基因重組人膠原蛋白融合肽段及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-19 01:51:00

專利名稱：基因重組人膠原蛋白融合肽段及其製備方法和應用的製作方法
基因重組人膠原蛋白融合肽段及其製備方法和應用技術領域
本發明屬於生物技術領域，具體涉及到基因重組人膠原蛋白融合肽段。
技術背景
膠原蛋白(colhgen)是廣泛分布於動物結締組織的一組蛋白質家族，也是體內含 量最多的一種蛋白質，約佔蛋白質總量的25-33%，其對維護細胞、組織、器官的正常生 理功能和損傷修復有重要作用。膠原蛋白作為天然的生物資源，具有合成高分子材料無 法比擬的生物相容性和生物可降解性，可廣泛應用在醫藥、化妝品等工業中，它能保持 血管壁彈性、防止栓塞、提高軟骨以及韌帶的潤滑、減輕關節僵硬等，其在治療真皮損 傷或缺陷、美容整形、改善睡眠、增強機體免疫力等方面的作用已獲得共識，同時它們 含有大量極性基團，和甘氨酸等天然保溼因子，且有阻止皮膚中的酪氨酸轉化為黑色素 的作用，故膠原蛋白有純天然保溼、美白、防皺、祛斑等作用。另外，膠原蛋白也在食 品、保健品和飼料添加劑等行業得到應用。
膠原蛋白最普遍的結構特徵是三螺旋結構，由3條α肽鏈組成，每一條膠原鏈 都是左手螺旋構型，3條左手螺旋鏈相互纏繞成右手螺旋結構，形成膠原蛋白獨特的三重 螺旋結構，使其分子結構相對穩定。一級結構分析表明，其多肽鏈主要由「Gly-x-y」氨 基酸序列重複而成。其中甘氨酸佔總胺基酸的27%，X通常是Pro(脯氨酸)，Y通常是 不由DNA鹼基密碼子編碼的羥基脯氨酸(Hyp)，它是在蛋白質一級結構序列形成之後由 特定的酶-脯氨酸-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase，P4H)作用於序列中的Pro形成的， Hyp羥基通過分子間氫鍵對穩定膠原螺旋結構起著非常重要的作用。
膠原蛋白是一個龐大的家族，種類繁多，現已至少發現了 30餘種膠原蛋白鏈的 編碼基因，可以形成16種以上的膠原蛋白分子，根據它們在體內的分布和功能特點，目 前將膠原分成間質膠原、基底膜膠原和細胞外周膠原。間質型膠原蛋白分子佔整個機體 膠原的絕大部分，包括I、II、III型膠原蛋白分子，主要分布於皮膚、肌腱等組織，其中 II型膠原蛋白由軟骨細胞產生。
膠原作為醫用生物材料和化妝品原料，最重要的特點在於其低免疫原性。膠原 有三種類型的抗原分子，第一類是膠原肽鏈非螺旋的端肽，第二類是膠原的三股螺旋的 構象，第三類是α-鏈螺旋區的胺基酸順序。其中第二類抗原因子僅存在於天然膠原分 子中，第三類只出現在變性膠原中，而第一類抗原因子在天然和變性膠原中均存在。
生物相容性是指膠原與宿主細胞及組織之間良好的相互作用。無論是在被吸收 前作為新組織的骨架，還是被吸收同化進入宿主成為宿主的一部分，都與細胞周圍的基 質有著良好的相互作用，表現出相互影響的協調性，並成為細胞與組織正常生理功能整 體的一部分。
膠原能被特定的蛋白酶降解，即生物降解性。因膠原具有緊密牢固的螺旋結 構，所以絕大多數蛋白酶只能切斷其側鏈，只有特定的蛋白酶在特定的條件下才能降解 膠原蛋白，膠原肽鍵才會斷裂。膠原的肽鍵一旦斷裂，其螺旋結構隨即被破壞，斷裂的膠原多肽就被蛋白酶徹底水解。
生產膠原蛋白傳統的也是目前最主要的方法是利用酸、鹼法處理動物來源的
組織(豬皮、牛皮、驢皮、魚等)，從中提取膠原蛋白，另外還有酶解法提取膠 原蛋白，這些方法具有較高的回收率，但是這些方法製取的膠原蛋白均為長度不等的混 合膠原蛋白肽段，各肽段水溶性不一、難以分離到單獨的肽段純品，同時由於均為異源 性膠原蛋白，在臨床上表現出排異反應，使其作為生物醫學材料或藥物載體等方面的應 用受到了很大限制。隨著現代生物技術的發展，利用轉基因技術和基因重組技術，可以 在動物、植物和微生物表達體系獲得重組人膠原蛋白，解決了傳統提取方法存在的病毒 隱患等缺點，同時也改善了膠原蛋白的親水性、免疫排異性等。國內外一些研究機構及 生物公司相繼投入研發開發重組膠原蛋白，如利用轉基因的方法，培育含類人膠原蛋白 的小白鼠、通過轉基因微量注射得到含重組類人膠原奶汁的哺乳動物，但通過哺乳類或 昆蟲細胞株生產的成本極高、生產周期長。我國西北大學的範代娣等採用PCR擴增得到 數段人膠原蛋白基因片段，接著進行拼接重複，轉化大腸桿菌，並通過高密度發酵培養 生產人源性膠原蛋白，得到高表達的重組膠原蛋白。2004年，東京農業科技大學的Yao J等對膠原蛋白細胞附著作用和自身交聯螺旋相關序列作了研究，設計了長度為240個氨 基酸的類膠原蛋白，並在大腸桿菌中得到了表達。但是細菌表達產生的致熱原致使表達 產物難以應用於臨床，目的蛋白常以包涵體形式表達，致使產物純化困難，另外原核表 達系統的翻譯後加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低等缺點也制約其發展。
近年來，利用畢赤酵母真核表達系統大規模生產重組蛋白越來越受到科研工作 者的青睞，它與傳統的大腸桿菌表達體系相比具有經下優點(1)表達產率高，由於表 達載體利用醇氧化酶基因啟動子很強，細胞生長速度快，所以該表達系統表達的外源蛋 白產量很高，其表達量比其它系統高10倍甚至100倍，這在表達量方面是一大突破。(2) 產物具有天然結構和生物活性，無需變性和復性。(3)培養基採用無機鹽，配製簡單、價 格低廉。(4)高穩定。由於該系統的表達載體不是以自方複製的質粒存在，而是整合在 宿主菌的染色體上，所以構建的菌株十分穩定。姚菊明等，楊樹林等利用這種高表達、 高穩定、高分泌的真核表達系統表達重組類人膠原蛋白均獲得高表達，但未見到其大規 模生產的報導。
目前市場銷售的膠原蛋白均是從動物皮膚、肌腱等組織用酸鹼水解提取的膠原 蛋白混合肽段，這些肽段的胺基酸序列與人體不完全相同，因此其生物安全性和生物相 容性在醫用材料研發方面受到限制。發明內容
本發明所要解決的一個技術問題在於克服上述人源性膠原蛋白及其製備方法的 缺點，提供一種與人膠原蛋白對應肽段胺基酸序列完全相同的基因重組人膠原蛋白融合 肽段。
本發明所要解決的另一個技術問題在於提供一種快速、簡便的基因重組人膠原 蛋白融合肽段的製備方法。
本發明所要解決的還有一個技術問題在於為基因重組人膠原蛋白融合肽段提供 一種新用途。
解決上述技術問題採用的技術方案是基因重組人膠原蛋白融合肽段的全長為 839個胺基酸，其氮端為III型人膠原蛋白908-1137位肽段共2 個胺基酸，碳端為I型 人膠原蛋白497-1104位肽段共608個胺基酸，兩肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸連結；該 基因重組人膠原蛋白融合肽段的胺基酸序列如下
AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG
LAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTA100
GEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGP
AGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKG200
HRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPKGPAGERGSPG
PAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300
GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGE
AGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPG400
DLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAP
GAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGL500
TGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAG
PPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600
GSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGP
AGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPG700
QRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGRE
GAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGD800
RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD- 839
上述的基因重組人膠原蛋白融合肽段的製備方法由下述步驟組成
1、克隆I型即COL1禾Π III型即COL3人膠原蛋白基因的cDNA
從新鮮人胎盤組織中提取總RNA，以總RNA為模板，反轉錄得cDNA，設計 COLl禾口 COL3弓丨物，COLl弓丨物序列為
F = CTGGCGCAGATGGTGTTG
R = CCACGGTGACCCTTTATGC
產物長度為1849bp ；
COL3引物序列為
F = GAATCTGTGAATCATGCCCTAC
R = GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT
產物長度為3295bp ；
以cDNA為模板，進行PCR擴增，提取特異性DNA擴增條帶，得COLl和 COL3 ；將COLl和COL3連接於pGM_T載體，轉化感受態E.coli DH 5 α，塗布平板， 經藍白斑篩選，挑選陽性pGMT-COLl和pGMT-COL3克隆，分別接種於LB培養基中， 37°C振蕩過夜培養，提取這兩種質粒，為下一步做好準備。
2、畢赤酵母重組表達載體pPIC9K-COL3al_COLlal的構建
引物設計COL3al上遊引物設計兩條，引入pPIC9K自身信號肽序列 GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,進行兩次擴增，各引物序列如下
COLlal引物序列為
F = GC GAATTCGGCGCAGATGGTGTTGC,酶切位點 EcoRI
R = TG GAATTCTTAGTCGCCCTGTCGCCTG,酶切位點 EcoRI
產物長度1843bp。
COL3al引物序列為
Fl = AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG
F2 = TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,酶切位點 XhoI
R TTGAATTCTGCAGGTCCTGG,酶切位點 EcoRI
產物長度722bp。
pPIC9k-COLl鑑定引物序列為
F = GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA
R = TCGCTCTCCAGCCTTGCCG
產物長度1155bp。
分別以pGMT-COLl和pGMT_COL3質粒為模板，進行PCR擴增，提取產物， 得C03al和COlal，雙酶切C03al和pPIC9K，以T4聯接酶處理，得pPIC9K_C03al ； 單酶切 COlal 和 pPIC9K-C03al，以 T4 聯接酶處理，得 pPIC9K-C03al_C01al ；轉化感受態E.C0liDH5ci，塗布平板，經藍白斑篩選，挑選陽性克隆，接種於LB培養基中， 37°C振蕩過夜培養，提取質粒，為下一步做好準備。
3、基因重組人膠原蛋白融合肽段畢赤酵母基因工程菌 SMDl 168-COL3al-COLlal 的構建
抽提pPIC9K-COL3al_COLlal質粒併線性化，製備畢赤酵母SMDl 168感受態 細胞，電擊轉化，以G418梯度法挑選高拷貝陽性克隆，得基因重組人膠原蛋白融合肽段 畢赤酵母基因工程菌SMDl 168-COL3al_COLlal，其目標蛋白的基因序列如下
1 CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGCGGGT AACACTGGTG CTCCTGGCAG CCCTGGAGTG
61 TCTGGACCAA AAGGTGATGC TGGCCAACCA GGAGAGAAGG GATCGCCTGG TGCCCAGGGC
121 CCACCAGGAG CTCCAGGCCC ACTTGGGATT GCTGGGATCA CTGGAGCACG GGGTCTTGCA
181 GGACCACCAG GCATGCCAGG TCCTAGGGGA AGCCCTGGCC CTCAGGGTGT CAAGGGTGAA
241 AGTGGGAAAC CAGGAGCTAA CGGTCTCAGT GGAGAACGTG GTCCCCCTGG ACCCCAGGGT
301 CTTCCTGGTC TGGCTGGTAC AGCTGGTGAA CCTGGAAGAG ATGGAAACCC TGGATCAGAT
361 GGTCTTCCAG GCCGAGATGG ATCTCCTGGT GGCAAGGGTG ATCGTGGTGA AAATGGCTCT
421 CCTGGTGCCC CTGGCGCTCC TGGTCATCCA GGCCCACCTG GTCCTGTCGG TCCAGCTGGA
481 AAGAGTGGTG ACAGAGGAGA AAGTGGCCCT GCTGGCCCTG CTGGTGCTCC CGGTCCTGCT
541 GGTTCCCGAG GTGCTCCTGG TCCTCAAGGC CCACGTGGTG ACAAAGGTGA AACAGGTGAA
601 CGTGGAGCTG CTGGCATCAA AGGACATCGA GGATTCCCTG GTAATCCAGG TGCCCCAGGT
661 TCTCCAGGCC CTGCTGGTCA GCAGGGTGCA ATCGGCAGTC CAGGACCTGC AGAATTCGGC
721 GCAGATGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT
781 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC
841 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT
901 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT
961 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG
1021 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
1081 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT
1141 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA
1201 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
1261 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA
1321 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT
1381 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT
1441 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT
1501 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC
1561 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT
1621 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTGCTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
1681 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT
1741 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT
1801 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT
1861 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT
1921 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA
1981 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT
2041 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG
2101 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC
2161 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT
2221 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT
2281 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT
2341 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC GTGGTGCCCC TGGCCCCGTT
2401 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT
2461 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT
2521 GAGACAGGCG AACAGGGCGA CTAAGAATTC
4、製備基因重組人膠原蛋白融合肽段
(1)發酵
以步驟(3)構建的基因重組人膠原蛋白融合肽段畢赤酵母基因工程菌 SMD1168-COL3al-COLlal為原始菌種，塗布YPD平板獲得單菌落，擴繁單菌落分裝為 甘油菌種保存；每次取甘油菌種，接種於5mL種子YPD培養基中，30°C振蕩培養20 M小時，轉接於400ml BMGY培養基中，30°C振蕩培養至OD600達10 12，作為一級種 子；將一級種子接入裝有4L FBS培養基的5L發酵罐中，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%,培養16-20小時，作為二級種子；將二級種子轉接入裝有30L FBS培養基的50L發 酵罐中；生長培養18 20小時，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%，補加甘油至發酵液內的菌體溼重達到150mg，飢餓1-2小時；馴化培養9小時，每三小時為一個馴化時 間段，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%，第一段每5分鐘補加甲醇lmL，第二段每5 分鐘補加甲醇2mL，第三段每5分鐘補加甲醇3mL;誘導培養72小時，30°C、pH值為 5.0、DO 20% 30%，視DO值提高甲醇流加速率並維持補料速度在5_10.9ml/L/h進行 發酵，至DO值浮動縮小至5% 8%，發酵結束。
(2)純化
取發酵液離心除去酵母細胞，得發酵上清液；用截留量為20000的聚碸中空纖 維超濾濃縮發酵上清液至原發酵上清液體積的20%，得超濾濃縮液；用凝膠過濾法脫除 超濾濃縮液中的無機鹽，得脫鹽液；用DAEA陰離子交換柱處理脫鹽液，以0.02ML NaCI水溶液為平衡液，樣品溶液PH為8-9，洗脫液PH5-6，NaCIO,5MOL ；分段收集洗 脫液，電泳，色譜法檢測純度，得純度為85%以上的溶液；用截留量為20000的聚碸中 空纖維超濾濃縮至質量濃度為1% 5%。
(3)製備基因重組人膠原蛋白融合肽段
冷凍乾燥，得基因重組人膠原蛋白融合肽段。
基因重組人膠原蛋白融合肽段在製備化妝品中的用途。其使用方法如下
基因重組人膠原蛋白融合肽段在製備化妝品中的用途，所製備的化妝品由下述 質量配比的原料製成
基因重組人膠原蛋白融合肽段8 12g
透明質酸0.3 0.6g
甘油20 30g
去離子水1000g。
所製備的化妝品由下述最佳質量配比的原料製成
基因重組人膠原蛋白融合肽段IOg
透明質酸0.5g
甘油25g
去離子水1000g。
採用本發明方法所製備的基因重組人膠原蛋白融合肽段，與動物來源的膠原蛋 白相比較，其生物相容性和生物安全性均佳。基因重組人膠原蛋白融合肽段經致敏性試 驗，所試驗的基因重組人膠原蛋白融合肽段無致敏性。以基因重組人膠原蛋白融合肽段 為原料製備的化妝品，在未開封的情況下存放於4度冰箱，半年內不變質，開封後每天 取適量使用，一周內不變質，具有良好的保溼作用。基因重組人膠原蛋白融合肽段可作 為美容化妝品使用，根據需要配製成不同濃度的化妝品。


圖1是實施例lcol3和coll基因的PCR產物電泳圖。
圖2是實施例1重組質粒pGM-T-COLl和pGM-T_COL3的PCR鑑定結果。
圖3是實施例lpGM-T_COL3的5』端部分測序圖譜。
圖4是實施例lpGM-T-COLl的3』端部分測序圖譜。
圖5是實施例1重組表達載體pPIC9K-COL3al_COLlal的構建策略路線圖。
圖6是實施例ICOLlal和COL3al序列的PCR產物電泳結果圖。
圖7是實施例lpPIC9K-COL3al_COLlal質粒的PCR鑑定電泳圖。
圖8是實施例lpPIC9K-COL3al_COLlal質粒的酶切鑑定電泳圖。
圖9是實施例lpPIC9K-COL3al_COLlal重組質粒5』端測序結果圖譜。
圖10是實施例lpPIC9K-COL3al_COLlal重組質粒3』端測序結果圖譜。
圖11是實施例ISMDl 168-COL3al_COLlal重組子的PCR鑑定電泳圖。
圖12是實施例1基因重組人蛋白質融合肽段的SDS-PAGE分析圖。
圖13是實施例1方法製備的基因重組人膠原蛋白融合肽段的電泳檢測圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施 例。
實施例1
基因重組人膠原蛋白融合肽段的全長為839個胺基酸，其氮端為III型人膠原蛋 白908-1137位肽段共2 個胺基酸，碳端為I型人膠原蛋白497-1104位肽段共608個胺基酸，兩肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸連結； 序列如下該基因重組人膠原蛋白融合肽段的胺基酸
AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARG
LAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTA100
GEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGP
AGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKG200
HRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPKGPAGERGSPG
PAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300
GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGE350
AGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPG400
DLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAP
GAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGL500
TGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAG
PPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600
GSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGP
AGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPG700
QRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGRE
GAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGD800
RGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD-839
上述的基因重組人膠原蛋白融合肽段的製備方法如下
1、克隆I型(COLl)和III型(COL3)人膠原蛋白基因的cDNA
1. IRNA 提取
(1)取新鮮人胎盤在液氮中研磨，將研碎的組織放入盛ImLTrizol的離心管中， 上下振蕩5η ι，將樣品在15-30°C放置15η ι，使核酸蛋白複合物分離。
(2)在高速冷凍離心機中4°C 10,OOOXg離心ΙΟη ι，吸取上清液。
(3)加0.2mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，室溫放置3η ι。
10,000\§離心151^11。樣品分為黃色有機相、中間層和無色水相三層， RNA主要在水相中，將水相轉移到新管中。
(5)加入0.5mL異丙醇，混勻，室溫放置ΙΟη ι。
(6)4°〇10,000\§離心101^11，棄上清，離心後在管側和管底可見RNA膠狀沉 澱；
(7)加ImL體積濃度為75%乙醇(用0.1 % DEPC處理水配製)洗滌沉澱。
(8)4°C 7500Xg 離心 5min，棄上清液。
(9)室溫放置晾乾，按RNA提取量的多少，力卩20-100 μ L無RNase的DEPC處 理水，室溫溶解後，-70°C保存。
(IO)RNA提取完成後，於1 %的瓊脂糖凝膠上進行檢測。
IJcDNA的反轉錄
以上述所得總RNA為模板，按下述方法進行反轉錄，得cDNA。
取溶解於DEPC 水中的總 RNA 5 μ L，0.2 μ g/μ L Random hexamers primer IuL, DEPC水6yL，70 °C,孵育5η ι，置冰上冷卻後加入下列試劑5XBuffer 4 μ L，10mmol/L dNTP Mixture 2 μ L，20u/ μ L RNA inhibitor 1 μ L, 25°C，孵育 5η ι， 200u/ μ L 反轉錄酶 1 μ L，總體積 20 μ L。在 PTC-100 Thermal Cycler (BIO-RAD) PCR 儀 中，25°C，IOmin, 42°C反應，60η ι，70°C, ΙΟη ι 終止反應，冰上冷卻。
1.3引物的設計
根據GenBank已發表的人膠原蛋白I型和III型基因序列，按照引物設計原則， 利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟體，設計COLl和COL3基因PCR擴增引物。引 物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。其序列見表1。
表ICOLl和COL3的PCR引物參數
基因名稱PCR引物序列PCR產物長度COLlF:CTGGCGCAGATGGTGTTG1849bpR:CCACGGTGACCCTTTATGCC0L3F:GAATCTGTGAATCATGCCCTAC3295bpR:GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT禾口 COL3的基因
1.4.1COL1 和 COL3 的 PCR 擴增
25 μ L 反應體系中含有13.3 μ L 滅菌的二 蒸水、2.5 μ L 10XPCR buffer, 3.5 μ L 2m mol/L dNTP Mix, 2.5 μ L Mg2+，1 μ L 10 μ mol/L Primer I，1 μ L 10 μ mol/ L Primer II，0.2 μ L 0.5U/ μ L Taq 酶，IyL cDNA 模板。反應條件為95 °C 5min, 94°C 30s, 610C 30s, 72°C 2.5min, 30 個循環，72°C ΙΟη η，4°C ΙΟη η。利用 PTC-100 Thermal Cycler (BIO-RAD) PCR 儀進行擴增。
COLl和COL3的PCR擴增結果見圖1。
1.4.2COL1和COL3的擴增片段的分離和克隆
利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按產品說明書，從普通的1.5%瓊脂糖凝膠 上回收特異性條帶，回收產物連接於pGM-T載體，轉化感受態E.coli DH 5 α，塗布平 板，經藍白斑篩選，挑選陽性克隆接種於IOmL LB培養基中，37°C振蕩過夜培養。用質 粒微量提取試劑盒抽提質粒DNA(鹼裂解法)，得pGM-T-COLl和pGM-T_COL3兩個 重組質粒。兩個重組質粒的PCR擴增鑑定結果見圖2。
1.4.3 重組質粒 pGM-T-COLl 和 pGM-T_COL3 的測序鑑定
委託測序公司對兩個重組質粒進行基因測序，測序結果與GenBank中的已知人I 型和III型膠原蛋白序列作同源性比較，同源性均為100%。測序結果見圖3和圖4。
2、畢赤酵母重組表達載體pPIC9K-COL3al_COLlal的構建
2.1重組表達載體的構建策略路線圖見圖5
2.2引物設計
根據引物設計的策略，利用DNAMAN和Primer 5.0軟體設計COLlal和COL3al 基因，同時為了後期蛋白序列的切割，COL3al上遊引物設計兩條，弓丨入pPIC9K自身信 號肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，進行兩次擴增，為了證明基因插入的正確 性，設計了特異性鑑定引物，9k_COLl。各序列見表2。
表2COLlal 和 COL3al 的 PCR 引物參數
基因名稱PCR引物序列酶切位點PCR產物長度COLlalF GC 6WmiGCGCAGATGGTGTTGC R TG6^77CTTAGTCGCCCTGTCGCCTGEcoR I EcoR I1843bpCOUalFlAGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG F2TCTtTO^AAAAGAGAGGCTGAAGCT R: TTi^TTCTGCAGGTCCTGGXhol EcoR I722bp9k-COLlFGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA RTCGCTCTCCAGCCTTGCCG 、無1155bp16
2.3PCR 擴增 COLlal 和 COL3al 序列
分別以pGM-T-COLl和pGM-T_COL3質粒為模板，進行PCR擴增
ddH2013.3 μ L
10 X Reaction Buffer 2.5 μ L
dNTP Mixture (2.5mM each) 3.5 μ L
pGMT-C01/pGMT-C030.1 μ L


Primer F (20 μ Μ) Primer R (20 μ Μ) Taq酶總體系25 μ L 反應條件分別為 colal 95 °C 5min 94°C 30S1 μ L 1 μ L 0.2 μ L61°C 30 S 72°C 2. 5min 72 °C IOmin}co3al95 °C 5min 94°C 30S30 cycles60 0C 30 S 72 0C 40S30 cycles
72 °C IOmin72 °C IOmin
COLlal和COL3al序列的PCR產物電泳結果見圖6。
由圖可見，分別在1843bp和722bp處有一條特異DNA條帶，與預期大小一致。 利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按產品說明書，從普通的1.5%瓊脂糖凝膠上回收特 異性條帶，得COLlal和COL3al序列，-20°C保存待用。


2.4COLlal和COL3al序列的酶切及回收 單酶切COLlal序列雙酶切COL3al序列ddH20 135 μ LddH20130 μ LIOXbufferH 20 μ LIOXbufferH 20 μ LCOLlal (150ng/μ L) 40 μ L EcoRI 5yLEcoRICOL3al(150ng/yL) 40 μ L 5 μ L
總體系200 PL

總體系200 μ LXhoI5 μ L
上述試劑加好後，混勻，37°C水浴消化1.5h_2.0h，終止反應前先取出5μ L以 0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否酶切完全。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按產品說 明書，從普通的1.5%瓊脂糖凝膠上回收特異性條帶，-20°C保存待用。
2.5質粒pPIC9K的轉化及提取
(1)取冷凍的DH5a感受態細胞一管，放於冰上解凍，立即加入質粒 pPIC9K(<50ng),手指輕彈使其混合，在冰中放置30分鐘。
(2) 42 V水浴熱激恰好90秒，不要搖動試管。
(3)快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2分鐘。
(4)加入800 μ L無抗生素的LB液體培養基，混勻，37°C溫育50分鐘。
(5)吸取100-200 μ L菌液，塗於含有卡那黴素(50ug/mL)的固體LB板上。
(6)將平板置於室溫待液體被吸收後，倒置於37°C培養箱中，培養12-18小時。
(7)挑選單菌落接種於含有卡那黴素(50ug/mL)的液體LB培養基中，搖床培 養，37°C過夜。
(8)利用質粒提取試劑盒操作說明提取pPIC9K質粒。
2.6pPIC9K質粒的Xho I和EcoR I雙酶切及回收
ddH2064 μ L
IOXbufferH20 μ L
pPIC9K (200ng/ μ L) 35 μ L
Xho I5 μ L
EcoR I5 μ L
利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按產品說明書，從普通的1.5%瓊脂糖凝膠 上回收特異性條帶，-20°C保存待用。
2.7pPIC9K 與 COL3al 的連接
COL3al (lOOng/ μ L) IlyL
pPIC9K (200ng/ μ L) 5 μ L
buffer2 μ L
T4DNA 連接酶2 μ L
上述連接體系充分混勻後，於16°C連接2小時。得pPIC9K_COL3al，其轉化和 提取方法同上述2.5項所述。
pPIC9K-co3al質粒的酶切鑑定
總體系200 μ L
總體系20 μ L
ddH20
IOXbufferH9μ L 1.5μ L
pPIC9K-co3al
XhoI
EcoR I
_
.總體系15 μ L2.5 μ L 1 μ L 1 μ L
以上酶切體系在37°C水浴中反應2小時後，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定連 接正確的質粒pPIC9K-co3al。
2.8pPIC9K-co3al 質粒的 EcoR I 單酶切
對雙酶切鑑定為連接正解的質粒進行大量提取，並進行EcoRI單酶切。
上述試劑加好後，混勻，37°C水浴消化Zh，終止反應前先取出5μ L以0.7%瓊 脂糖凝膠電泳檢測是否酶切完全，之後進行單酶切後的pPIC9K-C03al的回收。
2.9pPIC9K-co3al 的去磷酸反應
為了防止pPIC9K-C03al質粒單酶切後的自連，必須對其進行脫磷反應。
(1)在微量離心管中配製下列反應液，全量定容到50 μ L。
_
pPIC9K-co3al20 μ 1
10 X Alkaline Phosphatase Buffer 5 μ 1
CIAP (10 30U/ U 1)2 μ 1
dH20 23 μ 1
(2)37°〇或50°〇反應30分鐘。
(3)苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)抽提2次。
(4)氯仿/異戊醇04 1)抽提1次。
(5)添加 5 μ 1 的 3M NaOAC。
(6)添加125 μ 1的倍量)冷乙醇，在_20°C下保冷30 60分鐘。
(7)離心分離回收沉澱，用200 μ 1的70%冷乙醇洗淨後，減壓乾燥。
(8)用20 μ 1以下的TE Buffer溶解沉澱。
2.10pPIC9K-co3al 與 COLlal 的連接
COLlal5μ L
pPIC9K-COL3al (50ng/ μ L) IlyL
buffer2 μ L
T4DNA 連接酶2 μ L
ddH20
IOXbufferH
pPIC9K-co3al
EcoRI
_
『總體系200 μ L145 μ L 20 μ L 30 μ L 5 μ L
總體系20 μ L
上述連接體系充分混勻後，於16°C連接2小時。得pPIC9K-COL3al_COLlal， 其轉化和提取方法同上述2.5項所述。
2.11pPIC9K-COL3al-COLlal 質粒的鑑定
2.11.1pPIC9K-COL3al-COLlal 質粒的 PCR 鑑定
鑑定pPIC9K-COL3al_COLlal質粒構建是否正確，設計上遊引物源自pPIC9K 載體信號肽部分5』 -GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA-3『，下遊引物源自COLlal 序列中的一段5』 -TCGCTCTCCAGCCTTGCCG-3，，如果連接正確，即可擴增出一條 長約1155bp的片段。其鑑定結果見圖7。
從圖7可見，1、3、5、6、8、11號質粒在1155bp左右擴增出一條特異DNA條帶，達到預期目的。
2.11.2pPIC9K-COL3al-COLIal 質粒的酶切鑑定
根據pPIC9K-COL3al_COLlal重組質粒的酶切位點分析，對初步篩選出的重組 菌落經小量提取質粒DNA後，選用EcoR I、BamH I進行酶切鑑定，如果連接正確，用 EcoRI即可切出一條長度約1800bp左右的片段，而用BamHI即可切出一條2000bp左右 的片段。
ddH2010 μ LddH2010 μ L
IOXbufferH 1.5 μ LIOXbufferH1.5 μ L
質粒(150ng/yL)2.5yL 質粒(150ng/yL) 2.5 μ L
EcoRI 1 μ L BamHI1 μ L
以上兩個酶切體系在37°C水浴中反應2小時後，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其 結果見圖8。由圖8可見連接正確。
2.11.3pPIC9K-COL3al-COLIal質粒的目標基因測序鑑定
經PCR和酶切鑑定後，對確定連接正確的pPIC9K-COL3al_COLlal重組質粒送 往上海生工生物技術有限公司進行序列測定。測序結果見圖9、10。
測序結果顯示，COL3al_COLlal基因序列插入正確，未出現移碼突變。
3、基因重組人膠原蛋白融合肽段比赤酵母基因工程菌 (SMD1168-COL3al-COLlal)的構建
3.1pPIC9K-COL3al-COLlal 質粒的線性化
ddH201275 μ L
10 X buffer H160 μ L
pPIC9K-co3al-colal (200ng/ μ L) 150 μ L
Sail15 μ L
上述試劑加好後，混勻，37°C水浴消化5h，終止反應前先取出5μ L以0.7%瓊 脂糖凝膠電泳檢測是否酶切完全。之後，用質粒提取試劑盒對線性化質粒進行質粒大
總體系 15 μ L總體系15 μ L
總體系1500 μ L提。
3.2畢赤酵母感受態細胞的製備
(1)挑取酵母單菌落，接種至含有5mL YPD培養基試管中，30°C、250-300rpm培養過夜。
(2)取50μ L的培養物接種至含有50mL新鮮培養基的300mL三角瓶中， 28-300C > 250-300rpm 培養過夜，至 OD600 值達到 1.1-1.3。
(3)將細胞培養物於4°C，1500g離心5η ι，用50mL的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸。
(4)按步驟( 離心，用25mL的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸。
(5)按步驟(3)離心，用20mL的冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體沉澱重 ；塁、ο
(6)按步驟(3)離心，用0.3mL的冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體沉澱重 懸，其終體積約為0.5mL。
(7)分裝為 80 μ L —份，-70°C保存。
3.3畢赤酵母的電轉化
(1)將浸泡在70%乙醇中的電轉化杯取出，用無水乙醇衝洗三遍，於滅過菌的 超淨臺中晾乾殘餘乙醇。
(2)將電轉化杯轉至冰中預冷10分鐘。
(3)將5-20 μ g的線性化DNA溶解在5_10 μ L滅菌雙蒸水中，畢赤酵母感受態 細胞混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中。
(4)電擊，電壓1.5kV;電容25yF;電阻200 Ω;電擊時間為4-lOmsec。
(5)電擊完畢後，加入ImL冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液將菌體混勻，轉至 1.5mL離心管中。
(6)將菌體懸液塗布於MD平板上，每100 μ L-200 μ L塗布一塊平板。
3.4多拷貝插入SMD1168-COL3al_COLlal重組子的篩選
(1)在生長有轉化子的MD平板表面加入2mL滅菌雙蒸水，然後用無菌三角塗布 器在His+轉化子表面輕輕塗刮，並轉移到50mL離心管中。
(2)加入20mL滅菌雙蒸水稀釋，混勻後測定其OD600值(1 OD6OO = 5X107cells/mL)。
(3)取IO5個細胞塗布於含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30°C培養 72h-96ho
(4)在無菌96孔板中每孔加入200 μ LYPD液體培養基。
(5)用接菌牙籤往步驟(4)分別接入在含有0.5mg/mL G418的YPD平板上獲得 的轉化子，混勻，於30°C培養48h。
(6)4Sh後，取一塊新的無菌96孔板，每孔加入190 μ L YPD液體培養基。在相 應孔中加入 ο μ L第一塊96孔板所得的培養物，於30°C培養24h。
(7)24h後，再取一塊新的無菌96孔板，每孔加入190 μ L YPD液體培養基。在 相應孔中加入 ο μ L第二塊96孔板所得的培養物，於30°C培養24h。
(8) 24h後，分別從第三塊96孔板中取出1 μ L分別點在含有1 .Omg/mL和4.0mg/mLG418的YPD平板上，於30°C繼續培養％h-120h。酵母SMDl 168轉化子若 能在含高濃度G418的培養基上生長，說明該轉化子含有多拷貝的目的基因，即有多個 pPIC9K-COL3al-COLlal片斷轉化進了酵母SMD1168並同源重組插入了酵母SMD1168 的染色體上。經過這一步篩選得到的高拷貝的重組酵母SMD1168-COL3al-COLlal將更 有可能實現目的蛋白的高效表達。
3.4SMD1168-COL3al-COLlal 重組子的 PCR 鑑定
挑取待測酵母轉化子，按下述方法進行PCR模板的預製。
(1)挑取高拷貝轉化子的單菌落，置於裝有200uL去離子水的1.5mL離心管中， 2000g離心5η ι，棄上清。
(2)將裝有菌體的離心管置於微波爐加熱2η ι。
(3)轉移到 _80°C冰凍 5η ι。
(4)再置於微波爐中檔加熱2η ι。
(5)重複在_80°C冰凍Smin和微波爐中檔加熱2η ι。
(6)加入30gL去離子水，於IOOOOg離心Ιη ι，吸取上清作為PCR反應的模板。
(7)使用9k_coll鑑定引物，進行PCR擴增。
(S)PCR結束後，進行瓊脂糖電泳檢測，在1155bp左右出現條帶的，可以初步 確定為陽性轉化子。其結果見圖11。
經過G418不同濃度的反覆篩選，最終在高濃度4mg/mL條件下篩選到9個高拷 貝重組子，並對其進行菌落PCR鑑定，結果顯示，9個重組子都能擴增出約1155bp左右 的片段，說明重組子篩選結果正確。
3.5 重組酵母 SMD1168-COL3al_COLlal 的誘導表達
(1)分別挑選單菌落，置於裝有30mL BMGY培養基的150mL三角瓶中，於 28-30 °C、250-300rpm 培養至 OD600 為 2-6。
(2)室溫下1500-3000g離心5η ι，收集菌體，用BMMY重懸菌體，使OD600為1.0左右。
(3)將所得的菌液置於500mL的三角瓶中，用四層紗布封口，於28_30°C、 250-300rpm的搖床上繼續生長。
(4)每24h向培養基中添加無水甲醇至終體積濃度為1 %。
(5)按時間點分別取菌液樣品，取樣量為IOmL,置於50mL離心管中，常溫， 12000rpm離心5η ι，收集上清，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收穫時間。時間點一 般取12h、24h、36h、48h、60h 和 72h。
(6)待檢測樣品於-70°C保存備用。
3.6基因重組人蛋白質融合肽段的SDS-PAGE分析
(1)玻璃板清洗、晾乾後安裝。
(2)灌注分離膠，在一乾淨小燒杯中依次加入滅菌水l.lmL，1.5mol/L Tris · Cl(pH8.8)1.3mL, 10% SDS 50 μ L, 10% 過硫酸銨 50 μ L，30% 丙烯醯胺溶液 2.5mL，TEMED 2 μ L，混勻後立即灌注於玻璃板的間隙中，留出灌注濃縮膠所需的空間 (梳子的齒長再加1cm)，小心地在丙烯醯胺溶液上覆蓋一層滅菌水。
(3)分離膠聚合完全後(30min-60min)，傾出覆蓋液體，用濾紙吸淨殘留液體。22
(4)灌注5%的濃縮膠，在一乾淨小燒杯中依次加入滅菌水1.4mL，1.0mol/L Tris · Cl (pH6.8)250yL, 10% SDS 20 μ L, 10% 過硫酸銨 20 μ L，30% 丙烯醯胺溶液 330 μ L，TEMED 2 μ L，混勻後立即在已聚合的分離膠上灌注濃縮膠，小心插入梳子， 避免產生氣泡。再加入濃縮膠以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置於室溫下。
(5)樣品的處理，取蛋白樣品加入等體積的含DTT的2X SDS凝膠加樣緩衝液， 在100°C加熱IOmin以使蛋白質變性。
(6)濃縮膠完全聚合後(30min)，小心移出梳子，立即用滅菌水洗滌加樣槽以除 去未聚合的丙烯醯胺。必要時，用注射器針頭把濃縮膠上加樣槽之間的齒弄直。把凝膠 固定於電泳裝置上，槽內外各加入Tris-甘氨酸電泳緩衝液。
(7)按預定順序加樣，每樣品加15 μ L-20 μ L。
(8)將電泳裝置與電源相連，凝膠上所加電壓為100V。當染料前沿進入分離膠 後，把電壓提高到150V，繼續電泳直到嗅酚藍到達分離膠底部，然後關閉電源。
(9)從電泳裝置上卸下玻璃板，取出凝膠。
(10)用至少5倍體積的染色液浸泡凝膠，平緩搖動於室溫染色1小時以上。
(11)脫色，把膠用去離子水衝洗3遍，然後置微波爐上加熱5分鐘。
(12)取出凝膠，使用凝膠成像儀進行圖像捕捉和分析。結果見圖12:
4、製備基因重組人膠原蛋白融合肽段
4.1 發酵
以基因重組人膠原蛋白融合肽段畢赤酵母基因工程菌 SMD1168-COL3al-COLlal為原始菌種，塗布YPD平板獲得單菌落，擴繁單菌落分裝為 甘油菌種保存；每次取甘油菌種，接種於5mL種子YPD培養基中，30°C振蕩培養20 M小時，轉接於400ml BMGY培養基中，30°C振蕩培養至OD600達10 12，作為一級種 子；將一級種子接入裝有4L FBS培養基的5L發酵罐中，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%,培養16-20小時，作為二級種子；將二級種子轉接入裝有30L FBS培養基的50L發 酵罐中；生長培養18 20小時，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%，補加甘油至發 酵液內的菌體溼重達到150mg，飢餓1-2小時；馴化培養9小時，每三小時為一個馴化時 間段，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%，第一段每5分鐘補加甲醇lmL，第二段每5 分鐘補加甲醇2mL，第三段每5分鐘補加甲醇3mL;誘導培養72小時，30°C、pH值為 5.0、DO 20% 30%，視DO值提高甲醇流加速率並維持補料速度在5_10.9ml/L/h進行 發酵，至DO值浮動縮小至5% 8%，發酵結束。
4.2 純化
取發酵液離心除去酵母細胞，得發酵上清液；用截留量為20000的聚碸中空纖 維超濾濃縮發酵上清液至原發酵上清液體積的20%，得超濾濃縮液；用凝膠過濾法脫除 超濾濃縮液中的無機鹽，得脫鹽液；用DAEA陰離子交換柱處理脫鹽液，以0.02ML NaCI水溶液為平衡液，樣品溶液PH為8-9，洗脫液PH5-6，NaCIO,5MOL ；分段收集洗 脫液，電泳，色譜法檢測純度，得純度為85%以上的溶液；用截留量為20000的聚碸中 空纖維超濾濃縮至質量濃度為 5%。電泳檢測結果見圖13。
4.3製備基因重組人膠原蛋白融合肽段
冷凍乾燥，得基因重組人膠原蛋白融合肽段。
實施例2
採用本發明實施例1製備的基因重組人膠原蛋白融合肽段用於製備化妝品，該 化妝品由下述質量配比的原料製成
基因重組人膠原蛋白融合肽段IOg
其製備方法如下
取乾粉狀基因重組人膠原蛋白融合肽段，透明質酸，甘油，溶解於去離子水 中，調PH值至6.5 7.5，在無菌環境下用0.22um濾膜過濾，得無色透明的液體，以無 菌操作法封裝於5ml的玻璃瓶或塑料瓶中，4°C冰箱儲存。
實施例3
採用本發明實施例1製備的基因重組人膠原蛋白融合肽段用於製備化妝品，該 化妝品由下述質量配比的原料製成
基因重組人膠原蛋白融合肽段8g
透明質酸0.3g
甘油20g
去離子水IOOOg0
其製備方法與實施例2相同。
實施例4
採用本發明實施例1製備的基因重組人膠原蛋白融合肽段用於製備化妝品，該 化妝品由下述質量配比的原料製成
基因重組人膠原蛋白融合肽段 12g
透明質酸0.6g
甘油30g
去離子水IOOOg0
其製備方法與實施例2相同。
為了驗證本發明的有益效果，發明人採用本發明實施例1製備的基因重組人膠 原蛋白融合肽段進行了致敏性試驗，試驗情況如下
試樣質量分數為基因重組人膠原蛋白水溶液。
陽性對照質量分數為0.1甲醛水溶液。
陰性對照生理鹽水。
實驗動物自色豚鼠30隻，雌雄各半，體重^0 300g，試驗前M小時用電 動蒯須剃鬚刀將動物脊柱兩側擊毛，每側的去毛面積為3X3cm2。
1、試驗方法
動物分組將豚鼠按性別、體重隨機分成3組.每組10隻.第一組為試驗組，第 二組為陽性對照組，第三組為陰性對照組。
致敏接觸取1平方釐米紗布塊，在試樣中侵泡5分鐘，作為斑貼物，將其半封 閉固定在動物背側去毛區，持續六小時，去掉斑貼物，觀察記錄各組動物激發部位的皮
透明質酸
甘油
去離子水0.5g25gIOOOg0膚有無紅斑及水腫等現象，每天一次，連續六天，按標準進行評分，並算出致敏率。
結果判斷與評價試驗結果以動物皮膚反應強度和致敏陽性率表示。皮膚反應 強度評分按下列兩種標準進行。
(1)紅斑形成很淡的紅斑(勉強可見)為1分；輕度邊界清晰的紅斑為2分；中 度紅斑(鮮紅一深紅)為3分；重度紅斑(深紅一紫紅，且有焦痂形成)為4分。
(2)水腫形成很輕微的水腫(幾乎觀察不到)為1分；輕度水腫(邊緣明顯高出 皮面)為2分；中度水腫(腫脹高出皮面約Imm)為3分·』重度水腫(腫脹高出皮面Imm 以上，範圍超過斑貼區)為4分。
總積分等於紅斑分與水腫分之和，並依此確定動物有無過敏反應。致敏陽性 率是陽性動物數與合計動物數比值的百分率，根據此百分率對化學物質致敏強度進行分 級。致敏強度分級見表3。
表3致敏強度分級
致敏率(％)等級致敏強度0-8I弱致敏性9-28II輕致敏性28-64III中致敏性64-80IV強致敏性81-100V極強致敏性
試驗結果見表4.。
表4致敏性s試驗結果表
組別動物數反應 類型觀察時間及反應強度評分組內 總積分平均 反應值致敏率致敏強度Id2d3d4d5d6d陽性 組10紅斑1/11/32/13/43/43/4400.8100%中致敏性水腫1/21/43/43/43/53/5601.1試驗 組10紅斑0/00/00/00/00/00/0000無水腫0/00/00/00/00/00/0000無陰性 組10紅斑0/00/00/00/00/01/1100無水腫0/00/00/00/00/00/0000無
注1/3 = 1分/3隻，即得1分者有3隻
從表4可以看出，試驗組未出現1例致敏反應的動物，說明所試驗的基因重組人 膠原蛋白融合肽段無致敏性，至於陰性組有一例出現弱致敏反應，可能因為其它原因造25成，而非生理鹽水有致敏性。
權利要求
1.一種基因重組人膠原蛋白融合肽段，其特徵在於它的全長為839個胺基酸， 其氮端為III型人膠原蛋白908-1137位肽段共229個胺基酸，碳端為I型人膠原蛋白 497-1104位肽段共608個胺基酸，兩肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸連結；該基因重組人 膠原蛋白融合肽段的胺基酸序列如下AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG LAGPPGMPGP RGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGS PGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP AGKSGDRGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGP QGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FGADGVAGPK GPAGERGSPG PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGP PGPAGQDGRP 300 GPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGAAGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGE AGAQGPPGPA GPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG 400 DLGAPGPSGA RGERGFPGER GVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP GAPGSQGAPG LQGMPGERGA AGLPGPKGDR GDAGPKGADG SPGKDGVRGL 500 TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGA RGAPGDRGEP GPPGPAGFAG PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGN VGAPGAKGAR 600 GSAGPPGATG FPGAAGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP AGRPGEVGPP GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG 700 QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD 800 RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD- 839
2.—種權利要求1基因重組人膠原蛋白融合肽段的製備方法，其特正在於該方法由下 述步驟組成(1)克隆I型即COLl和III型即COL3人膠原蛋白基因的cDNA 從新鮮人胎盤組織中提取總RNA，以總RNA為模板，反轉錄得cDNA，設計COLl 禾口 COL3弓丨物，COLl弓丨物序列為 F = CTGGCGCAGATGGTGTTG R = CCACGGTGACCCTTTATGC 產物長度為1849bp ； COL3引物序列為 F = GAATCTGTGAATCATGCCCTAC R = GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT 產物長度為3295bp ；以cDNA為模板，進行PCR擴增，提取特異性DNA擴增條帶，得COLl和COL3 ； 將COLl和COL3連接於pGM-T載體，轉化感受態E.coli DH 5 α，塗布平板，經藍白斑 篩選，挑選陽性pGMT-COLl和pGMT-COL3克隆，分別接種於LB培養基中，37°C振蕩 過夜培養，提取這兩種質粒，為下一步做好準備；⑵畢赤酵母重組表達載體pPIC9K-COL3al_COLlal的構建 引物設計COL3al上遊引物設計兩條，引入pPIC9K自身信號肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,進行兩次擴增，各引物序列如下 COLlal引物序列為F = GC GAATTCGGCGCAGATGGTGTTGC,酶切位點 EcoRI R = TG GAATTCTTAGTCGCCCTGTCGCCTG,酶切位點 EcoRI 產物長度1843bp ； COL3al引物序列為Fl = AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTGF2 = TCT CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,酶切位點 Xho IR TT GAATTCTGCAGGTCCTGG,酶切位點 EcoRI產物長度722bp ；pPIC9k-COLl鑑定引物序列為F = GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAR = TCGCTCTCCAGCCTTGCCG產物長度1155bp ；分別以pGMT-COLl和pGMT-COL3質粒為模板，進行PCR擴增，提取產物，得 C03al和COlal，雙酶切C03al和pPIC9K,以T4聯接酶處理，得pPIC9K_C03al ；單 酶切COlal和pPIC9K-C03al，以T4聯接酶處理，得pPIC9K-C03al_C01al ；轉化感受^ E.coli DH 5 α ,塗布平板，經藍白斑篩選，挑選陽性克隆，接種於LB培養基中，37°C 振蕩過夜培養，提取質粒，為下一步做好準備；(3)基因重組人膠原蛋白融合肽段畢赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3al_COLlal 的構建抽提pPIC9K-COL3al_COLlal質粒併線性化，製備畢赤酵母SMD1168感受態細 胞，電擊轉化，以G418梯度法挑選高拷貝陽性克隆，得基因重組人膠原蛋白融合肽段畢 赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3al_COLlal，其目標蛋白的基因序列如下·1 CTCGAGAAAA GAGAGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTGGTG CTCCTGGCAG CCCTGGAGTG·61 TCTGGACCAA AAGGTGATGCTGGCCAACCA GGAGAGAAGG GATCGCCTGG TGCCCAGGGC·121 CCACCAGGAG CTCCAGGCCC ACTTGGGATT GCTGGGATCA CTGGAGCACG GGGTCTTGCA·181 GGACCACCAG GCATGCCAGGTCCTAGGGGA AGCCCTGGCC CTCAGGGTGT CAAGGGTGAA·241 AGTGGGAAAC CAGGAGCTAA CGGTCTCAGT GGAGAACGTG GTCCCCCTGG ACCCCAGGGT·301 CTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCTGGTGAA CCTGGAAGAG ATGGAAACCC TGGATCAGAT·361 GGTCTTCCAG GCCGAGATGG ATCTCCTGGT GGCAAGGGTG ATCGTGGTGA AAATGGCTCT·421 CCTGGTGCCC CTGGCGCTCC TGGTCATCCA GGCCCACCTGGTCCTGTCGG TCCAGCTGGA·481 AAGAGTGGTG ACAGAGGAGA AAGTGGCCCT GCTGGCCCTG CTGGTGCTCC CGGTCCTGCT·541 GGTTCCCGAG GTGCTCCTGGTCCTCAAGGC CCACGTGGTG ACAAAGGTGA AACAGGTGAA·601 CGTGGAGCTG CTGGCATCAA AGGACATCGA GGATTCCCTG GTAATCCAGG TGCCCCAGGT·661 TCTCCAGGCC CTGCTGGTCA GCAGGGTGCA ATCGGCAGTC CAGGACCTGC AGAATTCGGC·721 GCAGATGGTGTTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT·781 GGCCCCAAAG GATCTCCTGGTGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC·841 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCCTGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT·901 CCCGCCGGTCAAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT·961 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG·1021 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA·1081 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCCTGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT·1141 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA·1201 CCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC·1261 GAGAGAGGTTTCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA·1321 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT·1381 CCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT·1441 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT·1501 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC·1561 CCTGGTGACA AGGGTGAAAGTGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT·1621 GCCCCCGGAGACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT·1681 GGTGCTGACG GCCAACCTGGTGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT·1741 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT·1801 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGCTCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT·1861 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT·1921 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA·1981 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT·2041 GGTGCTGATG GTCCTGCTGGTGCTCCTGGTACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG·2101 CGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC·2161 CCCTCTGGTGAACCTGGCAA ACAAGGTCCCTCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT·2221 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT·2281 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT·2341 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT·2401 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGGTGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT·2461 GTCGGCCCTGTTGGCGCCCGTGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT·2521 GAGACAGGCG AACAGGGCGA CTAAGAATTC(4)製備基因重組人膠原蛋白融合肽段①發酵以步驟(3)構建的基因重組人膠原蛋白融合肽段畢赤酵母基因工程菌 SMD1168-COL3al-COLlal為原始菌種，塗布YPD平板獲得單菌落，擴繁單菌落分裝為 甘油菌種保存；每次取甘油菌種，接種於5mL種子YPD培養基中，30°C振蕩培養20 24小時，轉接於400ml BMGY培養基中，30°C振蕩培養至OD600達10 12，作為一級種 子；將一級種子接入裝有4L FBS培養基的5L發酵罐中，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%,培養16-20小時，作為二級種子；將二級種子轉接入裝有30L FBS培養基的50L發酵罐中；生長培養18 20小時，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%，補加甘油至發 酵液內的菌體溼重達到150mg，飢餓1-2小時；馴化培養9小時，每三小時為一個馴化時 間段，30°C、pH值為5.0、DO 20% 30%，第一段每5分鐘補加甲醇lmL，第二段每5 分鐘補加甲醇2mL，第三段每5分鐘補加甲醇3mL;誘導培養72小時，30°C、pH值為 5.0、DO 20% 30%，視DO值提高甲醇流加速率並維持補料速度在5-10.9ml/L/h進行 發酵，至DO值浮動縮小至5% 8%，發酵結束；②純化取發酵液離心除去酵母細胞，得發酵上清液；用截留量為20000的聚碸中空纖維超 濾濃縮發酵上清液至原發酵上清液體積的20%，得超濾濃縮液；用凝膠過濾法脫除超濾 濃縮液中的無機鹽，得脫鹽液；用DAEA陰離子交換柱處理脫鹽液，以0.02MLNaCI水 溶液為平衡液，樣品溶液PH為8-9，洗脫液PH5-6，NaCIO.5MOL ；分段收集洗脫液， 電泳，色譜法檢測純度，得純度為85%以上的溶液；用截留量為20000的聚碸中空纖維 超濾濃縮至質量濃度為 5% ；③製備基因重組人膠原蛋白融合肽段冷凍乾燥，得基因重組人膠原蛋白融合肽段。
3.權利要求1基因重組人膠原蛋白融合肽段在製備化妝品中的用途。
4.按照權利要求3所述的基因重組人膠原蛋白融合肽段在製備化妝品中的用途，其特 徵在於所製備的化妝品由下述質量配比的原料製成基因重組人膠原蛋白融合肽段8 12g透明質酸0.3 0.6g甘油20 30g去離子水1000g。
5.按照權利要求4所述的基因重組人膠原蛋白融合肽段在製備化妝品中的用途，其特 徵在於所製備的化妝品由下述質量配比的原料製成基因重組人膠原蛋白融合肽段IOg透明質酸0.5g甘油25g去離子水1000g。
全文摘要
一種基因重組人膠原蛋白融合肽段，它的全長為839個胺基酸，其氮端為III型人膠原蛋白908-1137位肽段共229個胺基酸，碳端為I型人膠原蛋白497-1104位肽段共608個胺基酸，兩肽段之間用穀氨酸和苯丙氨酸連結。其製備方法由克隆I型即COL1和III型即COL3人膠原蛋白基因的cDNA、畢赤酵母重組表達載體pPIC9K-COL3a1-COL1a1的構建、基因重組人膠原蛋白融合肽段畢赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1的構建、製備基因重組人膠原蛋白融合肽段步驟組成。採用本發明方法製備的基因重組人膠原蛋白融合肽段，經試驗，可作為製備化妝品的材料。
文檔編號C07K1/36GK102020716SQ20101052776
公開日2011年4月20日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者侯曾淼, 張鳳龍, 趙金禮 申請人:西安華澳麗康生物工程有限公司