具有螢光共振能量轉移特徵的成對蛋白及其用途的製作方法
2023-09-21 11:54:10
專利名稱：具有螢光共振能量轉移特徵的成對蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有螢光共振能量轉移(FRET)特徵的由蛋白A和蛋白B組成的成對蛋白，蛋白A是作為能量供體且帶有螢光物質或化學發光物質的抗原，蛋白B是作為能量受體且帶有螢光物質的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結合的共同抗原決定簇，由蛋白A、B和適當的緩衝液組成的均相免疫檢測藥盒，及它們用於檢測標本中抗體存在的用途，尤其在愛滋病毒抗體、B型肝炎病毒抗體、C型肝炎病毒抗體的檢測方面的用途。
免疫測定利用抗原抗體反應檢測標本中的微量物質，基於抗原抗體反應的特異性和敏感性，免疫測定的應用範圍遍及醫學檢驗的各個領域，由於它在醫學檢驗中的地位日益重要，近年來新方法、新技術不斷出現，從總體上說，其進展主要在自動化和簡便化兩個方面。目前基因工程、細胞工程和酶工程技術開發的重組抗原、單克隆抗體及酶技術已逐步取代原有免疫診斷試劑，為各種疾病的診斷增加了新型的有效試劑盒。在現有的免疫檢測方法中，固相免疫法以放射免疫檢測法(RIA)和酶免疫檢測法(EIA)的應用最為廣泛，通常包括包被(抗原或抗體)、封閉、多次孵育和洗滌以及檢測等過程，最快的也需2小時以上。而液相法的免疫反應和信號測定在溶液中一步完成，沒有固相的參與，因此反應速度比固相法快得多，操作程序也簡單得多，其中均相螢光免疫測定(Homogeneous Fluoroimmunoassay，hFIA)應用最為廣泛，但目前多只限於小分子藥物的測定，這主要是由於自然標本通常存在較廣泛、複雜的螢光背景以及化學標記技術的不成熟導致的。Ulman等人首先提出基於螢光共振能量傳遞(FRET)的hFIA，即均相螢光共振免疫測定(Homogeneous Fluorescence resonanceimmunoassay，hFRIA)，實現了抗原-抗體反應的均相測定。
光譜重疊的兩個螢光分子之間存在著一種螢光共振能量轉移(FRET)過程，即一個受激發的螢光物質(能量供體，energy donor)將其激發態能量轉移給一個光吸收分子(能量受體，energy acceptor)的過程。如果受體的激發波長與前者的發射波長重疊，那麼用供體的激發光激發，檢測到的就會是受體的發射光，同時供體自身的發射光強度就會大大減弱。這一過程與它們之間的距離密切相關，只有當距離足夠近時才能發生。
目前均相螢光共振免疫測定已應用於檢測血清中的抗原。Ueda等[Ueda H，Kubota K，WangY，et al.Biotechniques，27(4)738-742(1999)]用琥珀醯亞胺脂和螢光黃-X分別標記抗體的重鏈和輕鏈，兩者在比色杯中混合後再加入抗原，抗原抗體的特異結合，使琥珀醯亞胺脂與螢光黃-X靠近，用490nm波長激發琥珀醯亞胺脂，檢測到520nm發射光減弱，605nm的發射光增強，隨著抗原量的增加，605nm的螢光亦增強。Stenroos等[Stenroos K，Hurskainen P，Eriksson S，etal.Cytokine，10(7)495-499(1998)]用銪的螯合物標記重組人白介素2(IL-2)、用Cy5標記單克隆抗體，進行時間分辨螢光免疫測定。Blomberg等分別用鋱和羅丹明標記抗體，檢測血清中人絨毛膜促性腺素的βCG，結果能量轉移信號與樣品中的βCG濃度成正比。
現有的均相螢光共振免疫測定都必須用有機合成螢光染料或稀土元素對檢測試劑進行標記，將作為能量供受體對的兩種螢光物質分別偶聯在抗體的不同部位上或不同的抗體分子上，更多的是將它們分別偶聯在抗原和抗體上，在溶液中，通過抗原抗體的特異性結合而拉近兩個螢光分子之間的距離，從而發生FRET現象。這些方法雖然滿足了快速檢測的需要，但都要求獲得高純度的抗體和抗原，使檢測前期工作繁雜，由於無法達到百分之百的純度，螢光標記時難免產生非特異標記，在檢測中極易出現假陽性，而針對每種免疫反應都提取到抗體是極其困難的。而且到目前為止的診斷試劑對抗原的純度要求都很高，因而對生產工藝的要求也相應很高。這些不足給它們的實際推廣應用帶來了許多局限。為改變以上不足，本發明建立了一類新型的均相螢光共振免疫測定試劑及方法，以使生產工藝簡單，抗體檢測中假陽性的出現減少，檢測能夠快速、準確地進行。這一新型的均相螢光共振免疫測定方法利用了螢光蛋白及發光蛋白的光學特性。
目前報導的螢光蛋白主要有綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、藍色螢光蛋白(BFP)、紫外激發綠色螢光蛋白(GFPuv)等，它們都衍生自來源於水母的綠色螢光蛋白。綠色螢光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)是一個非常穩定的蛋白質，全長238肽，分子量約為27kDa，第65-67位的三個胺基酸能夠形成一種獨特的絲氨酸-脫氫酪氨酸-甘氨酸(Ser65-dehydroTyr66-Gly67)環化結構，這一結構使得GFP具有較強的螢光性。GFP螢光結構的形成是一個自催化的過程，僅由其一級結構決定，而無需特殊的酶或輔助因子參與，因此可以進行多種異源表達。GFP的N端和C端都可以與其他蛋白進行嵌合表達而保留其螢光活性，與GFP融合表達對許多蛋白的活性基本上也沒有影響。GFP的螢光很穩定，不易被光漂白。這些優點使得GFP成為監測活細胞內基因表達、蛋白定位、細胞分化發育的良好標記。Heim等通過突變篩選出了幾株螢光強度更強的和/或螢光光譜改變的GFP變異型，這些變異型與野生型GFP只有幾個胺基酸的差別。在其它物種中也分離並克隆表達出了一些螢光蛋白，如來自珊瑚蟲的紅色螢光蛋白DrFP583(DsRed)[Matz MV，Fradkov AF，Labas YA，et al，NatBiotechnol，17(12)969-973(1999)]。1996年Mitro等成功地觀察到兩個GFP變異型BFP5和RSGFP4之間的FRET現象[Mitra RD，Silva CM，Youvan DC，Gene 17313-17(1996)]。BFP和GFP之間的FRET已被應用於檢測細胞編程死亡、線粒體中Bcl-2和Bax之間的相互作用等研究中[Mahajan NP，Linder K，Berry G，et al，Nat Biotechnol，16(6)547-552(1998)]。
GFP的各種變異型可組成多組能量供受體對S65G/V68L/S72A/T203Y變異型(激發峰513nm，發射峰527nm的黃色螢光蛋白，YFP)和F64L/S65T變異型(激發峰488nm，發射峰507nm，EGFP)；Y66H變異型(激發峰382nm，發射峰448nm的藍色螢光蛋白，BFP)和EGFP，T203I/S72A/Y145F變異型(激發峰395nm，發射峰509nm，GFPuv)和S65G/S72A/K79R/T203Y變異型(激發峰513nm，發射峰527nm，EYFP)等[Heim R，Prasher DC and Tsien RY，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9112501-12504(1994)，Heim R，Cubitt AB，Tsien RY，Nature，373663-664(1995)]。將它們分別與一種抗原嵌合表達，其產物既有免疫原性又具備螢光特性，在體系中是特異存在的，經過初步純化就不會出現幹擾檢測、造成假陽性的因素，可以應用為檢測試劑。
在維多利亞水母體內自然存在著一種FRET現象，即水母發光蛋白(apoaequorin)和綠色螢光蛋白(wtGFP)之間的能量轉移。水母發光蛋白是一種生物發光蛋白，當Ca2+達到足夠的濃度並與之發生結合後，它將發生氧化反應並發射藍光，其最大發射波長是466nm，與wtGFP的最大發射波長470nm臨近，在水母體內，由於兩種蛋白之間距離極小，必然發生能量的轉移，最後以wtGFP發射綠色螢光(最大發射波長504nm)的形式體現出來。目前這兩種蛋白都得到了分離並在多種異源生物種活性表達，在GFP被改造利用的同時，發光蛋白也出現了多種變異型，包括生物活性提高的類型[Casadei J，Powell MJ，KantenJH，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，872047-2051(1990)，Zenno S，Inouye S，Biochem.Biophys.Res.Commun.，171169-174(1990)，Nomura M，Inouye S，Ohmiya Y，et al.FEBS Lett.，29563-66(1991)，Shimomura O，Inouye S，Musicki B，et al.Biochem.，J.270309-312(1990)，Kurose K，Inouye S，Sakaki Y，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8680-84(1989)]，將二者分別與一種抗原嵌合表達，加入Ca2+作為誘發劑，其產物既有免疫原性又具備螢光特性，在體系中是特異存在的，經過初步純化就不會出現幹擾檢測、造成假陽性的因素，而且還需要加入誘導劑才能檢測FRET，使檢測反應更加精確，也能構成一套靈敏的檢測試劑。
蛋白質、酶、核酸、糖等生物大分子，可通過雙功能交聯劑，在生物大分子之間或與藥物、半抗原等生物小分子進行共價連接，可以製備酶標抗體、人工抗體、酶標抗原、抗體導向藥物、免疫毒素、核酸探針、固定化酶、生物親和色譜材料、修飾性酶分子等。各種同型和異型雙功能交聯劑都已陸續開發出來。化學合成的螢光物質經交聯劑修飾後可標記在純化抗原的氨基、羧基或巰基上；以雙功能基團螯合劑與稀土離子Eu3+等形成螯合物，可與純化抗原結合得到螢光抗原[Evangelista RA，et al，Clin.Biochem，21173(1988)，DiamandisEP，Clin.Biochem.，21139(1988)，Diamandis EP，et al，J.Immunol.Methods，11243(1988)，Diamandis EP，et al，Anal.Chem.，6148(1989)]。標記蛋白配合融合表達螢光蛋白的蛋白構成能量供受體對。雖然這一步操作較為複雜、存在非特異性，但螢光蛋白/發光蛋白融合蛋白的存在將使非特異性大大降低，試劑生產工藝簡單化，並仍保持抗原、抗體的特異反應和FRET距離依賴性，檢測結果靈敏而特異。
本發明的目的是尋找並提供具有FRET特徵的檢測試劑。
本發明人經研究發現具有螢光共振能量轉移該檢測(FRET)特徵的由蛋白A和蛋白B組成的成對蛋白，其可用於檢測標本中抗體的存在，且該檢測具有簡單、快速，特異性高的特點，因此，該成對蛋白可用於疾病的檢測中。
本發明第一方面涉及具有螢光共振能量轉移特徵的由蛋白A和蛋白B組成的成對蛋白，其中，蛋白A是作為能量供體且帶有螢光物質或化學發光物質的抗原，蛋白B是作為能量受體且帶有螢光物質的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結合的共同抗原決定簇。
本發明第一方面涉及由蛋白A和蛋白B組成的成對蛋白作為檢測試劑的用途。
本發明還涉及用於疾病檢測的試劑盒，其包括(1)由蛋白A和蛋白B組成的成對蛋白，(2)緩衝液，及如必要離子和/或表面活性劑。
本發明另一方面涉及用於檢測標本中抗體存在的方法，該方法包括(a)將本發明所提供的任一成對蛋白與待測標本中抗體相互接觸，形成抗原抗體複合物；(b)檢測該抗原抗體複合物的存在，該抗原抗體複合物的存在指示該標本中與該成對蛋白共同抗原特異結合的抗體的存在。
根據本發明，本發明的成對蛋白中的蛋白A可選自病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關抗原或其它具有抗原決定簇的物質。
根據本發明，本發明的成對蛋白中的蛋白B可選自病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關抗原或其它具有抗原決定簇的物質。
根據本發明，本發明的螢光物質可選自螢光蛋白、螢光素、稀土元素、淬滅物質等。
根據本發明，本發明的化學發光物質可選自發光蛋白或魯米諾、過氧草酸鹽等化學合成發光物質。
根據本發明，本發明的螢光蛋白可選自綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、藍色螢光蛋白、紅色螢光蛋白及其它螢光蛋白。
根據本發明，本發明的發光蛋白可選自水母發光蛋白及它的各種變異型。
根據本發明，本發明的成對蛋白中融合螢光蛋白或發光蛋白與抗原決定簇片段的融合蛋白既保留了與原抗體分子特異結合的抗原決定簇，又具有螢光蛋白或發光蛋白的光學特性，純化要求簡單，成對蛋白與特異抗體反應後將導致螢光光譜的明顯變化，易檢測發現。加入特殊的均相螢光免疫反應添加劑的緩衝液還有助於擴大光譜變化的程度，因此可以作為檢測試劑，用於檢測標本中的特異抗體，如愛滋病毒抗體、B型肝炎病毒抗體、C型肝炎病毒抗體。
以基因工程的各種方法可以將螢光蛋白或發光蛋白基因與編碼某種抗原的基因嵌合在一起，置於合適的載體中進行表達。該抗原可以是病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關抗原或其它有抗原決定簇的物質。在基因工程中，利用大腸桿菌生產外源蛋白的技術已十分成熟，嵌合蛋白可以通過調整表達條件，以可溶性蛋白形式出現，而且是表達體系中唯一既有免疫原性、又能發射螢光或進行化學發光的抗原蛋白，略加純化就可用作檢測試劑。在均勻液相體系中，光學特性恰好構成一對能量供受體對的成對蛋白其相同的抗原決定簇分別結合特異抗體的兩臂，利用抗體本身的獨特構相，使它們之間的距離拉近，達到發生FRET的距離要求以內，即1-10nm內，發生螢光共振能量轉移，出現螢光光譜的明顯變化，這種明顯的變化在20分鐘內就可以發生，通過相應的螢光檢測儀器如螢光全譜儀或肉眼進行判定，證實待測樣品中特異抗體的存在，以此為檢測指標對疾病作出診斷。由於成對蛋白存在的特異性，只有存在特異抗體的體系中才能出現FRET，在非陽性的樣品溶液中，成對蛋白游離在溶液中，它們之間的距離不足以發生FRET。本發明的這一對蛋白中至少有一個涉及融合表達的螢光蛋白或發光蛋白，避免了使用化學方法進行標記操作的繁雜和以往免疫檢測中難以避免的假陽性，因此保證了檢測試劑生產的簡易性和應用的簡單、快速和準確性。
本發明採用的均相螢光免疫反應添加劑基於抗體本身具有極性，在溶液中加入離子或表面活性劑後輕微改變溶液的極性，相應改變抗體的構相，使抗體兩臂之間的距離更加接近，結合在抗體兩臂上的螢光抗原之間的距離也更近，從而提高能量傳遞效率和檢測的靈敏度。
本發明根據檢測對象—血清的自身螢光特性，選擇最大發射波長在500nm以上的螢光蛋白來構建成對蛋白。例如，為驗證血清中的綠色螢光蛋白GFPuv的抗體的存在，將綠色螢光蛋白GFPuv和黃色螢光蛋白EYFP分別定作蛋白A和蛋白B，它們之間95.8％的同源性確保了它們相似的免疫原性，而前者的最大發射波長(509nm)與後者的最大激發波長(513nm)十分接近，可以作為一對能量供受體對，它們與血清中的特異抗體反應後，形成免疫複合物，其中GFPuv-antiGFPuv-EYFP的形式將會發生FRET，以GFPuv的激發光(395nm)激發，20分鐘內，其最大發射波長509nm處的螢光強度將比加入血清前的大大降低而EYFP最大發射波長527nm處的螢光強度將增強。
根據本發明的一個具體實施方案，為檢測血清中是否存在HIV病毒抗體，選擇重組HIV-1包膜蛋白ENV2與螢光蛋白GFPuv、EYFP的嵌合蛋白ENV2-GFPuv、ENV2-EYFP分別作為蛋白A和蛋白B，由它們構成檢測試劑，當加入存在HIV-1病毒抗體的待測血清時，20分鐘內將檢測到FRET現象，即以GFPuv的最大激發光395nm激發，GFPuv的509nm處最大發射光強度較加入血清前降低而EYFP527nm處的最大發射光強度較加入血清前升高。而加入HIV-1抗體陰性血清觀察不到這種變化。上述蛋白A和蛋白B構成的成對蛋白因此可以應用在愛滋病檢測中。
根據本發明的另一個優選實施方案，本發明還構建另一套HIV-1抗體檢測試劑，其以嵌合蛋白ENV2-GFPuv作為蛋白A，標記螢光素BODIPY507/545的蛋白作為蛋白B，它們都有共同的抗原決定簇——重組HIV-1包膜蛋白ENV2，GFPuv的最大發射波長(509nm)與BODIPY507/545的最大激發波長(507nm)十分接近，是一對能量供受體對，當加入存在HIV-1病毒抗體的血清時，20分鐘內將檢測到FRET現象，出現極其顯著的光譜變化，即以GFPuv的最大激發光395nm激發，液相系統最大發射波長由加入血清前的507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗體陰性血清的體系最大發射波長几乎不移動。這一系統在愛滋病檢測中具有更高的靈敏度和準確性。
本發明中應用的成對蛋白都是基因工程產物，利用大腸桿菌構建和表達質粒pGFPuv、pEYFP、pRSETB-env2、pRSETB-env2-gfpuv、pRSETB-env2-eyfp，分別得到蛋白GFPuv、EYFP、ENV2、ENV2-GFPuv、ENV2-EYFP。以基因工程中常用的或熟知的純化技術純化表達產物，ENV2通過巰基反應標記上BODIPY507/545，就可以分別配對，組成成對蛋白中的蛋白A和蛋白B。
本發明提供的藥盒選擇極性緩衝液(10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，可以輕微改變抗體的構象和有機螢光物質的量子產率，有利於蛋白A、B和特異抗體反應、形成免疫複合物後FRET的檢測。根據本發明，優選以緩衝液稀釋等摩爾蛋白A和蛋白B，即可作為試劑盒檢測樣品中特異抗體的存在。
免疫檢測的對象一般都是血清，對多份血清進行螢光全譜掃描發現以紫外光激發常常會出現最大發射波長在450nm左右的發射峰並有很長的尾峰。在本發明中為避免血清中的背景的幹擾，選擇檢測試劑的最大發射光譜都在500nm以上。在現有的GFP各種突變型以及化學合成的螢光試劑中，選擇了GFPuv和EYFP，GFPuv和BODIPY507/545作為能量供受體對。
GFPuv的發射光波長(509nm)與EYFP的激發光波長(513nm)幾乎相重疊，二者在足夠近的距離內(10nm)可以發生螢光共振能量傳遞(FRET)，即以GFPuv的激發光(395nm)激發，GFPuv獲得的能量以無輻射的方式傳遞給近距離的EYFP，作為後者的激發能量，最後這一能量以527nm的光輻射形式發射，表現為黃色螢光。GFPuv與EYFP之間有95.8％的同源性，以GFPuv為免疫原免疫動物獲得的抗血清對EYFP也有良好的免疫反應。陽性抗血清中抗體的兩臂能將這兩種螢光蛋白拉近，發生FRET。檢測螢光光譜的變化情況可以反映免疫反應的強弱。將同一種抗原分別與這兩種螢光蛋白嵌合表達，利用抗體兩臂將兩種螢光抗原拉近的作用，使它們之間發生FRET現象。檢測這時液相中螢光光譜的變化可以測定抗原抗體間是否發生了結合。
Molecular probe公司的螢光物質BODIPY 507/545能與蛋白質中的巰基發生反應，共價結合標記於蛋白質上，使後者獲得最大激發波長507nm和最大發射波長530nm的螢光性質並保留大部分生物活性。以BODIPY 507/545標記純化抗原。這一螢光抗原與GFPuv嵌合表達的同種抗原構成一對能量供受體對，共同結合於同一抗體的兩臂上後，以GFPuv的激發光(395nm)激發，GFPuv獲得的能量以無輻射的方式傳遞給近距離的BODIPY 507/545，則可發生FRET，檢測到530nm的光強的增加。以FRET的發生與否可以作為特異抗體存在與否乃至疾病是否發生的標準。
以基因工程表達螢光蛋白/發光蛋白融合抗原的技術已十分成熟，它們一般以上清的形式出現，純化便利，活性高，易生產，檢測時利用抗體本身的特殊構象將它們拉近而發生FRET，反應快速而準確，適合大規模檢測的需要，是一種很有應用前景的檢測方法。
pGFPuv、pEYFP分別是兩種螢光蛋白GFPuv和YFP的表達載體，將這兩種質粒分別轉化E.coli表達菌株BL21，低溫誘導表達以保證螢光蛋白的正確摺疊和螢光活性。表達上清為可溶性成分，螢光明顯。由於GFPuv、EYFP、EGFP、EBFP四者有高於95％的同源性，取經分子排阻高效液相層析純化的GFPuv免疫小鼠，可獲得對這些螢光蛋白都有很強的免疫反應的抗體。
例如，將GFPvu和EYFP等摩爾混合，稀釋後加入免疫小鼠的血清，檢測前後的螢光變化，可以驗證被免疫的小鼠是否產生了抗體及抗體產生的強弱。當兩種螢光蛋白與螢光蛋白抗體的比例恰好是1∶1∶2時，應該有50％的抗原、抗體複合物以GFPuv-antiGFPuv-EYFP的形式存在，抗體的兩臂將GFPuv和EYFP的距離拉近，產生FRET。以395nm光對整個液相系統進行激發，螢光光譜的變化在20分鐘內達到穩定。可以看到，加入GFPvu抗體陽性血清的系統裡，GFPuv的發射光峰值明顯下降，而陰性血清中沒有特異的抗體將兩種螢光蛋白拉近，不發生FRET。由於加入血清造成螢光背景的變化一般都在500nm之前，可以忽略。
愛滋病(AIDS，獲得性免疫缺陷綜合症)對人類的威脅正在激增，檢測試劑的研製也顯得及其重要。EIA是目前最普及的HIV檢測手段，主要是基於HIV env基因編碼的鑲嵌於包膜的糖蛋白gp120、gp41和gag基因編碼的衣殼蛋白p24的免疫原性來研製的。根據本發明，本發明可以螢光共振能量傳遞均相檢測法來檢測愛滋病。
具體講，以分子克隆的方式構建出能夠融合表達螢光蛋白和抗原蛋白的融合蛋白表達質粒。質粒pRSETB-env2能在大腸桿菌中表達出具有較強抗原活性的重組愛滋病毒包膜蛋白，從含有gfpuv基因的質粒pGFPuv(購自Clonetech公司)中以限制性內切酶切出750bp的gfpuv基因片段，連入env2基因3`端，獲得重組質粒pRSETB-env2-gfpuv(2u)。同樣，連接來自於質粒pEYFP的750bp eyfp基因於env2基因的3`端，獲得重組質粒pRSETB-env2-eyfp(2y)。
構建的質粒2u、2y轉化大腸桿菌表達菌株BL21，低溫誘導表達2U、2Y以保證融合表達的螢光蛋白和ENV2構相和功能的正確，取超聲裂解的菌體上清用於檢測。螢光檢測及免疫檢測發現，融合蛋白保存了螢光蛋白和重組愛滋病毒包膜蛋白的生物學和化學活性，但略低於單獨表達的這兩種蛋白質。
將2Y和2U等摩爾混合，稀釋後加入血清，檢測前後的螢光變化。當兩種螢光抗原2U、2Y與包膜蛋白抗體的比例恰好為1∶1∶2時，理論上將有50％的抗原、抗體結合形式為2U-Ig-2Y，其餘50％是等比例的2U-Ig-2U和2Y-Ig-2Y，也就是將有50％的抗原、抗體複合物會發生FRET。以GFPuv的激發光對整個液相系統進行激發，螢光光譜的變化在20min內達到穩定。加入HIV-1抗體陽性血清的體系中，GFPuv的發射光峰值明顯下降，這是其吸收的激發光能量傳遞給EYFP所引起的。加入HIV-1陰性血清的體系測不到GFPuv發射光峰值的明顯下降，也即沒有特異的抗體將兩種螢光抗體拉近，不發生FRET。以稀釋液取代血清加入到檢測體系中，觀察由於加入血清造成的整個反應體積的變大、蛋白濃度降低，從而降低螢光強度的影響。但實驗發現這一影響很小，低於1％，可以忽略。
另外對純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2進行了化學螢光標記。Molecular probe公司生產的螢光探針可對蛋白質、多肽、核酸等進行標記，形成穩定的共價鍵。BODIPY 507/545是該公司生產的巰基反應螢光探針，以DMSO溶解成10mmol/l的儲備液。已純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2，標記前先對PB(pH＝7.3)透析，並以PEG10000濃縮成2mg/ml存於PB中的溶液，在室溫、避光、不停震蕩的條件下以1∶100(V/V)的比例緩慢加入BODIPY507/545儲備液(現配現用)，隔絕氧氣，維持室溫、避光、震蕩反應3小時，最後對PB(pH＝7.3)透析終止反應，獲得ENV2-BODIPY507/545(2D)。檢測得知其螢光光譜不變，螢光強度及抗原活性略有下降，可作為FRET檢測試劑。
根據本發明，在合適的反應緩衝液中按相等的抗原活性加入2U和2D組成檢測體系，再加入相應滴度的血清，以GFPuv的激發光激發，掃描500-550nm的發射光，對比加入血清前後發射光譜的變化，發現20分鐘後，加入HIV-1抗體陽性血清的體系最大發射波長由507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗體陰性血清的體系最大發射波長几乎不移動。即以FRET檢測到了HIV-1ENV2的特異性抗原、抗體反應，可應用於愛滋病檢測中(見圖3、圖4)。
綠色螢光蛋白現已發展出多種變異型，它們的特性包括激發光譜、發射光譜的移動，量子產率的變化以至螢光強度的變化，更易於表達等[(Heim R，Prasher DC，Tsien RY，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9112501-12504(1994)，Heim R，Cubitt AB，Tsien RY，Nature，373663-664(1995)]。隨著生物學技術的發展，X-衍射分析、蛋白質結構的預測、定點突變、DNA shuffling等技術應用於蛋白質的設計和改造中，可能產生出更多的GFP突變型，以供選擇成為FRET能量供受體對。從其它物種中也分離並克隆出了一些螢光蛋白，如珊瑚蟲螢光蛋白等。將螢光蛋白基因和抗原的核苷酸序列以分子克隆技術在氨基末端或羧基末端相連，可以製備融合蛋白，獲得螢光抗原。生物表達的螢光抗原，螢光蛋白作為分子探針高度特異地標記在特定的抗原上，可以避免純化工藝不足造成的檢測時的幹擾，其理化性質也是很穩定的。
對於化學合成螢光物質和稀土元素的研究已有很長的歷史，許多基團或稀土元素的螢光特性都已得到了充分的了解，經雙功能交聯劑修飾後即可對病毒蛋白或多肽的氨基、羧基或巰基等基團進行標記，純化後獲得螢光抗原。它們的特點是螢光的量子產率高，反應後螢光光譜的變化很明顯，易於檢測。
根據本發明，可以螢光抗原為檢測試劑，建立一個均勻液相反應體系，加入可能含有特異抗體的血清，一旦發生抗原、抗體的特異反應，抗體兩臂將檢測試劑中的這對螢光能量供受體拉近，就能觀察到FRET。加入某些特殊的添加劑，如Triton、金屬離子等，可能輕微改變溶液的電性從而改變蛋白質的構相，將抗體兩臂間的距離拉得更近。由於FRET的發生與距離的六次方成反比，更近的距離將使FRET的發生更加明顯，從而提高檢測的靈敏度。根據本發明，可以化學發光的抗原和螢光抗原為檢測試劑，建立均勻液相反應體系，加入可能含有特異抗體的血清，一旦發生抗原、抗體的特異反應，抗體兩臂將檢測試劑中的這對螢光能量供受體拉近，只要加入合適的誘發劑，就能觀察到FRET。由於化學發光需要誘導條件，可以用於設定檢測時間、控制測量值的大小，更有利於標準化操作和測定。
以下參照表格、附圖及描述實例以更詳細地說明本發明。
表格中表格1顯示檢測試劑GFPuv、EYFP體系中加入陰、陽性血清前後GFPuv螢光強度的比較表格2顯示檢測試劑2U、2Y體系中加入陰、陽性血清前後GFPuv螢光強度的比較表格3顯示檢測試劑2U、2D體系中加入陰、陽性血清前後體系的螢光高峰比較
圖1顯示GFPuv、EYFP檢測體系中加入陽性血清前後的螢光強度變化圖2顯示GFPuv、EYFP檢測體系中加入陰性血清前後的螢光強度變化圖3顯示檢測試劑2U、2Y體系中加入陽性血清前後的螢光強度變化圖4顯示檢測試劑2U、2Y體系中加入陰性血清前後的螢光強度變化圖5顯示檢測試劑2U、2D體系中加入陽性血清前後螢光光譜的變化圖6顯示檢測試劑2U、2D體系中加入陰性血清前後螢光光譜的變化術語解釋螢光共振能量傳遞(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)指一對合適的螢光物質可以構成一個能量供體(Donor)和能量受體(Acceptor)對，它們之間的距離達到1-10nm的範圍內時，由於偶極-偶極的相互作用，激發供體分子的光子能量hν可能被傳遞至受體分子，而後受體分子通過發射出光子hν』(hν＞hν』)而鬆弛。由Frster於1948年首先提出該理論。均相螢光免疫測定(Homogeneous Fluoroimmunoassay，hFIA)指在同一個均勻溶液系統中一步完成免疫反應和信號的測定，檢測方法包括夾心法和競爭法兩種，都是由抗原、抗體複合物的形成導致其中的標記物螢光信號的改變而進行檢測的。
實施例1 GFPuv和EYFP作為成對蛋白用於檢測血清中抗體的是否存在pGFPuv、pEYFP分別是兩種螢光蛋白GFPuv和YFP的表達載體，將這兩種質粒分別轉化E.coli表達菌株BL21，挑取單克隆30℃搖菌至OD600＝0.6，加入IPTG至終濃度0.5mmol/l，15℃ 200rpm震蕩培養24hr。離心菌體以裂解液(20mM Tris-Cl，5mM EDTA，100mMNaCl，pH＝8.0)吹起，超聲破碎，12000rpm離心10分鐘，上清螢光明顯，用於檢測。
以俄羅斯Lumex公司產螢光全譜儀(FLUORAT-02 PANORAMA)檢測表達上清，GFPuv激發波長395nm，發射波長507nm；EYFP激發波長513nm，發射波長527nm，螢光強度相當。
PSA軟體分析結果顯示，GFPuv、EYFP、EGFP、EBFP四者有很高的同源性，都在95％以上(GFPuvEGFP 96.7％，GFPuvEBFP95.8％，GFPuvEYFP95.8％，EGFPEBFP99.2％，EGFPEYFP97.9％)。基於這一點，取GFPuv免疫小鼠，以獲得螢光蛋白抗體。將GFPuv表達上清以飽和硫銨沉澱，其中50％飽和硫銨沉澱中GFPuv的含量在60％以上。用PBS(20mMNaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4，pH7.4)重懸浮後，對PBS透析，取透析產物進行分子排阻高效液相層析(TSK-GELHPLC，BECKMAN)，產物純度在95％以上。以MBA-2000核酸、蛋白檢測儀測定並調整濃度到2mg/ml，取30μl與等體積的福氏佐劑混勻，四肢肌肉等量注射免疫小鼠，並在2周和7周後分別以同樣劑量加強免疫一次。免疫前後都剪鼠尾採血，分離血清用於免疫檢測。EIA測定發現，GFPuv、EYFP表達上清以碳酸緩衝液1∶2000稀釋包被，仍有良好的免疫反應，與陰性血清對比P/N值都在10以上，適用於FRET檢測。
將GFPvu和EYFP等量混合，取2ul以1∶50的比例稀釋成100ul(稀釋液10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，加入5ul血清，檢測前後的螢光變化。以395nm光對整個液相系統進行激發，螢光光譜的變化在20min內達到穩定。可以看到，加入GFPvu抗體陽性血清後，GFPuv的發射光峰值明顯下降，達17％以上，這是其發射光能量被EYFP吸收所引起的。由於其尾峰的掩蓋，527nm處EYFP的發射光峰值的增加一般不能看到。陰性血清中沒有特異的抗體將兩種螢光抗體拉近，不發生FRET。加入陰性血清後GFPuv發射光也有下降，低於5％，這可能是由一些假陽性的抗原抗體反應引起。但可以體現出陰、陽性血清之間的差別。由於加入血清造成的整個反應體積的變大、蛋白濃度降低，從而螢光強度降低的影響很小，低於1％，可以忽略。(見表1，圖1、圖2)實施例2 ENV2-GFPuv(2u)和ENV2-EYFP(2y)作為成對蛋白檢測血清中是否存在HIV-1抗體已檢測到多數血清都存在以紫外光激發後產生的450nm左右的發射光，構建螢光抗原時避開了最大發射光在448nm的EBFP；同時為避免能量供體的激發光直接為能量受體提供激發能量，也避開了最大激發光波長與最大發射光波長之間距離很近的EGFP(EX＝488nm，EM＝507nm)，選擇了GFPuv(EX＝395nm，EM＝509nm)作為能量供體，EYFP作為能量受體(EX＝513nm，EM＝527nm，以分子克隆的方式構建出能夠融合表達螢光蛋白和抗原蛋白的融合蛋白表達質粒。質粒pRSETB-env2能在大腸桿菌中表達出具有較強抗原活性的重組愛滋病毒包膜蛋白，以限制性內切酶PstI/KpnI處理，切去其終止密碼前的一小段鹼基。同時將含有gfpuv基因的質粒pGFPuv(購自Clonetech公司)也以限制性內切酶PstI/KpnI處理，回收750bp的gfpuv基因片段，連入env2基因3`端，獲得重組質粒pRSETB-env2-gfpuv(2u)。同樣，以限制性內切酶BamHI/KpnI同時處理質粒pRSETB-env2和pEYFP，連接750bp的eyfp基因於env2基因的3`端，獲得重組質粒pRSETB-env2-eyfp(2y)。
構建的質粒轉化Ecoli BL21菌株，30℃搖菌至OD600＝0.6，加入IPTG至終濃度0.5mmol/l，15℃ 200rpm震蕩培養24hr。離心菌體以裂解液(20mM Tris-Cl，5mM EDTA，100mM NaCl，pH＝8.0)吹起，超聲破碎，12000rpm離心10分鐘，取上清用於檢測。
以12％SDS-PAGE觀察，2Y、2U均為43KD(ENV2 16KD，GFPuv、EYFP27KD)，含量約佔上清的20％。以螢光全譜儀FLUORAT-02(俄羅斯產)分別檢測2Y、2U的螢光，2U最大激發光波長Ex＝395nm，最大發射光波長Em＝509nm，2Y最大激發光波長Ex＝513nm，最大發射光波長Em＝527nm，與單獨表達的GFPuv、EYFP相同，但螢光強度相對減弱。EIA檢測二者均有較強的免疫學活性，但低於單獨的ENV2。
將2Y和2U等量混合，取100ul以1∶30的比例稀釋成3ml(稀釋液10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，加入50ul血清，檢測前後的螢光變化。以395nm光對整個液相系統進行激發，螢光光譜的變化在20min內達到穩定。.可以看到，加入HIV-1抗體陽性血清後，GFPuv的發射光峰值明顯下降，達14％以上，這是其發射光能量被EYFP吸收所引起的。由於其尾峰的掩蓋，527nm處EYFP的發射光峰值的增加一般不能看到，但強陽性血清與抗原的反應比例合適而充分時，也有增強的現象。陰性血清中沒有特異的抗體將兩種螢光抗體拉近，不發生FRET。加入陰性血清後GFPuv發射光也有下降，低於5％，這可能是由一些假陽性的抗原抗體反應引起。但可以體現出陰、陽性血清之間的差別。由於加入血清造成的整個反應體積的變大、蛋白濃度降低，從而螢光強度降低的影響很小，低於1％，可以忽略。(見表2，圖3、圖4)實施例3 2u和ENV2-BODIPY 507/545(2D)作為成對蛋白用於檢測血清中是否存在HIV-1抗體。
對純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2進行了化學螢光標記。螢光物質購於Molecular probe公司。BODIPY 507/545為紅色固體粉末，避光、乾燥、保存於-20℃。標記前挑取適量乾粉，溶於200μl DMSO成紅色溶液，測其在507nm激發光下的吸光值A。根據公式C＝A/ε(ε＝69000)算出BODIPY 507/545的實際濃度，再加DMSO調整濃度到10mM。純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2，純度達95％，濃度為0.5mg/ml，保存於Tris-Cl緩衝液中，標記前先對PB(pH＝7.3)透析，並以PEG10000濃縮成為2mg/ml存於PB中的溶液。將抗原ENV2等分，每200μl到一0.5ml eppendorf管中，室溫下避光、不停震蕩、緩慢加入2μl稀釋好的BODIPY507/545溶液(現配現用)，蓋好管蓋，維持室溫、避光、震蕩反應3小時。反應後，溶液對PB(pH＝7.3)透析終止反應，獲得ENV2-BODIPY507/545(2D)。檢測其螢光光譜及抗原性。光譜為激發光504nm，發射光530nm，EIA檢測抗原活性下降10％，可作為FRET檢測試劑。
在100μl反應緩衝液(含10％牛血清、0.5％酪蛋白、2％BSA、5‰TritonX-100、1ppm氨基吡啉)中加入5μl 2U和5μl 2D，裝入酶聯免疫檢測微孔板的微孔中，再加入3μl血清，檢測前後的螢光光譜變化。以395nm光激發，掃描500-550nm的發射光，對比加入血清前後發射光譜的變化，發現20分鐘後，體系的螢光強度整體提高，可能是TritonX-100提高了螢光團的螢光效率的結果。加入HIV-1抗體陽性血清的微孔最大發射波長由507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗體陰性血清的微孔最大發射波長几乎不移動，在510nm左右。即以FRET檢測到了HIV-1ENV2的特異性抗原、抗體反應，可應用於愛滋病檢測中，以尋找最大發射波長的位置確定血清中是否含有陽性抗體(見表3、圖5、圖6)。
表1.加入不同血清前後507nm螢光強度的比較
表2.加入陰、陽性血清的509nm螢光強度比較50ul 2Y+50u12U稀釋→3000ul 激發光Ex＝395nm
表3.加入不同血清前後螢光最大發射波長的變化Ex＝395nm 掃描Em 480~550nm
權利要求
1.具有螢光共振能量轉移(FRET)特徵的由蛋白A和蛋白B組成的成對蛋白，其中蛋白A是作為能量供體且帶有螢光物質或化學發光物質的抗原，蛋白B是作為能量受體且帶有螢光物質的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結合的共同抗原決定簇。
2.根據權利要求1的成對蛋白，其中蛋白A可選自病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關抗原或其它具有抗原決定簇的物質。
3.根據權利要求1的成對蛋白，其中蛋白B可選自病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關抗原或其它具有抗原決定簇的物質。
4.根據權利要求1-3任一要求的成對蛋白，其中螢光物質可選自螢光蛋白、螢光素、稀土元素、淬滅物質等。
5.根據權利要求1-3任一要求的成對蛋白，其中化學發光物質可選自發光蛋白和魯米諾、過氧草酸鹽等化學合成發光物質。
6.根據權利要求4的成對蛋白，其中螢光蛋白可選自綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、藍色螢光蛋白、紅色螢光蛋白及其它螢光蛋白。
7.根據權利要求5的成對蛋白，其中發光蛋白可選自水母發光蛋白及它的各種變異型。
8.一種用於檢測標本中抗體存在的方法，該方法包括(a)權利要求1-7任一要求的成對蛋白與待測標本中的抗體相互接觸，形成抗原、抗體複合物；(b)檢測該抗原抗體複合物的存在，該抗原抗體複合物的存在指示該標本中與該成對蛋白共同抗原特異結合的抗體的存在。
9.權利要求8的方法，其中待測抗體可為愛滋病毒抗體、B型肝炎病毒抗體、C型肝炎病毒抗體。
10.一種檢測盒，其包括(1)權利要求1-7任一要求的成對蛋白，(2)緩衝液，及(3)如必要離子和/或表面活性劑。
全文摘要
本發明涉及具有螢光共振能量轉移(FRET)特徵的由蛋白A和蛋白B組成的成對蛋白,蛋白A是作為能量供體且帶有螢光物質或化學發光物質的抗原,蛋白B是作為能量受體且帶有螢光物質的抗原,而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結合的共同抗原決定簇,由蛋白A、B和適當的緩衝液組成的均相免疫檢測藥盒,及它們用於檢測標本中抗體存在的用途,尤其在愛滋病毒抗體、B型肝炎病毒抗體、C型肝炎病毒抗體的檢測方面的用途。
文檔編號G01N33/576GK1353313SQ0013029
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月3日 優先權日2000年11月3日
發明者夏寧邵, 羅文新, 張軍, 謝小燕, 李少偉 申請人:廈門大學