利用ppar核受體的表達調節系統的製作方法
2023-09-19 07:44:40
專利名稱：利用ppar核受體的表達調節系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物學領域。具體地，本發明涉及基因表達調節領域，更具體地，本發明描述研製和發展藥理學調節轉基因表達的新系統。本發明特別基於使用人源構建體激活轉基因轉錄。因此，本發明描述例如在肌肉細胞中，在試管中、在活體外或在活體內能有效調節核酸表達的新組合物、構建體和方法。源於本發明的應用場合多種多樣，例如見諸實驗、臨床、治療或診斷方面。
控制轉基因表達水平與時間對於許多應用都是必不可少的。於是，在基因治療方面，成功的治療可能要求特定劑量由轉基因合成的蛋白。同樣地，使用例如能夠分開生長期和生產期的誘導型表達系統時，可改善在活體外重組蛋白的生產。構建轉基因動物、研究基因作用或蛋白的生物利用率等都是屬於適當控制遺傳表達並帶來許多改善的情況。
現有技術已設想出不同的人工轉錄調節基因，它們被與轉基因轉錄啟動子序列連接的異生素分子激活。
通過大腸桿菌Lac抑制子與單純皰疹病毒(HSV)的VP16反式激活域融合構建首先說明的這些調節基因。這些調節基因有兩個版本，一個可以用異丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)激活，另一個被IPTG失活(Baim S.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，88，(1991)5072-5076；Labow M.及其同事，《Mol.Cell.Biol.》，10(1990)3343-3356)。
通過大腸桿菌Tet抑制子與HSV的VP16反式激活域融合構建另一個系統。這些調節基因也有兩個版本，一個可用四環素或其衍生物激活，另一個可被這些同樣分子失活(Gossen M.和Bujard H.，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，89，(1992)5547-5551；Gossen M.及其同事，《科學》，268(1995)1766-1769)。
S.cerevisiae的GAL4蛋白DNA的鏈區與黃體酮上人受體配體鏈區和HSV的VP16反式激活域融合構建另一個系統，這個版本可用如RU486黃體酮類似物激活(Wang Y.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，91，(1994)8180-8184)。還描述過果蠅蛻皮激素受體與HSV的VP16反式激活域融合，用蛻皮激素和這種甾類激素類似物激活(No D.及其同事，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，93，(1996)3346-3351)。另一個系統利用促進某些細胞蛋白群聚的某些免疫抑制分子(環孢黴素A，納巴黴素及其衍生物)的本領。這時，轉錄調節基因由兩種蛋白亞單位構成，第一種可由嵌合DNA鏈區與FKBP人蛋白的三個複製品融合而成，第二種由FRAP人蛋白的納巴黴素鏈區與人NFkB的p65亞單位反式激活域融合而成。這種轉錄調節基因可用有可能將兩種亞單位二聚化的納巴黴素激活(Rivera V及其同事，《Nat.Med》，2(1996)1028-1032)。
雖然這些系統在某些組織中能夠達到令人滿意的調節水平，但它們仍然有某些制約其使用條件的不足。因此，這些轉錄調節基因在人體中是異體蛋白。它們事實上是由來自細菌、病毒、酵母或昆蟲的蛋白片段構成，或蛋白區是人源的時，它們由人的外部序列產生接合。這些蛋白區因此可以誘導細胞毒素的免疫反應，於是使得在異體轉錄調節基因控制下表達目標基因的細胞受到破壞，這樣停止了轉基因表達。這種情況可迫使採取重複施用治療基因，這樣構成在涉及創傷外科行為時尤為嚴重的缺陷，這種治療不總是有效的，特別是在治療基因的載體是第一次注射引起免疫反應的病毒時。另外，用現有技術的調節系統所觀察到的表達水平不總是令人滿意的。
因此，需要一種得到改善的表達調節系統，這種系統與在活體內使用是相容的，還可在不同組織中使用，並且還保證在激活狀態下具有很高的表達水平。本發明針對這些問題提出一種解決方案。
本發明事實上涉及使用人源激活子的調節系統。這種系統應能夠避免反覆施用治療基因。
本發明特別地描述一種使用PPAR核受體(激活過氧化物酶體增生子的受體)作為轉錄調節基因的改善誘導型表達系統。在申請WO 98/21349中曾描述過在肝特效表達系統中使用PPRE。現在，本發明的改善系統能夠產生轉錄調節基因(人源PPAR蛋白，因此在人體中屬於基本上非異體蛋白)，控制轉基因表達的誘導啟動子由最小啟動子和對PPAR(PPRE)反應的成分組成。本發明的系統，無論在活體外還是在活體內，特別是在肌肉中，都可用PPAR特效配體激活。此外，在激活後達到的轉基因表達水平與諸如hCMV-IE啟動子之類強啟動子表達水平相似。
本發明的系統因此在大量誘導、耐性(特別對於在活體內使用)、力和利用條件方面都具有許多優點。
因此，本發明描述了用於實施和使用這種系統的新構建體，特別是啟動子區，表達盒和質粒。本發明還描述能改善基因表達控制的新的PPAR構建體以及這些不同構建體的組合。本發明還表明這些方法和組合物能在活體外和在活體內大量控制和調節表達。本發明還涉及例如包含本發明構建體的細胞，以及PPAR配體化合物的篩選方法。
更具體地，本發明第一個目的在於組合物，該組合物包含a)第一個成分，它包含在誘導啟動子控制下的目的核酸，該誘導啟動子包含對PPAR反應的成分和最小轉錄啟動子，以及b)第二個成分，它包含在轉錄啟動子控制下編碼PPAR的核酸，以便同時地、分別地或以一定時間間隔地使用它們。
在更特別的方式中，本發明組合物還包括(c)PPAR配體，也是為了同時，分別地或以一定時間間隔地使用它們。
有利地，這些組合物還包含成分(d)，它包含在轉錄啟動子控制下編碼X類視黃醛衍生物受體(RXR)的核酸。
其目的在於同時地、分別地或以一定時間間隔地使用的表達表明可以分別地製備、分別地調節和相繼使用成分(a)、(b)、必要時(c)和/或(d)，以便能控制目的核酸的表達。典型地，製備成分(a)和(b)以及任選的(d)並且將其包裝在一起，而化合物(c)則被分開包裝，並與(a)和(b)以及任選的(d)以一定時間間隔被使用，這些不同成分在細胞、組織、器官等中組合得到所要求的表達調節效果。
對此，在本發明組合物的特定實施方式中，通過不同的遺傳構建體加入成分(a)和(b)和任選的(d)。
在本發明組合物的另一個特定和優選的實施方式中，成分(a)和(b)以及任選的(d)集合在同一個遺傳構建體中。於是，本發明描述了能表達目的產品和PPAR的複合遺傳構建體。這些構建體是特別有利的，因為，它們獨自包含了在調節表達目的核酸所需的全部遺傳成分。
一種或多種遺傳構建體可以是天然的和/或各種不同來源的，特別是質粒附加體、染色體、病毒、噬菌體等。優選地，遺傳構建體是質粒或病毒載體。
為了說明分別地帶有成分(a)或(b)的質粒，例如可以列舉JxnS-TK-pGL3、JxnAS-TK-pGL3、DR1xnS-TK-pGL3、DR1xnAS-TK-pGL3、JxnAS-CMV-pGL3、pSG5-hPPARg2g2或Jx10AS-CMV-EF-pGL3質粒，這些將在後面詳細描述。
為了說明其中已集合成分(a)和(b)的質粒，例如可以列舉Jx5AS-TK-Luc-bPPARg2、SV-g2-J10-C-pGL3、hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3或hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒，這些將在後面詳細描述。
作為病毒載體實例，特別可以列舉重組腺病毒，重組反錄病毒，AAV，皰疹病毒，疫苗病毒等，其製備可以按照本領域技術人員已知方法進行。
在本文下面將更詳細地描述遺傳構建體的配置與結構。
對此，如前面所指出的，成分(a)包含可誘導啟動子，它包含至少-對PPAR反應的成分，以及-最小轉錄啟動子。
對PPAR反應的成分(PPRE，「過氧化物酶體增生子反應成分」)是能夠固定PPAR的核酸區，PPAR鏈然後可以向附近核酸區傳遞信號。對PPAR反應的成分因此是能夠連接PPAR的核酸區。為了實施本發明，對PPAR反應的成分更特別地包含一個或多個PPAR鏈的位點。在現有技術中曾描述過這樣一些鏈位點，例如像在不同人的啟動子中(例如AII載脂蛋白基因)。這樣一些位點還可以是人工構建的，並且試驗過它們的PPRE性質，如下所述。
在一種特定實施方式中，對PPAR反應的成分包含一個或多個TCAACCTTTACCCTGGTAG序列(SEQ ID NO1)位點，或這種序列的功能性變體。SEQID NO1序列相應於人apoAII啟動子的J區(核苷酸-734位至-716位)。
在另一種特定實施方式中，對PPAR反應的成分包含一個或多個AGGTCAAAGGTCA序列(SEQ ID NO5)位點，或這種序列的功能性變體。SEQ ID NO5序列相應於DR1共有區。
術語功能性變體是指保持上述PPRE性質，即特別是連接PPAR的能力的所有修飾序列。這些修飾可以包括在所研究序列中一個或多個核苷酸的添加、突變、缺失和/或取代。可以採用分子生物學的常規方法，特別地例如通過定向突變發生或更實際地通過在合成器中人共合成序列加入這些修飾。一般地，變體保留至少50％標出起始序列的殘留序列。更優選地，這些變體具有對所研究序列中少於5個核苷酸產生影響的修飾。這樣得到的變體然後進行它們的PPRE活性試驗。這些性質可採用不同方式加以證實，特別地(i)讓試驗序列與PPAR和X類視黃醛衍生物受體(RXR)接觸，優選地在非細胞的試驗中進行接觸，以及(例如通過在凝膠上遷移的滯後)檢測複合物形成；(ii)在包含最小啟動子和報導基因的表達盒中插入試驗序列，將這種盒加入細胞中，以及在存在下或不存在PPAR和PPAR配體的條件下，檢測報導基因表達(如果需要測定劑量)；(iii)採用本領域技術人員已知的任何其他技術，這些技術使得可能證明例如核酸與蛋白之間的相互作用。
例如上述(ii)中測量的活性優選地至少等於用SEQ ID NO1或5序列位點測量的活性50％，更優選地至少等於75％時，變體可被認為是本發明意義的功能變體。本發明意義上的PPAR鏈位點的功能變體例如在下述文獻中描述過Juge-Aubry等人，《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)，272(1997)25252和Nakshatri等人，《NAR》26(1998)2491，這些文獻作為參考文獻引用於本文。
用三個RXRα、RXRβ和RXRγ基因編碼X類視黃醛衍生物受體(RXR)，其分離與序列曾得到描述(Mangelsdorf DJ等人(1990)《自然》345，224-229；Mangelsdorf DJ等人(1992)，《基因發展》6，329-344)。優選地，成分(d)編碼人的RXRα。
關於PPAR/RXR異源二聚化作用，可以討論兩個考查結果Mangelsdorf DJ和Evans RM(1995)，《細胞》83，841-850和Wilson TM和Wahli W(1997)，《化學生物學中的通用觀點》(Current Opinion in Chemical Biology)，1，235-241。Schulman IG等人(1998)，在《分子與細胞生物學》(Molecular andCellular Biology)，18，3483-3494中的文章描述了通過PPARγ/RXRα異源二聚體的反式激活作用。
使用成分(d)能對成分(b)的活性產生協同作用。
正如前面所指出的，在本發明組合物中，對PPAR反應的成分可以包含多個PPAR鏈位點。可以涉及相同位點的重複或不同位點的組合，相同位點重複是優選的。更優選地，反應成分包含多達30個鏈位點，優選地3-20個鏈位點，更優選地5-15個鏈位點。本發明的優選實施方式是一種包含10-15鏈位點的構建體，實施例中列出的結果事實上表明這樣一些構建體特別是在肌肉細胞中在誘導和表達水平方面的有利性質。
為了根據本發明組合物中成分(a)製造誘導啟動子，對PPAR反應的成分與最小的轉錄啟動子結合。最小啟動子是基礎活性低或沒有基礎活性並且其基礎活性在轉錄激活子存在(激活的PPAR與PPRE成分相互作用)下能增加的轉錄啟動子。因此，最小啟動子可以是在哺乳動物細胞中自然地弱型啟動子，即對於獲得顯著生物作用產生無毒性表達和/或不充分表達的啟動子。有利地，最小啟動子是使用天然的啟動子通過一種或多種具有轉錄活性的非必需區的缺失所製備的構建體。因此，優選地涉及一種基本上包含TATA盒的啟動子，其盒的尺寸一般小於160個核苷酸，並以轉錄的起始密碼子為中心。最小啟動子還可以用強或弱細胞病毒啟動子例如像皰疹病毒的胸苷激酶(TK)基因的啟動子、CMV的立即啟動子、PGK啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)基因啟動子、骨骼肌肌動蛋白不同同種型基因的啟動子、結蛋白基因的啟動子、波形蛋白基因的啟動子、肌球蛋白的輕鏈或重鏈基因的啟動子等製備。最小啟動子的特定實例例如可用CMV的-54至+48位核苷酸或TK啟動子的-105至+56位核苷酸表示。應當理解，本領域技術人員可以構建由其他啟動子得到這些啟動子或類似構建體的所有變體，並且可用於本發明範圍內。
最小啟動子(Pmin)，對PPAR反應的成分(PPRE)和目的核酸(AN)功能性地配置在成分(a)中，也就是說以便使最小啟動子控制目的核酸的表達，其活性由PPRE成分調節。一般地，這些區因此按照下述順序配置，在5』-3』方向PPRE-Pmin-AN。然而，本領域技術人員可以在不背離本發明的條件下考慮任何其他的功能性配置。
另外，上述不同的功能區彼此可以直接連接或者被對成分(a)啟動子的調節特性不產生明顯的不利影響的核苷酸分開。這樣一些核苷酸可以是在功能方面是中性殘基，例如由克隆步驟得到的中性殘基(PCR端，限制位點等)。這些核苷酸還可能具有生物學性質，能夠賦予本發明系統以改善的特性或性能(管理基因擴增子，特異組織擴增子，沉默子，內含子，剪接位點等)。對此，在本發明的特定實施方式中，誘導啟動子還包含擴增區。這樣一個區有利地能夠提高目的核酸表達水平。根據下述示意圖(5』-3』)PPRE-Pmin-AN，這樣一個擴增區(E)優選地定位在處於最小啟動子與目的核酸之間的該啟動子3』位。
另一方面，在本發明的構建體中，最小啟動子和對PPAR反應的成分可以同樣方向(即以轉錄方向)，或以相反方向(即與通過Pmin啟動子進行的轉錄相比，對PPAR反應的成分處於反方向)存在。正如實施例中說明的，這兩種實施方式能夠如在活體內一樣在活體外有效控制表達調節。
如上所述，本發明組合物的成分(b)至少包括-編碼PPAR的核酸，-在第二轉錄啟動子控制下。
PPAR屬於核激素受體的超家族，並歸併成三個不同的組，PPARα、PPARδ(還被稱作NCU-1或PPARβ)和PPARγ。在文獻中曾描述過許多人PPAR的分離和序列(具體參見Sher T.及其同事，《生物化學》，32(1993)5598-5604；Mukher jee R.及其同事，《J.Steroid Biochem.Molec.Biol.》，51(1994)157-166；Fajas L.及其同事，《生物化學雜誌》，272(1997)18779-18789；Mukher jee R.及其同事，《生物化學雜誌》，272(1997)8071-8076；Schmidt A.及其同事，《Mol.Endocrinol.》6(1992)1634-1641)。如專利申請WO99/05161所描述的，近來還曾克隆PPARγ啟動子。
在本發明的優選方式中，編碼PPAR的核酸編碼了人的PPAR，具體地是PPARα或PPARγ。這些實施例中列出的結果事實上表明，使用這些分子可保證本發明系統高調節水平和高表達水平，特別是在肌肉細胞中。
根據第一個實施方式，涉及其自然形態的PPARα或PPARγ，即與自然分子相比，沒有修飾原始結構。
根據另一種實施方式，涉及修飾的PPAR，它包含多個配體鏈位點。
對此，本發明描述並且同時涉及所有任何修飾的PPAR，它包含多個配體鏈位點。更特別地，涉及PPARα或PPARγ，還更優選地涉及PPARγ。優選地，本發明修飾的PPAR包含2-5個配體鏈位點，更優選地2-4個鏈位點。更特別地涉及PPAR，它包含在配體鏈E和F區的2-5個複製品。PPAR蛋白包含不同的區包含非依賴配體的反式激活區的A/B N-端區，作為DNA(DBD)鏈區的C區，作為鉸連結頭區的D區，以及E/F區，它包含依賴配體的反式激活區。E/F區還稱之配體鏈區(LBD)(具體參見Schoon jans K.及其同事，《生物化學與生物物理學報》(Biochim.Biophys.Acta)，1302(1996)93-109)。E/F區的限從一個PPAR改變到另一個PPAR。作為實例，對於所使用人的PPARγ2的同種型，E/F區從284位胺基酸擴展到505位胺基酸。本發明現在表明有可能構建包含多個重複E和F區的修飾PPAR，並且這些修飾的PPAR是功能性的，具有通過PPAR配體改善的誘導性。這樣一些構建體因此代表一種實施方式和本發明的特定目的。
根據本發明修飾的典型PPAR實例是包含2個配體鏈位點(即兩個E和F區)的PPARγ。SEQ ID NO24中列出PPARγ2γ2蛋白序列。
SEQ ID NO24MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNKPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY本發明還涉及保持PPAR模式活性的SEQ ID NO24序列的所有變體(激活能力，在如BRL49653的PPAR配體存在下，包含PPRE序列的啟動子)。這些變體可以被理解為所有突變體，缺失體和/或包含一個或多個互補殘基的多肽。優選地，一種變體保持至少80％ ID NO24序列殘基。
另外，本發明還涉及編碼這樣一種修飾PPAR的所有核酸。可以涉及DNA(特別是cDNA或合成的或半合成的DNA)或RNA。這個DNA可以根據本領域技術人員已知的分子生物學常規方法構建(合成，連接，庫篩選等)。有利地涉及包含編碼SEQ ID NO24序列多肽的序列，或與編碼SEQ ID NO24多肽的序列雜化，以及編碼具有PPAR模式活性多肽的所有核酸。另外，這種DNA可以包含例如啟動子和/或轉錄終止子。
控制編碼PPAR的核酸表達的第二轉錄啟動子，可以是在哺乳動物細胞中，特別是在人的細胞中的任何強或弱的、普遍存在或選擇性的、構成的或調節的功能性啟動子。可以涉及家畜細胞啟動子(即哺乳動物基因啟動子，特別是人的基因啟動子)，天然或合成的，簡單或複雜的病毒、細菌、昆蟲、植物啟動子等。適用於這種成分(b)的啟動子實例特別是病毒啟動子(SV40病毒的直接啟動子，CMV病毒直接啟動子，反錄病毒的長末端重複順序，皰疹病毒TK啟動子)或細胞的啟動子(PGK啟動子，白蛋白，EF1α，或在肌肉中強表達的基因，如肌的肌酸激酶(MCK)基因啟動子，骨骼肌肌動蛋白的不同同種型基因的啟動子，結蛋白基因的啟動子，波形蛋白基因啟動子，肌球蛋白的輕鏈或重鏈基因的啟動子)。另外，啟動子可通過加入一種或多種增強子區進行修飾，如β球蛋白基因的2基因內區的增強子區，CMV病毒的非常早期基因的增強子EF1α的增強子，一種或多種沉默子，賦予組織特效性(例如由特效組織啟動子分離的區，如肌的肌酸激酶(MCK)基因啟動子，骨骼肌肌動蛋白的不同異構重整體基因的啟動子，結蛋白基因的啟動子，波形蛋白基因啟動子，肌球蛋白的輕鏈或重鏈基因的啟動子)或可調節特性的區，或例如通過具有活性的非必需區的缺失進行修飾。這樣一些啟動子可用於表達在成分(d)中包含的RXR。
第二啟動子的優選實例是病毒啟動子，特別是SV40病毒早期啟動子和CMV直接啟動子或它們的衍生物。
另外，在特定的實施方式中，當成分(a)和(b)以及任選的(d)集合在同一遺傳構建體中時，(成分(b)的)第二轉錄啟動子和成分(a)的誘導啟動子，以及任選的成分(d)的啟動子可以集合以便只生成共同的啟動子區，特別是雙向的共同啟動子區，如在下文將詳細解釋的那樣。
對此，本發明另一個目的在於包含如前面定義的成分(a)和(b)以及任選的(d)的載體。
根據本發明的第一個實施方案，成分(a)和(b)，以及任選的(d)在載體中取相同的方向。例如用SV-g2-J10-C-pGL3質粒說明這樣一種實施方案(圖17)。
根據本發明的另一個實施方案，成分(a)和(b)，以及任選的(d)在載體中相反取向。例如用圖16、18和19中表示的質粒說明這樣一種實施方案。更優選地，在這種實施方案中，成分(a)的誘導啟動子和成分(b)的轉錄啟動子集合在載體中以便形成可調節的雙向啟動子。例如用圖18和19中表示的質粒說明這樣一種實施方式。
對此，本發明的特定目的在於一種載體，其特徵在於它在5』-3』方向包含第一個編碼PPAR的核酸，控制所述第一個核酸表達的第一個最小轉錄啟動子，一個或多個對PPAR反應的成分，第二個最小轉錄啟動子和處在所述第二個最小轉錄啟動子控制下編碼目的產物的第二個核酸。
這種構建模式是有利的，因為它允許在同一質粒中共-表達兩個核酸、並且通過PPAR及其配體調節兩個核酸而擴增這種表達。
一般地，在PPAR配體(成分(c))存在下，本發明組合物中目的核酸的表達被激活。對此，根據使用的PPAR，可以使用不同類型配體，天然的或合成的配體。
因此，PPARα的激活子配體例如是纖維酸鹽(fibrate)，例如纖維酸及其類似物。作為纖維酸類似物，特別可以列舉吉非貝齊(《動脈粥樣硬化》，114(1)(1995)61)，苯扎貝特(《肝臟病學》，21(1995)1025)，環丙貝特(《BCE M》，9(4)(1995)825)，安妥明(《藥物安全》(Drug Safety)，11(1994)301)，非諾貝特(非諾貝特專論，牛津大學臨床通訊，1995)，克利貝特(KidneyInternational，44(6)(1993)1352)，pirinixique酸(Wy-14643)或5，8，11，14-二十烷四酸(ETYA)。這些不同的化合物在活體外或在活體內與生物使用和/或藥理學使用是相容的。
PPARγ的激活子配體可以選自天然或合成配體。作為天然配體，可以提及脂肪酸和eicosanoides(例如亞油酸，亞麻酸，9-HODE，5-HODE)，作為合成配體，可以列舉噻唑烷二酮，具體如rosiglitazone(BRL49653)，pioglitazone或troglitazone(例如參見Krey G.及其同事，《Mol.Endocrinol.》11(1997)779-791或Kliewer S.和Willson T.《(Curr.Opin.IN Gen.Dev.》8(1998)576-581)或化合物RG12525。
另外，本發明的組合物可以包含幾種配合的PPAR的激活子，特別是與視黃醛衍生物配合的纖維酸鹽或纖維酸鹽類似物。
本發明還有一個目的是使用如前面定義的組合物或載體，表達在活體外或試管內細胞中的目的核酸。
對此，核酸可以是編碼目的產物(RNA、蛋白、多肽、肽等)的任何核酸(DNA，RNA)。可以涉及農業食品、治療、疫苗、標記物等的目的產物。
本發明還涉及上述組合物或載體在製備用於表達在活體內細胞中目的核酸的產品方面的應用。
本發明還涉及調節表達細胞中核酸的方法，該方法包括讓所述細胞與前面定義的組合物或載體接觸。
對於在試管或在活體外應用，根據不同的方案，細胞可以與本發明的組合物或載體進行接觸。因此，培養物中的細胞可以與本發明的成分(a)、(b)和(c)以及任選的(d)一起，例如與包含成分(a)和(b)的載體並且在配體(c)存在下直接培養。作為可供選擇替代的方案，細胞首先可以與成分(a)和(b)，以及任選的(d)一起培養(具體地集合在同一個載體中)，然後，其次(在培養與任選地選擇修飾細胞後)，可以加入成分(c)。這後一種方案例如能夠將培養期(或細胞擴展期)與核酸表達期分開。這些試驗可以在任何設備和適當介質中進行，優選地在板、盒、瓶中在滅菌條件下進行。本領域技術人員根據實施例中提供的信息及其常識很容易確定細胞、載體和配體的量。
對於活體內應用，細胞(或器官，組織等)以同時，分開或以一定時間間隔的方式加入成分(a)、(b)和(c)，以及任選的(d)進行接觸。為此，一般地通過腸胃外、特別地採用肌內、靜脈內、皮下、皮內、腫瘤內或立體定位途徑任選地以唯一遺傳構建體形式加入成分(a)和(b)以及任選的(d)。可以由所考慮的應用，靶組織和/或被轉基因編碼的目的產物類型指導用藥方式的選擇。對於這種用藥，本發明組合物可以包含任何有利於細胞轉染的試劑(陽離子聚合物，脂類等)。在特定方式中，採用肌內方法給藥該組合物，以「null露」核酸形式，即在無添加的轉染劑存在下使用遺傳構建體。
同樣地，在採用病毒載體加入成分(a)和(b)以及任選的(d)時，無需任何補充的轉染劑。
正如實施例中所描述的，配體(c)可以在成分(a)和(b)以及任選的(d)之前、與其同時或之後加入。
對此，例如可以採用口服、肛門、靜脈內、腹膜內或肌內途徑給藥配體。
本領域技術人員根據文獻中公開的在活體內的數據可調整使用的劑量。因此，例如對於在水中不溶的形式，如BRL49653配體典型劑量是5-50毫克/千克，例如30毫克/千克，這樣的劑量至少能夠達到質粒濃度接近大約15微克/毫升。對於其生物利用率較大的配體的水溶性形式(例如BRL49653馬來酸鹽)，典型劑量較低，一般低於5毫克/千克，例如0.01-1毫克/千克。本領域技術人員顯然可以根據使用的構建體、使用的配體以及所尋求的應用與效果，可調整這些劑量。一般地，實施例中列出的結果有利地表明，本發明組合物以配體劑量低於通常使用的劑量能夠達到在活體內強而可調節的表達。另外，儘管可以反覆給藥配體，但列出的結果還表明，僅一次給藥配體後表達就很強。
一般地，根據所尋求的應用，使用的載體劑量可以是0.01-1000微克或更多。
本發明可以用於在試管中，在活體外或在活體內表達不同類型細胞、組織或器官中的基因。特別地，可以涉及哺乳動物，優選地人的細胞、組織或器官。說明性地，可以列舉肌細胞(或肌肉)，肝細胞(或肝臟)，心臟細胞(或心臟，動脈壁或血管壁)，神經細胞(或腦，骨髓等)或腫瘤細胞(或腫瘤)。
優選地，本發明的構建體、組合物和方法用於在試管中、在活體外或在活體內調節表達肌細胞(或肌肉)中的核酸。實施例中列出的結果更特別地說明了在活體內或在試管中在這類細胞中本發明所呈現的優點。
本發明還涉及通過與上述組合物或載體接觸所修飾的任何細胞。
本發明還涉及上述組合物、載體或細胞的應用，其中目的核酸是用於在試管中，在活體外或在活體內(特別在肌細胞或肌肉中)篩選PPAR配體的報導基因(例如分泌的螢光素酶或鹼性磷酸酶)。對此，本發明還描述了PPAR配體鑑定方法，該方法包括使上述細胞與試驗分子(或組合物)接觸並且證明目的核酸的表達(它優選地是報導基因)。為了評價試驗化合物的活性，還可以將這種表達與沒有試驗化合物或有參比配體時所觀察的表達進行比較。
本發明還涉及如前面定義的組合物或載體在構建轉基因動物，特別是非人哺乳動物方面的應用，這些轉基因動物對於潛伏期研究或生物利用率、標記等研究是很有效的。
通過下述實施例更詳細地描述本發明，這些實施例被認為是說明性的，而不是限制性的。
圖1圖示法說明FTKpGL3質粒。
圖2圖示法說明Jx3S-TK-pGL3質粒。
圖3圖示法說明Jx3AS-TK-pGL3質粒。
圖4圖示法說明DR1x3S-TK-pGL3質粒。
圖5圖示法說明DR1x3AS-TK-pGL3質粒。
圖6鼠的成肌細胞(C2C12)在試管中瞬時轉染時所評價的誘導啟動子的活性。這些細胞用①10納克FTKpGL3質粒(a)，或Jx3S-TK-pGL3質粒(b)，或Jx3AS-TK-pGL3質粒(c)，或DR1x3S-TK-pGL3質粒(d)，或DR1x3AS-TK-pGL3質粒(e)；②增加量的pSG5-hPPARg2質粒，以及③20納克pRL-null質粒進行共轉染。每個誘導啟動子的活性表示通過Renilla reniformis的螢光素酶活性標準化的Photinus pyralis的螢光素酶活性。
圖7鼠的成肌細胞(C2C12)在試管中瞬時轉染時所評價的誘導啟動子的活性。這些細胞用①10納克FTKpGL3質粒(a)，或Jx3S-TK-pGL3質粒(b)，或Jx3AS-TK-pGL3質粒(c)，或DR1x3S-TK-pGL3質粒(d)，或DR1x3AS-TK-pGL3質粒(e)；②增加量的pSG5-hPPARa(Koz)質粒，以及③20納克pRL-null質粒進行共轉染。每個誘導啟動子的活性表示通過Renilla reniformis的螢光素酶活性標準化的Photinus pyralis的螢光素酶活性。
圖8圖示法說明Jx5AS-CMV-pGL3質粒。
圖9鼠的成肌細胞(C2C12)在試管中瞬時轉染時所評價的誘導啟動子的活性。這些細胞用①10納克Jx5AS-TK-pGL3質粒(a)，或Jx5AS-CMV-pGL3質粒(b)；②增加量的pSG5-hPPARg2質粒，以及③20納克pRL-null質粒進行共轉染。每個誘導啟動子的活性表示通過Renilla reniformis的螢光素酶活性標準化的Photinus pyralis的螢光素酶活性。
圖10鼠的成肌細胞(C2C12)在試管中瞬時轉染時所評價的誘導啟動子的活性。這些細胞用①10納克JxnAS-TK-pGL3質粒；②10納克pSG5-hPPARg2質粒，以及③20納克pRL-null質粒進行共轉染。每個誘導啟動子的活性表示通過Renilla reniformis的螢光素酶活性標準化的Photinus pyralis的螢光素酶活性。
圖11鼠的成肌細胞(C2C12)在試管中瞬時轉染時所評價的誘導啟動子的活性。這些細胞用①10納克JxnAS-CMV-pGL3質粒；②10納克pSG5-hPPARg2質粒(a)或50納克pSG5-hPPARg2質粒(b)，以及③20納克pRL-null質粒進行共轉染。每個誘導啟動子的活性表示通過Renilla reniformis的螢光素酶活性標準化的Photinus pyralis的螢光素酶活性。
圖12圖示法說明pSG5-hPPARg2g2質粒。
圖13hPPARg2和hPPARg2g2轉錄調節基因的比較。鼠的成肌細胞(C2C12)用①10納克Jx10AS-CMV-pGL3質粒；②增加量的pSG5-hPPARg2質粒(a)或pSG5-hPPARg2g2質粒(b)，以及③20納克pRL-null質粒進行共轉染。誘導啟動子的活性表示了用Renilla reniformis的螢光素酶活性標準化的Photinuspyralis的螢光素酶活性用pSG5-hPPARg2質粒或pSG5-hPPARg2g2質粒得到的BRL49653的誘導因子。通過用DMSO存在下的活性除以在BRL49653存在下的活性，可計算出這個誘導因子。
圖14圖示法說明Jx10AS-CMV-EF-pGL3質粒。
圖15鼠的成肌細胞(C2C12)在試管中瞬時轉染時所評價的誘導啟動子的活性。這些細胞用①10納克Jx10AS-CMV-pGL3質粒(a)，或Jx10AS-CMV-EF-pGL3質粒(b)；②增加量的pSG5-hPPARg2g2質粒，以及③20納克pRL-null質粒進行共轉染。每個誘導啟動子的活性表示通過Renilla reniformis的螢光素酶活性標準化的Photinus pyralis的螢光素酶活性。
圖16圖示法說明Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質粒。
圖17圖示法說明SV-g2-J10-C-pGL3質粒。
圖18圖示法說明hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質粒。
圖19圖示法說明hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒。
圖20在試管中不同誘導系統版本的比較。每個系統版本，使用相同摩爾數的誘導表達盒轉染鼠的成肌細胞(C2C12)。以通過使用pCMV-前導TK質粒得到的hCMV-IE啟動子活性百分數表示這些結果。通過用有DMSO存在時的活性除以有BRL49653存在時的活性，可計算出BRL49653誘導因子。1＝pSG5-hPPARg2+Jx5AS-TK-pGL3；2＝Jx5AS-TK-luc-hPPARg2；3＝pSG5-hPPARg2g2+Jx10AS-CMV-pGL3；4＝pSG5-hPPARg2+Jx10AS-CMV-pGL3；5＝SV-g2-J10-C-pGL3；6＝hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3；7＝hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3；8＝hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3；9＝hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3。
圖21BRL49653和RG12525配體在試管中的比較。鼠的成肌細胞(C2C12)用①10納克其表達盒存在於(a)的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒；和②10納克pRL-null質粒(b)進行轉染。誘導啟動子的活性表示通過Renillareniformis的螢光素酶活性標準化的Photinus pyralis的螢光素酶活性。
圖22在活體中不同誘導系統版本的比較。在C57Bl/6鼠(每組6隻鼠)顱側脛骨兩側注射對於每個系統版本而言相同摩爾數的誘導表達盒。在每塊肌肉上施加電轉移。處理的動物每天採用強飼法接受30毫克/千克BRL49653。在注射DNA後四天，動物經宰殺後，取下肌肉測量螢光素酶活性。1＝pCMV-前導TK；2＝pSG5-hPPARg2+Jx10AS-CMV-pGL3；3＝pSG5-hPPARg2g2+Jx10AS-CMV-pGL3；4＝hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3。
圖23在活體內不同BRL49653誘導方案的比較。在C57Bl/6鼠(每組6隻鼠)顱側脛側骨兩側注射10微克包含1微克其表達盒存在於(a)中的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒的DNA。用不同誘導方案得到的活性匯集在部分(b)中。
圖24圖示法說明pRDA02質粒。
圖25在活體內用誘導系統得到的誘導動力學。(A)在十隻C57Bl/6鼠顱側脛側骨兩側注射包含3毫克pRDA02質粒和3毫克pSG5-hPPARg2質粒的DNA混合物。這時在每塊肌肉上施加電轉移。在注射DNA後第四天，然後第39天，採用強飼法用30毫克/千克BRL49653處理動物。在不同時間抽取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix，PE Biosystem，Foster City，CA)，測量質粒中分泌的鹼性磷酸酶的酶活性。(B)在C57Bl/6鼠(兩組各十隻)顱側脛側骨兩側注射包含3毫克pRDA02質粒和3毫克pSG5-hPPARg2質粒的DNA混合物。這時在每塊肌肉上施加電轉移。在注射DNA後四天，採用強飼法，動物或者僅一次接受劑量30毫克/千克BRL49653，或者5天內每天接受一次劑量(30毫克/千克)。在不同時間取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix)，測量血漿中hSeAP的酶活性。列出的結果(誘導因子)相應於在有意義那天測量的hSeAP活性與第四天得到的活性的比。
圖26在活體內比較不同PPARg配體並且研究其中一種配體的劑量效果。在C57Bl/6鼠(每組五隻)顱側脛骨兩側注射包含5毫克pRDA02質粒和5毫克pSG5-hPPARg2質粒的DNA混合物。這時在每塊肌肉上施加電轉移。在注射DNA後六天(A)或十天(B)，採用強飼法，動物或者用不同的PPARg配體(A；BRL49653，ActosTM(Takeda Phamaceuticals)和AvandiaTM(SmithKline Beecham))，或者用不同劑量BRL49653(B)處理。在不同時間抽取肝素血，使用Phospha-LightTM盒(Tropix)，測量血漿中hSeAP的酶活性。列出的結果(誘導因子)相應於在有意義那天測量的hSeAP活性與第六天(A)或第十天(B)得到的活性的比。
圖27圖示法說明Jx10AS-CMV-VEGFA165質粒。
材料與方法分子生物學中通常使用的方法，例如質粒DNA製備提取法，質粒DNA的氯化銫梯度離心法，瓊脂糖凝膠電泳法，DNA片段電洗脫純化法，在鹽介質中採用乙醇或異丙醇完成的質粒DNA沉澱法，在大腸桿菌中轉化法，都是本領域技術人員熟知內容並且在文獻中作過大量描述(Sambrook及其同事，《分子克隆，實驗室手冊》(Molecular Cloning，a Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。
被用於克隆不同啟動子區的pGL3-Basic質粒以及pRL-null質粒都是商業來源的質粒(Promega Corportion)，pSG5(Stratagene)，pBluescript IISK+(Stratagene)和pSL301(Invitrogen Corportion)質粒也是商業來源的質粒。前面描述過構建pSG5-hPPARg2表達質粒(Fajas及其同事，《生物化學雜誌》272，(1997)18779-18789)和pSG5-hPPARa(Koz)(Gervois P.及其同事，《Mol.Endocrinol.》13(1999)400-409)。
在25/09/98的法國專利申請FR98/120000和美國專利申請US SN 60/123298(臨時申請)中也描述過構建pCMV-前導TK質粒。
需要注意的是這種質粒以下述方式構建。Tanaka及其同事描述過的pCGN表達載體(《細胞》，60(1990)375-386)包含CMV啟動子(-522/+72)，在編碼血凝素抗原決定簇的序列上遊，該啟動子與HSV的tk基因(+51/+101)的《頂枝》融合。pGCN質粒(10納克)被用作ACP擴增的基質。曾使用的引物如下
-6718引物(5』CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG3』)(SEQ ID NO26)，這種引物與-522位的CMV啟動子(在pGCN的EcoRI位點下遊8個核苷酸)雜化。
-6719引物(5』GGGACGCGCTTCACAAGGCGCTGGCCGAA3』)(SEQ ID NO27)，這種引物發生雜化直到tk《前導區》的101位為止。如下面所解釋的，採用粗體字標記的第一核苷酸G用於修復pGL3-Basic的Ncol位點。
如此得到的ACP片段經純化後，再用T4噬菌體的多核苷酸激酶進行磷酸化(New Englands Biolabs)。同時，pGL3-Basic載體(Promega)用Ncol線性化，純化，然後用Klenow DNA聚合酶(Boehringer Manheim)處理，以便填平Ncol位點。這種載體然後用鹼性磷酸酶(Boehringer Manheim)進行去磷酸化，再用於插入磷酸化ACP片段。於是，只有當用在pGL3-Basic的HindIII位點下遊的5』部分(6718引物，CMV的-522位)使CMV-前導區tk片段定向，並且其3』端(6719引物，前導區tk)與pGL3-Basic的Ncol位點(螢光素酶的第一個ATG)連接時，6719引物的鳥苷(G)能夠修復Ncol位點。得到的質粒命名為pCMV-前導TK。
根據生產者的推薦，通過使用DNA熱循環器TM(Perkin Elmer Cetus)，可以藉助ACP(通過聚合酶擴增鏈)技術進行DNA片段酶擴增。
根據生產者的推薦，使用電穿孔儀在大腸桿菌細胞中進行質粒DNA的電穿孔。
採用Sanger及其同事研製的方法(《Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.》74，(1977)5463-5467)，根據生產者推薦，使用由應用生物系統提供的試劑盒，確認核苷酸序列。
在補充10％胎牛血清(SVF)的DMEMTM介質(Life Technologies Inc.)中培養C2C12鼠的成肌細胞。在37℃烘箱中，在潮溼氣氛與5％CO2分壓下進行培養。
在24孔板中進行轉染，每個轉染進行三次。在轉染前二十四小時，每個孔接種在DMEMTM介質中的3×104個細胞。對於每個孔，500納克質粒DNA(目的質粒和pBluescript II SK+，以補充到500納克)與RPR120535 B陽離子脂類(WO97/18185)，按照每微克DNA 6納摩爾脂類，在包含150毫摩爾NaCl和50毫摩爾碳酸氫鹽的DMEMTM介質(最後20微升)中混合。在室溫下20分鐘後，在沒有SVF的情況下，20微升DNA/脂類混合物與這些細胞接觸2小時。培養介質這時補加SVF和ULTROSERTM(BioSepra Inc.)，以便最後濃度分別達到10％或2％。與SVF或ULTROSERTM同時，將溶於DMSO中的PPAR配體加入培養介質中。在轉染後四十八小時，取出培養介質，用PBS(Life Technologies Inc.)清洗細胞兩次。這時根據供應商的推薦，使用Dual-Luciferase Reporter AssaySystemTM(Promega)，測定Renilla pyralis的螢光素酶活性和Renillarenifomis的螢光素酶活性。
用6周齡C57BI/6雌鼠在活體內進行基因轉移試驗。這些動物用250微升氯胺酮(Rhne Mérieux，最後為10毫克/毫升)/甲苯噻嗪(Bayer Pharma，最後為0.3毫克/毫升)的混合物，通過腹膜內方式進行麻醉。這時，在每個顱側脛骨肌中注射總量為10微克DNA。然後，每個爪被施加電場(頻率1Hz；在250伏/釐米下4個脈衝，每個脈衝為20毫秒)。在整個試驗期，在每天早晨採用強飼法，讓這些動物接受30毫克/千克BRL49653(SmithKline Beecham)在1％(重量/體積)羧基纖維素中的溶液，或者只是接受1％羧基纖維素。在轉移基因後四天，宰殺這些動物，在Lysing MatrixTM管(BIO 101，Inc.)的PLBTM細胞溶解緩衝液(Promega Corporation)中取下肌肉。使用FastPrepTM(BIO 101，Inc.)以6.5米/秒磨碎肌肉25秒，這樣能夠提取螢光素酶。根據供應商推薦，這時使用Luciferase Assay SystemTM盒(Promega Corporation)測定Photinuspyralis的螢光素酶活性。
實施例實施例1用PPAR構建誘導啟動子和構建包含這些啟動子的表達質粒1.1 FTKpGL3質粒使用pBLCAT2質粒(Luckow B.和Schutz G.，《核酸研究》(Nucleic AcidsRes.)，15(1987)5490)作為基質並且利用5』CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGCCCA GCG 3』(SEQ ID NO28)和5』TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA 3』(SEQID NO2)寡核苷酸作為引物藉助ACP擴增相應於一部分1型單純皰疹病毒TK基因啟動子的DNA片段，與轉錄起始位點相比，該片段位-105位至+56位之間。這個片段用BaIII和HindIII消化，然後在預先用BaIII和HindIII消化的pGL3-Basic質粒中進行克隆，以便得到FTKpGL3質粒。這個質粒的示意圖說明於圖1中。
1.2 JxnS-TK-pGL3質粒使用J3TK-pGL3質粒(Vu-Dac N.及其同事，《J.Clin.Invest.》96(1995)741-750)作為基質並且利用3RDA37(5』ACG TGT CGA CAC TAG TGG CTAGAG GAT CTC TAC CAG G3』；SEQ ID NO3』)和4RDA48(5』CGA TGG TAC CCT CGAGCA ATG TGC TAG CGA GAT CCT TCA ACC TTT ACC 3』；SEQ ID NO4)寡核苷酸作為引物，藉助ACP使包含一個或多個(n)人ApoA-II基因的啟動子J位點的DNA片段擴增。這個片段用Xhol和Spel消化，然後在預先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3質粒中，沿TK(S)最小啟動子轉錄方向進行克隆，以便根據存在的J位點數得到Jx1S-TK-pGL3、Jx2S-TK-pGL3和Jx3S-TK-pGL3質粒。Jx3S-TK-pGL3質粒的示意圖如圖2所示。
通過使用J3TKpGL3質粒和3RDA37和4RDA48寡核苷酸作為引物被ACP擴增的、用Xhol和Spel消化的DNA片段，也在預先用Xhol和Nhel消化的Jx3S-TK-pGL3質粒中克隆，以便根據存在的J位點數得到Jx4S-TK-pGL3、Jx5S-TK-pGL3和Jx6S-TK-pGL3質粒。
1.3 JxnAS-TK-pGL3質粒A JxnAS-TK-pGL3質粒在存在於誘導啟動子中的J位點定向方面與JxnS-TK-pGL3質粒不同。通過使用J3TKpGL3質粒作為基質，3RDA37和4RDA48寡核苷酸作為引物藉助ACP擴增包含一個或多個人ApoA-II基因的啟動子J位點的DNA片段。這個片段用Sall和Nhel消化，然後在用Xhol和Nhel預先消化的FTXpGL3質粒中，沿TK(AS)最小啟動子轉錄相反方向進行克隆，以便根據存在的J位點數得到Jx1AS-TK-pGL3、Jx2AS-TK-pGL3和Jx3AS-TK-pGL3質粒。Jx3AS-TK-pGL3質粒的示意圖如圖3所示。
通過使用J3TKpGL3質粒和3RDA37和4RDA48寡核苷酸作為引物被ACP擴增的、用Kpnl和Spel消化的DNA片段，也在預先用Kpnl和Nhel消化的Jx3AS-TK-pGL3質粒中，沿反方向(AS)進行克隆，以便根據存在的J位點數得到Jx4AS-TK-pGL3和Jx5AS-TK-pGL3質粒。
1.4 DR1xnS-TK-pGL3質粒這些質粒包含被稱作共有DR1的共有序列(AGGTCA A AGGTCA，SEQ ID NO5)作為對PPAR反應的成分(PPRE)。通過使用1RDA69(5』ACG TGT CGA CAC TAGTCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA AAG GTC ACG GAA AACTAG3』；SEQ ID NO6)和2RDA64(5』CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCGTGA CCT TTG ACC TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3』；SEQ ID NO7)寡核苷酸作為引物藉助ACP擴增包含一個或多個共有DR1位點的DNA片段。這個片段用Xhol和Spel消化，然後在預先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3質粒中，沿取向方向進行克隆，以便根據存在的共有DR1位點數得到DR1x2S-TK-pGL3和DR1x3S-TK-pGL3質粒。DR1x3S-TK-pGL3質粒的示意圖如圖4所示。
通過使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作為引物時藉助ACP擴增的用Xhol和Spel消化的DNA片段，還在用Xhol和Nhel預先消化的DR1x3S-TK-pGL3質粒中進行克隆，以便根據存在的共有DR1位點數得到DR1x5S-TK-pGL3、DR1x6S-TK-pGL3和DR1x7S-TK-pGL3質粒。
1.5 DR1xnAS-TK-pGL3質粒DR1xnAS-TK-pGL3質粒與DR1xnS-TK-pGL3質粒在存在於誘導啟動子中的共有DR1位點的定向方面不同。通過使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作為引物藉助ACP擴增包含一個或多個共有DR1序列的DNA片段。這個片段用Sall和Nhel消化，然後在預先用Xhol和Nhel消化的FTKpGL3質粒中，沿反方向進行克隆，以便根據存在的共有DR1位點數得到DR1x2AS-TK-pGL3和DR1x3AS-TK-pGL3質粒。DR1x3AS-TK-pGL3質粒的示意圖如圖5所示。
通過使用1RDA69和2RDA64寡核苷酸作為引物藉助ACP擴增的Kpnl和Spel消化的DNA片段，還在預先用Kpnl和Nhel消化的DR1x3AS-TK-pGL3質粒中進行克隆，以便根據存在的共有DR1位點數得到DR1x5AS-TK-pGL3和DR1x6AS-TK-pGL3質粒。
實施例2PPAR對不同反應成分的特效性2.1.使用hPPARg2的系統在鼠的成肌細胞瞬時轉染中(圖6)，曾評價過使用hPPARg2作為轉錄調節基因時誘導啟動子的活性。這些結果表明，根據使用的反應成分(PPRE)，使用hPPARg2(BRL49653)的配體的誘導作用與激活後最後的活性都隨之改變。使用J位點作為PPRE時得到最佳結果。另外，PPRE方向也很重要。在J位點的情況下，AS方向更為有利(部分c)。
2.2.使用hPPARa的系統使用hPPARa作為轉錄調節基因所得到的結果匯集於圖7。與hPPARg2相反，對於hPPARg2，共有DR1才是最佳PPRE(部分d和e)。
因此，這些結果表明(1)本發明質粒的泛函性和(2)根據選自誘導系統的PPAR，重要的是選擇對轉錄調節基因最合適的PPRE。由於配體存在，這種選擇可能影響誘導因子，但也影響誘導後所達到的活性水平。不言而喻，其他PPRE也可以用於本發明系統。
實施例3用PPAR構建誘導啟動子，它們包含除HSV1-TK啟動子外的最小啟動子，例如像hCMV-IE最小啟動子3.1.構建包含hCMV-IE最小啟動子的質粒通過使用pCMVβ質粒(Clontech)作為基質並且利用5RDA32(5』ACG TAGATC TCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG 3』；SEQ ID NO8)和6RDA29(5』ACG TAAGCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GC 3』；SEQ ID NO9)寡核苷酸作為引物，採用ACP擴增包含hCMV-IE最小啟動子(相對於轉錄起始位點從-54位到+48位)的DNA片段。這個片段用HindIII和BqIII消化，然後在用HindIII和BqIII預先消化的FTKpGL3質粒中進行克隆，以便得到FCMVpGL3質粒。
用BgIII和Nhel消化Jx5AS-TK-pGL3質粒，以便分離包含5個J位點複製品的179pb BgIII-Nhel片段。這個片段被插入用BgIII和Nhel預先消化的FCMVpGL3質粒以便得到Jx5AS-CMV-pGL3質粒。Jx5AS-CMV-pGL3質粒示意圖如圖8所示。
用Sphl和Nhel消化Jx5AS-CMV-pGL3質粒，分離出包含5個J位點複製品，hCMV-IE最小啟動子和編碼螢光素酶的基因5』部分的982pb Sphl-Nhel片段。這個片段被插入用Sphl和Spel預先消化的Jx5AS-CMV-pGL3質粒中以便得到Jx10AS-CMV-pGL3質粒。根據同樣的構想，可得到Jx15AS-CMV-pGL3和Jx20AS-CMV-pGL3質粒3.2.包含hCMV-IE最小啟動子的質粒活性在瞬時轉染時，對可被用於誘導系統中的最小啟動子進行過比較。匯集於圖9中的結果表明，根據最小啟動子，誘導後的最後活性可以增大或減少一倍。這些結果特別地表明，在試驗條件下，CMV啟動子似乎給出較高的活性。當然，其他的最小啟動子，如不包含TATA盒的啟動子，也可以使用。
實施例4在誘導啟動子中存在的反應成分數的重要性在瞬時轉染時，對存在於誘導啟動子中的PPRE數的最優化進行研究。在圖10中列出的結果表明，PPRE複製品數量越大，配體的誘導因子和誘導活性就越高。相反地，如果這個數太大，誘導因子和誘導活性同時隨之降低，不管試驗中存在的hPPAPRg2量如何都是如此(圖11)。最佳PPRE數似乎是10-15。
實施例5用PPAR的配體構建強誘導的轉錄調節基因5.1.構建包含兩個配體鏈區複製品的轉錄調節基因。構建pSG5-hPPARg2g2質粒通過使用pSG5-hPPARg2質粒作為基質並且利用20RDA21(5』GGT TTG CTGAAT GTG AAG CCC 3』；SEQ ID NO10)和21RDA42(5』AGT CTC TAG AGC TAC GCGTAC AAG TCC TTG TAG ATC TCC TGC3』；SEQ ID NO11)寡核苷酸作為引物，採用ACP擴增被標記為A的DNA片段，該片段包含編碼F區C-端部的hPPARg2的互補DNA區。通過使用pSG5-hPPARg2質粒作為基質並且利用22RDA32(5』AGTCAC GCG TGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG AC 3』；SEQ ID NO12)和23RDA21(5』GCC TTT GAG TGA GCT GAT ACC 3』；SEQ ID NO13)寡核苷酸作為引物，採用ACP擴增被標記為B的DNA片段，該片段包含編碼E和F區的hPPARg2互補DNA區。用Sacl和Mlul消化的A片段與用Mlul和Xbal消化的B片段一起，在用Sacl和Xbal預先消化的pSG5-hPPARg2質粒中進行克隆，得到pSG5-hPPARg2g2質粒。其示意圖如圖8所示的這個質粒包含編碼轉錄調節基因(記為hPPARg2g2)的互補DNA，而該調節基因包含兩個E和F區複製品，即兩個配體鏈區。
下面列出PPARγ2γ2的完全序列(SEQ ID NO24)MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNKPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY
包含E和F區的PPARγ2γ2的C-端部分的序列是下述SEQ ID NO25序列MMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLYAWAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY5.2.pSG5-hPPARg2g2質粒的活性圖13中列出的結果表明，如果使用hPPARg2g2作為轉錄調節基因時，誘導活性比較低(圖13a和b)，則使用這種調節基因時，配體的誘導因子(圖13c)明顯地較高。兩種轉錄調節基因之間的差別可用下述事實解釋對於hPPARg2g2，沒有配體存在時系統的基底噪聲是低的，儘管存在一定量的調節基因，但仍然保持低水平。另一方面，hPPARg2g2量增加越大，誘導活性也越強，使用看來飽和的hPPARg2的系統就不是這種情況。
因此，第二個配體鏈區(hPPARg2g2)的存在通過配體賦予轉錄調節基因以更大的誘導性。
實施例6提高誘導啟動子的最後活性6.1.構建包含hEF1a基因內區的誘導表達盒。構建Jx10AS-CMV-EF-pGL3質粒通過使用25RDA35(5』AGT CAC TAG TAA GCT TTT TGC CGC CAG AAC ACA GG3』；SEQ ID NO14)和26RDA36(5』AGT CAC TAG TCC ATG GCT GCC CAG TGC CTCACG ACC 3』；SEQ ID NO15)寡核苷酸作為引物藉助ACP擴增包含編碼hEF1a的基因的第一個基因內區的DNA片段(相對於轉錄起始位點從+16位到+984位；進入Genbank的編號E02627)。這個片段用HindIII和NcoI消化，然後在用HindIII和NcoI預先消化的Jx10AS-CMV-pGL3質粒中進行克隆，得到Jx10AS-CMV-EF-pGL3質粒。Jx10AS-CMV-EF-pGL3質粒示意圖如圖14所示。
6.2.Jx10AS-CMV-EF-pGL3質粒的活性為了提高系統的最後活性，在誘導啟動子附近克隆位於hEF1a基因的第一個基因內區中的增強子序列。圖15中列出的結果表明，增強子區的存在提高了系統的誘導活性，無論轉錄調節基因使用量為多少仍然如此。
實施例7構建同時包含轉錄調節基因表達盒和誘導表達盒的質粒7.1.Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質粒用Mlul和Scal消化pSG5-hPPARa(Koz)質粒，以便分離包含hPPARa互補DNA的3』區的1229pb Mlul-Scal片段。這個片段插入用Mlul和Smal預先消化的pSL-301質粒中，得到pSL-3』hPPARa質粒。
用Sall和Mlul消化pSG5-hPPARa(Koz)質粒，以便分離包含SV40病毒早期啟動子和hPPARa互補DNA的5』區的1406pb Mlul-Scal片段。這個片段插入用Xhol和Mlul預先消化的pSL-3』hPPARa質粒，得到pSL-hPPARa質粒。
用Spel和Sall消化pSL-hPPARa質粒，以便分離包含SV40病毒早期啟動子和hPPARa互補DNA的2664pb Spel-Sall片段。這個片段插入用Spel和Sall預先消化的pBluescript II SK+質粒中，得到pBS-hPPARa質粒。
用Avrll和Sacl消化pSG5-hPPARg2質粒，以便分離包含hPPARg2互補DNA的5』區的2070pb Avrll-Sacl片段(標記為C)。通過使用pSG5-hPPARg2質粒作為基質並且利用10RDA21(5』CAG GTT TGC TGA ATG TGA AGC 3』；SEQ ID NO16)和11RDA40(5』TGA CGT GTC GAC CTA GTA CAA GTC CTT GTA GAT CTC CTGC3』；SEQ ID NO17)寡核苷酸作為引物；藉助ACP擴增包含hPPARg2互補DNA的3』區的DNA片段(標記為D)。在用Avrll和Sall預先消化的pBS-hPPARa質粒中，使採用Sacl和Sall消化的片段C和片段D一起進行克隆，得到pBS-hPPARg2質粒。
使用Kpnl和Sall消化Jx5AS-TK-pGL3質粒，以便分離在誘導啟動子控制下包含luc+基因的2324pb Kpnl-Sall片段。這個片段插入用Kpnl和Sall預先消化的pBS-hPPARg2質粒中，得到Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質粒。Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質粒示意圖如圖16所示。
7.2.SV-g2-J10-C-pGL3質粒用Notl和Sall消化pBS-hPPARg2質粒，以便分離在SV40早期啟動子控制下包含hPPARg2互補DNA的2622pb Notl-Sall片段(標記為E)。通過使用FTK-pGL3質粒作為基質並且利用18RDA31(5』AGT CGT CGA CGC TTC GAG CAG ACATGA TAA G 3』；SEQ ID NO18)和19RDA35(5』AGT CGC TAG CGA CGG ATC CTTATC GAT TTT ACC AC 3』；SEQ ID NO19)寡核苷酸作為引物，採用ACP擴增包含SV40病毒的多腺苷酸化位點的DNA片段(標記為F)。在用Notl和Nhel預先消化的Jx10AS-CMV-pGL3質粒中，使採用Sall和Nhel消化的片段E和片段F一起進行克隆，得到SV-g2-J10-C-pGL3質粒。SV-g2-J10-C-pGL3質粒示意圖如圖17所示。
7.3.hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質粒通過使用Jx5AS-TK-luc-hPPARg2質粒作為基質並且利用12RDA50(5』GTCAGC TAG CCT ACT CGA GCC ACC ATG GGT GAA ACT CTG GGA GAT TCT CC 3』；SEQID NO20)和13RDA42(5』TAC GGG GTA CCC AGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA TGAGTT TGG 3』；SEQ ID NO21)寡核苷酸作為引物，採用ACP擴增包含hPPARg2互補DNA的DNA片段(標記為G)。通過使用pCMVβ質粒作為基質並且利用14RDA33(5』GTC AGC TAG CCG GTA GGC GTG TAC GGT GGG AGG 3』；SEQ ID NO22)和15RDA33(5』TAC GCT CGA GCT TCT ATG GAG GTC AAA ACA GCG 3』；SEQID NO23)寡核苷酸作為引物，採用ACP擴增包含hCMV-IE最小啟動子(相對於轉錄啟動位點，從-54位到+48位)的DNA片段(標記為H)。在用Kpnl和Nhel預先消化的Jx5AS-TK-pGL3質粒中，採用Kpn和Xhol消化的片段G和採用Xhol和Nhel消化的片段H一起進行克隆，得到hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質粒。hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質粒示意圖如圖18所示。
7.4.hPPARg2-CMV-JxnAS-CMV-pGL3質粒用Nhel和Sphl消化Jx5AS-CMV-pGL3質粒，以便分離在誘導啟動子控制下包含luc+基因5』區的982pb Nhel-Sphl片段。這個片段插入用Spel和Sphl預先消化的hPPARg2-CMV-Jx5AS-TK-pGL3質粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒。hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒示意圖如圖19所示。
用Nhel和Sphl消化Jx5AS-CMV-pGL3質粒，以便分離在誘導啟動子控制下包含luc+基因5』區的982pb Nhel-Sphl片段。這個片段插入用Spel和Sphl預先消化的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx15AS-CMV-pGL3質粒。
用Nhel和Sphl消化Jx10AS-CMV-pGL3質粒，以便分離在誘導啟動子控制下包含luc+基因5』區的1151pb Nhel-Sphl片段。這個片段插入用Spel和Sphl預先消化的hPPARg2-CMV-Jx10AS-CMV-pGL3質粒中，得到hPPARg2-CMV-Jx20AS-CMV-pGL3質粒。
實施例8在活體外不同誘導系統版本的比較圖20匯集了在活體外用多種誘導系統版本得到的結果。這些結果表明，與僅具有一個質粒的系統(圖20，曲線2和5-9)一樣，使用兩個質粒的系統(圖20，曲線1、3和4)是功能性的也就是說PPARg(在此為BRL49653)配體的存在明顯增強了置於誘導啟動子控制下的基因表達。還應該指出，對於某些系統(圖20，曲線3和7-9)，配體誘導因子高於30，而對於圖20曲線4所示系統，誘導後的活性等於強啟動子的活性，如hCMV-IE啟動子活性。
實施例9不同的PPAR配體能夠激活誘導系統9.1.使用hPPARg2的系統圖21中的結果表明除BRL49653外的hPPARg配體，在此為RG12525(hPPARg的RPR配體)，可以用於激活誘導系統。在100微摩爾濃度下，用RG12525處理甚至得到與採用BRL49653得到的誘導作用相比更強的誘導作用。hPPARg的所有其它配體因此可以用作系統的誘導劑。
9.2.使用hPPARa的系統與使用hPPARg的系統一樣，使用hPPARa作為轉錄調節基因的系統可以用例如纖維酸鹽或WY-14643或hPPARa的任何其它配體激活。
實施例10在活體內在肌肉中可以激活誘導系統圖22匯集了使用不同版本的誘導系統在活體肌肉中所得到的結果。這些結果表明，對於三種試驗的版本(圖22，曲線2-4)，採用強飼法用hPPARg配體處理能夠在肌肉中明顯提高誘導啟動子的活性。誘導因子是，圖22曲線2版本為×14，圖22曲線3版本為×8，圖22曲線4版本為×24。此外，對於其中一個版本(圖22曲線2)，在被BRL49653處理的動物體內所達到的活性與諸如hCMV-IE啟動子之類強啟動子的活性處於同一數量級。
在圖23中列出的結果還表明，僅一次施用配體就可以誘導該系統，並且這種施用可在基因轉移前或後進行。這個試驗還表明比常用劑量小兩倍的劑量就能夠達到同樣的誘導因子。
使用PPAR核受體作為轉錄調節基因的系統，因此在活體內是功能性的，通過口服PPAR配體可以誘導該系統。
實施例11構建能夠誘導表達分泌產物的基因的質粒11.1.構建pRDA02質粒用HindIII和Mlul消化Jx10AS-CMV-pGL3質粒，以便分離459pbHindIII-Mlul片段。這種片段插入用HindIII和Mlul預先消化的pXL3010質粒中(Bettan M.及其同事，《Anal.Biochem.》，271(1999)187-189)，得到pRDA02質粒。這種質粒包含編碼人胎盤鹼性磷酸酶分泌形式(hSeAP)的基因的互補DNA，其磷酸酶表達通過利用PPAR作為轉錄調節基因的系統處在誘導的啟動子控制下。pRDA02質粒示意圖說明於圖24中。
實施例12誘導系統能夠在活體內調節分泌蛋白中的質粒濃度圖25中列出的結果表明，使用誘導系統時，可以隨時調節由肌肉分泌的蛋白中的質粒濃度，這一點可以通過僅口服一次PPAR配體來實現。在施用配體後兩天，增加hSeAP質粒濃度的17倍(圖25A)，一星期後恢復到其基礎水平。在第21天至第39天之間，觀察到對人源的hSeAP免疫反應，並表現為這種蛋白質粒濃度降低。儘管存在這種免疫反應，仍然可能進行第二個誘導周期(圖25A)。
正如圖25B所表明的，每天多次服用配體，在與處理時間相同的時間內，誘導系統也能夠使hSeAP質粒濃度保持高水平。
實施例13不同的PPAR配體可以激活在活體內的誘導系統，並以依賴劑量的方式激活誘導系統呈現用於治療II型糖尿病的銷售形式的BRL49653(AvandiaTM，SmithKlineBeecham)和用於這種同樣治療的呈銷售形式的pioglitazone(ActosTMTakedaPharmaceuticals)也可以激活誘導系統(圖26A)。圖26B還表明，誘導因子與使用的配體劑量直接相關。
使用PPAR核受體作為轉錄調節基因的系統因此能夠非常精確地控制分泌蛋白的質粒含量。此外，使用不同的PPAR配體時，可以達到這種調節。
實施例14構建能誘導表達其產物是血管生成因子的基因的質粒
14.1.構建Jx10AS-CMV-VEGFA165質粒由人胎盤總RNA通過反轉錄和PCR複製人VEGF165閱讀區(Clontech)(Houck等人，《Mol.Endocrinol.》12(1991)1806-1814)，然後插入包含-522位至+72位的CMV E/P啟動子和SV40的緩步類polyA的pBluescript質粒(Stratagene)，以便得到pXL3218質粒。這個質粒然後用HindIII和BsrGI消化，以便分離482pb HindIII-BsrGI片段A。pXL3218質粒還可用BsrGI和BamHI消化，以便分離390pb BsrGI-BamHI片段B。A和B片段插入預先用HindIII和BamHI消化的Jx10AS-CMV-pGL3質粒中，以便得到Jx10AS-CMV-VFGFA165質粒。這個質粒包含編碼VEGFA165的基因互補DNA，通過使用PPAR作為轉錄調節基因的系統，在誘導啟動子控制下表達VEGFA165。Jx10AS-CMV-VEGFA質粒示意圖如圖27所示。
這個質粒例如能用於以治療目的隨時控制VEGF的血管生成活性。
序列表110阿文蒂斯藥物股份有限公司120使用PPAR核受體及其配體的藥理學調節表達系統130序列14014116028170在2.1版本中專利210121119212ADN213智人4001tcaaccttta ccctggtag 19210221127212ADN213智人4002tcgccaagct tctcgtgatc tgcggca 27210321137212ADN213智人4003acgtgtcgac actagtggct agaggatctc taccagg 37210421148212ADN213智人4004cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagcga gatccttcaa cctttacc 48210521113212ADN213智人4005aggtcaaagg tca 13210621169212ADN213智人4006acgtgtcgac actagtcaaa actaggtcaa aggtcacgga aaactaggtc aaaggtcacg 60gaaaactag 69210721164212ADN213智人4007cgatggtacc ctcgagcaat gtgctagccg tgacctttga cctagttttc cgtgaccttt 60gacc64210821132212ADN213智人4008acgtagatct cggtaggcgt gtacggtggg ag 32210921129212ADN213智人4009acgtaagctt ctatggaggt caaaacagc 292101021121212ADN213智人40010ggtttgctga atgtgaagcc c 212101121142212ADN213智人40011agtctctaga gctacgcgta caagtccttg tagatctcct gc422101221132212ADN213智人40012agtcacgcgt gggcgatctt gacaggaaag ac 322101321121212ADN213智人40013gcctttgagt gagctgatac c 212101421135212ADN213智人40014agtcactagt aagctttttg ccgccagaac acagg352101521136212ADN213智人40015agtcactagt ccatggctgc ccagtgcctc acgacc 362101621121212ADN213智人40016caggtttgct gaatgtgaag c 212101721140212ADN213智人40017tgacgtgtcg acctagtaca agtccttgta gatctcctgc 402101821131212ADN213智人40018agtcgtcgac gcttcgagca gacatgataa g312101921135212ADN213智人40019agtcgctagc gacggatcct tatcgatttt accac352102021150212ADN213智人40020gtcagctagc ctactcgagc caccatgggt gaaactctgg gagattctcc502102121142212ADN213智人40021tacggggtac ccagacatga taagatacat tgatgagttt gg422102221133212ADN213智人40022gtcagctagc cggtaggcgt gtacggtggg agg 332102321133212ADN213智人40023tacgctcgag cttctatgga ggtcaaaaca gcg3321024211750212PRT213智人40024Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser1 5 10 15Phe Thr AsD Thr Leu Ser Ala Asn Ile Ser Gln Glu Met Thr Met Val20 25 30Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser Ser Val35 40 45Asp Leu Ser Val Met Glu Asp His Ser His Ser Phe Asp Ile Lys Pro50 55 60Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His Tyr Glu Asp65 70 75 80Ile Pro Phe Thr Arg Thr Asp Pro Val Val Ala Asp Tyr Lys Tyr Asp85 90 95Leu Lys Leu Gln Glu Tyr Gln Ser Ala Ile Lys Val Glu Pro Ala Ser100 105 110Pro Pro Tyr Tyr Ser Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Asn Lys Pro His Glu115 120 125Glu Pro Ser Asn Ser Leu Met Ala Ile Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp130 135 140Lys Ala Ser G1y Phe His Tyr G1y Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys145 150 155 160Gly Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Leu Lys Leu Ile Tyr Asp Arg Cys165 170 175Asp Leu Asn Cys Arg Ile His Lys Lys Ser Arg Asn Lys Cys Gln Tyr180 185 190Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser His Asn Ala Ile195 200 205Arg Phe Gly Arg Met Pro Gln Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu210 215 220Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg225 230 235 240Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu245 250 255Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys260 265 270Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp275 280 285Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu290 295 300Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala305 310 315 320Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn325 330 335Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu340 345 350Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu355 360 365Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu370 375 380Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val385 390 395 400Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile405 410 415Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys420 425 430Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln435 440 445Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu450 455 460Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu465 470 475 480Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu485 490 495Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp Ala Ile Leu Thr Gly
500 505 510Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu515 520 525Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln530 535 540Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe545 550 555 560Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile565 570 575Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys580 585 590Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn595 600 605Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu610 615 620Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys625 630 635 640Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp645 650 655Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly660 665 670Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln675 680 685Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu690 695 700Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr705 710 715 720Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met725 730 735Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr740 74575021025211467212PRT213智人40025Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln1 5 10 15Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe20 25 30Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile35 40 45Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys50 55 60Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn65 70 75 80Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu85 90 95Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys100 105 110Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp115 120 125Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly130 135 140Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln145 150 155 160Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu165 170 175Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr180 185 190Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met195 200 205Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp210 215 220Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr225 230 235 240Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His245 250255Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe260 265 270Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu275 280 285Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln
290 295 300Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu305 310 315 320Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly325 330 335Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp340 345 350Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu355 360 365Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser370 375 380Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln385 390 395 400Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro405 410 415Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu420 425 430Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys435 440 445Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys450 455 460Asp Leu Tyr4652102621130212ADN213智人40026cccgttacat aacttacggt aaatggcccg 302102721130212ADN213智人40027gggacgcgct tctacaaggc gctggccgaa 302102821130212ADN213智人40028cgactctaga agatcttgcc ccgcccagcg 30
權利要求
1.組合物，其中包含(a)第一個成分，它包含處在誘導啟動子控制下的目的核酸，該誘導啟動子包含對PPAR反應的成分和最小轉錄啟動子，(b)第二個成分，它包含在誘導啟動子控制下編碼PPAR的核酸，以便它們同時地、分別地或以一定時間間隔使用。
2.根據權利要求1的組合物，其特徵在於它還包含(c)PPAR配體以便同時地、分別地或以一定時間間隔使用。
3.根據權利要求1或2的組合物，其特徵在於不同的遺傳構建體帶有所述成分(a)和(b)。
4.根據權利要求1或2的組合物，其特徵在於所述成分(a)和(b)集合在同一的遺傳構建體中。
5.根據權利要求3或4的組合物，其特徵在於所述遺傳構建體是質粒或病毒載體。
6.根據權利要求1-5中任一項的組合物，其特徵在於對PPAR反應的成分包含一個或多個PPAR鏈的位點。
7.根據權利要求6的組合物，其特徵在於所述對PPAR反應的成分包含SEQID NO1序列或這個序列的功能性變體的一個或多個位點。
8.根據權利要求6的組合物，其特徵在於所述對PPAR反應的成分包含SEQID NO5序列或這個序列的功能性變體的一個或多個位點。
9.權利要求6-8中任一項的組合物，其特徵在於所述反應成分包含多達30個鏈位點，優選地3-20個鏈位點，更優選地5-15個鏈位點。
10.權利要求1-9中任一項的組合物，其特徵在於所述最小啟動子是缺失一個或多個具有轉錄活性的非必需區的細胞基因或病毒基因啟動子。
11.權利要求1-10中任一項的組合物，其特徵在於所述誘導啟動子還包含擴增區。
12.權利要求1-11中任一項的組合物，其特徵在於所述最小啟動子和對PPAR反應成分的方向相同。
13.權利要求1-11中任一項的組合物，其特徵在於最小啟動子和對PPAR反應成分的方向相反。
14.權利要求1-13中任一項的組合物，其特徵在於編碼PPAR的核酸可編碼PPARα或PPARγ。
15.權利要求1-14中任一項的組合物，其特徵在於編碼PPAR的核酸可編碼包含多個配體鏈位點的修飾PPAR。
16.權利要求1-15中任一項的組合物，其特徵在於它還包含成分(d)，該成分包含在轉錄啟動子控制下編碼RXR的核酸。
17.包含權利要求所述的成分(a)和成分(b)的載體。
18.根據權利要求17的載體，其特徵在於所述成分(a)和成分(b)的方向相反。
19.根據權利要求17或18的載體，其特徵在於所述成分(a)的誘導啟動子和成分(b)的轉錄啟動子集合在載體中，以便生成可調節雙向啟動子。
20.根據權利要求19的載體，其特徵在於在5』-3』方向，它包含編碼PPAR的第一個核酸，控制所述第一個核酸表達的第一個最小轉錄啟動子，一種或多種對PPAR反應成分，第二個最小轉錄啟動子，以及在所述第二個最小轉錄啟動子控制下編碼目的產品的第二個核酸。
21.根據權利要求17-20中任一項的載體，其特徵在於它還包含 16的成分(d)。
22.權利要求1-16中任一項的組合物或權利要求17-21中任一項的載體在活體外或試管內的細胞中表達目的核酸的應用。
23.權利要求1-16中任一項的組合物或權利要求17-21中任一項的載體在製備用於活體內的細胞中表達目的核酸的產品中的應用。
24.在活體外或或試管內的細胞中調節表達核酸的方法，該方法包括所述細胞與權利要求1-16中任一項的組合物或權利要求17-21中任一項的載體進行接觸。
25.根據權利要求24的方法，其特徵在於該方法涉及哺乳動物細胞，優選地人細胞。
26.根據權利要求25的方法，其特徵在於該方法涉及肌肉細胞。
27.通過與權利要求1-16中任一項的組合物或權利要求17-21中任一項的載體接觸修飾的細胞。
28.修飾的PPAR，它包含多個配體鏈位點。
29.編碼權利要求28的PPAR的核酸。
30.PPAR配體的鑑定方法，該方法包括使權利要求27的細胞與試驗分子接觸，再證明目的核酸的表達。
全文摘要
本發明涉及用於藥理學調節轉基因表達的新方法與組合物。本發明特別涉及組合物,它包含:(a)第一個成分,它包含在誘導啟動子控制下的目的核酸,該誘導啟動子包含對PPAR反應的成分和最小轉錄啟動子,(b)第二個成分,它包含在誘導啟動子控制下編碼PPAR的核酸,以便它們同時地、分別地或以一定時間間隔地使用。本發明涉及這些組合物和方法在實驗、臨床、治療或診斷方面的應用。
文檔編號C12N5/10GK1370240SQ00811928
公開日2002年9月18日 申請日期2000年6月22日 優先權日1999年6月22日
發明者R·達特爾, J·克魯澤塔, B·斯塔爾斯, A·馬赫方蒂 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司