生長快成活率高牙鮃優良品系的選育方法
2023-09-10 23:39:30
專利名稱：生長快成活率高牙鮃優良品系的選育方法
技術領域：
本技術屬於海洋生物技術領域，是一種選擇培育生長速度快、成活率高牙鮃新品系的育種方法。
背景技術：
牙鮃(Paralichthys olivaceus)是分布在我國沿海的主要經濟魚類，是天然捕撈、工廠化、池塘和網箱養殖的主要對象，在漁業產量中佔有較大的比重。但是隨著對天然魚類資源捕撈強度的加大，牙鮃種質資源的衰退已經顯現。另外在人工養殖環境下，長期以來我國對牙鮃優良品種選育未得到足夠的重視，近親交配繁殖、集約化養殖等導致牙鮃養殖品種種質退化、生長速度降低、養殖周期長、養殖效率低，嚴重影響了牙鮃苗種大面積養殖推廣和產業化的發展。因此利用牙鮃不同地理群體及人工篩選的抗病群體進行牙鮃品種培育，培育生長速度快、抗逆力強的牙鮃養殖新品種，對於牙鮃種質恢復、提高養殖產品質量和經濟效益具有重要意義。在牙鮃養殖新品種的研究方面，Kanako Fuji等篩選培育出一個能夠抗病淋巴囊腫病的養殖群體(Faculty of Marine Science，Tokyo University ofMarine Science and Technology，Kanako Fuji et al，Aquaculture，2006)。近年來本課題組利用微衛星標記和AFLP技術對牙鮃養殖群體和野生群體的遺傳結構進行評價(中國水產科學研究院黃海水產研究所，Liu et al，Aquaculture，2005)，發現養殖群體的遺傳多樣性明顯降低。分析了牙鮃抗病魚和不抗病魚的MHC II B基因多態性與抗鰻弧菌病的相關性，初步篩選到抗病相關的MHC II B基因型(中國水產科學研究院黃海產研究所，Zhang etal，Marine Biotechnology，2006)，同時利用3個育種群體建立了牙鮃家系(中國水產科學研究院黃海產研究所，陳松林，田永勝等，水產學報，2008)，從此展開了國內牙鮃育種工作，但是在生長快、成活率高牙鮃新品系的選擇培育方面在國內外還屬首次。
發明內容
本發明的目的是針對人工養殖環境下牙鮃苗種生長速度慢和成活率低的問題，培育出生長速度快、成活率高的牙鮃新品系，從而提高牙鮃養殖經濟效益。
本發明是通過以下技術方法實現的 本發明內容主要包括1、牙鮃育種群體培育和生殖調控，2、精子冷凍技術輔助家系建立，3、家系培育和標準化，4、數量性狀的測量和分析，5、遺傳參數估計，6、優良家系篩選，7、利用異源冷凍精子誘導牙鮃雌核發育構建優良品系。
1、牙鮃育種群體培育和生殖調控 將如下3個牙鮃育種群體分別利用電子標識標記，建立育種檔案，在人工養殖條件下集中飼養培育，達到2-3齡。育種群體的年培育溫度控制在13-25℃，採用正常日照，每年2-5月的繁殖季節水溫控制在14-17℃，光照時間15h，光照強度1500-2000lux，連續照射1-2月，水流交換量為6-7m3/h，親魚在非繁殖季節利用市售人工配合鉺料飼喂，繁殖季節利用添加維生素E的野雜魚飼喂。經過以上培育達到性成熟，可產出成熟卵子。4個育種群體包括①抗病育種群體(RS)利用人工感染鰻弧菌的方式從養殖群體中篩選感染病菌後長期不發病的個體100尾組成。②日本育種群體(JS)從日本引進牙鮃魚苗經人工培育、篩選30尾組成。③黃海育種群體(YS)從山東省煙臺地區沿海收集天然捕撈的野生牙鮃個體50尾組成。
2、精子冷凍技術輔助家系建立 利用人工擠壓腹部法，採集成熟牙鮃親魚精液，利用MPRS+20％DMOS溶液以體積比1∶1的比例稀釋，注入2.0ml冷凍管中，放入液氮中冷凍保存，MPRS溶液的各成分濃度為NaCl 60.35mM，NaH2PO41.8mM；NaHCO33mM，KCl 5.23mM，CaCl2.2H2O 1.13mM，MgCl2.6H2O 1.13mM，D-Glucose 55.55mM。DMSO為市售二甲基亞碸。
利用以上方法冷凍保存以上3個育種群體及篩選優良家系成熟雄魚的精子，並且從其它養殖公司收集和冷凍保存了牙鮃雄魚精子，預先建立牙鮃育種群體精子冷凍庫，利用冷凍精子輔助人工受精。在3個育種群體之間或群體內親本之間，採用1雄多雌或1雌多雄的交配方式建立牙鮃家系。
3、家系培育和標準化 利用水質、水流量、溫度和光照可控制的循環水車間進行家系孵化、苗種培育，每個家系的培育水體為3m3水缸，水流量可在1-5m3/h之間調控，水溫可在14-25℃調控，光照可保持10-15h。利用小球藻、輪蟲和滷蟲進行早期魚苗的培育，利用人工配合餌料進行後期魚苗的培育。分別在魚苗生長至15、50、90、150、210d左右對每個家系的養殖數量進行標準化，標準化魚苗數量分別為10000、1000、500和200尾，210d將標準化魚苗集中飼養在1-2個30m3水池中，同時利用紅、橙、黃3種螢光顏料，在魚苗腹部選擇背前、背中、背後、腹後和腹中5個位置，利用注射方式對選擇家系個體進行標記。
4、數量性狀測量和分析 家系生長性狀測量家係數量性狀的測量時間為生長至90、210、510、720(2齡)幾個時間段，90-210天是牙鮃家系建立後第一個高溫季節，也是牙鮃魚苗的第一個快速生長期；210-510天為魚苗第一個越冬期和第二個快速生長期，720天魚苗已經度過了第二個冬季，大部分個體已經達到了商品魚規格，而且部分生長快的個體達到了性成熟。在各時期相繼測量魚苗的體長(從吻端至尾鰭末端)、體重和養殖存活數量。
性狀分析利用牙鮃家系不同生長時期測量的體長、體重數據，採用單因素方差分析及Student-Newman-Keuls(SNK)法對不同家系生長性狀進行多重比較分析，同時計算生長平均值和標準差。利用絕對增重公式AGRW(g.d-1)＝(W2-W1)/(t2-t1)計算每個家系生長一定時期的絕對增重率。利用(魚苗成活數量/標準化後總數)*100％計算家系成活率。分析家系間的生長差異，選擇出生長最快和成活率高的家系。
5、遺傳參數的估計 利用不同生長時期測定的牙鮃家系體長、體重數據，採用線形混合模型(Linear mixed model)、「加性-顯性」遺傳分析模型及約束極大似然法(REML)估計體長和體重性狀的加性和顯性方差組分、協方差組分、遺傳相關和遺傳力。加性和顯性方差達到極顯著水平(P＜0.01)，遺傳相關達到極顯著正相關水平(P＜0.01)，遺傳力達到極顯著(P＜0.01)且大於0.2，說明對體長和體重的選擇效果明顯，以此來檢測選擇育種過程中遺傳因素和環境因素發生的作用，為牙鮃選擇育種提供相關參數。
6、優良家系篩選 通過對標準化後家系生長性狀的測定和對比分析，從建立的家系中篩選出體長和體重具有顯著性差異(P＜0.05)，90-524d的絕對增重率在0.25以上，成活率在80％以上的家系，做為生長快、成活率高家系繼續培育。將篩選出的家系利用標記從集中養殖池中與其它家系分離，專池培育至2-3齡達性成熟，培育方法如內容1所述，並在每個個體上注射永久性電子標記，記錄電子標識，建立育種檔案。
7、利用異源冷凍精子誘導牙鮃雌核發育構建優良品系 預先採集成熟的鱸魚精子，利用MPRS+20％DMOS溶液以體積比1∶1的比例稀釋鱸魚精子，採用2.0ml冷凍管在液氮中冷凍保存，建立鱸魚精子冷凍庫，MPRS溶液的各成分濃度為NaCl 60.35mM，NaH2PO41.8mM；NaHCO33mM，KCl 5.23mM，CaCl2.2H2O 1.13mM，MgCl2.6H2O 1.13mM，D-Glucose55.55mM。DMSO為市售二甲基亞碸。
將篩選的優良家系培育至性成熟，通過人工生殖調控達到產卵要求，利用人工擠壓腹部法採集未受精卵。隨之利用37℃水浴解凍鱸魚精子，利用MPRS稀釋液將精子以1∶10的比例稀釋，在直徑為10cm的培養皿中加入1ml稀釋精液鋪平，在40000μJ/cm2強度紫外線下照射，使其遺傳物質失活，加入牙鮃卵中進行幹法授精，受精卵與精液比為100∶0.4，授精3min後浸入2～4℃海水中冷休克處理45min，使其染色體加倍，然後將卵放入17℃海水孵化，至此完成了優良牙鮃家系雌核發育，建立優良品系。
本發明技術方案的技術特點1、利用了太平洋西岸牙鮃分布上具有典型地理特點的牙鮃育種群體日本牙鮃和黃海牙鮃，以及人工感染方法構建了抗病牙鮃群體，豐富了牙鮃優良品種選育的遺傳背景。2、將魚類精子冷凍保存技術溶合到牙鮃家系的建立中，為雜交組配提供了豐富的牙鮃精子來源和更多的組配方式，提高了家系建立效率。3、利用異源冷凍鱸魚精子誘導了牙鮃優良家系個體雌核發育，提高了優良家系基因的純合速度，1代雌核發育相當了4代全同胞兄妹自交，同時異源精子的誘導保證了雌核發育後代基因的純合性。4、通過大量家系的建立和篩選、數量性狀的測量和多重比較、遺傳參數的估計和雌核發育方法篩選並建立了生長速度快牙鮃新品系0719、0750和0751。5、將精子冷凍技術、雌核發育技術、數量性狀的遺傳參數估計等現代生物技術與傳統的選擇育種有機的結合在一起，提高了新品種選育的效率，建立了一條育種的新途徑。
具體實施例方式 本發明技術方案所依據的科學原理將現代生物技術與傳統的選擇育種技術相結合進行新品種培育。選擇育種(selective breding)是根據育種目標，在現有品種或育種材料內出現的自然變異類型中，經比較鑑定，通過多種選擇方法，選優去劣，選出優良的變異個體，培育新品種的方法。家系選育是選擇育種的方法之一，通過家系的建立、繁殖、比較，淘汰不良家系，選擇符合標準的家系，逐代提高品種的遺傳純合性，可選育出具有穩定優良性狀的新品種。本發明技術將精子冷凍保存技術、雌核發育技術、遺傳參數估計等現代生物技術與傳統的選擇育種技術有機的結合在一起，提高育種水平，顯著加快了魚類新品種培育進程。
下面通過實施例詳細敘述本發明的技術內容 本發明內容主要包括1、牙鮃育種群體培育和生殖調控，2、精子冷凍技術輔助家系建立，3、家系培育和標準化，4、數量性狀的測量和分析，5、遺傳參數估計，6、優良家系篩選，7、利用異源冷凍精子誘導牙鮃雌核發育構建優良品系。
1、牙鮃育種群體培育和生殖調控 將3個牙鮃育種群體利用電子微粒注射法進行標記，並記錄其電子標識，同時對其體長、體重進行測量和記錄，建立育種群體檔案。3個育種群體包括①抗病育種群體(RS)利用人工感染鰻弧菌的方式從養殖群體中篩選感染病菌後長期不發病的個體100尾組成。②日本育種群體(JS)從日本引進牙鮃魚苗經人工培育、篩選30尾組成。③黃海育種群體(YS)從山東省煙臺地區沿海收集天然捕撈的野生牙鮃個體50尾組成。
經過人工培育達到2-3齡，育種群體的年培育溫度控制在13-25℃，採用正常日照，每年2-5月的繁殖季節水溫控制在14-17℃，光照時間15h，光照強度1500-2000lux，連續照射1-2月，水流交換量為6-7m3/h，親魚在生長季節以投餵人工混合飼料，繁殖期飼餵添加維生素E的野雜魚，經過以上生長和生殖調控，達到性成熟和人工繁殖要求，人工擠壓魚體腹部可流出成熟的卵子和精子。
2、精子冷凍技術輔助家系建立 牙鮃精子冷凍保存方法利用人工擠壓腹部法採集成熟的牙鮃精子，顯微鏡檢測精子活力，活力在70％以上者，利用MPRS+20％DMOS溶液以體積比1∶1的比例稀釋，採用2.0ml冷凍管在液氮中冷凍保存。共冷凍保存各育種群體的牙鮃精子500餘份(約900ml)，建立牙鮃精子冷凍庫。在人工繁殖時，將冷凍保存的牙鮃精子在37℃水浴中解凍，鏡檢凍後精子活力，如精子活力保持在70％以上，可與採集的牙鮃卵幹法受精，受精時卵精比例為100ml∶1ml。
牙鮃家系建立方法利用以上3個育種群體，選擇群體中性成熟個體，人工採集卵子和精子(或冷凍庫中精子)，在3個育種群體內或群體間採用如下交配方式建立半同胞或全同胞家系RS♂×JS♀、RS♂×RS♀、RS♂×YS♀、JS♂×RS♀、JS♂×JS♀、JS♂×YS♀、YS♂×RS♀、YS♂×JS♀。(表1)。
表1 2007牙鮃家系系譜
注RS抗病牙鮃，JS日本牙鮃，YS黃海牙鮃 3、家系的培育和標準化 家系培育牙鮃家系魚苗培養在3m3水缸中，早期採用微流水，每天交換量1-2m3，保持水質清新，每天早晚各1次利用虹吸法清洗池底沉澱的藻類、過剩的飼料。3m3水缸中放養初孵仔魚數量在10000尾左右，伏底魚苗(體長1cm)2000尾，5-7cm魚苗1000尾，10-15cm魚苗500尾。水體中小球藻的濃度保持在8～10萬個/ml，輪蟲投餵量以水中5-10個/ml為宜，滷蟲投餵量以1-2個/ml為宜。人工飼料的投餵應當以魚苗規格大小及時調節飼料顆粒大小，第12-15天開始投餵顆粒配合飼料，25天前苗種顆粒飼料粒徑250-400μm，0.1-0.15g體重的仔稚魚顆粒飼料粒徑400-600μm，0.5g體重顆粒飼料粒徑800μm左右。隨著魚體的生長，配合飼料粒徑逐漸增加。配合飼料日投飼量為魚體重的5-15％，投餵及時，宜少投勤投。防止飼料過剩、溫度變化、水質汙染、水流不穩定等現象發生。
家系標準化家系標準化的主要目的將養殖環境造成的家系差異降低到最低。家系養殖至15天左右對魚苗密度進行初步調整，使每缸魚苗數量保持在10000尾左右，養殖到50天對所有家系進行第一次標準化，每個家系隨機選留2000尾魚。90天左右(5-7cm)選留1000尾，150天左右(10-15cm)選留500尾繼續養殖。養殖到210天左右從每個家系中隨機的選擇200尾個體，利用紅、黃、橙3個種螢光顏料，在魚苗腹部選擇背前、背中、背後、腹後和腹中5個位置進行標記，標記後集中飼養在1-2個30m3水池中，同時對選擇家系個體的體長、體重逐一測量，此時完成家係數量和養殖環境的標準化。
4、數量性狀的測量和分析 2007年建立牙鮃家系在生長到平均日齡至90、524d左右，對每個家系的體長、體重、成活率進行了測量，利用單因素方差分析及Student-Newman-Keuls(SNK)法對不同家系生長性狀進行多重比較，分析家系間的生長差異。利用絕對增重率(AGRW，g.d-1)＝(W2-W1)/(t2-t1)，對每個家系生長90d至524d絕對增重率進行了計算，平均日齡(t2-t1)按286d計算，成活率＝(524d家系存活數量/200尾)*100％，依據絕對增重率和養殖成活率篩選出生長快、成活率高的家系，0719、0750、0703、0751號家系生長最快成活率最高(表2)。
表2 2007年牙鮃家系90d和524d生長性狀比較
注*在生長方面具有顯著性差異(P＜0.05) 5、遺傳參數的估計 利用2007年建立了63個家系，收集了所有家系5328尾魚苗的體長和體重數據.藉助線形混合模型(Linear mixed model)、「加性-顯性」模型、約束極大似然法(REML)分別估計體長和體重的遺傳相關和遺傳力。結果顯示體長和體重兩性狀的加性、顯性、表型和基因型相關分量都達到極顯著水平(P＜0.01)，體長和體重的加性方差比率均大於顯性方差比率，可見兩性狀的遺傳效應主要取決於基因的加性效應。體長和體重達到極顯著正相關(P＜0.01)。體長的總遺傳效應率為31.20％，體重的總遺傳效應率為33.58％，體長和體重的隨機方差比率分別達到68.80％和66.41％，說明養殖環境等因素對牙鮃體長和體重的影響較大，同時說明在牙鮃選擇育種中消除環境影響極為重要。體長和體重的狹義遺傳率分別為0.20和0.26(P＜0.01)，廣義遺傳率分別為0.31和0.34(P＜0.01)，牙鮃在以上兩性狀上屬於中等遺傳力，通過選擇育種可取得較大的遺傳進展(表3)。
表3利用「加性-顯性」模型對牙鮃家系體長和體重方差分量、方差分量比率及遺傳力估計結果
注0**表示顯著性水平P＜0.01 6、優良家系的篩選 經過對2007年家系培育、生長、成活率性狀的測定、多重比較及遺傳參數估計，篩選出了2007年家系中具有生長快、成活率高性狀的牙鮃家系共4個分別為0719、0703、0750和0751(表2、表4)，絕對增重率為0.27-0.372，成活率為82.5-100％。經過對篩選家系的人工培育、生殖調控，培育和調控方法如具體實施方法1所述，2009年春季部分家系個體已經達到性成熟，通過異源冷凍精子誘導建立了雌核發育品系(表5)。
表4 2007年家系篩選結果
注1-背前，2-背後，3-腹後，Y-黃色，O-橙色，R-紅色 7、利用異源冷凍精子誘導牙鮃雌核發育構建優良品系 通過對2007年篩選出的生長快、成活率高家系0719、0750、0751的人工培育、生殖調控，於2009年4月達到性成熟，利用擠壓腹部法可採集到未受精卵。同時於2008年11月冷凍保存鱸魚精子200ml，建立了其精子庫，在受精時利用37℃水浴解凍精子，利用MPRS稀釋液將精子以1∶10的比例稀釋，在40000μJ/cm2強度紫外線下照射，使其遺傳物質失活。採集以上成熟家系個體卵子，將失活的鱸魚精子加入卵中，進行幹法授精，受精時卵精比例為100∶0.4，授精3min後放入2-4℃海水中冷休克處理45min，然後放入17℃海水孵化和魚苗培育。相繼建立以上家系雌核發育系7個分別為0921、0927、0920、0938、0939、0946和0947(表5)。對雌核發育系生長進行了測量，目前雌核發育系體長為10.54-12.28cm，體重為13.19-20.62g。
表5牙鮃雌核發育優良品系系譜及生長情況
注RS-抗病牙鮃，JS-日本牙鮃，S.P-滅活的鱸魚冷凍精子
權利要求
1.一種生長快成活率高牙鮃優良品系的選育方法，其特徵在於它的方法，包括牙鮃育種群體的培育和生殖調控、精子冷凍技術輔助家系建立、家系的培育和標準化、數量性狀的測定和分析、遺傳參數估計、優良家系篩選、利用異源冷凍精子誘導牙鮃雌核發育構建優良品系；將事先構建的抗病牙鮃、日本牙鮃、黃海牙鮃利用電子微粒注射標記，集中培育達2-3齡，年培育溫度控制在13-25℃，投餵人工配合飼料；每年2-5月繁殖季節水溫控制在14-17℃，光照時間15h，光照強度1500-2000lux，連續照射1-2月，水流交換量為6-7m3/h，飼餵添加維生素E的野雜魚培育，達到性成熟時，人工採集成熟牙鮃卵子和精子，鏡檢活力在70％以上的精子冷凍保存在液氮中，建立牙鮃精子冷凍庫；人工繁殖時將冷凍精子在37℃水浴中解凍，鏡檢活力在70％以上者與卵子幹法受精，其卵精比例為100ml∶1ml；在3個育種群體間或群體內以1雄多雌或1雌多雄的交配方式，建立全同胞或半同胞家系；210d前的家系培育在3m3水缸中，水流量調控在1-5m3/h之間，水溫14-25℃；分別在魚苗生長至15、50、90、150、210d左右對每個家系的養殖數量進行標準化，標準化魚苗數量分別為10000、1000、500和200尾，210d分別利用紅、黃、橙3種螢光顏料，在魚苗腹部選擇背前、背中、背後、腹後和腹中5個位置對家系選擇個體進行標記，併集中養殖在1-2個30m3水池中；家系生長至90、210、510、720d幾個時間段對其體長、體重和成活率進行測定，利用方差分析、多重比較、絕對增重和成活率比較分析家系生長情況；採用線性混合模型對測量性狀遺傳參數進行估計，體長和體重的狹義遺傳率分別為0.20和0.26(P＜0.01)，廣義遺傳率分別為0.31和0.34(P＜0.01)；通過以上方法篩選出生長快、成活率高牙鮃家系4個分別為0703、0719、0750、0751號家系。將篩選家系培育成熟，可產出成熟卵子；將冷凍保存的鱸魚精子在37℃水浴中解凍，用MPRS以1∶10的比例稀釋鱸魚精液，後在40000μJ/cm2紫外線下照射，使其遺傳物質失活，加入牙鮃卵中進行幹法授精，受精卵與精液體積比為100ml∶0.4ml，授精3min後浸入2～4℃海水中冷休克處理45min，誘導牙鮃卵雌核發育，然後將卵放入17℃海水孵化，建立生長快、成活率高牙鮃品系，共建立7個優良品系，分別為0920、0921、0927、0938、0939、0946、0947號品系。
全文摘要
一種生長快成活率高牙鮃優良品系的選育方法，其技術方法包括牙鮃育種群體的培育和生殖調控，精子冷凍技術輔助家系建立，家系的培育和標準化，數量性狀的測定和分析，遺傳參數估計，優良家系篩選和利用異源冷凍精子誘導牙鮃雌核發育構建優良品系。本發明可選擇培育出生長速度快、成活率高牙鮃養殖新品系，篩選出生長快、成活率高的優良牙鮃家系共4個(0703、0719、0750和0751)，利用冷凍保存的鱸魚精子，誘導建立了雌核發育的牙鮃優良品系7個(0920、0921、0927、0938、0939、0946和0947)。該技術方法可用於牙鮃養殖新品種培育，解決海水養殖魚類牙鮃生長慢、成活率低的問題，可提高牙鮃養殖經濟效益。
文檔編號A01K61/00GK101699998SQ20091023001
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月3日 優先權日2009年11月3日
發明者田永勝, 陳松林, 鄧寒, 徐田軍, 王磊 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所