具有內切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的製作方法

2023-09-18 20:29:10 2

專利名稱：：具有內切葡聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苦酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於在洗滌劑、紙和紙漿、石油鑽井(oildrilling)、煉油(oilextraction)、酒和果汁(wineandjuice)、食品成^分(foodingredients)、動物飼#+或紡織品工業中產生和使用所述多肽的方法。
背景技術：
：纖維素是通過(3-l,4-糖苷鍵連接的葡萄糖的聚合物。纖維素鏈形成許多分子內和分子間氫鍵，導致不溶性纖維素微原纖維的形成。纖維素微生物水解成葡萄糖涉及以下三類主要的纖維素酶(i)內切葡聚糖酶(EC3.2丄4),其在整個纖維素分子中隨機切割卩-l，4-糖苷鍵，也稱為內切-(3-l,4-葡聚糖酶；(ii)纖維二糖水解酶(EC3.2丄91)，其從非還原端消化纖維素，釋放纖維二糖；和(iii)P-葡糖苷酶(EC3.2丄21),其水解纖維二糖和低分子量纖維糊精以釋放葡萄糖。卩-l,4-糖苷鍵也存在於其它天然存在的聚合物中，例如在源自植物例如大麥和燕麥的(3-葡聚糖中。在某些情況下，內切葡聚糖酶還提供對這些非纖維素聚合物的水解。纖維素酶由許多微生物產生，並且通常以多種形式存在。對酶降解纖維素的經濟意義的認識已經推動了對能夠在工業上使用的微生物纖維素酶的廣泛搜尋。結果，已經多種纖維素酶的酶性質和一級結構已經得到了研究。基於催化結構域胺基酸序列的疏水簇分析結果，這些纖維素酶被分成不同的糖基水解酶家族；已將真菌和細菌糖基水解酶分組為35個家族(Henrissat，B.:Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.280(1991),309-316。Henrissat,B.,andBairoch，A.:Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293(1993),781-788。)。大多數纖維素酶由被接頭分開的糖結合模塊(CBM)和催化結構域(CAD)組成，所述接頭可富含脯氨酸和羥基胺基酸殘基。已經基於纖維素酶的CBM的相似性建立了另一種纖維素酶分類法(Gilkesetal.(1991))，該分類生成五個糖基水解酶家族(I-V)。纖維素酶由許多微生物合成，所述微生物包括真菌、放線菌、粘細菌和真細菌，但也由植物合成。特別是已經鑑定了具有很多種特異性的內切-(3-1,4-葡聚糖酶。已經描述了許多細菌內切葡聚糖酶(Gilbert,H丄andHazlewood，G.P.(1993)丄Gen.Microbiol.139:187-194。Henrissat,B.，andBairoch,A.:Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293(1993),781-788。)。纖維素分解酶的一個重要工業用途是用於紙漿的處理，例如用於改進再循環紙的濾水(drainage)或用於再循環紙的脫墨。纖維素分解酶的另一個重要的工業用途是用於纖維素紡織品或織物的處理，例如作為洗滌劑組合物或織物柔軟劑組合物中的成分，用於新織物的生物拋光(衣物整理(garmentfinishing)),和用於獲得含纖維素的織物特別是斜紋粗棉布(denim)的"石洗(stone-washed)"夕卜觀，並且已經提出用於這種處理的幾種方法，例如在GB-A-1368599、EP-A-0307564和EP陽A-0435876、WO91/17243、WO91/10732、WO91/17244、WO95/24471和WO95/26398中。日本專利申請no.13049/1999公開適合用於洗滌劑的源自芽孢桿菌屬菌種KSM-S237(作為FERM-P-16067保藏)的耐熱》鹹性纖維素酶。提供可用於期望纖維素酶，優選內切-P-l,4-葡聚糖酶活性(內切葡聚糖酶，EC3.2.1.4)的應用中的新纖維素酶或酶製劑，一直是人們的需求。本發明的目的是提供多肽和多肽組合物，其在弱酸性至鹼性條件下具有實質的(substantial)|3-1，4-葡聚糖酶活性，並且在紙漿加工、紡織品處理、洗衣方法、提取方法或動物飼料中具有改進的性能；優選的是，這種性能優良的新內切葡聚糖酶可以使用重組技術高產率生產，或者是使用重組技術以高產率生產的。發明概述本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2的胺基酸1至759具有至少72%同一性的氛基酸序列；(b)多肽，其由在至少低嚴緊條件下與以下雜交的核苷酸序列編碼(i)SEQIDNO:1的核苦酸100至2376,或(ii)(i)的互補鏈；和(c)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:2的胺基酸1至759。本發明還涉及編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽的分離的多核苷酸，其選自下組(a)編碼多肽的多核苦酸，所述多肽具有與SEQIDNO:2的胺基酸1至759具有至少72%同一性的胺基酸序列；(b)多核苷酸，其在至少低嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核普酸100至2376，或(ii)(i)的互補鏈。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細月包。本發明還涉及用於產生這種具有內切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益於所述多肽產生的條件下培養包含核酸構建體的重組宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼該多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發明的內切-P-l,4-葡聚糖酶具有穩定性和活性性質，這使其非常適合用於與含有表面活性劑和/或氧化活性類物質(例如化學漂白劑)的鹼性水溶液相關的應用。這些應用條件非常普遍地存在於家用和工業洗滌劑、紡織品整理處理和纖維素紙漿的製造或再循環中。因為本發明的內切葡聚糖酶在這些相關應用條件下維持其活性的程度是優異的，所以預期所述內切葡聚糖酶將比其它已知的酶更有用，例如，當用於洗滌劑中、用於紙/紙漿加工或用於紡織品處理時。因此本發明也涉及在洗滌劑或紡織品處理組合物、用於紙漿處理或用於生物質降解例如用於產生乙醇的組合物中使用本發明的多肽的方法。此外，本發明涉及用包含所述多肽的洗滌劑來洗滌紡織品、廚房用具或硬表面的方法，用於處理纖維素紡織品或織物的方法，例如軟化、生物拋光或石洗。還包括用於改進再循環紙的濾inking)的方法。本發明進一步涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因與編碼信號肽的第一核苷S吏序列中的一個或兩個可操作地連接，所述第一核香酸序列由SEQIDNO:1的核苷酸1至99組成。附圖筒述圖1,本發明的多肽的胺基酸序列(ACE160，SEQIDNO:2)與現有技術的相關多肽的比對。現有技術多肽公開為名稱登錄號專利號KSM-64ADP87708,GeneseqPJP2004173598KSM-365AAR77395,GeneseqPJP07203960-1994KSM-634AAR07478,GeneseqPJP01281090KSM-S237ADP87707,GeneseqPJP2004173598MB1181ABG76403，Genes叫PWO200299091KSM-635P19424，Uniprot—圖2，顯示本發明的內切葡聚糖酶(ACE160，SEQIDNO:2)與現有技術多肽序列之間關係的系統樹，其通過在DNAStarTM程序包中程序MegAlign版本5.05的ClustalV功能中用默認i殳置比對來構建。定義內切葡聚糖酶活性術語"內切葡聚糖酶活性，，在本文中定義為催化纖維素、地衣澱粉(lichenin)和穀物P-D-葡聚糖中的1,4-(3-D-糖苷鍵內切水解(endohydrolysis)的水解活性，EC3.2.1.4。用於測定內切葡聚糖酶活性的方法在下文中描述。本發明的多肽具有由SEQIDNO:2的氨基S復1至759所示胺基酸序列組成的多肽或由SEQIDNO:2的胺基酸65至347組成的催化核心結構域的內切葡聚糖酶活性的至少70%,更優選至少80%，甚至更優選至少90%，甚至更優選至少95%，最優選至少98%，並且甚至最優選至少100%。分離的多肽術語"分離的多肽"用於本文中指通過SDS-PAGE測定為至少20%純，優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，最優選至少90%純，甚至最優選至少95%純的多肽。基本上純的多肽(substantiallypurepolypeptide):術語"基本上純的多肽"在本文表示多肽製備物，所述多肽製備物按重量計含有至多10%,優選至多8%，更優選至多6%,更優選至多5%，更優選至多4%，至多3%，甚至更優選至多2%,最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然伴隨的(associated)的其它多肽材料。即，因此，優選所述基本上純的多肽是按存在於製備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，更優選至少98%純，甚至更優選至少99%純，最優選至少99.5%純，並且甚至最優選100%純。本發明的多肽優選是基本上純的形式。具體而言，優選所述多肽是"實質上(essentially)純的形式"，即，所述多肽製備物實質上(essentially)不含與其天然伴隨的其它多肽材料。這可以通過，例如，用公知的重組方法或由經典純化方法製備多肽來實現。在本文中，術語"基本上純的多肽，，與術語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。同一性參數"同一性"描述兩個胺基酸序列之間的相關性(relatedness)。就本發明而言，通過使用來自EMBOSS軟體包Oi加:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序來測定兩個胺基酸序列之間的比對。Needle程序執行在Needleman,S.B.andWunsch,CD,(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的總體比對算法。使用的取代矩陣是BLOSUM62，缺口開啟罰分(gap叩eningpenalty)是10，在夬口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發明的氨基S交序列("發明序列"；例如SEQIDNO:2的胺基酸1至759或SEQIDNO:2的胺基酸65至347的催化核心結構域)和另一不同胺基酸序列("外源序列")之間的同一性程度如下計算用兩個序列比對中完全匹配的數目除以"發明序列"的長度或"外源序列"的長度中最短的一個。結果以百分比同一性表示。當"發明序列"和"外源序列"在重疊的相同位置中具有同一胺基酸殘基(在下述比對實例中用T表示)，發生完全匹配。序列的長度是序列中胺基酸殘基的數目(例如SEQIDNO:2的"發明序歹'J"的長度是759個胺基酸)。在以下比對實例中，重疊是序列1的胺基酸序歹'J"HTWGER.NLG";或序列2的胺基酸序列"HGWGEDANLA"。缺口用"."表示。比對實例序歹ll1:ACMSHTWGER.NLGIIIIII:序歹'J2:HGWGEDANLAMNPS"發明序列"的重疊的長度可以是"發明序列"的長度的至少20%，更優選"發明序列"的長度的至少30%、40%、50%、60。/o、70%、80%或至少90%。"外源序列，，的重疊的長度可以是"外源序列，，的長度的至少20%，更優選"發明序列"的長度的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%。多肽片段術語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個胺基酸的多肽；其中所述片段具有內切葡聚糖酶活性。優選地，片段含有至少283個胺基酸殘基，例如，SEQIDNO:2的胺基酸65至347。亞序列(subsequence):術語"亞序列，，在本文中定義為從SEQIDNO:l或其同源序列的5'和/或3'端缺失一個或多個核苦酸的核苦酸序列；其中所述亞序列編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽片段。優選地，亞序列含有至少849個核苷酸，例如，SEQIDNO:l的核酸193至1041。等位變體(allelicvariant):術語"等位變體，，在本文中表示佔據同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式中的任一種。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。基本上純的多核苷酸術語"基本上純的多核芬酸"用於本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸製備物，並且所述多核芬酸製備物處於適合於在基因工程化蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%,更優選至多4%,更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然伴隨的其它多核香酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3，非翻譯區，例如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苦酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99。/。，並且甚至最優選至少99.5%純的。本發明所述多核苷酸優選是基本上純的形式。具體而言，優選的是，本文公開的多核苷酸是"實質上(essentially)純的形式，，，即，所述多核苷酸製備物實質上不含與其天然伴隨的其它多核苷酸材料。在本文中，術語"基本上純的多核苷酸"與術語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。核酸構建體術語"核酸構建體"用於本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當所述核酸構建體含有本發明的編碼序列表達所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語"表達盒"同義。調控序列(controlsequence):術語"調控序列"在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。每種調控序列對於編碼所述多肽的核苷酸序列而言可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以具有用於引入特異性限制位點的接頭，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核芬S吏序列編碼區的連"t妄。可操作地連接術語"可操作地連接"在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。編碼序列當用於本文時術語"編碼序列，，的意思是直接指定其蛋白產物的胺基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核芬酸序列。表達術語"表達"包括多肽的產生所涉及的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體術語"表達載體，，在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核普酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語"宿主細胞"包括任何對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體的轉化、轉染、轉導等易感的(susceptible)細胞類發明詳述具有內切葡聚糖酶活性的多肽在第一個方面，本發明涉及具有下述胺基酸序列的分離的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的胺基酸1至759即成熟多肽具有至少72%，優選至少75%，更優選至少80%,更優選至少85%，甚至更優選至少90%,最優選至少95%,並且甚至最優選至少97%的同一性程度，所述多肽具有內切葡聚糖酶活性(下文中稱"同源多肽")。在優選的方面，所述同源多肽具有與SEQIDNO:2的胺基酸1至759相差十個胺基酸，優選相差五個胺基酸，更優選相差四個胺基酸，甚至更優選相差三個胺基酸，最優選相差兩個胺基酸，並且甚至最優選相差一個胺基酸的胺基酸序列。本發明的多肽優選包含SEQIDNO:2的氨基S吏序列或其等位變體；或其具有內切葡聚糖酶活性的片段。在優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其等位變體組成；或由其具有內切葡聚糖酶活性的片段組成。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列組成。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸65至347中的催化核心結構域，或其等位變體；或其具有內切葡聚糖酶活性的片段。催化核心結構域的多肽具有與SEQIDNO:2的胺基酸65至347具有至少86%,更優選至少88%,甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少97%的同一性程度的胺基酸序列。在另外的優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸65至347中的催化核心結構域，或其變體；或其具有內切葡聚糖酶活性的片段。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸65至347組成。對催化核心結構域的註解基於與糖基水解酶家族5的纖維素酶的同源性(HenrissatB.Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.280309-316(1991》HenrissatB.，BairochA.Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293781-788(1993);HenrissatB.,BairochA.Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.Biochem.J.316695-696(1996》DaviesG"HenrissatB.Structuresandmechanismsofglycosylhydrolases.Structure3853-859(1995);HenrissatB"ClaeyssensM.,TommeP.,LemesleL.,MornonJ.-P.Cellulasefamiliesrevealedbyhydrophobicclusteranalysis.Gene8183-95(1989);PyB.，Bortoli-GermanI.，HaiechJ"ChippauxM.,BarrasRCellulaseEGZof五rvWw/ac/zrysawf/ze附/:structuralorganizationandimportanceofHis98andGlul33residuesforcatalysis.ProteinEng.4325-333(1991))。催化核心結構域的結構域註解可以通過http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/、http:〃www.ebi.ac.uk/interpro/、在本發明的另一個方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸368至569中的糖結合模塊。在另一優選的方面，本發明涉及包含糖結合模塊的多肽，所述糖結合模塊與SEQIDNO:2的胺基酸368至569具有至少67%,更優選至少70%,更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少卯％，最優選至少95%，並且甚至最優選至少97%的同一性程度。在另一優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸368至569中的糖結合才莫塊，或其等位變體；或具有糖結合活性的它們的片段。在另外的優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸368至569組成。糖結合模塊屬於家族17/28。CBM的註解基於與已知序列特別是KSM-635的CBM(Ozaki，K.Shikata,S.Kawai,S.Ito,S.Okamoto,K.;"MolecularcloningandnucleotidesequenceofageneforalkalinecellulosefromBacillussp.KSM陽635.";J.Gen.Microbiol.136:1327-1334(1990),UniprotNo.P19424)的同源性，所述KSM-635的CBM的註解為基於與半乳糖結合樣結構域的相關性的CBM，所述半乳糖結合樣結構域在ItoN.,PhillipsS.E.，StevensC.,OgelZ.B.，McPhersonM丄，KeenJ.N.,YadavK.D.，KnowlesP.F.Novelthioetherbondrevealedbya1.7Acrystalstructureofgalactoseoxidase.Nature35087-90(1991);Macedo-ribeiroS.,BodeW.,HuberR.，Quinn畫AllenM.A.，KimS.W"OrtelT丄.，BourenkovG.R,BartunikH.D.,StubbsM.T"KaneW.H.，Fuentes-priorP.Crystalstructuresofthemembrane-bindingC2domainofhumancoagulationfactorV.Nature402434-439(1999);HimanenJ.P.，RajashankarK.R.，LackmannM.，CowanC.A.,HenkemeyerM.,NikolovD.B.CrystalstructureofanEphreceptor-ephrincomplex.Nature414933-938(2001)[PUBMED:11780069][PUB00010665];和MarintchevA.,MullenM.A.，MaciejewskiM.W.,PanB.，GrykM.R.,MullenG.P.Solutionstructureofthesingle-strandbreakrepairproteinXRCClN-terminaldomain.Nat.Struct.Biol.6884-893(1999)中描述。糖結合模塊的結構域註解可通過http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/、http:〃www.ebi.ac.uk/interpro/、http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/或http:〃www.expasy.org/prosite/獲得。在第二個方面，本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苦酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優選低嚴緊條件下，更優選中嚴緊條件下，更優選中-高嚴緊條件下，甚至更優選高嚴緊條件下，並且最優選非常高嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸100至2376，(ii)(i)的亞序列或(iii)(i)或(ii)的互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,M/ecw/arC7om."g,」丄a6orator少Ma履a/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:l的亞序列含有至少100個連續的核苷酸或優選至少200個連續的核苷酸，更優選300、400、500、600、700、800、900個連續的核苷酸或甚至更優選至少1000個連續的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽片段。可以利用SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的胺基酸序列或其片段來設計核酸探針，根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌抹鑑定和克隆編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具體而言，可根據標準的Southern印跡方法，將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑑定和分離其中相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少14，優選至少25,更優選至少35，並且最優選至少.70個核芬酸。然而，優選所述核酸探針的長度是至少100個核苦酸。例如，所述核酸探針的長度可以是至少200個核苷酸，優選至少300個核苦酸，更優選至少400個核苷酸，或最優選至少500個核苷酸。可以使用更長的探針，例如，長度是至少600個核苷酸，至少700個核苷酸，更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。本發明包含這些探針。因此，可以在由這些其它生物製備的基因組DNA文庫中篩選與上述探針雜交並且編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳或其它分離技術來分離來自這些其它生物的基因組DNA或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝酸纖維素NO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthem印跡中。就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應於SEQIDNO:l所示的核苷酸序列、它的互補鏈或其亞序列。可使用例如X射線膠片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸^l罙針雜交的分子。在優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸193至1041。在另一優選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:l。在另一優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42。C，在5XSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml已剪切並且變性的鮭精DNA，和對於非常低和低嚴緊性為25%的曱醯胺，對於中和中-高嚴緊性為35%的甲醯胺，或對於高和非常高嚴緊性為50%的曱醯胺中，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2。/。SDS優選至少在M。C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50。CC(氐嚴緊性)，更優選至少在M。C(中嚴緊性)，更優選至少在60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在"。C(高嚴緊性)，並且最優選至少在70。C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。優選地，使用0.2XSSC、0.2。/。SDS優選至少在45。C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50°C(低嚴緊性)，更優選至少在55°C(中嚴緊性)，更優選至少在60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在6S。C(高嚴緊性)，並且最優選至少在70。C(非常高嚴緊性)進行所述洗滌。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比才艮據Bolton和McCarthy計算法(1962,PraceeWwgsAeiVfl^wa/Jcadewy。/5We"cM48:1390)計算的Tm低大約5。C至大約10。C的溫度，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、1xDenhardt5容'液、1mM焦石舞酉臾4內(sodiumpyrophosphate)、1mM石舞酉臾三氛4內(sodiummonobasicphosphate)、0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，才艮據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交後洗滌。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSCC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，並使用6XSSC在比計算的TJ氐5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽，所述多肽由包含SEQIDNO:1的核苷酸193或1041作為獨特(unique)基序的多核芬酸編碼。在第四個方面，本發明涉及具有以下理化特性的分離的多肽pl為4.4,最適pH為9，最適溫度為40°C,且在pH5-10.5具有穩定性。本發明的(3-1,4-葡聚糖酶不被Fe(II)離子顯著失活。所述多肽的酶活性對亞鐵離子的存在的敏感性可能限制多肽的可應用性，例如在金屬容器或設備中進行的方法。在第五個方面，本發明涉及人工變體，所述人工變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:2或其成熟多肽。優選胺基酸改變在性質上是較不重要的(ofaminornature),即保守的胺基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性；通常為1至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸，例如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合^或(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變具體活性(specificactivity)的氨基S吏取代是本領域已知的，並且由侈'B口H.NeurathandR.L.Hill，1979,/"，77ze戶rafe/"s，AcademicPress,NewYork描述。最普遍存在的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了上述20種基本胺基酸，可以用非基本胺基酸(例如4-羥脯氨酸、6-7V-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)取代野生型多肽的胺基酸殘基。可以用有限數量的非保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸和非天然胺基酸來取代胺基酸殘基。"非天然胺基酸，，在蛋白質合成後已經過修15飾，並且/或者在它們的側鏈具有不同於基本胺基酸的化學結構。非天然胺基酸能夠以化學方法合成，並且優選是商業上能夠獲得的，包括2-哌啶酸(pipecolicacid)、p塞口坐》克酉臾(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氛月甫氛酉交、3-矛口4-曱基脯氨酸，和3，3-二曱基脯氨酸。可供選擇的是，胺基酸改變具有這樣的性質，使得多肽的物理化學性質發生改變。例如，胺基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變法(CunninghamandWells,1989，>SWe"ce244:1081-1085)來鑑定親本多肽中的必需胺基酸。在後一技術中，向分子中的每個殘基引入單一丙氨酸突變，並且測試所得突變分子的生物活性(即，內切葡聚糖酶活性)以鑑定對於所述分子的活性而言關鍵的胺基酸殘基。同樣參見HiltoneZa/.，1996，/C/zem.271:來測定，如通過以下這些技術如核石茲共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，結合對推定接觸位點胺基酸的突變來加以測定。參見例如deVos"a/.，1992,&/e"ce255:306-312;Smith"a/.,1992,乂Mo/.224:899-904;Wlodaver"a/.,1992,/^^S309:59-64。也可以從分析同與本發明多肽相關的多肽的同一性來推斷必需胺基酸的身份。可以使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然後進行有關的篩選方;去，侈寸^t口刃卩些由Reidhaar-OlsonandSauer,1988，5We"ce241:53-57;BowieandSauer，1989，戶rac.TVa".86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來實現和測試單個或多個胺基酸取代。能夠使用的其它方法包括易4晉PCR、噬菌體展示(例如，Lowman"a/.,1991,所oc/zew.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)和區域定向誘變(Derbyshire^/,,1986,46:145;Ner"a/.，1988,D細7:127)。具有內切葡聚糖酶活性的多肽的來源本發明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發明而言，用於本文與給定的來源有關的術語"獲得自"的意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌林產生。在優選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發明的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬C6a"7/w力多肽，例如嗜鹼芽孢桿菌C6ac/〃^a汰a/op/n7w)、解澱鬥分芽孑包桿菌(5ac〃/i^附少/0//《1^/^/￡似)、短芽孑包牙幹菌(5ac/〃i"Zrev&)、環^!犬芽孑包4幹菌(5ac/〃wsc/rcw/ara)、；疑結芽孑包才幹菌coagw/a""、火山步蘭芽孑包桿菌C5(3"'〃W5/aw/w力、遲緩芽孑包桿菌(5ac〃/ws/e"^s)、地衣芽孑包桿菌(^3c/〃z^//c/zem》r/w'力、巨大芽孑包4幹菌(^fi!c/〃i^附egafer/wm)、口耆熱月旨肪芽孑包才幹菌(Bac/〃wsWearc^ermo////^)、枯草芽孑包桿菌(萬ac/〃wssw6W//。或蘇雲金芽孑包桿菌(5flc/〃w"/wn'"g/era/力多肽；或鏈黴菌屬(5^e;to7^c&s)多肽，例如，淺青紫鏈黴菌((S^e/to7"ces1//v/^my)或鼠灰鏈零菌(iSyr，圃ycesw,Vw力多狀；或革蘭氏陰性細菌多肽，例如，大腸桿菌或々支單胞菌屬菌種CP"MW.)多肽。在另一優選的方面，多肽是芽孢桿菌屬菌種ACE160多肽，例如SEQIDNO:2的多肽。可理解的是對於前述的種，本發明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph)，而與它們已知的種名無關。本領域技術人員將輕易地識別適合的等同物的身份。對於公眾而言，這些種的菌抹可以容易地獲自許多培養物保藏機構，諸如美國典型培養物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口糹田胞培養物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑑定和獲得這些多肽。用於從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。隨後可通過相似地篩選其它微生物的基因組文庫或cDNA文庫來獲得所述多核苦酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就可以使用本領域普通技術人員熟知的技術分離或克隆所述多核苷酸(參見,例如，Sambrook^a/.,1989，見上文)。本發明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另外的多肽被融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苦酸序列(或其部分)融合於本發明的核苷S臾序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們共閱讀框，並且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。多核苷酸本發明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸具有編碼本發明的多肽的核苷酸序列。在優選的方面，核苷酸序列是SEQIDNO:l中所示。在另一優選的方面，核苦酸序列是SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區。本發明還包含編碼具有SEQIDNO:2的胺基酸序列的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，且由於遺傳密碼的簡併性所述核苷S吏序列不同於SEQIDNO:l。本發明還涉及SEQIDNO:l的亞序列，其編碼具有內切葡聚糖酶活性的SEQIDNO:2的片段，例如SEQIDNO:2的胺基酸65至347的催化核心結構域或SEQIDNO:2的胺基酸368至569的片段。本發明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的胺基酸1至759組成的多肽。用於分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例^口,Innisa/,，1990,屍C7:爿Gw/c/etoMef/zo(iy^wt/AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基於核苷酸序歹1]的擴增(NASBA)。可以從芽孢桿菌屬的菌抹，或從其它或相關的生物克隆所述多核苷酸，因此所述多核苷酸可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區的等位基因變體或種間變體(speciesvariant)。本發明還涉及具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列(即，核苷酸100至2376)具有至少60%,優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，更優選至少90%，甚至更優選至少95%，並且最優選至少97%同一性的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發明的多肽的核苷酸序列對於合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以某些工程改造的方式不同於從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩定性、最適pH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:l的多肽編碼區提供的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上構建變體序列，和/或通過引入如下的核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苷酸序列編碼的多肽的其它胺基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物的密碼子用法；或者所述取代可產生不同的胺基酸序列。關於核苷酸取代的才既述，參見，例如，Forda/.,1991,戶raZez'wEx/mw/o"awJ戶w〃yca"o"2:95-107。本領域技術人員顯而易見的是，這些取代可以在對於分子功能至關重要的區域之外進行，並且仍然產生活性多肽。對於由本發明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的並且因此優選不加以取代的胺基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸掃描誘變法(參見，例如，CunninghamandWells，1989,Sc/e"ce244:1081-1085)來鑑定。在後一技術中，在分子中的每個正電殘基處引入突變，測試所得突變分子的內切葡聚糖酶活性，以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也可以通過分析三維結構來確定，所述三維結構通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos"a/"1992,6We廳255:306-312;Smitha/.,1992，/。畫a/o/Mo/簡/ar腸/ogy224:899-904;WlodaverWa/"1992，F^^S丄e論rs309:59-64)。本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優選低嚴緊條件，更優選中嚴緊條件，更優選中-高嚴緊條件，甚至更優選高嚴緊條件，並且最優選非常高的嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸100至2376,(ii)SEQIDNO:l的核苷酸193至1041，(iii)SEQIDNO:l的核苷酸1104至1707或(iv)(i)至(iii)的互補鏈;或它們的如本文所定義的等位變體和亞序列(Sambrook"a/.,1989,見上文)。本發明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸100至2376，或(ii)(i)的互補《連；和(b)分離發生雜交的多核苷酸，其編碼具有內切葡聚糖酶活性的多肽。核酸構建體本發明還涉及包含本發明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苦酸與一個或多個調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。可以用許多方式操作編碼本發明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴於表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用於表達編碼本發明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核香酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用於指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍色鏈黴菌OS^eptom少cescoe/Zco/or)瓊脂糖酶基因0fa^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因0acB)、地衣芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amy丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽澱粉酶基因O,，7k0、解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amyi0、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(pe"P)、枯草芽孢桿菌xyM和x_y/B基因和原核(3-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff&a/"1978,/Vocee(i/"gsiV加'ow"/」c"d簡yo/6We"cej"&475:3727-3731)，以及toc啟動子(DeBoer"a/.，1983，Pracee^"^o/AeiVfl/c"a/」cacfew_yo/Sc/e"c&st/S^80:21-25)。另夕卜的啟動子在"Usefolproteinsfromrecombinantbacteria"in5We"孝cyl膨Wcaw,1980,242:74-94中；和在Sambrookda/.，1989,見上文中有所描述。用於指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米麴黴G^;wgz7/M07zae)TAKA澱粉酶、曼赫根毛黴CR/zizowMcorm/e/2e/)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴(^^erg"/^w'ger)中性a-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性a-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(g/"j)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴(A^wg/〃wm'血/a"》乙醯胺酶、鑲片鐮孢CFwan'Mwve"e"a&m)澱粉葡糖芬酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(WO00/56900)、尖鐮孢(FMsan'Mmox，poram)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、裡氏木黴(7Wc/z^fem^wese/)|3-葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶n、裡氏木黴內切葡聚糖酶m、裡氏木黴內切葡聚糖酶iv、裡氏木黴內切葡聚糖酶v、裡氏木黴木聚糖酶i、裡氏木黴木聚糖酶n、裡氏木黴p-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性ot-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下蛋白的基因獲得釀酒酵母(&cc/zaramyc^cewWWae)烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADHl，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對於酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos^/.，1992,1fea^8:423-488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，即由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接。任何在所選宿主細胞中有功能的終止子均可以在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯曱酸合酶、黑麴黴ot-葡糖苦酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對於酵母宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油酪-3-磷酸脫氫酶。對於酵母宿主細l包其它有用的終止子由Romanos&a/.,1992，見上文描述。調控序列還可以是合適的前導序列，即對於宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端。在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列均可以在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶。對於酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺香酸化序列，即與核芬酸序列的3，末端可操作地連接的序列，並且在轉錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA的信號。在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可以在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴a-葡糖苷酶。對於酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列記載於GuoandSherman,1995,Mo/ecw/arCe〃w/ar15:5983-5990。調控序列還可以是信號肽編碼區，其編碼與多肽的氨基末端相聯，並且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑的胺基酸序列。核苷酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號肽編碼區，其與編碼分泌多肽的編碼區片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5'端可含有與所述編碼序列異源的信號肽編碼區。在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區的場合，異源信號肽編碼區可能是必需的。或者，外源信號肽編碼區可以簡單地取代天然信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區均可以在本發明中使用。對於細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區是從下列蛋白的基因獲得的信號肽編碼區芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草溶菌素(subtilisin)、地衣芽孢桿菌P-內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(wprr、^nS、"pr局和枯草芽孢桿菌SimonenandPalva，1993，Mfcra6/o/og/ca/i^Wewy57:109-137描述了其它信號肽。對於絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區是從下述蛋白的基因獲得的信號肽編碼區米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴(//"附//0/rao/e"力纖維素酶和3危才帛卄犬腐質黴(i/ww/coZa/awMg/"osa)月旨肪酶。在優選的方面，信號肽編碼區是SEQIDNO:l的核苷酸1至99,其編碼SEQIDNO:2的胺基酸-33至陽l。對於酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區由Romanose/a/.,1992,見上文描述。調控序列還可以是前肽編碼區，其編碼位於多肽氨基末端的胺基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，並且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化成成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(";^7>釀酒酵母a因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區。當信號肽和前肽區二者均出現在多肽的氨基末端時，前肽區緊鄰著(nextto)多肽氨基末端，而信號肽區緊鄰著前肽區的氨基末端。此外，最好添加調節序列，其允許相對於宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是導致基因表達響應於化學或物理刺激，包括調節性化合物的存在，而開啟或關閉的那些系統。原核系統中的調節系統包括/ac、toc和^p操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在曱氨蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和隨重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列可與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。上文所述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或替換編碼多肽的核苷酸序列。或者，可以通過在合適的用於表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發明的核苷酸序列。在製備表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中，致使該編碼序列與合適的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即作為染色體外實體(entity)存在，其複製獨立於染色體複製的載體，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段(means)。或者，載體可以是當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒，或使用共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)的兩個或更多個載體或質粒，或可以-使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個選擇性標記，其允許容易地選擇被轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。條件性必需基因(conditionallyessentialgene)可以作為非抗生素選4奪性標記發揮作用。細菌條件性必需非抗生素選擇性標記的非限制性例子是來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或其它芽孢桿菌0^"7//)的&/基因，這些基因僅當在缺乏D-丙氨酸條件下培養細菌時是必需的。當將細胞培養在存在半乳糖的條件下或培養在導致半乳糖存在的培養基中時，編碼UDP-半乳糖更新(turnover)中涉及的酶的基因同樣能夠發揮細胞中的條件性必需標記的功能。這些基因的非限定性實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌編碼UTP依賴性磷酸化酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依賴性尿苷醯轉移酶(UDP-glucose-dependenturidylyltransferase)(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向異構酶(EC5丄3.2)的那些基因。在以木糖為唯一碳源的基本培養基中培養的細胞中，木糖異構酶基因例如芽孢桿菌屬的^M同樣能夠用作選^H"生標記。在以葡糖酸為唯一碳源的基本培養基中培養的細胞中，利用葡糖酸所必需的基因g"W和g"^P也能夠用作選擇性標記。其它條件性必需基因的實例是本領域已知的。抗生素選擇性標記賦予對抗生素如氨千青黴素、卡那黴素、氯黴素、紅黴素、四環素、新黴素、潮黴素或曱氨喋呤的抗生素抗性。對於酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨曱醯基轉移酶)、z^r(草銨膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、/z;/z(潮黴素磷酸轉移酶)、m'oD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、(乳清酸核苦-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷醯轉移酶)和^tC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase》以及它們的等價物。優選用在麴黴屬細胞中的是構巢麴黴或米麴黴的am必和；^rG基因和吸水鏈黴菌(6^eptomyc^/^gmsccip/cw力的6ar基因。本發明的載體優選含有允許載體整合入宿主細胞基因組或允許載體在細胞中獨立於基因組自主複製的元件。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優選含有足夠數量的與相應目標序列具有高度同一性的核酸，如100至10,000個鹼基對，優選400至10,000個鹼基對，並且最優選800至10,000個鹼基對，以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。為了自主複製，載體可以進一步包含使載體能夠在所述的宿主細胞中自主複製的複製起點。複製起點可以是介導自主複製的任何質粒複製子(replicator),其在細胞中發揮功能。術語"複製起點"或"質粒複製子"在本文定義為使質粒或載體能夠體內複製的核苷S臾序列。細菌複製起點的實例是允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，和允許在芽孢桿菌中複製的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMBl的複製起點。用於酵母宿主細胞中的複製起點的實例是2微米複製起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的複製起點的實例是AMA1和ANSI(Gemsea/.，1991,G面98:61-67;Cullen"a/.,1987，AWe/d油ie廳rc/715:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構建包含該基因的質粒或載體可以根據公開於WO00/24883中的方法完成。可以將多於一個拷貝的本發明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或包括與多核苷酸一起的可擴增的選擇性標記基因，其中細胞含有選擇性標記基因的擴增的拷貝，並且由此可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇多核苷酸的額外拷貝。用於連接上述元件以構建本發明重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook"a/"1989,見上文)。宿主細力包本發明還涉及包含本發明的多核苷酸的重組宿主細胞，將其有利地用於多肽的重組生產中。將包含本發明多核苷酸的載體引入宿主細胞中，使得該載體作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自主複製的染色體外載體被保持。術語"宿主細胞"包含親本細胞的任何由於複製過程中發生的突變而異於親本細胞的子代。宿主細胞的選擇將在很大程度上依賴於編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如原核生物，或者是非單細胞微生物，例j口真一亥生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌，包括但不限於芽孢桿菌屬細胞，例如，嗜i鹹芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(Ba"7/Mc/aww7)、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌；或鏈黴菌屬細胞，例如，淺青紫鏈黴菌和鼠灰鏈黴菌，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種。在優選的方面，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一優選的方面，芽孢桿菌屬細胞是嗜鹼的芽孢桿菌。可通過如下方法實現將載體？1入到細菌宿主細胞例如原生質體轉化(參見，例如，ChangandCohen,1979,Mo/ecw/wGe麼a/Ge"W"168:111-115),4吏用感受態糹田月包(參見，例如,YoungandSpizizen，1961，J。Mwa/o/^Sacten-o/o^81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971,Jbwrm/o/Mo/ecw/arB/o/ogy56:209—221),電穿孑L(參見，侈寸j!口，ShigekawaandDower,1988,腸tec/zw々腦6:742-75l)或接合(參見，例如，KoehlerandThome,1987，Jo畫a/q/"BacteWo/ogv169:5771-5278)。宿主細胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、才直物或真菌細胞。在優選的方面，宿主細胞是真菌細胞。"真菌"用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworthe/1力/"，oW/z朋(i5/A少i1Z)/"/owar_yo/77zeFwwg/,她edition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth"a/.,1995,見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfongi)(Hawksworth26"g/"1995,見上)。在更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包括產子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內孑包黴目(Endomycetales))、產4旦子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬於半#、口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包糹岡(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，將酵母定義為如Wo/ogyaw/J"/v/Z^o/1feas/(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.,andDave叩ort，R.R.，eds，5bc.」,^acfer/o/.S，屍cw/騰Sen.esNo.9，19S0)中所述。在更加優選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬(OwAV/a)、漢遜酵母屬(//a/we歷/a)、克魯維酵母屬CS7wyvera/，ce力、畢赤酵母屬(屍/c/z/a)、酵母屬(iS"acc/zara"ca51)、裂殖酵母屬(5b/z/zasacc/2aram^ycas)或西洋蓍黴屬(J^rraw/a)細胞。在最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母OSbcc/^rawycwcar/s6ergem7's)、S良酒酵母、4唐"f匕酵母0Sacc/iaramjvc&st//asfaft'cws)、道才各4立氏酵母(&cc/zaramycesc/owg7as7.0、克魯弗酵母(&cc/zarom少cesWwyver/)、諾地酵母(Sacc/aramyceswor6em7'力或卯形酵母糹田月包(iSacc/zaromycesovzybrw/s)。在另外最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母CS:/《yveramyc"/acto)細胞。在另外最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍黴(7arraw/a/^0(yrica)細胞。在另一更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth"a/.,1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體(thallus)的出芽(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵性的。在一個甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢黴屬(ylcremom'wm)、曲審屬、4豆片更審屬(^"/^060/^"附)、步因管審屬(5/erA:aMcfer(3)、Cen)wn'o/w^、鬼傘屬(Co/n'"m力、革蓋菌屬(Con'o/us)、隱3求菌屬(Oy/tococcw力、網孑包菌屬(屍z7oZos7W/wm)、鐮孑包屬(Fuyan'wm)、腐質黴屬(/wm/cok)、梨孢菌屬(M3g"apoW/ze)、毛黴屬(A/wcor)、毀絲黴屬(A^ce//o//^/7c>ra)、誶斤考3馬月旨黴屬(7Veoca〃/mos^/;c)、月永孑包菌屬(7Vewra5pon3)、擬、青黴屬(i^ec〃o附少ces)、青黴屬(屍em'".〃/臓)、平革菌屬(屍/zawmc/2aefe)、射脈菌屬CP/7/e6/a)、瘤胃壺菌屬CP/ramyce力、側耳屬(屍/ewrafw力、裂褶菌屬(5"c/2/zo//^〃mw)、3果節菌屬(7^/an9m少ce力、P耆熱子嚢菌屬(772erwooycus1)、鬥炎孑包殼屬(777/e/aWa)、彎頸黴屬(7b/，oc/a(i/M附)、檢菌屬(7h3wetes)或木黴屬(7Hc/70c/er附a)糹田月包。在一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、煙麴黴(y^/e^/〃M/訓/ga加)、臭麴黴(^5pe^7.〃MS》eri(i—、日本曲審(y^/erg/〃ws/"屍cra'cw力、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴細胞。在另一個最優選方面，絲狀真菌宿主細胞是一幹孑包卄大鐮孑包(Fwsan'wm6acfnWo/fifes1)、禾穀鐮孑包(Fwsan'wmcerea/Z力、庫威鐮孑包(Fwsan'wmcrao^we〃e"se)、大刀鐮孑包(Fwsan'Mwcw/wo/^m)、禾本牙牛鐮孑包(Fwsar/wmgraw/"earww)、禾赤鐮孑包(Fwsan'wmgram/www)、異孑包鐮孑包(Fz^an'ww/zeferos^orw附)、合7欠木鐮孑包(Fwsan'Mmwegw"<i/)、尖鐮孑包、多4支鐮孑包(FMS(3r/Mm7-e/7'cw/(3fwm)、4分糹工鐮孑包CFi^or/Mmra化ww)、才妄骨木鐮孑包(Fwsan'w"7samZwc/wwm)、月夫色鐮孑包(Fwsan'wmsa/roc/zraww)、擬、分4支孑包鐮孑包(Fz^arz'wm^sporafWc/z/o/cie力、石克色鐮孑包(FMsan'Mmw/p/wreww)、圓鐮孑包(jFYAsanYw7tonJoraw)、4以絲孑包鐮孑包(Fwsan'wmfn'c/7c^/2ec/o/cfe力或4裡片鐮孑包(Fusan'wmve/7e"afwm)糹田月包。在另一最"f尤選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌CSyerfez"cferaa^iwto)、Cen)on'o^^、Ce—on'op^awezWwa、Ce—o":o/m/sca廠eg/ea、Ce"jw"'op^毛革蓋菌(Cor/o/w/7hw^力、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、米赫毛黴(Mwcorm/e/ze/)、嗜熱毀絲黴(踏<^//0^/^/20^;Aemw//n7a)、^a4造月永孑包菌(A^wms^oracm^a)、產紫青黴(屍em'c/〃/wm/w/wrage"MW)、黃孑包平革菌(P/a"erac/zaefec"/zoAscw/or/Mm)、輻射射月永菌(屍WeW(3rac^'ata)、屍/ewrafwse;^wg〃、土生4發孑包殼(77z/e/麵'afermst〃》、絨毛檢菌(7函etov/〃osa)、雜色栓菌(『rameteyvem'co/or)、哈茨木黴(7Hc/20fife削a/zarz/朋Mm)、康亍木黴(7Hc/zo<ierm(3A:0"/"g7'/)、長鬥支木審(7/c/z。cfer附"/owg/ferac/zfafw附)、裡氏木審或鄉錄色木審(7h'c/zo(iermav/nV/e)菌^朱糹田月包。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用於轉化麴黴屬和木黴屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton<a/.，1984,PraceW"gso/Atofcwa/爿cacfemyo/Sc/mcmWS^Si:1470-1474中描述。用於轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier&"/.,1989，Ge"e78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法專爭4b酵母BeckerandGuarente,Abelson，J.N.andSimon,M.I.，editors,GWcfeto1fem/G"ewWoyM/ecw/"rA/e/Zzoo^EVzywo/ogy,Volume194，pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoa/.,1983,ToM廠wa/o/Bacten'o/c^153:163;和Hinnenda/.，1978,屍raceW"g^Ato/cwa"ccwfe附yq/"Sc/e"cest75^75:1920。產生方法
技術領域：
：本發明還涉及用於產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。優選地，所述細胞是芽孢桿菌屬的細胞。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區中具有至少一個突變的突變核苷酸序列，其中所述突變核苷S吏序列編碼包含SEQIDNO:2的胺基酸1-759或SEQIDNO:2的胺基酸65至347或SEQIDNO:2的胺基酸368至569的多肽，和(b)回收所述多肽。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在包含碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，可以從所述培養基中直接回收該多肽。如果多肽不分泌，則可以從細胞裂解物(lysate)回收之。可以使用本領域已知的對於所述多肽具有特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定(enzymeassay)可用於測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常身見方法，包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱等，從營養培養基中回收。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，石克酸銨沉澱)、SDS-PAGE或4是耳又(參見，例^口，屍ra/e/"J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本發明還涉及具有內切-(3-l,4-葡聚糖酶活性，並且通過上述方法之一生產，優選通過重組產生技術生產的分離的酶。分離的酶優選不含同源雜質。這些雜質可由內源內切-(3-l，4-葡聚糖酶基因生產，因此如果生產是在不表達具有內切-P-1,4-葡聚糖酶活性的內源多肽的宿主細胞中進行的，酶將不含同源雜質。組合物本發明還涉及包含本發明的多肽的組合物。優選地，所述組合物富含這種多肽。術語"富含，，表示所述組合物的內切葡聚糖酶活性已經得以增加，例如，以至少1.1的富集因數(enrichmentfactor)增加。所述組合物可以包含本發明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氬酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、(x-半乳糖苷酶、)3-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、卣素過氧化酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶(peptidoglutamiriase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬於以下屬或種的微生物產生麴黴屬，優選棘孢麴黴04verg/〃wacM/ea&力、泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴；鐮孢屬，優選杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、好b色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質黴屬，優選特異腐質黴或疏棉狀腐質黴；或木黴屬，優選哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木黴。可以依照本領域內已知的方法製備多肽組合物，並且可以是液體或幹組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以將包括於所述組合物中的多肽依照本領域內已以下提供的實施例是本發明多肽組合物的優選的用途。本發明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基於本領域內已知的方法決定。用途紡織品應用在另外的實施方式中，本發明涉及本發明的內切葡聚糖酶在紡織品整理方法例如生物拋光中的用途。生物拋光是對紗線(yarn)表面的特殊處理，其在手感和外觀方面改善織物的質量，而不損失織物可溼性。生物拋光最重要的效果特徵可在於起毛(fuzz)和起球(pilling)減少、光彩(gloss)/光澤(luster)增加、織物手感改善、持久柔軟性增加及吸水性(waterabsorbency)改變。生物拋光通常在製造針織(knitted)和編織(woven)織物期間的溼加工中進行。溼加工包括例如脫漿、衝刷(scouring)、漂白、洗滌、染色/印染和整理等步驟。在這些步驟期間，織物或多或少地經受機械作用。通常而言，在針織或編織紡織品之後，接著對織物進行任選的脫漿階段，其後是衝刷階段等。脫漿是從紡織品去除漿料(size)的作用。在機械織機上紡織之前，通常用由澱粉或澱粉衍生物組成的漿泮牛包4li至紗(warpyarn)，/人而增加它們的4立伸強度(tensilestrength)。紡織之後，必須在進一步加工織物之前將漿料包覆去除以保證均勻和防洗效果。在衝刷過程中，將雜質從織物去除。本發明的內切葡聚糖酶能夠有利地用於纖維素和棉紡織品以及韌皮纖維的沖刷，並且可改進雜質去除的效率。對纖維素紡織品賦予耐久免燙性(durablepress)的一種最普遍使用的方法是通過纖維素交聯化學整理。交聯使纖維素在分子水平固定，並且顯著減少纖維素衣物收縮和褶鈹。用本發明的內切葡聚糖酶處理經耐久免燙處理的纖維素紡織品，可使受應力區域得到選擇性的鬆弛，從而使邊緣磨損最小化。此外，可以利用本發明的內切葡聚糖酶高效地去除印染方法中使用的紡織品和設備中多餘的羧曱基纖維素基印花色漿(printpaste)。已知為了實現生物拋光的效果，需要纖維素分解作用和機械作用的結合。還已知將纖維素酶處理與柔軟劑的常規處理相結合可以實現"超柔軟"。預期本發明的內切葡聚糖酶和該酶與其它酶的組合用於纖維素物品(cellulosics)(天然的和製造的纖維素物品、織物、衣物、紗線和纖維)生物拋光的用途是有利的，例如能夠實現更徹底的拋光。相信可以通過應用例如WO93/20278中描述的方法來獲得生物拋光。進一步預期本發明的內切葡聚糖酶能夠應用於同時或順序的紡織品溼加工，包括脫漿、衝刷、漂白、生物拋光、染色和整理的不同組合。石洗已知染色織物，特別是斜紋粗棉布織物或細斜紋布(jeans)中的"石洗"外觀(局部性的顏色磨損)可以如下提供在浮石存在下洗滌由這種織物製造的斜紋粗棉布或細斜紋布以提供期望的織物顏色局部性淺化，或通過酶處理所述織物，具體而言用纖維素分解酶處理所述織物。本發明的內切葡聚糖酶(單獨或與其它酶組合)的處理可以如US4,832,864中7>開的那樣單獨進行，與用量少於傳統方法所需量的浮石一起進行，或者如WO95/09225中公開的那樣與珍珠巖(perlite)—起進行。用本發明的內切葡聚糖酶處理斜紋粗棉布織物與常規方法相比可以減少回染(backstaining)。生物質降解可將4艮據本發明的酶或酶組合物有利地應用，例如如下匿用於去皮(debarking)，即在機械筒(mechanicaldrum)中去皮之前，用可部分降解富含果膠的形成層的水解酶預處理，從而導致有利的能源節約。-用於脫纖維(勻漿(refming)或打漿(beating》，即在勻漿或打漿之前，用水解酶處理含有纖維素纖維的材料，由於酶在纖維表面的水解效果，致使能量消耗降低。-用於纖維改性，即改進纖維性質(例如為了使粗纖維更柔韌)，其中需要跨越纖維壁的部分水解，所述水解需要較深滲透性的酶。-用於濾水用水解酶處理紙漿可以改善造紙紙漿的濾水能力。使用本發明的酶或酶組合物可以更有效，例如導致細粒部分(finesfraction)中的強力水合微原纖維束得到更高程度的鬆弛，所述強力水合的微原纖維束阻斷纖維之間和造紙機絲網(wiremesh)中的中空間隙，從而限制濾水速率。木質纖維素紙漿的處理可以例如WO93/08275、WO91/02839和WO92/03608中所述進行。洗衣本發明的酶或酶組合物在用於紡織品和衣物的家用或工業洗滌的洗滌劑組合物中可能是有用的，並且在織物的機洗處理方法中可能是有用的，所述方法包括在機洗方法的一個或多個洗滌循環期間用含有本發明的酶或酶製劑的洗滌溶液處理織物。用於洗滌過程中的洗滌劑組合物通常包含常規成分例如表面活性劑(陰離子、非離子、兩性離子、兩性)、增效劑(builder)、漂白劑(過硼酸鹽、過碳酸鹽或過氧化氫)和其它成分，例如WO97/01629中所述，將其通過提述全部併入本文。洗滌劑應用可以將本發明的酶添加至洗滌劑組合物，並且因此成為洗滌劑組合物的成分。本發明的洗滌劑組合物可以例如配製為手洗或機洗的洗滌劑組合物，包括適於預處理沾汙織物的洗衣添加劑組合物和添加了漂洗劑的織物柔軟劑組合物，或將其配製為用於常規家庭硬表面清理操作的洗滌劑組合物，或配製用於手洗或機洗的洗碟(dishwashing)操作，特別用於自動洗碟(ADW)。本發明的內切-(3-l,4-葡聚糖酶提供例如改進去汙和減少汙垢再沉積等優點。特定的沾汙，例如特定的食品沾汙含有(3-葡聚糖，其使得完全去除所述沾汙難以實現。同樣，織物的纖維素纖維可能含有由這種酶降解的(3-葡聚糖聚合物，尤其在"非結晶，，和表面區。在洗滌過程中，沾汙中或織物上的這些卩-葡聚糖的水解使汙垢對織物的結合減少。家庭洗衣過程在一定範圍的條件下進行。通常而言，洗滌時間是5-60分鐘，而洗滌溫度是15-60。C,最通常是20-40。C。洗滌溶液通常是中性或鹼性，最通常具有pH7-10.5。通常使用漂白劑，尤其用於白色織物的洗滌。這些漂白劑通常是過氧化物漂白劑，例如過硼酸鈉、過碳酸鈉或過氧化氫。在具體的方面，本發明提供包含本發明的酶的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可包含一種或多種其它的酶例如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或過氧化物酶。通常選擇的酶的性質應該與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH，與其它酶和非酶成分的相容性等)，並且所述酶應以有效量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。微生物來源是優選的。包括經化學修飾或蛋白質工程化的突變體。所述蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選鹼性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。鹼性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶"7和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來源)和在WO89/06270和WO94/25583中描述的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，特別是在以下位置中的一個或多個具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優選的商業上能夠獲得的蛋白酶包括Relase、Alcalase、Savinase、Primase、Everiase、Esperase、Ovozyme、Coronase、Polarzyme和Kannase(NovozymesA/S)，Maxatase、Maxacal、MaxapemTM、Properase、Purafect、PurafectOxPTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM和PurafectPrimeTM(GenencorInternational,Inc.),BLAPX和BLAPS(Henkel)。脂肪酶:合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自以下的脂肪酶腐質黴屬(同物異名嗜熱黴屬(77zermomyce力)，例如，來自疏棉狀腐質黴(細毛嗜熱黴(r/"w《/"oy^))，如EP258068和EP305216中所述，或來自特異腐質黴，如WO96/13580中所述，假單胞菌屬脂肪酶，例如，來自產石威假單胞菌CR"/^//^"")或類產鹼假單胞菌(/(EP218272)、洋蔥假單胞菌CRcepa"'a)(EP331376)、施氏假單胞菌OR潔zen〕(GB1,372,034)、螢光假單胞菌CRy7womce似)、假單胞菌屬菌種(i^ewcfowoww^.)菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假單胞菌CPw'"om/"m^)(WO96/12012)、芽孢桿菌屬脂肪酶，例如，來自枯草芽孢桿菌(Dartoisetal.(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌C8./m加7m)(WO91/16422)的脂肪酶。其它實例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶變體。優選的商業上能夠獲得的脂肪酶包括Lipolase和LipolaseUltra(NovozymesA/S)。澱粉酶:合適的澱粉酶(a和/或(3)包括細菌和真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程化的突變體。澱粉酶包括例如從芽孢桿菌屬獲得的a-澱粉酶，例如，地衣芽孢桿菌的一個特殊菌抹，在GB1,296,839中對其有更詳細的描述。有用的澱粉酶的實例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別在一個或多個以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業上使用的澱粉酶是Duramyl、Termamyf、Stainzyme、Fungamyl和BAN(NovozymesA/S),Rapidase頂、Purastar和PurastarOxAmTM(來自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶:其它合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾或蛋白質工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質黴屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢黴屬的纖維素酶，例如，產生自特異腐質黴、嗜熱毀絲黴和尖鐮孢的真菌纖維素酶，其公開於US4,435,307、US5,648,263、US5，691,178、US5,776,757和WO89/09259。特別合適的纖維素酶是鹼性或中性纖維素酶，其具有保護顏色的益處(colourcarebenefits)。這些纖維素酶的實例是在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實例是纖維素酶變體，例如在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和WO99/01544中描述的那些。35商業上能夠獲得的纖維素酶包括CelluzymeTM、Renozyme⑧和Carezyme(NovozymesA/S)，Qazinase*PuradaxHATM(GenencorInternationalInc.),和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。過氧化物酶/氧化酶:合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾或蛋白質工程化的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬的過氧化物酶，例如來自灰蓋鬼傘的及其變體，如在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些。商業上能夠獲得的過氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。半纖維素酶:合適的半纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾或蛋白質工程化的突變體。合適的半纖維素酶包括甘露聚糖酶、地衣聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、乙醯木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶(glucorunidase)、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶，如WO95/35362中描述。合適的甘露聚糖酶在WO99/64619中描述。通過添加含有一種或多種酶的單獨的添加劑，或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，可將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中。可將本發明的洗滌劑添加劑(即單獨的添加劑或組合的添加劑)配製成例如，顆粒、液體、漿等。優選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，具體為非粉化性(non-dusting)顆粒，液體，具體為穩定的液體，或漿。例如，可以如美國專利號4,106,991和4,661,452中所公開的產生非粉化顆粒，並且可以任選地通過本領域已知的方法包覆。蠟質包覆材料(waxycoatingmaterial)的實例是具有1000至20000的平均摩爾量的聚(環氧乙烷)產品(聚乙二醇，PEG);具有從16至50個的環氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有從12至20個碳原子，並且其中存在15至80個環氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單g吏甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。適合於流化床技術應用的成膜包覆材料的實例提供於GB1483591。例如，可根據已經建立的方法通過添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩定化液體酶製劑。可以根據公開於EP238,216中的方法來製備保護酶。本發明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片、粉末、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%的水和0-30%的有才幾溶劑，或非7jC性的(non-aqueous)。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，表面活性劑可以是非離子型的，包括半極性型的和/或陰離子型的和/或陽離子型的和/或兩性離子型的。所述表面活性劑通常以"接重量計0.1%至60%的水平存在。當包括於其中時，所述洗滌劑將通常含有大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽、a-烯烴磺酸酯(olefinsulfonate)、烷基硫酸鹽(月旨肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽(alcoholethoxysulfate)、次級鏈烷-黃酸鹽(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯、烷基-或烯基琥珀酸或肥急(soap)。當包括在其中時，洗滌劑將通常含有大約0.2%至大約40%的非離子型表面活性劑，例如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二曱基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇醯胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇醯胺、多羥基烷基脂肪酸醯胺或葡糖胺的N-醯基N-烷基衍生物("葡糖醯胺(glucamide)，，)。洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增效劑或絡合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽(phosphonate)、碳酸鹽(carbonate)、檸檬酸鹽、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶矽酸鹽或分層矽酸鹽(layeredsilicates)(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例是羧曱基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咬-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、馬來SH/丙烯S吏共聚物和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白體系，其可以包含H202源例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，H202源可以與形成過酸的漂白激活劑例如四乙醯乙二胺或壬醯氧苯石黃酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合。或者，漂白體系可以包含過氧酸，例如醯胺、二醯亞胺(imide)或碸類型的過氧酸。本發明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規穩定劑來穩定化，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物例如4-曱醯苯基硼酸(4-formylphenylboronicacid),並且可以依照例如WO92/19709和WO92/19708中所述配製所述組合物。洗滌劑還可以含有其它常規洗滌劑成分，例如，織物整理劑(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸汙劑、防汙漬再沉積劑、染泮十、殺菌劑、光亮劑(opticalbrightener)、水溶助劑(hydrotrope)、晦暗#卩製劑(tarnishinhibitors)或香泮牛。在洗滌劑組合物中的任何酶，特別是本發明的酶，可以按相當於每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的量添加。還可以將本發明的酶4參入/>開於WO97/07202的洗滌劑配製物，WO97/07202在本文中作為參考文獻併入。信號肽和前肽本發明還涉及核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼蛋白質的基因，該基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，其中所述基因對於編碼信號肽的核苦酸序列是外源的。本發明還涉及包含這些核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發明還涉及用於產生蛋白質的方法，其包括(a)在適合於產生所述蛋白質的條件下培養這種重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。可以將第一和第二核苷酸序列單獨地與其它調控序列或組合地與其它調控序列一起可操作地連接至外源基因。這些其它調控序列如上所述。如前文所述，當信號肽和前肽區二者均出現在蛋白質的氨基末端時，前肽區緊鄰著蛋白質的氨基末端，並且將信號肽區緊鄰著前肽區的氨基末端。蛋白質對於宿主細胞可以是天然的或異源的。術語"蛋白質"在本文的並不意在指稱具體長度的編碼產物，因此涵蓋了肽、寡肽和蛋白質。術語"蛋白質，，還包含兩種或多種多肽結合形成的編碼產物。蛋白質還包括雜合多肽，其包含從至少兩種不同的蛋白質獲得的部分或完整多肽序列的組合，所述至少兩種不同的蛋白質中的一種或多種對於宿主細胞可以是異源的或天然的。蛋白質進一步包括上述蛋白質和雜合蛋白質的天然存在的等位變異和工程化變異°優選地，蛋白質是激素或其變體，酶，受體或其部分，抗體或其部分，或報導蛋白(reporter)。在更優選的方面，蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構酶或連接酶。在甚至更優選的方面，蛋白質是氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖香酶、卩-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。通過以下實施例進一步對本發明進行描述，但不應將其理解為對本發明範圍的限制。實施例'用作緩衝劑和底物的化學品是至少試劑等級的商業產品。內切葡聚糖酶活性測試材料Berol537,由AkzoNobel供應的非離子表面活性劑，或類似物(similar)。CellazymeC片劑，由MegazymeInternational,Ireland供應。玻璃微纖維濾器，GF/C，9cm直徑，由Whatman供應。pH9,5緩衝溶液將21,0gNaHC03和14，6gNaCl溶解在大約900ml去離子水中。添加10mlBerol537(由AkzoNobel供應的非離子表面活性劑)。通過添加4NNaOH來調節pH至9,5。其後調節總體積至1000ml。方法在試管中，混合lmlpH9,5緩衝液和5ml去離子水。添加100微升酶樣品(或具有已知重量:重量稀釋因子的酶樣品稀釋液)。向每個試管中添加1個CellazymeC片劑，蓋上管蓋並且在渦旋混合器上混合10秒。將試管置於恆溫水浴，溫度40。C。在15、30和45分鐘之後，通過顛倒試管來混合試管中的內容物，再置於水浴中。60分鐘之後，通過倒置混合試管中的內容物，其後通過GF/C濾器過濾。將濾液收集至乾淨的試管中。用分光光度計在590nm測量吸光度(A^(A酵))。通過添加100^1水代替100微升酶稀釋液來測量空白值Awater(A水)。計算Adelta=Aenz-AwaterA她a必須0.5。如果獲得了較高的結果，以不同的酶稀釋因子進行重複。求出DFO.l，其中DF0.1是得到Adelta=0.1所需的稀釋因子。單位定義1個內切-(3-葡聚糖酶活性單位(1EBG)是在上文規定的測試條件下得出A她a二0.10的酶量。因此，例如，如果給定的酶樣品在以稀釋因子IOO稀釋之後得出Adelta=0.10,則所述酶樣品具有100EBG/g的活性。在pH固定時以不同的溫度範圍運行活性測試，或者與之相反，在溫度固定時以不同的pH範圍運行活性測試，來測定內切葡聚糖酶的最適溫度和pH。實施例1篩選新的內切葡聚糖酶通過將細菌培養在添加0.1%AZCL-P-葡聚糖(大麥，Megazyme)的TY瓊脂上來篩選多種芽孢桿菌屬菌抹的鹼性內切葡聚糖酶的產生。菌林ACE160在這種基質上產生藍色暈圈(halo),通過測定部分16SrDNA來鑑定所述細菌，並且將所述序列插入系統樹後顯示ACE160是芽孢桿菌組05^///附group)的一個新種。實施例2全長枯草蛋白酶(subtilase)的生產基因組文庫構建通過使用標準分子生物學技術(Ausubleetal.1995"Currentprotocolsinmolecularbiology"Publ:JohnWileyandsons)製備來自^C￡MC>的染色體DNA。用Sau3A部分切割製備的DNA並且在瓊脂糖凝膠上分離。洗脫3-8kb的片,殳，沉澱，再重懸在合適的緩衝液中。使用StratageneZAPExpressTM預消化載體試劑盒和StratageneZAPExpressTM預消化Gigapacl^克隆試劑盒(BamHI預消化的)(StratageneInc.,USA)遵循銷售商的說明書/建議來製備基因組文庫。所得lambdaZAP文庫包含38000個pfo(蝕斑形成單位)，收集其中10000個進行總體切離(massexcision)。匯集(pool)所得的70000個大腸桿菌菌落。將大腸桿菌克隆匯集物(clonepool)通過以100(il的匯集物(pool)與100mlLB培養基混合進4亍稀釋後，以每個瓊脂平板100塗布在補充了0.1%AZCL-P-葡聚糖(大麥，Megazyme)和50pg/ml卡那黴素的LB上，並溫育2-3天。50個瓊脂平板上每個平板有1600-1800個菌落，從中獲得了具有藍色暈圈的三個菌落。從這三個菌落回收了質粒DNA並且用載體引物加以測序。通過後續的引物步移法表徵了內切-1,4-(3-葡聚糖酶開讀框(ORF)的完整核苷酸序列。三個菌落含有相同的ORF，如SEQIDNO:l所示。全長內切葡聚糖酶的產生為了產生內切-l，4-P-葡聚糖酶，從野生型芽孢桿菌屬菌種ACE160菌抹的染色體DNA擴增基因。使用固有(indigenous)的跨膜信號肽來表達所述酶。引物ACE160-Bglu-Mlul-4:將內切-1,4-(3-葡聚糖酶基因擴增為大約2500nt的PCR產物。使用的引物是ACE160-Bglu-Sacl和ACE160-Bglu-Mlul-4。模板DNA是芽孢桿菌屬菌種ACE160的染色體DNA。使用Qiaquicktm離心柱(spincolumn)按照推薦(Qiagen，Germany)回收PCR產物。通過瓊脂糖凝膠電泳來評估分離的模板的質量。按照以下方案進行PCR:94。C,2分鐘；40個循環的[94。C30秒，52。C30秒'68。C1分鐘];68。C10分鐘後完成。在TAE緩沖液中在用溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠上分析PCR產物，確認大小正確的單一條帶。用限制酶Sacl和Mlul消化PCR產物並利用GFXPCR及凝膠條帶純化試劑盒(AmerhamBiosciences)力口以糹屯4匕。將消化並且純化的PCR片段連接至SacI和MluI消化的質粒pDG268NeoMCS-PramyQ/Prcryin/cryinAstab/Sav(美國專利5,955,310)。使用連接混合物轉化至大腸桿菌TOP10F，(InvitrogenBV，TheNetherlands)中'並選擇幾個菌落用於小量製備(01八口化？@spin,QIAGENGmbH,Germany)。檢查純化質粒的插入序列，然後將純化質粒轉化到枯草芽孢桿菌菌林TH1中(TH1是一種枯草芽孢桿菌菌抹(amy-鄰o-,apr-,叩r-)，系從菌株DN3(Nooneetal.2000,JBacteriol182(6)1592-1599)通過轉化和紅黴素(Erytromycin)選擇，插入構建體修飾而來。改變的基因型是ykdA::pDN3(PykdA-lacZPspac-ykdA)Ermr。TH1含有下列特徵全長ykdA啟動子與LacZ報導基因融合。此外將ykdA基因置於IPTG誘導的Pspac啟動子的調控下，使得ykdA基因不再具有其天然的調節。可以將該菌林用作表達克隆和文庫的宿主，而表達並分泌蛋白質的轉化體可以在含有X-gal和IPTG的平板上加以選4f。TH1能夠維持(maintain)在LB瓊脂+6jig/mL紅黴素上)。將經轉化的細胞塗布在補充了1%脫脂乳、100pg/LX-gal、lmMIPTG、6嗎/ml氯黴素和12lig/ml紅黴素的LB-PG瓊脂平板上。將塗布的細胞在37。C溫育過夜，挑取具有藍色並且無透明區(clearingzone)的菌落，通過PCR和核苷酸測序來確^人正確的插入序列。實施例3純化來自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內切葡聚糖酶從670ml發酵液純化內切葡聚糖酶，通過對發酵液進行離心和過濾的組合從所述發酵液中去除細胞。用去離子水將體積調節至2升並且將pH滴定為8.5。將該材料上樣至用25mMTris緩衝液pH8.5平衡的Q-sepharose柱。施加相同緩衝液中的NaCl梯度來洗脫酶，並匯集含有內切葡聚糖酶的級分。將該匯集物的一部分在以100mM乙酸鈉pH6作為液相的S-200凝膠過濾柱上分級。匯集含有內切葡聚糖酶的級分，並在Amicon超濾單元上濃縮大約三倍(threetimes)。通過SDSPAGE分析濃縮物，獲得了大約80kD的蛋白質帶。實施例4來自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內切葡聚糖酶的洗滌性能使用這種方法來測定"酶去垢性效益"。通過將沾汙的棉織物樣品和清潔棉織物樣品二者一起在小規模洗滌測試設備中洗滌來進行洗滌測試。洗滌之後，通過光反射來評估棉織物上的汙垢。對原先為沾汙的棉織物和原先為清潔的棉織物樣品兩者進行評估。棉織物#2003白色紡織100%棉織物，由Tanigashira，4-11-15KomatsuYodogawa-ku，Osaka,533-0004,Japan供應。在用於洗滌測試之前，將新的棉織物預洗滌三次。使用歐洲家用前載式洗衣^Kfront-loaderwashingmachine)進行所述預洗滌，並且使用標準40。C洗滌流程。以0.5g/L的濃度向洗滌水中添加LAS(SurfacSDBS80烷基苯石黃酸鈉，80%)，並且通過加入石友酸鈉將洗滌溶液的pH調節至10。在預洗滌之後，將織物在轉鼓式乾燥機(tumblerdrier)中乾燥。切割出大小5x5cm的經預洗滌的棉織物樣片，大約每個重0.3g，並且將這些樣片用於洗滌測試。沾汙的棉樣片從上述的5x5cm樣片製備沾汙的棉樣片。使用P-葡聚糖(中等粘度，來源於大麥，由MegazymesInternational,Ireland供應)和碳黑("用於去垢性測試的碳，，，由SentakuKagakuKyokai,Tokyo,Japan供應)來製備沾汙的樣片。通過攪拌和加溫至〉50。C將大約0.67g(3-葡聚糖溶解在100ml自來水(tapwater)中。添加0.33g碳黑。用UltraTurraxT25混合器進行混合，以4000rpm速度進行2分鐘。向每個樣片的中央施加250孩￡升(3-葡聚糖/碳。在室溫使其乾燥過夜。洗滌測試將三個沾汙的樣片和三個清潔的樣片在Mini-Terg-O-Tometer機器中洗滌。Mini-Terg-O-Tometer是JayC.Harris,"DetergencyEvaluationandTesting",IntersciencePublishersLtd.(1954)pp.60-61中4苗述的Terg-O-Tometer測試洗滌機的小規模型號。使用以下條件燒杯大小250ml洗滌;容'液體積100ml洗滌溫度40°C洗滌時間30分鐘攪拌150rpm在開始測試之前將洗滌劑溶液預熱至40。C。在30分鐘洗滌期開始時添加織物和酶。在洗滌之後，將織物樣片在流動的自來水下漂洗5分鐘，然後展平並且使其在室溫過夜風千。儀器評估使用MacbethColorEye7000反射分光光度計來進行織物樣片的光反射評估。測量在500mn進行。不包括UV濾光器。在每個樣片的正面和反面上進行測量。沾汙樣片在沾汙區域的中央進行測量。然後由對每種類型的六次測量計算沾汙樣片和清潔樣片的反射的平均結果(R,500nm)。洗滌劑溶液如下製備洗滌劑溶液對於l升溶液的製備，將0.5g碳酸鈉和l.Og碳酸氫鈉溶解在去離子水中，並且添加2ml含有117.8g/1CaCl2.2H20和54.3g/1MgCl2.6H20的溶液。這種鈣/鎂的添加提供了12。dH的水硬度。添加0.2g非離子表面活性劑(Berof537，AkzoNobel)和0.5gLAS(811遷30@808880烷基苯磺酸鈉，80%)，並且調節終體積至1升。調節pH至pH9.5士0.1(通過添加碳酸鈉或10%檸檬酸溶液)。酶添加將待測試的酶以已知濃度預溶解在水中，並且在洗滌流程開始時將所需量的酶添加至洗滌劑溶液。計算酶的去垢性效益酶的去垢性效益是對在洗滌測試中納入酶之後，樣片(原為沾汙和原為清潔的)變得清潔了多少的量度。如下計算酶的去垢性效formulaseeoriginaldocumentpage44在洗滌測試之後，沾汙樣品的平均R,500nm值是R，沾汙。在洗滌測試之後，清潔樣品的平均R，500nm值是R，清潔。對於使用酶的洗滌測試，酶去垢性效益是有酶時的R，沾汙+R,清潔之和減去無酶時的R,沾汙+R,清潔之和。以這種方法測定的酶的去垢性效益值是對汙垢從織物的去除和汙垢在織物上的再沉積的組合量度。因此酶的去垢性效益值可具有負值或正值。可將酶的去垢性效益值用於比較不同的酶的性能。最高的正去垢性效益值是優選的結果。為了比較，將源自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內切葡聚糖酶的洗滌性能與現有技術WO2002/099091中公開的芽孢桿菌屬內切葡聚糖酶MB1181-7的洗滌性能進行比較。結果洗滌溶液中的酶活性ACE160,6EBG/LACE160,12EBG/LMB1181-7，6EBG/LMB1181-7,12EBG/L酶的去垢性效益28,129,915，222，2結果顯示，源自芽孢桿菌屬菌種ACE160的內切葡聚糖酶與已知的內切葡聚糖酶相比給出較高的酶去垢性效益。因為這些方面旨在說明本發明的幾個方面。任何等同的方面意欲在本發明的範圍之內。當然，根據前文的描述，在本文顯示和描述的內容之外對本發明的各種修飾對於本領域技術人員將是顯而易見的。這些修飾也意欲落入所附權利要求的範圍之內。如有衝突，以包括定義在內的本^^開為準。4權利要求1.具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組a)多肽，其具有與SEQIDNO2的胺基酸1至759具有至少72％同一性的胺基酸序列；b)多肽，其具有與SEQIDNO2的胺基酸65至347具有至少86％同一性的胺基酸序列；c)多肽，其由在至少低嚴緊條件下與以下雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO1的核苷酸100至2376，(ii)SEQIDNO1的核苷酸193至1041，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；d)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO2的胺基酸1至759；e)多肽，其由包含SEQIDNO1的核苷酸100至2376或SEQIDNO1的核苷酸193至1041的核苷酸序列編碼。2.權利要求l的多肽，其中包含SEQIDNO:2的胺基酸368至569的片段具有糖結合模塊活性。3.權利要求1或2的多肽，所述多肽具有以下性質中的至少一種a)pi為4.4,b)最適pH為9，c)最適溫度為40°C和d)在pH5-10.5的穩定性。4.分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-3中任一項的多肽的核苦酸序列。5.權利要求4的分離的多核苷酸，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變體核苦酸序列編碼由SEQIDNO:2的胺基酸1至759組成的多肽。6.核酸構建體，其包含權利要求4或5的多核苷酸，所述多核苷酸與一個或多個調控序列可操作地連接，所述調控序列指導多肽在表達宿主中的產生。7.重組表達載體，其包含權利要求6的核酸構建體。8.重組宿主細胞，其包含權利要求7的核酸構建體。9.用於產生權利要求1-3中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益於所述多肽產生的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。10.用於產生權利要求1-3中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益於所述多肽產生的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，其中所述核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。11.分離的多核苷酸，其在至少低嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:l的核苷酸100至2376,(ii)SEQIDNO:l的核苷酸193至1041，(iii)SEQIDNO:l的核苦酸1104至1707，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈。12.酶組合物，其包含根據權利要求1-3的多肽。13.根據權利要求12的組合物，其還包含選自下組的一種或多種酶蛋白酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶、(3-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、a-澱粉酶、葡糖澱粉酶、角質酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質酶、支鏈澱粉酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙醯酯酶、多聚半乳糖酪酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果膠裂合酶、甘露聚糖酶、果膠曱基酯酶、纖維二糖水解酶、轉穀氨醯胺酶；或它們的混合物。14.用於降解含纖維素的生物質的方法，其中用有效量的根據權利要求1-3中任一項的多肽或根據權利要求12或13的酶組合物來處理所述生物質。15.根據權利要求1-3中任一項的多肽或根據權利要求12或13的酶組合物用於降解含纖維素的生物質的用途。16.根據權利要求1-3中任一項的多肽或根據權利要求12或13的酶組合物在洗滌劑組合物中的用途。17.根據權利要求1-3中任一項的多肽或根據權利要求12或13的酶組合物在紡織品整理方法中的用途。18.根據權利要求1-3中任一項的多肽或根據權利要求12或13的酶組合物用於在染色的織物中獲得顏色的局部磨損的用途。19.洗滌劑組合物，其包含權利要求1-3中的多肽或根據權利要求12或13的酶組合物。20.紡織品處理組合物，其包含權利要求1-3中的多肽或根據權利要求12或13的酶組合物。全文摘要本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於產生和使用所述多肽的方法。文檔編號C12P19/00GK101310017SQ200680043004公開日2008年11月19日申請日期2006年11月15日優先權日2005年11月16日發明者凱特傑·S·約翰森,基思·吉布森,普雷本·尼爾森,赫勒·烏特拉普申請人:諾維信公司