製備永久人細胞系的方法

2023-09-18 20:39:20 2

專利名稱：製備永久人細胞系的方法
製備永久人細胞系的方法本發明涉及一種製備永久人細胞系的方法，其中用允許至少 一種細胞 轉化因子表達的序列和允許至少一種重組多肽表達的序列同時轉染分離的 原代人細胞。用於治療、診斷或技術目的的重組多肽在細胞培養(體外)中的製備，通 常在穩定、持久或永久性建立的、其中編碼所述多肽的核酸整合到細胞染色體DNA中的細胞系(所謂生產細胞系)中實施。這些生產細胞系尤其必須 展現兩種特徵性質首先，它們必須持久(永久性)地在細胞培養中生長並且 能夠增殖，其次，它們必須表達編碼期望多肽的基因，而該多肽隨後能夠 從細胞或者從培養上清液中分離。除了細菌之外，特別地，使用酵母和植 物細胞、動物細胞來製備重組多肽。當前全部治療用蛋白質中大約60-70% 是在哺乳動物細胞中製備的(Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398， 2004)。生產細胞的製備通常開始於已經被永生化或轉化，在細胞培養中永 久生長和增殖的細胞系，例如來源於動物的CHO (中國倉鼠卵巢細胞)、BHK (幼倉鼠腎)細胞、NS0 (小鼠骨髓瘤)細胞或人HEK293 (人胚胎腎)細胞或 PER,C6糹田月包。這些細胞系同時已經商品化，它們是從原代細胞通過培養生 成的，實質上是作為通過遺傳操作的生產細胞建立方法的第一步；或者是 從自然腫瘤分離的。在產生實際的生產細胞的情況下， 一方面，通過轉染將編碼重組多肽 的核酸(所謂轉基因)與必要的轉錄調控元件一同轉移到這些已經建立的細 胞系中，另一方面，轉移第二表達盒，該表達盒具有編碼選擇標記的基因， 其基因產物為細胞提供特定的選擇優勢。基因轉移後在沒有選擇試劑的培 養基中培育細胞數天，然後給培養基提供合適的選擇試劑。在選擇試劑的 存在下，只有攝取了用於轉染的核酸並表達選擇標記的細胞方可生存和生 長。常用的選擇標記有新黴素抗性基因、潮黴素抗性基因和二氫葉酸還原 酶(DHFR) (Wurm, Nat Biotechnology 22:1393-1398, 2004; Wurm and Jordan, 309-333 in: Makrides (Eds.)， Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells， Elsevier, Amsterdam, 2003)。
相應地分別在含有選擇試劑，例如新黴素或潮黴素等抗生素，和含有合成糖皮質素甲氨蝶呤的培養基中進行選擇。對於 經過選擇過程後存活並增殖的、具有選擇標記和轉基因的細胞(即所謂轉化體)， 一般隨後加以個體化(individualised)(克隆)以保證培養物中所有的細胞 是遺傳上同 一的，並將具有最佳產率的期望生產細胞系與生產力較差的細 胞系分開。取決於製備過程，可能不但在選擇期中，而且在後來克隆細胞的生長 過程中均必須向培養基中加入選擇試劑，以保證生產細胞系的遺傳穩定性。 期望多肽的基因(轉基因)和選擇標記的基因通常整合到細胞基因組的相同 位點中。如果在隨後的細胞擴增中或製備期中沒有選擇壓力，則會發生細 胞喪失選擇標記一也隨之喪失期望多肽的轉基因一的危險。通過持續添加 選擇試劑來防止這種危險。從生物體或組織取出後投入細胞培養的原代動物和人細胞通常只能短 期生長並經過少數幾次傳代。人細胞特別適於製備人生物治療劑，因為與 其它生物哺乳動物或動物細胞相反，它們可表達具有真實的翻譯後修飾模 式的複雜多肽。與在非人生產系統中生產相比，在使用人細胞生產的情況 下，複雜的重組蛋白的糖基化模式(即分子內糖殘基的結構和構象)會更好地 重現真實人多肽的模式。該糖基化模式在很多時候對於多肽的重要性質例 如生物學活性、穩定性、溶解性和免疫原性而言具有決定性的重要性。從患者的腫瘤組織分離了可用於表達重組多肽的、持久建立的人細胞 系(永久人細胞系)(例如HeLa細胞)。但是，出於安全性相關的考慮，同時 由於它們的遺傳不穩定性，這樣的細胞不適合應用於人體的治療用多肽的 工業生產。除了極少的例夕卜(例如所謂HaCaT細胞)，自發永生化的人細胞 系事實上是不可得到的。相反，用特定病毒基因產物轉化原代組織而產生 的永久人細胞系則適用於生物技術生產的目的。通過表達DNA病毒的轉化 性多肽，可以將原代細胞轉化為永久生長的細胞。轉化的機制需要病毒編 碼的基因產物與在細胞分裂調控中起作用的細胞蛋白(所謂腫瘤抑制基因產 物)相互作用。由此，細胞周期的停滯(G0/G1期)被打斷，細胞進入S期， 導致細胞的失控增殖(Helt & Falloway， Carcinogenesis 24:159-169, 2003)。此 類具轉化性的、由病毒編碼的基因產物的例子有猿猴病毒40 (SV40)的T抗 原、人乳頭瘤病毒(HPV)的E6/E7或者腺病毒的E1A/E1B。這些病毒蛋白質 的轉化機制是類似的T抗原、E6和E1A使細胞視網膜母細胞瘤蛋白家族(pRb)的基因產物失活，T抗原、E7和ElB使細胞腫瘤抑制蛋白p53失活(zur Hausen, J. Natl. Cancer Inst, 92, 690-698, 2000; Ludlow, FASEB J. 7: 866-871， 1993; Moran， FASEB J. 7, 880-885， 1993的綜述)。如此轉化的這些細胞系變 得可以永久培養，特別適用於生物技術生產目的。迄今為止只有極少數人細胞類型已被腺病毒E1基因區域所轉化。其中 包括人胚胎腎組織的神經元細胞(HEK293) (Graham et al.， J. Gen. Virol. 36:59-74, 1977)、人胚胎視網膜細胞(EP 833 934 Bl)和人羊水細胞(EP 1 230 354 Bl)。上述分別基於現有永生化細胞系和轉化細胞系的生產細胞系製備方法 從不同方面帶來了缺陷。在製備之前，在選擇期間，可能還在擴增期間向 培養基添加抗生素、化療劑或其它選擇試劑，會增加製備方法的成本。除 此之外，還需要在分析製備過程中進行繁重的分析工作，並對終產物進行 分析，來確保和證實經過純化和調製(confectioned)的終產物沒有保留任何殘 餘的選擇試劑。這就對質量控制提出了進一步的要求，以保證治療用製劑 的安全性。另外， 一些已被應用的選擇試劑分別對生產細胞的質量和克隆 穩定性顯示影響。例如，在一些生產細胞系中，向培養物中連續添加曱氨 蝶呤作為選擇試劑，可以使細胞在其生產能力上維持被施予的"穩定，，表 型。但是，遺傳分析已經顯示，這種試劑的存在可增加細胞的細胞遺傳異 質性，這是人們所不希望的，尤其是對於認證過程的監管要求而言(Wurmet al" Dev. Biol. Stand. 76:69-82, 1992; Kim and Lee, Biotechnol. Bioeng. 64:741-749， 1999)。經典的生產細胞系產生方法的另 一個缺陷體現在這一事 實，作為生成方法的基礎的現有永久性起始細胞系的選擇是極為有限的(例 如CHO， BHK， HEK293)。所有這些細胞在^皮開發成生產細胞系之前都已經 歷多年培養和無數次傳代並被保存。這些操作總是帶有這樣的危險，即除了最初永生化必需的遺傳改變之外還積累其它染色體異常和遺傳修飾，使 它們越來越不像各自的"天然"動物和人起始細胞。這些變化對於重組蛋 白基因工程的安全性相關和/或生產技術方面可能造成的後果至今還沒有得 到詳細的分析。因此，作為本發明基礎的問題是提供一種更筒單、更划算，並且在毒 性方面更為安全的方法，來製備用於生產重組多肽的永久人細胞系。 該問題通過專利權利要求中定義的主題來解決。下面的


了本發明。圖1示意性地顯示用於表達E1基因功能及腺病毒血清型5病毒結構蛋 白pIX的質粒pGSl 19之組成(assembly)。圖2示意性地顯示用於在巨細胞病毒(CMV)啟動子控制下表達人a 1-抗胰蛋白酶(hAAT) cDNA的質粒pGSl 16之組成。圖3顯示在7種不同的基於羊水細胞的人a 1-抗胰蛋白酶永久性生產細 胞系中針對Ad5 E1A和E1B蛋白表達的Western印跡結果。抗胰蛋白酶蛋白(hAAT)表達的Western印跡結果。A，從細胞分泌到培養上 清液中的hAAT; B,細胞內的hAAT。圖5示意性地顯示培養上清液中由選定的生產細胞系所表達的人a 1-抗胰蛋白酶蛋白(hAAT)的量(ELISA，酶聯免疫吸附測定)。A，各個細胞克 隆第5代中的hAAT的量；B，選定的細胞克隆中經過數次傳代的穩定性。圖6顯示針對來自基於羊水細胞的生產細胞系的人a 1-抗胰蛋白酶蛋 白的糖基化的Western印跡分析結果。本文所用的術語"羊水細胞"以最廣泛的意義涉及存在於羊水(amniotic liquor)中，並可通過羊膜腔穿刺術(amniocentesis)獲得的所有細胞。它們或 者來源於羊膜，或者來自與羊水接觸的胎兒組織。已經描述了可以根據形 態學標準加以區分的三類主要的羊水細胞成纖維細胞樣細胞(F細胞)、上 皮樣細胞(E細胞)和羊膜液細胞(AF細胞)(Hohn et al,, Pediat. Res. 8:746々54, 1974)。 AF細胞是主要的細胞類型。來自羊膜腔穿刺(例如為細胞遺傳學診 斷而進行的)的細胞可充當羊水細胞的來源。此外，對於妊娠中採耳又的羊膜 腔穿刺的細胞，如果羊水的量高於平均(羊水過多(polyhydramnion, hydramnios))，可以作為羊水細胞的來源。術語"表達盒"，具體地分別涉及這樣的核酸分子和核酸分子之區域， 其分別含有位於編碼區域之前的調控元件或者啟動子、編碼區域和可讀 框、和位於編碼區域之後的轉錄終止元件。分別位於編碼區域之前的調控 元件和啟動子可以是組成型的，即為永久性地活化轉錄的啟動子(例如CMV 啟動子)，或者為可調控的啟動子，即可以被開啟和/或關閉的啟動子(例如 四環素可調控的啟動子)。表達盒的編碼序列可以是連續的可讀框，如同5， 端具有起始密碼子、3，端具有終止密碼子的cDNA那樣。編碼區域可以由編碼外顯子及間插的非編碼內含子的基因組排列或者新組合的排列所構成。但是，表達盒的編碼區域可以由數個可讀框構成，它們之間由所謂IRE(內部核糖體進入位點)隔開。術語"永久細胞系"(permanent cell lines),如本文所用的，涉及以這樣 的方式被遺傳修飾，使其可以在細胞培養中於穩定的培養條件下永久持續 生長的細胞。這樣的細胞又稱為永生化(immotalized)細胞。術語"多肽，，或者"重組多肽"，如本文所用的，涉及由至少2個氨 基酸組成的肽。多肽可以受到共翻譯修飾和/或後翻i斧修飾，例如通過附接 糖殘基或通過修飾胺基酸殘基而修飾。多肽可以是線性、環狀或分枝的。 另外，多肽可由多於一條胺基酸鏈組成，其中這些鏈可以通過分子內和/或 分子間4定而形成或多或少的複雜三維結構(例如二級、三級、四級結構)。如 果多肽是由 一條胺基酸鏈構成的，它也可以通過分子內鍵形成或多或少的 複雜三維結構。多肽可以是藥理學或免疫學活性的多肽，或者是用於診斷 目的的多肽。術語"原代細胞，，，如本文所用的，涉及通過直接從生物體或組織移 出並置於培養中而獲得的細胞。原代細胞僅顯示很有限的壽命。原代細胞 可以是例如羊水細胞、神經元細胞或視網膜細胞。術語"生產細胞系"(production cell lines),如本文所用的，涉及通過導 入編碼待生產的期望多肽的轉基因而被遺傳修飾的永久細胞系。術語"選擇標記，，(selection marker),如本文所用的，涉及為細胞提供 在選擇條件下生長的優勢的遺傳標記。所述的選擇條件可以是，例如，培 養基中化學治療劑或抗生素或者其它細胞毒性物質或生長幹擾物質的存 在。常用的選擇標記是新黴素抗性基因、潮黴素抗性基因和二氫葉酸還原 酵。術語"轉染，，(transfection),如本文所用的，涉及任何適於將述及的核 酸導入細胞中的方法。作為例子，包括經典的磷酸鈣法、電穿孔、任何類 型的脂質體系統，以及這些方法的組合。術語"轉基因"，如本文所用的，涉及編碼重組多肽的核酸序列。 本發明的一個方面涉及一種製備永久人細胞系的方法，其中用 一種核 酸分子或者至少兩種不同的核酸分子轉染分離的原代人細胞，並且在轉染 一種核酸分子的情況下，核酸分子顯示允許至少一種細胞轉化因子表達和重組多肽表達的序列；在轉染至少兩種不同核酸分子的情況下，第一種核 酸分子顯示允許至少一種細胞轉化因子表達的序列，第二種核酸分子顯示 允許至少一種重組多肽表達的序列。通過直接從生物體或者分離自生物體的組織移出而獲得用於本發明方 法的原代人細胞，並投入培養。優選的是可通過細胞轉化因子的表達而良 好地轉化為永久人細胞系的原代人細胞，尤其是羊水細胞、胚胎視網膜細 胞和神經元來源的胚胎細胞。細胞轉化因子可以是SV40的T抗原(GeneBank登錄號J02400)、 HPV 的E6和E7基因產物(例如HPV16, GeneBank登錄號K02718)、和人腺病毒 的E1A和E1B基因產物(例如人腺病毒血清型5, GeneBank登錄號 X02996)。如果本發明的方法使用E6和E7基因產物的核酸序列，則必須用 這兩種基因產物的序列轉染原代人細胞。如果本發明的方法使用E1A和 E1B基因產物的核酸序列，則必須用這兩種基因產物的序列轉染原代人細 胞。在通過天然存在的HPV來進行表達的場合，可以從RNA轉錄本表達 E6和E7。對於通過天然存在的腺病毒表達E1A和E1B也是如此。細胞轉 化因子(例如腺病毒E1基因功能)導致細胞的永生化或者轉化，從而導致它 們可持久培養的能力。未轉染的原代人細胞在培養中至少經數周后即自然 死亡，而轉染的細胞則由於永生化活性(例如El基因產物的永生化活性)而 擴增成為表型上可識別的細胞集落。於是，在本發明方法中，細胞轉化因 子的轉移(這種轉移對細胞的永生化是至關重要的)就擔負了選擇標記的功 能，該選擇標記使得人們能夠在沒有任何附加的外源化學選擇壓力的條件 下分離細胞系，其中所述細胞系表達一種或多種不同的重組多肽。因此， 本發明特別地涉及無需轉染選擇標記的永久人細胞系製備方法。用於表達細胞轉化因子的核酸序列以表達盒的形式存在。表達盒可分別含有同源啟動子和轉錄終止序列，例如用於表達腺病毒 E1A基因功能的天然E1A啟動子和天然E1A聚腺苷酸化位點。如果轉染所 用的核酸分子含有各自病毒基因組的片段，例如顯示所述基因功能的腺病 毒基因組的片段，例如E1A、 E1B,這是可以實現的。細胞轉化因子的表達 盒還可含有不與所用編碼區或者轉錄終止序列 一起天然存在的異源啟動 子。可作為異源啟動子的有，例如CMV(巨細胞病毒)啟動子(Makrides， 9-26 in: Makrides (Eds.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier:Amsterdam, 2003)、 EF-1啟動子(Kim et al., Gene 91:217-223, 1990)、 CAG啟 動子(來自人巨細胞病毒立即早期增強子及具有第 一 內含子的修飾的雞卩肌 動蛋白啟動子的雜合啟動子)(Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991)、人或鼠 pgk (磷酸甘油酸激酶)啟動子(Adra et al., Gene 60:65-74， 1987)、 RSV (勞氏肉 瘤病毒)啟動子(Makrides, 9-26 in: Makrides (Eds,)， Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)或者SV40沐猴 病毒40)啟動子(Makrides, 9-26 in: Makrides (Eds.)， Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)。 可4乍為聚A泉香酉臾 化位點的有，例如SV40大T抗原(GeneBank登錄號J02400)的聚腺香酸化 位點或者人G-CSF (粒細胞集落刺激因子)基因的聚腺苷酸化位點 (Mizushima and Nagata, Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990)。同樣地，有些表達 盒可含有用於轉化因子的同源調控元件及其它異源調節元件。即，EIA表達盒可以例如顯示異源啟動子，而E1B表達盒可顯示同源啟動子，或者相 反；或者兩個表達盒均顯示異源啟動子。用於表達至少一種重組多肽的核酸序列也存在於至少一種表達盒中， 其中啟動子和轉錄終止序列的種類和選擇與上述用於細胞轉化因子的那些 對應。細胞轉化因子和重組多肽的核酸序列，包括各自的調控元件，可以存 在於一個核酸分子上或者數個不同的核酸分子上。在本發明一個優選的實 施方案中，包括各自調控元件的細胞轉化因子的序列，例如E6和E7基因 功能或者EIA和E1B基因功能，或者細胞轉化因子例如SV40的T抗原的 序列，存在於一個核酸分子上，而包括調控元件的重組多肽的序列存在於 不同於前一核酸分子的第二個核酸分子上。在另一個優選的實施方案中， 細胞轉化因子E6與E7，以及E1A與E1B的序列，包括其各自的調控元件， 存在於不同的核酸分子上。在此情況下，包括調控元件的重組多肽序列可 以存在於不同於上述第一個和第二個核酸分子的第三個核酸分子上，或者 可以存在於第一個或第二個核酸分子上，構成(comprising)所述細胞轉化因 子之一的序列。在一個優選的實施方案中，用含有E1A和E1B基因功能之 表達盒的第一種核酸分子和顯示重組多肽之表達盒的第二種核酸分子轉染 原代人細胞，其中第二種核酸分子不同於第一種核酸分子。在這個實施方 案中，第一種核酸分子含有E1A表達盒，該表達盒含有異源啟動子和同源轉錄終止元件；而E1B轉錄單元含有同源啟動子和同源轉錄終止元件。在 一個特別優選的實施方案中，第一種核酸分子含有從核苷酸505到核苷酸 4079的腺病毒血清型 5核苷酸序列。在另 一 個特別優 選的實施方案中，第一種核酸分子含有從核苷酸505到核苷酸3522的腺病 毒血清型5核苷酸序列。在另一個特別優選的實施方案中，第一種核酸分 子含有從核苷酸1到核苷酸4344的腺病毒血清型5核苷酸序列，對應於 HEK293細胞的腺病毒DNA (Louis et al., Virology 233:423-429， 1997)。在這個實施方式的情況下，E1B啟動子和E1B聚腺苷酸化序列(核苦酸 4037-4070)的存在可能導致E1B的最優轉錄和表達。另一個優勢在於EIB 終止密碼子和EIB聚腺苷酸化位點之間的序列區域含有腺病毒pIX基因功 能。pIX多肽是一種病毒結構蛋白質，它在不同的病毒和細胞啟動子(例如 胸苷激酶和p-珠蛋白啟動子)上充當轉錄活化物。如果重組多肽的編碼序列 處於上面提到的啟動子之一的控制下，則細胞中附加表達的pIX多肽的轉 錄活化效應可導致本發明的生產細胞系中重組多肽的表達率(expression mtes)增力口。重組多肽可以是治療用蛋白，例如人al抗胰蛋白酶或者生長因子例如 紅細胞生成素或白細胞介素-2。人al抗胰蛋白酶(hAAT)是一種蛋白酶抑制 劑，它抑制彈性蛋白酶和其它蛋白酶，在導致嚴重肺和肝損害的遺傳性 hAAT缺陷中具有治療活性。紅細胞生成素是紅細胞(紅血球)的重要生長因 子，在貧血的場合以及移植患者的場合具有成血(bloodforming)活性。白細 胞介素-2 (n-2)是免疫系統的一種細胞信使，在細胞免疫應答活化的場合， 例如在肺瘤疾病的情況下，其具有顯著的重要性。凝血因子，例如治療具 有凝血障礙的血友病患者時使用的因子VIII和IX,也屬於治療活性多肽。 根據本發明方法的重組多肽可以是激素。在具有激素性病症的患者的場合， 在替代療法中使用生物技術工程化的激素。例子有降低血糖的激素胰島 素，許多糖尿病患者依賴於該激素；用於治療侏儒症的促生長素 (somatotropin ， growth hormone)，和用於治療生育障礙的促性腺因子 (gonadotrope factors)例如促卵泡激素(FSH)或黃體化激素(LSH)。重組多肽可以是重組抗體，其可用於治療或診斷目的。針對腫瘤壞死 因子a (TNF-a)的抗體用於類風溼性關節炎患者的場合，針對表皮生長因子 細胞受體(EGFR)的抗體用於癌症患者的場合。用於診斷目的的抗體可以是，例如，基於酶聯免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫吸附測定(RIA)等方法的商 品化診斷試劑盒的組成部分。在這些試驗測定法中，抗體用於檢測感染原 例如人B型肝炎病毒的抗原。抗體或者免疫球蛋白(Ig)由重鏈和輕鏈構成，重鏈和輕鏈各自由可變和 恆定區或域構成。用於表達抗體的轉染核酸分子的核酸序列可含有兩個分 別的(separated)表達盒，其中一個編碼免疫球蛋白的輕鏈，另一個編碼免疫 球蛋白的重鏈。在本發明的抗體中表達兩條鏈時，這些鏈組裝成活性抗體不過，輕鏈和重鏈的編碼序列可以存在於同一表達盒內並由IRES序歹'j(內 部核糖體進入位點)所分隔，該IRES序列可用於實現重鏈和輕鏈的同時表 達。輕鏈和重鏈的編碼序列在大體上(in principle)還可以存在於同一表達盒 內並由編碼蛋白酶(例如凝血酶)酶切位點的序列分隔，所述蛋白酶同時在細 胞中表達，將由重鏈和輕鏈的序列構成的前體多肽切割成活性的輕鏈和重 鏈。由本發明細胞的核酸序列編碼的重組抗體還可以由抗體片段，而不是 完整的輕鏈和重鏈所構成。所謂單鏈抗體(scFv,單鏈可變片段)是由一個重 鏈可變域、 一個輕鏈可變域、以及連接這兩個域並為它們提供自由運動性 的胺基酸序列(所謂"接頭")所構成。這兩個域的分子內組裝形成抗原結合 結構，該結構對應於免疫球蛋白分子的可變區。雙特異性單鏈抗體(bis-scFv) 由兩個這樣的單鏈組裝體構成，組裝體由重鏈和輕鏈的可變域組成，這些 可變域通過連接序列連結並且可以彼此相對運動；這樣的分子可以同時結 合兩個抗原結合位點(表位)從而以非共價方式連接兩個分子結構。雙特異性 雙抗體由分別表達的兩條單鏈構成，每條單鏈由輕鏈可變域和重鏈可變域 構成，輕鏈可變域和重鏈可變域僅由非常短的接頭分隔開或者根本沒有接 頭。短接頭或者缺少接頭抑制分子內組裝；通過重鏈可變域和輕鏈可變域 的分子內組裝再一次形成具有兩個結合價的活性分子。在本發明方法中轉染的核酸分子所編碼的重組多肽可以是要製備用作 預防性或治療性疫苗的病毒蛋白、細菌蛋白或者寄生蟲蛋白。這些蛋白可 以是來自病毒、細菌或寄生蟲的結構性多肽和調控性多肽或酶活性多肽。 病毒蛋白可以是，例如，B肝病毒表面抗原(HBV表面抗原)或者來自人乳 頭瘤病毒的結構性蛋白Ll。考慮在生產細胞系中表達後用於生產疫苗的細菌蛋白有，例如，來自產腸毒素性(enterotoxinogeneous)大腸桿菌(Escherichia coli)的腸毒素亞單位(ETEC)或來自淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的 運鐵蛋白結合蛋白(Tbp A和B)。來自寄生蟲的多肽(這些多肽可以被本發明 方法中轉染的核酸分子所編碼)有例如症疾致病原惡性痴原蟲(Plasmodium falciparum)的裂殖子表面蛋白(MSP),或者來自日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的穀胱甘肽S轉移酶(GST)。本發明方法中轉染的核酸分子所編碼的重組多肽可以是一種或多種這 樣的病毒多肽它們具有複製因子活性，使得隨後通過轉染導入人細胞系 中的核酸分子能夠在該細胞系中進行附加型複製，即獨立於染色體的複製。 隨後通過轉染導入細胞系中的核酸分子含有稱為"複製起點"(ori)的基因元 件，充當複製因子的多肽結合該元件，從而起始附加型核酸分子的複製。 核酸分子，尤其是質粒DNA在細胞中的附加型複製導致;故轉移的核酸分子 的拷貝數激增，從而增加由該分子編碼的重組多肽的表達及其在多次細胞 分裂中的維持。這樣的病毒複製因子是，例如，猿猴病毒40 (SV40)的T抗 原，它在結合於核酸分子(例如質粒DNA)上稱作SV40複製起點(SV40 ori) 的序列時，起始其複製。Epstein-Barr病毒蛋白EBNA-1 (Epstein-Barr病毒 核抗原-l)識別稱為ori-P的複製起點，並催化攜帶ori-P的核酸分子的染色 體外複製。本發明的方法中轉染的核酸分子所編碼的重組多肽也可以是用於在細 胞系中產生重組病毒基因轉移載體的病毒蛋白。這些病毒蛋白，又稱為互 補因子(complementation factors),在細胞系中被表達，並且是產生基因轉移 載體所必需的酶組分或結構組分，這些組分沒有被編碼在基因轉移載體的 核酸分子上。在這樣的基因轉移載體中，往往出於安全考慮而刪除某些病 毒基因功能。基因轉移載體的互補因子可以由通過上述方法導入的轉基因 所編碼；基因轉移載體的例子有基於腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)或者皰滲病 毒的載體。細胞系中表達的互補因子還可以在缺失病毒或重組病毒的產生 過程中補全這些病毒，這些病毒不含有要轉移的基因，因此不充當基因轉 移載體，而是用作例如疫苗。在基於腺病毒的基因轉移載體的場合，例如基因功能pIX、 E2、 E3和/ 或E4可以在本發明的細胞中表達。從載體基因組刪除上述各基因功能可提 高載體的安全性，並提高其攝取不相關的核酸序列的能力。基因功能pIX13是一種腺病毒結構蛋白，即病毒核殼的組分。病毒基因功能E2、 E3和E4 編碼調控性多肽，這些多肽在病毒複製的早期階段中被表達。第一代的腺 病毒載體僅僅刪除了 El和/或E3。第二代的腺病毒載體還缺少基因功能E2 和/或E4。補全所有病毒基因功能的細胞系大體上可具有補全被稱為"無內 容"(gutless)載體或稱高容量腺病毒載體的一代腺病毒基因轉移載體的能 力，這些載體不再含有任何編碼基因功能，而只具有用於載體核酸複製的 序列，這樣的序列稱為反向末端重複(ITR)。通過本發明的方法轉染到原代人細胞的核酸可以進一步編碼受體多 肽，該多肽尤其定位於細胞表面，分別負責病毒對細胞的感染和病毒基因 轉移載體對細胞的轉導。作為以腺病毒血清型2或5 (最常規的腺病毒載體 衍生自這兩種血清型)感染細胞的最初步驟所用的病毒受體，鑑定了所謂柯 薩奇病毒和腺病毒受體(Coxsackie and adenovirus receptor)， 即 CAR (Bergelsonetal., Science 275:1320-1323, 1997)。 CAR在表面上的足量表達是 細胞適合用作腺病毒基因轉移載體生產細胞的先決條件。在一個優選的實 施方案中，重組多肽是柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)。受體多肽的過度表 達能夠顯著改善可感染性(infectibility),從而顯著提高這些細胞對腺病毒載 體的生產效率。此外，核酸分子除了 CAR之外，還可以編碼次級受體 (secondary receptors)或者內在4b受體(internalizing receptors), 例如某些整洱關 蛋白，它們分別介導細胞對病毒和基因轉移載體的攝入，它們的額外表達 對於製備腺病毒載體的生產細胞是有利的。本發明的方法中用於轉染原代人細胞的核酸分子(這些核酸分子編碼至 少一種重組多肽)，或者編碼細胞轉化因子的核酸分子，可以含有"基質附 著區"(matrix attachment regions, MAR)。這些基因元件又稱"支架附著區" (scaffold attachment regions, SAR)，在基因表達的調控中起作用，因為它們 與基因組中的轉錄單位和調控元件相關。MAR能夠保護整合到細胞中的外 來基因不受轉染細胞內的轉錄沉默(muting)或轉錄關閉(shut-off)的作用，從 而提高它們的表達(Girod and Mermod, p. 359-379， in S.C. Makrides (Eds.) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. 2003. Elsevier, Amsterdam)。通過以含有如下所述的核酸序列的核酸分子同時轉染原代人細胞，發 明人成功地製成了用於在不添加選擇試劑的情況下生產重組多肽的永久人細胞系，其中所述核酸序列分別是細胞轉化因子和兩個功能上關聯的因
子的可表達核酸序列，以及至少一種重組多肽的可表達核酸序列。由此， 本發明進一步涉及一種製備用於表達至少一種期望多肽的永久細胞系的方 法，優選不轉染選擇標記。所述細胞可用於製備治療用多肽、凝血因子和 生長因子、激素和抗體，以及供用作疫苗的病毒多肽、細菌多肽或寄生蟲 多肽，及其它。另外，根據本發明的細胞可用於製備診斷上有意義的蛋白 質，例如病毒抗原、細菌抗原或寄生蟲抗原或它們各自的特異性抗體。另 外，本發明的細胞可用於生產技術上或工業上有意義的蛋白質，例如用於 催化技術合成過程或者降解有害物質的酶。本發明的細胞可表達一種或者 多種不同的重組多肽。可表達的多肽數目取決於使用本發明方法轉染到細 胞中的編碼重組多肽的不同核酸序列有多少。
生產細胞中轉基因表達的強度，關鍵取決於轉基因導入細胞後所整合 到的基因組中的區域。雖然在細胞基因組的某些位點上，轉基因的表達在
相對較短的時間後即被關閉，但在另 一些位點，即所謂轉錄"熱點"(hot spots) 上，表達盒在長時間內保持高效率的轉錄活性。為了維持根據本發明製備 的永久細胞中的轉化表型，要求細胞轉化因子的持續表達。因此，在永久 人細胞中，各個表達盒的整合位點處於細胞基因組中的"熱點"上。由此， 本發明的另外一個方面涉及一種製備永久人細胞的方法，其中，顯示細胞 轉化因子序列的核酸分子進一步包含序列特異性重組酶的識別序列。在後 續的步驟中，可以將另外的轉基因表達盒整合到永久人細胞系中，而同時 表達特定的(respective)重組酶，其中該表達盒還含有一個或多個特定 (respective)重組酶識別序列。由此使得該表達盒整合到特定的"熱點，，中， 從而使轉基因得以持久高表達。通過所述方式製備的、具有確定的高生產 效率的生產細胞系，可以用來快速生成用於另 一種轉基因的高效生產細胞。 本發明的另 一個方面涉及通過對整合位點的序列分析來分離這些特定的 "熱點，，，以及它們在表達載體中的用途。藉此可以從人細胞中分離迄今 未知的熱點序列。可以通過同源重組將特定表達盒整合到這些序列中。
本發明的另 一個方面涉及一種製備永久人細胞系的方法，其中展示允 許重組多肽表達之序列的核酸分子，除了該重組多肽的表達盒或者該重組 多肽的編碼序列之外，還顯示一個或多個重組酶識別序列。例如，重組酶 識別序列可以位於特定(respective)序列的5'末端和3，末端。在此情況下，重組多肽可以是報導基因，即具有易於識別和定量測定的基因表達產物的基 因。選擇具有報導蛋白(即報導基因編碼的基因產物)強表達的穩定細胞系之 後，可以通過作為另 一步驟的轉染將包含另 一重組多肽表達盒的核酸分子 整合到細胞中。該表達盒也含有同一重組酶的識別序列。在短期表達重組 酶後，通過原重組多肽的切除及新轉染到細胞中的重組多肽的整合，將生 成亦具有高生產效率的新生產細胞系。這種方法縮短了篩選良好表達的細
胞系的耗時過程。重組酶及其各自的識別序列例子有來自噬菌體P1的 Cre重組酶和loxP識別序列、來自噬菌體cJ)C31的整合酶和attB/attP識別序 列、或來自酵母的Flp重組酶和frt識別序列(Groth et al.， PNAS 97: 5995-6000: 2000; Araki et al., Nucl. Acids Res. 25: 868-872, 1997; O'Go腿n et al" Science 251: 1351-1355, 1991)。 4艮多時候，"偽，，lox (Araki et al., Nucl. Acids Res. 25: 868-872, 1997)或"偽，，att (Thyagarajan et al" Mol. Cell Biol. 21: 3926-3934， 2001)而非真實識別序列，對於高效整合是有利的。
下面的實施例舉例說明了本發明，不應視為限制性。除非另外指出， 使用標準的分子方法，例如Sambrook et al" 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.中描述的方法。
1.克隆方法
a) 質粒pSTK146
質粒pSTK146在EP 1 230 354 Bl有詳細描述，包含鼠磷酸甘油酸激酶 (pgk)啟動子，腺病毒血清型5 (Ad5)序列核苷酸(nt.) 505至3522，和SV40 的剪接和聚腺苷酸化信號。
b) 質粒pGS119 (圖1)
質粒pGS119含有鼠pgk啟動子、含有整個El區的Ad5序列nt. 505-3522, SV40的3，剪接和聚腺苷酸化信號，和Ad5的pIX區 (nt.3485-4079)。
Ad5 pIX基因序列來自含有Ad5序列nt.22-5790的質粒pXCl (Microbix Biosystems Inc, Catalogue No. PD-01-03)。 4吏用該質粒和引物p9.3485匿3504 (CTGGCTCGAGCTCTAGCGATGAAGATACAG;SEQIDNO:l)和p9.4079-4060 (GCTGCTCGAGCACTTGCTTGATCCAAATCC; SEQ ID N0:2) 通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增Ad5基因序列nt. 3485-4079,用Xhol切割(每 個引物含有一個Xhol限制位點)，並導入pSTK146的Xhol限制位點。
c)質粒pGS122
質粒pGS122含有Ad5序列bp 1-4344。在第一個步驟中，利用SacII 消化從pXCl (Microbix Biosystems Inc， Catalogue No. PD畫01隱03)分離Ad5序 列nt. 356-3826，並導入pSTK31的SacII限制位點(含有Pmel限制位點，後 續pBluescript中的Ad5序歹'j bp 1-400)。將如此產生的質粒pGS120用BstEII 線性化，然後導入含有Ad5序列bp 1914-5185的來自pXCl的BstEII片段 (pGS121)。 將兩個寡核苷酸 Ad5_4297-4344.PX
TTGCCAGTTTAAAC; SEQ ID NO:3) 和 Ad5—4344-4297
ACCACGCCCAGCT; SEQ ID N0:4)雜交形成雙鏈。用Afel和Xhol消化質 粒pGS121,並將上述寡核苷酸導入。所述寡核苷酸序列的選擇使得導入 pGS131時5，末端的Afel限制位點被保留，而在3'末端Pmel限制位點之後 跟隨再生的Xhol限制位點。這樣，pGS122中的Ad5序列就直接側翼鄰接 著一個PmeI限制位點。
d)質粒pGS124
質粒pGS124含有SV40啟動子和SV40 T抗原的基因序列。通過用 Bamffl和Kpnl消化SV40 DNA，從SV40基因組切出 一個3 kb片段並將其 導入經Bamffl和Kpnl消化的pBluescript。這樣，質粒pGS124表達SV40 T抗原。
e)質粒pGS116 (圖2)， pGS129， pGS131， pGS132， pGS133
質粒pGS116、 pGS129、 pGS131、 pGS132和pGS133在不同啟動子控 制下表達人al抗胰蛋白酶(hAAT)。
質粒pGS116(圖2)含有人巨細^^病毒(CMV)早期啟動子，後隨SV40剪 接供體/剪接受體位點，hAAT-cDNA和SV40聚腺苷酸化位點(polyA)。 CMV和SV40序列來自質粒pCMVp (BD Clontech, Catalogue No. 6177-1)。通過 Notl消化然後進行5'突出端填平反應來刪除pCMV卩中的p-半乳糖苦酶基 因並代之以hAAT cDNA,該hAAT cDNA是從質粒Ad/PGK-hAAT (Kay et al.: Hepatology 21:815-819, 1995)通過EcoRI消化而分離的。
質粒pGS129含有處於人延伸因子EF-la啟動子控制之下的上述hAAT cDNA。通過Xhol和EcoRI消化pGS116然後進行5'突出端填平反應來刪 除pGS116中的CMV啟動子並代之以含EF-la啟動子的1.3 kb片段。
質粒pGS131含有在由CMV增強子和雞卩肌動蛋白啟動子構成的雜合 啟動子(CAG啟動子)控制下的hAAT cDNA。通過用Xhol和EcoRI消化， 隨後進行5，填平反應，用1.1 kbCAG啟動子取代CMV啟動子。
質粒pGS 132含有在勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子控制下的hAAT cDNA。 通過用Xhol和EcoRI消化隨後進行5'突出端填平反應刪除pGS116中的 CAG啟動子，並代之以0.58kbRSV啟動子。
在質粒pGS133中，hAAT cDNA的表達受猿猴病毒40 (SV40)早期啟動 子的控制。通過用Xhol和EcoRI消化，隨後進行5，突出端填平反應，刪除 pGS116中的CMV啟動子並代之以0.23 kb SV40啟動子。
f) 質粒pGS126
質粒pGS126含有下列元件由pkg啟動子、Ad5序列nt. 505-3522、 SV40 polyA組成的El表達盒，由Ad5序列nt. 3485-4079組成的pIX表達 盒，和由CMV啟動子、hAATcDNA、 SV40 polyA組成的hAAT表達盒。 通過用EcoRI和HindIII消化pGS116 (見1 e)然後進行填平反應分離hAAT 表達盒，並導入經過BamHI消化和5，突出端填平反應的質粒pGS119(見1 b) 中。由此，質粒pGS126表達Ad5El和pIX蛋白及hAAT。
g) 質粒pGS123
質粒pGS 123除了 hAAT表達盒外，還含有基質相關區(matrix associated region, MAR)。該MAR定位於來自人AAT基因座位的內含子區域的2085 bp 的EcoRI/Spel片段(GenBank登錄號K02212)中。該片段克隆在pBluescript 中(pGS58),並在pGS116 5'突出端填平反應後將其導入EcoRI限制位點中 (見1 e)。h)質粒pGS127
質粒pGS127含有CMV啟動子、人紅細胞生成素(Epo) cDNA和SV40 polyA序列。通過Notl消化從pCMVp去除(3半乳糖苷酶基因並代之以Epo cDNA。
2. 構建體的JiHi
a) 序列分析
通過限制消化檢驗上述所有質粒的完整性。此外，通過序列分析證實 了 pGS119、 pGS122和pGS126中腺病毒片段的正確序列；未發現序列相比 於Ad5野生型有所改變。
b) 表達
將質粒pGS 116 、 pGS 129 、 pGS 131 、 pGS 132 、 pGS 13 3 、 pGS 123和pGS 126 轉染到HEK293細胞中，並利用ELISA (見6b章)檢測人al抗胰蛋白酶 (hAAT)的表達和向培養上清液中的分泌。
將質粒pGSl 19和pGS122轉染到HeLa細胞中，使用單克隆抗體進行 Western印跡來分鬥斤E1A蛋白的表達。
將質粒pGS124轉染到HeLa和HEK293細胞中，使用Western印跡和 單克隆抗體(Abcam, Cambridge, UK)來檢測T抗原的表達。
3. 細胞培養
a) 細月包系
除非另有說明，細胞培養試劑獲自Invitrogen GmbH公司。HEK293和 HeLa細胞在含10。/。胎牛血清(FCS)、 1 x青黴素/鏈黴素的改進的Eagle's Medium (MEM)中於37°C 、 95%溼度和5% C02的條件下培養。
b) 原代羊水細胞
在羊膜穿刺術中根據常規方法獲得原代羊水細胞。將這樣的羊膜穿刺 液(puncture) 1-2 ml用5ml Ham氏F10培養基、10%FCS、 2% Ultroser G (CytoGen GmbH)、 lx抗生素/抗真菌劑在37°C 、 95%溼度和5% C02的條件下於6 cmPrimaria細胞培養皿(Falcon)中培養。4-6天後羊膜細胞開始貼壁， 添加3ml含添加劑(如上)的新鮮培養基。 一旦細胞完全貼壁，即除去培養基 並換成5 ml加添加劑的新鮮培養基。對於進一步的傳代，將匯合的細胞用 PBS洗滌，用胰蛋白酶(TrypleSelect, Invitrogen)解離，分別轉入10和25 ml 的加有添加劑的新鮮培養基中，分別加入10和25 cm亞中。
4.原代羊水細胞的轉染和轉化
通過轉染不同組合的上述質粒來轉染原代羊水細胞，分離轉化的細胞 系並分析其轉基因的表達。下面，詳細描述使用質粒pGS116和pGS119產 生hAAT表達細胞系。以同樣方式使用下面的核酸組合產生了其它細胞系
-pSTK146 (含有Ad5序列nt, 505-3522)和pGSl 16 (含有CMV-hAAT 表達盒)
-pGSl 19 (含有Ad5序列nt. 505-4079)和pGS129 (含有EFla hAAT表 達盒)
-pGS 119和pGS 131 (含有CAG hAAT表達盒)
-pGS 119和pGS32 (含有RSV hAAT表達盒)
-pGS 119和pGS 133 (含有SV40 hAAT表達盒)
-pGS 119和pGS 123 (含有CMV hAAT表達盒和MAR序列)
-pGS122 (含有Ad5序列nt. l-4344)和pGSl 16 (CMV hAAT表達盒)
-pGS126 (含有Ad5序列nt. 505-4079和CMV hAAT表達盒)
-pGSl 19和pGS127 (含有CMV-Epo表達盒)
-pGS124(表達T-Ag)和pGS116
為了轉染，在轉染之前通過用合適的限制性核酸酶消化將除pGS122之 外的所有質粒線性化。在轉染前用Pmel消化質粒pGS112,因為pGS112 中的腺病毒序列分別側翼鄰接一個PmeI限制位點。當轉染兩種質粒時，每 種質粒使用1嗎；當只用一種質粒(pGS126)轉染時，使用2嗎。用所有核 酸組合均可以獲得轉化細胞克隆，並且可以分離和測試單克隆。轉化細胞 克隆的數目依賴於所用的編碼細胞轉化因子的核酸分子。因此，使用質粒 pGS119時獲得的轉化細胞克隆令人驚訝且出人意料地顯著多於使用 pSTK146時獲得的轉化細胞克隆。此外，使用具有E1作為細胞轉化因子的 核酸分子進行轉化導致轉化細胞克隆顯著多於用表達SV40 T抗原(pGS 124)轉染所得的轉化細胞克隆。重組多肽的表達則依賴於所用的啟動子，其中
pGS133中使用SV40導致最低的表達率。
下面，詳細描述使用質粒pGS 116和pGS 119生成表達hAAT的細胞系。 轉染之前，使羊水細胞適應於含2% Ultroser的Opti-Pro培養基。為此 目的，每2-3天以75:25%、 50:50%、 25:75%和0:100%向細胞添加新鮮Ham 氏F10培養基(含添加劑)+ Opti-Pro培養基(含2% Ultroser)。
對於轉染，將一個大約80%匯合的15 cm培養皿的細胞分配到6 cm培 養皿上，相應於每個培養皿5-7 x 105個細胞的細胞數。第二天，使用轉染 試劑Effectene(Qiagen)，根據製造商的規程，用1 pg的pGS116和pGS119 (均 經過Scal線性化)轉染5個培養皿上的細胞。對一個培養皿不進行轉染，培 養用作對照。次日，用PBS洗滌細胞，用TrypleSelect將細胞解離，並轉移 到15cm培養亞中。將細胞再培養10-15天，其中每3-4天用新鮮培養基更 換培養基。在此過程中，Ultroser的添加減少到1%。大約10-15天後，細胞 匯合，將它們轉移到15cm培養皿中，如上所述。
5. 轉化細胞克隆的分離
轉染後數周，可觀察到克隆細胞島(clonal cell islands),這些細胞在形態 上顯著不同於未轉化的羊水細胞。挑取這些細胞島並轉移到24孔培養皿上 (對應於第l代)。進一步增殖細胞，並將它們先轉移到6cm培養皿中， 而後轉移到15 cm培養皿中。
最初，有大約40個克隆被分離，在進一步培養中，它們部分地在形態 上彼此顯著不同。這些克隆中有一些在長期培養的情況下表現出顯著的"危 機"，即它們的生長非常不穩定。進一步的實驗限於對7個形態上穩定的 細胞克隆的進一步培養和分析。這些克隆命名如下2AL2、 2AI.3、 2AI.6、 2AU2、 2AI.15、 2AU7、 2AU8。
6. 細胞系的表徵
a) El基因的表達(Western印跡)
使用單克隆抗體進行Western印跡分析，在7個克隆細胞系中檢測了 E1A和E1B 21kD蛋白質的表達。
為此目的，將每個細胞克隆的7 x 105個細胞各自鋪在6孔培養皿上。72小時後，用Tris-鹽水/4mMEDTA解離細胞，離心沉澱，重懸在lOO(ilTris-鹽水中，並添加30 pl 4 x SDS上樣緩衝液(40%甘油、1.4 M巰基乙醇、8% SDS、 250 mMTris/HClpH7)加以裂解。作為陰性對照，使用由同樣數目 的原代羊水細胞製備的裂解物。以HEK293細胞的裂解物作為陽性對照。 將這些蛋白質混合物各自取10在10% SDS聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離， 並轉移到硝酸纖維素膜上。通過分別與抗E1A和抗E1B 21 kD抗體 (Oncogene Research)—起溫育，並分別與HRP偶聯的抗小鼠抗體(E1A， Jackson Immunoresearch Laboratories )及抗大鼠抗體(EIB 21 kD, Oncogene Research) —起溫育，然後再溫育，利用化學發光(ECL， Amersham)使膜結 合蛋白可視化。E1A和EIB的Western印跡結果示於圖3,其顯示，所有被 檢細胞系均表達E1A蛋白(30-50 kD的三個條帶)和EIB 21 kD蛋白。
b) hAAT表達(Western印跡)
分別在細胞內(克隆細胞系中)和分泌後(培養基中)檢測hAAT的表達， 鬥企測方式也是使用單克隆hAAT特異性抗體進行Western印跡分析。為此目 的，將單個細胞克隆的7x 105個細胞分別鋪在6孔培養皿上。作為陰性對
作為後續測定中的陽性對照，使用50ng來自人血漿的純化hAAT。
72小時後，除去細胞培養上清液，用Tris-鹽水/4mMEDTA解離細胞， 離心沉澱，重懸於100 (ilTris-鹽水中，並加入30)il4xSDS上樣緩衝液加 以裂解。為檢測細胞內hAAT，取裂解細胞的蛋白混合物10 (il加以電泳分 離，並利用單克隆hAAT抗體(ICN Biomedicals)和HRP偶聯的抗山羊抗體 (Pierce)及隨後進行化學發光染色來可視化。為檢測分泌的hAAT，用10 pl 細胞培養基添加2xSDS上樣緩衝液，電泳分離，並如上所述^f企測。
圖4A顯示從細胞分泌到培養上清中的hAAT, hAAT的細胞內表達示 於圖4B。用於hAAT細胞內檢測的裂解物相對於細胞培養上清濃縮了大約 20倍。這意味著細胞以很高的效率分泌hAAT。
c) 在數次傳代中hAAT表達的量和穩定性
使用ELISA (酶聯免疫吸附反應)方法定量測定分泌到培養基中的 hAAT的量。為此目的，將不同克隆細胞系的7 x 105個細胞分別鋪到6孔培養皿中，72小時後除去細胞培養上清液。使用多克隆抗hAAT抗體(未偶 聯的或者偶聯HRP的，ICN Biomedicals)進行ELISA來確定hAAT的量。 使用/人人血漿純化的hAAT (ICN Biomedicals)作為對照。圖5A顯示各個細 胞克隆的第5代中表達的每個細胞的hAAT量。圖5B顯示了選定細胞克隆 中表達在數次傳代中的穩定性。受檢細胞系在大約20代的測試時間段內恆 定地每個細胞表達0.2至4 pg。
d) hAAT的糖分衝斤(glyco國analysis)
由於hAAT是糖蛋白，考察了各個細胞系中hAAT的糖基化程度。為 此目的，預先將細胞克隆逐步適應於不含Ultroser的Opti-Pro培養基中，結 果使得細胞不再貼壁而是懸浮生長。為了測試分泌到培養上清液中的hAAT 是否為糖基化的，用肽-N-糖苷酶F (PNGase F)酶進行消化。這種酶切去附 接於天冬醯胺殘基的(N連接的)糖殘基，使得蛋白質的分子量減少。取各個 細胞克隆的細胞培養上清液22.5 pl，加入2.5 (al致變性緩衝液(10倍5% SDS、 10% P-巰基乙醇)，IO(TC IO分鐘使蛋白變性。然後，向蛋白中加入 3.5 pl G7反應緩衝液(IO倍500 mM磷酸鈉pH 7.5)、 3.5 pl 10% NP-40和3 pl PNGase F (New England Biokbs; 500單位/pl)，在37。C溫育60分鐘。作為 對照，在每種情況下，分別將45 ng的來自人血漿的純化hAAT在25 pl Opti-Pro培養基中如上述方式變性，並添加PNAase F和H20。隨後，通過 使用單克隆hAAT特異性抗體進行Western印跡分析，如6b)所述方式檢測 hAAT分子量的變化。圖6分別顯示在4種不同細胞克隆中表達的hAAT， 以及從人血漿純化的hAAT經過PNGase F消化後分子量的變化。這些實驗 清楚地顯示，這些單個細胞克隆中合成的hAAT是糖基化的。
權利要求
1.一種製備永久人細胞系的方法，其中用一種核酸分子或至少兩種不同核酸分子轉染分離的原代人細胞，並且在轉染一種核酸分子的情況下，該核酸分子顯示允許至少一種細胞轉化因子表達及重組多肽表達的序列；而在轉染至少兩種不同核酸分子的情況下，第一種核酸分子顯示允許至少一種細胞轉化因子表達的序列，第二種核酸分子顯示允許至少一種重組多肽表達的序列。
2. 權利要求1的方法，其中所述原代人細胞是羊水細胞、胚胎視網膜 細胞和源自神經元的胚胎細胞。
3. 前述任一權利要求的方法，其中所述細胞轉化因子是來自SV40的T 抗原、來自HPV的E6和E7或者來自人腺病毒的E1A和E1B。
4. 權利要求3的方法，其中來自人腺病毒的E1A和E1B的序列包括人 腺病毒血清型5的核普酸1-4344、 505-3522或核苷酸505-4079。
5. 前述任一權利要求的方法，其中所述重組多肽是激素；凝血因子； 生長因子；柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR);抗體；病毒抗原、細菌抗原或 寄生蟲抗原；或用於產生重組病毒的互補因子。
6. 前述任一權利要求的方法，其中，在細胞轉化因子是來自HPV的E6 和E7的情況下，E6的序列存在於一個核酸分子上，E7的序列存在於另一 個不同的核酸分子上；而在細胞轉化因子是來自人腺病毒的E1A和E1B的 情況下，E1A的序列存在於一個核酸分子上，E1B的序列存在於另一個不 同的核酸分子上。
7. 權利要求6的方法，其中重組多肽的序列存在於細胞轉化因子的兩 個核酸分子之一上。
8. 前述任一權利要求的方法，其中允許細胞轉化因子或重組多肽表達 的序列顯示異源啟動子和/或異源轉錄終止元件。
9. 權利要求8的方法，其中所述啟動子是CMV(巨細胞病毒)啟動子、 EF-la啟動子、CAG啟動子、人或鼠pgk啟動子、RSV啟動子或SV40啟 動子；所述轉錄終止元件是SV40大T抗原的聚腺苷酸化序列或者人G-CSF 基因的聚腺苷酸化序列。
10. 前述任一權利要求的方法，其中允許重組多肽表達的序列含有重組酶識別序列，所述識別序列位於所述重組多肽的編碼序列或者所述重組 多肽的全表達盒的側翼。
11. 權利要求10的方法，其中所述識別序列是loxP、 attB/attP或Frt序列。
12. 前述任一權利要求的方法，其中所述被轉染的核酸分子不顯示編 碼選捧標記的序列。
13. 能夠根據權利要求l-12任一項的方法得到的永久人細胞系。
14. 權利要求13的細胞系用於製備多肽的用途。
15.權利要求13的細胞系用於製備病毒基因轉移載體的用途。
全文摘要
本發明涉及一種製備永久人細胞系的方法，其中用允許至少一種細胞轉化因子表達的序列和允許至少一種重組多肽表達的序列同時轉染分離的原代人細胞。
文檔編號C12N5/10GK101310014SQ200680043000
公開日2008年11月19日 申請日期2006年11月15日 優先權日2005年11月16日
發明者克里斯多福·沃爾珀斯, 古德倫·希德納 申請人:塞維克製藥有限責任公司