的親和力(如Marks等人，Biotechnol 10779-186(1992)所述)。這一技術產生了具有10-9M範圍親和力的抗體和抗體片段。
淘選噬菌體展示文庫的抗IFN-α克隆a.IFN-α的合成利用已公布的幹擾素和胺基酸和核酸序列(如見J.Interferon Res.，13443-444(1993)含有各種I型幹擾素基因組和cDNA序列的彙編參考品和該文引用的參考品)可設計本文所用的編碼IFN-α亞型的核酸序列。對於IFN-αA(IFN-α2)、IFN-αB(IFN-α8)、IFN-αC(IFN-α10)、IFN-αD(IFN-α1)、IFN-αE(IFN-α22)、IFN-αF(IFN-α21)、IFN-αG(IFN-α5)、IFN-αH(IFN-α14)胺基酸序列或cDNA序列，見Goeddel等人，Nature，29020-26(1981)23-24頁的圖3和圖4。對於編碼IFN-α7(IFN-αJ)的胺基酸序列的cDNA，見Cohen等人，Dev.Biol.Standard，60111-112(1985)。用本領域已知的各種方法可製備感興趣的幹擾素編碼的DNA。這些方法包括但不限於Engels等人Agnew.Chem.Int.Ed.Eghl.，28716-734(1989)中所述任何一種化學合成方法，如三酯，亞磷鹽酸，亞磷醯胺和H磷酸酯方法。在一個實施例中，在編碼幹擾素DNA的設計中採用宿主細胞表達優選的密碼子。另外，編碼幹擾素的DNA也可從基因組或cDNA文庫中分離得到。
構建了編碼感興趣幹擾素的DNA分子之後，將該DNA分子操作性連接於表達載體如質粒中的表達調控序列，其中調控序列可為用此載體轉化的宿主細胞所識別。總之，質粒載體包含有複製和調控序列，這些序列衍生於與宿主細胞相容的物種。此載體通常帶有一個複製位點以及編碼蛋白質(能夠提供在轉化細胞中的表型選擇)的序列。
對於原核宿主的表達，合適的載體包括pBR322(ATCC No.37017)、phGH107(ATCC No.40011)、PB0475、pS0132、pRIT5、PRIT20或pRIT30系列中的任何載體(Nilsson和Abrahmsen，Meth.Enzymol.，185144-161(1990))、pRIT2T、pKK233-2、pDR540和pPI-lambda。本文所適用的含有表達載體的原核宿主細胞包括大腸桿菌K12株294(ATCC NO.31446)，大腸桿菌株JM101(Messing等人，Nucl.Acid Res.，9309(1981))，大腸桿菌株B，大腸桿菌株II1776(ATCCNo.31537)，大腸桿菌株c600(Appleyard，Genetics，39440(1954))，大腸桿菌株W3110(F-、γ-、原養型，ATCC編號27325)，大腸桿菌株株27C7(W3110，tonA，phoAE15，(argF-lac)169，ptr3，degP41，ompT，kan)(美國專利No.5288931，ATCCNo.55244)，枯草芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、粘質沙雷氏菌和假單胞菌屬。
除原核生物之外，真核生物如酵母菌，或多細胞生物衍生的細胞可用作宿主細胞。對於酵母宿主細胞的表達，如普通的麵包酵母或釀酒酵母，合適的載體包括基於2微米的質粒，整合載體和酵母人工染色體(YAC)載體的附加型複製性載體。對於昆蟲宿主細胞的表達，如Sf9細胞，合適的載體包括杆狀病毒載體。對於植物宿主細胞的表達，特別是雙子葉植物宿主如菸草，合適的表達載體包括衍生自根瘤農桿菌Ti質粒的載體。然而，脊椎動物宿主細胞最有利。有用的哺乳動物宿主細胞包括受SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)轉化的猴腎CV1系；人胚胎腎系(生長於懸浮培養中的293或亞克隆293細胞，(Graham等人，J.Gen Virol.，3659(1977))；乳倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/DHFTR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL2)；犬腎細胞(MDCK，QTCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138 ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68(1982))；MRC5細胞；FS4細胞；以及人肝癌細胞系(Hep G2)。對於哺乳動物宿主細胞表達，有用的載體包括SV40衍生的載體，巨細胞病毒衍生的載體如PRK載體，包括痘苗病毒或其它痘病毒衍生的pRK5和pRK7(Suva等人，Science，237893-896(1987)EP 307,247(3/15/89)，EP 278776(8/17/88))載體，以及逆轉病毒如莫落尼小鼠白血病病毒衍生的載體。
任選地，將編碼感興趣幹擾素的DNA操作性連接於一分泌性前導序列導致宿主細胞表達產物分泌培養基中。分泌前導序列的離子包括stII，ecotin，lambherpes GD lpp，鹼性磷酸酶，蔗糖酶，以及α因子。也適用於本文的是蛋白質A的36胺基酸前導序列(Aberahmsen等人，EMBO J.，43901(1985))。
轉染宿主細胞並優選用本發明上述表達或克隆載體轉化，並在已改進適合於誘導型啟動子，選擇性轉化體，或擴增編碼所需序列的基因的常規營養培養基中培育。
轉染指用宿主細胞攝入表達載體，不論編碼序列實際上是否表達。許多轉染方法是本領域普通技術人員所已知的，例如磷酸鈣沉澱和電穿孔。當表明該載體操縱已在宿主細胞中發生時，一般認為轉染成功。
轉化指將DNA引入生物體使得DNA可複製(作為染色體外元件或通過染色體整合)。取決於所用的宿主細胞，採用適合該細胞的標準方法進行轉化。使用氯化鈣作鈣處理(如Sambrook等人，Molecular Cloning(第二版)，Cold Spring HarborLadoratory，NY(1989)1.82節所述)通常用於含有大量細胞壁屏蔽的原核生物或其他細胞。根瘤農桿菌感染用於某些植物細胞的轉化，如Shaw等人，Gene，23315(1983)和1989年6月29號公開的WO89/05859所述。對於沒有細胞壁的哺乳細胞，優選如Sambrook等人(同上第16.30-16.37節)所述的磷酸鈣沉澱方法。哺乳細胞宿主系統轉化的總體方面內容在Axel的1983年8月16日公布的美國專利4,399,216中有所描述。通常根據Van Solingen等人，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Scia(USA)，763829(1979)的方法進行酵母轉化。然而，也可採用將DNA引入細胞的其它方法，如核注射，電穿孔，或原生質融合。
如Sambrook等人(同上)所述，可培養用於產生感興趣幹擾素的原核宿主細胞。
可用各種培養基培養用於產生感興趣幹擾素的哺乳動物宿主細胞。可購得的培養基如Ham’s F10(Sigma)，Minimal Essential Medium((MEM)，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium((DMEM)，Sigma)適用於培育宿主細胞。另外，如Ham和Wallace，Meth.Enz.，5844(1979)，Barnes和Sato，Anal.Biochem.，102255(1980)，U.S.4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；U.S.Pat.Re 30,985；或U.S.5,122,469所述的任何培養基(所有這些公開內容納入本文參考文獻中)，可用作宿主細胞的培養基。如需要，這些培養基可補加激素和/或其它生長因子(如胰島素，運鐵蛋白，或表皮生長因子)。
鹽類(如氯化鈉，鈣，鎂，以及磷酸鹽)，緩衝液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，抗生素(如慶大黴素藥物)，微量元素(限於通常以微摩爾範圍存在的最終濃度的無機化合物)，以及葡萄糖或等同的能源。其他所需補充物也可包括本領域技術人員所知的適當濃度。培養條件，如溫度，PH值等等，是那些先前與所選表達宿主細胞一起使用的，並且對於本領域普通技術人員是清楚的。
本文所提宿主細胞包括體外培養的細胞以及宿主動物體內的細胞。
在胞內表達系統或周質間隙分泌系統中，可通過破壞宿主細胞膜/胞壁(如滲透休克或用洗滌劑溶解宿主細胞膜)從培養細胞中回收重組表達的幹擾素蛋白質。另外，在胞外分泌系統中，可由培養基中回收重組蛋白質。第一步，離心培養基或裂解液以除去任何顆粒性細胞碎片。然後分離膜與可溶性蛋白組分。通常從可溶性組分中純化得到幹擾素。如果IFN-α表達為膜結合種類，可用洗滌劑溶解從膜組分中回收膜結合肽。然後用合適的方法(如免疫親和或離子交換柱上的分級；乙醇沉澱；反相HPLC；矽或陽離子交換樹脂(如DEAE)層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉澱；如使用葡聚糖凝膠G-75的凝膠過濾；疏水親和樹脂和使用固定在基質上的幹擾素受體的配體親和法)進一步純化該粗肽提取物。
本文所用的許多人IFN-α可從商業來源獲得，如從Sigma(St.Louis，MO)，Calbiochem-Novabiochem Corporation(San Diego，CA)或ACCURATE Chemical Scientific Corporation(Westbury，NY)獲得。
標準的克隆方法如Maniatis等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)所述用於構建質粒，該質粒能指導各種hIFN-α轉位進入大腸桿菌周質空隙中)。利用加入到引物中的Nsil和STYI限制性位點在IFN-α(公開於L31)的不同亞型的cDNA克隆上進行PCR反應(Goeddl等，Nature 29020-26(1981)。然後將這些PCR產物亞克隆入表達載體pB0720的相應位點(如Cunninghan等人，Science2431330-1336(1989)所述)。所得的質粒將h-IFN-α亞型的產生置於大腸桿菌phoA啟動子和熱穩定腸毒素II信號肽的調控下(如Chang等人，Gene 55189-196(1987)所述)。用美國生物化學測序酶試劑盒2.0版本證實每個基因的正確DNA序列。將各質粒轉化入大腸桿菌株。27C7(ATCC 3 55244)中並在10升發酵罐中培養(如Carter等人，Biol/Technology 10163-167(1992)所述)。用親和層析法從含有各個IFN-α的大腸桿菌糊漿中純化得到人hiFN。裂解細菌，並以10,000×離心裂解液除去碎片。將上清液加到含有小鼠抗hIFN-αB抗體(LI-1)(如Staehelin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.781848-1852(1981)所述獲得)的免疫親和柱上。用Roy等人，Journal of Chromatography，303225-228(1984)的改進方法將LI-1固定在可控孔玻璃上。用含20％(W/V)甘油PH為3.0的0.1M檸檬酸鹽從該柱中洗脫體結合的幹擾素。純化的IFN用SDS-PAGE和免疫印跡法分析，和用本文所述的hIFN誘導的抗病毒試驗測試生物活性。
如Rehberg等人，J.Biol.Chem.，25711497-11502(1992)或Horisberger和Marco，Pharmac.Ther.，66507-534(1995)所述，獲得了人IFN-α2/1雜交分子(IFN-α21-62/α64-166)。
b.IFN-α的固定為了用於噬菌體展示克隆的親和層析分離，可將純化的IFN-α吸附於合適的基質，如瓊脂糖珠，丙烯醯胺珠，玻璃珠，纖維素，多種丙烯酸共聚物，羥基甲基丙烯酸鹽凝膠，聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物，尼龍，中性和離子型運載體，等等。用如Methods in Enzymology，vol.44(1976)所述方法可實現IFN-α蛋白質與基體的吸附。將蛋白質配體吸附在多糖基質(如瓊脂糖、葡聚糖或纖維素)的常用技術包括用滷素氰活化運載體並隨後將肽配體的主要脂肪胺或芳香胺與該活化基質偶聯。
另外，IFN-α可用於包被吸附板孔，表達在固定於吸附板的宿主細胞上或用於細胞選種，或偶聯生物常用於捕獲鏈親和素包被的玻珠，或用於其他已知的淘選噬菌體展示文庫的方法中。
C、淘選方法在適合於用吸附劑結合至少一部分噬菌體顆粒的條件下使噬菌體文庫樣品，與固定的IFN-α接觸。通常，此條件包括選擇PH值，離子強度，溫度等來模擬生理條件。洗滌結合於固相的噬菌體並用酸(如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA，887978-7982(1991)所述)，或用鹼(如Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述)，或用IFN-α抗原(如類似於Clackson等人，Nature，352624-628(1991)的抗原競爭法的方法)洗脫。在一輪選擇中，可富集噬菌體20-1000倍。另外，可將富集的噬菌體培養在細菌培養物中進行更多輪選擇。
在一個優選實施例中，用各種固定的IFN-α亞型連續地培養噬菌體以鑑定和進一步特徵分析對大部分(優選全部)IFN-α亞型表現出明顯結合的噬菌體克隆。此方法中，噬菌體先與一特異性IFN-α亞型一起培養。洗脫結合於此亞型的噬菌體並用另一-IFN-α亞型選擇。對所有IFN-α亞型重複此結合與洗脫過程。最後，該方法獲得了對所有IFN-α亞型具有廣譜反應活性的噬菌體展示抗體群。除IFN-α外用其它種類IFN檢測這些噬菌體，以選擇那些對其他種類IFN不顯示明顯結合的克隆。最後，可檢測所選出的噬菌體克隆中和各種IFN-α亞型的生物活性(如抗病毒活性)的能力，最後選出對大部分(優選全部)IFN-α亞型有廣泛中和活性的代表性克隆抗體。選擇效率依賴許多因素，包括洗滌時的解離動力學，和單個噬菌體上的各個抗體片段能否同時與抗原結合。具有快速解離動力學(和弱結合親和力)的抗體可用短時洗滌，多價噬菌體展示和固相中抗原高密度包被來保留。高密度通過多價相互作用不僅能穩定噬菌體，還有利於已解離的噬菌體重結合。用長時間洗滌和單價噬菌體展示(如Bass等人，Proteins，8309-314(1990和WO92/09690所述)，以及抗原低密度包被(如Marks等人，Biotechnol.，10779-783(1992)所述)可促進具有慢解離動力學(和良好結合親和力)的抗體的選擇。
可在對IFN-α具有不同親和力(甚至微弱差別的親和力)的噬菌體抗體之間進行選擇。然而，所選抗體的隨機突變(如按照上述親和力突變技術的某些技術進行)可能產生許多突變體，大部分能結合抗原，且少數具有高親和力。用有限的IFN-α，可競爭罕見的高親和力噬菌體。為了保留所有較高親和力的突變體，可與過量生物素化的IFN-α(但用低於IFN-α的靶摩爾親和力常數的摩爾濃度生物素化的IFN-α)一起培養噬菌體。用鏈親和素包被的順磁珠可捕獲高親和力結合性噬菌體。此種「平衡捕捉」使得抗體根據它們的結合親和力而被選出。也可操縱用於洗滌結合於固相的噬菌體的條件來根據解離動力學進行區分。
在一個實施例中，將噬菌體與固定在固體支撐物(如上述層析聚合物基質)上的不同IFN-α亞型一起連續培養。此方法中噬菌體先與一特異性IFN-α亞型一起培養。用合適的洗脫液(如能將結合的噬菌體釋放到溶液中的鹽或酸性緩衝液)從固相中洗脫結合於該亞型的噬菌體。然後，將洗脫的噬菌體克隆用另一IFN-α亞型選擇。為了富集與可溶性IFNAR2競爭結合IFN-α的克隆群，從一系列IFN-α亞型層析分離物中回收噬菌體克隆，將其與預先吸附於IFN-α的固定IFNAR2的複合物一起培養，然後從培養反應混合物中回收未吸附的噬菌體克隆。
選擇方法可設計為使用任何合適的批次層析技術。在一個實施例中，使噬菌體克隆吸附在IFN-α衍生的聚合物懸浮基質珠。離心回收吸附的珠，以合適的洗脫緩衝液重懸回收的珠並培養，合適的洗脫液衝洗是能使結合的噬菌體釋放到溶液中的鹽或酸性緩衝液，離心洗脫混合物，從上清液中回收洗脫的噬菌體克隆，然後對於每種其它IFN-α亞型都重複此吸附/洗脫測序。為了富集能與可溶性IFNAR2競爭性結合IFN-α的克隆群，將從IFN-α亞型層析分離物回收的噬菌體克隆與IFNAR2衍生的聚合物基質珠懸浮液一起培養，離心培養混合物，然後從上清液中回收未吸附的噬菌體克隆。
在另一實施例中，設計選擇方法來富集在每次親和層析分離中能抑制IFN-α與IFNAR2結合的噬菌體群落，此方法中，使噬菌體與各種固定在固體支撐物上的特異性IFN-α亞型一起連續培養，然後用含有過量可溶性IFNAR2(如IFNAR2ECD-IgG Fc)的洗脫液，在可溶性IFNAR2能夠置換與IFNAR2競爭結合固定化IFN-α的噬菌體克隆的條件下從固相中洗脫。對每種特異性IFN-α亞型重複次結合與洗脫過程。
在另一實施例中，使噬菌體克隆吸附於IFN-α衍生的聚合物懸浮基質珠。離心回收吸附的珠，以含有過量可溶性IFNAR2(如IFNAR2ECD-IgGFc)的合適的洗脫緩衝液重懸回收的珠。在可溶性IFNAR2能夠置換與IFNAR2競爭性結合固定化IFN-α的條件下培育，使結合的噬菌體釋放到溶液中，離心洗脫混合物，從上清液中回收洗脫的噬菌體克隆，然後對於每種其它IFN-α亞型都重複此吸附/洗脫程序。
最後，此法獲得對廣泛IFN-α亞型具有IFNAR2抑制活性結合的噬菌體展示抗體群。然後可測試這些噬菌體對其它IFN種類(除了IFN-α種類)如IFN-β的作用，以選出那些對其他種類IFN不顯示明顯結合的克隆。最後，可測試所選噬菌體克隆中和各種IFN-α亞型生物活性，如抗病毒活性的能力，最終選出對大多數(優選全部)IFN-α亞型有廣泛中和活性的代表性抗體克隆。
抗IFN-α克隆的活性選擇在一個實施例中，本發明提供了抗IFN-α抗體，該抗體能結合併中和大多數(優選全部)IFN-α亞型的活性，但並不明顯結合或中和其他種類幹擾素的活性。例如用前述用於抗體的基本上相同方法，可測試不同噬菌體克隆中和不同IFN-α亞型抗病毒活性的能力。
4、可溶性IFNAR2-IgG的製備採用與Haak-Frendscho等人，Immunology 79594-599(1993)所述用於構建小鼠IFN受體免疫黏附素的相似方法，可產生基於hIFNAR2(pRKS hIFNAR2-IgG克隆)胞外域編碼人免疫球蛋白融合蛋白(免疫黏附素)的cDNA。簡而言之，如WO89/02922(PCT/US 88/0344，公布於1989年4月6日)所述構建質粒pRKCD42FCl。從公開的序列(Novick等人，Cell，77391-400)中獲得成熟hIFNAR2 ECD的前216個殘基的cDNA編碼序列。用hIFNAR2 ECD編碼cDNA代替pRKCD42FCl的CD4編碼序列以形成pRK5hIFNAR2-IgG克隆。使用磷酸鈣沉澱技術通過瞬間轉染在人胚胎腎293細胞中表達hIFNAR2-IgG。通過蛋白質A瓊脂糖凝膠柱親和層析(如Haak-Frendscho等人，(1993)，同上所述)從無血清細胞培養上清液中一步純化此免疫黏附素，用含20％(W/V)甘油，PH為3.0的0.1M檸檬酸緩衝液洗脫結合的hIFNAR2-IgG。
5、抗IFN-α抗體的診斷應用本發明的抗IFN-α抗體是IFN-α表達診斷試驗中的獨特研究試劑。如前所述，在某些免疫疾病如IDDM，SLE以及自身免疫性甲狀腺炎中IFN-α表達增加。使用對大部分IFN-α亞型有廣泛反應活性的本發明抗IFN-α抗體可檢測並定量測量這些疾病中各種IFN-α亞型的增加表達。抗IFN-α抗體也用於從重組細胞培養物或天然來源中親和純化各種IFN-α亞型的。
在許多眾所周知的診斷試驗方法之一中可採用IFN-α抗體以檢測IFN-α。例如從所需來源中獲得樣品，將該樣品與抗IFN-α抗體混合使得該抗體與存在於混合物中的任何IFN-α亞型形成抗體/IFN-α複合物，並且檢測存在於混合物中的任何抗體/IFN-α複合物，可測定生物體樣品的IFN-α。以本領域已知的適合特定樣品的方法可製備試驗用的生物樣品，根據所用試驗的類型選擇將樣品與抗體混合的方法以及檢測抗體/IFN-α複合物的方法。這種試驗包括競爭和夾心試驗，以及空間抑制試驗。競爭和夾心方法採用相分離步驟作為該方法的完整部分而空間抑制試驗在單個反應混合物中進行。
IFN-α的分析方法都採用1種或多種下列試劑標記IFN-α的類似物，固定化IFN-α的類似物，標記的抗IFN-α抗體，固定化抗IFN-α抗體和立體偶聯物。標記試劑也稱為「示蹤劑」。
所用標記是任何不幹擾IFN-α和抗IFN-α抗體結合的可檢測的官能度。用於免疫試驗的許多標記是已知的，例子包括那些可直接檢測的分子，如螢光色素，化學發光劑，和放射性標記以及必須經反應或衍生才能檢測到的分子，如酶。這些標記的例子包括放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物羅丹明及其衍生物，丹醯，7-羥基香豆素，螢光素酶，如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利NO 4,737,456)，螢光素，2，3-二氫二氮雜萘二酮，辣根過氧化酶(HRP)，鹼性磷酸酶，β-半孔糖苷酶，葡糖澱粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，如葡糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡糖-6-磷酸脫氫酶，雜環氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與酶偶聯使用過氧化氫氧化染料前體，如HRP，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶，生物素/親和素，自旋標記，噬菌體標記，穩定的的自由基，等等。
可用常規方法將這些標記共價結合於蛋白質或多肽。例如可用偶聯劑如二醛，碳化二亞胺，馬來氫醯亞酐，雙二醯胺酯，雙重氮化聯苯胺等以上述螢光、化學發光和酶標記對抗體進行標記。見美國專利NO.3,940,475(螢光測定)和3,645,090(酶)；Hunter等人，Nature，144945(1962)；David等人，Biochemistry，131014-1021(1974)；Pain等人，J.Immunol.Methods，40219-230(1981)；和Nygren，J.Histochem.And Cytochem.，30407-412(1982)。本文優選的標記是酶，如辣根過氧化酶和鹼性磷酸酶。
這些標記(包括酶)與抗體的偶聯是免疫試驗技術普通技術之一的標準操作方法。如參見O』Sullivan等人，「Methods for the Preparation of Enzyme-antibodyConjugates for Use in Enzyme Immunoassay，」收編在Metnods in Enzymology，J.J.Langone和H.Van Vunzkis編，第73卷(Academic Press，New York，New York，1981)。
對某些試驗方法需要固定試劑。固定需要將抗IFN-α抗體與溶液中保持游離的IFN-α相分離。常規上，在試驗步驟之前不溶解抗IFN-α抗體或IFN-α類似物而實現這一分離，如通過吸附於水不溶性基質或表面(Bennich等人，美國專利3,720,460)，通過共價偶聯(例如，用戊二醛交連)，或者後來不溶解抗IFN-α抗體或IFN-α類似物，如免疫沉澱法。
其它的試驗方法，已知為競爭或夾心試驗，已經完善建立並廣泛用於商品化診斷產業。
競爭性試驗依賴示蹤劑IFN-α類似物與測試樣品IFN-α競爭有限數量的抗IFN-α抗體抗原結合位點的能力。通常在競爭之前或/之後不溶解抗IFN-α抗體然後將結合於抗IFN-α抗體的示蹤劑與未結合的示蹤劑和IFN-α相分離。通過傾析(其中結合伴侶為預先不溶解的)或離心(其中結合伴侶在競爭反應之後被沉澱)進行此分離。試驗樣品IFN-α的量與結合的示蹤劑的量(通過標記物質的量測定)成反比。用已知數量的IFN-α製作劑量反應曲線並與試驗結果作比較，以定量試驗試驗樣品中的IFN-α量。當用酶作為可試驗標記時這些試驗稱為ELISA系統。
另一種競爭試驗稱為「均相」試驗，不需要相分離。在此，製備並使用IFN-α與酶的偶聯物，這樣當抗IFN-α抗體結合於IFN-α時，所含抗IFN-α抗體調節了酶活性。此例中，IFN-α或其免疫活性片段以雙功能有機橋與酶(如過氧化酶)偶聯。用抗IFN-α抗體選擇所用的偶聯物抗IFN-α抗體的結合抑制或加強了標記酶的活性。此方法本身以EMIT命名而廣泛使用。
立體偶聯物用於均相試驗的空間位阻方法中。將低分子量的半抗原與小IFN-α片段共價連接合成這些偶聯物使得抗半抗原的抗體基本上不能與抗IFN-α抗體同一時間結合此偶聯物。在此試驗方法下，試驗樣品中所含IFN-α將結合抗IFN-α抗體，從而使抗-半抗原抗體與此偶聯物結合，導致偶聯物半抗原的特性改變，如，當半抗原是螢光團時發生螢光改變。
夾心試驗尤其適用於IFN-α或抗IFN-α抗體的測定。順序夾心試驗中，使用固定的IFN-α抗體吸附試驗樣品的IFN-α，通過洗滌除去試驗樣品，用結合的IFN-α吸附第二個標記的IFN-α抗體，然後將殘餘的示蹤劑與結合物質相分離，結合的示蹤劑量與試驗樣品的IFN-α量成正比。在「同時」夾心試驗中，試驗樣品在加入標記的抗IFN-α之前不分離。用抗IFN-α單克隆抗體作為一種抗體，多克隆抗IFN-α抗體作為另一種抗體的順序夾心試驗可用於試驗樣品的IFN-α。
前文只是IFN-α的示範性診斷試驗。現在或以後開發的採用抗IFN-α抗體測定IFN-α的其他方法，也包括在本文範圍之內，包括上述的生物試驗法。
6、藥物組合物與抗IFN-α抗體的給藥將具有所需純度的抗體與任選的生理上可接受的運載體，賦形劑或穩定劑(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版Edition，Alfoson，R.編，Mack Publishing Co.(Easton，PA1995))混合製備本發明的抗IFN-α抗體治療製劑以凍幹餅或水溶液形式貯存。可接受的運載體，賦形劑或穩定劑在所用劑量和濃度下對受者無毒性，且包括緩衝液，如磷酸鹽，檸檬酸鹽，以及其它有機酸，抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽，蛋白質，如血清蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸，穀氨酸，天冬氨酸，精氨酸或賴氨酸，單糖，二糖以及其它糖類包括葡萄糖，甘露糖，或糊精，螯合劑如EDTA；糖醇如幹露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如吐溫，聚醚或聚乙二醇(PEG)。
用於體內給藥的抗IFN-α抗體必須是無菌的。在凍幹和重建之前或之後，通過無菌過濾膜過濾不難實現這一要求。通常抗IFN-α抗體以凍幹形式或溶液貯存。
通常將治療性抗IFN-α抗體組合物置於帶無菌入口的容器中，例如帶有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈輸液袋或小管中。
根據已知方法進行抗IFN-α抗體的給藥，如靜脈內、腹膜內、腦內、皮下、肌肉內、眼內、動脈內、腦脊髓內或病灶內途徑注射或灌注，或如下所述的緩釋系統。抗體優選是全身給藥的。
緩釋製品的合適例子包括以有形物品形式如薄膜，或微膠囊的半滲透性聚合物基質。緩釋基質包括聚酯，水凝膠，聚交酯(美國專利3,773,919，EP 58,481)，L穀氨酸和乙基-L-穀氨酸酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22547-556(1983)，聚(2羥基乙基甲基丙烯酸酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)和Langer.Chem Tech.1298-105，1982)，乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚合-D(-)-3羥丁酸(EP 133，988)緩釋抗IFNAR2抗體組合物也包括脂質體包裹的抗體。按已知方法(DE3218121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692，1985；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030-4034，1980；EP 52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利申請83-118008；美國4,485,045和4,544,545，以及EP102,324)製備含抗體的脂質體。通常脂質體是小的(約200-800埃)單室類型，其中脂類含量大於約30mol％的膽固醇，為獲得最適抗體療法調整所選比例。
抗IFN-α抗體也可通過吸入給藥。用於液體製劑的商品化霧化器(包括噴射霧化器和超聲霧化器)可用於給藥。液體製劑可直接霧化而幹凍粉末可在重建後霧化。另外，抗IFN-α抗體用氟碳配方和米製劑量吸入器氣溶膠化，或作為凍乾粉和碾磨粉吸入器。
治療上所用的抗IFN-α抗體的「有效量」將取決於例如治療對象、給藥途徑、所用抗IFN-α抗體的類型，以及患者狀況。因此，治療學家必需滴定劑量並按需修改給藥途徑以獲得最佳治療效果。通常，臨床醫生將給予抗IFN-α抗體直到獲得所需效果的劑量。用常規試驗不難監控該治療過程。
用本發明抗IFN-α抗體治療的患者包括臨床前患者或那些最近發作免疫介導疾病，尤其是自身免疫性疾病的患者。患者是本發明治療對象直到沒有健康組織需要受保護避免免疫介導的破壞。例如，患胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的患者可從用本發明抗IFN-α抗體的治療中得益，直到患者的胰島細胞不再有活力。在免疫介導的或自身免疫性疾病的發展過程中，需要儘可能早的給予抗IFN-α抗體，並且要持續治療只要必須保護健康組織不受患者免疫系統的破壞。例如，治療IDDM患者直到胰島素監測顯示有充分的胰島應答和胰島壞死減少的其它跡象(如抗-胰島-抗體滴度降低)之後患者可撤銷抗IFN-α抗體治療一段試驗時間，監測此期間內胰島素反應和抗胰島抗體的水平有無復發。
在用抗IFN-α抗體治療與預防免疫介導的或自身免疫性疾病中，以複合優良藥物規範的方式製備此抗體組合物，確定劑量並給藥。上文所考慮因素包括待治療的具體疾病、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、患病原因、抗體輸送的部位、抗體的具體類型、給藥方法、給藥時間表，以及其他醫生已知的因素。待給予的抗體的「治療有效量」將收這些因素而定，而且是預防，緩解或治療此病(包括治療慢性自身免疫性疾病和移植物受者中維持免疫抑制)所必需的最小量。此量宜低於對宿主有毒或使宿主對感染顯著易感的量。
作為總建議，腸胃道外給予該抗體的初步藥學有效量範圍是每天病人體重每公斤約0.1-50mg，典型的初步抗體劑量範圍是0.3-20mg/kg/天，更佳是0.3-15mg/kg/天。所需的劑量可通過抗體的單藥團給藥，多個藥團給藥或連續輸注給藥來輸遞，取決於醫師希望達到的藥物動力學衰減模式。
如上所所指，這些抗體的建議量應經過大量的治療性斟酌。如上所示，選擇適當劑量與時間表的關鍵因素是所獲結果。
此抗體不需要，但任選地可與當前用於預防或治療所示免疫介導的或自身免疫性疾病的一種或多種製劑一起配製。例如，對於類風溼性關節炎，此抗體可與糖皮質類固醇聯合給予。這些其他製劑的有效量取決於配方所含抗IFN-α抗體的量，疾病或治療類型，以及上述的其它因素。這些製劑通常以相同劑量和前述給藥途徑或以上所用劑量的1-99％使用。
以下實例中可發現本發明的更多細節，進一步明確了本發明的範圍。此說明書引用了所有的參考文獻及此處所引用的參考文獻都在這裡完整引入以作參考。
實施例提供以下實例來闡明而不限制。提供實例的目的是為了向本領域的普通技術人員提供如何製備和應用本發明的化合物，組合物，及方法，而無意限制發明者所認為的發明範圍。已作出努力確保所用數字的準確度(如，數量，溫度，等)但是應該說明有一些實驗性誤差和偏差。除另有註明，分是重量等分，溫度是攝式度，而壓力為大氣壓或接近大氣壓。在說明書中所有引用的公開內容納入本文作為參考文獻引用。
實施例1廣泛反應活性的鼠抗IFN-α單克隆抗體的產生和特性鑑定材料與方法對IFN-α諸亞型具有廣泛反應性的鼠單克隆抗體用人IFN-α諸亞型的混合物順次免疫接種小鼠產生大量候選mAbs，然後篩選其結合能力和活性，從而開發了泛-IFN-α中和性抗體。特別地，用重懸在MPL-TDM(Ribi ImmonochemicalResearch，Inc.，Hamilton，MT)中的2.5g淋巴母細胞hIFN-α(Product No.I-9887of Sigma，St.Louis，MO)免疫接種Balb/c小鼠各後腿足墊9次(間隔兩周)。最後一次加強注射三天後，用35％聚乙二醇將膕窩淋巴結細胞與小鼠類骨髓瘤細胞P3X63Ag 8.U.I(ATTC CRL 1597)融合。在HAT培養基中選擇雜交瘤。融合十天後，在ELISA中先篩選雜交瘤培養上清液與不同種類hIFN-α結合的mAbs。如下所述，測試了所選雜交瘤培養上清液抑制IFN對人肺癌細胞系A549細胞的抗病毒細胞病變效應的能力。如圖1所示從1794個融合孔中獲得的3個mAbs能中和多組的IFN-α亞型。亞克隆並重分析這三個mAbs。
中和IFN-α的抗病毒活性如Yousefi，S.，等人，Am.J.Clin.Pathol.，83735-740(1985)所述測試了侯選抗體中和IFN-α的抗病毒活性的能力。簡而言之，用受腦心肌炎(EMC)病毒攻擊的人肺癌A549細胞進行了該試驗。以100∶1的總體積將mAb的系列稀釋液與各種單位的I型幹擾素一起培養37℃1小時。然後以100∶1的細胞培養基將這些混合物與用5×105個A549細胞一起培養24小時。然後用2×105pfu的EMC病毒攻擊細胞24小時。在培養後。用可視顯微鏡檢查或結晶紫染色測定細胞活力。中和性抗體滴定度(EC50)定義為能中和100單位/ml的I型IFN50％的抗病毒細胞病變作用的抗體濃度。用NIH參考品重組人IFN-α2為標準品測定本研究中I型IFN的單位。所測的各種I型IFN的比活性如下IFN-α2/α1(IFN-α2殘基1-62/-α1殘基64-166(2×107IU/mg)，IFN-α1(3×107IU/mg)，IFN-α2(2×107IU/mg)，IFN-25(8×107IU/mg)，IFN-α8(19×107IU/mg)，以及IFN-α10(1.5×107IU/mg)。所測的白細胞IFN是Sigma產品No.I-2396。所測的淋巴母細胞IFN是NIH參考標準品Ga23-901-532。在申請人請求下，用Access Biomedical(San Diego，CA)進行的實驗中使用上述試驗方式獲得圖3B所示數據。
電泳遷移變動實驗IFH的大多數立即作用與潛伏性胞質信號轉導劑和轉錄(STAT)蛋白活化劑的激活相連繫產生多蛋白複合體、幹擾素刺激的基因因子3(ISGF-3)，其誘發靶啟動子幹擾素刺激應答元件(ISRE)的轉錄。ISGF3包含3個蛋白質亞基STAT1，STAT2和P48/ISGF3γ。P48蛋白質屬於幹擾素調節因子(IFR)家族，且是直接與ISRE互相作用的DNA結合蛋白質。這樣，監測IFN治療反應中的ISRE特異性細胞DNA結合複合體提供了評價IFN對靶細胞作用的簡單，快捷而方便的方法。進行這種分析的方便形式之一是電泳遷移變動試驗(EMSA)，其中IFN治療所誘發的ISRE結合活性，導致了相應於ISRE的共同序列的放射標記的雙鏈寡酸苷酸探針的電泳遷移率變動。
基本上如Kurabayashi等人，Mol.Cell Biol.，156386(1995)所述進行了該試驗。簡而言之，將5ng的特異性IFN-α亞型加入不同濃度(5-100μg/ml的抗IFN-αmAb在37℃下用5×105個Hela細胞在200μL的DMEM中培養30分鐘。加入hIFN-α前特細胞與抗體4℃預培養15分鐘。在PBC中洗滌細胞並懸於125μL緩衝液A中(10mMHEPES PH7.9，10mMKCL，0.1mMETDA，1mMDTT，1mM苯甲基磺醯氟，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽)。在冰上培育15分鐘後，加入0.025％NPAO裂解細胞，從而獲得核沉澱，懸於50微升緩衝液B(20mMHEPES，pH7.9，400mMNaCl，0.1mM EDTA，1mMMDTT，1mM苯甲基磺醯氟、10微克/毫升亮抑蛋白酶酞、10微克/毫升抑蛋白酶肽)中，並保持在冰上30分鐘。離心澄清核組分並在70℃下保存上清液直至使用。利用DNA聚合酶I克列諾32P-dATP(3000imM，Amersham)的填充反應由單鏈寡酸苷酸(ISG 15頂部5，GATCGGGAAAGGGAAACCGAAACTGAAGCC-3，[SEQ ID NO.13]，ISG15底部，GATCGGCTTCAGTTTCGGTTTCCCTTCCC-3，[SEQ ID NO.14])製得雙鏈探針。使用BIO-Spin 30柱(Bio-Rad)從未摻入放射性核苷酸中提純標記的寡核苷酸。室溫下培養結合反應物(在15μL結合緩衝液(10Mm Tris-HCL，PH7.5，50mMNacl，1mMEDTA，1mMDTT，1mM苯甲基磺醯氟和15％甘油)中含有5μL核提取物，25000cpm標記探針和2μg非特異性異競爭物聚(dI-dC)-聚(dI-dC))30分鐘。將DNA蛋白質複合體溶解在6％非變性聚丙烯醯胺凝膠中並用作放射自顯影圖分析。在單獨反應混合物中加入350ng的未標記ISG15探針測定試驗的特異性。用抗STAT1抗體以超變動試驗證實ISGF3特異複合體的形成。
克隆編碼9F3抗IFN-α單克隆抗體的基因產生、克隆並測序鼠抗人IFN-αAb 9F3。用於大腸桿菌中的F(ab)表達與誘變的質粒PEMXI先前已有描述(Werther等人，J.Immunol.1574986-4995)。簡單而言，此質粒含有編碼共有的人K亞組1輕鏈(VLK1-CL)和共有的人亞組III重鏈(VHIII-CH1)的DNA片段和鹼性磷酸酶啟動子。採用VL和VH的共有序列先前已有描述(Carter等人，Proc.Natl.Sci.USA 894285-4289)。
結果我們前已經表明IDDM患者的胰島表達了廣譜的IFN-亞型(Huang等人，Diabetes 44658-664同上)。我們也闡述了在IDDM和IFN-β或IFN-γ的表達之間沒有明顯關係(Huang等人，同上)。雖然特異性IFN-亞型的表達作為SLE病理學的一部分還沒有被確定，對於IDDM，是與IFN-α相關，而不與IFN-β或IFN-γ相關(Hooks，等人，Arthritis Rheumatism 25396-400；Kim等人，Clin.Exp.Immunol.70562-569，Lacki等，J.Med.2899-107，Robak等人，Archivum Immunologiae et，Therapiae Experimentalis46375-380[]1998)，Shiozawa等，ArchritisRheumatism 35417-422，von Wussow等人，Rheumatology International 8225-230。這些觀察使得我們提出對於IDDM或SLE的治療幹預需要候選抗體能中和大多數的IFN-a亞型而同時保留其它幹擾素(β，γ和ω)和白細胞介素的完整活性，該活性是宿主防禦所需要的。
它們(9F3)之一能夠中和廣譜重組幹擾素-α亞型並進一步作了特徵鑑定。如圖2所示，9F3能中和7種重組幹擾素(IFN 2，4，5，8和10(圖2)和IFN 1以及21(表2和圖6)的抗病毒活性。這些IFN-亞型包括全譜序列，如I型幹擾素序列系統樹圖闡明的那樣。更重要的是，能中和IFN-諸亞型的9F3 mAb不能中和IFN-β(圖2，表2)或IFN-γ。如圖2所示IFN-β活性的略微增加在其他試驗中不可再現，看起來這是試驗誤差的結果。
已經開發了其它中和IFN-a的mAb(P72，L11~L14)。然而，這些抗體只中和有限數量的重組IFN-α亞型，不能中和廣譜IFN-α亞型，如那些由活化白細胞產生的IFN-α亞型(圖3A)。相反，9F3 mAb能中和活化白細胞產生的異質性IFN2亞型混合物的至少95％抗病毒活性(圖3A)。類似地，9F3mAb也能封閉淋巴母細胞IFN(NIH參考標準)的獨立製品的抗病毒活性，如獨立試驗所測得的那樣(圖3B)。
採用另一種生物試驗法也可測定9F3 mAb中和IFN-α的能力。該試驗根據在DNA結合試驗即電泳遷移率變動試驗中IFN-α激活信號分子，幹擾素刺激基因因子3(ISGF3)與衍生自幹擾素刺激應答元件(ISRE)的寡核苷酸的結合能力(P72，L25~26)。
I型幹擾素信號向細胞核的轉導依靠蛋白複合體ISGF3的激活，包括兩個信號轉導及轉錄活化(STAT)蛋白，STAT1和STAT2，以及幹擾素調節因子(IRT)蛋白，P48/ISGF3γ(P72，L29)。後者是ISGF3的DNA序列識別亞基直接與ISRE相互作用(L30~L32)。用IFN-α或IFN-β處理COS細胞，導致相應於ISGF3與ISRG衍生探針結合的複合體的出現。9F3 mAb阻斷了IFN-α誘導的而不是IFN-β誘導的複合體的出現(圖4)。另外，該試驗測得V9F3 mAb能中和6種重組IFN-亞型的活性(表2)。
表2mAb 9F3對I型IFN誘導ISGF3形成的抑制作用
9F3對IFN誘導的複合體的抑制作用程度如表中所示-表示誘導條帶沒有改變；+表示誘導條帶部分丟失而+++表示誘導條帶被大部分消除。所用mAb為10μg/ml，所用IFN-α為25ng/ml。
已建立了9F3能中和廣泛種類的重組IFN-亞型與活化白細胞產生的IFN-亞型的混和物，我們克隆並排序了編碼9F3 mAb重和輕鏈的cDNA。提純重和輕鏈而所衍生的N終端胺基酸用於設計對應於N末端的簡併5』引物，而對應於鼠類K輕鏈和IgG2重鏈的恆定結構域設計3』引物。用常規PCR技術克隆對應cDNA並測定嵌入的核苷酸序列。圖5顯示了鼠類9F3單克隆抗體VL(5A)和VH(5B)的序列順序，人源化版本(V13)以及人重鏈亞基III和人K輕鏈亞基的交感序列。為確保所克隆的cDNA編碼了反應9F3 mb特異性與特性的正確Mab，使用如圖5所示的鼠類cDNA序列和人CH1結構域生成了重組嵌合蛋白。所得嵌合體(CH8-2)能完全中和多種重組IFN-α亞型(圖6)。然後用重和輕鏈的胺基酸序列生成人源化抗體。
實施例2 9F3泛-IFN-中和性單克隆抗體的人源化材料與方法人源化F(ab)的構建為了構建人源化9F3的第一個F(ab)變體，在p EMX1的含脫氧尿苷的模板上進行定點誘變(P74，L10)，將6個CDR改為鼠9F3序列(圖5)，每個CDR中所包含的殘基來自於基於序列的CDR定義(P24，L13)。因此F-1由具有6個完整鼠CDR序列的完整人構架(VLK亞型1和VH亞型III)組成。從F-1的質粒模板構建了所有其它F(ab)變體的質粒。用商品化試劑盒(P74，L18)將質粒轉化入大腸桿菌株XL-1Blue中(P74，L16～L17)，用於製備雙鏈和單鏈DNA。用雙脫氧核苷酸鏈終止法(P74，L19～L20)對每個變體編碼輕鏈和重鏈的DNA完全試序。將質粒轉化入大腸桿菌株16Cg(MM294的衍生物)中，接種在含有50μg/ml羧苄青黴素的Luria肉湯平板上，並選擇單個菌落以表達蛋白質。37下，單菌落培養在5ml Luria肉湯-100μg/ml羧苄青黴素中5-8小時。將這5ml培養物加入到500ml含有50μg/ml羧苄青黴素的AP5培養基中並在4L折流搖瓶中37℃培養20小時。AP5培養基含有1.5g葡萄糖，11.0g Hycase SF，0.6g酵母提取物(檢定的)，0.19克MgSO4(無水的)，1.07gNH4Cl，3.73gKCl，1.2gNaCl，120ml 1M三乙醇胺，PH7.4加到1L水中，然後用0.1μM Sealkeen過濾器過濾除菌。在1L離心瓶中以3000×g離心收穫細胞並除去上清液。凍結1小時之後，將沉澱重懸於25ml冷的10mMTris-1mMEDTA-20％蔗糖，PH7.5中，加入250μL的0.1M苯甲醯胺(P74，L31)抑制蛋白酶水解。冰上緩慢攪拌3小時後，以40000xg離心樣品15分鐘。然後將上清液加到已用10mMTris-1mMEDTA，PH7.5平衡的蛋白G-Sepharose CL-4B(pharmaciaUppsala.Sweden)柱中(柱床體積0.5ml)。用10ml 10mM Tris-1mM EDTA，PH7.5洗滌此柱並用3ml 0.3m甘氨酸，PH3.0洗脫到1.25ml 1M Tris，PH8.0中。然後用Centricon-30(L5)將F(ab)的緩衝液更換為PBS並濃縮到0.5ml的最終體積。所有F(ab)跑SDS-PAGE電泳膠以確定純度，並用電噴射質譜法驗證各變體的分子量。用定量胺基酸分析測定F(ab)濃度。
嵌合性與人源化IgG的構建為了產生嵌合性和人源化9F3的人IgG2版本，將合適的鼠或人源化的VL和VH(F-13，表3)結構域亞克隆入分開的前述pRK載體中(P75，L13～L14)，該載體含有編碼人IgG2 CH1-Fc或人輕鏈CL結構域的DNA，用雙脫氧核苷酸測序法驗證編碼各變體的完整輕鏈和完整重鏈的DNA。嵌合性IgG含有與人CH1結構胺基酸SerH113融合的完整鼠9F3VH結構域，和與人CL結構域胺基酸LysL107融合的完整鼠9F3V結構域。
採用高效方法(L21)將重鏈和輕鏈質粒共轉染入腺病毒轉化的人胚腎細胞系293中(L20)。將培養液改為無血清培養液，每日收穫至5天。用蛋白A-SephroseCL-4B(Phrmacia)從合併的上清液中提純抗體。用Centricon-30(Amicon)將洗脫抗體的緩衝液換為PBS，濃縮至0.5ml，用Millex-GV(Millipore，Bedford，MA)除菌過濾並在4下保存。用定量胺基酸分析測定IgG2濃度。
IFN-結合試驗在ELISAK中，在各孔中加入50μL PBS配的0.1μg/mlIFN-α包被96孔微量滴定板(Nunc)4培養過夜。然後用洗滌緩衝液(PBS加0.05％Tween20)洗板三次。用200μl SuperBlock(Pierce)封閉微量滴定板諸孔室溫培養1小時。用洗滌緩衝液再洗板三次。洗滌後，在所選孔中加入100μl起始於10μg/ml人源化mAb的毓稀釋液。在振搖器上室溫培養滴定板1小時，並用洗滌緩衝液洗三次。接著，將100μL與山羊抗人Fab特異性抗體(Cappel)偶聯的辣根過氧物酶以試驗緩衝液(溶於PBS中的0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween)作稀釋1∶1000加入到各孔中。室溫振搖器上培養滴定板然後用洗滌緩衝液洗三次，然後在各孔中加入100μl底物(TMB，3，31，5，51-四甲基聯苯胺；Kirkegarrd Perry)室溫培養10分鐘。各孔中加入100μL終止液(購自Kirkegaard Perry)終止反應，在自動微量滴定板讀數器中讀取450nm處吸光值。
BIA coreTM生物傳感器試驗用BIA coreTM生物傳感器(P76，L16～L17)測定了IFN-α與人源化F(ab)，嵌合性和人源化IgG2抗體的結合。將IFN-α固定在PH6.3，50mM MES緩衝液配的IFN-α60μg/ml的傳感晶片上。使抗體接觸用磷酸鹽緩衝鹽水/1％Tween-20配的IFN-α75μg/ml(500nM)的晶片。測定抗體的on-rate(Kon)。
鼠和人源化F(ab)的計算機圖解模型用VL和VH結構域(圖5A和B)序列構建了鼠9F3VL-VH結構域的計算機圖解模型(圖7)。用此模型確定哪個構架殘基應該摻入到人源化抗體中。還構建了人源化F(ab)模型以驗證鼠構架殘基的正確選擇。如前所述(P76，L28)構建了這些模型。
結果將人重鏈亞型III和輕鏈亞型I的共有序列用作圖5所示的人源化構架(P77，L3～4)。此構架已成功用於其它鼠抗體的人源化(P77，L5～L7)。先製備所有人源化變體並篩選在大腸桿菌中表達的F(ab)的結合。500ml搖瓶中通常得率為0.1-0.4mgF(ab)。
已根據F(ab)-抗原複合體的序列高變性(P77，L11)或晶體結構(L12)明確了互補決定區(CDR)殘基。雖然以序列為基礎的CDR大於以結構為基礎的CDR，這兩種限定(範圍)除3CDR-H1外通常是一致的。根據以序列為基礎的限定範圍，CDR-H1包括殘基H31-H35，而以結構為基礎的限定範圍是CDR-H1的殘基H26-H32為(輕鏈殘基以L為前綴，重鏈殘基以H為前綴)。對於本研究，CDR-H1的限定範圍是此二者的結合，即，包括殘基H26-H35。用以序列為基礎的限定範圍來確定其它CDR(L19)。
在最初的變體F-1中，從小鼠抗體的CDR殘基轉移到人構架。另外，生成含有帶F-1輕鏈(Ch-1)的嵌合重鏈和帶嵌合輕鏈(Ch-2)的F-1重鏈組成的F(ab)並試驗結合能力。F-1與IFN-結合極差(表3)。對Ch-1和Ch2結合親合性的比較(表3)表明需要改變F-1vH結構域中的構架殘基以增強結合。
表3
鼠殘基為粗體字，殘基編號方式根據Kabat等人(1991)。標準鉛字標明了由人構架殘基到鼠的變化。斜體字標明了由鼠構架殘基到人的變化。用ELISA測試Fab與IFN-的結合，結果以10μg/ml OD450mm提供。SD，標準差，n，實驗重複次數。
先前的人源化過程(P79，L2～L3)與F(ab)抗原晶體結構的研究(P79，L3～L4)已顯示了殘基H71和H73能對結合上的深度影響(可能通過影響CDR-H1和CDR-H2的構型)。將H71和H73位置的人殘基改變成其小鼠對應物僅僅微弱改善結合(版本F-2，表3)。在位置H67，H69和H78(版本F-3)的更多的同時改變以及隨後ArgH94Ser(版本F-4)和AlalH24Thr(版本F-5)的改變顯著改善了結合(表3)。由於位置H67，H69和H78已經同時改變，每個各自變回人共有序列構架殘基；版本F-7，F-8，F-9和F-10顯示位置H67人殘基是優選的，位置H69並未顯示對鼠或人殘基有任何偏愛。而鼠殘基優先在位置H78。
在之前的人源化過程中，我們已發現緊鄰CDR-H1和CDR-H2的構架環，FR3(P79，L16)內的殘基能影響結合(L17)。因此，將此環中的兩個殘基改變為它們的鼠對應物賴氨酸H75變為小鼠的絲氨酸(版本F-11)和天冬醯胺H76變為鼠精氨酸(版本F-12)。只有天冬醯胺H76變成精氨酸，提高了結合(表3)。
檢驗鼠和人源化F(b)的模型，表明了掩蔽在VL-VH界面並與CDR-H3互相作用的殘基L46也可能對CDR-H3構建的決定和1或VL與VH結構域中的互相作用的影響起作用。類似地，緊鄰於CDR-L12的L49位置在人共有序列(酪氨酸)和9F3(絲氨酸)序列之間不同。因此，同時取代亮L46結頁氨酸和酪氨酸L49絲氨酸殘基，產生了具有更進一步改善的結合(表3)的變體(F-13)。根據所有產生的變體中的最佳結合，選擇F-13作為最終人源化版本。
將衍生於F-13的VH和VL結構域分別與人IgG2CH1-Fc和人CL結構域融合產生了人源化重組抗IFN-單克隆抗體(V13IgG2)。然後將V13IgG2的Kon速率和KD值與嵌合性IgG2或鼠9F3相比較。V13IgG2和嵌合性IgG2結合於固定化IFN-α的BLACoreTM測定顯示它們的KON速率相似(表4)。採用KinexaTM技術的親和力測量表明，與親代鼠9F3抗體相比，V13IgG2對IFNα的親和力降低了2倍。
表4
a.V13IgG2是與人IgG2 CH1-Fc相連的F-13HV結構域和與人CL結構域相連的F-13 VL結構域，ChIgG2是與人IgG2 CH1-Fc相連的鼠9F3VH結構域和與人CL結構域相連的鼠9F3VL結構域。bKoff/Kon。
材料的保藏以下材料已存放在美國典型培養物保藏所(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA(ATCC))材料ATCC保藏號獲取權利證書日期
1、分泌9F3鼠抗-IFN-α PTA-2917 2001年1月18日單克隆抗體的雜交瘤細胞系(Id.Ref.9F3.18.5)2、表達嵌合性CH8-2全長 PTA-2883 2001年1月9日IgG的重鏈的pRK基礎載體(Id.Ref.XAIFN-ChHp DR2)3、表達嵌合性CH8-2全長 PTA-2880 2001年1月9日IgG2的輕鏈的pRK基礎載體(Id.Ref.XAIFN-ChLp DR1)4、表達人源化V13全長 PTA-2881 2001年1月9日IgG重鏈的pRK基礎載體(Id.Ref.VHV30-IgG2)5、表達人源化V13全長 PTA-2882 2001年1月9日IgG2輕鏈的pRK載體(Id.Ref.VLV30-IgG)為了專利的(申請)程序和管理的目的，在微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約的條款下進行保藏(佩達佩斯條約)。自保藏之日起，保證所保藏的活培養物維持30年。保藏物在布達佩斯條約條款下有ATCC製備而可獲得並遵循Genentech公司和ATCC之間的協定，其保證根據相關美國專利，該保藏物培養產生的後代公眾可永久和不受限制的得到或向美國公眾或外國專利申請公開(無論哪個先來)，並保證對美國專利商標委員會根據35 U.S.C 122和該委員會規則包括37 C.F.R§1.14具體參考8860G638所確定的人可得到該保藏物後代。
本申請代理人同意在合適的條件下培養時如果保藏的材料培養物死亡或損失或遭受破壞，此材料可立即用另一相同材料替換。獲的該保藏材料並不構成許可市售本發明，那樣做就違反了政府當局根據其專利法所授予的權利。
認為先前所寫的說明書足以使本領域技術人員實施本發明。因為本文的保存實施例的目的是闡述本發明的某些方面，任何功能上相同的構建物都在本發明的範圍之內，所以本發明並不限於該保藏的構建物所限定的範圍。本文材料的保藏並不構成承認本文中的描述不足以使本發明任何方面得以實施，包括其最佳形式，也不構成將權利要求的範圍限制在本說明書所描述的範圍內。本領域技術人員會懂得除了本文所顯示和描述的內容外，可根據以上描述對本發明作各種修改，這些都落在附屬權利要求書的範圍內。
序列表110A.春塔拉帕伊(Chuntharapai，Anan)J.K.金(Kim，Jin K.)T.斯圖爾特(Stewart，Timothy)L.G.普雷斯塔(Presta，Leonard G.)120抗-幹擾素α的抗體130GENENT.074A15060/2707751512001-02-2216014170FastSEQ for WindowS Version 4.02101211114212PRT2 13鼠科(Murine)4001Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Val Leu Ile Ser Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Ser Trp85 90 95Gly Ile Pro Arg Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg100 105 110Ala Val2102211119212PRT213鼠科(Murine)4002Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr20 25 30Ile Ile His Trp Val Lys Gln Gly His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ser Ile Asn Pro Asp Tyr Asp Ile Thr Asn Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95Ala Ser Trp Ile Ser Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Leu Met Val Ser Ala Ala Ser1152103211114212PRT213人工序列220223該序列表示包含人和非人序列的人源化嵌合抗體。4003Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro35 40 45Lys Val Leu Ile Ser Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp85 90 95Gly Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105 110Thr Val2104211110212PRT213智人(Homo sapiens)4004Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val100 105 1102105211119212PRT213人工序列220223該序列表示包含人和非人序列的人源化嵌合抗體。4005Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr20 25 30Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ser Ile Asn Pro Asp Tyr Asp Ile Thr Asn Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Lys Ser Lys Arg Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ser Trp Ile Ser Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser1152106211119212PRT213智人(Homo sapiens)4006Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser GIy Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser Ala Ser115210721115212PRT213智人(Homo sapiens)4007Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His1 5 10 1521082117212PRT213智人(Homo sapiens)4008Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5210921110212PRT213智人(Homo sapiens)4009Gln His Ser Trp Gly Ile Pro Arg Thr Phe1 5 102101021110212PRT213智人(Homo sapiens)40010Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His1 5 102101121117212PRT213智人(Homo sapiens)40011Ser Ile Asn Pro Asp Tyr Asp Ile Thr Asn Tyr Asn Gln Arg Phe Lys1 5 10 15Gly210122118212PRT213智人(Homo sapiens)40012Trp Ile Ser Asp Phe Phe Asp Tyr1 52101321130212DNA213智人(Homo sapiens)40013gatcgggaaa gggaaaccga aactgaagcc 302101421130212DNA213智人(Homo sapiens)40014gatcggcttc agtttcggtt tccctttccc 30
權利要求
1.一種抗IFN-α單克隆抗體，其特徵在於，該抗體與至少IFN-α亞型IFN-α1，IFN-α2，IFN-α4，IFN-α5，IFN-α8，IFN-α10和IFN-α21結合併中和其生物活性；
2.如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，該抗體為鼠抗體；
3.如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，該抗體為人源化抗體；
4.如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，該抗體為人抗體；
5.如權利要求1所述的抗體，其中所述生物活性為抗病毒活性；
6.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-α諸亞型至少70％的抗病毒活性；
7.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-α諸亞型至少80％的抗病毒活性；
8.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-α諸亞型至少90％的抗病毒活性；
9.如權利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-α諸亞型至少99％的抗病毒活性；
10.如權利要求1所述的抗體，該抗體能結合與鼠抗人IFN-α單克隆抗體9F3或其人源化或嵌合形式基本上相同的IFN-α表位；
11.如權利要求1所述的抗體，該抗體是鼠抗人IFN-α單克隆抗體9F3或其人源化或嵌合形式；
12.如權利要求1所述的抗體，該抗體是人源化的抗人IFN-α單克隆抗體9F3的版本13(V13)；
13.如權利要求1所述的抗體，該抗體能結合與ATCC於2001年1月18日保存的登錄號PTA-2917的雜交瘤細胞系所產生的抗IFN-α抗體基本上相同的IFN-α表位；
14.如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，該抗體為IgG類；
15.如14.所述抗體，其特徵在於，該抗體有IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4同種型；
16.如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，該抗體為抗體片段；
17.如權利要求16所述的抗體，其特徵在於，該抗體為Fab片段；
18.如權利要求16所述的抗體，其特徵在於，該抗體為F(ab『)片段；
19.如權利要求16所述的抗體，其特徵在於，該抗體為Fab片段；
20.一種抗IFN-α抗體輕鏈或其片段，其特徵在於，該輕鏈或其片段含有下列CDR(a)化學式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO7)的L1；(b)化學式YASNLES(SEQ ID NO8)的L2；和(c)化學式QHSWGIPRTF(SEQ ID NO9)的L3；
21.如權利要求20所述的抗IFN-α抗體輕鏈片段，其特徵在於，該輕鏈片段為輕鏈可變結構域；
22.一種抗IFN-α抗體重鏈或其片段，其特徵在於，該重鏈或其片段含有下列CDR(a)化學式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO10)的H1；(b)化學式SINPDYDITNYNQRFKG(SEQ ID NO11)的H2；(c)化學式WISDFFEY(SEQ ID NO12)的H3；
23.如權利要求22所述的抗IFN-α抗體重鏈片段，其特徵在於，該重鏈片段為重鏈可變結構域；
24.一種抗IFN-α抗體，其特徵在於，該抗體含有(A)至少一條輕鏈或其片段，而該輕鏈或其片段含有下列CDR(a)化學式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO7)的L1；(b)化學式YASNLES(SEQ ID NO8)的L2；和(c)化學式QHSWGIPRTF(SEQ ID NO9)的L3；和(B)至少一條重鏈或其片段，而重鏈或其片段含有下列CDR(a)化學式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO10)的H1；(b)化學式SINPDYDITNYNQRFKG(SEQ ID NO11)的H2；和(c)化學式WISDFFEY(SEQ ID NO12)的H3；
25.如要求24所述的抗體，其特徵在於，該抗體含有二硫鍵聯接的抗體重鏈-輕鏈對的同質四聚體結構。
26.如權利要求24所述的抗體，其特徵在於，該抗體為線形抗體；
27.如權利要求24所述的抗體，其特徵在於，該抗體為鼠抗體；
28.如權利要求24所述的抗體，其特徵在於，該抗體為嵌合抗體；
29.如權利要求24所述的抗體，其特徵在於，該抗體為人源化抗體；
30.如權利要求24所述的抗體，其特徵在於，該抗體為人抗體；
31.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子編碼權利要求1所述的抗體；
32.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子編碼權利要求11所述的抗體；
33.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子編碼權利要求12所述的抗體；
34.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子編碼權利要求24所述的抗體；
35.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子編碼權利要求20所述的抗體輕鏈或其輕鏈片段；
36.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子編碼權利要求22所述的抗體重鏈或其重鏈片段；
37.本發明是一種獨立核酸分子，其特徵在於，該獨立核酸分子含有ATCC於2001年1月9日保存的登錄號PTA-2882的載體中編碼輕鏈多肽的核酸序列；
38.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子含有ATCC於2001年1月9日保存的登錄號PTA-2881的載體中編碼重鏈多肽的核酸序列；
39.一種載體，其特徵在於，該載體含有權利要求31至38任何一項所述的核酸分子；
40.一種宿主細胞，其特徵在於，該細胞是用權利要求31至38任何一項所述的核酸分子轉化的宿主細胞；
41.如權利要求1，11，12和24任何一項所述的產生抗體的方法，其特徵在於，該方法包括在核酸序列表達產生抗體的條件下，培養含有編碼該抗體的核酸序列的宿主細胞；
42.一種雜交瘤細胞系，其特徵在於，該雜交瘤細胞系含有權利要求31至38任何一項所述的核酸分子；
43.一種雜交瘤細胞系，其特徵在於，該雜交瘤細胞系由ATCC於2001年1月18日保存登錄號為PTA-2917；
44.一種權利要求42所述的雜交瘤細胞系產生的抗體；
45.一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的權利要求1所述的抗體；
46.一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的權利要求11所述的抗體；
47.一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的權利要求12所述的抗體；
48.一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有與藥學上可接受的運載體混合的有效量的權利要求24所述的抗體；
49.一種診斷與細胞內IFN-α表達有關的疾病的方法，其特徵在於，該方法包括使所述細胞與權利要求1所述的抗IFN-α抗體接觸，並檢測IFN-α的存在；
50.一種治療與患者體內IFN-α表達有關的疾病的方法，其特徵在於，該方法包括給予所述患者有效量的如權利要求1所述的抗IFN-α抗體；
51.如權利要求50所述方法，其中所述患者為哺乳動物患者；
52.如權利要求51所述方法，其中所述患者為人；
53.如權利要求52所述方法，其中所述疾病為自身免疫性疾病；
54.如權利要求53所述方法，其中所述疾病選自於胰島素依賴性糖尿病(IDDM)；和全身性紅斑狼瘡(SLE)；和自身免疫性甲狀腺炎。
全文摘要
本發明總體上涉及產生和特徵鑑定對各種IFNα亞型具有廣泛反應活性的中和性抗－IFNα單克隆抗體。本發明還涉及這種抗－IFN－α抗體在診斷和治療與IFN－α表達增高有關的疾病，特別是自身免疫性疾病，如胰島素依糖性糖尿病(1DDM)和全身性紅斑狼瘡中的應用。
文檔編號A61P37/06GK1492930SQ02805351
公開日2004年4月28日 申請日期2002年1月29日 優先權日2001年2月22日
發明者A·春塔拉帕伊, A 春塔拉帕伊, J·K·金, 金, L·G·普雷斯塔, 普雷斯塔, T·斯圖爾特, 級 申請人:基因技術股份有限公司