β‑葡聚糖測定方法與流程
2023-09-11 02:25:30 2
本申請要求於2013年12月5日提交的美國臨時專利申請序列號61/912,275，以及於2014年5月30日提交的美國臨時專利申請序列號62/005,335的優先權，所述美國臨時專利申請各自通過引用併入本文。概述本公開內容提供了用於就生物標記物分析來自受試者的樣品的方法，所述生物標記物指示受試者對β-葡聚糖的免疫應答。在一些實施方案中，該方法一般包括從受試者中獲得生物樣品，與參考標準品相比較就生物標記物抗β-葡聚糖抗體分析樣品，計算樣品中的抗β-葡聚糖抗體濃度或關於抗β-葡聚糖抗體的相對抗體單位（RAU）值，並且如果抗β-葡聚糖抗體濃度或RAU值大於預定的抗β-葡聚糖抗體濃度或關於生物標記物抗β-葡聚糖抗體的RAU值，則將受試者鑑定為生物標記物陽性的。在其他實施方案中，該方法一般包括從受試者獲得生物樣品，與參考標準相比較就生物標記物抗β-葡聚糖抗體分析樣品，並且如果樣品含有的抗β-葡聚糖抗體的量大於關於生物標記物抗β-葡聚糖抗體的預定截斷值（其將生物標記物陽性受試者與生物標記物陰性受試者分開），則將受試者鑑定為生物標記物陽性的。在一些實施方案中，生物標記物抗β-葡聚糖抗體可以是IgG。在這些實施方案的一些中，預定的RAU值可以是200。在一些實施方案中，生物標記物抗β-葡聚糖抗體可以是IgM。在這些實施方案的一些中，預定的RAU值可以是300。在一些實施方案中，該方法可以進一步包括給鑑定為生物標記物陽性的受試者施用包括β-葡聚糖的組合物。在一些實施方案中，該方法可以進一步包括給鑑定為生物標記物陽性的受試者施用包括抗β-葡聚糖IgG2的組合物。在一些實施方案中，β-葡聚糖衍生自酵母，例如β-1,3/1,6葡聚糖。在某些實施方案中，β-葡聚糖可以包括β（1,6）-[聚（1,3）-D-吡喃葡糖基]-聚β（1,3）-D-吡喃葡萄糖。在一些實施方案中，就生物標記物抗β-葡聚糖抗體分析樣品可以涉及使用酶聯免疫吸附測定（ELISA）。本發明的上述概括並不意圖描述本發明的每個公開的實施方案或每一種實現。下述說明書更具體地示例了說明性實施方案。在整個申請的幾個地方，通過實施例列表提供了指導，所述實施例可以以各種組合使用。在每種情況下，所述列表僅充當代表性組，並且不應解釋為詳盡列表。附圖簡述圖1A.對參考血清指定160的任意值（即160相對抗體單位[RAU]/mL）。因此，在校準曲線上的最高點1:400稀釋度導致400mRAU/mL的值，並且在校準曲線上的最低點1:51200稀釋度導致3.125mRAU/mL的值。平均RAU/mL=365。圖1B.IgG抗β-葡聚糖抗體濃度工作標準曲線。圖1C.IgM抗β-葡聚糖抗體濃度工作標準曲線。圖2.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的八個健康志願者的全血摻料有濃度增加的IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）。去除血漿並且對於每個樣品確定RAU值。圖3.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的四個健康志願者的血液樣品摻料有濃度增加的IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）。全血細胞用以10µg/mL的IMPRIMEPGG進行處理，並且在37℃下溫育30分鐘，並且分析嗜中性粒細胞結合。圖4.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的八個健康志願者的全血細胞與IMPRIMEPGG（10mg/ml）和IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）一起培養，並且就IMPRIMEPGG結合和功能進行評估（30分鐘溫育用於補體分析；2小時溫育用於結合和受體調節分析；過夜培養用於細胞因子分析）。圖5.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAU<100）抗β-葡聚糖抗體的八個健康志願者的全血細胞與IMPRIMEPGG（10mg/ml）和IVIG（0、2.5、5和10mg/ml）一起培養，並且就IMPRIMEPGG誘導的SC5b-9釋放進行評估。圖6.來自具有低水平IgG（RAU<200）和IgM（RAUIVIG-5組（RAU233-610）中發生，並且因此關於IgG截斷的進一步分析應集中於高於200的RAU範圍。圖8.通過IgGRAU水平標繪的IMPRIMEPGG的健康志願者嗜中性粒細胞結合。圖9.通過IgGRAU水平標繪的IMPRIMEPGG的健康志願者嗜中性粒細胞結合。帶圓圈的受試者是具有低IgGRAU的高嗜中性粒細胞結合者，但具有高IgMRAU，因此，可以從IgGRAU分析中去除。圖10.通過IgGRAU水平標繪的IMPRIMEPGG的健康志願者嗜中性粒細胞結合。在235的IgGRAU截斷將其RAU足以促進結合（生物標記物陽性）的志願者相對於其RAU不足以促進結合（生物標記物陰性）的志願者分離。圖11.通過IgGRAU水平標繪的IMPRIMEPGG的健康志願者嗜中性粒細胞結合。帶圓圈的個體是IgG生物標記物陰性但高IgMRAU的。圖12.通過IgGRAU水平標繪的IMPRIMEPGG的健康志願者嗜中性粒細胞結合。綠色圓圈中的非藍色志願者基於高IgGRAU已經是生物標記物陽性的，並且因此，可以從IgMRAU分析中去除。圖13.通過IgGRAU水平標繪的IMPRIMEPGG的健康志願者嗜中性粒細胞結合。在330的IgMRAU截斷將其RAU足以促進結合（生物標記物陽性）的志願者相對於其RAU不足以促進結合（生物標記物陰性）的志願者分離。圖14.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖抗體水平和C4a生產的關聯。用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養物中的C4a量在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的倍數變化而呈現。在X軸呈現了關於每個組的平均倍數變化+SEM。具有IgGRAU>235的8/10個體（80%）和具有IgGRAU1.5倍的C4a生產，支持高RAU和更大的補體活化之間的顯著關聯（**p=0.0069）。圖15.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖抗體水平和C5a生產的關聯。用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養物中的C5a量在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的倍數變化而呈現。在X軸呈現了關於每個組的平均倍數變化+SEM。具有IgGRAU>235的10/10個體和具有IgGRAU1.5倍的C5a生產，支持高RAU和更大的補體活化之間的顯著關聯（*p=0.0381）。圖16.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖RAU水平和SC5b-9生產的關聯。與IMPRIMEPGG（10μg/ml）一起溫育30分鐘的健康個體全血培養物中的SC5b-9量。作為超過檸檬酸鹽對照的倍數變化而呈現的SC5b-9水平（Y軸）通過IgGRAU狀態（X軸）分層。具有IgGRAU>235的11/11（即100%）個體相對於具有IgGRAU2倍的SC5b-9生產，支持高RAU和更大的補體活化之間的顯著關聯（**p=0.0082）。圖17.來自健康供體的全血的PMN中的抗β-葡聚糖抗體水平和CR3的表面表達增加的關聯。在用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養物中的CD15+嗜中性粒細胞上的CR3表面表達在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的MFI百分比變化而呈現。在X軸呈現了關於每個組的平均MFI百分比變化+SEM。與具有IgGRAU235的個體（N=11）的嗜中性粒細胞證實表面CR3水平中的顯著增加（*p=0.0211）。圖18.來自健康供體的全血的PMN中的抗β-葡聚糖抗體水平和CD88表達降低的關聯。在用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養物中的CD15+嗜中性粒細胞上的CD88表面表達在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的MFI百分比變化而呈現。在X軸呈現了關於每個組的平均MFI百分比變化+SEM。與具有IgGRAU235的個體（N=13）的嗜中性粒細胞證實表面CD88水平中的顯著降低（*p=0.0197）。圖19.健康供體全血與IMPRIMEPGG（10μg/ml）一起溫育，並且測定在CD15+嗜中性粒細胞上的CD62L表面表達。CD15+CD62Llo細胞百分比（各個和平均值±SEM）通過X軸上的RAU狀態分層而存在於Y軸上。來自具有IgGRAU>235的個體的嗜中性粒細胞證實CD62L表達的顯著喪失（**p=0.005）。圖20.健康供體全血與IMPRIMEPGG（10μg/ml）一起溫過夜育，隨後測量血漿IL-8水平。作為超過檸檬酸鹽對照的倍數變化而呈現的IL-8水平（Y軸）通過IgGRAU狀態（X軸）分層。具有IgGRAU>235的12/13（即92%）個體相對於具有IgGRAU2倍的IL-8生產，支持高RAU和更大的IL-8生產之間的顯著關聯（**p=0.0028）。圖21.來自健康供體的全血中的抗β-葡聚糖抗體水平和SC5b-9生產的關聯。在用來自各個健康供體的IMPRIMEPGG（10μg/ml）刺激30分鐘的WB培養物中的SC5b-9量在Y軸中作為超過檸檬酸鹽對照的倍數變化而呈現。在X軸呈現了關於每個組的平均倍數變化+SEM。與具有IgMRAU330的個體（N=3）的嗜中性粒細胞證實SC5b-9生產中的顯著增加（***p=0.0003）。圖22.用考馬斯藍染色的純化的「黃金參考」IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體的SDS-PAGE（在還原條件下4-20%）。其分子量（MW）以千道爾頓（kDa）表示的蛋白質標準品顯示於泳道3中。圖23.（A）健康受試者的全血中的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細胞結合的關聯；（B）健康受試者的全血中的IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細胞結合的關聯。圖24.（A）健康受試者的全血中的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細胞結合的關聯；（B）健康受試者的全血中的IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細胞結合的關聯。圖25.（A）基於高相對於低結合者狀態，IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細胞結合的關聯；（B）基於高相對於低結合者狀態，IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細胞結合的關聯。圖26.（A）基於高相對於低結合者狀態，IgG抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細胞結合的關聯；（B）基於高相對於低結合者狀態，IgM抗β-葡聚糖抗體濃度與IMPRIMEPGG的單核細胞結合的關聯。圖27.（A）基於嗜中性粒細胞結合的IgGROC曲線分析；（B）基於嗜中性粒細胞結合的IgMROC曲線分析。圖28.（A）基於單核細胞結合的IgGROC曲線分析；（B）基於單核細胞結合的IgMROC曲線分析。圖29.基於高相對於低結合者狀態的IgG抗β-葡聚糖抗體亞類嗜中性粒細胞結合。圖30.IgG抗β-葡聚糖抗體亞類嗜中性粒細胞結合。圖31.靜脈內免疫球蛋白的體內輸注以增加抗β-葡聚糖抗體用於低結合者患者的IMPRIMEPGG治療的結果。（A）IgGRAU；（B）PMN結合和單核細胞結合；（C）C5a增加倍數。舉例說明性實施方案的詳述β-葡聚糖是衍生自各種微生物和植物來源的葡萄糖聚合物，所述來源包括例如酵母、細菌、藻類、海藻、蘑菇、燕麥和大麥。當然，酵母β-葡聚糖已就其免疫調節特性進行廣泛評估。酵母β-葡聚糖可以作為各種形式存在，例如完整的酵母、酵母聚糖、純化的全葡聚糖顆粒、溶解的酵母聚糖多糖、或不同分子量的高度純化的可溶性β葡聚糖。在結構上，酵母β-葡聚糖由葡萄糖單體組成，所述葡萄糖單體作為具有經由β-（1,6）糖苷鍵與主鏈連接的循環β-（1,3）吡喃葡萄糖分支的β-（1,3）-連接的吡喃葡萄糖主鏈組構。不同形式的酵母β-葡聚糖可以彼此不同起作用。酵母β-葡聚糖通過其發揮其免疫調節作用的機制可以受不同形式的β-葡聚糖之間的結構差異影響，所述結構差異例如其微粒或可溶性質、三級構象、主鏈的長度、側鏈的長度和側鏈的頻率。酵母β-葡聚糖的免疫刺激功能也依賴於在不同物種中的不同細胞類型中接合的受體，其再次可以依賴於β-葡聚糖的結構特性。一般而言，β-葡聚糖免疫療法可以包括給受試者施用任何合適形式的β-葡聚糖或者兩種或更多種形式的β-葡聚糖的任何組合。合適的β-葡聚糖和由其天然來源製備合適的β-葡聚糖在例如美國專利申請公開號US2008/0103112A1中描述。在一些情況下，β-葡聚糖可以衍生自酵母例如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。在某些情況下，β-葡聚糖可以是或衍生自β（1,6）-[聚（1,3）-D-吡喃葡糖基]-聚β（1,3）-D-吡喃葡萄糖，在本文中也稱為PGG（IMPRIMEPGG，Biothera，Eagan，MN），高度純化且充分表徵形式的可溶性酵母衍生β-葡聚糖。此外，基於β-葡聚糖的免疫療法可以涉及例如經修飾的和/或衍生化的β-葡聚糖例如國際專利申請號PCT/US12/36795中描述的那些的使用。在其他情況下，β-葡聚糖免疫療法可以涉及施用例如微粒-可溶性β-葡聚糖或微粒-可溶性β-葡聚糖製劑，其各自在例如美國專利號7,981,447中描述。生物標記物研究證實在受試者中在其嗜中性粒細胞和單核細胞結合ImprimePGG的能力中的差異。IMPRIMEPGG與這些細胞的結合與受試者對IMPRIMEPGG的免疫調節應答關聯。此外，與嗜中性粒細胞和單核細胞的IMPRIMEPGG結合涉及特異性水平的天然抗β-葡聚糖抗體的存在。本公開內容提供了定量測量患者血清樣品中的抗β-葡聚糖IgG和IgM抗體的簡單ELISA方法。ELISA方法可以用作生物標記物測定。用於生物標記物測定的截斷水平鑑定健康志願者的生物標記物陽性和生物標記物陰性亞組，並且這些截斷點與結合、功能和臨床結果關聯。評估IMPRIMEPGG與來自健康志願者的嗜中性粒細胞結合的早期研究揭示具有不同結合能力的受試者。IMPRIMEPGG的高嗜中性粒細胞結合（例如與>20%嗜中性粒細胞結合的IMPRIMEPGG）在~40%的健康志願者中發現。IMPRIMEPGG的單核細胞結合與健康志願者中的嗜中性粒細胞的結合潛力平行。在體外，高嗜中性粒細胞結合者和高單核細胞結合者產生比低結合者更多的IL-8。更高的天然抗β-葡聚糖抗體水平與IMPRIMEPGG的嗜中性粒細胞結合對應。高結合者血清/血漿可以增加與來自低結合者的嗜中性粒細胞的IMPRIMEPGG結合。高結合者血清中的抗β-葡聚糖抗體可以增加在非允許結合條件下在低結合者中的嗜中性粒細胞IMPRIMEPGG結合。例如，含有高天然抗β-葡聚糖抗體滴度的靜脈內免疫球蛋白（IVIG）可以增加與來自低結合者的嗜中性粒細胞的IMPRIMEPGG結合。天然抗β-葡聚糖IgG和/或IgM抗體涉及與嗜中性粒細胞和單核細胞結合。不希望受任何特定理論束縛，天然抗β-葡聚糖抗體（例如IgG和IgM）與IMPRIMEPGG結合。IMPRIMEPGG經由補體活化的經典途徑受調理作用。受調理作用的IMPRIMEPGG與嗜中性粒細胞和單核細胞上的CR3受體的凝集素樣結構域結合。IMPRIMEPGG的調理作用（即iC3b沉積）由於在抗體結合後的補體活化的經典途徑而發生。幾種功能標記物在IMPRIMEPGG的嗜中性粒細胞和/或單核細胞結合過程期間得到調節，例如C4a、C5a和SC5b-9。與全血樣品中的嗜中性粒細胞和/或單核細胞的IMPRIMEPGG結合可以使用測定進行重現性測量，例如流式細胞術。然而，全血對於此類測定的使用存在某些挑戰。例如，它需要活的健康細胞，使得血樣需要在收集24小時內接受且加工。因此，運送條件和環境因素可以損害血細胞。此類測定還需要來自已知高結合者和低結合者受試者的對照血樣。最後，儘管是概念上簡單的測定，但流式細胞術技術在許多臨床實驗室中並不常見。因此，基於流式細胞術的測定不是用於臨床開發的實際測定。本公開內容提供了涉及測量人血清樣品中的內源抗β-葡聚糖抗體水平的簡單定量ELISA的方法。該方法克服了由用於開發實際臨床測試的基於流式細胞術的測定存在的挑戰。基於血清的ELISA測定是常見的臨床測定，並且可以由大多數臨床實驗室執行。此外，血清樣品可以進行冷凍，導致更容易的貯存、運送和測定表現中的一致性。在一些實施方案中，β-葡聚糖可以衍生自酵母例如釀酒酵母。在一些實施方案中，β-葡聚糖可以包括β-1,3/1,6葡聚糖，例如β（1,6）-[聚（1,3）-D-吡喃葡糖基]-聚β（1,3）-D-吡喃葡萄糖。在一些實施方案中，與免疫細胞結合的β-葡聚糖可以通過使樣品與單克隆抗體接觸進行檢測，所述單克隆抗體與β-葡聚糖特異性結合。單克隆抗體可以是與β-葡聚糖特異性結合的任何單克隆抗體。如本文使用的，「特異性」及其變化指對於特定靶具有差異或非一般（即非特異性）親和力，至任何程度。特異性結合β-葡聚糖的示例性單克隆抗體包括例如鑑定為BfDI、BfDII、BfDIII和/或BfDIV（Biothera，Eagan，MN）的單克隆抗體，其各自在美國專利號6,294,321中描述。測量血清中的抗體量的傳統方法通常涉及在將樣品系列稀釋的測定背景下使用ELISA。對ELISA測定實施系列稀釋，並且基於生成陽性測定應答的血清樣品的最大稀釋度估計血清樣品中的抗體量。所得到的滴度值是在稀釋範圍內的估計值，而不是抗體量的確切測量。系列稀釋方法頻繁用於血清學中，以確定血清中的抗體量（滴度水平）。確定滴度水平頻繁用於評估對疫苗的抗體應答。然而，在系列稀釋方法中，不能直接測量產生的抗體的確切量。相反，僅能夠估計在稀釋範圍內產生的抗體量。滴度水平因此不順應以直接方式而無需數據修飾和/或統計分析技術的標準統計分析。相比之下，本公開內容提供了基於ELISA的方法，其測量人血清中針對IMPRIMEPGG的天然抗β-葡聚糖抗體。該方法涉及定量測量作為相對抗體單位（RAU）或在統計要求內的抗β-葡聚糖抗體濃度的天然抗β-葡聚糖抗體量。這通過在相同測定中生成滴度並且關聯RAU數據或抗體濃度數據（兩者均由校準曲線確定）來完成。因此，本文描述的方法涉及由具有確定水平的抗β-葡聚糖抗體的血清生成內部標準曲線。此外，該方法提供了定量測量相對或實際抗β-葡聚糖抗體而不是測量滴度的更佳方法。該方法可以用於測量抗β-葡聚糖IgG和/或抗β-葡聚糖IgM。關於IgG和/或IgM的RAU計算顯示於表7中。關於IgG和/或IgM的抗體濃度的計算分別顯示於表8和表9中。該方法提供了測定內精確度-即板之間的重現性。該方法還提供了測定間精確度-即測定和/或測定日之間關於對照和測試血清樣品的重現性。該方法允許通過單個操作者評估在不同測試板上分析的多重樣品。因此，該方法提供了無論是在單日內分析多重樣品的單個操作者的手中還是經過多日過程多個操作者的手中的可靠、重現性結果。結合和功能所需的抗β-葡聚糖抗體水平可以根據個體而改變。圖2顯示了對於IVIG在抗β-葡聚糖IgGRAU水平中的劑量依賴性增加。該方法涉及使用生物標記物截斷來鑑定RAU水平，所述RAU水平排除將不響應ImprimePGG的個體，並且富集具有更高的響應概率的生物標記物陽性受試者。結合和功能數據指示大多數活性在>IVIG-5組（RAU233-610）中發生，並且因此關於IgG截斷的進一步分析應集中於高於200的RAU範圍（圖7）。執行在32個健康志願者中的初始研究，以確定在嗜中性粒細胞或單核細胞中的IMPRIMEPGG結合和功能必需的天然抗β-葡聚糖抗體的特異性最低水平（IgG和/或IgM的RAU）。定量為IgG和/或IgM的抗β-葡聚糖抗體濃度的最低水平使用健康受試者的更大隊列（n=143）進一步優化，並且證實就IMPRIMEPGG與嗜中性粒細胞和單核細胞結合而言的升高的抗β-葡聚糖抗體水平、IMPRIMEPGG誘導的功能變化和臨床結果的顯著性。具有有助於IMPRIMEPGG與嗜中性粒細胞和單核細胞結合的抗β-葡聚糖抗體水平的受試者視為「生物標記物陽性的」。生物測定可以允許鑑定在臨床背景下具有抗β-葡聚糖抗體水平的受試者，所述抗β-葡聚糖抗體水平對於IMPRIMEPGG與嗜中性粒細胞和單核細胞結合太低（「生物標記物陰性」），使得他們可以接受替代治療或接受抗β-葡聚糖抗體治療，使得他們可以更好地響應涉及IMPRIMEPGG的療法。可替代地，生物標記物陽性個體可以比生物標記物陰性個體更免疫活性，並且因此可以更好地響應免疫療法藥物。當使用RAU方法時，通過具有至少最低IgGRAU預定值的IgGRAU和/或具有至少最低IgMRAU預定值的IgMRAU，個體可以是生物標記物陽性的。在一些實施方案中，IgGRAU預定值可以是至少200，例如至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270或至少275。在一些實施方案中，IgMRAU預定值可以是至少300，例如至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370或至少375。即，例如至少200的IgGRAU或例如至少300的IgMRAU合理地與個體關聯，所述個體顯示出至少5%的嗜中性粒細胞結合β-葡聚糖，以及與β-葡聚糖「高結合者」狀態相關的嗜中性粒細胞和單核細胞功能調節。例如，圖8顯示了根據計算的IgGRAU關於32個健康志願者各自的嗜中性粒細胞結合百分比曲線。在5%嗜中性粒細胞結合處的水平線描繪「高結合者」與「低結合者」。為了區分其IgGRAU太低不能結合超過5%的嗜中性粒細胞的那些志願者與其IgGRAU足以顯示出至少5%的其嗜中性粒細胞結合β-葡聚糖的那些志願者，我們確定了在235的IgGRAU處的截斷線（圖10），在顯示高於5%的嗜中性粒細胞結合β-葡聚糖的最低IgGRAU值（239）下的最接近值。我們隨後估計三個個體的水平，所述個體具有大於5%的嗜中性粒細胞結合β-葡聚糖，但是IgG生物標記物陰性的（圖9，帶圓圈的）。這三個個體是IgG生物標記物陰性的-即小於235的IgGRAU-然而，顯示出至少5%的其嗜中性粒細胞結合β-葡聚糖。當嗜中性粒細胞結合根據IgMRAU進行標繪時，確定了330的IgMRAU截斷值（圖13）。當使用進一步優化的抗體濃度方法時，通過具有至少最低IgG抗β-葡聚糖抗體濃度預定值的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度和/或具有至少最低IgM抗β-葡聚糖抗體濃度預定值的IgM抗β-葡聚糖抗體濃度，個體可以是生物標記物陽性的。來自衍生自相同全血抽取的血清的IMPRIMEPGG結合和抗β-葡聚糖抗體濃度測量在健康志願者N=143中進行評估。對於N=143個體確定的IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體濃度範圍分別為1.13-209.8µg/ml（7.8-1447.8RAU/ml）和5.3-2032.7µg/ml（12.8-4878.4RAU/ml）。嗜中性粒細胞和單核細胞均證實分別在大約14µg/ml（100RAU/ml）和42µg/ml（100RAU/ml）IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體水平時更頻繁的大於5%結合。因此，在一些實施方案中，IgG抗β-葡聚糖抗體濃度預定值可以是至少14µg/ml（100RAU），例如至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75或至少80µg/ml（100RAU）。在一些實施方案中，IgM抗β-葡聚糖抗體濃度預定值可以是至少42µg/ml，例如至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、至少300、至少310、至少320、至少330、至少340、至少350、至少360、至少370、至少380、至少390、至少400、至少410、至少420、至少430、至少440、至少450、至少460、至少470、至少480、至少490、至少500、至少510、至少520、至少530、至少540或至少550µg/ml（100RAU）。即，例如至少14µg/ml的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度或例如至少42µg/ml的IgG抗β-葡聚糖抗體濃度合理地與個體關聯，所述個體顯示出至少5%的嗜中性粒細胞或單核細胞結合β-葡聚糖，以及與β-葡聚糖「高結合者」狀態相關的嗜中性粒細胞和單核細胞功能調節。圖23和圖24顯示根據計算的（A）IgG和（B）IgM抗β-葡聚糖抗體濃度，關於每個健康志願者的嗜中性粒細胞和單核細胞結合百分比曲線。如所示的，與嗜中性粒細胞和單核細胞的IMPRIMEPGG結合隨著IgG和/或IgM抗β-葡聚糖抗體濃度增加而增加。如圖25和圖26中所示，在IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體濃度以及在5%結合水平下的嗜中性粒細胞和單核細胞結合兩者之間存在強關聯，區分高和低IMPRIMEPGG結合者。在抗β-葡聚糖抗體濃度以及年齡、性別或總免疫球蛋白之間不存在關聯（數據未示出）。接下來，在143個健康志願者中研究抗β-葡聚糖抗體的探索性截斷。使用關於IMPRIMEPGG的嗜中性粒細胞和單核細胞結合兩者的5%水平，使用ROC曲線分析測定抗β-葡聚糖濃度的靈敏度和特異性之間的關聯（圖27和圖28）。在關於結合的95%的初始探索性特異性時，確定抗β-葡聚糖抗體濃度截斷，並且用於計算健康群體中的生物標記物的流行及其用於確定結合狀態的靈敏度。結果顯示於表1中。表1陽性IgG抗β-葡聚糖生物標記物狀態與使用任一組截斷的體外IMPRIMEPGG生物活性高度關聯。然而，如由ROC曲線分析指示的，在不同截斷下的相似靈敏度指示與IMPRIMEPGG的生物活性關聯的抗β-葡聚糖抗體濃度範圍。因此，研究各種抗β-葡聚糖抗體濃度截斷，並且功能終點用於確定截斷是否合理地將個體分離成高結合者和低結合者（生物標記物陽性和生物標記物陰性）狀態。IL-8生產用作功能終點，以探究IgG抗β-葡聚糖抗體濃度截斷範圍。結果顯示於表2中。表2截斷（RAU/μg/ml）與嗜中性粒細胞結合與單核細胞結合IL-8生產近似特異性/靈敏度100/14<0.0001<0.00010.013244.90/92.55125/18<0.0001<0.00010.001959.18/88.30150/22<0.0001<0.00010.000269.39/79.79175/25<0.0001<0.0001<0.000177.55/74.47200/29<0.0001<0.0001<0.000181.63/72.34276/40<0.0001<0.0001<0.000197.96/60.64351/51<0.0001<0.0001<0.0001100/54.26400/60<0.0001<0.0001<0.0001100/48.94425/62<0.0001<0.0001<0.0001100/47.87450/65<0.0001<0.0001<0.0001100/45.74475/69<0.0001<0.0001<0.0001100/42.55500/72<0.0001<0.0001<0.0001100/40.43525/76<0.0001<0.0001<0.0001100/39.36550/80<0.0001<0.00010.0009100/35.11同樣地，C4a/SC5b9生產用作功能終點，以探究IgM抗β-葡聚糖抗體濃度截斷範圍。結果顯示於表3中。表3截斷（RAU/μg/ml）與嗜中性粒細胞結合與單核細胞結合C4a生產近似特異性/靈敏度100/420.0001<0.0001N/A67.35/68.09150/63<0.0001<0.0001N/A77.55/54.26200/83<0.0001<0.00010.133185.71/42.55250/104<0.0001<0.00010.058793.88/30.85300/125<0.0001<0.00010.036395.92/21.28350/146<0.00011500μW/cm2的高強度紫外線共5分鐘，並且在室溫下第二次暴露於紫外線五分鐘之前，置於50℃強制通風烘箱中直至乾燥。板在用牛血清白蛋白（BSA）的0.5%溶液封閉大於30分鐘之後，用洗滌緩衝液（具有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩衝鹽水[PBS]）洗滌。每個測定運行包括兩塊測定板。每塊板包括通過系列稀釋參考人血清製備的校準曲線。板還包括與參考血清同樣稀釋的四個測試血清樣品。用於校準曲線和血清樣品的稀釋系列以1:400稀釋度開始，並且以系列1:2稀釋繼續至1:51,200的最低稀釋度。稀釋在洗滌緩衝液中進行。參考血清的1:50稀釋度用作曲線上的最高錨定點。參考和血清樣品的每個稀釋度在兩塊板各自的重複孔中進行評估。樣品在測定板上在室溫下溫育90分鐘，以允許人IgG與板結合的IMPRIMEPGG結合。在溫育後，孔用洗滌緩衝液進行洗滌，並且酶標記的二抗（辣根過氧化物酶綴合的親和力純化的山羊抗人IgG、Fcγ特異性抗體）在孔中進行溫育，以與IMPRIMEPGG抗原結合的人IgG結合。在用洗滌緩衝液洗滌之前，允許二抗溫育90分鐘。在從孔中去除洗滌緩衝液之後，使過氧化物酶底物在孔中進行溫育，並且在5分鐘顯色時用~1M磷酸猝滅顯色。使用微量滴定板閱讀器測量在450nm處的光密度，並且計算來自重複孔的平均值。結果以兩種方式進行計算：1）滴度：滴度測定為其光密度讀數大於或等於0.1OD的樣品的最大稀釋因子。2）RAU-160的任意值指定至參考血清（160相對抗體單位（RAU/mL）。因此，測定方法中的1:400稀釋度導致400mRAU/mL的值作為校準曲線上的最高點。稀釋值和相應的RAU值在表10中陳述。表10稀釋度平均OD計算的濃度（mRAU/ml）計算的濃度×稀釋度除以1000=RAU/ml4001.577404.68001.493322.225774925816001.369239.338291238332001.031119.938368338464000.71564.3411398411128000.39329.5378022378256000.20414.7377574378512000.1058.0關於樣品和對照的RAU值用4參數擬合進行計算，使用參考人血清稀釋系列作為校準曲線。通過由校準曲線內插，隨後校準稀釋度，來計算對於落入校準曲線的線性部分內的每個樣品稀釋度以mRAU表示的濃度。隨後，由那些回復計算的多個稀釋度獲得每個樣品的平均濃度。結果顯示於圖1A中。實施例2IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體「黃金參考標準品」由商購可得的95%純的總IgG和IgM級分進行純化，所述總IgG和IgM級分衍生自合併的正常人血漿（AthensResearchandTechnology，Athens，GA）。使IgG和IgM級分經過IMPRIMEPGG親和柱，濃縮且使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）就純度進行表徵。參見圖22。「黃金參考標準品」的系列稀釋通過下文描述的用於生成標準曲線的方法用於生成校準曲線。用通過針對「黃金參考標準品」校準測定的抗β-葡聚糖濃度，由合併的正常人血清製備測定工作參考標準品。測定對照由來自所選擇的各個受試者的正常人血清進行製備，所述受試者具有接近工作標準曲線上的限定位置的抗β-葡聚糖濃度。Maxisorp平底96孔板（ThrmoFisherScientific，Waltham，MA）用在D-PBS（CorningInc.，Tewksbury，MA）中以3μg/mL的IMPRIMEPGG以每孔100μL進行包被。將板覆蓋，置於緊密密封的拉鏈封口塑膠袋中，並且在4℃下溫育最少15小時且最多24小時。包被的板隨後取出用於冷藏，抽吸且用洗滌緩衝液（在PBS中的0.05%聚山梨醇酯20（AlfaAesar，WardHill，MA））洗滌三次。在最終抽吸後，每塊包被的板完全包裹在紙巾中，並且在紙巾墊上用力拍打三次，以去除剩餘液體。板隨後在工作檯上用250µl/孔的StabilCoatImmunoassayStabilizer（SurModics，Inc.，EdenPrairie，MN）封閉1至3小時。在封閉後，將板抽吸以去除內容物且包裹在紙巾中。重複如上所述的去除剩餘液體的拍打程序。將板打開且允許在工作檯上乾燥最少45分鐘且最高達三小時。每個測定包括通過系列稀釋工作參考樣品製備的工作標準曲線。工作參考樣品的稀釋系列顯示於表11和12中。測定還包括1:20、1:400和1:1600稀釋的對照和測試樣品。稀釋在洗滌緩衝液中進行。參考和血清樣品的每個稀釋度一式三份進行評估。樣品在測定板上在室溫下溫育45分鐘在設為310rpm的軌道直徑2mm的定軌振蕩器上進行溫育，以允許人IgG和/或IgM與板結合的IMPRIMEPGG結合。在溫育後，孔用洗滌緩衝液進行洗滌，並且酶標記的二級抗體（辣根過氧化物酶綴合的親和力純化的山羊抗人IgG或IgM、Fcγ特異性抗體）在孔中進行溫育，以與IMPRIMEPGG抗原結合的人IgG或IgM結合。在用洗滌緩衝液洗滌之前，允許二級抗體溫育45分鐘。在從孔中去除洗滌緩衝液之後，使過氧化物酶底物在孔中進行溫育，並且在五分鐘顯色時用~1M磷酸猝滅顯色。使用微量滴定板閱讀器測量在450nm處的光密度，並且計算來自重複孔的平均值。通過針對由工作參考樣品稀釋生成的工作標準曲線校準樣品吸光度，來確定IgG和IgM抗β-葡聚糖抗體濃度（µg/ml）。關於校準曲線的稀釋度值和相應的濃度在表11和12中陳述。表11.用於標準曲線的IgG稀釋度稀釋度平均OD平均計算的濃度（ng/ml）1:102.85942073.31:1002.626191.01:4002.21458.21:8001.77329.11:16001.16113.71:32000.6747.11:128000.2022.0表12.用於標準曲線的IgM稀釋度稀釋度平均OD平均計算的濃度（ng/ml）1:6.262.64211176.31:50.082.1331354.71:100.171.706664.41:200.331.227338.51:801.380.45483.71:3204.760.15820.81:128190.0795.2衍生自表11和12的數據的標準曲線分別顯示於圖1B和1C中。一旦通過標準曲線確定測試樣品的抗體濃度，濃度就可以通過將平均計算的濃度乘以稀釋因子並且隨後除以1000而轉換為μg/ml。實施例3在含有肝素的管（BDVacutainersodiumheparintubes，BectonDickinson，FranklinLake，NJ）中收集來自健康志願者的全血（WB）。在研究中使用的IVIG是Privigen，以100mg/mL的人多價人免疫球蛋白的10%溶液（CSLBehring，KingofPrussia，PA）。樣品摻料有在PBS中至2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL的最終濃度的IVIG稀釋物，連同僅PBS對照。隨後製備IVIG摻料血液的等分試樣用於IgGRAU測定、以及補體途徑活化的IMPRIMEPGG誘導、嗜中性粒細胞結合（下文實施例4中所述）、活化標記物表達和IL-8生產測定。IVIG摻料的WB的等分試樣在37℃下與以10µg/mL的IMPRIMEPGG、或作為對照的等體積的檸檬酸鹽緩衝液（11mMNaCitrate，140mMNaCL，pH6.3）一起溫育30分鐘。在溫育後，在加入5µLBfDIV小鼠抗β-葡聚糖IgM抗體/100µLWB，並且在室溫下溫育15分鐘之前，將細胞用PBS洗滌兩次。樣品隨後再次用PBS洗滌兩次，並且用含有用於表面標記物的抗體以及用於檢測BfDIV結合的抗小鼠IgM的抗體混合物染色。使細胞在室溫下溫育30分鐘，隨後加入2mLFACS/Lyse（eBiosciences，SanDiego，CA），並且在室溫下溫育15分鐘。細胞用PBS洗滌兩次，之後用1%多聚甲醛固定且在LSRII流式細胞儀上分析。FACS數據通過FlowJo軟體進行分析。結果顯示於圖2-7中。實施例4在WB中的IMPRIMEPGG結合和細胞表面上的葡聚糖結合的檢測基本上如上文實施例2中所述執行。結果顯示於圖8-13、23-30、31A和31B中。實施例5如實施例3中所述，在含有肝素的管中收集來自健康志願者的全血（WB）。將管充分混合且貯存於冰上，直至準備使用時。WB的等分試樣與以10µg/mL或100µg/mL最終濃度的IMPRIMEPGG、或者與等體積的PBS或檸檬酸鹽緩衝液一起溫育。以10µg/mL的完整葡聚糖顆粒（WGP）用作陽性對照。經處理的WB在37℃下在加溼5%CO2溫箱中溫育30分鐘或120分鐘。在每個時間點結束時立即將WB在4℃下以2000xrpm（或1150xg）離心10分鐘。收集上清液（血漿），並且轉移至1.5mLeppendorf管且保持在冰上。血漿如下述部分中所述在補體調節研究的相同日使用，或在-70℃下冷凍直至準備使用時。補體C4a調節研究。MicroVueC4aEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）根據廠商說明書用於血漿中的C4a定量。簡言之，將標準品、對照和1:20稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿製劑）加入用特異性抗C4a單克隆抗體預包被的微量測定孔中。在室溫下溫育60分鐘後，將板洗滌一個洗滌循環。將辣根過氧化物酶（HRP）綴合的鼠抗人C4a單克隆抗體加入每個測試孔中，並且在室溫下溫育另外60分鐘。在溫育後，在加入生色酶底物TMB以起始酶促反應之前，將板洗滌一個洗滌循環。使板在室溫下溫育60分鐘，並且隨後用所提供的終止溶液猝滅酶反應。顏色強度在450nm處進行分光光度法測量。由用所提供的標準品生成的標準曲線計算測試樣本中存在的C4a濃度，並且使用4參數回歸分析進行分析。結果顯示於圖14中。補體C5a調節研究。MicroVueC5aEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）根據廠商說明書用於血漿中的C5a定量。簡言之，將標準品、對照和1:60稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿製劑）加入用特異性抗C5a單克隆抗體預包被的微量測定孔中。在室溫下溫育60分鐘後，將板洗滌一個洗滌循環。將辣根過氧化物酶（HRP）綴合的鼠抗人C5a單克隆抗體加入每個測試孔中，並且在室溫下溫育另外60分鐘。在溫育後，在加入生色酶底物TMB以起始酶促反應之前，將板洗滌一個洗滌循環。使板在室溫下溫育60分鐘，並且隨後用所提供的終止溶液猝滅酶反應。顏色強度在450nm處進行分光光度法測量。由用所提供的標準品生成的標準曲線計算測試樣本中存在的C5a濃度，並且使用4參數回歸分析進行分析。結果顯示於圖15和圖31C中。補體Sc5b-9調節研究。MicroVueSc5b-9PlusEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）根據廠商說明書用於測量血漿樣本中存在的Sc5b-9複合物的量。簡言之，將標準品、對照和1:20稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿製劑）加入用特異性抗Sc5b-9單克隆抗體預包被的微量測定孔中。使板在室溫下溫育60分鐘，隨後為五次洗滌。隨後使板在室溫下與所提供的SC5b-9PlusConjugate一起溫育30分鐘，所述SC5b-9PlusConjugate含有對於SC5b-9特異性的辣根過氧化物酶綴合的鼠抗人Ab。隨後將板洗滌五次，在室溫下與生色酶底物TMB一起溫育60分鐘，以起始酶促反應，並且隨後用終止溶液猝滅。測量OD450。使用線性回歸分析由所生成的標準曲線計算結果。結果顯示於圖16中。細胞表面補體受體的調節。IMPRIMEPGG與WB的結合以10µg/mL和100µg/mL以及在30分鐘和120分鐘時進行研究。在結合後，細胞用PBS洗滌兩次，並且隨後在室溫下與CD88-APC、CD35-PE和CD11b-PB（BioLegend）一起溫育30分鐘。通過在室溫下與2mLFACS/Lyse（eBiosciences，SanDiego，CA）一起溫育15分鐘來裂解RBC。細胞用PBS洗滌兩次，用1%多聚甲醛固定且在LSRII流式細胞儀上進行分析。FACS數據通過FlowJo軟體進行分析。結果顯示於圖17和圖18中。實施例6IMPRIMEPGG與WB的結合以10µg/mL和100µg/mL以及在30分鐘和120分鐘時進行研究。在結合後，細胞用PBS洗滌兩次，並且隨後在室溫下與CD62L-PB（BioLegend）一起溫育30分鐘。通過在室溫下與2mLFACS/Lyse（eBiosciences，SanDiego，CA）一起溫育15分鐘來裂解RBC。細胞用PBS洗滌兩次，用1%多聚甲醛固定且在LSRII流式細胞儀上進行分析。FACS數據通過FlowJo軟體進行分析。結果顯示於圖19中。實施例7如實施例3中所述，在含有肝素的管中收集來自健康志願者的全血（WB）。WB的等分試樣與以10µg/mL或100µg/mL最終濃度的IMPRIMEPGG一起溫育，或者用作為基線對照的PBS或檸檬酸鹽緩衝液、或者作為陽性對照的100ng/mLTLR4激動劑LPS（大腸桿菌（E.coli）菌株0127:B8，Sigma，St.Louis，MO）進行處理。培養物在37℃下在加溼5%CO2溫箱中進行溫育。在20-24小時後，將WB以1600xrpm離心10分鐘，並且收集血漿上清液。將樣品貯存於-80℃下的96孔Matrix貯存板（MatrixTechnologies，Hudson，NH）中，直至準備使用時。通過根據製造商的說明書執行HumanCXCL8/IL-8ELISA（R&DSystems，Catalog#D8000C，Minneapolis，MN），來確定IMPRIMEPGG或對照處理的WB的血漿樣品中IL-8的存在。結果顯示於圖20中。實施例8Sc5b-9調節研究。根據廠商說明書使用MicroVueSc5b-9PlusEIA試劑盒（QuidelCorp.，SanDiego，CA）測量血漿樣本中存在的Sc5b-9複合物的量。簡言之，將標準品、對照和1:20稀釋的測試樣本（未處理的或各種處理的血漿製劑）加入用特異性抗Sc5b-9單克隆抗體預包被的微量測定孔中。使板在室溫下溫育60分鐘，隨後為五次洗滌。隨後使板在室溫下與所提供的SC5b-9PlusConjugate一起溫育30分鐘，所述SC5b-9PlusConjugate含有對於SC5b-9特異性的辣根過氧化物酶綴合的鼠抗人Ab。隨後將板洗滌五次，在室溫下與生色酶底物TMB一起溫育60分鐘，以起始酶促反應，並且隨後用終止溶液猝滅。測量OD450。使用線性回歸分析由所生成的標準曲線計算結果。結果顯示於圖21中。實施例9使用GraphPadPrism軟體進行ROC曲線分析。結果顯示於圖27和28中。本文引用的所有專利、專利申請和出版物，和可電子獲得的材料（包括例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的胺基酸序列提交，以及來自GenBank和RefSeq中的注釋編碼區的翻譯）的完全公開內容以其整體通過引入本文。在本申請的公開內容和引入本文作為參考的任何文件的公開內容之間存在任何不一致的情況下，以本申請的公開內容為準。前述詳述和實施例僅為了清楚理解而給出。由其不應理解不必要的限制。本發明並不限於所示和所述的確切細節，因為對於本領域技術人員顯而易見的變化將包括在由權利要求限定的本發明內。除非另有說明，否則表示說明書和權利要求中使用的組分數量、分子量等等的所有數目均應理解為在所有情況下由術語「約」進行修飾。相應地，除非另有相反說明，否則在說明書和權利要求中闡述的數目產生是近似值，其可以根據尋求通過本發明獲得的所需特性而改變。最低限度以及並非作為限制權利要求範圍的等價原則的嘗試，每個數目參數應至少根據所報告的有效數字且通過應用普通四捨五入技術加以解釋。雖然闡述本發明的廣泛範圍的數目範圍和參數是近似值，但具體實施例中闡述的數值儘可能精確地報告。然而，所有數值固有地含有必然起因於在其各自的測試測量中發現的標準差範圍。所有標題均為了讀者方便，並且不應用於限制標題下的正文的含義，除非如此指明。當前第1頁1 2 3