細胞毒免疫球蛋白的製作方法
2023-09-22 00:21:45
本發明涉及細胞毒免疫球蛋白(cytotoxicimmunoglobulin)。單克隆抗體已廣泛用作治療性結合劑。基本的抗體結構在本文中以完整的IgG1免疫球蛋白為例來說明。兩條相同的重鏈(H)和兩條相同的輕鏈(L)組合，形成Y形抗體分子。每條重鏈有4個結構域。氨基末端可變區(VH)位於Y形的頂端。它們之後是三個恆定區：CH1,CH2,以及位於Y形的莖部底座的羧基端CH3。一條短鏈，即連接鏈(switch)，將重鏈可變區與恆定區相連。鉸鏈將CH2和CH3(Fc片段)與抗體的其餘部分(Fab片段)相連。對完整抗體分子的鉸鏈區進行蛋白裂解，可以產生一個Fc和兩個相同的Fab片段。輕鏈由可變區(VL)和恆定區(CL)這兩個區組成，它們被一個連接鏈分隔。鉸鏈區中的二硫鍵將兩條重鏈連接起來。輕鏈與重鏈通過另外的二硫鍵相連。根據免疫球蛋白類型的不同，在恆定區中不同位置附著有Asn-連接的糖模塊(Carbohydratemoieties)。對於IgG1，鉸鏈區中位於Cys235和Cys238之間的二硫鍵將兩條重鏈串起來。輕鏈與重鏈通過CH1區的Cys229與CL區的Cys214之間的兩個額外二硫鍵相連。糖模塊與每個CH2中的Asn306相連，在Y形的莖區產生明顯的凸出。這些特徵具有深遠的功能性後果。重鏈和輕鏈兩者的可變區(VH和VL)位於Y形"尖端"，它們在那裡處於與抗原反應的位置。該分子的這種尖端是胺基酸序列N端所在。Y形的主幹區以有效介導效應子功能的方式凸出，所述效應子功能諸如激活補體以及與Fc受體相互作用，或ADCC和ADCP。其CH2和CH3區凸出有利於與效應蛋白的相互作用。該胺基酸序列的C端位於與尖端相反的一側，即Y形的"底部"。抗體中發現兩個型的輕鏈：lambda(λ)型和kappa(κ)型。一種具體的免疫球蛋白要麼具有κ鏈，要麼具有λ鏈，不會同時具有兩種鏈。具有λ輕鏈的抗體與具有κ輕鏈的抗體之間未發現功能差異。抗體分子的每個結構域具有相似的結構：兩個beta片層彼此緊密靠近而反向平行堆積成beta柱體(barrel)。這一保守結構稱為免疫球蛋白摺疊。恆定區的免疫球蛋白摺疊包含一個由3-鏈片層堆積在一個4-鏈片層上。該摺疊的穩定是通過每個片層的beta鏈之間的氫鍵、通過內部的反向片層殘基之間的疏水相互作用、以及通過這些片層之間的二硫鍵來實現。所述3-鏈片層包含C,F,和G鏈，所述4-鏈片層具有A,B,E,和D鏈。字母A-G表示這些beta鏈沿免疫球蛋白摺疊的胺基酸序列的依次位置。可變區的摺疊結構具有9條β摺疊鏈，排列成4條鏈和5條鏈的兩組片層。5鏈片層在結構上與恆定區的3鏈片層類似，但包含額外的C'和C」鏈。其餘鏈(A、B、C、D、E、F、G)與它們在恆定區免疫球蛋白摺疊結構中的對應物具有相同的拓撲學和相似的結構。一個二硫鍵連接對立片層中的B和F鏈，與恆定區中的一樣。免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區都包含三個高變環或互補決定區(CDR)。V區的三個CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在β桶的一端簇集。這些CDR是連接免疫球蛋白摺疊結構的β鏈B-C、C'-C」和F-G的環。這些CDR中的殘基在不同免疫球蛋白分子中有不同，賦予抗體各自的抗原特異性。抗體分子尖端的VL和VH結構域壓緊，使得6個CDR(每個結構域3個)協作而構建供抗原特異性結合的表面(或空腔)。如此，抗體的天然抗原結合位點由連接輕鏈可變區的B-C、C'-C」和F-G鏈及重鏈可變區的B-C、C'-C」和F-G鏈的環構成。抗體分子尖端的VL和VH區緊密推擠，使得6個CDR(每區3個)協作而構建出供抗原特異性結合的表面(或空腔)。如此一來，抗體的天然抗原結合位點由連接輕鏈可變區的B-C、C'-C」和F-G鏈及重鏈可變區的B-C、C'-C」和F-G鏈的多個環構成。有些環並非天然免疫球蛋白中的CDR環、或者也不是由CDR環和可能還有CDR環區內鄰接環決定的抗原結合口袋的一部分，這樣的環不具有抗原結合或表位結合特異性，但有助於完整免疫球蛋白分子和/或其效應物或其它功能的正確摺疊，因此為了本發明的目的被稱為結構環。現有技術文獻顯示，到目前為止免疫球蛋白樣支架被用於操控已有的抗原結合位點，從而導入新的結合特性。在大多數情況下CDR區已經被改造用於抗原結合，換言之，就免疫球蛋白摺疊來說，只有天然抗原結合位點被改造以便改變其結合親和力或特異性。已有非常多的文獻記載了不同形式的此類被操作過的免疫球蛋白，它們常常以單鏈Fv片段(scFv)或Fab片段的形式表達，或是展示在噬菌體顆粒的表面，或是在各種原核或真核表達系統中可溶性表達。WO06/072620A1描述了一種改造免疫球蛋白的方法，其包括在結構環區的改造以獲得新的抗原結合位點。該方法廣泛適用於免疫球蛋白，可用於產生一系列靶向於不同抗原的免疫球蛋白。CH3文庫已經被證明可用於選擇抗原的特異性結合劑。WO08/003103A2描述了在代表CD20抗原的模擬表位(mimotope)的合成肽上淘選CH3,CH1或CL文庫。多種免疫球蛋白文庫已在本領域被提議用於獲得特異性免疫球蛋白結合劑。現有技術總體上涉及結合結構域的單體單價展示。WO9209690A2描述了噬菌粒顆粒在其顆粒表面展示單拷貝的融合蛋白。從而描述了從噬菌粒顆粒(亦稱為噬菌體)的文庫獲得高親和力的結合劑。這提供了含編碼結合多肽和噬菌體外殼蛋白的基因的可複製型表達載體，以形成編碼融合蛋白的基因融合體，其是噬菌粒顆粒、噬菌體外殼蛋白和結合多肽的嵌合蛋白。US5223409泛泛描述了將編碼目的蛋白的基因與絲狀噬菌體M13基因III外殼蛋白的N端結構域融合的方法。所述基因融合體經突變，形成結構相關、且在噬菌粒顆粒表面少量表達的融合蛋白的文庫。生物學選擇和篩選方法被用來鑑定可用作藥物候選物的新配體。但是，在使用這類「融合噬菌體」或單價噬菌體展示和使用相應單個融合蛋白方面存在一些限制。多個生物製品天然以低聚形式存在。對於本發明的目的來說，低聚表示二聚、三聚或甚至更高的多聚形式，直至24個單體。現有技術的融合噬菌體被描述為展示單體融合蛋白，主要是因為，據信如果通過噬菌粒顆粒展示多個單體融合蛋白，最高親和力的結合劑只能選自一種文庫。但是天然蛋白經常組裝為二聚體或甚至以更高的寡聚程度組裝。為了獲得具有單個融合蛋白的二聚展示，已經開發出一些技術，它們涉及位於外殼蛋白和結合多肽之間的條件終止密碼子(Dall'Acquaetal.TheJournalofImmunology,2002,169:5171-5180)。從而除了與噬菌體融合的多肽之外的那些多肽的可溶性單體被表達，由此啟動二聚體的形成。但是，這類終止密碼子需要在能將終止密碼子翻譯為胺基酸的特異性抑制者宿主細胞中增殖，以便提供合適量的除可溶性結合多肽之外的融合蛋白。在一些情況下，現有技術的融合蛋白包括接頭序列，以便展示更大的結合多肽。最多有24個胺基酸的接頭序列常規用於展示抗體的可變區。參見例如，展示載體pCOMB3x(Hybrid.Hybridomics.2003Apr；22(2):97-108.Developmentoffunctionalhumanmonoclonalsingle-chainvariablefragmentantibodyagainstHIV-1fromhumancervicalBcells.BerryJD,RutherfordJ,SilvermanGJ,KaulR,EliaM,GobutyS,FullerR,PlummerFA,BarbasCF.)。基於全長IgG1的免疫球蛋白已廣泛用於治療實體腫瘤患者，尤其過表達erbB類受體的那些。所述的受體例如EGFR(Her1),Her2,Her2neu,Her3和Her4。Herceptin(曲妥珠單抗(trastuzumab),humAb4D5)是基於單克隆抗體、用於治療乳腺癌的產品。Herceptin抗體特異於her2neu(也稱c-erbB-2或MAC117)的HER2胞外區的4D5表位。"HER2胞外區"或"HER2ECD"是指位於細胞外側的HER2區，包括其片段，它們或者錨著在細胞膜上，或者在血液循環中。HER2胞外區可包含4個區："I區"(胺基酸殘基約1-195)，"II區"(胺基酸殘基約196-319)，"III區"(胺基酸殘基約320-488)，和"IV區"(胺基酸殘基約489-630)(不含信號肽時的殘基編號)。"4D5表位"是HER2胞外區中被4D5抗體(ATCCCRL10463)和曲妥珠單抗結合的區。該表位靠近HER2跨膜區，位於HER2的第IV區內。HER2的4D5表位在大約殘基529-625區域(包括HER2ECD)跨越(encompasses)任意一或多個殘基，是含有信號肽時的編號。EGFR是大分子(1,186個殘基)單體糖蛋白，有單個跨膜區，胞漿酪氨酸激酶區，側翼為非催化調節區。序列分析顯示，外功能區(ectodomain,殘基1-621)包含4個亞區，在此稱L1,CR1,L2和CR2，其中L和CR分別是大和Cys富集。TheL1和L2區也分別稱I區和III區。CR區以前稱II區和IV區，或稱S1.1-S1.3和S2.1-S2.3，其中的S是「小(small)」的縮寫。已開發出抗EGFR胞外區的單克隆抗體(Mab)，其破壞配體與受體的結合及隨後的信號傳導。三種EGFR-特異性阻斷抗體已在體外試驗中被非常詳細地表徵，目前已用於臨床研究；它們是mAbC225(ERBITUX/西妥昔單抗(cetuximab)),mAb425(EMD72000)和人mAbABX-EGF。C225(西妥昔單抗/Erbitux)已被FDA批准用於轉移性結直腸癌，mAb425(EMD59000)的人源化形式是(EMD72000)，其目前已進入II期臨床試驗，用於多種表達EGFr的實體腫瘤。C225結合EGFr胞外區的明顯(distinct)表位。已有證據表明，這兩種抗體都與野生型受體獨立地結合，也都與在腫瘤細胞中優勢表達的突變受體(EGFrVIII)獨立地結合。西妥昔單抗僅與EGFR胞外區的III區(sEGFR)發生相互作用，其與該結構域的配體結合區域部分地咬合，在空間上阻礙該受體二聚化。自發突變的EGF受體首先在神經母細胞瘤中發現。現稱為EGFRvIII的這種分子代表了EGF受體胞外區外顯子2-7的缺失。這去掉了273個胺基酸，在融合連接處產生新的甘氨酸。EGFRvIII(也稱de2-7EGFR或deltaEGFR)在胞外區有框內缺失(in-framedeletion)，在非常多種類型的人類腫瘤中都已發現。WO9720858A1涉及誘導Her2表達細胞凋亡的抗Her2抗體。因此，與Her2結合的單克隆抗體(mAb)通過用純化的可溶性Her2免疫小鼠來產生。WO06087637A2涉及識別Her2/neu並對Her2/neu表達細胞發揮抗增生效應的抗體。該文獻描述了能特異性結合Her2neu、但無細胞毒活性的分離的抗體或片段，變體或其衍生物，尤其人Fab片段，以及scFv片段。一些現有技術文獻涉及能在缺乏諸如ADCC等細胞毒活性的情況下抑制腫瘤生長的抗體形式。Rovers等(CancerImmunol.Immunother.(2007)56:303-317)描述了具有抑制腫瘤細胞生長的潛能的抗EGFR納米抗體(nanobodies)。WO03/075840A2描述了以相當於或高於人VEGF的親和力結合KDR、並中和KDR的激活作用的抗體，其中的單價Fabs能中和KDR的激活作用，並因此抑制血管新生和腫瘤生長。還有其它一些免疫球蛋白片段被提議用於人類的治療。專利申請WO06036834A2描述了作為內部序列摻入到Fc結構域環區之中的生物活性肽；其說明書描述了一種分子，其通過插入或替換先前存在於Fc結構域中的胺基酸，而添加了所述內部肽序列。一個肽實例靶向p185HER2/neu。靶向Her2/neu的肽參見ParketalNat.Biotechnol.(2000)18(2):194-8。雖然肽結合親和力常常很低，在kD值高於10-6M的範圍，但該文獻所述的環外抗HER2/neu肽模擬物發揮出不一般的高親和力(KD＝300nM)。WO01/01748A2描述了以低水平結合親和力與人erbB2基因產物結合的肽混合物。一例抗erbB2的肽-Fc融合蛋白在競爭結合試驗中被測試，以少量相同類型的肽作為競爭劑，結果IC50值較低，但並不指示飽和試驗中測出的Kd或EC50值。本發明的目的是提供改進的與細胞表面結合的免疫球蛋白產物。所述目的通過本文所述的主題來解決。發明簡述本發明提供分子量最高達60kD的細胞毒模塊抗體(cytotoxicmodularantibody)，其以Kd<10-8M的結合親和力(優選在納摩爾範圍或更低水平)結合細胞表面的靶。本發明的高親和力模塊抗體因此體積縮小，具有易於穿過細胞層或腫瘤、在目標被過表達的部位有效裂解細胞或使細胞死亡的優勢。備選地，本發明的模塊抗體優選IC50<10-8M，可在飽和結合試驗中測出。本發明的模塊抗體優選發揮ADCC,ADCP,CDC或凋亡活性中的至少一種活性。本發明模塊抗體的細胞毒活性優選通過其效應子功能確定，即通過測定ADCC,ADCP,CDC或凋亡活性中的至少一種活性來確定。優選的本發明模塊抗體是模塊抗體結構域的寡聚體，尤其免疫球蛋白結構域的寡聚體，或全長免疫球蛋白的片段。優選的抗體是選自VH/VL,CH1/CL,CH2/CH2,CH3/CH3,Fc加Fab的二聚體，或它們的單鏈。本發明的模塊抗體優選包含具有隨機化抗體序列的結合位點和/或位於結構環區的至少一個結合位點，其總是要理解為潛在地包括可以對抗原結合作貢獻的末端結構域序列。隨機化抗體序列的位點可以位於CDR區或結構環區之中。因此，與靶結合、或與功能性配體如效應分子(優選支架配體)結合是可能的，即使免疫球蛋白不含CDR區，或者在CDR區以外的部位也是如此。根據優選實施方案，細胞表面靶結合位點位於CDR區之中，特異於功能性配體或支架配體的結合位點位於結構環區之中。根據另一優選實施方案，特異於功能性配體或支架配體的結合位點位於CDR區之中，細胞表面靶結合位點位於結構環區之中。優選的本發明模塊抗體具有與靶結合的特異性結合特性，所述靶是erbB類別的受體，如選自EGFR,Her2,Her2neu,HER3和HER4。優選的本發明模塊抗體用於治療實體腫瘤患者，所述腫瘤表達erbB類型的受體。那些抗-Her2模塊抗體特別優選在結構環區的EF環之中包含選自表4和表5的胺基酸序列，表4和表5的序列任選地包含在EF和/或AB和/或CD環之中。雖然長期以來都需要高效的小分子抗體，但這是首次可以根據本發明，用模塊抗體結構域的文庫，尤其與效應配體結合的模塊抗體結構域寡聚體的文庫，獲得這樣的模塊抗體。所述文庫中選出的成員具有兩種特性，靶結合特性和效應配體結合特性，這是生物學細胞毒性或胞解作用的前提。還優選模塊抗體支架的形式不因產生所述支架的變體和文庫而改變，因此文庫成員仍保持功能性形式，可通過與支架配體的結合來確定。本發明提供了產生權利要求1的模塊抗體的方法，包括以下步驟：a.提供模塊抗體結構域寡聚體的庫，b.在有效應配體存在的條件下，將所述庫與所述靶接觸，c.選出具有以下兩項特性的庫成員：(i)靶結合親和力為Kd<10-8M或IC50<10-8M，且(ii)具有細胞毒活性，和d.產生該模塊抗體的製劑。優選的篩選方法能選出同時對兩者(靶和效應配體)的結合，這種同時結合有利於進行胞解。同時結合優選在能進行二維鑑別的基於細胞的試驗(如FACS系統)中測定。優選地，文庫成員含有隨機化抗體序列，其中的誘變位點任選在CDR區之中或在CDR區一側，優選在結構環區之中，可能包括末端序列。本發明方法中使用的文庫優選根據以下設計產生，所述設計在與效應配體相互作用的結合位點之外提供誘變。因此，優選使用高質量文庫(highqualitylibrary)，其通過利用效應分子結合試驗或支架配體結合試驗進行的質量控制測量法來確定。本發明的優選方法還包括親和力成熟步驟，以增加與細胞表面靶的結合親和力。這種親和力成熟優選通過對選定的免疫球蛋白的誘變來進行，所述選定的免疫球蛋白具有確定的與靶結合的結合特異性，不與對照蛋白發生交叉反應，但具有中度或低水平的親和力。優選對結合親和力為IC50或Kd<10-6M的文庫成員進一步誘變，以提供親和力成熟的結合劑或所述結合劑的群體，即具有較高親和力的親和力成熟結合劑的文庫，所述較高親和力是指IC50或Kd<10-7M、優選IC50或Kd<10-8M、或甚至在納摩爾範圍或更低範圍。在本例中，優選本發明的模塊抗體在其細胞毒效應方面仍然是具有功能的。根據優選實施方案，本發明提供了製備本發明模塊抗體的方法，用於治療實體腫瘤患者，所述腫瘤表達erbB一類的受體。本發明的模塊抗體優選用於治療實體腫瘤患者，所述腫瘤表達erbB一類的受體。本發明涉及以下項：1.細胞毒模塊抗體，分子量最高達60kD，以Kd<10-8M的結合親和力特異性結合細胞表面的靶。2.項1的模塊抗體，具有ADCC,ADCP,CDC或凋亡活性中的至少一種活性。3.項1或2的模塊抗體，包含具有隨機化抗體序列的結合位點。4.項1-3之一的模塊抗體，包含具有結構環區域的結合位點。5.項1-4之一的模塊抗體，是模塊抗體結構域的寡聚體。6.項1-5之一的模塊抗體，是選自VH/VL,CH1/CL,CH2/CH2,CH3/CH3,Fc和Fab的二聚體，或它們的單鏈。7.項1-6之一的模塊抗體，其中所述靶是erbB類型的受體。8.項7的模塊抗體，其中所述靶選自EGFR,Her2,Her2neu,HER3和HER4。9.項8的模塊抗體，包含特異性結合Her2的結合位點，並包含選自表4和表5所示序列編號的胺基酸序列。10.項1-9之一的模塊抗體，從與效應配體結合的模塊抗體結構域寡聚體的庫獲得。11.產生項1-10之一的模塊抗體的方法，包括以下步驟：a)提供模塊抗體結構域寡聚體的庫，b)在有效應配體存在的條件下，將所述庫與所述靶接觸，c)選出具有以下兩項特性的庫成員：i)靶結合親和力為Kd<10-8M或IC50<10-8M，且ii)具有細胞毒活性，和d)產生該模塊抗體的製劑。12.項11的方法，其中所述庫包含具有隨機化抗體序列的成員。13.項11或12的方法，還包含使所述庫成員發生親和力成熟的步驟。14.製備項1-10之一的模塊抗體用於治療實體腫瘤患者的方法，所述腫瘤表達erbB類型的受體。15.項1-10之一的模塊抗體，是用於治療實體腫瘤患者的模塊抗體，所述腫瘤表達erbB類型的受體。附圖：圖1：產生裝配文庫Fcab01所用片段的PCR示意圖。PCR引物按它們各自5』-3』的取向用箭頭表示，垂直線表示為裝配突變基因所引入的限制性位點的大概位置。所述限制性位點都包含在引物上，用於連接所述PCR片段。圖2：CH3結構域的胺基酸序列和二級結構(IMGT編號)。為文庫Fcab01至Fcab06提供了隨機化方案。AB環和EF環中的隨機化位置用圓圈標示。X代表所有20種胺基酸，z僅指Ala,Asp,Ser,Tyr。圖3：IgGFc片段的晶體結構(胺基酸序列)，具體為IgG1Fc片段的晶體結構(SEQIDNO:1)圖4：含隨機化胺基酸修飾的人IgG1(胺基酸序列)(SEQIDNO:2)圖5：FcabRGD4L的胺基酸序列(胺基酸序列)(SEQIDNO:11)圖6：載體pHENFcabRGD4(核苷酸序列)(SEQIDNO:12)圖7：載體pHENFcabRGD4L(核苷酸序列)(SEQIDNO:14)圖8(SEQIDNO:15)：載體pYD1dX(核苷酸序列)圖9(SEQIDNO:16)：載體pYD1dXFc(核苷酸序列)圖10(SEQIDNO:17)：載體pYD1CH12(核苷酸序列)圖11(SEQIDNO:18)：Fcab01(核苷酸序列)圖12(SEQIDNO:19)：Fcab02(核苷酸序列)圖13(SEQIDNO:20)：Fcab03(核苷酸序列)圖14(SEQIDNO:21)：Fcab04(核苷酸序列)圖15(SEQIDNO:22)：Fcab05(核苷酸序列)圖16(SEQIDNO:23)：Fcab06(核苷酸序列)圖17(SEQIDNO:72)：載體pYD1(核苷酸序列)圖18(SEQIDNO:73)：修飾的載體pYD1Nhe(核苷酸序列)圖19(SEQIDNO:74)：載體pYD1lnk(核苷酸序列)圖20(SEQIDNO:75)：載體pYD1mata(核苷酸序列)圖21(SEQIDNO:76)：載體pYD1gal(核苷酸序列)圖22(SEQIDNO:77)：4D5H(核苷酸序列)圖23(SEQIDNO:78)：4D5L(核苷酸序列)圖24(SEQIDNO:79)：載體pYD4D5hc(核苷酸序列)圖25(SEQIDNO:80)：4D5hp(胺基酸序列)圖26(SEQIDNO:81)：載體pYD4D5hl(核苷酸序列)圖27(SEQIDNO:82)：4D5lp(胺基酸序列)圖28(SEQIDNO:427)：質粒pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt(核苷酸序列)圖29(SEQIDNo.428)：pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt發明詳述定義說明書全文使用的專有術語具有下列含義。本發明使用的術語「免疫球蛋白」被定義為可以顯示單一或雙重或多重特異性，或單價、二價或多價結合特性的多肽或蛋白，優選至少兩個，更優選至少三個特異性結合位點，所述位點針對例如病原體來源的或具有人的結構的抗原、效應分子或蛋白(象包含細胞結合蛋白或血清蛋白的自身抗原)的表位。本發明使用的術語免疫球蛋白還包括，抗體的功能性片段，諸如Fc,Fab,scFv,CH1/CL結構域的單鏈二聚體,Fv,二聚體如VH/VL,CH1/CL,CH2/CH2,CH3/CH3，或免疫球蛋白的其它衍生物或組合，象成對免疫球蛋白區的單鏈。所述定義進一步包括，可變區重鏈和輕鏈的結構域(諸如dAb,Fd,Vl,Vk,Vh,VHH)，完整抗體的恆定區或個別結構域諸如CH1,CH2,CH3,CH4,Cl和Ck，以及由結構環連接的免疫球蛋白區至少兩條beta鏈組成的小結構域。本發明使用的「模塊抗體」被定義為抗原結合分子，例如人抗體，由至少一個多肽組件或蛋白結構域組成，優選採用天然形式。術語「模塊抗體」包括抗原結合分子，其是免疫球蛋白，免疫球蛋白樣蛋白，或顯示類似於免疫球蛋白或抗體的模塊形式和抗原結合特性的其它蛋白，其可用作抗原結合支架，優選基於人蛋白。本發明使用的術語「免疫球蛋白樣分子」涉及任意抗原結合蛋白，尤其是人蛋白，其具有可以以模塊方式組建的域結構。本發明優選使用的免疫球蛋白樣分子是T細胞受體(TCR)或其可溶性部分，纖連蛋白，運鐵蛋白，CTLA-4，單鏈抗原受體，例如與T細胞受體和抗體有關的那些，抗體模擬物，adnectins，anticalins，phylomers，重複蛋白諸如錨蛋白重複，avimers，VersabodiesTM，基於全蠍毒素(scorpiotoxin)的分子，以及其它具有抗原結合特性的非抗體的蛋白支架。錨蛋白重複(AR)，armadillo重複(ARM)，亮氨酸富集重複(LRR)和三角形四肽(tetratricopeptide)重複(TPR)蛋白是重複蛋白這一類的最重要成員。重複蛋白由同源結構單位(重複單位)組成，這些單位堆積形成延長的結構域。結合相互作用通常由數個相鄰重複單位介導，導致大的靶相互作用表面。Avimers包含A結構域，是在數個細胞表面受體中排成一列的多個結構域。該家族的結構域天然結合超過100種不同的已知靶，包括小分子，蛋白和病毒。截短分析顯示，靶通常與多個A結構域接觸，其中每個結構域獨立地結合唯一表位。通過組合多個結合結構域來產生親合力(avidity)，是增加親和力和特異性的有效方法，這些受體在進化過程中已經利用了這一點。Anticalins是源自脂籠蛋白(lipocalin)支架、具有指定的結合特性(主要是對於人源化抗體而言)的工程化人蛋白。脂籠蛋白包括160-180個胺基酸，與被4個環圍繞的配體結合口袋一起形成錐狀beta-桶蛋白。小分子疏水化合物是脂籠蛋白的天然配體，將該結合口袋中的殘基隨機化後，可以分離出具有新的化合物特異性的不同脂籠蛋白變體(亦稱為「anticalins」)。單鏈或單域抗原受體包含單個可變區，並且比駱駝單域抗體(camelidsingledomainantibodies)小20％。Phylomers是源自生物多樣化天然蛋白片段的肽。應理解，術語「模塊抗體」，「免疫球蛋白」，「免疫球蛋白樣蛋白」還包括其衍生物。衍生物是本發明一種或更多種模塊抗體的任意組合，和/或是融合蛋白，其中本發明模塊抗體的任意結構域或迷你結構域(minodomain)可以在一種或多種其它蛋白(諸如其它的模塊抗體，免疫球蛋白，配體，支架蛋白，酶，毒素等等)的任意位置融合。本發明模塊抗體的衍生物還可以通過各種化學技術關聯或結合其它物質來獲得，所述技術諸如共價偶聯，靜電相互作用，雙硫醚鍵等等。結合免疫球蛋白的其它物質可以是脂質，碳水化合物，核酸，有機和無機分子或其任意組合(例如PEG，前體藥物或藥物)。衍生物還包括具有相同的胺基酸序列但完全或部分從非天然的或化學修飾的胺基酸製備的抗體。術語衍生物還包括片段和功能等價物。優選的衍生物仍然是在靶結合和細胞毒活性兩方面都具有功能的那些。本發明的「結構環」或「非CDR環」應以下列方式理解∶模塊抗體，免疫球蛋白或免疫球蛋白樣物質由具有所謂免疫球蛋白摺疊的結構域組成。實質上，反平行beta片層由環連接形成緊湊的反平行beta桶。在可變區中，這些結構域的一些環對抗體的特異性(即通過抗體的天然結合位點結合抗原)具有實質上的貢獻。這些環被稱為CDR-環。CDR環位於CDR環區內，其在一些情況下還可以包括靠近CDR環的可變框架區(稱為「VFR」)。已知VFR的一些環對抗體的抗原結合口袋(其通常主要由CDR環確定)有貢獻。因此，那些VFR環被認為是CDR環區的一部分，不適合用於產生新的抗原結合位點。抗原結合口袋或CDR環區以外的環通常稱為結構環或非-CDR-環。與CDR環區之中或靠近CDR環的那些VFR不同，可變區VFR的其它環被認為是結構環、且尤其適用於本發明。這些優選是與CDR環區相對，或位於免疫球蛋白可變區C端一側的VFR的結構環。恆定區在結構環區之中具有結構環，例如，在抗體結構域C端一側，或在N端一側，甚至在抗體結構域的側鏈之中。恆定區也稱框架區的組成部分。本發明使用的術語「抗原」或「靶」將特別包括能夠被模塊抗體的結合位點識別的所有抗原和靶分子。被本發明分子的靶向的特別優選抗原是以下抗原或分子，其已經被證明是或能夠是免疫上或治療上相關的，尤其是臨床功效已經得到驗證的那些。本文使用的術語「靶」或「抗原」將尤其包括選自以下的分子：變應原，腫瘤相關抗原，自體抗原包括細胞表面受體，酶，Fc-受體，FcRn，HSA，IgG，白介素或細胞因子，補體系統的蛋白，轉運蛋白，血清分子，細菌抗原，真菌抗原，原生動物抗原和病毒抗原，以及引起傳染性海綿狀腦炎(TSE)的分子，如感染性或非感染性朊病毒(prion)，和與炎性病症有關的標記物或分子如促炎因子，多發性硬化或阿爾茨海默爾病，或半抗原。術語「細胞表面抗原」將包括能夠被細胞表面的抗體結構和這類分子的片段識別的所有抗原。優選細胞表面抗原是以下抗原，其已經被證明是或能夠是免疫或治療上相關的，尤其是臨床前或臨床功效已經得到驗證的那些。對於本發明的目的來說，調節細胞殺傷活性的那些細胞表面分子是特別適合的。當本發明的免疫球蛋白優選結合所述細胞表面分子中的至少兩種時，免疫系統引起細胞裂解或細胞死亡，從而提供攻擊人細胞的有效工具(means)。抗原作為完整靶分子或這類分子的片段被識別，所述片段尤其是通稱為表位的靶的子結構(substructure)。只要它們是免疫上相關的(即還可以被天然的或單克隆的抗體識別)，抗原子結構就被通稱為「表位」(例如B細胞表位，T細胞表位)。根據本發明在本文使用的術語「表位」應尤其指，完全組成針對本發明模塊抗體或免疫球蛋白結合位點的特異性結合伴侶或者是其一部分的分子結構。術語「表位」還可以指半抗原。化學上，表位可以由碳水化合物，肽，脂肪酸，有機物、生化物質或無機物或其衍生物及其任意組合組成。若表位是多肽，其通常包括至少3個胺基酸，優選8-50個胺基酸，更優選約10-20個胺基酸。在肽的長度方面沒有關鍵上限，其可以包括幾乎全長的蛋白多肽序列。表位可以是線性表位或構象性表位。線性表位由多肽鏈一級序列的單個片段組成。線性表位可以是連續或重疊的。構象性表位由因多肽摺疊成三級結構而聚在一起的胺基酸組成，這些胺基酸在線性序列中彼此不必鄰接。具體來說，表位是與診斷相關的分子的至少一部分，即樣品中表位的有無，與患者的疾病或健康狀態，或與生產中的加工狀態，或與環境狀況和食品狀況，有定性或定量的關係。表位還可以是與治療相關的分子的至少一部分，即可以被改變疾病進程的特異性結合結構域靶定的分子。本文使用的術語「特異性結合(specificallybinds或specificbinding)」是指一種結合反應，其不同分子組成的群體中確定相關的(cognate)目標配體。因此，在指定條件(例如免疫分析條件)下，模塊抗體結合其特定靶，而不以高水平結合樣品中的其它分子。特異性結合表示，根據所選的靶的特性，高、中或低水平的結合親和力或親合力，結合是選擇性的。當結合常數或結合動力學有至少10倍的差異，優選至少100倍的差異，更優選至少1000倍時，通常可以實現選擇性結合。術語「表達系統」是指核酸分子，其中包含所需編碼序列和調控序列，它們可操作相連，使得被這些序列轉化或轉染的宿主能夠產生所編碼的蛋白。為了實現轉化，表達系統可以包括在載體上；但相關DNA隨後也可整合到宿主染色體中。備選地，表達系統可以用於體外轉錄/翻譯。免疫球蛋白胺基酸序列的所有編號是根據IMGT編號方案(IMGT,theinternationalImMunoGeneTics,Lefrancetal.,1999,NucleicAcidsRes.27:209-212)。對於本發明的目的而言，術語「結合劑」或「配體」是指結合對的一員，尤其是有可能作為針對結合伴侶的結合結構域的結合多肽。結合伴侶的實例包括具有功能性相互作用的成對結合劑，如受體與配體結合，抗體與抗原或受體結合，藥物與靶結合，以及酶與底物結合。用於本發明目的的術語「融合蛋白」或「嵌合融合蛋白」應是指，由基因包，外表面結構的至少一部分(諸如外殼蛋白)，可選還有接頭序列，以及結合劑組成的分子。融合蛋白由載體編碼，所述載體有結合劑的基因和在基因包表面展示一個拷貝的結合劑的信息。用於本發明目的的術語「細胞毒活性(cytotoxic或cytotoxicactivity)」應是指，抗細胞抗原的任何特異性分子，它們與抗原結合後，激活補體途徑或激活殺傷細胞，導致細胞裂解或觸發凋亡。具體地，它是指效應細胞引起細胞毒T細胞或介導以下活性的細胞活化的活性，所述活性是，介導抗體依賴性細胞型細胞毒性(ADCC)，補體依賴性細胞毒性(CDC)和/或細胞吞噬(ADCP)。它還指凋亡效應，由此觸發程序性細胞死亡(PCD)。本發明的模塊抗體因此殺傷被抗體包裹的靶細胞，可選地通過與效應細胞的Fc受體結合或通過誘導程序性細胞死亡來完成。「支架」應是指，構建多肽的變體或所有組成成分時，用於支持多肽分子結構的天然或人工臨時框架。它通常是維持親代分子的三級結構或功能的多肽結構域的模塊系統。示例性支架是模塊抗體，其可以被誘變以在所述支架內產生變體，從而獲得文庫。用於本發明目的的術語「支架配體」應是指，與模塊抗體的支架或主鏈結合，從而確定所述模塊抗體的分子結構或基本功能和特異性的配體。在優選情況下，支架配體是功能性配體，通過結合來介導生物功能，象效應配體一樣。在備選實施方案中，支架配體是功能性配體，其是被CDR區或結構環區結合的特異性靶。相同的支架配體可以與模塊抗體的多個變體結合，而與它們的靶特異性無關。通常，支架配體結合位點的存在提示變體被表達並且正確摺疊。因此，支架配體與其結合位點的結合提供一種從多肽的所有組成成分預選(preselecting)、共選(coselecting)、鑑定和篩選功能性多肽的方法。設計模塊抗體的變體使之保持對支架配體的結合特性，避免製備出無功能的變體，例如因引入基本上不能結合任意靶或效應配體的突變、摺疊突變體或表達突變體所致。這類無功能的突變體有時由構建多肽所有組成成分時的常規隨機化和變異步驟產生。提供與支架配體結合的功能性突變體允許本領域技術人員製備富含功能性、良好摺疊和高表達的庫成員的模塊抗體文庫。例如，所述支架可以是親本Fab，且至少20％，優選至少30％，更優選至少40％的親本Fab變體與所述親本Fab的CDR-靶結合。用於本發明目的的術語「效應配體」應是指，介導效應子功能的配體，象效應分子。示例性的效應配體是幹擾免疫球蛋白的Fc受體或Fc受體樣分子。Fc受體是在一些細胞(包括自然殺傷細胞，巨噬細胞，中性粒細胞，和肥大細胞)表面發現的、負責免疫系統的保護功能的蛋白。其名稱來源於其對稱為Fc(可結晶的片段)的抗體部分的結合特異性。Fc受體結合那些與感染的細胞或侵入病原體粘附的抗體。它們的活性刺激吞噬細胞或細胞毒細胞，通過抗體介導的細胞吞噬作用(ADCP)或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，破壞微生物或被感染的細胞。有數種不同類型的Fc受體，根據它們識別的抗體類型進行分類；例如，結合IgG(最常見的抗體類型)的那些被稱為Fc-gamma受體(FcγR)，結合IgA的那些被稱為Fc-alpha受體(FcαR)，結合IgE的那些被稱為Fc-epsilon受體(FcεR)。等同於效應配體、並因此包括在該定義中的是，識別模塊抗體(諸如蛋白A)內相同或類似結合位點的任意替代配體。所有FcγRs都屬於免疫球蛋白超家族，是誘導吞噬已被調理(被包裹)的微生物時最重要的Fc受體。該家族包括數個成員；例如FcγRI(CD64),FcγRIIA(CD32a),FcγRIIB(CD32b),FcγRIIIA(CD16a),FcγRIIIB(CD16b)；它們因為不同的分子結構而在抗體親和力方面不同。例如，FcγRI對IgG的結合比FcγRII和FcγRIII更強，並具有由3個免疫球蛋白(Ig)-樣結構域組成的胞外部分，比FcγRII和FcγRIII多一個結構域。這些特性允許FcγRI通過單個IgG分子(或單體)活化，而後兩種Fcγ受體必須結合免疫複合物內的多個IgG分子才能被活化。另一FcR在多種細胞類型中表達，與MHCI類分子結構相似。該受體還結合IgG，並與保護(preservation)該抗體有關。但是，因為該Fc受體還參與IgG從母體通過胎盤轉移到胎兒或通過在乳汁中轉移到吃母乳的嬰兒，所以它被稱為新生兒Fc受體(FcRn)。最近該受體已被顯示參與IgG血清水平的自穩(homeostasis)。抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)是細胞介導的免疫力的一種機制，由此免疫系統的效應細胞主動裂解被特異性抗體結合的靶細胞。這是抗體作為體液免疫應答的一部分起限制和包含感染的作用的機制之一。典型的ADCC由自然殺傷(NK)細胞介導；單核細胞和嗜酸性粒細胞也可以介導ADCC。例如嗜酸性粒細胞可以通過ADCC殺傷一些被稱為蠕蟲(helminths)的寄生蟲。ADCC屬於獲得性免疫應答的組成部分，因為其依賴於在先的抗體應答。描述胺基酸時，術語「外源」應是指，新導入的胺基酸，它是天然的，但對修飾位點來說是外來的，或者它是天然胺基酸的替代物。對於抗原結合位點來說，「外源」表示該抗原結合位點不是該分子的特異性結合區天然形成的，而且，所述新修飾的結合位點結合的是外源結合伴侶，而不是該分子的天然結合伴侶。本文使用的術語「可變結合區」有時稱「CDR區」，是指具有能與抗原發生結合相互作用的差異化結構(varyingstructures)的分子。所述分子可以以其本來面目來使用，或摻入更大的蛋白中，由此形成這類蛋白的具有結合功能的特異性區域。所述差異化結構可以來源於結合蛋白(如免疫球蛋白或phylomers)的天然所有組成成分，或來源於合成的多樣性，包括重複蛋白，avimers和anticalins。所述差異化結構還可以通過隨機化技術產生，尤其是本文描述的那些。這些包括，經誘變的CDR或非CDR區，免疫球蛋白可變區或恆定區的環區。在特異性位點具有不同修飾的修飾性結合劑被稱作「變體」。支架的變體優選被歸為一組，形成結合劑的文庫，其可用於選出具有預定功能的文庫成員。據此，抗體序列優選通過例如誘變方法進行隨機化。根據優選的實施方案，結合劑的環區，諸如包含一個或多個環內位置、或位於末端位置、可能對結合位點有貢獻的親本抗體序列，優選被突變或修飾以產生文庫，優選通過隨機、半隨機或尤其是通過定點隨機誘變法，尤其是刪除、交換或引入隨機生成的插入序列至多個環中或環區域內，優選至CDR環區或結構環區，其可能包括末端序列，它們位於抗體域或結構的一個末端。另外優選的是應用組合方法。可以使用任一種的已知誘變方法，其中包括盒誘變(cassettemutagenesis)。這些方法可用於在本發明免疫球蛋白的目標位置進行胺基酸修飾。在一些情況下，位置是隨機選擇的，例如利用任意可能的胺基酸或選出優選的胺基酸以將環序列隨機化，或利用簡化規則進行胺基酸變化。例如所有殘基優選可以突變為特定胺基酸，諸如丙氨酸，這稱為胺基酸掃描或丙氨酸掃描。這類方法可以伴隨更複雜的工程化方法，後者使用選擇法來篩選更高水平的序列多樣性。本發明的分子量小於60kD或最多為60kD的細胞毒模塊抗體比全長抗體要小。優選的大小是最多55kD。模塊抗體單個結構域通常具有10-15kD的分子大小，因此基於4個模塊抗體結構域或由4個所述域組成的分子具有40-60kD的大小，這取決於糖基化或任何額外偶聯的藥理學活性物質，例如毒素或肽。優選形式是由模塊抗體結構域組成的寡聚體，優選最多4個結構域，更優選3個結構域，更優選基於2個結構域，所述寡聚體優選包含異二聚體如Fab，或同二聚體如Fc。基於5個模塊抗體結構域或更多的組合的形式通常被認為不具有小型抗體片段的特別優勢，即易於在各種表達系統中表達和穿透組織的優勢。提供本發明優選模塊抗體作為單域抗體是可行的。但是，抗體結構域在表達時傾向於二聚化，成為同二聚體(例如Fc)或異二聚體(例如Fab)。二聚結構因此被認為是提供穩定分子的基礎。優選的免疫球蛋白結構域二聚體選自單域二聚體，例如VH/VL,CH1/CL(kappa或lambda),CH2/CH2和CH3/CH3。模塊抗體結構域的二聚體或寡聚體還可以為單鏈或雙鏈分子，尤其是將一個結構域的C端連結到另一結構域的N端的那些。結合伴侶(bindingpartner)是通常通過非共價相互作用彼此特異性結合的試劑。結合伴侶的實例包括具有功能性相互作用的成對結合劑，諸如受體結合配體，抗體結合抗原，藥物結合靶，酶結合底物。結合伴侶已在多個治療、診斷、分析和工業用途中得到應用。最重要的結合對是抗體或免疫球蛋白，其片段或衍生物。在大多數情況下需要這類結合劑的結合來介導生物學效應或功能，即「功能性相互作用」。根據本發明的具體實施方案，細胞毒模塊抗體是結合劑，其是人或小鼠來源的免疫球蛋白，可用於各種目的，尤其是用於藥物組合物。當然，修飾的免疫球蛋白也可以是人源化或嵌合的免疫球蛋白。結合劑(為人免疫球蛋白)優選選自或源自IgA1,IgA2,IgD,IgE,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4和IgM。小鼠免疫球蛋白結合劑優選選自或源自IgA,IgD,IgE,IgG1,IgG2A,IgG2B,IgG2C,IgG3和IgM。這類結合劑優選包括重鏈和/或輕鏈或其部分。本發明修飾的免疫球蛋白可以包括重鏈和/或輕鏈，至少一個可變區和/或恆定區，或其包括迷你結構域的部分。恆定區是免疫球蛋白分子恆定部分的免疫球蛋白摺疊單位，也稱為恆定區的結構域(例如CHl,CH2,CH3,CH4,Ck,Cl)。可變區是免疫球蛋白可變部分的免疫球蛋白摺疊單位，也稱為可變區的結構域(例如Vh,Vk,Vl,Vd)。本發明的示例性模塊抗體由選自具有至少一個環區的CHl,CH2,CH3,CH4,Igk-C,IgI-C，其組合、衍生物或包括迷你結構域的部分組成，其特徵在於所述至少一個環區包括至少一個胺基酸修飾以形成至少一個修飾的環區，其中所述至少一個修飾的環區特異性結合抗原的至少一個表位。本發明的另一模塊抗體可以由具有至少一個環區的重鏈或輕鏈的可變區、其組合、衍生物或其包括迷你結構域的部分組成，其特徵在於所述至少一個環區包括至少一個胺基酸修飾以形成至少一個修飾的環區，其中所述至少一個修飾的環區特異性結合抗原的至少一個表位。本發明的模塊抗體可以包括一個或更多個結構域(例如至少2，3，4，5，6，10個結構域)。如果模塊抗體中存在不止一個結構域，則這些結構域可以是相同的類型或不同的類型(例如CH1-CH1-CH2,CH3-CH3,(CH2)2-(CH3)2，有或者沒有鉸鏈區)。當然單個結構域的排列順序也可以是任意(例如CH1-CH3-CH2，CH4-CH1-CH3-CH2)。本發明優選涉及抗體的部分，諸如IgG,IgA,IgM,IgD,IgE等等的部分。本發明的模塊抗體也可以是功能性抗體片段諸如Fab,Fab2,scFv,Fv,Fc,FcabTM,抗原結合性Fc,或其部分，或免疫球蛋白的其它衍生物或組合諸如minibodies，可變區重鏈和輕鏈的結構域(諸如dAb,Fd,VL,包括Vlambda和Vkappa,VH,VHH)以及由至少兩個結構環連接的免疫球蛋白區兩條beta-鏈組成的迷你結構域，作為分離的結構域或在天然結合的分子的群體中。本發明的具體實施方案涉及抗體分子的Fc片段，作為通過修飾胺基酸序列而形成的抗原結合性Fc片段(FcabTM)，或作為受體、肽或其它抗原結合模塊(諸如scFv)的偶聯物或融合體。模塊抗體可以作為分離的多肽或組合分子使用，例如通過與其它肽或多肽重組、融合或偶聯的技術。所述肽優選與免疫球蛋白結構域序列同源，優選至少5個胺基酸長，更優選至少10或甚至至少50或100個胺基酸長，並至少部分構成免疫球蛋白結構域的環區。優選的結合特徵涉及預先確定的表位結合、親和力和親合力。本發明的模塊抗體還可進一步與一個或更多個修飾的模塊抗體或未修飾的模塊抗體或其部分組合以獲得組合模塊抗體。組合優選通過重組技術獲得，還可以通過吸附、靜電相互作用等等或通過有或沒有接頭的偶聯或化學結合來獲得。優選的接頭序列是天然接頭序列或功能上合適的人工序列。通常本發明的模塊抗體可以用做結構單元(buildingblock)，以便與其它模塊抗體或生物活性物質或分子在分子水平組合。優選將至少一個通過可變或非可變序列(例如結構環)與特定伴侶結合的抗體與至少一個其它結合分子(其可以是抗體，抗體片段，可溶性受體，配體或另一抗體結構域，或其結合模塊)在分子水平組合。其它組合涉及蛋白性質的分子，核酸，脂質，有機分子和碳水化合物。本發明的工程化分子可以作為獨立的蛋白，以及融合蛋白或衍生物來用，最常見的是，在修飾之前或之後融合，以成為更大的結構(例如完整抗體分子或其部分)的部分。根據本發明製得的免疫球蛋白或融合蛋白因此也包含Fc片段，Fab片段，Fv片段，單鏈抗體，尤其單鏈Fv片段，雙特異性或多特異性scFv，雙價體(diabodies)，單價體(unibodies)，多價體(multibodies)，多價或多聚的免疫球蛋白結構域及其它。有可能利用工程化的蛋白產生單特異性、雙特異性、三特異性和甚至同時載有更多特異性的分子。通過恩發明，還可根據這類分子的計劃用途的要求同時控制和預選結合的效價。根據本發明，模塊抗體可選的具有針對抗原的一個或更多個結合區，包括特異性結合細胞表面靶的結合位點和介導效應子功能的結合位點。針對一個或更多個抗原的抗原結合位點可以由CDR區或任意其它天然受體結合結構呈現，或可以被導入可變區或恆定區結構的抗體結構域的結構環區。用於檢測結合位點結合特性的抗原可以是天然存在的分子或化學合成的分子或重組分子，其可以位於溶液或懸浮液中，例如位於顆粒(諸如固相)上或顆粒(諸如固相)中，在細胞上或細胞中或病毒表面。優選免疫球蛋白與抗原的結合在該抗原仍然粘附或結合天然狀態下的分子和結構時來測定。從而有可能鑑定和獲得最適於診斷或治療用途的那些修飾的免疫球蛋白。模塊抗體或免疫球蛋白結構域可以根據本發明進行修飾(本文術語免疫球蛋白和抗體可以互換使用)，所述修飾優選在免疫球蛋白結構域、或其末端序列(優選C-端序列)部分、和/或其包含環(CDR-環或非-CDR環)的環區部分進行，結構環是優選的修飾或誘變位點。根據具體實施方案，結構環區也包括末端序列，其負責抗原結合。在一些情況下，優選使用指定的經修飾的結構環或結構環區或其部分，作為用於結合或組合目的的分離的分子。尤其優選本發明的模塊抗體通過結構環和/或CDR環的至少一部分結合所述細胞表面靶。在備選實施方案中，優選本發明的模塊抗體通過結構環和/或CDR環的至少一部分結合所述效應配體，或這類效應配體的替代配體，例如蛋白A，從而介導效應子功能。在優選實施方案中，結合劑利用其天然或修飾的結合結構，或新形成的結合位點，與相同抗原或不同抗原的至少兩個這類表位(彼此相同或不同)特異性結合。在結合劑的優選域結構中，優選修飾或隨機化模塊抗體的至少一個環區或末端區，導致一個或更多個核苷酸或胺基酸的取代、缺失和/或插入，優選點突變，或甚至全環的交換，更優選改變至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15，最多30個胺基酸。由此修飾的序列包括：未包含在環的保守區內的胺基酸，新導入的胺基酸(是天然存在的，但對改造位點來說是外源的)，或是天然胺基酸的取代。但是，插入結合劑環區的胺基酸最大數目優選不超過30，優選25，更優選最多20個胺基酸。胺基酸的取代和插入優選通過本領域已知的和本專利申請公開的方法，使用所有可能的胺基酸或用於隨機化目的篩選的優選胺基酸隨機或半隨機進行。修飾位點可以位於特定的單個環或環區，尤其是結構環或結構環區。環區通常由至少兩個，優選至少3個或至少4個彼此鄰接的環組成，它們可能通過形成抗原結合位點或抗原結合口袋而負責結合抗原。優選一個或更多個修飾位點位於10個胺基酸的區域內，更優選位於20，30，40，50，60，70，80，90直至100個胺基酸內，尤其是結構區內，以形成使抗原可以空間上接近環區的表面或口袋。在這方面，優選修飾在CH1、CH2、CH3和CH4的環區中進行，尤其是以下範圍：胺基酸7-21，胺基酸25-39，胺基酸41-81，胺基酸83-85，胺基酸89-103和胺基酸106-117，或者在末端序列中，優選在與抗體結構域的C-端或N-端相距6個胺基酸的範圍內。在另一優選實施方案中，包括胺基酸92-98的結構環區的改造與包括胺基酸8-20的結構環區的改造組合。上述鑑定的相應免疫球蛋白的胺基酸區包括待改造的環區。優選，包括胺基酸92-98的結構環區的改造與一個或更多個其它結構環中的改造組合。在另一優選實施方案中，包括胺基酸92-98的結構環區的改造與包括胺基酸41-45.2的結構環區的改造組合。最優選包括胺基酸92-98，胺基酸41-45.2和胺基酸8-20的各個結構環中的每一個包含至少一個胺基酸改造。在另一優選實施方案中，包括胺基酸92-98，胺基酸41-45.2，和胺基酸8-20的各個結構環中的每一個包含至少一個胺基酸改造。根據另一優選實施方案，位於CH3的15-17，29-34，41-45.2，84-85，92-100，和/或108-115位的胺基酸殘基被改造。優選人來源Igk-C和IgI-C的改造在環區的以下區域進行：胺基酸8-20，胺基酸26-36，胺基酸41-82，胺基酸83-88，胺基酸92-100，胺基酸107-124和胺基酸123-126，或者在末端序列中，優選在與抗體結構域的C-端或N-端相距6個胺基酸的範圍內。優選小鼠來源Igk-C和IgI-C的環區改造在以下區域的位置進行：胺基酸8-20，胺基酸26-36，胺基酸43-79，胺基酸83-85，胺基酸90-101，胺基酸108-116和胺基酸122-126。根據本發明優選用作治療劑的另一優選免疫球蛋白，由具有至少一個環區(優選結構環區)的重鏈、或輕鏈、或其包含迷你結構域的部分的可變區組成，其特徵在於所述至少一個環區包括至少一個胺基酸修飾以形成至少一個修飾環區，其中所述至少一個修飾的環區形成如上所述的相關結合位點。根據一個具體實施方案，本發明優選使用的免疫球蛋白可以包含位於可變區內的改造，所述可變區選自VH，Vkappa，Vlambda，VHH和其組合。更具體地，它們包含至少一個修飾，所述修飾位於胺基酸7-22，胺基酸39-55，胺基酸66-79，胺基酸77-89或胺基酸89-104內(其中結構域胺基酸位置的編號是IMGT編號)，或者位於末端序列中，優選在與抗體結構域的C-端或N-端相距6個胺基酸的範圍內。在一個具體實施方案中，本發明優選使用的免疫球蛋白的特徵在於，人來源VH或Vkappa或Vlambda的環區包括位於胺基酸7-22，胺基酸43-51，胺基酸67-77，胺基酸77-88，和胺基酸89-104，最優選胺基酸12-17位，胺基酸45-50位，胺基酸68-77位，胺基酸79-88，和胺基酸92-99位內的至少一個修飾，其中結構域胺基酸位置的編號是IMGT編號。作為可能選出用於修飾的人來源免疫球蛋白可變區的結構環區，優選位於以下區域：胺基酸8-20，胺基酸44-50，胺基酸67-76，胺基酸78-87，和胺基酸89-101，或者位於末端序列中，優選在與抗體結構域的C-端或N-端相距6個胺基酸的範圍內。根據優選實施方案，作為可能篩選用於改造目的的小鼠來源免疫球蛋白可變區的結構環區優選位於以下區域：胺基酸6-20，胺基酸43-52，胺基酸67-79，胺基酸79-87，和胺基酸91-100，或者在末端序列中，優選在與抗體結構域的C-端或N-端相距6個胺基酸的範圍內。根據本發明優選用作治療劑的免疫球蛋白還可以是駱駝來源。駱駝抗體只包括一條重鏈，與由輕鏈和重鏈組成的正常抗體具有相同的抗原親和力。因此駱駝抗體比例如人抗體小得多，這允許它們穿透嚴密的組織到達抗原，而更大的蛋白無法到達。此外，在臨床重要化合物的設計、生產或應用中，駱駝的重鏈抗體比普通抗體具有優勢：相對較簡單，高親和力和特異性以及到達活性位點並與其相互作用的潛力。根據本發明另一優選實施方案，駱駝來源的模塊抗體或免疫球蛋白的結構環區被改造，例如在VHH內，在胺基酸7-19，胺基酸43-55，胺基酸68-76，胺基酸80-87和胺基酸91-101的區域內，或者在末端序列中，優選在與抗體結構域的C-端或N-端相距6個胺基酸的範圍內。本發明優選的產生模塊抗體的方法涉及，改造模塊抗體(其特異性結合至少一個第一表位，並在結構環區內的至少兩個位點或環的每一個中包含修飾)，並確定所述結構環區與至少一個第二表位的特異性結合，其中未改造的結構環區(非CDR區)不與所述至少一個第二表位特異性結合。因此，對第一抗原特異的抗體或抗原結合結構可以通過以下方式改進：添加抗第二抗原的另一效價或特異性(其特異性可以是相同的，針對不同表位或相同表位)，以增加效價或獲得雙特異性、寡特異性或多特異性分子。另一方面優選使用包含與效應分子或免疫細胞相互作用的天然結構的模塊抗體，優選與效應配體結合。所述天然結構保持不變或為了增強效應子功能而進行改造。針對例如Fc受體的結合位點被描述位於CH2和/或CH3結構域區，可以通過公知的技術進行誘變。ADCC，抗體依賴性細胞介導的細胞毒活性，是通過具有識別結合抗體恆定區的Fc受體的細胞對抗體包被的靶細胞的殺傷。大部分ADCC由在其表面具有Fc受體FcgammaRIII或CD16的NK細胞介導。典型分析法使用靶細胞，例如Ramos細胞，在添加新分離的效應細胞前與系列稀釋的抗體溫育。然後將ADCC分析物進一步溫育數小時，檢測細胞毒活性％。通常靶：效應物比例為約1:16，但可以是1:1直至1:50。補體依賴性細胞毒性(CDC)是一種殺傷細胞的機制，其中與靶細胞表面結合的抗體固定補體，導致組裝膜攻擊複合物，其在靶細胞膜上穿孔，導致隨後細胞裂解。常規使用的CDC分析法按照ADCC測定法的相同步驟，但是，利用包含補體的血清代替效應細胞。本發明模塊抗體的細胞毒活性經ADCC或CDC分析法測定，當與對照相比細胞裂解百分比顯著增加時，證明有細胞毒活性。與ADCC或CDC相關的細胞毒活性優選測量的是絕對百分比的增長，其優選高於5％，更優選高於10％，甚至更優選高於20％。抗體依賴性細胞吞噬作用，即ADCP(有時稱為ADPC)，通常與培養的人細胞的細胞裂解一起被研究。可以如下確定抗體介導的吞噬細胞(通常人單核細胞或單核細胞來源的巨噬細胞)的吞噬。可以將純化的單核細胞與細胞因子一起培養以增強FcγRs的表達或誘導分化為巨噬細胞。然後用靶細胞進行ADCP和ADCC分析。測定吞噬作用，表示為通過流式細胞術檢測的陽性細胞百分比。通過吞噬細胞對抗體-抗原複合物的顯著攝取，證明陽性ADCP活性。與ADCP相關的細胞毒活性優選測量的是吞噬細胞攝取抗體-抗原複合物的絕對百分比，其優選高於5％，更優選高於10％，甚至更優選高於20％。在典型分析法中，將PBMC或單核細胞或單核細胞來源的巨噬細胞，按照1×105活細胞的濃度，重懸於96孔板的RF2培養基(添加2％FCS的RPMI1640)中，100ml/孔。表達靶抗原(例如Her2/neu抗原)的相應靶細胞，以及SKBR3細胞，利用PKH2綠色螢光染料染色。隨後將1×104PKH2-標記的靶細胞和不同濃度(例如1-100μg/ml)的Her2特異性(IgG1)抗體(或模塊抗體)或小鼠IgG1同種型對照(或模塊抗體對照)添加到PBMCs的孔中，在200ml的終體積中37℃溫育24小時。溫育後，利用EDTA-PBS收集PBMCs或單核細胞或單核細胞來源的巨噬細胞和靶細胞，將其轉移到96孔V形底的板。將板離心並吸出上清。細胞用100ml偶聯RPE的抗CD11b、抗CD14和人IgG的混合物復染，混合後在冰上溫育60分鐘。清洗細胞，並用2％甲醛-PBS固定。在最適門控條件下，利用例如FACSCalibur進行雙色流式細胞分析。在FL-1通道(發射波長，530nm)中檢測到PKH2標記的靶細胞(綠色)，在FL-2通道(發射波長，575nm)中檢測到RPE標記的PBMC或單核細胞或單核細胞來源的巨噬細胞(紅色)。剩餘的靶細胞被定義為PKH2+/RPE-雙重標記的細胞(PKH2+/RPE-)，它們被認為代表被PBMC或單核細胞或單核細胞來源的巨噬細胞吞噬的靶。利用下列等式計算靶細胞的吞噬：吞噬百分比＝100×[(雙陽性百分比)/(雙陽性百分比+剩餘靶百分比)]。所有試驗通常一式雙份或一式三份，結果表示為平均值6SD。凋亡活性優選用確定染色的細胞或死亡細胞的標準方法來測量。為了測量壞死和凋亡，也可以應用細胞毒分析。這些試驗可以是測量細胞膜通透性的放射性和非放射性試驗，因為染色的細胞變得容易滲漏，或可以是測量線粒體代謝活性下降的比色試驗；死細胞中的線粒體不能代謝染料，活細胞中的線粒體能。也可以測定凋亡的早期指標，如細胞群體或單個細胞中的DNA片段化(其中凋亡的DNA斷成不同長度的片段)，膜不對稱性的改變(基於磷脂醯絲氨酸和膜聯蛋白V的試驗)，測量凋亡性caspases的活化，或測量線粒體釋放細胞色素C和AIF到胞漿中的情況。本發明的模塊抗體優選的細胞毒活性相當於，在相應的回體(exvivo)細胞裂解試驗中測得的胞解活性的至少20％。優選地，本發明的模塊抗體的細胞毒活性是，在基於細胞的試驗中，以EC50<10-8M，優選在納摩爾範圍或更低範圍，介導細胞裂解或細胞殺傷的活性。本發明模塊抗體的效應子功能優選是生物學細胞毒活性，其通常不同於任意合成的細胞毒活性，例如通過可以與免疫球蛋白結構偶聯的毒素帶來的活性。毒素通常不活化效應分子和生物學防禦機制。因此，本發明模塊抗體優選的細胞毒活性是生物學細胞毒活性(通常是免疫刺激性)，導致有效的細胞裂解。細胞毒活性進一步與簡單的細胞抑制效應區分，在後者中，物質通過例如下列機制來抑制細胞生長：與生長因子受體結合，由此阻斷生長因子的功能；或者抑制血管新生。細胞毒活性基本上被認為是主動攻擊以殺滅細胞，因此導致細胞死亡或裂解，故而被認為是高效率地快速減少惡性細胞或被感染的細胞的數量的方法。與細胞毒化合物相比，細胞生長抑制劑不會馬上殺死細胞，僅僅是減少細胞生長和增殖，因此被認為對於治療目的而言作用較小。本發明的模塊抗體可以特異性結合任何種類的結合分子或結構，尤其是抗原，蛋白性質的分子，蛋白，肽，多肽，核酸，聚糖，碳水化合物，脂質，有機分子，尤其是小有機分子，無機分子，或其組合或融合物，包括PEG，前體藥物或藥物。本發明優選的模塊抗體可以包括至少兩個環或環區，從而每一環或環區可以特異性結合不同的分子或表位。優選靶抗原選自細胞表面抗原，包括受體，尤其是選自erbB受體酪氨酸激酶(諸如EGFR,HER2,HER3和HER4，尤其是這類受體胞外結構域的那些表位，例如4D5表位)，TNF受體超家族的分子，諸如Apo-1受體,TNFR1,TNFR2,神經生長因子受體NGFR,CD40,T細胞表面分子,T細胞受體,T細胞抗原OX40,TACI受體,BCMA,Apo-3,DR4,DR5,DR6,誘餌受體,諸如DcR1,DcR2,CAR1,HVEM,GITR,ZTNFR-5,NTR-1,TNFL1但不限於這些分子,B細胞表面抗原,諸如CD10,CD19,CD20,CD21,CD22,實體瘤或血液學癌細胞的抗原或標記物，淋巴瘤或白血病的細胞，其它血細胞包括血小板，但不限於這些分子。根據另一優選實施方案，靶抗原選自由諸如上皮細胞，實體瘤細胞，被感染的細胞，血細胞，抗原呈遞細胞和單核細胞等細胞呈遞的抗原。由細胞表達或過表達的靶抗原是優選的靶，其選自腫瘤相關抗原，尤其是EpCAM,腫瘤相關糖蛋白-72(TAG-72),腫瘤相關抗原CA125,前列腺特異性膜抗原(PSMA),高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA),表達LewisY相關碳水化合物的腫瘤相關抗原,癌胚抗原(CEA),CEACAM5,HMFGPEM,粘蛋白MUCl,MUC18和細胞角蛋白腫瘤相關抗原,細菌抗原,病毒抗原,變應原,變態反應相關分子IgE,cKIT和Fc-epsilon-受體1,Irp60,IL-5受體,CCR3,紅細胞受體(CRl),人血清白蛋白,小鼠血清白蛋白,大鼠血清白蛋白,Fc受體,例如新生兒Fc-gamma-受體FcRn,Fc-gamma-受體Fc-gammaRI,Fc-gamma-RII,Fc-gammaRIII,Fc-alpha-受體,Fc-epsilon-受體,螢光素,溶菌酶,toll樣受體9,紅細胞生成素,CD2,CD3,CD3E,CD4,CD11,CD11a,CD14,CD16,CD18,CD19,CD20,CD22,CD23,CD25,CD28,CD29,CD30,CD32,CD33(p67蛋白),CD38,CD40,CD40L,CD52,CD54,CD56,CD64,CD80,CD147,GD3,IL-1,IL-1R,IL-2,IL-2R,IL-4,IL-5,IL-6,IL-6R,IL-8,IL-12,IL-15,IL-17,IL-18,IL-23,LIF,OSM,幹擾素alpha,幹擾素beta,幹擾素gamma；TNF-alpha,TNFbeta2,TNFalpha,TNFalphabeta,TNF-R1,TNF-RII,FasL,CD27L,CD30L,4-1BBL,TRAIL,RANKL,TWEAK,APRIL,BAFF,LIGHT,VEGl,OX40L,TRAIL受體-1,Al腺苷受體,淋巴細胞毒素Beta受體,TACI,BAFF-R,EPO；LFA-3,ICAM-1,ICAM-3,整聯蛋白beta1,整聯蛋白beta2,整聯蛋白alpha4/beta7,整聯蛋白alpha2,整聯蛋白alpha3,整聯蛋白alpha4,整聯蛋白alpha5,整聯蛋白alpha6,整聯蛋白alphav,alphaVbeta3整聯蛋白,FGFR-3,角質細胞生長因子,GM-CSF,M-CSF,RANKL,VLA-1,VLA-4,L-選擇蛋白,抗-Id,E-選擇蛋白,HLA,HLA-DR,CTLA-4,T細胞受體,B7-1,B7-2,VNR整聯蛋白,TGFbeta1,TGFbeta2,eotaxinl,BLyS(B-淋巴細胞刺激劑),補體C5,IgE,IgA,IgD,IgM,IgG,因子VII,CBL,NCA90,EGFR(ErbB-1),Her2/neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3),Her4(ErbB4),組織因子,VEGF,VEGFR,內皮縮血管肽(endothelin)受體,VLA-4,碳水化合物諸如血型抗原和相關碳水化合物,Galili-糖基化,胃泌素,胃泌素受體,腫瘤相關碳水化合物,半抗原NP-cap或NIP-cap,T細胞受體alpha/beta,E-選擇蛋白,P-糖蛋白,MRP3,MRP5,穀胱甘肽-S-轉移酶pi(多抗藥性蛋白),alpha-顆粒膜蛋白(GMP)140,地高辛,胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)和睪丸PLAP樣鹼性磷酸酶,運鐵蛋白受體,類肝素酶I,人心臟肌球蛋白,糖蛋白Ilb/IIIa(GPIIb/IIIa),人巨細胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白,HIVgpl20,HCMV,呼吸道合胞病毒RSVF,RSVFFgp,VNR整聯蛋白,HepBgpl20,CMV,gpIIbIIIa,HIVIIIBgpl20V3環,呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp,單純皰疹病毒(HSV)gD糖蛋白,HSVgB糖蛋白,HCMVgB包膜糖蛋白,產氣莢膜梭菌毒素和其片段。本發明優選的模塊抗體以高親和力結合所述靶抗原，特別是以高結合率和/或低解離率，或高的結合親合力。通常，Kd<10-9M的結合劑被認為是高親和力結合劑。根據本發明同樣可以提供Kd低於10-6直至10-9M的中等親和力結合劑，優選與親和力成熟方法聯用。親和力成熟是一種方法，用這種方法可以產生對抗原的親和力增加的抗體。抗體發生結構變化(包括胺基酸誘變，或因免疫球蛋白基因節段發生體細胞突變所致)，導致產生抗原結合位點的變體，選出更大的親和力。親和力成熟的模塊抗體可以顯示比親本抗體大幾個對數級的親和力。單個親本抗體可以進行親和力成熟。備選地，具有相似的靶抗原結合親和力的模塊抗體庫也可以被看作要進行改變的親本結構，以獲得親和力成熟的單個抗體或這類抗體的親和力成熟庫。本發明模塊抗體優選的親和力成熟變體顯示結合親和力至少增加10倍，優選至少增加100倍。親和力成熟可以在利用相應的親代分子庫進行篩選的過程中使用，所述篩選利用中等結合親和力的模塊抗體來獲得具有Kd<10-8M的特異性靶結合性和/或IC50<10-8M功效的本發明模塊抗體。可選的，結合功效或親和力可以通過本發明模塊抗體的親和力成熟進一步增加，以獲得與低於10-9M的Kd或IC50對應的高值，優選低於10-10M或甚至低於10-11M，最優選在皮摩範圍。IC50亦稱EC50或50％飽和濃度，是度量模塊抗體結合功效的測量值。它是在平衡或飽和條件下，產生50％最大可能結合的結合劑摩爾濃度。拮抗劑的功效通常由其IC50值定義(此處理解為EC50值)。對於指定拮抗劑來說，這可以通過確定引發最大結合的半飽和水平所需拮抗劑濃度來計算。闡明IC50或EC50值有利於比較具有類似效應的抗體或抗體變體的功效，尤其當在飽和結合試驗而非競爭試驗中測定時。在這種情況中，它被當作濃度來考慮，其在體內(invivo)測定胞漿濃度，以獲得半最大(50％)效應。IC50或EC50越低，模塊抗體的功效越高，抑制最大生物反應(例如效應子功能或細胞毒活性)所需的抗體濃度越低。抗體濃度更低還可能與更少的副作用有關。抗體的親和力通常以抗體濃度表徵，在該濃度，半數抗原結合位點被佔據，該濃度稱為解離常數(Kd,或KD)。抗體的親和力在飽和結合試驗中測定時，通常與IC50很好地關聯。拮抗劑對其結合位點的親和力(Ki)，被理解為其結合受體的能力，這決定了結合的持續時間和相應激動劑的活性。利用親和力成熟來增加親和力的措施常常也增加結合功效，導致在相同的Kd值範圍內，IC50值相應降低。可以利用本領域公知的飽和結合試驗測定IC50和Kd值。與競爭試驗相反，飽和結合試驗提供出不依賴於競爭劑濃度的值，因此是可比的值，其可能指示體內結合親和力。本發明的模塊抗體優選與標記或報告分子偶聯，所述標記或報告分子選自有機分子，酶標記，放射性標記，有色標記，螢光標記，生色標記，發光標記，半抗原，地高辛配基，生物素，金屬複合物，金屬，膠體金和其混合物。與標記或報告分子偶聯的修飾型免疫球蛋白可以在例如分析系統或診斷方法中使用。本發明的模塊抗體可以與允許在例如結合試驗(例如ELISA)和結合研究中簡單地檢測所述偶聯物的其它分子偶聯。在優選實施方案中，抗體變體利用一種或多種基於細胞的試驗或體內試驗來篩選。為進行這類試驗，通常外源添加純化或未純化的修飾型免疫球蛋白，使細胞暴露於一個個的免疫球蛋白或屬於文庫的免疫球蛋白群體。這些試驗通常是，但不總是，基於免疫球蛋白的功能；即，抗體結合其靶並介導一些生化事件的能力，例如效應子功能，配體/受體結合抑制，凋亡，等等。這類試驗常涉及，監測細胞對抗體的應答，例如細胞存活，細胞死亡，細胞形態學的變化，或轉錄活化諸如天然基因或報告基因的細胞表達。例如，這類試驗可以測量抗體變體引發ADCC，ADCP，CDC或凋亡的能力。對於一些試驗來說，除了靶細胞之外，可能需要添加其它細胞或組分，例如血清補體，或效應子細胞諸如外周血單核細胞(PBMCs)，NK細胞，巨噬細胞，等等。所述其它細胞可以來自任何生物，優選人，小鼠，大鼠，兔，和猴。模塊抗體可以引起表達所述靶的一些細胞系的凋亡，或它們可以介導已經添加到試驗中的免疫細胞對靶細胞的攻擊。監測細胞死亡或活力的方法是本領域已知的，包括染料，免疫化學製品，細胞化學製品，和放射性試劑的使用。例如，caspase染色試驗可能能檢測凋亡，放射性底物或螢光染料諸如alamarblue的攝取或釋放可能能監測細胞生長或活化。在優選實施方案中，可以使用基於DELFIARTEuTDA的細胞毒性試驗(PerkinElmer,MA)。備選地，死亡或損壞的靶細胞可通過測量一種或多種天然胞內成分例如乳酸脫氫酶的釋放來監測。轉錄活化也可以作為基於細胞的試驗中分析功能的方法。在這種情況下，應答可以通過分析可能被上調的天然基因或免疫球蛋白來監測，例如可以檢測一些白細胞介素的釋放，或經由報告子構建體來獲得結果。基於細胞的試驗還可以涉及檢測細胞的形態改變，作為對模塊抗體的存在的應答。這類試驗所用的細胞可以是原核或真核類型，本領域已知的多種細胞系都可以使用。備選地，基於細胞的篩選用已被編碼變體的核酸轉化或轉染的細胞進行。也就是說，抗體變體不從外源添加給細胞。例如，在一個實施方案中，基於細胞的篩選利用細胞表面展示。可以使用能在細胞表面展示修飾的免疫球蛋白的融合伴侶(Wittrup,2001,CurrOpinBiotechnol,12:395-399)。在優選實施方案中，模塊抗體的免疫原性可利用一種或多種基於細胞的試驗來確定。在優選實施方案中，使用回體T細胞活化試驗定量免疫原性。在該方法中，來自匹配供體的抗原呈遞細胞和初始化(naive)T細胞用目標肽或完整抗體攻擊一次或多次。然後，T細胞活化可以用多種方法檢測，例如通過監測細胞因子的生成，或檢測氚化胸苷的攝取。在最優選實施方案中，幹擾素gamma的生成用Elispot試驗監測。本發明模塊抗體的生物學特性可以在細胞、組織和完整生物的實驗中回體表徵。本領域已知，藥物常常在包括但不限於小鼠，大鼠，兔，狗，貓，豬，和猴等的動物體內測試，以便檢測藥物治療疾病或疾病模型的功效，或檢測藥物的藥代動力學，藥效學，毒性和其它特性。所述動物可以被稱為疾病模型。治療劑經常在小鼠中檢驗，所述小鼠包括但不限於裸鼠，SCID小鼠，異種移植小鼠，和轉基因小鼠(包括敲入(knockins)和敲出(knockouts))。這種實驗可提供有價值的數據用於確定具有合適半衰期，效應物功能，凋亡活性，細胞毒或溶胞活性的用做治療劑的抗體的潛力。任何生物，優選哺乳動物，可用於測試。例如，靈長類動物、猴因與人類遺傳相似，可以作為合適的治療模型，並因此可以用於測試本發明模塊抗體的功效，毒性，藥代動力學，藥效學，半衰期，或其它特性。最終需要所述物質在人體中的試驗來獲批藥物，因此這些實驗當然也在考慮範圍內。因此，本發明的模塊抗體可以在人體中試驗，以確定它們的治療效力，毒性，免疫原性，藥代動力學，和/或其它臨床特性。尤其那些與單個細胞或細胞複合物通過至少兩個結合基元結合(優選結合至少三個結構交聯的靶細胞)的本發明模塊抗體，被認為一旦進行細胞靶向和交聯，就具有效應物活性或前凋亡或凋亡活性。多價結合提供了結合伴侶的相對較大結合(也稱為交聯)，這是凋亡和細胞死亡的先決條件。本發明的模塊抗體可用於廣泛多種抗體產物。在一個實施方案中，本發明的模塊抗體用於治療或預防，例如作為主動或被動免疫療法，用於製備、工業或分析用途，作為診斷劑、工業化合物或研究試劑，優選作為治療劑。模塊抗體可用於單克隆或多克隆的抗體組合物。在優選實施方案中，本發明的模塊抗體用於捕獲或殺傷載有靶抗原的靶細胞，例如癌細胞。在備選實施方案中，本發明的模塊抗體用於阻斷，拮抗，或刺激靶抗原，例如通過拮抗細胞因子或細胞因子受體來實現。在另一優選實施方案中，本發明的模塊抗體用於阻斷，拮抗，或刺激生長因子或生長因子受體，從而介導對載有或需要靶抗原的靶細胞的殺傷。在另一優選實施方案中，本發明的模塊抗體用於阻斷，拮抗，或刺激酶和酶的底物。在優選實施方案中，給患者施用模塊抗體以治療特定病症。用於本發明目的的「患者」包括人和其它動物，優選哺乳動物，最優選人。本文「特定病症」表示可以通過施用含本發明修飾的免疫球蛋白的藥物組合物而改善的病症。在一個實施方案中，本發明的模塊抗體是唯一給患者施用的治療活性劑。備選地，本發明的模塊抗體施用時組合了一種或多種其它治療劑，包括但不限於細胞毒性劑，化療劑，細胞因子，生長抑制劑，抗激素劑，激酶抑制劑，抗血管生成劑，心臟保護劑，或其它治療劑。模塊抗體可以與一種或多種其它治療方案相伴施用。例如，本發明的模塊抗體可以與化療，放療，或化療加放療一起給患者施用。在一個實施方案中，本發明的模塊抗體可以與一種或多種抗體聯合施用，後者包含或不含本發明的模塊抗體。根據本發明的另一實施方案，本發明的模塊抗體和一種或多種其它抗癌療法被用於回體治療癌細胞。本發明考慮，這種回體治療可用於骨髓移植，尤其是自體骨髓移植。當然也考慮，本發明的抗體可與其它治療技術諸如手術聯合使用。我們發現，多種其它治療劑可與本發明的模塊抗體一起施用。在一個實施方案中，所述模塊抗體與抗血管生成劑一起施用，後者是阻斷或在一定程度上幹擾血管發育的化合物。抗血管生成因子可以是，例如，小分子或蛋白，例如抗體，Fc融合分子，或細胞因子，它們結合參與促進血管發生的生長因子或生長因子受體。本文優選的抗血管生成因子是結合血管內皮生長因子(VEGF)的抗體。在備選實施方案中，所述模塊抗體與誘導或增強獲得性免疫應答的治療劑(例如靶向CTLA-4的抗體)一起施用。在備選實施方案中，修飾的免疫球蛋白與酪氨酸激酶抑制劑一起施用，後者是在一定程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在備選實施方案中，本發明的模塊抗體與細胞因子一起施用。本文使用的「細胞因子」是，一個細胞群體作用於另一細胞而釋放的作為細胞間介質的蛋白的總稱，包括趨化因子。藥物組合物也包括在內，其中本發明的模塊抗體與一種或多種治療活性劑一起配製。通過將具有所需純度的所述免疫球蛋白與可選的可藥用載體、賦形劑或穩定劑混合，形成凍幹配製劑或水溶液的形式，可以製得用於保存的本發明模塊抗體的穩定配製劑。用於體內施用的配製劑優選是無菌的。這可通過濾過除菌膜或其它方法輕易地實現。本文公開的模塊抗體和其它治療活性劑還可以配製為免疫脂質體，和/或包裹在微膠囊中。含本發明模塊抗體的藥物組合物，優選無菌水溶液，可以通過多種方式施用，包括但不限於，口服，皮下，靜脈內，鼻內，光內(intraotically)，經皮膚，黏膜，表面局部(topically)(如，凝膠，油膏劑(salve)，洗劑，霜劑，等等)，腹腔內，肌肉，肺內(例如，購自Aradigm的AERxTM可吸入技術，或購自InhaleTherapeutics的InhanceTM肺遞送系統)，陰道，腸胃外，直腸，或眼內。本發明優選的方法涉及對模塊抗體通過誘變進行修飾，以獲得新的結合位點。優選的誘變涉及隨機化技術，其中，肽或多肽的胺基酸序列在至少一個位置被突變，由此獲得隨機化序列，其介導抗原結合。例如，特異性抗體序列被隨機修飾，以獲得編碼免疫球蛋白、免疫球蛋白結構域或其部分的核酸分子，其包含至少一個核苷酸重複單元，優選在結構環編碼區內或在末端區域內，具有序列5'-NNS-3'，5'-NNN-3'，5'-NNB-3'或5'-NNK-3'。在一些實施方案中，修飾的核酸包含選自以下的核苷酸密碼子：TMT,WMT,BMT,RMC,RMG,MRT,SRC,KMT,RST,YMT,MKC,RSA,RRC,NNK,NNN,NNS或其任意組合(根據IUPAC進行編碼)。核酸分子的修飾可以是，向大核酸節段中引入合成的寡核苷酸，或從頭合成(denovo)完整核酸分子。核酸的合成可以用三核苷酸結構單元進行，其在編碼胺基酸子集時，減少無義序列組合的數目(例如Yanezetal.NucleicAcidsRes.(2004)32:e158；Virnekasetal.NucleicAcidsRes.(1994)22:5600-5607)。本發明另一重要方面是，每個潛在的結合結構域與編碼它的具體DNA或RNA分子保持物理結合，而且，融合蛋白在基因包的表面寡聚，以呈遞天然的功能性寡聚結構的結合多肽。一旦鑑定出成功結合的結構域，可以很容易地獲得基因用於表達、重組或進一步的工程化目的。這種結合採取的形式是「複製型基因包」，諸如病毒、細胞或孢子，它們複製並表達編碼結合結構域的基因，然後將結合結構域輸送到其外表面。另一形式是體外複製型基因包，諸如將編碼RNA與翻譯出的蛋白相連的核糖體。在核糖體展示中，遺傳物質通過聚合酶的酶促擴增進行複製。載有識別靶分子的結合劑的那些細胞或病毒核酸被分離和，必要時，被擴增。基因包優選是M13噬菌體，且所述蛋白包括M13基因III蛋白的外表面運輸信號。用於融合蛋白的優選表達系統是非抑制者宿主細胞，其對終止密碼子(諸如琥珀終止密碼子)敏感，並因此終止翻譯。在缺乏這類終止密碼子時，優選使用這類非抑制者宿主細胞，優選大腸桿菌。在存在這類終止密碼子時，將使用抑制者宿主細胞。優選在本發明的方法中，基因包的載體或質粒受轉錄調控元件的嚴密控制，培養條件經過調整以使得那些在顆粒表面展示少於兩個拷貝的融合蛋白的載體或噬菌粒顆粒的量或數低於約20％。更優選，那些展示少於兩個拷貝的融合蛋白的載體或噬菌粒顆粒的量，是那些展示一個或多個拷貝的融合蛋白的顆粒的量的10％以下。最優選所述量低於1％。本發明優選使用的表達載體優選能表達結合多肽，且可以如下產生：首先，引入多個編碼不同結合序列的多核苷酸，以合成結合多肽的基因文庫。可以合成合適量的多個多核苷酸，將它們以可操作的組合方式連接至載體中，通過載體擴增來表達所述結合多肽的融合蛋白。備選地，可通過聚合酶鏈式反應擴增多個多核苷酸，以獲得足夠的材料用於表達。但是，這只在結合多肽由大的多核苷酸序列(例如200個以上的鹼基對，或有時300個以上的鹼基對)編碼的情況下才是有利的。因此，優選形成多樣性合成文庫，使得可以從所述多樣性文庫選出至少一種能產生具有所需預選功能和結合性(諸如特異性)的結合多肽的表達載體。隨機改造的核酸分子可以包括上述鑑定的重複單位，其編碼所有已知天然存在的胺基酸或其子集。包含修飾序列的那些文庫(其中特定胺基酸子集被用於修飾目的)被稱為「集中型」文庫。這類文庫的成員在修飾位置具有這類子集的胺基酸的概率增加，比正常高至少兩倍，優選高至少3倍或甚至至少4倍。這類文庫還具有受限或更少數目的文庫成員，使得文庫成員的實際數目達到文庫成員的理論數目。一些情況下，集中型文庫的文庫成員數目是理論數目的103倍以上，優選不低於102倍，最優選不低於10倍。本發明的文庫通常包含至少10個融合蛋白或潛在結合劑或支架蛋白變體，優選至少100個，更優選至少1000個，更優選至少104個，更優選至少105個，更優選至少106個，更優選至少107個，更優選至少108個，更優選至少109個，更優選至少1010個，更優選至少1011個，最多1012個，在體外展示方法，如核糖體展示方法中，甚至更高的數目也是可達到的。在製備編碼隨機化文庫的基因方面存在多種選擇。有可能通過完全合成的方法產生DNA，其中的序列被分成重疊的片段，它們隨後被製成合成的寡核苷酸。將這些寡核苷酸混合在一起，先加熱到約100℃，再緩慢冷卻到室溫，從而彼此退火。在該退火步驟後，合成組裝的基因可以被直接克隆，或在克隆前先通過PCR擴增。備選地，可以用其它定點誘變的方法產生文庫插入物，諸如Kunkel法(KunkelTA.Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection.ProcNatlAcadSciUSA.1985Jan；82(2):488-92)或DpnI法(WeinerMP,CostaGL,SchoettlinW,ClineJ,MathurE,BauerJC.Site-directedmutagenesisofdouble-strandedDNAbythepolymerasechainreaction.Gene.1994Dec30；151(1-2):119-23.)。對於各種目的來說，將沉默突變導入編碼文庫插入物的序列中是有利的。例如，可以導入限制性酶切位點，這有利於所述序列多個部分的克隆或模塊交換。導入沉默突變的另一實例是「標記」文庫的能力，這意味著在所選位置給予它們特定的密碼子，允許它們(或從它們衍生的所選克隆)在例如後續多個步驟期間被識別，在這些步驟中，例如具有不同特徵的不同文庫可以混合在一起，用做淘選過程中的混合物。本發明還提供一種產生與靶結合的模塊抗體結構域的寡聚體的方法，包括以下步驟：-提供按本發明方法製備的模塊抗體結構域的寡聚體的文庫-在有支架配體存在的條件下，將所述文庫與所述靶接觸-選出在有支架配體存在的條件下與所述靶結合的文庫成員，和-生產所述功能性寡聚體的製品。支架配體可以選自效應分子、FcRn、蛋白A、蛋白G、蛋白L和CDR靶。舉例來說，效應分子可以選自CD64，CD32，CD16，Fc受體。寡聚體可以是選自VH/VL，CH1/CL，CH2/CH2，CH3/CH3，Fc和Fab的二聚體，或其單鏈。本發明的方法可以提供含至少102個獨立克隆的文庫，所述獨立克隆表達模塊抗體結構域或其變體的功能性寡聚體。本發明還提供預選的獨立克隆的群體，其是例如親和力成熟的，所述群體優選含至少10個，更優選至少100個，更優選至少1000個，更優選至少10000個，還更優選至少100000個獨立克隆。這些含有預選的群體的文庫是選出本發明的高親和力模塊抗體的優選來源。本發明使用的文庫優選包含至少102個文庫成員，更優選至少103個，更優選至少104個，更優選至少105個，更優選至少106個文庫成員，更優選至少107個，更優選至少108個，更優選至少109個，更優選至少1010個，更優選至少1011個，最多1012個文庫成員，它們優選源自親代分子(指功能性模塊抗體，被當作了含至少一種特定功能或結合模塊的支架)，和其衍生物，以便在所述親本模塊的原始功能性結合區以外造出新的結合位點。通常本發明的文庫還包含由誘變或隨機化技術產生的模塊抗體的變體。這些變體包括無活性或無功能的抗體。因此，優選用合適的試驗篩選任意這類文庫以確定功能性效應。本發明優選的文庫包含至少102個模塊抗體的變體，更優選至少103個，更優選至少104個，更優選至少105個，更優選至少106個，更優選至少107個，更優選至少108個，更優選至少109個，更優選至少1010個，更優選至少1011個，最多1012個變體或更多，以提供抗體的高度多樣化多成員庫，用於篩選最適合的結合劑。任何這類合成文庫都可以用本文公開的誘變方法產生。優選的文庫是酵母文庫，酵母宿主細胞在細胞表面顯示具有生物活性的寡聚體。酵母宿主細胞優選選自糖酵母屬(Saccharomyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，漢遜氏酵母屬(Hansenula)，裂殖酵母屬(Schizisaccharomyces)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，耶羅威亞酵母屬(Yarrowia)和假絲酵母屬(Candida)。最優選，宿主細胞是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。本發明還提供含至少102個獨立克隆的高質量文庫，所述克隆是模塊抗體結構域或其變體的功能性二聚體的獨立克隆，或提供優化的或預選的克隆(如親和力成熟克隆)的群體，所述群體含至少10個與靶結合併與支架配體結合的獨立克隆。靶可以是與經受胺基酸變異的親代分子結合的配體。親代分子可以是功能性寡聚體，尤其是功能性Fc或功能性Fab或其部分。文庫可以包含與靶結合併與支架配體結合的模塊抗體結構域的功能性二聚體，且至少20％，優選至少30％，更優選至少40％的功能性二聚體與CD64結合。這對於包含CH2結構域的模塊抗體如Fc支架是尤其優選的。備選地，文庫可以包含與靶結合併與支架配體結合的模塊抗體結構域的功能性二聚體，且至少20％，優選至少30％，更優選至少40％的功能性二聚體與蛋白A結合。這對於包含CH2和CH3結構域的模塊抗體如Fc支架是尤其優選的。備選地，文庫可以包含與靶結合併與支架配體結合的模塊抗體結構域的功能性二聚體，且至少20％，優選至少30％，更優選至少40％的功能性二聚體與相同的CDR靶結合。這對於包含可變區的模塊抗體，如對單個CDR靶具有特異性的Fab支架，是尤其優選的。本領域公知，有多種展示和選擇技術可用於鑑定和分離具有某些結合特徵和親和力的蛋白，包括，例如，展示技術，諸如細胞的和非細胞的展示技術，尤其是移動展示系統。在眾多細胞系統中，可以使用噬菌體展示，病毒展示，酵母或其它真核細胞展示，諸如哺乳動物或昆蟲細胞展示。移動系統涉及可溶形式的展示系統，諸如體外展示系統，其中包括核糖體展示、mRNA展示或核酸展示。用於產生和篩選抗體變體的方法是本領域公知的。抗體分子生物學、表達、純化和篩選的一般方法參見AntibodyEngineering,編輯Duebel&Kontermann,Springer-Verlag,Heidelberg,2001；Hayhurst&Georgiou,2001,CurrOpinChemBiol5:683-689；Maynard&Georgiou,2000,AnnuRevBiomedEng2:339-76。本發明的文庫可以被設計為專用文庫(dedicatedlibrary)，其包含至少50％的特異性形式，優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，或主要由特異性抗體形式組成的那些。特異性抗體形式是優選，使得本發明優選的文庫選自VH文庫，VHH文庫，Vkappa文庫，Vlambda文庫，Fab文庫，CH1/CL文庫，Fc文庫和CH3文庫。以包含超過一個抗體結構域的混合分子內容物為特徵的文庫(諸如IgG文庫或Fc文庫)是特別優選的。其它優選的文庫是，含T細胞受體(形成T細胞受體文庫)的那些文庫。進一步優選的文庫是表位文庫，其中融合蛋白包括具有表位變體的分子，也使得能篩選具有相似結合能力、但功能不同的競爭性分子。實例是TNFalpha文庫，其中TNFalpha融合蛋白的三聚體由單個基因包展示。以上描述參照下列實施例將更全面的理解。但是，這類實施例僅僅是代表實施本發明一種或多種實施方案的方法，不應被理解為限制本發明的範圍。實施例實施例1：構建非集中的Fcab文庫(Fcab01)並在噬菌體表面展示IgG1Fc片段的晶體結構在BrookhavenDatabase的登錄號為1OQO.pdb，用該結構輔助設計所述Fcab文庫。用作構建Fcab文庫的基礎是SEQIDNo.1所示序列。在該序列中，第一個胺基酸對應於人IgG1的Glu216(EU編號，依據IMGT資料庫(http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html；lookup20070625)，它是人IgG1鉸鏈區恆定重鏈(E)PKSCDKTHTCPPCP)的第一個殘基)。SEQIDNo.1的倒數第二個殘基對應於人IgG1的Gly446(EU編號；IMGT：人IgG1CH3結構域第129位殘基)。詳細分析了1oqo.pdb的結構，並目測觀察了形成連接beta鏈的環的殘基之後，決定將連接beta鏈E-F的環上的殘基144,145和146、以及連接beta鏈SEQIDNo.1的環上的殘基198,199,200,203和204隨機化。除了這些突變的殘基，另有5個殘基插入到SEQIDNo.1的第198位殘基處。在SEQIDNo.2中，給出了文庫Fcab01的文庫插入節段的序列，所有隨機化的殘基位置、以及5個插入的殘基都用字母X表示。通過用簡併引物進行一系列PCR、再連接這些PCR產生，產生所述工程化改造的基因。為便於連接，編碼SEQIDNo.1的核苷酸序列中一些密碼子在不改變胺基酸序列的情況下被修飾(沉默突變)，以產生限制性位點。為了將克隆載體pHEN1(NucleicAcidsRes.1991Aug11；19(15):4133-7.Multi-subunitproteinsonthesurfaceoffilamentousphage:methodologiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchains.HoogenboomHR,GriffithsAD,JohnsonKS,ChiswellDJ,HudsonP,WinterG.)與pelB分泌信號插入在一個讀碼框內，在pelB分泌信號3』附近用到了NcoI限制性位點。為了進行殘基隨機化，選用密碼子NNS(IUPAC編碼，其中S表示核苷酸C和G)，其編碼所有20個天然胺基酸，但棄用3個終止密碼子中的2個。其它密碼子例如NNB(B表示核苷酸T,C和G)也可以採用。經改造的核苷酸序列見SEQIDNo.3。該序列也包括用於克隆到噬菌體展示載體pHEN1中的限制性位點，即5』端的NcoI位點和3』端的位點。用於裝配突變的CH3結構域的PCR引物序列見SEQIDNo.4至SEQIDNo.9。SEQIDNo.4(PCR引物EPKSNCO)ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactcSEQIDNo.5(PCR引物CH3LSAC)agtcgagctcgtcacgggatgggggcagggSEQIDNo.6(PCR引物CH3CSAC)gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctggSEQIDNo.7(PCR引物CH3CHIN)tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccgSEQIDNo.8(PCR引物CH3RHIN)tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccgSEQIDNo.9(PCR引物CH3RNOT)agttgcggccgctttacccggagacagggagag圖1圖示用於裝配突變的基因的PCR片段，及其所用的的引物。用人單克隆抗體3D6(FelgenhauerM,KohlJ,RükerF.NucleotidesequencesofthecDNAsencodingtheV-regionsofH-andL-chainsofa人mono-clonalantibodyspecifictoHIV-1-gp41.NucleicAcidsRes.1990Aug25；18(16):4927.)重鏈cDNA作模板進行PCR反應。3種PCR產物分別用SacI和/或HindIII消化，連接在一起。該連接產物進一步用NcoI和NotI消化，連接到用於表面展示的已先用NcoI和NotI消化的噬菌粒載體pHEN1中。然後，將該連接產物經電穿孔轉化到大腸桿菌(E.coli)中。多個選出的克隆通過限制性和DNA測序進行監控，發現它們包含預計的插入序列，包括正確插入的隨機化序列。下列噬菌體製備步驟按照標準程序進行。簡言之，連接混合物通過電穿孔轉化到大腸桿菌TG1細胞中。隨後，用輔助噬菌體M13-KO7從大腸桿菌TG1細胞中挽救噬菌體顆粒。然後，用PEG/NaCl，經兩個步驟，從培養上清中沉澱出噬菌體顆粒，將其溶於水，用於通過淘選法進行選擇，或貯存在-80℃。實施例2：構建集中型Fcab文庫(Fcab02)並進行噬菌體展示按實施例1所述製得Fcab文庫，其中的隨機化文庫位置都徹底隨機化，即它們都由諸如NNS,NNB,NNK,NNN等密碼子編碼，或採用其它密碼子。為清楚起見，諸如N,B,S或K等字母的含義由IUPAC核苷酸模糊碼定義，見下表：表1.IUPAC核苷酸模糊碼(nucleotideambiguitycode)來源：Nomenclatureforincompletelyspecifiedbasesinnucleicacidsequences:recommendations1984.ACornish-Bowden,NucleicAcidsRes.1985May10；13(9):3021–3030。上述密碼子被設計為，使所有20種胺基酸都由它們編碼。優選從可能的胺基酸中進一步選子集。實例參見文獻(FellouseFA,LiB,CompaanDM,PedenAA,HymowitzSG,SidhuSS.Molecularrecognitionbyabinarycode.JMolBiol.2005May20；348(5):1153-62.Epub2005Apr1.；FellouseFA,WiesmannC,SidhuSS.Syntheticantibodiesfromafour-amino-acidcode:adominantrolefortyrosineinantigenrecognition.ProcNatlAcadSciUSA.2004Aug24；101(34):12467-72.Epub2004Aug11.)。允許例如只有4種不同胺基酸類型的集中文庫可以通過，例如利用密碼子KMT來構建，該密碼子編碼胺基酸Ser,Tyr,Ala和Asp。按照與實施例1相同的方式、但用NNS密碼子替代KMT密碼子，構建了另一Fcab文庫，命名為Fcab02。因此，為了描述集中文庫Fcab02，這時的字母「X」在SEQIDNo.2中指代「S,Y,A和D」(Ser,Tyr,AlaandAsp)。實施例3：構建噬菌體表面展示文庫，其在文庫插入序列(結合伴侶)和p3之間有額外的胺基酸序列為了研究所展示的蛋白中潛在結合位點的可接近性，進行結合試驗：將噬菌體懸液與抗-mycmAb9E10包被的微滴板(或免疫管)反應。洗後，結合的噬菌體用抗M13-酶偶聯物檢測。作為對照，不展示所述蛋白融合物的輔助噬菌體、以及myc-標籤與所述板反應。其它對照是，噬菌體與未包被的板反應，以及噬菌體與識別噬菌體上的p3–融合伴侶的抗血清反應。理想的情況是，展示p3融合蛋白的噬菌體的抗myc反應性應當給出非常清楚的ELISA讀數，而輔助噬菌體與抗myc-mAb的反應不應高於背景(未包被的板)。CH3二聚體通過與作為錨(anchor)的蛋白III結合而在M13噬菌體表面展示的結構是這樣的，每個CH3利用具有不同長度和組成的接頭錨定到蛋白III。因此，CH3二聚體優選通過兩個錨來展示。接頭優化：當被展示的分子的潛在結合位點在空間上靠近噬菌體顆粒時，位於被展示的蛋白與基因包錨定蛋白(在絲狀噬菌體情況下，例如p3，p8，pX，pIX，pVII)之間的接頭是尤其重要的。在利用了由多個CDR環形成的可變區和抗原結合位點、並將庫成員展示為p3的氨基端融合物的抗體文庫中，潛在的抗原結合位點指向背離噬菌體顆粒的方向。因此，庫成員和噬菌體外殼蛋白之間的接頭結構不太重要。但是改造免疫球蛋白區的底部環和進行噬菌體展示可能是一種低效步驟，降低抗原結合克隆的產率或甚至排斥它。改變庫成員蛋白與其融合伴侶之間位於表面的接頭可以解決或可能至少減少該問題。為了選擇(在長度和柔性以及穩定性方面)最佳的接頭序列，可以製備接頭文庫，在其中將複製型基因包表面的錨定蛋白與因空間原因而出了名地很難選擇的已知結合蛋白融合。這種序列文庫可以在長度和胺基酸含量方面不同。在接頭文庫中選擇最佳接頭的方法取決於用途，但基本上應當是在某一方法學中選出希望具有的所有特性的方法。針對難於選擇的抗原進行的富集可以產生允許庫成員容易地接近該抗原的接頭序列。在蛋白酶溶液中或其它苛刻條件下進行溫育，或者在蛋白水解條件下(例如用老齡的微生物培養物)通過宿主細胞進行頻繁傳代，可以是合適的選擇穩定展示接頭的方法。接頭文庫可通過任何公知的文庫技術產生。合成的接頭序列長度可以為10-500個胺基酸不等。備選的，接頭可以是已知具有柔性的完整蛋白。接頭優化Fcab01：舉例來說，可以使用文庫Fcab01(如實施例1所述)。首先，利用NcoI和NotI限制性酶切位點將該文庫克隆入噬菌粒展示載體pHEN1。當採用這種方式克隆時，18個胺基酸殘基位於Fcab01文庫插入物的C端胺基酸殘基與噬菌體M13p3的N端胺基酸殘基之間。該連接區的序列是SEQIDNo.10SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVES，解釋如下：前4個殘基SPGK是Fcab01文庫插入物的4個C端殘基，然後是胺基酸序列AAA(其是由NotI限制性酶切位點編碼的胺基酸殘基)，然後是序列EQKLISEEDL(其是myc表位)，然後是NGAA，其後是琥珀終止密碼子，該終止密碼子在大腸桿菌的琥珀抑制者菌株諸如TG1中被翻譯為穀氨醯胺(Q)。SEQIDNo.10的C端4個殘基TVES是存在於載體pHEN1中的噬菌體M13p3的N端4個殘基。為了構建噬菌體來展示Fcab插入物、且使Fcab(結合伴侶)與噬菌體(基因包)之間的距離加大，將5個額外殘基插入Fcab插入物FcabRGD4的C端，在緊接NotI克隆位點的上遊，產生克隆FcabRGD4L。FcabRGD4是一種Fcab，其在CH3結構域的EF環中插入了能與整聯蛋白結合的RGD基元，並且在ELISA中結合αvβ3-整聯蛋白。作為長度增加的接頭序列，使用胺基酸序列EGGGS，其在噬菌體M13p3序列中出現8次。所得的FcabRGD4L胺基酸序列在克隆入pHEN1後表達為SEQIDNo.11(圖5)。在SEQIDNo.11中(圖5)，胺基酸殘基198-204代表RGD基元，胺基酸殘基237是Fcab插入物的C端殘基，殘基238-242代表插入的接頭序列(與未修飾的pHEN1不同)，其後是myc標籤、琥珀終止密碼子和p3序列。為了克隆構建體，利用PCR引物EPKSNCO(SEQIDNo.4)和CH3rlinkactagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag(SEQIDNo.13)從pHENFcabRGD4(SEQIDNo.12)擴增FcabRGD4序列，並通過NcoI和NotI限制性酶切位點將其克隆入載體pHEN1。所得載體pHENFcabRGD4L(SEQIDNo.14/圖7)在核苷酸位置3057-3071處具有額外的接頭序列。將兩種噬菌粒載體pHENFcabRGD4和pHENFcabRGD4L轉化入大腸桿菌TG1。隨後，利用輔助噬菌體M13-KO7從大腸桿菌TG1細胞挽救噬菌體顆粒。然後用PEG/NaCl按照2步法從培養上清中沉澱出噬菌體顆粒，將其溶於水中，用於ELISA。如下進行噬菌體ELISA：噬菌體懸液與αvβ3-整聯蛋白包被的微滴板(或免疫管)反應。清洗後，利用抗M13酶偶聯物檢測結合的噬菌體。作為對照，輔助噬菌體(其不展示蛋白融合體和myc-標籤)與這些板、以及表面載有wtFcab的噬菌體顆粒反應。其它對照是，噬菌體與未包被的板反應，以及噬菌體與識別噬菌體上的Fcab融合伴侶的抗血清反應。與pHENFcabRGD4上的具有原始接頭的噬菌體顆粒相比，來自pHENFcabRGD4L的具有加長接頭的噬菌體顆粒更容易與αvβ3-整聯蛋白反應，從而在ELISA中產生更強的信號。噬菌體篩選是可以進行的，其中將具有wtFcab的噬菌體顆粒與少量載有FcabRGD4或FcabRGD4L的噬菌體顆粒混合。在數輪(通常3-5輪)淘選後，優先選出展示FcabRGD4L的噬菌體。實施例4∶FcabTM文庫設計Fcab文庫的設計(見圖2)：考慮對抗體CH3恆定區的非CDR環中的胺基酸位置進行隨機化。尤其考慮環A-B、C-D和E-F，因為它們都位於結構域的一側。對具體位置進行隨機化的一些設計標準在本文描述。頻繁參與抗原抗體相互作用的胺基酸在本文中被描述為包括在集中型文庫中。具有受限的胺基酸應用的文庫已經被證明足以產生實質上抗任何抗原的結合劑(Sidhu&Fellhouse,NATURECHEMICALBIOLOGYVOLUME2page682ff.；KoideetalPNAS,volume104p6632-6637)。這類受限(或集中型)文庫的優點是，它們完全可以用當前的技術手段來實現。理想的是，胺基酸應用反映出配體受體結合的天然胺基酸應用情況。但是，即使只利用2種胺基酸(酪氨酸和絲氨酸)的文庫據報導也得到較好的篩選結果(在抗不同結合劑的結合劑的頻率、以及在親和力方面)。環的柔性(loopflexibility)：支架蛋白可能需要一些環結構以便總體上維持天然結構。在隨機化位置的一側或雙側構建一些序列，有可能促進環中多個胺基酸位置的隨機化，甚至使環延長。這些序列可以是柔性的序列，以便允許彌補這類位置中一些文庫序列的任何張力。表2:集中型和非集中型FcabTM文庫實例Fcab01文庫在以上實施例中描述。集中型文庫設計Fcab02、Fcab04和Fcab06的序列空間被大約10e9的實際細菌文庫大小覆蓋。與此相反，完全隨機化的文庫Fcab01、Fcab03和Fcab05事實上遠遠未能被充分代表。設計酵母中的環隨機化與上述關於Fcab文庫設計和在細菌中產生所述文庫的實施例相似，產生酵母文庫。如表3所示，產生了修飾的AB環、CD環和EF環的各種不同組合。本實施例修飾的AB環是從胺基酸358到362(wt序列「LTKNQ」)，CD環是從胺基酸384到388(wt序列「NGQPE」)，EF環是從413到419(wt序列「DKSRWQQ」)。如前文所述，「X」代表徹底隨機化，「Z」代表集中的設計。被插入的、不出現在wtFc支架中的胺基酸在表3中用括號表示。對於那些未修飾環的文庫，各自的野生型序列在表中用單字母胺基酸代碼表示。由於在大多數的這些文庫中，理論上的組合個數遠遠超過實驗的克隆數，因此，在最後一欄顯示的是獨立的酵母克隆的產生量。表3：集中型和非集中型FcabTM文庫實例，它們具有AB環、CD環和EF環的突變和插入實施例5∶通過同源重組來克隆酵母展示文庫載體用載體pYD1(Invitrogen)作為基礎載體。該載體如下修飾，以除去XhoI位點：pYD1用XhoI切割，再用DNA聚合酶的Klenow片段處理，然後重新連接。所得序列在pYD1dX(SEQIDNo.15/圖8)中給出。pYD1dX在位置921/925包含唯一的BamHI限制性酶切位點，在位置963/967包含唯一的NotI限制性酶切位點。它被這兩種限制性內切酶打開。從編碼人IgG1單克隆抗體重鏈的cDNA通過PCR製備編碼人IgG1CH1-鉸鏈-CH2-CH3的插入物。在該插入物中，利用標準方法引入點突變，以將CH1結構域的C端半胱氨酸殘基突變為絲氨酸。PCR擴增該插入物，所用的引物將BamHI和Not限制性酶切位點分別連接到兩個末端。然後用這些限制性酶切位點將插入物克隆入pYD1dX，得到展示載體pYD1dXFc(SEQIdNo.16/圖9)。CH1結構域C端的突變密碼子(Cys突變為Ser)是位於pYD1DxFc序列中的位置1233-1235。該插入物的終止密碼子是在位置1917/1919。該載體被用作在酵母表面展示人CH1-鉸鏈-CH2-CH3的陽性對照，還被用做構建載體pYD1CH12的起點(見下文)。文庫的克隆CH3結構域的結構環中引入了突變的那些文庫，在酵母中通過同源重組(缺口修補)進行克隆。為此，製備不包含CH3結構域的受體載體：pYD1dXFc用XhoI切割(1603/1607位)並用NotI切割(1921/1925位)，通過製備型凝膠電泳來製備大的片段，然後用DNA聚合酶的Klenow片段處理，再重新連接。該方法重建了唯一的XhoI位點(1603/1607位)，並得到載體PYD1CH12(SEQIDNo.17/圖10)。pYD1CH12隨後用XhoI切割，並被用做酵母中進行缺口修補時的受體載體。備選地，對於表3所列文庫，構建另一種受體載體，其僅包含鉸鏈區、CH1區和CH2區，但缺乏CH1區。在該載體中，通過用BamH1切割(位置：921/926)並用Xho1切割(位置：1603/1608)，除去CH1結構域。取而代之的是，我們導入了經PCR產生的片段，其包含鉸鏈區、CH2結構域和相應的限制酶位點。所得質粒是pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt(SEQIDNo.428)。下一步，我們用Xho1(1309/1314)和Not1(1626/1633)進行消化，除去後一種質粒中的CH3結構域，代之以兩個依次的標籤：V5標籤，後隨His6標籤。該序列通過從pYD1載體進行PCR擴增並用Xho1和Not1限制酶位點進行克隆而得到。最終的質粒是pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt(SEQIDNo.427)，用作文庫受體載體。pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt編碼始於鉸鏈區、止於CH3結構域起點的人IgG1片段。它包含唯一的BamHI(921/926)、Xho1(1309/1314)和NotI限制性位點(1422/1429)。後兩種酶用於通過同源重組引入CH3文庫。載體pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt作為在酵母表面展示人鉸鏈-CH2-CH3的陽性對照，pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt作為構建表3所列文庫的起點。作為pYD1dXFc中插入物的來源，使用Fcab文庫Fcab01(SEQIDNo.18)，Fcab02(SEQIDNo.19)，Fcab03(SEQIDNo.20)，Fcab04(SEQIDNo.21)，Fcab05(SEQIDNo.22)和Fcab06(SEQIDNo.23)。這些文庫通過標準DNA合成法製備，它們在人IgG1CH3結構域的AB環(殘基359和361之間(EU編號))以及EF環(殘基413和419之間(EU編號))中包含隨機化殘基以及插入的殘基。從該合成的DNA出發，通過PCR擴增用於在酵母中進行缺口修補的插入物，所用PCR引物對是：gapch35caacaaggccctgcctgcccccatcgagaagaccatctccaaggccaagggccagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgccc(SEQIDNo.24)和gapfcs3gagaccgaggagagggttagggataggcttaccttcgaagggccctctagactcgatcgagcggccgctcatttacccggagacagggagagctcttc(SEQIDNo.25)。將100μg經XhoI切割的載體pYD1CH12和100μg插入物混合，然後根據下列方案(其按100的係數放大以轉化所需量的細胞和DNA)使用醋酸鋰法轉化糖酵母菌株EBY100(Invitrogen)。簡言之，對於1μg載體DNA和1μg插入DNA的單次轉化來說，用一個酵母菌落接種10mlYPD(2％蛋白腖，2％葡萄糖(D-葡萄糖))，30℃振搖過夜。測定過夜培養物的OD600，用50mlYPD將所述培養物稀釋到OD600為0.4，再培養2-4小時。細胞在2500rpm沉澱，將其重懸於40ml1XTE(10mMTris,pH7.5,1mMEDTA)中。細胞再在2500rpm沉澱，重懸於2ml1MLiAc/0.5XTE中，然後室溫溫育10分鐘。將1μg載體DNA、1μg插入物和100μg變性剪切的鮭精DNA(2mg/ml)與100μl酵母懸液混合。添加700μl1MLiAc/40％PEG-3350/1XTE，將其與酵母/DNA懸液混合，然後在30℃溫育30分鐘。添加88μlDMSO並混合，將混合物在42℃溫育7分鐘，然後在微量離心機中離心10秒。然後去除上清，將細胞沉澱重懸於1ml1XTE中，再次沉澱。然後將沉澱重懸於50-100μlTE中，鋪在含亮氨酸的基本葡萄糖平板上(10g/1酵母氮鹼(yeastnitrogenbase)，20g/1葡萄糖，0.1g/1亮氨酸，15g/1瓊脂)。平板在30℃溫育2-4天後，出現單菌落，隨後收集單菌落。作為載體pYD1dX_dCH1dCH3中插入物的來源，使用表3所列的Fcab文庫。這些文庫通過標準DNA合成法製備，它們在人IgG1CH3結構域的AB環、CD環、以及EF環中包含隨機化殘基以及插入的殘基。從該合成的DNA出發，用寡核苷酸YCH3.25rec.back個YCH3.25rec.opt.for(列在下文中)，通過PCR擴增用於在酵母中進行缺口修補的插入物。基本的轉化混合物包含2μg經XhoI切割的pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt和1μg插入DNA，將它們混合後，用醋酸鋰法轉化到糖酵母菌株EBY100(Invitrogen)中，該方法可以按100的係數放大以得到所需量的轉化子。簡言之，對於2μg載體DNA和1μg插入DNA的單次轉化來說，用一個酵母菌落接種10mlYPD(2％蛋白腖，2％葡萄糖(D-葡萄糖))，30℃振搖過夜。測定過夜培養物的OD600，用50mlYPD將所述培養物稀釋到OD600為0.3，再培養6小時或達到OD600為2.5。細胞在2500rpm沉澱，洗兩次：先用25mL蒸餾水洗，再用100mMLiAc洗；最後重懸於500μl100mMLiAc中。將2μg載體DNA、1μg插入物和100μg變性剪切的鮭精DNA(2mg/ml)與50μl所述酵母在含PEG3500(33％w/v)和100mMLiAc的溶液中混合，最終體積為360μL。充分勻漿後，將酵母在30℃放置30分鐘，然後在42℃放置45分鐘。棄去上清，將細胞沉澱重懸於YPD中，在30℃放置60-90分鐘以使細胞恢復。再將沉澱在選擇培養基(培養板和/或液體，見下文)中30℃保溫2天。根據在培養板上長成菌落的單細胞的數量確定該文庫的多樣性，所述板是在恢復期之後迅速製備並接種得到的。引物列表：a)CH3seqs/2(SEQIDNo.429):5』-AAGGAGTACAAGTGCAAGG-3』b)反向引物：CDmut_back(SEQIDNo.430):5』-GCTCTCCCACTCCACG-3』EFmut_back(SEQIDNo.431):5』-CACGGTGAGCTTGCTGTAGAG-3』ABMUT5/2_back(SEQIDNo.432):5』-CTCATCCCGGGATGGG-3』c)正向引物(X＝用於隨機化的胺基酸的三核苷酸合成)CDmut5cod_for(SEQIDNo.433):5』-GTGGAGTGGGAGAGCXXXXXAACAACTACAAGACCACG-3』EFMUT7cod_for(SEQIDNo.434):5』-AGCAAGCTCACCGTGXXXXXXXGGGAACGTCTTCTCATGC-3』EFMUT3+2_for(SEQIDNo.435):5』-AGCAAGCTCACCGTGXXXAGGTGGXXGGGAACGTCTTCTCATGC-3』ABMUT5(wt)_for(SEQIDNo.436):5』-CCATCCCGGGATGAGXXXXXGTCAGCCTGACCTGCCTGG-3』d)CH3seqAS(SEQIDNo.437):5』-TAGAATCGAGACCGAGG-3』e)YCH3.25rec.opt.for(SEQIDNo.438):5』-ACCATCTCCAAGGCCAAGG-3』f)Ych3.25rec.back(SEQIDNo.439):5』-AAGGGCCCTCTAGACTCG-3』培養-誘導將收穫的酵母文庫(yFcab文庫)接種至10mlSD-CAA培養基(10g/1酵母氮鹼，10g/1酪蛋白胺基酸，和20g/1葡萄糖，0.1g/1亮氨酸，9.67g/1NaH2PO4-2H2O和10.19g/1Na2HPO4·7H2O)，在250rpm的搖床上28℃培養6-8小時。測定培養物的OD600，將培養物稀釋到OD600為0.2，然後在相同條件下培養直至OD600達到1-2。離心(3000rpm/5分鐘/4℃)收穫細胞，將其重懸於誘導培養基SG/R-CAA(10g/1酵母氮鹼，10g/1酪蛋白胺基酸，和20g/1半乳糖，10g/1棉子糖，0.1g/1亮氨酸，9.67g/1Na2HPO4-2H2O和10.19g/1Na2HPO4·7H2O)。培養物通過在250rpm的搖床上20℃溫育2天來誘導，隨後進行分析和分選。備選地，培養物通過在250rpm的搖床上37℃溫育1天來誘導，隨後進行分析和分選。yFcab文庫的質量控制用SD-CAA培養基誘導兩天後，檢測yFcab文庫的表達水平和表達的Fcab's的質量。表達水平用多克隆抗人IgG-Fc抗血清(Sigma)檢測。為此，將0.5×l0e6個文庫細胞稀釋於1ml染色緩衝液(SB)中，所述染色緩衝液包括含2％BSA的PBS。將細胞沉澱，然後用包含1/2000稀釋的抗人IgG-Fc-PE抗血清(Sigma)的l00μlSB在冰上染色30分鐘，用SB清洗兩次，隨後在FACS中進行分析。總體上每個文庫中所有細胞的70％-80％在其細胞表面表達Fcabs。為了驗證Fcabs的正確摺疊，進行蛋白A染色。還是將0.5×l0e6個文庫細胞稀釋於1ml染色緩衝液SB中，將細胞沉澱，用包含1μg/mlProt-A-FITC(Fluka)的l00μlSB在冰上染色30』，用SB清洗兩次，隨後在FACS中進行分析。總體上，如上所述的yFcab文庫顯示≥40％的ProtA(蛋白A)陽性細胞。為了檢驗Fcabs是否在細胞表面表達為二聚體，進行人CD64染色。將5×l0e5個細胞沉澱，用含1μg/mlCD64(R&DSystemns)的50μlSB在冰上染色30min。清洗後，將細胞重懸於含1μg/mlPentaHisAlexaFluor488(QIAgen)的50μlSB中，在冰上再保溫30』。將細胞洗過之後，重懸於200μl冰冷的SB，進行FACS分析。作為對照，將細胞與等量的PentaHisAlexaFluor488一起保溫，但事先不與CD64一起保溫。溫育後，細胞用冰冷的SB洗一次，然後在FACS中進行分析。總體上，每個文庫中所有細胞的>50％在其細胞表面表達二聚化的Fcabs。抗原(Her2)的生物素化重組抗原例如Her2(Bendermedsystems)用Pierce的EZlinksystem按照說明書來製備。簡言之，將所述抗原用PBS透析，然後用PBS稀釋到1mg/ml，再與預先溶於水的10mM硫代-LC-LC-生物素(EZlink,Pierce)混合。抗原與生物素的最終比例是1:3，將混合物在室溫溫育30』。然後利用VivaspinMWCO3000(Sartorius)柱將混合物用PBS「透析」(5×8',4000rpm)。最後通過HPLC檢測生物素化抗原(Her2)的濃度，將其等分保存於-20℃。生物素化抗原的質量用ELISA檢測。平板先用10μg/ml抗-Her2抗體(例如Herceptin)的PBS溶液(100μl/孔)4℃包被過夜，之後平板用清洗緩衝液(WB)(PBS+0.05％Tween20)洗3次，用封閉緩衝液(BB)(PBS+2％BSA)室溫封閉1小時。用WB洗3次後，添加不同濃度的Her2-生物素，100μl/孔BB，室溫1小時，然後用WB洗3次。最後，平板與1:25000鏈黴親和素-HRP(GEhealthcare)的BB溶液室溫溫育1小時，用WB洗3次。添加100μl/孔的底物TMB(Sigma)來顯色，約10分鐘後，添加100μl/孔的30％H2SO4終止反應。結果用ELISA讀數器在450-630nm進行分析。實施例6∶抗原特異性(Her2)Fcabs的產生用FACS篩選抗原特異性(Her2)Fcabs第一輪篩選：在FACSorting前兩天，如上述用SG/R-CAA培養基誘導含2.5×10e8個獨立Fcab克隆的酵母文庫，以在它們的細胞表面表達Fcabs。兩天後，將例如10倍文庫量(＝2.5×l0e9)的細胞與500nM生物素化抗原(Her2)的2mlSB溶液在冰上溫育30』。然後將細胞用冷的SB洗一次，隨後與用SB按1:100稀釋的鏈黴親和素-PE(來自R&Dsystems)在冰上溫育30』。細胞用冰冷的SB洗兩次，然後稀釋到終濃度1×l0e9個細胞/ml。對照染色是，在100μl中，只用鏈黴親和素-PE而不用抗原5×l0e6個細胞/ml進行染色。在例如來自BD的FACSARIA中分析完整文庫和對照染色。為了設置分選的門通條件(gate)，使用所述對照細胞。首先設置FSC/SSC門(G1)來鑑定健康的酵母細胞，從G1製作FSC-寬度對FSC-面積的曲線，在新的門(G2)中只選擇非聚集細胞。G2中的細胞隨後用FSC相對於(versus)FL-2(PE通道)分析其與鏈黴親和素-PE的反應性。G3被設置為包括0.1％的(假)陽性細胞。隨後，至少5×l0e8個被染色的細胞(比文庫規模大兩倍，越大越好)用上述設置進行分析，將G3中的細胞分選至含2-3mlSD-CAA培養基的管中。第一輪篩選收穫到約5×l0e5個細胞(庫1)，使它們增殖1-2天，然後將細胞保存在-80℃，可以取等分試樣，如上述誘導Fcabs表達。再過兩天後，進行下一輪篩選。第二輪篩選：第1輪篩出的庫1如上述誘導Fcab在其表面表達。將至少5×l0e6個細胞(含多個庫1拷貝)與500nM生物素化抗原(Her2)的1mlSB溶液在冰上溫育30』。然後將細胞用冷的SB洗一次，再與用SB按1:100稀釋的鏈黴親和素-PE(來自R&Dsystems)、以及2μg/ml蛋白A-FITC(Fluka)一起，在冰上溫育30分鐘。接著，細胞用冰冷的SB洗兩次，稀釋至終濃度約2×l0e6個細胞/ml。此外，進行對照染色，其中，100μl5×l0e6個細胞/ml的庫1與ProtA(蛋白A)和鏈黴親和素-PE的混合物如上述溫育，但不與抗原(Her2)溫育。此外，在沒有鏈黴親和素-PE的情況下，將100μl表達Fcabwt非隨機化Fc片段的酵母克隆的5×l0e5個細胞如上述用ProtA-FITC染色。表達Fcab-wt的細胞在例如BD的FACSARIA中分析，以便為分選而設門。先設置FSC/SSC門(G1)來鑑定健康的酵母細胞，從G1製作FSC-寬度相對於FSC-面積的曲線，在新的門(G2)中只選擇非聚集細胞。G2中的細胞隨後用FSC相對於FL-1(FITC)來分析蛋白A的表達。G3被設置為囊括ProtA強陽性細胞(親本門的50-60％)，G4被設置為囊括ProtA弱陽性細胞(親本細胞的20-30％)。G3+G4將包括G2中所有細胞的大概70-80％。現在，用不存在ProtA-FITC時被鏈黴親和素-PE染色的庫細胞來設置其餘的分選門。首先用庫細胞檢查G1和G2，在必要時進行調整。庫細胞在G3中具有較少的事件，可能在G4中也如此，提示不是所有庫1中的細胞表達被摺疊為Fcab-wt的Fcabs。使用對照染色的庫細胞，為了G3和G4準備新的門。所述新的門在曲線FSC和FL-2(PE)中設置。製得門(G5)，其包括G3中0.1％的鏈黴親和素(假)陽性細胞，對G4中的細胞進行相同處理，得到G6。在下一步中，至少5×l0e6個進行Her2-生物素+鏈黴親和素-PE和ProtA-FITC染色的細胞通過FACS-ARIA來分選。在包含2-3ml酵母培養基的不同管中收集G5(庫2.1)和G6(庫2.2)的細胞。預期兩個門中都有10到1000個克隆。使兩個新庫增殖1或2天，保存於-80℃。來自2.1和2.2的細胞可用於指導第3輪的進一步分選，或者它們可以(優選在將兩個克隆再次混合後)經歷AB環的另一輪隨機化(親和力成熟)，然後在FACS中被進一步分選。所選克隆/庫的親和力成熟為進行親和力成熟，向所選克隆或所選克隆的庫中引入多樣性，優選僅在一個環中引入，本文是AB環。為此進行PCR，引物是，在第359、360和361位(EU編號)包含簡併密碼子的引物(引物Abmut，gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtcaaag,SEQIDNo.26)，或者是，在第358、359、360、361和362位(EU編號)包含簡併密碼子的引物(引物Abmut2LR，gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag,SEQIDNo.27)。在兩種情況，這些PCR中所用的第二引物是gapfcs3。為了產生側翼序列以便在酵母中進行有效缺口修補，將所得PCR產物用引物對gapch35和gapfsc3進一步擴增，然後與經XhoI切割的pYD1CH12一起，如上述用醋酸鋰法轉化至釀酒酵母菌株EBY100中。作為AB環中所述殘基隨機化時用的備選引物，還可以使用引物諸如Abmut1L(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagectgacctgcctggtcaaag,SEQIDNo.28)或Abmut1R(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag,SEQIDNo.29)。採用類似的方式，可以通過總體隨機化(totalrandomization)，將EF環中的殘基隨機化。備選隨機化用帶刺寡核苷酸(spikedoligonucleotides)作為引物對單個的克隆y-Her.C2.P4.2-9進行。在本例中，所述寡核苷酸的設計與前文對各個環完整隨機化所述的設計類似，但隨機化的部分在密碼子的第一和第二位置包含70％的原始鹼基，另外3種核苷酸每種10％。第三個位置含70％的原始鹼基，30％的依據NNK或NNS密碼子的鹼基。通過完全隨機化，Abmut引物為每個克隆產生8000個新變體(庫2.3)，Abmut2LR引物導致3×l0e6個新變體(庫2.4)。因此，庫2.3和2.4均產生大約10e8個個體的新文庫，因為起始原料(庫2.1+2.2)已經包含大約10-1000個克隆。第三輪篩選親和力成熟庫2.3和2.4以及必要時庫2.1(優選只有ProtA陽性細胞)按上述誘導Fcabs在其細胞表面表達，隨後按照「第二輪篩選」的描述進行分選，例外的是庫2.3和2.4是更大的，因此這些庫的染色體積等於在「第一輪篩選」中描述的文庫染色體積。在第三輪篩選中，只有Her2陽性/ProtA陽性細胞被分選出。從這些選擇過程選出的庫大都包含>20％的Her2/ProtA陽性細胞。若不然，針對Her2+ProtA、或僅針對Her2進行第四和第五(或甚至更多)輪篩選。例如，H242-9Q克隆的親和力成熟使得結合親和力從EC50＝155nM增至18.9nM(H10-03-6克隆)。克隆分析：從含Her2/ProtA細胞(優選>20％)的庫的製備單個的克隆，方法是，將所述庫鋪於含SD-CAA培養基的瓊脂平板上，或不產生庫而將直接來自FACSARIA的單個細胞(＝克隆)點樣在平板上。使這些克隆生長，再將其轉移到液體培養物中，保存於-80℃。隨後，取這些克隆的等分試樣，如上述誘導Fcabs在其細胞表面表達，在FACS中篩選多個參數。這些參數是：在有和無上述ProtA-FITC、CD64染色的情況下，用於篩選的抗原(Her2)的劑量應答範圍。此外，用類似的染色方案，篩出多個無關的生物素化抗原，來鑑定非交叉反應性Fcabs。觀察到，在數輪篩選抗原(Her2)+ProtA陽性細胞後，這些克隆中有較大百分比例當用500nM抗原(Her2)染色時顯示>25％的抗原(Her2)陽性，當用2μg/mlProtA-FITC染色時顯示>70％的ProtA陽性。在大多數情況下，這些克隆還顯示>50％的CD64結合。因此，這反映了表達在酵母中的非隨機化Fc片段(Fcabwt)的ProtA和CD64染色水平。將如上述選出的具有上述特徵的克隆製成可溶性分子。這主要通過FcabDNA瞬時轉染至新的宿主細胞來實現，但也通過FcabDNA穩定轉染至新的宿主細胞來實現。為此，使用標準方法從單個酵母克隆分離DNA。通過PCR擴增相關DNA(編碼完整CH3結構域，或只是CH3結構域的已在文庫中被隨機化的部分)，將其轉移至新表達載體，所述載體包含Fcab缺失部分(missingpart)和合適的啟動子以及多種篩選標記之一如G418(允許從未轉染細胞群體中篩選出轉染細胞)。然後將所述新載體瞬時轉染至新的宿主細胞如HEK293或CHO中。使宿主細胞恢復，然後培養最多10天。含可溶性Fcab的培養上清經ProtA純化後用於進一步的測試。穩定的細胞系也可用標準方法製備。表4.經過庫擴增、並經過親和力成熟之後，從原始文庫選出的Her2結合型酵母克隆的序列：參考SEQIDNo.1(圖3)(CD環：AA169ffNGQPE)的編號表5.經過庫擴增、並經過親和力成熟之後，從原始文庫選出的Her2結合型酵母克隆的序列：參考SEQIDNo.1(圖3)的編號表達並純化哺乳動物細胞中的抗原特異性克隆：將如上述選出的具有上述特徵的克隆子再克隆到哺乳動物表達載體如pCEP4(Invitrogen)中。用高度純化的質粒DNA(Qiagen)瞬時轉染HEK293freestyle細胞，FreestyleTMMAXReagent(Invitrogen)按說明書來用。轉染後第5天，通過離心以及濾過0.2μMStericupfilter(Millipore)，使細胞上清與細胞碎片徹底分離。備選地，HEK293freestyle細胞或CHO細胞用含抗生素(如新黴素或嘌呤黴素)抗性基因的表達質粒轉染。被轉染的細胞在有所述抗生素存在的條件下培養，僅有穩定表達抗生素抗性基因和抗原特異性Fc片段的細胞克隆存活。這種穩定的轉染子長期持續分泌目標蛋白。用蛋白A免疫-親和力層析，從細胞上清純化出抗原特異性Fcabs。結合的Fcabs通過用甘氨酸緩衝液(pH＝2.9-4.0)洗柱、接著對PBS(pH＝6.8)透析，而從蛋白A上洗脫。Fcabs的純度用非還原SDS-PAGE確定，潛在的聚集物用大小排阻HPLC來檢測，所述層析是在ZorbaxGF250柱上、以PBS作為過柱緩衝液來進行。鑑定Fcabs的結構：利用與Fc受體和蛋白A的結合來評估純化的Fcabs的總體結構完整性。與新生兒Fc受體(FcRn)的結合如下測量：在pH＝6.0，將10μg/mlFcab添加至BiacoreCM5晶片，該晶片偶聯了5000個反應單元(responseunits,RU)的重組人FcRn。Fcab從FcRn上解離的情況在pH＝7.4檢測。這些實驗表明，Her-2特異性Fcabs與FcRn的pH依賴性相互作用具有與野生型Fcab非常類似的結合特性。Fcabs與高親和力Fc受體CD64的結合，用包被了3000RU蛋白A的BiacoreCM5晶片、隨後添加10μg/mlFcab溶液來測量。最後添加5μg/ml可溶性人CD64。所得結合曲線與野生型Fcab的無法區分。重組Fcabs(10μg/ml)與蛋白A的相互作用也用蛋白A包被的BiacoreCM5晶片(3000RU)經SPR來測量。同樣，所得親和力與野生型Fcab的相當。Fcabs的抗原特異性結合：Her-2特異性Fcabs結合Her-2的潛力和特異性用ELISA評估。用2μg/ml可溶性人Her-2(BenderMedSystems,Austria)包被塑料。清洗，並封閉非特異性結合位點後，添加遞增濃度的Fcabs。為檢測Her-2結合的Fcabs，添加與辣根過氧化物酶偶聯的抗FcCH2結構域特異性單克隆抗體(Serotec)。結果表明，有一些Her-2特異性Fcabs可以在低納摩爾範圍與其靶相互作用(表6)。該相互作用是特異性的，因為與Her家族其它成員(Her1,Her3和Her4)的結合根據ELISA判定要弱100倍以上。未檢測到對Her-2無關抗原的結合。表6:Her-2特異性Fcabs在ELISA中的結合親和力：Fcab克隆Her-2ELISAEC50[nM]SKBR3細胞結合EC50[nM]y-Her.C2.P4.2-3463ndy-Her.C2.P4.2-4370ndH561G3M1G4263ndy-Her.C2.P4.2-1993ndABEFs010116.15.2H10-03-64.810.3EF3-174.71.3y-Her.C2.P4.2-94.3ndH10-03-6R2.611.1nd＝未做。還通過SPR測定抗原結合。BiacoreCM5晶片用不同量的可溶性人Her-2包被，然後添加遞增濃度的Fcabs。所得結合曲線用BiaEval軟體調適後，計算Fcabs的親和力(KD)。在這些實驗條件下，Her-2特異性FcabsH561G3M1G4和H10-03-6分別以7.5nM和8.6nM的KD值結合Her-2。抗原結合也用過表達Her-2的人乳腺癌細胞系SKBR3和Calu-3通過FACS進行評估。1x105細胞與遞增濃度的Fcabs一起，在冰上保溫60分鐘。然後，通過離心和清洗，除去未結合的抗體。與細胞結合的Fcabs通過與偶聯了藻紅蛋白(Sigma)的抗人Fc特異性抗體在冰上保溫60分鐘來檢測。清洗細胞後，細胞表面的螢光強度在FACSCalibur儀器(BecktonDickinson)中測量。所有測試的Her-2特異性Fcabs都與SKBR3和Calu-3細胞結合，但與不表達Her-2的MDA-MB468細胞僅有最低結合，這證實了在ELISA中觀察到的弱抗原交叉反應性。Her-2特異性Fcabs對SKBR3細胞的表觀親和力(EC50)列於表6中。抗原特異性Fcabs的效應子功能(ADCC)：為確定Her-2特異性Fcabs是否介導Fc效應子功能，進行了ADCC試驗。在這些類型的試驗中，通過效應細胞(如自然殺傷(NK)細胞)表面Fc受體的結合，使抗體與靶細胞結合，並指示靶細胞的凋亡。SKBR3細胞(靶細胞)與遞增濃度的Her-2特異性Fcabs在37℃保溫20分鐘，所述細胞標記有螢光染料羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(carboxy-fluoresceinsuccinimidylester,CFSE)。在AutoMACS裝置中，按說明書使用MACS磁珠(MiltenyiBiotech)，通過陰性耗竭(negativedepletion)，從健康人供血者的血液分離NK細胞。純化的NK細胞與經過調理的SKBR3細胞以5:1混合，37℃保溫4小時。之後，添加螢光染料7-氨基放線菌素(7-AAD)，其專門染色凋亡細胞。凋亡的SKBR3細胞在FACS中被列為7-AAD/CSFE雙陽性細胞。Her-2特異性FcabsH10-03-6和ABEFs0101被證明是殺滅SKBR3細胞的強效介導者(potentmediator)，EC50值分別為1.1nM和1.0nM。凋亡誘導機制有賴於NK細胞的存在，這說明，Her-2特異性Fcabs具有ADCC功能。實施例7∶對4D5Fab的酵母展示為了在酵母中展示Fab片段，如下改造酵母展示載體pYD1(Invitrogen)(SEQIDNo.72/圖17)：在581/586位通過定點誘變引入Nhel限制性位點，產生修飾的載體pYDINhe(SEQIDNo.73/圖18)。該載體用NheI和PmeI限制性消化，得到3個片段。最大的片段是剩餘的載體主鏈，向其中插入合成的寡核苷酸接頭，得到載體pYD1lnk(SEQIDNo.74/圖19)。然後，含MATα轉錄終止區的表達盒通過PCR從載體pYD1擴增，將其通過BamHI和Pstl限制性消化和連接而克隆入pYD1lnk。所得載體是pYD1mata(SEQIDNo.75/圖20)。含GAL1啟動子、Aga2編碼基因、以及帶NotI和SfiI克隆位點的合成接頭的表達盒通過PCR從pYD1擴增，經EcoRI和PacI限制性消化而克隆入pYD1mata，得到載體pYD1gal(SEQIDNo.76/圖21)。作為在酵母中展示的Fab的實例，合成分別編碼抗體4D5(Herceptin)的VH-CH1和VL-CL的基因：序列4D5H(SEQIDNo.77/圖22)和4D5L(SEQIDNo.78/圖23)。4D5H側翼為SfiI和NotI限制性酶切位點，將其克隆入載體pYD1gal，得到載體pYD4D5hc(SEQIDNo.79/圖24)。在該載體中，將4D5H的N端融合到Aga2的C端，並在4D5H的C端連接六聚組氨酸標籤，後面是終止密碼子。4D5的VH-CH1胺基酸序列在4D5hp(SEQIDNo.80/圖25)中給出。4D5L側翼為NcoI和Ascl限制性位點，將其克隆入載體pYD4D5hc，得到載體pYD4D5hl(SEQIDNo.81/圖26)。4D5L在其前面有一個Aga2分泌信號，並在CL結構域的C端半胱氨酸殘基之後有終止密碼子。4D5的VL-CL胺基酸序列在4D51p(SEQIDNo.82/圖27)中給出。為了展示4D5Fab，將載體pYD4D5hl轉化入酵母菌株EBY100(Invitrogen)，在不含色氨酸的基本培養基上篩選轉化體，然後按照標準步驟(Invitrogen)，通過在含半乳糖的培養基上生長，來誘導重組蛋白的表達。實施例8∶構建在4D5FabCL結構域的結構環中有隨機化殘基的文庫作為酵母展示文庫構建的第一步，利用限制酶BsiWI和AscI從展示載體pYD4D5hl(SEQIDNO:81)中切出野生型CL(Ckappa)結構域。製備側翼為BsiWI和AscI位點(在根據pYD4D5hl的環境中)的編碼人Ckappa結構域的合成基因，其中在AB和EF環中分別引入隨機突變和插入。在該具體例中，在人Ckappa結構域的16和17位胺基酸之間插入3，4或5個NNB密碼子，將第92，93，94，95，97，98和99位殘基用NNB密碼子取代(IMGT編號，參見圖2)。NNB密碼子在位置1和2處包含全部4種核苷酸，在位置3處包含C、G和T。因此，NNB編碼全部20種天然編碼的胺基酸。文庫按照標準方法進行製備和篩選。作為支架配體，使用CDR靶Her2neu和4D5表位。篩選文庫成員用於產生本發明的細胞毒模塊抗體，它們在CL結構域中加入了結合位點，所述位點特異性結合效應分子，如Fcgamma受體。對所得Fab進行以下測試：(i)以Kd<10-8M和IC50<10-8M進行Her2neu結合，和(ii)用CDC和/或ADCC分析效應子功能。當前第1頁1 2 3