一種對基因甲基化檢測的方法
2023-09-21 21:34:15
一種對基因甲基化檢測的方法
【專利摘要】本發明公開了一種對基因甲基化檢測的方法，包括步驟為：將待測DNA樣品、陰性質控品、陽性質控品和無模板對照進行PCR擴增反應，其中PCR擴增反應中DNA樣品是以亞硫酸氫鹽修飾的DNA、對檢測基因和內參基因進行雙重PCR擴增反應，通過對參數範圍的判讀，判斷所述待測DNA樣品的檢測基因的甲基化情況。通過上述方式，本發明的對基因甲基化檢測的方法具有特異性強、雙重反應、靈敏度高、受汙染小、操作簡單快速、安全性等優點，檢測結果具有較好的準確性和重複性，對結直腸癌等癌症早期檢測有一定的輔助診斷作用。
【專利說明】一種對基因甲基化檢測的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因檢測領域，特別是涉及一種對基因甲基化檢測的方法。
【背景技術】
[0002]DNA甲基化水平和模式的改變是腫瘤發生的一個重要因素，這些變化包括CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態。由於CpG島的局部高度甲基化要早於細胞惡性增生，故其甲基化的檢測可用於腫瘤的預測，而全基因組水平的低水平甲基化狀態，則隨著腫瘤惡性程度的增加而進一步降低，使其可用於腫瘤的診斷以及分級。甲基化可作為腫瘤等早期診斷的生物標記物和預後評估指標，對腫瘤的篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預後判斷及治療監測都具有重要的意義。
[0003]septin是一類廣泛分布於除植物外所有真核生物中具有GTPase活性的保守骨架蛋白基因家族，與細胞分裂有關。在人類中，septin由14個家族成員組成，分別命名為s印tinl-14，其中septin9定位於17q25.3，含有17個外顯子，能夠編碼Septin9蛋白。Septin9有多個亞型(如Septin 9_vl、v2、v3、v4),且各亞型間具有結構相似性，由位於中央的P-1oop GTP結合域、可變的N端和C端結構域組成。s印tin9基因與染色體分離、DNA修復、遷移、凋亡等細胞功能有關。研究發現，在結直腸癌中，s印tin9-v2啟動子區的CPG島高度甲基化。septin9甲基化與結直腸癌的密切相關性已有大量的研究報導。例如2011年Warren JD等人檢測結直腸癌患者的血漿DNA-septin9的甲基化情況，在1、II期的靈敏度分別為71%和90%，II1、IV期的靈敏度為100%，在正常人群中的甲基化檢測靈敏度僅為10%。由此可見，檢測s印tin9甲基化情況可以作為結直腸癌早期診斷一個較好的分子指標。
[0004]目前檢測甲基化的方法主要有以下幾種:
(I)直接測序法(bisulfite sequencing PCR、BSP)。直接測序法的原理是:重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，PCR擴增後，尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最後對PCR產物進行測序並且與未經處理的序列比較，判斷CpG位點是否發生甲基化。該實驗方法首先需要進行引物設計(每個基因設計一對引物，引物位置儘可能的避開DNA中的CG位點)，隨後需要對目的條帶進行切膠回收；回收後的PCR產物連接克隆載體；挑選陽性克隆測序並對測序結果進行分析。但此方法實驗過程長，需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣，實驗檢測的費用高。
[0005](2)甲基化特異性PCR法(Methylm1n Specific PCR、MSP)。該方法為用重亞硫酸鹽使胞嘧啶轉化為尿嘧啶，進行引物設計(每個基因設計兩對引物，分別為:甲基化引物M、非基因化引物U，對應擴增甲基化和非甲基化的目的片段)，有時需設計巢式引物；PCR擴增:對甲基化和非甲基化的目的片段分別進行擴增，此時應儘可能使用梯度PCR儀，同時使用不同的退火溫度，以篩選到合適的退火溫度J^PCR產物電泳。該方法檢測時間相對較長，不能及時獲得檢測結果。
[0006] (3)甲基化敏感性解鏈曲線分析法(MS-High Resolut1n Melting Curve、MS-HRM)ο該方法利用經亞硫酸氫鹽處理(修飾)後的甲基化DNA與非甲基化DNA之間的鹼基差異，結合鹼基變化會引起產物熔解溫度變化及熔解曲線差異以及在反應結束後熱變性熔解曲線圖明顯不同的原理，結合梯度甲基化標準品，可繪製標準梯度曲線。對比待檢樣品的熱變性曲線在標準曲線中的區域，即可得出該樣品的甲基化水平區間。該方法需要不同甲基化程度的標準品，實驗結果讀取複雜繁瑣。並且該方法用的螢光染料為飽和螢光染料，結果只能檢測一個螢光信號通道，不能同時分析樣本內參基因的擴增情況，不能推斷硫化修飾的效果，容易出現重亞硫酸鹽處理不完全的問題以及假陰性。
[0007](4)螢光法(Methylight)。螢光法是基於Taqman螢光實時定量技術的甲基化檢測技術。其過程如下:先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5』端連接報告螢光，3』端連接淬滅螢光，隨後一般採用MSP引物進行實時定量PCR0 Methylight法最大的優勢在於其高通量和高敏感性，且無需在PCR後再進行電泳、雜交等操作，減少了汙染和操作誤差。但該方法多為單重PCR檢測，沒有內參基因的擴增，不能確保模板DNA的硫化修飾質量。
[0008](5)甲基化敏感性限制性內切酶(methylat1n-sensitive restrict1n Endonuclease, MS-RE法)。這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段後再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內切酶有HpaI1-MspI (識別序列CCGG)和Sma1-XmaI (CCCGGG)等。由於後者識別的鹼基數相對較多，其鹼基序列在體內出現的概率相對較低，所以以前者即HpaIl-MspI更常用。其中HpaII和MspI均能識別CCGG序列，然而當序列中的胞嘧啶發生甲基化時，HpaII不切割，利用HpaI1-MspI的這種屬性處理DNA，隨後進行Southern或PCR擴增分離產物，明確甲基化狀態。這是一種經典的甲基化研究方法，其優點是:相對簡單，成本低廉，甲基化位點明確，實驗結果易解釋；缺點是:1.由於CG不僅僅限於CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；2.只有檢測與轉錄相關的關鍵性位點的甲基化狀態時，該檢測方法的結果才有意義；
3.相對而言，Southern方法較複雜，且需要樣本的量大；4.存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題；5.不適用於混合樣本。
【發明內容】
[0009]本發明主要解決的技術問題是提供一種對基因甲基化檢測的方法，該檢測方法特異性強且靈敏度高。
[0010]為解決上述技術問題，本發明採用的一個技術方案是:提供一種對基因甲基化檢測的方法，包括步驟為:將待測DNA樣品、陰性質控品、陽性質控品和無模板對照進行PCR擴增反應，其中所述PCR擴增反應中DNA樣本以亞硫酸氫鹽修飾的DNA、對檢測基因和內參基因進行雙重PCR擴增反應，所述PCR擴增反應的體系中包括3』端進行了修飾處理的block，通過對所述待測DNA樣品、所述陰性質控品、所述陽性質控品和所述無模板對照的參數範圍的判讀，判斷所述待測DNA樣品的檢測基因的甲基化情況。
[0011]在本發明一個較佳實施例中，所述待測DNA樣品為人類基因組DNA，所述陽性質控品為亞硫酸氫鹽修飾的全甲基化人類基因組DNA，所述陰性質控品為亞硫酸氫鹽修飾的非甲基化人類基因組DNA。
[0012]在本發明一個較佳實施例中，所述待測DNA樣品為人類正常DNA、細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細胞DNA、外周血血清或血漿DNA、體液DNA或排洩物細胞DNA。
[0013]在本發明一個較佳實施例中，所述檢測基因為s印tin9基因或s印tin9甲基化基因，所述內參基因為GAPDH、β-actin (ACTB)、B2M、SDHA、HPRTl中的一種或者多種。
[0014]在本發明一個較佳實施例中,所述septin9甲基化位點為啟動子區的CpG島,序列為轉錄起始位點上遊的-670~-555bp區。
[0015]在本發明一個較佳實施例中，所述PCR擴增反應體系的終濃度組成為:1~10XPCR緩衝液、0.1~ImM dNTPs,0.1~IuM septin9引物序列、0.1~IuM內參基因引物序列、0.1 ~2uM block、0.05 ~2ng/ul 模板 DNA、0.1 ~IuM septin9 Taqman 水解探針、
0.1~IuM內參基因Taqman水解探針、0.01~0.10U/ul TaqDNA聚合酶、I~5mM氯化鎂。
[0016]在本發明一個較佳實施例中，所述block為寡核苷酸,所述block的3』端的修飾為:磷酸化或者間臂:Spacer 3、Spacer 6、Spacer 18或者MGB處理中的一種或多種處理。
[0017]在本發明一個較佳實施例中，所述septin9和內參基因探針5』端報告突光基團為FAM、TET、HEX、TAMRA、Texas Red、Rox、Cy5中的一種或多種，所述s印tin9和內參基因探針3』端的猝滅基團為BH Q1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一種或多種，所述dNTPs中包括1mM dATP、1mM dCTPUOmM dTTP和1mM dGTP，所述PCR緩衝液中包含Tris*Cl、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。
[0018]在本發明一個較佳實施例中，所述PCR擴增反應的具體過程為:92~97°C預變性5~35分鐘，聚合酶鏈式反應擴增階段，92~97 °C變性10~30s，50~65°C退火10~30s，並進行35~55個循環。
[0019]本發明的有益效果是:本發明的對基因甲基化檢測的方法，該方法具有特異性強、雙重反應、靈敏度高、受汙染小、操作簡單快速、安全性等優點，檢測結果具有較好的準確性和重複性，對結直腸癌等癌症早期檢測有一定的輔助診斷作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發明的對基因甲基化檢測方法一較佳實施例中檢測甲基化模板和非甲基化豐旲板的不意圖；
圖2是本發明的對基因甲基化檢測方法一較佳實施例中septin9甲基化檢測擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0021]下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0022]材料:待檢血漿樣本、陽性質控品、陰性質控品。
[0023]儀器:Lightcycler 480> nanodrop 1000、高速離心機、水浴鍋、鏇潤震蕩儀、冰箱、
烘箱、滅菌鍋。
[0024]試劑:DNA聚合酶(羅氏公司)、10XPCR Buffer (羅氏公司)、MgCl2 (羅氏公司)、dNTP (TaKaRa )、純化水。
[0025]引物:所有引物純度應達到電泳級(PAGE)或HPLC級，不含雜帶。提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜，證明使用PAGE或者HPLC純化後應有明顯單峰PAGE或者HPLC純化圖譜，濃度為1ng/ μ I備用。
[0026]septin9的引物、block和探針序列如下:
【權利要求】
1.一種對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，包括步驟為:將待測DNA樣品、陰性質控品、陽性質控品和無模板對照進行PCR擴增反應，其中所述PCR擴增反應中的DNA樣本是以亞硫酸氫鹽修飾的DNA、對檢測基因和內參基因進行雙重PCR擴增反應，所述PCR擴增反應的體系中包括3』端進行了修飾化處理的block，通過對所述待測DNA樣品、所述陰性質控品、所述陽性質控品和所述無模板對照的參數範圍的判讀，判斷所述待測DNA樣品的檢測基因的甲基化情況。
2.根據權利要求1所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述待測DNA樣品為人類基因組DNA，所述陽性質控品為亞硫酸氫鹽修飾的全甲基化人類基因組DNA，所述陰性質控品為亞硫酸氫鹽修飾的非甲基化人類基因組DNA。
3.根據權利要求2所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述待測DNA樣品為人類正常DNA、細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細胞DNA、外周血血清或血漿DNA、體液DNA或排洩物細胞DNA。
4.根據權利要求1所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述檢測基因為s印tin9基因或s印tin9甲基化基因，所述內參基因為GAPDH、β-actin(ACTB)、B2M、SDHA、HPRTl中的一種或者多種。
5.根據權利要求4所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述s印tin9甲基化位點為啟動子區的CpG島，序列為轉錄起始位點上遊的-670~-555bp區。
6.根據權利要求1所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述PCR擴增反應體系的終濃度組成為:1~10XPCR緩衝液、0.1~ImM dNTPs.0.1~IuM septin9引物序列、0.1~IuM內參基因引物序列、0.1~2uM block、。.05~2ng/ul模板DNA、0.1~IuMseptin9 Taqman 水解 探針、0.1 ~IuM 內參基因 Taqman 水解探針、0.01 ~0.10U/ul TaqDNA聚合酶、I~5mM氯化鎂。
7.根據權利要求1所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述block為寡核苷酸，所述block的3』端的修飾為:磷酸化或者間臂:Spacer 3>Spacer 6>Spacer 18或者MGB處理中的一種或多種處理。
8.根據權利要求6所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述s印tin9和內參基因探針5』端報告螢光基團為FAM、TET、HEX、TAMRA、Texas Red、Rox、Cy5中的一種或多種，所述s印tin9和內參基因探針3』端的猝滅基團為BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL中一種或多種，所述 dNTPs 中包括 1mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTP 和 1mM dGTP，所述 PCR 緩衝液中包含Tris*Cl、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。
9.根據權利要求1所述的對基因甲基化檢測的方法，其特徵在於，所述PCR擴增反應的具體過程為:92~97°C預變性5~35分鐘，聚合酶鏈式反應擴增階段，92~97 °C變性10~30s，50~65°C退火10~30s，並進行35~55個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131070SQ201410215847
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年5月22日 優先權日:2014年5月22日
【發明者】王弢, 秦勇, 巴兆粉, 張麗 申請人:蘇州工業園區為真生物醫藥科技有限公司