一種人Pif1基因、其編碼蛋白及其應用的製作方法

2023-09-21 06:54:20

專利名稱：一種人Pif1基因、其編碼蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和基因工程領域，特別涉及一種能抑制端粒DNA加長的人Pif1基因、其編碼蛋白及其應用。
背景技術：
端粒是真核細胞內染色體末端的蛋白質-DNA結構，在保護染色體的完整性和維持細胞的複製能力方面起著重要作用。其功能是完成染色體末端的複製，防止染色體遭融合、重組和降解。
發明人發現酵母的Pif1蛋白(5』到3』DNA解旋酶)可抑制端粒DNA的加長，而且是通過抑制端粒酶而起作用的。Pif1蛋白的突變和Pif1蛋白的缺失的表型是一樣的，都使端粒變長。如果過量表達有酶活性的Pif1蛋白，端粒DNA會縮短。發明人還進一步證明了，在酵母細胞內Pif1蛋白和端粒DNA是直接相互作用的。尤為重要的是，發明人發現PIF1基因家族在進化上是非常保守的，從酵母、線蟲到果蠅都有Pif1同源蛋白。
人們在代表不同腫瘤類型的大約1000多個活檢樣品中發現大約85％的樣品呈端粒酶陽性反應。相反，90％以上的鄰近正常組織卻是端粒酶陰性。從而將這個酶與永生化和腫瘤的形成密切聯繫在一起！在正常的人體細胞中，端粒程序性地縮短限制了轉化細胞的生長能力，這很可能是腫瘤形成的一個抑制機制。端粒酶的重新表達在細胞永生化及癌變過程中起著重要的作用。有人甚至認為表達端粒酶的正常細胞更易癌變，端粒酶活性與腫瘤的這種特殊關係使之在診斷與治療方面具有重要的應用價值。對端粒酶活性的抑制可能對某些類型的腫瘤來說是一個很有意義的治療方法。
因此，本領域迫切需要研究開發人Pif1基因、其編碼蛋白及其應用。

發明內容
本發明的目的是提供了一種人Pif1基因(hPif1)及其編碼蛋白。
本發明的另一目的是提供一種利用所述基因或蛋白篩選促進或抑制端粒DNA加長的化合物的方法。
本發明的另一目的是提供了一種檢測個體Pif1表達水平的試劑盒及治療腫瘤的組合物。
本發明的第一方面，提供了一種分離的人Pif1蛋白，其特徵在於，它包含具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳的，所述多肽選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有DNA解旋酶活性的由(a)衍生的多肽。
本發明的第二方面，提供了一種人Pif1多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。
較佳的，所述人Pif1多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1923位的序列(b)具有SEQ ID NO1中1-2052位的序列。
本發明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有上述的多核苷酸。
本發明的第四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，所述宿主細胞含有上述載體。
本發明的第五方面，提供了一種具有人Pif1蛋白活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達人Pif1蛋白的條件下，培養上述宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人Pif1蛋白活性的多肽。
本發明的第六方面，提供了一種能與上述人Pif1蛋白特異性結合的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。優選的，所述抗體為單克隆抗體。
本發明的第七方面，提供了一種組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的上所述Pif1蛋白、或上述多核苷酸，以及藥學上可接受的載體。
本發明的第八方面，提供了一種篩選促進或抑制端粒DNA加長的化合物的方法，其特徵在於，它包括步驟(1)將人Pif1基因的cDNA裝入表達載體，轉染哺乳動物細胞株，製備表達Pif1蛋白的細胞株(2)向步驟(1)中的表達Pif1蛋白的細胞株培養液中加入測試化合物，檢測Pif1蛋白表達量的變化；抑制Pif1蛋白表達量增加的化合物就是促進端粒DNA加長的化合物，促進Pif1蛋白表達量增加的化合物就是抑制端粒DNA加長的化合物。
本發明的第九方面，提供了一種檢測個體Pif1表達水平的試劑盒，其特徵在於，它包括特異性擴增人Pif1基因或轉錄本的引物，或者與人Pif1蛋白特異性結合的抗體。
如本文所用，術語「人Pif1蛋白」和「人Pif1多肽」可互換使用，指人Pif1胺基酸序列(SEQ ID NO2)有70％以上，較佳地80％以上，更佳地90％，最佳地95％以上同源性的多肽。此外，人Pif1的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物可用於本發明。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的人Pif1蛋白或多肽」是指人Pif1多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化人Pif1蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括人Pif1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然人Pif1蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「人Pif1多肽」指具有人Pif1蛋白活性的SEQ IDNO2序列的多肽。該術語還包括具有與人Pif1蛋白相同功能的、SEQ IDNO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能(如不改變其DNA解旋酶活性區域，SEQ ID NO233-243)。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人Pif1蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人Pif1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Pif1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人Pif1多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人Pif1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Pif1多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供人Pif1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Pif1多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「人Pif1蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼Pif1蛋白的多聚核苷酸。而反義的核酸片段可作為Pif1的拮抗劑，用於抑制遺忘和促進記憶。
Pif1核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據已知的酵母Pif1、小鼠Pif1或本發明所公開人Pif1的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或Pif1蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的Pif1多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼人Pif1多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
具體而言，本發明的人Pif1蛋白可通過將相應的編碼序列引入宿主細胞(直接引入或通過引入含人Pif1編碼序列的載體)，並在合適的條件下培養轉化的宿主細胞以表達人Pif1蛋白，然後分離和純化出人Pif1蛋白。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
具體而言，本發明的人Pif1蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)抑制端粒DNA的加長，和用於篩選促進或抑制人Pif1蛋白功能的抗體、多肽或其它配體或化合物。用表達的重組人Pif1蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激人Pif1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人Pif1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人Pif1基因產物或片段。較佳地，指那些能與人Pif1基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制Pif1蛋白的分子，也包括那些並不影響Pif1蛋白功能的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人Pif1基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人Pif1蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的各類抗體可以利用人Pif1基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人Pif1基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗Pif1蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人Pif1蛋白。
多克隆抗體的生產可用Pif1蛋白或多肽免疫動物，如家兔，羊等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與人Pif1蛋白發生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。在篩選時，可以將人Pif1蛋白加入生物分析測定中，通過測定化合物影響Pif1蛋白和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。此外，還可將Pif1基因的cDNA裝入表達載體，轉染哺乳動物細胞株，製備高表達Pif1蛋白的細胞株並以此細胞株中的人Pif1蛋白為靶位點，篩選對人Pif1蛋白有激活或抑制作用的藥物。並向所述的表達人Pif1蛋白的細胞株培養液中加入測試化合物，檢測人Pif1蛋白表達量的變化。促進人Pif1蛋白表達的化合物就是抑制端粒DNA加長的化合物，而抑制人Pif1蛋白表達的化合物可用作促進端粒DNA加長的化合物。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、靜脈內、皮下、口服、或局部給藥。
正常的人Pif1多肽可直接用於疾病治療，例如，應用於治療腫瘤。在使用本發明Pif1基因或蛋白的激動劑時，可以抑制端粒DNA的加長，從而抑制腫瘤細胞的生長。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明人Pif1蛋白、其編碼核酸以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.01微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的Pif1蛋白或其激動劑施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.01微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.01微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
Pif1蛋白的多聚核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於Pif1蛋白的無表達或異常/無活性的Pif1蛋白的表達所致的細胞的無限生長。構建攜帶Pif1基因的重組病毒載體的方法可見於已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人Pif1基因可包裝到脂質體中，然後再轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發明還涉及定量和定位檢測Pif1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的Pif1蛋白水平，可以用作解釋Pif1蛋白在各種疾病中的重要性和用於診斷Pif1蛋白起作用的疾病。
一種檢測樣品中是否存在Pif1蛋白的方法是利用Pif1蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與人Pif1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在Pif1蛋白。
人Pif1蛋白的多聚核苷酸可用於Pif1蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，Pif1蛋白的多聚核苷酸可用於檢測Pif1蛋白的表達與否或在疾病狀態下Pif1蛋白的異常表達。如人Pif1 DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷人Pif1蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用人Pif1蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測人Pif1基因的轉錄產物。
檢測Pif1基因的突變也可用於診斷Pif1蛋白相關的疾病。人Pif1蛋白突變的形式包括與正常野生型人Pif1 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
發明人研究發現人的Pif1同源蛋白也有7個解旋酶的保守區域圖3。為了弄清人的Pif1蛋白是否類似酵母的可以抑制端粒酶介導的端粒延長活性，以及Pif1蛋白表達和癌症發生的關係，發明人將進一步篩選與人的Pif1蛋白相互作用的蛋白因子，希望這一系列的研究將有助於更深入地了解端粒複製的機制和端粒酶的調控機理，從而篩選到能抑制腫瘤生長的物質。
1999年10月22日，普林斯頓的Weinmann，Roberto所報導的美國第425335號專利中(Human homologue of yeast helicase and uses thereof，October22，1999)的人Pif1序列與發明人實驗室報導的不一致。他們的序列為708胺基酸殘基，而發明人的序列為641胺基酸殘基，且C段完全異源，其序列的等同性為88％，其中在233-243胺基酸區域他們的序列出現缺失，而這一段是hPif1蛋白作為DNA解旋酶最重要的活性區。發明人的實驗表明這段區域甚至單胺基酸突變都會使解旋酶失去活性。


圖1.Pif1蛋白的人同源蛋白基因的核苷酸序列圖2.Pif1蛋白的人同源蛋白的胺基酸序列(641aa)圖3.Pif1蛋白家族各成員之間的序列比對由圖可知，七個解旋酶結構域從酵母、果蠅、小鼠到人都是高度保守的。
圖4.人Pif1蛋白的四種多克隆抗體效價及特異性的鑑定圖5、人Pif1蛋白有ATP水解酶活性和DNA解旋酶活性A圖，N端缺失的hPif1與GST融合蛋白在半乳糖誘導GAl1啟動下在芽殖酵母中表達。酵母蛋白在7％的SDS-PAGE電泳，Coomassie染色。泳道1為分子量Marker，泳道2泳道3為半乳糖誘導前後的酵母粗抽提物，泳道4為半乳糖誘導後的酵母粗抽提物被50％硫酸銨沉澱部分，泳道5為Glutathione sepharose 4B親和純化的組分。
B圖，PEI層析板分析酶活反應並磷屏成像泳道5含有γ-ATP32(AmerPharcia.Co)，M13單鏈DNA，Mg2+和hPif1，其他泳道成分都一致除泳道1用yPif1(酵母Pif1)代替hPif1，泳道2用BSA替代hPif1，泳道3無Mg2+，泳道4無M13單鏈DNA。
C圖，對解旋酶活性試驗來說，36鹼基(36mer)的寡核苷酸序列用PNKinase(AEBioLab.Co)進行同位素末端標記，然後於單鏈M13 DNA復性褪火。泳道1樣品煮變性過，泳道7含有hPif1_N(140-641位胺基酸)，DNA底物，ATP，及Mg2+，其它泳道於7泳道相同除過泳道3是BSA而非hPif1_N，泳道2含有酵母Pif1而非hPif1-N；泳道4是hPif1(K234A)-N泳道5無ATP，泳道6無Mg2+圖6、Northern顯示hPIF1在各細胞株中的表達分布圖7、人內源性hPif1蛋白的檢測圖8、人hPif1蛋白在穩定轉染株的表達情況將穩定株分別表達hPif1(表達hPif1蛋白的穩定轉染株)，hPif1-Myc(表達帶Myc標籤hPif1蛋白的穩定轉染株)，hPif1(K234A)(表達點突變hPif1蛋白的穩定轉染株，第234位胺基酸由K(賴氨酸)突變為A(丙氨酸))，及其HT1080對照(沒有做轉染的原HT1080細胞株)，用識別hPif1蛋白N端的抗體進行免疫沉澱，識別hPif1蛋白C端的抗體進行Western鑑定，control為純化的hPif1蛋白。
圖9、人hPif1蛋白的亞細胞定位圖10、人hPif1蛋白過表達使細胞端粒變短泳道1為1kb的分子量Marker，泳道2為0代HT1080細胞，泳道3為40代HT1080細胞，V代表0代空載體細胞，V40為40代空載體細胞，MO代表點突變hPif1的O代細胞，M10點突變hPif1的10代細胞……。S0為表達hPif1的0代細胞，S40表達hPif1的40代細胞。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook、Russell等人，分子克隆實驗室手冊III(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例一人PIF1基因的克隆與鑑定發明人以前報導人PIF1蛋白質與酵母PIF1蛋白在438個胺基酸區域中有32％的同源性(Zhou，etc Science 2000)。從資料庫中並沒有搜索到人PIF1基因的全長克隆。但是發明人找到了果蠅的cDNA克隆基因。然後用果蠅的克隆基因在NCBI資料庫過行比對，發明人找到了兩個人的基因克隆AK026045和BC033254。這兩個序列與酵母PIF1進行比對，N端有9％的同源性，C端有43％的等同性。另外這兩個克隆片段都同時分布在人15號染色體上11Kb的範圍內，暗示它們是人PIF1基因的兩部分。因此，發明人設計兩組引物，從Hek293的cDNA文庫中進行PCR擴增，得到2.1Kb的片段。這兩個獨立克隆的測序結果顯示，它們都在同一個閱讀框架內。但有幾個核苷酸差異，這可能是PCR差錯。將克隆的序列進一步與基因組資料庫和EST資料庫比對，將這兩片段拼接成人PIF1cDNA全長(SEQ ID NO1)圖1。推出hPIF1編碼641個胺基酸的蛋白質(SEQ ID N02)圖2，其分子量為71KD，含有完整的解旋酶結構域。人PIF1蛋白的cNDA做成各種亞克隆載體，進行過表達。
實施例二製備針對人Pif1蛋白的四種多克隆抗體為檢測hPIF1在蛋白水平上的表達，發明人做了一些多克隆抗體。分別是N端的(76aa-230aa)Ag0，中間的(309aa-435aa)Ag1，近C端(438aa-549aa)Hp43，C端(550aa-641aa)Ag2。四種多克隆抗體經鑑定特異性強而且效價高。並將這些抗體進行了親和純化。
將四個肽段對應的的基因克隆到pGEX(AmerPharmarcial Co)原核表達載體中，轉染到B121菌株進行表達，利用GST凝膠珠進行親和純化，透析後免疫兔子取300μg純化的GST-hPif1(O、1、2、43)融合蛋白，溶解於0.5mL PBS中，加入等體積的弗氏完全佐劑(Sigma Co)，充分混勻，皮內多點注射於2.0kg雌性紐西蘭大白兔背部。兩星期後，再次以同樣蛋白量用弗氏完全佐劑充分混勻後，皮內多點注射於背部。第28天，以同樣蛋白量用弗氏不完全佐劑混勻後，背部皮內注射以加強免疫。在此一周後，頸動脈放血收集血液，37℃放置1小時，4℃放置過夜以使血清完全析出，離心收集血清，分裝，-70℃保存。抗體的特異性檢測方法如下將2μg GST-hPif1(0、1、2、43)質粒用8μ1 Lipofectamine 2000(GIBCOL BRL公司產品)混合後轉染在35mm的細胞培養皿中培養的293細胞。轉染方法見GIBCOL BRL公司提供的實驗操作規程(將pc-DNA3.1B(-)mycHis[Invitrogen.Co]載體中克隆hPIF1及hPIF1(K234A)，利用脂質體Lipofectamine2000[Invitrogen.Co]把基因轉染到hek293細胞48小時)。48小時後收集細胞，用300μl Triton X-100裂解液(10mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，10mM EDTA，10mM EGTA，1％Triton X-100，1mM PMSF，10mM DTT，5mg/ml aprotinin)裂解。取出50μl裂解物加入等量2×SDS上樣緩衝液，沸水煮沸10分鐘，細針頭剪切DNA，離心去沉澱。取10μl上樣於10％SDS聚丙烯醯胺(PAGE)凝膠，進行蛋白電泳。電泳結束後，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司產品)。用抗hPif1的各段對應的抗血清1∶5000稀釋進行免疫印跡，再用辣根過氧化物酶(HRP)交聯的二抗(Santa Cruz公司產品)進行雜交。最後用化學發光試劑檢測，壓X光片30秒。
結果見圖4，在轉染了hPif1的細胞中，檢測到專一性的蛋白條帶，而在轉染了空載體的細胞中，沒有檢測到蛋白帶，這說明得到了專一識別hPif1蛋白的多克隆抗體。
實施例三人PIF1蛋白編碼5』-3』的DNA解旋酶既然人PIF1蛋白與酵母的PIF1蛋白有明顯的序列同源性，並含有7個解旋酶結構域[圖3]，發明人想證明，它是一個DNA解旋酶。hPIF1基因的編碼序列同時克隆到細菌、酵母和杆狀病毒表達載體。在所有的三個表達載體中，發明人都檢測到重組PIF1蛋白質的過表達，但是，發明人僅在酵母表達系統中純化到hPIF1蛋白。將hPIF1的cDNA克隆酵母表達載體pEG(KT)，[此系統表達過重組的Rrm3p和Pfh1p(Zhou et，al 2003，Teng et，al2003)]，做成pEG(KT)-hPIF1，將此質粒轉化到酵母菌株BCY123，如圖所示，在半乳糖誘導下，hPif1-GST融合蛋白得到了表達。融合蛋白用GST凝膠珠親合純化到。圖5a因為解旋酶是以ATP為能量的，發明人用ATP酶活檢測重組蛋白hPif1-GST。如圖所示，重組的hPif1-GST蛋白具有ATP酶活性，並且這種活性是依賴鎂離子的圖5b。為進一步分析解旋酶活性，發明人用36mer和25mer的寡核苷酸序列分別在3『和5』與線狀單鏈M13 DNA匹配。如果重組蛋白有解旋酶活性，它就會在DNA上運動，並至少解下其中一條寡核苷酸鏈。既然PIF1是從5『向3』解旋，所以解離下36mer的寡核苷酸鏈。發明人的結論是，像酵母PIF1一樣，人的Pif1有5『到3』的解旋酶活性。圖5c實施例四 檢測人PIF1基因在端粒酶陽性細胞株和端粒酶陰性細胞中的表達從資料庫搜索，發明人發現hPIF1的mRNA僅僅在人的某些正常組織中表達(Deloukas et al.，1998，science)，但是，據報導的克隆只與發明人的克隆到的基因的N端或是C端匹配，並不清楚PIP1是哪種剪切形式？發明人用12種細胞株，它們分別來自於人的不同組織，例如Wr168，HT1080，HepG2，Hek293，ECV304，Changliver，Be17404，AGS，A431，MRC5，以及HLF1，在mRNA水平上分析PIF1基因的表達，Northern結果顯示，PIF1基因在Wr168，HT1080，HepG2，Hek293，ECV304，Changliver，Bel7404，AGS，A431裡有表達，而這些細胞都是端粒酶陽性的。但PIF1的表達在MRC5和HLF1並未檢測到，這兩個細胞都是端粒酶陰性細胞圖6。為進一步探知hPIF1基因的表達與端粒酶活性之間的關係，發明人檢測PIF1在不同組織的表達譜(clontech)。不幸的是，發明人並沒有檢測到人PIF1在這些組織中的表達。(所有細胞均來自中科院細胞庫，上海市嶽陽路320號)在端粒酶陽性的細胞株中有約2.5kb的轉錄本廣泛表達，12種細胞株Wr168，HT1080，HepG2，Hepl，Hek293，ECV304，Changliver，Bel7404，AGS，A431，MRC5，HLF1每種兩盤(10釐米培養皿)，用Trizol(Invitrogen Inc)抽提，各個細胞株的的總RNA約300ug過0lgotex柱，每條Lane加入mRNA10ug，在1％甲醛變性膠電泳，分別用hPIF1的5『端(225-691n’t)，中段(671-1305nt)，3』端(1335-1926nt)三部分探針分別進行Northern分析。都在端粒酶陽性的細胞株中看到有2.5kb的帶出現。在HLF1，MRC5中沒有觀察到條帶的出現。內參用B-ACTIN顯示mRNA的上樣量，對照為hPif1在Hek293瞬時表達的總RNA。
為檢測hPIF1在蛋白水平上的表達，發明人利用了做的多克隆抗體進行免疫印記實驗。將Wr168 MRC5細胞長滿10-釐米培養皿，用冷的1×PBS洗滌，加入0.5％NP40裂解緩衝液1毫升，裂解半小時離心，在上清中加入5ul識別hPif1的N端抗體，然後加入protein A beads孵育1小時，免疫沉澱物30ul中取10ul進行SDS-PAGE電泳，在利用識別hPif1的C端抗體進行Western鑑定，對照為71kd的純化的hPif1蛋白。
Western結果顯示在Northern檢測到這些組織裡，發明人並未檢測到蛋白水平的Pif1蛋白，表明hPif1的表達量是很低的。
發明人將親和純化抗體在Wr168，HT1080，HepG2，Hek293，ECV304，Changliver，Be17404，AGS，A431，MRC5，以及HLF1的抽提物中進行免疫沉澱，免疫沉澱物用Pif1抗體做Western鑑定。如圖所示，hPif1的表達在Wr168細胞裡可以檢測到，但是在其它細胞中均未檢測到。見圖7，這表明，人Pif1蛋白的表達量相當有限。
實施例五細胞中Pif1蛋白水平受泛素系統調控既然在大多數細胞中hPif1蛋白的表達量少到難以用Western檢測，通過檢測內源性的hPif1蛋白來闡明hPif1的細胞功能是非常困難的。發明人利用hPIF1轉染的穩定株來解決這個問題(在CMV強啟動異源過表達人Pif1蛋白)。將穩定株分別表達hPif1，hPif1-Myc，hPif1(K234A)，及其HT1080對照，用識別hPif1蛋白N端的抗體進行免疫沉澱，識別hPif1蛋白C端的抗體進行Western鑑定，對照為純化的hPif1蛋白。
Northern結果顯示，外源性hPif1的表達遠遠高於內源性的數十倍。但是，Western仍然檢測不到相對分子量的特異條帶，表明hPif1蛋白質的表達是轉錄後調控的。為了確定hPif1蛋白在穩定株中的過表達，發明人在穩定表達株中對hPif1蛋白進行了免疫沉澱，檢測到免疫沉澱的Pif1蛋白，未轉染細胞中沒有檢測到，證明外源性的hPif1是過表達的圖8。儘管表達量還是相當低，既然發明人以前的結果表明hPif1的低表達是由於轉錄後調控，一種可能性是hPif1蛋白受泛素調控。為驗證此假說，發明人用MG132處理細胞(泛素降解途徑中26S蛋白酶複合體的特異抑制劑)(SigmaCo)，發明人用親和純化的抗體檢測到hPif1片段的積累。
實施例六在體內和體外，hPif1蛋白與端粒DNA結合人Pif1蛋白除了解旋酶活性外，發明人在N端發現了潛在的核定位信號。為確定其亞定位，發明人將hPIF1的GFP融合基因載體轉染HT1080細胞，在hPIF1基因的N端或C端融合GFP，發現些融合蛋白定位在細胞核內圖9。
將hPif1蛋白的C端或N端用GFP標記的質粒，用Lipofectin2000(Invitrigen Inc)介導轉染HT1080細胞，轉染48小時後，用4％多聚甲醛固定後，細胞經tritonX100通透後，DAPI染色，用DAPCO封片後，在螢光顯微鏡觀察。第一列，DAPI染核的位置；第二列，GFP-hPif1融合蛋白的位置；第三列，DAPI染核和融合蛋白的重疊圖像；第四列，光鏡下細胞的形狀。
如果hPIF1基因影響端粒的複製，那麼它就有可能與端粒DNA直接相互作用。發明人利用凝膠阻滯實驗檢測hPif1蛋白與端粒DNA的結合情況。
為檢測hPif1蛋白在體內與端粒DNA的結合，發明人用染色質免疫沉澱實驗(CHIP assay)，用特異抗體與沉澱染色質/蛋白複合體，用端粒DNA探針檢測端粒DNA的存在情況(Hsu et al，1999)。
實施例七人Pif1蛋白質的過表達引起端粒縮短，並且此縮短是通過端粒酶途徑的酵母Pif1的過表達引起酵母端粒的縮短，這樣發明人想知道人Pif1是否會影響人的端粒。將HT1080穩定轉染株分別表達hPif1、hPif1(K234A)、空載體對照及其HT1080對照，分別傳代至40代。抽提DNA被內切酶AfaI和HinfI消化，每條泳道上樣4ug電泳，進行Southern blot。建立穩定表達株後就馬上進行端粒長度的檢測，比較不同世代端粒的長短，並與未轉染的細胞株，轉染空載體的，及轉染點突變hPif1(將ATP結合區的關鍵胺基酸Lys突變成Ala)的穩定株進行比較。端粒長短的變化與hPif1的過表達相關，但是與點突變的hPif1不相關，表明，hPIF1基因抑制端粒的加長，並且這種抑制是依賴於解旋酶活性的。發明人追蹤了端粒長度有變化的幾個克隆端粒的變化情況，結果端粒長度在80代內沒有進一步縮短，儘管人Pif1蛋白一直在穩定表達圖10。
因為發明人沒有看到傳代細胞端粒的持續縮短，發明人的解釋是，一定量的Pif1蛋白只能在一定程度上抑制端粒酶的活性。因此發明人採用tet-off系統進行外源PIF1的過表達。在培液中增加doxycycline(Chemicon Co)，如圖所示。12小時去除dox，Pif1誘導表達，24小時達到峰值。如果Pif1的表達是受控的話，重新加入dox，hPIF1基因就會被關閉。人為控制hPIF1表達的上調與下調，分析細胞端粒的長短。Pif1誘導表達端粒逐漸變短，去除hPif1端粒變長。有趣的是，hPif1表達24小時，端粒長短並沒有明顯變化，表明hPif1影響端粒的加長是受細胞周期調控的。
在多數真核生物中，端粒的維持是受端粒酶調控或不依賴於端粒酶的重組機制。發明人想知道hPIF1影響端粒是否通過端粒酶。發明人在端粒酶陰性細胞中轉染hPIF1基因並篩選到穩定株，穩定株端粒長短。既然端粒長度沒有變化，發明人得出的結論是Pif1抑制端粒是依賴於端粒酶的。共轉TERT和hPIF1，可以抑制端粒酶陰性細胞的端粒加長。這些實驗都證明，hPif1抑制端粒酶活性是依賴於Pif1蛋白質的解旋酶活性的。因為突變的hPif1對端粒長短沒有作用。
討論Pif1影響端粒酶活性端粒長度的維持通常可以反映出端粒酶活性。因為酵母Pif1蛋白抑制端粒加長是通過端粒酶途徑的，有可能酵母的Pif1蛋白通過學習解開RNA/DNA雙鏈結構，從而直接抑制了端粒酶活性，因此，進一步探知人Pif1在體外對端粒酶的抑制作用是相當重要的。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海生命科學研究院120一種人Pif1基因、其編碼蛋白及其應用1300404011602170PatentIn version 3.121012112052212DNA213Pif1220
221CDS222(1)..(1923)223
4001atg ctc tcg ggc ata gag gcg gcg gca ggg gaa tat gag gac tcg gag48Met Leu Ser Gly Ile Glu Ala Ala Ala Gly Glu Tyr Glu Asp Ser Glu1 510 15ctg cgg tgc cgc gtg gct gtg gag gag ctg agc ccg ggc ggg cag ccg96Leu Arg Cys Arg Val Ala Val Glu Glu Leu Ser Pro Gly Gly Gln Pro20 25 30cga agg cgc cag gcc ctg cgc acc gcg gag ctg agc ctg ggt cgc aac144Arg Arg Arg Gln Ala Leu Arg Thr Ala Glu Leu Ser Leu Gly Arg Asn35 40 45gag cgc cgc gag ttg atg ctg cgg ctg caa gcg cca ggg ccc gcg ggg192Glu Arg Arg Glu Leu Met Leu Arg Leu Gln Ala Pro Gly Pro Ala Gly50 55 60
egg ccg cgc tgc ttc cct etg cgc gcc gcg cgc ctc ttc acg cgt ttc 240Arg Pro Arg Cys Phe Pro Leu Arg Ala Ala Arg Leu Phe Thr Arg Phe65 70 75 80gcc gag gcc ggg cgc agc acc ctg cgg ctc ccc gcc cac gac acc ccc 288Ala Glu Ala Gly Arg Ser Thr Leu Arg Leu Pro Ala His Asp Thr Pro85 90 95ggg gcc ggc gca gtg cag ctg ctg ctc tcg gac tgc ccc cca gac cgc 336Gly Ala Gly Ala Val Gln Leu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asp Arg100 105 110ctg cgc cgc ttc ctg cgc aca ttg cgc ctc aag ctg gct gcg gcc ccg 384Leu Arg Arg Phe Leu Arg Thr Leu Arg Leu Lys Leu Ala Ala Ala Pro115 120 125ggt ccc ggg ccg gcc tcc gcc cga gcg cag ctg ctg ggc ccg cgg ccc 432Gly Pro Gly Pro Ala Ser Ala Arg Ala Gln Leu Leu Gly Pro Arg Pro130 135 140cgc gat ttc gtc acc atc agc cct gtg cag ccc gag gag cgg cgg ctc 480Arg Asp Phe Val Thr Ile Ser Pro Val Gln Pro Glu Glu Arg Arg Leu145 150 155 160agg gcg gcc acc cgg gtt ccg gac act acg ctg gtg aag cgg cct gtg 528Arg Ala Ala Thr Arg Val Pro Asp Thr Thr Leu Val Lys Arg Pro Val165 170 175gag ccc cag gct ggg gcc gag cct agc aca gaa gcc cca agg tgg ccc 576Glu Pro Gln Ala Gly Ala Glu Pro Ser Thr Glu Ala Pro Arg Trp Pro180 185 190ctg cct gtg aag agg ctg agc ttg ccc tcc acc aag cca cag ctt tct 624Leu Pro Val Lys Arg Leu Ser Leu Pro Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ser195 200 205gag gaa cag gct gct gtg ctg agg gcc gtc ctg aaa ggc cag agc atc 672
Glu Glu Gln Ala Ala Val Leu Arg Ala Val Leu Lys Gly Gln Ser Ile210 215 220ttc ttc act ggg agt gca gga aca ggg aag tca tat ctg cta aag cga 720Phe Phe Thr Gly Ser Ala Gly Thr Gly Lys Ser Tyr Leu Leu Lys Arg225 230 235 240atc ctg ggc tca ctg ccc ccc aca ggc act gtg gcc act gcc agc act 768Ile Leu Gly Ser Leu Pro Pro Thr Gly Thr Val Ala Thr Ala Ser Thr245 250 255ggg gtg gca gcc tgc cac atc ggg ggc acc acc ctc cat gcc ttt gca 816Gly Val Ala Ala Cys His Ile Gly Gly Thr Thr Leu His Ala Phe Ala260 265 270ggc atc ggc tca ggc cag gct cct cta gcc cag tgt gtg gcc ctg gcc 864Gly Ile Gly Ser Gly Gln Ala Pro Leu Ala Gln Cys Val Ala Leu Ala275 280 285caa agg cca ggc gtg cgg cag ggc tgg ctg aac tgc cag cgg ttg gtc 912Gln Arg Pro Gly Val Arg Gln Gly Trp Leu Asn Cys Gln Arg Leu Val290 295 300att gac gag atc tca atg gtg gag gca gac ctg ttt gac aaa ctg gag 960Ile Asp Glu Ile Ser Met Val Glu Ala Asp Leu Phe Asp Lys Leu Glu305 310 315 320gcc gtg gcc aga gct gtc cgg cag cag aac aag cca ttc gga ggg atc 1008Ala Val Ala Arg Ala Val Arg Gln Gln Asn Lys Pro Phe Gly Gly Ile325 330 335cag ctc atc atc tgt ggg gac ttt ctg cag ctg cca cct gtg acc aag 1056Gln Leu Ile Ile Cys Gly Asp Phe Leu Gln Leu Pro Pro Val Thr Lys340 345 350ggc tcc cag ccc cca cgg ttc tgc ttc cag tcc aag agc tgg aag agg 1104Gly Ser Gln Pro Pro Arg Phe Cys Phe Gln Ser Lys Ser Trp Lys Arg355 360 365
tgt gtg cca gtg acc ctg gag ctg acc aag gtg tgg agg cag gca gac 1152Cys Val Pro Val Thr Leu Glu Leu Thr Lys Val Trp Arg Gln Ala Asp370 375 380cag acc ttc atc tct cta ctg cag gcc gtg agg cta ggc agg tgt tca 1200Gln Thr Phe Ile Ser Leu Leu Gln Ala Val Arg Leu Gly Arg Cys Ser385 390 395 400gat gag gtg acc cgc cag ctc cag gcc aca gct tcc cac aag gtg ggg 1248Asp Glu Val Thr Arg Gln Leu Gln Ala Thr Ala Ser His Lys Val Gly405 410 415cga gat ggg att gtg gcc acg agg ctc tgc acc cac cag gat gat gtg 1296Arg Asp Gly Ile Val Ala Thr Arg Leu Cys Thr His Gln Asp Asp Val420 425 430gcc ctc acc aac gag agg cgg ctt cag gag ctg cca ggt aag gta cac 1344Ala Leu Thr Asn Glu Arg Arg Leu Gln Glu Leu Pro Gly Lys Val His435 440 445aga ttt gag gct atg gac agc aac cct gag ctg gcc agt acc ctg gat 1392Arg Phe Glu Ala Met Asp Ser Asn Pro Glu Leu Ala Ser Thr Leu Asp450 455 460gcc cag tgt cct gtt agc cag ctc ctt caa cta aag ctg ggg gcc cag 1440Ala Gln Cys Pro Val Ser Gln Leu Leu Gln Leu Lys Leu Gly Ala Gln465 470 475 480gtg atg ctg gtg aaa aac tta tcg gtg tct cgg ggc ctg gtg aat ggt 1488Val Met Leu Val Lys Asn Leu Ser Val Ser Arg Gly Leu Val Asn Gly485 490 495gcc cga ggg gtg gta gtt ggg ttc gag gca gaa ggg aga ggg cta ccc 1536Ala Arg Gly Val Val Val Gly Phe Glu Ala Glu Gly Arg Gly Leu Pro500 505 510cag gtg cgg ttc ctg tgt gga gtc act gag gtc atc cac gct gac cgc 1584
Gln Val Arg Phe Leu Cys Gly Val Thr Glu Val Ile His Ala Asp Arg515 520 525tgg acg gtg cag gcc acc ggg ggc cag ctc ctc agt cgg cag cag ctg 1632Trp Thr Val Gln Ala Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Arg Gln Gln Leu530 535 540ccc ctc cag ctg gcc tgg gcg atg tcc atc cac aag agc cag ggc atg 1680Pro Leu Gln Leu Ala Trp Ala Met Ser Ile His Lys Ser Gln Gly Met545 550 555 560acc ctg gat tgt gtg gag att tct ctg ggc cgt gtg ttt gcc agt ggc 1728Thr Leu Asp Cys Val Glu Ile Ser Leu Gly Arg Val Phe Ala Ser Gly565 570 575cag gcc tat gtg gcc ctt tct cgg gcc cgc agc ctg cag ggc cta cgt 1776Gln Ala Tyr Val Ala Leu Ser Arg Ala Arg Ser Leu Gln Gly Leu Arg580 585 590gtg ctg gac ttt gac ccc atg gcg gtt cgc tgt gac ccc cgt gtg ctg 1824Val Leu Asp Phe Asp Pro Met Ala Val Arg Cys Asp Pro Arg Val Leu595 600 605cac ttc tat gcc acc ctg cgg cgg ggc agg agc ctc agt ctg gag tcc 1872His Phe Tyr Ala Thr Leu Arg Arg Gly Arg Ser Leu Ser Leu Glu Ser610 615 620cca gat gat gat gag gca gcc tca gac cag gag aac atg gac cca atc 1920Pro Asp Asp Asp Glu Ala Ala Ser Asp Gln Glu Asn Met Asp Pro Ile625 630 635 640ctc tgagcctcac ccacaaagag aagacaaagg gtggcctgtg gcctccccgt 1973Leucctcctgctc cctagtggcc cagggcccca gggaataact ggagtaggca ggcagtgtcc2033ccttctgtat tttttaggg 2052
2102211641212PRT213Pif14002Met Leu Ser Gly Ile Glu Ala Ala Ala Gly Glu Tyr Glu Asp Ser Glu1 5 10 15Leu Arg Cys Arg Val Ala Val Glu Glu Leu Ser Pro Gly Gly Gln Pro20 25 30Arg Arg Arg Gln Ala Leu Arg Thr Ala Glu Leu Ser Leu Gly Arg Asn35 40 45Glu Arg Arg Glu Leu Met Leu Arg Leu Gln Ala Pro Gly Pro Ala Gly50 55 G0Arg Pro Arg Cys Phe Pro Leu Arg Ala Ala Arg Leu Phe Thr Arg Phe65 70 75 80Ala Glu Ala Gly Arg Ser Thr Leu Arg Leu Pro Ala His Asp Thr Pro85 90 95Gly Ala Gly Ala Val Gln Leu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asp Arg100 105 110Leu Arg Arg Phe Leu Arg Thr Leu Arg Leu Lys Leu Ala Ala Ala Pro
115 120 125Gly Pro Gly Pro Ala Ser Ala Arg Ala Gln Leu Leu Gly Pro Arg Pro130 135 140Arg Asp Phe Val Thr Ile Ser Pro Val Gln Pro Glu Glu Arg Arg Leu145 150 155 160Arg Ala Ala Thr Arg Val Pro Asp Thr Thr Leu Val Lys Arg Pro Val165 170 175Glu Pro Gln Ala Gly Ala Glu Pro Ser Thr Glu Ala Pro Arg Trp Pro180 185 190Leu Pro Val Lys Arg Leu Ser Leu Pro Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ser195 200 205Glu Glu Gln Ala Ala Val Leu Arg Ala Val Leu Lys Gly Gln Ser Ile210 215 220Phe Phe Thr Gly Ser Ala Gly Thr Gly Lys Ser Tyr Leu Leu Lys Arg225 230 235 240Ile Leu Gly Ser Leu Pro Pro Thr Gly Thr Val Ala Thr Ala Ser Thr245 250 255Gly Val Ala Ala Cys His Ile Gly Gly Thr Thr Leu His Ala Phe Ala260 265 270
Gly Ile Gly Ser Gly Gln Ala Pro Leu Ala Gln Cys Val Ala Leu Ala275 280 285Gln Arg Pro Gly Val Arg Gln Gly Trp Leu Asn Cys Gln Arg Leu Val290 295 300Ile Asp Glu Ile Ser Met Val Glu Ala Asp Leu Phe Asp Lys Leu Glu305 310 315 320Ala Val Ala Arg Ala Val Arg Gln Gln Asn Lys Pro Phe Gly Gly Ile325 330 335Gln Leu Ile Ile Cys Gly Asp Phe Leu Gln Leu Pro Pro Val Thr hys340 345 350Gly Ser Gln Pro Pro Arg Phe Cys Phe Gln Ser Lys Ser Trp Lys Arg355 360 365Cys Val Pro Val Thr Leu Glu Leu Thr Lys Val Trp Arg Gln Ala Asp370 375 380Gln Thr Phe Ile Ser Leu Leu Gln Ala Val Arg Leu Gly Arg Cys Ser385 390 395 400Asp Glu Val Thr Arg Gln Leu Gln Ala Thr Ala Ser His Lys Val Gly405 410 415Arg Asp Gly Ile Val Ala Thr Arg Leu Cys Thr His Gln Asp Asp Val
420 425 430Ala Leu Thr Asn Glu Arg Arg Leu Gln Glu Leu Pro Gly Lys Val His435 440 445Arg Phe Glu Ala Met Asp Ser Asn Pro Glu Leu Ala Ser Thr Leu Asp450 455 460Ala Gln Cys Pro Val Ser Gln Leu Leu Gln Leu Lys Leu Gly Ala Gln465 470 475 480Val Met Leu Val Lys Asn Leu Ser Val Ser Arg Gly Leu Val Asn Gly485 490 495Ala Arg Gly Val Val Val Gly Phe Glu Ala Glu Gly Arg Gly Leu Pro500 505 510Gln Val Arg Phe Leu Cys Gly Val Thr Glu Val Ile His Ala Asp Arg515 520 525Trp Thr Val Gln Ala Thr Gly Gly Gln Leu Leu Ser Arg Gln Gln Leu530 535 540Pro Leu Gln Leu Ala Trp Ala Met Ser Ile His Lys Ser Gln Gly Met545 550 555 560Thr Leu Asp Cys Val Glu Ile Ser Leu Gly Arg Val Phe Ala Ser Gly565 570 575
Gln Ala Tyr Val Ala Leu Ser Arg Ala Arg Ser Leu Gln Gly Leu Arg580 585 590Val Leu Asp Phe Asp Pro Met Ala Val Arg Cys Asp Pro Arg Val Leu595 600 605His Phe Tyr Ala Thr Leu Arg Arg Gly Arg Ser Leu Ser Leu Glu Ser610 615 620Pro Asp Asp Asp Glu Ala Ala Ser Asp Gln Glu Asn Met Asp Pro Ile625 630 635 640Leu
權利要求
1.一種分離的人Pif1蛋白，其特徵在於，它包含具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有DNA解旋酶活性的由(a)衍生的多肽。
3.一種人Pif1多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。
4.權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1923位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2052位的序列。
5.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求5所述的載體。
7.一種具有人Pif1蛋白活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達人Pif1蛋白的條件下，培養權利要求6所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人Pif1蛋白活性的多肽。
8.一種能與權利要求1所述的人Pif1蛋白特異性結合的抗體。
9.一種組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的Pif1蛋白、或權利要求3所述的多核苷酸，以及藥學上可接受的載體。
10.一種篩選促進或抑制端粒DNA加長的化合物的方法，其特徵在於，它包括步驟(1)將人Pif1基因的cDNA裝入表達載體，轉染哺乳動物細胞株，製備表達Pif1蛋白的細胞株(2)向步驟(1)中的表達Pif1蛋白的細胞株培養液中加入測試化合物，檢測Pif1蛋白表達量的變化；抑制Pif1蛋白表達量增加的化合物就是促進端粒DNA加長的化合物，促進Pif1蛋白表達量增加的化合物就是抑制端粒DNA加長的化合物。
11.一種檢測個體Pif1表達水平的試劑盒，其特徵在於，它包括特異性擴增人Pif1基因或轉錄本的引物，或者與人Pif1蛋白特異性結合的抗體。
全文摘要
本發明涉及一種人Pifl基因、其編碼蛋白，及其檢測個體Pifl表達水平等方面的用途。此外，本發明還涉及人Pifl蛋白的抗體、激動劑、檢測試劑盒，以及含有上述物質的組合物。
文檔編號G01N33/68GK1680438SQ20041004738
公開日2005年10月12日 申請日期2004年4月6日 優先權日2004年4月6日
發明者周金秋, 張登宏, 黃妤, 徐露霞 申請人:中國科學院上海生命科學研究院