螯合澱粉樣蛋白β肽的人源化抗體的製作方法

2023-09-19 01:49:15 3

專利名稱：：螯合澱粉樣蛋白β肽的人源化抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及結合Ap肽胺基酸13到28之間的表位的人源化抗體，以及涉及預防和治療與(3澱粉樣蛋白有關的病症，例如阿耳茨海默氏病、Down氏症候群和腦澱粉樣血管病。更具體地說，本發明涉及使用人源化單克隆抗體螯合血漿、腦和腦脊髓液中的澱粉樣蛋白(3(A(3)肽，以預防AP肽在腦和腦血管中的積累或逆轉A(3肽在腦和腦血管中的沉積，由此改善認知。
背景技術：
：多種導致認知缺陷、中風、腦出血和一般性精神衰弱(generalmentaldebilitation)的症狀似乎與腦內包含澱粉樣蛋白P肽(A(3)的神經斑和腦血管斑有關。在這些病症中，有臨床前和臨床阿耳茨海默氏病、Down氏症候群以及臨床前和臨床腦澱粉樣血管病(CAA)。澱粉樣蛋白P肽形成所述澱粉樣斑。這些肽在血液和腦脊髓液(CSF)中循環，通常為與脂蛋白複合的形式。循環形式的Ap肽包含39-43個胺基酸(大多數40或42個胺基酸)，通過對共同前體蛋白的切割而產生，所述共同前體蛋白即澱粉樣前體蛋白，通常命名為APP。溶解性A(3的某些形式本身有神經毒性，可能決定神經變性和/或認知下3降的嚴重性(McLean,C.A.等,7V離o/.(1999)46:860-866;Lambert,M.P.等，(1998)95:6448-6453;Naslund,J.,J.Am.Med.Assoc.(2000)283:1571)。證據顯示Ap能夠在腦和血液之間來迴轉運(Ghersi-Egea，J-F.等，臉腳cA綴(1996)67:880-883;Zlokovic,B.V.等，腸cA艮所o//y^.A&s.Comm.(1993)67:1034-1040;ShibataM等，C//"./m^W.(2000)106:1489-1499)。此外，斑內的A(3與腦和血液中的溶解性A(3形成平衡(KawarabayashiT等，A/ewms"'.(2001)372-381)。如PCT申請US00/35681和美國序號09/153,130所述，CSF中A卩肽的總循環水平在正常個體和傾向於呈現阿耳茨海默氏病的個體中相似，這兩份文獻都通過引用結合到本文中。然而，在患有阿耳茨海默氏病的個體中，平均AP42水平要更低(Nitsch,R.M.等，A^wra/.(1995)37:512-518)。已知A(342比A(340更易聚集，當發生聚集時，隨後就出現不利後果，例如AB在澱粉樣斑中沉積、A(3轉化成毒性溶解型、神經細胞損傷和行為障礙如痴呆(Golde，T.E.等，A'oc/^附.5&;/i".Jcto.(2000)1502:172-187)。在1999年6月10日公開的PCT公開號W099/27944中，描述了誘導免疫應答以減少澱粉樣蛋白沉積的方法。該說明書假設全長聚集A(3肽可能是有用的免疫原。給予與綿羊抗小鼠IgG綴合的Ap片段(胺基酸13-28)並不導致大腦皮質澱粉樣蛋白量發生變化，並且在接受AP13-28片段綴合物注射的動物中，僅有九分之一顯示A(340作用下的淋巴增殖。該申請還指出可以使用特異性結合AP肽的抗體作為治療劑。然而，這看起來是推測性的，因為支持數據反映涉及使用例如AP42主動免疫的方法。使用佐劑提供所述肽，並確定免疫形成的抗體滴度和AP肽及前體肽的水平。該出版物明顯提示為緩解阿耳茨海默氏病症狀，必須減少AP斑，並且成功減少Ap斑需要細胞介導的過程。1999年11月25日公開的WO99/60024涉及利用抗澱粉樣蛋白抗體去除澱粉樣蛋白的方法。然而根據陳述，該機制利用抗AP抗體結合預形成澱粉樣沉積(即澱粉樣斑)的能力，導致隨後局部小神經膠質細胞清除局部斑。沒有在體內證明該機制。該出版物進一步陳述為有效對抗Ap斑，抗AB抗體必需到達腦實質並穿過血腦屏障。在2000年12月7日公開了幾份涉及嘗試控制澱粉樣斑的PCT申請。WO00/72880描述在阿耳茨海默氏病的轉基因鼠模型中，海馬內的澱粉樣斑顯著減少，而用綴合綿羊抗鼠IgG的Ap13-28片段進行治療或用對抗所述13-28片段的抗體即抗體266進行治療時，則沒有這種情況。人們斷言所述N末端定向抗體在體外研究中穿過血腦屏障，並誘導對澱粉樣斑的吞噬作用。WO00/72876公開內容事實上與WO00/72880相同，涉及用澱粉樣蛋白原纖維成分本身進行免疫。WO00/77178描述設計用於催化(3-澱粉樣蛋白水解的抗體，包括針對苯丙氨酸statine轉換化合物Cys-Ap10_25、statinePhe19-Phe20和Cys-Ap,。—25statinePhe2。-Ala21的混合物產生的抗體，以及針對在Phe^和Phe2o之間具有還原性醯胺鍵的A(31Q_25產生的抗體。該文件提到螯合AP，但這是猜測，因為它沒有給出這種螯合的證據。此外，該文件沒有提供體內證據證明給予抗體導致A(3從中樞神經系統流出、幹擾斑形成、減少澱粉樣斑負荷、在所述抗體和組織樣品中的Ap之間形成複合物、或影響認知。已經顯示Ap代謝的一條途徑是從CNS轉運到血漿(Zlokovic,B.V.等，A^/.Jcat/.(1996)93:4229-4234;Ghersi-Egea，J-F.等，J.A^wrocAem.(1996)67:880-883)。此外，已經顯示血漿中的AP能夠穿過血腦屏障並進入腦內(Zlokovic,B.V.等，^oc/化m.i仏Omm.(1993)67:1034-1040)。已經顯示在阿耳茨海默氏病的APPV""轉基因小鼠模型中，給予某些多克隆和單克隆A(3抗體降低澱粉樣斑內的A(3沉積(Bard，F.等，Mz&reAfet/.(2000)6:5916-919);然而，據說這是由於某些抗A(3抗體穿過血腦屏障，刺激小膠質細胞吞噬澱粉樣斑。在Bard的試驗中，對來自體內的腦切片的測定顯示加入的Ap抗體與外源加入的小膠質細胞一起誘導對A(3的吞噬，導致除去AP沉積。使用標準化測試可以容易地檢測CSF和血液中溶解性八(340和A(342的水平，所述標準化測試使用針對Ap4連上表位的抗體。在例如美國專利5,766,846、美國專利5,837,672和美國專利5,593,846中已經詳細報導了所述測定。這些專利描述產生針對AP肽中心域的鼠單克隆抗體，據報導這些抗體在位置16和17周圍、包括位置16和17上具有表位。還描述了針對N-末端區的抗體。據稱幾種單克隆抗體與Ap肽的位置13-28發生免疫反應；它們不結合代表位置17-28的肽，因此根據所引用的專利，這證明包括位置16-17(a-分泌酶位點)在內的該區是這些抗體的靶。在已知結合AP胺基酸13到28的抗體中包括小鼠抗體266、4G8和1C2。我們目前意外地發現對24月齡半合子轉基因小鼠(APPV717,給予266抗體非常快速並且幾乎完全地恢復認知(目標記憶(objectmemory))。然而，所述抗體並不具有本領域教導的有效治療下列疾病和病症的抗體所需的特性阿耳茨海默氏病、Down氏症候群和其它涉及AP肽的病症。更令我們驚奇的是，我們觀察到結合AP位置13到28之間的抗體(266和4G8)能夠螯合血液中結合的循環形式AP肽中的溶解型Ap,並且外周給予抗體266導致相當大量的Ap肽從CNS快速流出到血漿。這導致溶解性Ap的清除增加，防止斑澱粉樣形成，最驚人的是改善認知，甚至不一定降低Ap澱粉樣斑負荷、穿過血腦屏障達到任何顯著的程度、修飾斑、激活細胞機制或以強親和力與聚集的A(3結合。本發明的公開本發明提供人源化抗體或其片段，所述抗體或其片段積極地影響涉及Ap的疾病和病症中的認知，所述疾病和病症如臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏症候群以及臨床或臨床前腦澱粉樣血管病。所述抗體或其片段不必穿過血腦屏障、修飾澱粉樣斑、激活細胞反應或甚至不必降低澱粉樣斑負荷。另一方面，本發明提供提供人源化抗體及其片段，所述抗體或其片段螯合血液中結合的循環形式Ap肽中的Ap肽，改變溶解型Ap和結合型AJ3在中樞神經系統和血漿中的清除。又一方面，本發明提供人源化抗體及其片段，其中所述人源化抗體特異性結合AP胺基酸13到28之間的表位。再一方面，本發明提供人源化抗體及其片段，其中CDR源自小鼠單克隆抗體266,並且其中所述抗體大致保留所述小鼠抗體的結合特性，具有與所述小鼠抗體在功能上等同的體外和體內特性(序列SEQIDNO:l到SEQIDNO:6)。另一方面，本發明提供人源化抗體及其片段，其中所述可變區具有包括以下的序列來自小鼠抗體266的CDR和特異性人構架序歹'j(序列SEQIDNO:7-SEQIDNO:10),其中所述抗體大致保留所述小鼠抗體的結合特性，具有與所述小鼠抗體266在功能上等同的體外和體內特性。再一方面，本發明提供人源化抗體及其片段，其中輕鏈是SEQIDNO:ll，重鏈是SEQIDNO:12。多核苦酸序列、包含編碼所述人源化抗體或其片段的多核苷酸序列的載體、用所述載體轉化的宿主細胞或摻入表達所述人源化抗體或其片段的多核苷酸的宿主細胞、本文所公開的人源化抗體及其片段的藥用製劑、以及製造和使用上述物質的方法。預防特徵在於腦內有A(3斑或Ap毒性的疾病和病症，例如人類阿耳茨海默氏病、Down氏症候群和腦澱粉樣血管病；用於i貪斷人體內的這些疾病；以及用於確認人體是否會對使用針對Ap的人類抗體的治療有反應。可用於預防性治療以及治療性治療涉及腦內形成包含A(3的彌散斑(diffuseplaque)、神經斑和腦血管斑的病症。所述人源化抗體(包括其免疫反應性片段)導致從大分子複合物中去除Ap肽，所述大分子複合物在正常情況下涉及在體液和形成斑的位點或所述Ap肽有毒性的位點之間轉運所述A(3肽。此外，用所述抗體或其片^:螯合血漿Ap肽的作用象是一個"接受器(sink)",有效螯合血漿區室中的溶解性Ap肽，並誘導AP從中樞神經系統(CNS)的各位置進入血漿。通過螯合血液中的Ap，增強從腦的淨流出，防止溶解性AP沉積在不溶性斑內，並防止溶解性Ap在腦內形成有毒性的溶解性種類。此外，斑內的不溶性AP與溶解性A(3形成平衡，通過血液中的螯合效應，可以從腦內除去斑內不溶性A|3。用所述抗體螯合Ap肽也增強從體內去除所述Ap肽，抑制溶解性Ap在腦內的毒性效應，並抑制不溶性A(3發展並進一步積累成為斑內的澱粉樣蛋白。用於本發明的抗體並不大量穿過血腦屏障(幼.1%血漿水平)。此外，當外周給予用於本發明的人源化抗體時，所述抗體不必在結合A(3肽後或自由循環時在腦內引發細胞免疫應答以發揮它們的有益作用。此外，當外周給予時，所述抗體不必可觀地結合腦內聚集的A(3肽以發揮它們的有益作用。因此，一方面，本發明涉及治療和預防特徵在於在人體內形成包含P-澱粉樣蛋白的斑的病症，該方法包括給予(最好是外周給予)需要所述治療的人治療有效量或預防有效量的人源化單克隆抗體或其免疫反應性片段，所述抗體特異性結合Ap肽的中心區。又一方面，本發明涉及抑制人體內澱粉樣斑形成和清除人體內澱粉樣斑的方法，所述方法包括給予需要所述抑制作用的人類個體有效量的人源化抗體，所述抗體螯合其血液循環形式中的A(3肽，誘導A(3肽流出腦，並改變血漿和腦中的Ap清除。再一方面，本發明涉及所述人源本發明還包括對診斷患有臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏症候群或臨床或臨床前腦澱粉樣血管病的患者逆轉認知下降、改8善認知、治療認知下降和預防認知下降的方法，所述方法包括給予所述個體有效量本發明的人源化抗體。本發明還包括使用本發明的人源化抗體生產藥物，包括延長所述抗體或抗體片段的重組序列在人體組織內的表達，以治療、預防或逆轉阿耳茨海默氏病、Down氏症候群或大腦血管澱粉樣樣變性；以治療、預防或逆轉臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏症候群或臨床或臨床前大腦血管澱粉樣樣變性的認知下降；或抑制澱粉樣斑的形成或抑制毒性溶解性AP在人體內的效應。本發明涉及驚人的觀察結果在給予本發明抗體後短時間內，相當大量的Af3從中樞神經系統流出到血液。因此，本發明包括評價方法，評價人類個體對於用結合AP或其片段的抗體治療的反應，該方法包括a)給予所述個體所述抗體或其片段；然後b)測量Ap在所述個體血液中的濃度。該方法包括a)給予所述個體首次量的所述抗體或其片段；b)給予第一次劑量後3小時到2周內，測量Ap在所述個體體內的濃度；c)如果需要，根據步驟b)的結果計算抗體或其片段第二次的量，其中第二次的量與第一次的量相同或不同；然後d)給予第二次劑量的所述抗體或其片段。本發明還包括評價方法，評價在人類個體中抗體結合A(3或其片段以抑制或預防A(3澱粉樣斑形成、減少A(3澱粉樣斑、降低毒性溶解性Ap的作用或治療與A(3斑有關的病症或疾病的效能，該方法包括a)獲取所述個體血漿或CSF的第一份樣品；b)測量第一份樣品中Ap的基線濃度；c)給予所述個體所述抗體或其片段；d)給予所述抗體或其片段後3小時到2周，獲取所述個體血漿或CSF的第二份樣品；然後e)測量第二份樣品中AP的濃度；其中，效能與血液中結合所述抗體的AP的量以及CSF中A(3的濃度有關。附圖簡述圖1顯示通過Mab266用透析膜從人腦脊髓液回收A(3肽的百分率與透析膜截止分子量的函數。圖2顯示在注射200|ig或600|igMab266後APpV""轉基因小鼠血漿內存在的APT。^濃度與時間的函數。圖3A顯示在用鹽水、小鼠IgG或Mab266治療的APpV""轉基因小鼠皮質內A(3肽沉積的量。圖3B顯示這些結果與親代來源的相關性。圖4顯示用於從質粒pVk-Hu266表達人源化266輕鏈的多核普酸序列以及所表達的人源化266輕鏈的單胺基酸編碼(成熟時對應於SEQIDNO:l1)。Hu266輕鏈基因的完整序列位於pVk-Hu266的Mlul位點和BamHI位點之間。核苷酸數指示其在pVgk-Hu266中的位置。Vk和Ck外顯子翻譯為單字母編碼；點指出翻譯終止密碼子。成熟重鏈起始於雙下劃線的天冬氨酸(D)。內含子序列以斜體表示。圖5顯示用於從質粒pVgl-Hu266表達人源化266重鏈的多核苷酸序列和所表達的人源化266重鏈的單胺基酸編碼(成熟時對應於SEQIDNO:12)。Hu266重鏈基因的完整序列位於pVgl-Hu266的Mlul位點和BamHI位點之間。核苷酸數指示其在pVgl-Hu266中的位置。VH和CH外顯子翻譯為單字母編碼。點指出翻譯終止密碼子。成熟重鏈起始於雙下劃線的穀氨酸(E)。內含子序列以斜體表示。圖6是pVk-Hu266的質粒圖。圖7是pVgl-Hu266的質粒圖。發明實施方式在人類生物學液體內循環的AP肽代表染色體21編碼的前體蛋白的羧基末端區。根據體外實驗的結果，已經報導AP肽在生理溶液內溶解度很小，因為它包含一段疏水胺基酸，該段胺基酸構成將其更長的前體錨定到細胞脂質膜的區段的一部分。因此，並不奇怪循環AP肽通常與其它部分結合，防止其聚集。這導致難以檢測生物學液體中循環Ap肽。上面提到的專利文件(美國專利5，766，846、美國專利5,837,672和美國專利5，593，846)描述抗體製備，包括單克隆抗體，由於所述抗體針對克隆266，因此將其命名為克隆266，已經顯示該抗體特異性結合包含A卩肽胺基酸13-28的肽。本發明申請人已經發現結合該10區的抗體與結合Ap胺基酸序列中其它位點的抗體不同，能夠非常有效地從大分子複合物中螯合溶解性Ap肽。該螯合將實現AP肽從CNS的淨流出，改變其在CNS和血漿中的清除，降低其用於形成斑的有效性。因此，具有該特異性的抗體提供預防性治療和治療性治療與形成p-澱粉樣蛋白斑有關的病症的機會，其中將所述抗體轉化為人源化形式以降低它們的免疫原性。如上文提到的，這些病症包括臨床前和臨床阿耳茨海默氏病、Down氏症候群以及臨床前和臨床腦澱粉樣血管病。本文所用的術語"治療"包括治療性治療(已知存在需要治療的病症)、預防(即防止)或改善未來可能發生的病症。"結合Ap肽中區的單克隆抗體"指結合胺基酸序列的單克隆抗體(Mab或Mabs)，所述胺基酸序列代表A(3位置13到28之間所包含的表位。不一定針對整個區。只要所述抗體結合該區內的至少一個表位(例如，尤其是包括a分泌酶位點16-17或抗體266結合的位點)，所述抗體就可以有效用於本發明的方法。"抗體"本質上指單克隆抗體或其免疫有效片段，例如其F化、F化,或F帥,)2片段。在本文的一些地方，將特別強調片段；然而，應當知道不論是否特定指出是片段，術語"抗體"包括這樣的片段以及單鏈形式。只要所述蛋白保持特異性結合其既定靶的能力，在結合後螯合分離Ap肽與其血液中的載體蛋白，它就在術語"抗體"的範圍內。定義"抗體"還包括，例如，具有該特異性的抗體的單鏈形式，該形式一般情況下名為Fv區。用於本發明的抗體最好但不一定是重組產生，因為需要操作具有合適特異性的抗體，所述抗體一般情況下是小鼠抗體或其它非人類抗體，將它們轉化為人源化形式。抗體可以是糖基化的或未糖基化的，而優選糖基化抗體。眾所周知，抗體通過二碌^建適當交聯。已知基本抗體結構單位包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對鏈包含一條"輕"鏈(約25kDa)和一條"重"鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個約100到IIO個胺基酸或更長的可變區，該可變區負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分定義一個恆定區，該區主要負責效應子功能。輕鏈分為y、|u、a和X。重《連分為y、|u、a、5或s,分別將抗體同種型定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區通過一個約12個胺基酸或更長的"J"區連接，重鏈還包括一個約10多個胺基酸長的"D"區。每個輕鏈/重鏈對的可變區形成抗體結合位點。因此，完整的抗體具有兩個結合位點。所有鏈都呈現同樣的通用結構，其中三個高變區連接相對保守的構架區(FR)，所述通用結構也稱為互補決定區或CDR。所述構架區使來自每一對兩條鏈的CDR平行排列，使其能夠結合特異性表位。從N末端到C末端，輕鏈和重鏈都包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。4安照眾所周知的慣例劃分每個域的胺基酸[Kabat"具有免疫價值的蛋白質序列"NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.，1987和1991;Chothia等，Mo/.腸/.'196:901-917(1987);Chothia等，胸騰342:878-883(1989)]。本領域內眾所周知，通過標準技術可以容易地產生具有合適特異性的單克隆抗體接種哺乳動物，從所述哺乳動物的抗體生成細胞形成雜交瘤，或用其它方法使所述細胞無限增殖化，然後培養所述雜交瘤或無限增殖化細胞，評價它們的合適特異性。在本發明的情況下，可以如下產生所述抗體例如，用代表一個表位的肽免疫人、兔、大鼠或小鼠，所述表位包括Ap肽的13-28區或其合適亞區。從產生所需抗體的雜交瘤或其它細胞回收所述核苦酸序列，獲得用於重組操作的材料。然後操作這些核苷酸序列，以人源化形式提供它們。"人源化抗體"指這樣的抗體通過改變具有非人類互補決定區(CDR)的抗體的序列，使所述抗體部分或全部由來自人抗體種系的胺基酸序列組成。最簡單的所述改變包括僅僅用人抗體的恆定區取代小鼠恆定區，產生人/小鼠嵌合體，該嵌合體具有藥物應用可接受的足夠低的免疫原性。然而，最好也用目前本領域內眾所周知的技術人源化所述抗體的可變區甚至CDR。用對應的人構架區取代所述可變區的構架區，保持所述非人類CDR基本完整，或甚至用來自人類基因組的序列取代所述CDR。在遺傳改造小鼠體內產生完全的人抗體，其中已經改變所述小鼠的免疫系統使其對應於人免疫系統。如上文所提到的，使用所述抗體的免疫特異性片段、包括代表單鏈形式的片段足以應用於本發明方法。人源化抗體還指這樣的抗體所述抗體包含人類構架區、至少一個來自非人類抗體的CDR，其中存在的任何恆定區與人免疫球蛋白恆定區基本相同，即至少約85-90%相同，優選至少95%相同。因此，人源化抗體的所有部分，可能除CDR外，都與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的對應部分基本相同。例如，人源化免疫球蛋白一般不包括嵌合型小鼠可變區/人恆定區抗體。當用於人類治療時，人源化抗體與非人類和嵌合抗體相比至少有三個潛在的優勢1)因為效應部分來自人類，因此它可以與人類免疫系統的其它部分更好地相互作用(如通過依賴補體的細胞毒性(CDC)或依賴抗體的細胞毒性(ADCC)更有效地破壞靶細胞)。2)人類免疫系統不會將所述人源化抗體的構架區或C區識別為外源成分，因此針對所述注射抗體的抗體應答應該比針對完全外源的非人類抗體或部分外源的嵌合抗體的抗體應答更小。3)已經報導注射非人類抗體在人體循環中的半壽期比人抗體相同的半壽期，使得可以使用更少和更低頻率的劑量。可以如下設計人源化免疫球蛋白。當胺基酸屬於下面類別時，用來自提供CDR的非人類免疫球蛋白(供體免疫球蛋白)的構架胺基酸取代需要使用的人免疫球蛋白(接受者免疫球蛋白)的構架胺基酸13(a)所述接受者免疫球蛋白人構架區內的胺基酸在該位置對於人免疫球蛋白是不常見的，而所述供體免疫球蛋白中的對應胺基酸在該位置對於人免疫球蛋白是常見的；(b)所述胺基酸的位置緊接其中一個CDR;或(c)在三維免疫球蛋白模型中，構架胺基酸中的任何側鏈原子與CDR胺基酸任一原子的距離在約5-6埃之內(中心到中心)[Queen等,同前，和Co等，/Voc.A/fl"JcW."5L488,2869(1991)]。當所述接受者免疫球蛋白人構架區內的每一個胺基酸以及所述供體免疫球蛋白內的對應胺基酸在該位置對於人免疫球蛋白是不常見的，那麼就用在該位置對於人免疫球蛋白是常見的胺基酸取代所述胺基酸。優選的人源化抗體是小鼠抗體266的人源化形式。人源化266的CDR具有如下胺基酸序列輕鏈CDR1:1510:15ArgSerSerGinSerLeulieTyrSerAspGlyAsnAlaTyrLeuHis(SEQIDNO:l)輕鏈CDR2:15LysValSerAsnArgPheSer(SEQIDNO-2)輕鏈CDR3:SerGinSerThrHisValProTrpThr(SEQIDNO:3)重鏈CDRl:15ArgTyrSerMetSer(SEQIDNO:4)重鏈CDR2:15.1015GinlieAsnSerValGlyAsnSet"ThrTyrTyrProAspThrValLysGly(SEQ工DNO:5)和重鏈CDR3:GlyAspTyr(SEQIDNO:6)本發明人源化抗體的優選輕鏈可變區具有如下胺基酸序列，其中所述構架來自人種系Vk區,殳DPK18和J區^史Jkl，並且在同一人V亞組的共有胺基酸發生幾個胺基酸取代以減少潛在的免疫原性iAspGlyTyrGlyS10XaaValMetThrGinXaaProLeuSerLeuProValXaa20GinProAlaSerlie35SerAspGlyAsnAla50GinSerProXaaLeu65SerGlyValProAspArg80PheTkrlieuLyslieSerSerCysArgTyr!LeuHisLeulieTyxPheSerGly25Ser40Trp55Lys70Sear85ArgValGluAlaSerGinSerLeuPheLeuGinLysValSerAsnArgGlySerGlyTh:rGluAspXaaGlyTyrGly95TyxCysSerGinSeir100ThrHisValProTrpThrPheGly15Xaa30Xaa45Pro60Phe75Asp90Val105Xaa110ThrXaaXaaGlulieLysArg(SEQIDNO:7)其中.-在位置在位置在位置在位置2的Xaa是Val或lie;7的Xaa是Ser或Thr;14的Xaa是Thr或Ser;15的Xaa是Leu或Pro;在位置30的Xaa是lie或Val;在位置50的Xaa是Arg、Gin或Lys;在位置88的Xaa是Val或Leu;在位置105的Xaa是Gin或Gly;在位置108的Xaa是Lys或Arg;和在位置109的Xaa是Val或Leu。本發明人源化抗體的優選重鏈可變區具有如下胺基酸序列，其中所述構架來自人種系VH區^殳DP53和J區段JH4，並且在同一人亞組的共有胺基酸發生幾個胺基酸取代以減少潛在的免疫原性XaaValGinLeuGlySe:rlieuArgTyrSerMetXaaLeuValAlaPro'AspXaaValXaaAsiiThrLeuThrAlaValTyrThrXaaValThr5Val20lieu3SSer50Gin65Lys80Tyr95Tyr110ValGluTrpXaaGlyGlyCysAlaAlaValArgGin10Gly25lieuValGinPro15Gly30SerGlyPheThrPheProGlyLysGlyAsnSerThrTyrSerArgAspAsnlieuArgAlaXaa100CysAlaSerGlyAspTyrTrpGly(SerSer(SEQIDNO:8)lieAsnSerValGlyArgPheThrLeuGinMetAsn40AlaS5Gly70lie85Ser45lieu60Tyr75Xaa30Asp105Gly其中在位置1的Xaa是Glu或Gin;在位置7的Xaa是Ser或Leu;在位置46的Xaa是Glu、Val、Asp或Ser;在位置63的Xaa是Thr或Ser;在位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr;在位置76的Xaa是Lys或Arg;16在位置89的Xaa是Glu或Asp;和在位置107的Xaa是Leu或Thr。列，其中所述構架來自人種系Vk區段DPK18和J區段JK1,並且在同一人V亞組的共有胺基酸發生幾個胺基酸取代以減少潛在的免疫原性1510AspValValMetThrGinSerProLeuSerLeuProValThr2025GlyGinProAlaSer工leSerCysArgSerSerGinSerLeu3540lieuTyrSerAspGlyAbuAlaGlyGinSerProSerGlyValProPheThr!Leu!LysTyrTyrCysSerGlyThrLysVa:LGlulieSOArg65Asp80工le95Gin110GluTyrlieuHisTrpPheLeuGinLysSerAsnArgArgPheSerGlySerGlySerGlyTlir55]jeulieTyrLys70Val85SerArgValGluAlaGluAspValGly100SerISlieu30lie45ProSOPhe75Asp90Val105GillThrHisValProTrpThrPheGlyIyBArg(SEQIDNO:9)本發明人源化抗體特別優選的重鏈可變區具有如下胺基酸序列，其中所述構架來自人種系VH區段DP53和J區段JH4:GluValGinlieuGlySerLeuArgArgTyrSerMet:5Vai20lieu35Ser50GluSerGlyGlySerCys10GlyLeuValGinPro25AlaAlaSerGlyPheThrPhe40TrpValArgGinAlaPro55GluLeuValAlaGin工leAsnSerValGlyAsn65ProAspThrValLysGlyArgPheThr70lieLysAsnThr!LeuThrAlaValTyr80TyrLeuGinMetAsnCysAlaSearGly85Se;rOlyIiysGlySerThrTyrSerArgAspAsnI*euArgAlaGlu100AspTyrTrpGlyGin15Gly30Ser45Leu60Tyr75Ala90Asp105GlyThrLeuValThrValSerSer(SEQIDNO:10)18本發明人源化抗體優選的輕鏈具有如下胺基酸序列15AspValValMetTtu:GinSerProLeu20GlyGinProAlaSea:lieSerCysArg35TyrSerAspGlyAsnAlaTyrLeuHisGlyGinSearProSerGlyValProPheThrLeuLysTyrTyrCysGlyThrLys50.A^rgLeuJjeulieTyr65Asp80lieArgPheSerGlySerArgValGlu10Ser2540Trp55Lys70Ser85Ala15UeuProValThrlieu30SerGinSerLeu.liePheValGlyGlu95SerGinSerThrHisValValPheliePheProSerValValValGinTrpGluSerValCysLysThrSerSerThrLeuCys110Glu:125:Pro140〕beuVal170(3lu:L85Thr200GlulieLysArgThrSerAspGluGinLeuAsnAsnPheAspAsnAlaLeu100ProTrp115ValAl3130lieuLys145TyrPro160GinSer175GinAspSerLysAspSer190LeuSerLysAlaAspTyr205ValThrHisGinGlyLeulieuGinLysSerAsnArgSerGlyThrAspValGlyThrPheGlyAlsProSerSerGlyThrArgGluAlaGlyAsnSerThr"TyrSerGluLysHisSerSerPro45P;ro6075Asp90Val105Gin120Val135Ala150Lys165Gin180Leu195!Lys210Val215PheAsnArgGlyGluCys(SEQIDNO:11}ValTyrAlaThrLysSsr本發明人源化抗體優選的重鏈具有如下胺基酸序列:151015GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly19GlySerLeuArgArgTyrSerMetGluJLeuValAlaProAspThrValLysAsuThr!LeuThrAlaValTyr2025LeuSerCysMaAlaSer3540SerTrpValArgGinAla50GinlieAsnSerVal65Lys80Tyr95TyrGlyArgPheThr55Gly70lieGlyPheThrPheProGlyLysGlyAsnSerThrTyr30Sear45Leu60Tyr75SerArgAspAsnAla85lieuGinMetAsnSerlieuArgAlaGluCysAlaSerGly110ThrLeuValThrValSerSerAlaSer125PheProLeuAlaProSerAlaLeuGlyCysValSerTrpAsn140:Leu155170ProAlaValLeuG工nSer185ValThrValProSerSer200AsnValAsnHiLysProGluProLysSerAlaProGlulieuLysProLysAspCysValValValAsnTrpTyrVa!1ProArgGluGluLeuThrValLeu215Cys230Ijeu245ThrAsp275Asp290Gin305HisSerLysSerValLysAspTyxGlyAlaLeuThrSerGlylieuSerLeuGlySsrAs:dThrAspLysTill:HisGlyGlyProSerLeuMetlieSea:ValSerHisGluGlyValGluValTy:cAsnSerTh:rGinAspTrpLeu100AspTyrTrpGlyGin115ThrLysGlyProSer130Th:rSerGlyGlyThr145PheProGluProVal160SerGlyValHisThr175TyrSerlieuSerSerThrGinThrTyr工le205LysValAspLysLys220TlxrCysProProCys235ValPheLeuPhePro250ArgThrProGluValAspProGluValLys280HisAsnAlaLysThr235TyrArgValValSer310AsnGlyLysG工uTyr90Asp105Gly120Val135Ala150Thr165Phe180Cys210Val225Pro240Pro255Thr270Phe285Lys300Val315CysLysValSerlieSearIysAlaLeuProProSerThrCysLeuValTrpGluSerAsnProValIeuAspThrValAspLysSerValMetHis320Asn335Lys35.0Arg3S5Lys3B0Gly335Ser410Ser425GluIysAlaLeuProGlyGinProArgAspGlulieuThrGlyPheTyrProGinProGluAsnAspGlySerPheArgTrpGinGinAlaLeuHisAsn325AlaPro340GluPro355LyBAsm370SerAsp385AsnTyr400Phelieu415GlyAsn430HisTyrlieGluLysGinValTyrGinValSerlieAlaValLysThrltu:TyrSerLy日ValPheSerThrGlrxLys330Thr345Thr360Leu375Glu390Pfo405]jeu420Cys435Ser440LeuSerLeuSerProGlyLys(SEQIDNO:12)還有其它可能可以作為本發明人源化抗體和人源化266的輕鏈和重鏈的序列。所述免疫球蛋白具有兩對輕鏈/重鏈複合物，至少一條鏈包含與人構架區段功能性連接的一個或多個互補決定區。另一方面，本發明涉及編碼抗體的重組多核苷酸，當所述抗體得到表達時，其包含本發明抗體的重鏈和輕鏈CDR。至於人構架區，將提供CDR的非人類免疫球蛋白構架區或可變區胺基酸序列與人免疫球蛋白可變區序列集合中的對應序列相比較，選擇相同胺基酸百分率高的序列。圖4和圖5給出代表性多核苷酸，當所述多核苷酸表達時編碼包含單克隆抗體266重鏈和輕鏈CDR的多肽鏈。由於密碼子簡併性和非關鍵胺基酸取代，可以使用其它多核苷酸序列容易地取代那些序列。本發明尤其優選的多核苷酸編碼抗體，當所述抗體得到表達時，其包含SEQIDNO:l-SEQIDNO:6的CDR、或SEQIDNO:7—SEQIDNO:10的任何可變區、或SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12的輕鏈和重鏈。所述多核芬酸一般還包括有效連接人源化免疫球蛋白編碼序列的表達控制多核苷酸序列，包括天然連接或異源的啟動子區。所述表達控制序列最好是處於能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統，但也可以使用針對原核宿主的控制序列。一旦將所述載體摻入合適的宿主細胞系，就在適於高水平表達所述核苷酸序列的條件下培養所述宿主細胞，然後根據需要收集和純化輕鏈、重鏈、輕鏈/重鏈二聚體或完整抗體、結合片段或其它免疫球蛋白形式。可以從多種不同多核苷酸(基因組或cDNA、RNA、合成寡核苷酸等等)和成分(如V、J、D和C區)，並通過多種不同技術形成能夠最終表達所需人源化抗體的本發明核香酸序列。連接合適的基因組序列和合成序列是生產的通用方法，但也可以利用cDNA序列。可以按照眾所周知的程序，從多種人類細胞(優選無限增殖化的B細胞)分離人恆定區DNA序列。相似地，可以從能夠結合AP肽胺基酸13到28之間表位的非人類單克隆抗體獲得用於生產本發明免疫球蛋白的CDR,所述單克隆抗體如上文所述，通過眾所周知的方法在任何方便的哺乳動物來源中生產，包括小鼠、大鼠、兔或能夠產生抗體的其它脊推動物。可以從本領域內眾所周知的多種來源獲取適合所述多核苷酸序列的來源細胞以及用於表達和分泌免疫球蛋白的宿主細月包。除本文專門描述的人源化免疫球蛋白外，利用本領域內技術人員眾所周知的各種重組DNA技術可以容易地設計和生產其它"基本同源"的修飾免疫球蛋白。例如，所述構架區可能因為幾個胺基酸取代、末端和中間添加和缺失等等，在一級結構水平上與天然序列有所不同。此外，可以單獨使用或組合使用多種不同的人構架區作為本發明人源化免疫球蛋白的基礎。一般地說，通過各種眾所周知的技術可以容易地進行基因修飾，所述技術例如定點誘變。或者，可以產生僅包含部分一級抗體結構的多肽片段，所述片22段具有一種或多種免疫球蛋白活性(如補體結合活性)。如下產生這些多肽片段通過本領域內眾所周知的方法蛋白水解切割完整的抗體，或使用定點誘變在載體中所需位點插入終止密碼子，如在CH1後插入以產生Fab片段或在鉸鏈區後插入以產生F(ab')2片段。通過用DNA接頭連接VL和VH，可以產生單鏈抗體。如以前所述，當將所述序列有效連接表達控制序列(即定位以保證表達控制序列發揮作用)後，在宿主中表達所述編碼核苷酸序列。這些表達載體一般在宿主生物中或者作為附加體、或者作為宿主染色體DNA的整合部分複製。表達載體一般包含選擇標記(如四環素或新黴素)，以便可以檢測出那些受到所需DNA序列轉化的細胞。大腸桿菌(E.co")是尤其適用於克隆本發明多核苷酸的原核宿主。適用的其它微生物宿主包括桿菌，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)，以及其它腸桿菌科，如沙門氏菌屬、沙雷菌屬(Serratia)和各種假單胞菌屬菌。也可以製造在這些原核宿主中的表達載體，所述表達載體一般將包含適合所述宿主細胞的表達控制序列(如複製原點)。此外，可以利用多種眾所周知的啟動子中的任何一種，例如乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、P-內醯胺酶啟動子系統或來自X噬菌體的啟動子系統。所述啟動子一般控制表達，可選地與操縱基因一起控制表達，並且具有核糖體結合位點序列等等，以起始和完成轉錄和翻i奪。其它微生物如酵母也可用於表達。酵母屬是優選宿主，根據需要，合適的載體具有表達控制序列，如啟動子(包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶)和複製原點、終止序列等等(根據需要)。除微生物外，也可使用哺乳動物組織細胞培養物表達和產生本發明的多肽。事實上優選真核細胞，因為本領域已經發展出多種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS糹田胞系、金黃倉鼠卵巢細胞系、HeLa糹田月包，最好是骨髓瘤細胞系、轉化B細胞、人胚胎腎細胞系或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，例如複製原點、啟動子、增強子和必需的加工信息位點如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。優選的表達控制序列是來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等等的啟動子。可以通過眾所周知的方法將包含目標核苷酸序列(如重鏈和輕鏈編碼序列以及表達控制序列)的載體轉移進宿主細胞，所使用的方法根據細胞宿主類型而不同。例如，氯化鈣轉染一般用於原核細胞，而磷酸4丐處理或電穿孔可用於其它細胞宿主。一旦表達本發明的完整抗體、其二聚體、各個輕鏈和重鏈或其它免疫球蛋白形式後，就可以根據本領域內標準程序純化它們，所述程序包括硫酸銨沉澱、離子交換、親和層析、反相層析、疏水相互作用柱層析、凝膠電泳等等。對於藥物應用，優選具有至少約90到95%同質性的基本純免疫球蛋白、最優選具有98到99%或更高同質性。一旦根據需要部分純化所述多肽或純化所述多肽至同質性後，可以如本文所述將所述多肽用於治療或預防。使用標準給藥技術，將所述抗體(包括免疫反應性片段)給予表現Ap相關症狀或疾病或受到所述症狀或疾病威脅的個體，所述症狀或疾病例如臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏症候群、或臨床或臨床前澱粉樣血管病，所述標準給藥技術最好是通過靜脈內給予、腹膜內給予、皮下給予、肺部給予、經皮給予、肌內給予、鼻內給予、口月空含4匕糹合藥法、舌下糹會予或才全劑糹會予(suppositoryadministration)進行外周給藥(即不給予中樞神經系統)。雖然可以將所述抗體直接給予腦室系統、脊髓液或腦實質，並且對這些位置給藥的技術是本領域內眾所周知的，但不必利用這些更困難的程序。當通過依賴於外周循環系統的更簡單技術給予時，本發明抗體是有效的。本發明的優點包括所述抗體能夠在甚至不直接提供給中樞神經系統本身的情況下發揮其有益的效果。而本文確實已經證明穿過血腦屏障的抗體量低於血漿水平的0.1%,而本發明抗體表現出能夠螯合外周循環24中的Ap，並且改變CNS和血漿中溶解性A(3的清除。設計用於給藥的藥用組合物，使其適於選定的給藥模式，合適地使用藥學上可接受的賦形劑如分散劑、緩衝劑、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等張劑、穩定劑等等。Remington'sPharmaceuticalScience,MackPublishingCo.，EastonPA,最新版，通過引用結合到本文中，提供醫師眾所周知的製劑技術綱要。改變本發明抗體的溶解度特性是特別有用的，例如通過將它們包嚢在脂質體中，或通過封閉極性基團而使它們更加親脂。優選通過靜脈內注射或腹膜內注射或皮下注射進行的外周系統性傳遞。用於所述注射劑的合適媒介是簡單的。然而，此外，可以採用鼻氣霧劑或栓劑的方法通過黏膜進行給藥。用於所述給藥模式的合適製劑是眾所周知的，所述製劑一般包括便利跨膜轉運的表面活性劑。所述表面活性劑常常是類固醇衍生物或者是陽離子脂類，例如N-[1-(2,3-二油醯基)丙基-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)或各種化合物如半琥珀酸膽固醇酯、磷脂醯甘油等等。製劑中人源化抗體的濃度低至約0.1%重量比，高至15或20%重量比，該濃度主要根據液體體積、粘度等等，按照選定的具體給藥模式選擇。因此，典型的注射用藥用組合物將包含1mL磷酸緩衝鹽水的無菌緩衝水和1-100mg本發明人源化抗體。製造所述製劑後，無菌過濾，或用其它方法處理使其在微生物學上可接受。典型的用於l爭脈內輸注的組合物可包括高至250mL液體體積，如無菌Ringer氏溶液，以及1-100mg/mL或更高的抗體濃度。本發明的治療劑可以冷凍或凍幹保存，然後使用前用合適的無菌載體重建。凍幹和重建會導致不同程度的抗體活性喪失(如對於常規免疫球蛋白，IgM抗體的活性喪失比IgG抗體更嚴重)。可能需要調整劑量以進行補償。選擇所述製劑的pH以平衡抗體穩定性(化學和物理穩定性)並使其在給予患者時更舒服。一般地說，4到8之間的pH是可以接受的。雖然前述方法看起來對於給予蛋白如人源化抗體是最方便和最合適的，但其它給藥技術(如經皮給藥和口服給藥)經過改進後，只要設計合適的製劑，也可以使用。此外，比較理想的是採用控釋製劑，所述控釋製劑使用生物可降解膜和基質、或滲透性微型泵、或基於葡聚糖珠、藻酸鹽或膠原蛋白的傳遞系統。總的來說，可以獲得用於給予本發明抗體的製劑，所述製劑是本領域內眾所周知的，可以從多種選擇中選出合適的製劑。可以使用標準臨床技術最優化一般劑量水平，並且一般劑量水平取決於給藥模式和患者的狀況。下面的實施例將舉例說明本發明而不是限制本發明。其中下文的實施例使用名為"266"的小鼠單克隆抗體，該抗體最初通過用包含人A(3肽殘基13-28的肽接種而製備。已經證實該抗體與所述肽發生免疫反應，但以前衝艮道該抗體不與僅包含人Ap肽殘基17-28的肽、或在所述AP肽內其它任何表位上反應。美國專利5,766,846描述了該抗體的製備，通過引用結合到本文中。由於本文的實施例描述在小鼠系統內進行的實驗，使用小鼠單克隆抗體是令人滿意的。然而，在本發明應用於人類的治療方法中，優選具有對應於抗體266的免疫特異性的人源化形式抗體。實施例1螯合人類體液中加入的AP肽如下在室溫下溫育人腦脊髓液(CSF)樣品(50pl)和人血漿樣品1小時1.單獨溫育；2.與5ngA(340肽一起溫育；或3.5ngA卩40肽和1mg單克隆抗體266(在例如美國專利5,766,846中描述，通過引用結合到本文中)。所述樣品隨後在4-25%非變性梯度膠上電泳(即非變性梯度電泳(NDGGE))，然後轉移到硝酸纖維素上。所述印跡隨後用PonceauS染色或者用針對Ap肽頭五個胺基酸的生物素標記單克隆抗體(3D6)探觀'K蛋白質印跡分析)，用鏈黴抗生物素-辣根過氧化物酶顯象，然後通過增強化學發光(ECL)檢測。根據Pharmacia分子量標記估計所述印跡帶中所包含材料的水合直徑。因此，假如所述AJ3肽結合其它分子，它將按照所得複合物的大小遷移。用或不用5ngAP肽對CSF進行的蛋白質印跡顯示沒有證據表明A(3肽響應由抗體3D6介導的才企測。對於人血漿獲得相似的結果。儘管對於同樣的CSF樣品，使用同樣技術通過SDS-PAGE以及隨後的蛋白質印跡可以檢測到Ap肽，但這是事實。大概是該肽與所育物中加入Mab266,代表與所述抗體複合的螯合Ap肽的特徵帶在血漿和CSF中同時存在。主要帶約11nm水合直徑，對應於抗體單體，另有一個13nm的小帶，對應於抗體二聚體。實施例2螯合抗體的特異性使用含50jil人CSF或10|nlAPPV7I7FCSF的樣品。APP罰7F是轉基因小鼠，代表阿耳茨海默氏病的小鼠模型，在該模型中表達帶有家族性阿耳茨海默氏病突變的人澱粉樣蛋白前體轉基因，從而導致在中樞神經系統中產生人AP肽。如實施例1所述，將所述樣品在存在或不存在各種Mab(l|iig)的情況下於室溫下溫育1小時，然後在4-25%NDGGE上電泳，隨後在硝酸纖維素上形成印跡。所述抗體如下Mab266(結合位置13-28);Mab4G8(結合位置17-24);QCBpan(針對位置1-40的兔多克隆抗體)；小鼠IgG(非特異性)；Mab3D6(結合位置1-5);Mab21F12(結合位置33-42);Mab6E10(結合位置1-17);和QCB4,42(針對Ap40和A(342的兔多克隆抗體)。如實施例1所述檢測Ap肽抗體複合物首先使用生物素標記的3D6(針對AP肽N-末端)，隨後使用鏈黴抗生物素蛋白-HRP和ECL。在人CSF中的相似檢測與Mab266—起溫育，在某些情況下用結合Ap肽羧基末端的QCB4。,42取代3D6。結果顯示在測試的抗體中，只有在Mab4G8和Mab266的情況下檢測到Ap肽。結果顯示對於人CSF，只有Mab266和Mab4G8能夠以可檢測到的量螯合抗體A(3複合物(同樣，在沒有抗體存在的情況下，檢測不到A(3)。Mab266也能夠對於使用人CSF、APPV717F轉基因小鼠CSF的實驗產生相似結果。不論是否使用3D6或QCB4o,42抗體顯影蛋白質印跡，使用Mab266都能夠螯合人CSF中的Ap肽。實施例3通過雙向電泳顯示Af3肽-266複合物包含50ngAP4Q肽的樣品與2|ugMab266在37。C溫育3小時。對應地單獨溫育Mab266作為對照。然後對所述樣品進行雙向凝"交電泳。在第一向，如實施例1所述對所溫育的樣品進行NDGGE。將聚丙烯醯胺凝膠以垂直於第一向的方向切成單獨的泳道，然後在變性/還原條件下，通過SDS-PAGE(Tricine尿素凝膠)在第二向進行凝膠分離。通過Ponceau-S染色(任何蛋白)，或通過在基於HRP的檢測系統中使用6E10Mab(Senetek,Inc.)和生物素化抗小鼠Ap進行特異性顯影，檢測帶的存在。28轉移後對硝酸纖維素印跡進行Ponceau-S染色，使Mab266的重鏈和輕鏈可見。經證實，A(3肽與Mab266形成複合物，表現為一條4kD的帶，該帶與第一向NDGGE後看到的全長Mab266的大小對齊。實施例4證明在結合與螯合之間沒有對等性人們認為當A(3肽在血漿和CSF中循環時，它與蛋白質形成複合物，所述蛋白質包括載脂蛋白E。本實施例證明針對apoE的抗體雖然能夠結合所述複合物，但不能螯合分離apoE與所述複合物的其它部分。將ApoE複合物(500ng)與針對apoE的Mab或多克隆抗體(2叱)在37。C溫育1小時。然後使用在實施例1中描述的技術，對所溫育的樣品進行NDGGE。NDGGE後，用親和純化的山羊抗apoE抗體進行蛋白質印跡分析，通過ECL4企測。當不存在抗體時，4全測到apoE處在8-13nm,該直徑與其以脂蛋白顆粒存在一致。針對apoE的單克隆抗體或多克隆抗體的存在導致apoE群體漂移到更大的分子，即"超級漂移(supershift)"。這證明針對apoE的抗體並不螯合分開apoE與脂蛋白顆粒(即從脂蛋白顆粒去除apoE)，而是結合於脂蛋白上的apoE,產生更大的分子。實施例5抗apoE抗體並不幹護u對A(3的螯合100|id人CSF樣品或者僅與Mab266、或者與多克隆抗apo-E、或者與這兩種抗體一起在37。C溫育60分鐘。隨後如實施例1所述通過NDGGE分析所述樣品，如實施例1所述一企測帶。結果顯示只要Mab266加入所述樣品中，螯合的266-Ap肽複合物約11nm直徑的特徵帶是可見的。不論抗apoE存在與否，情況都是如此。在Mab266存在的情況下，假如在所述溫育混合物中加入50ngAp肽，仍然出現代表受螯合Ap的該帶。因此，抗apoE抗體的存在對apoE分子量的改變並不幹擾Mab266螯合A(3肽。實施例6體內螯合A6肽A.轉基因APPV""小鼠也稱為PDAPP小鼠，該小鼠過度表達人APP蛋白的突變體形式。這些小鼠在CNS中產生人Ap，在CSF和血漿中循環的人A(3肽水平提高。對八月齡小鼠靜脈內注射鹽水或100ngMab266。所述小鼠在初次注射10分鐘後耳又血，初次注射20小時後再次取血。如實施例1所述，通過NDGGE和使用抗體3D6的蛋白質印跡，分析來自每隻動物的20fil血漿樣品。注射鹽水的動物在IO分鐘或20小時後都不顯示螯合Ap肽特徵性11nm帶的存在。然而，注射Mab266的兩隻動物在20小時後確實顯示該帶的存在。B.該研究使用兩月齡APPV""小鼠。第O天，小鼠或者不接受Mab266、或者接受1mgMab266、或者接受100昭該抗體。在給予所述抗體前兩天以及在第1、3、5和7天取血漿樣品。如實施例1所述，所述血漿樣品進行NDGGE，然後用3D6進行蛋白質印跡分析和檢測。在給予Mab266後的所有時間點，除非血漿樣品已經用蛋白G處理，否則都檢測到266/AP複合物，蛋白G結合免疫球蛋白，因此有效去除Mab266。複合物水平在測試時間內保持穩定，只是在注射100pgMab266的動物中在第7天有輕微下降；一般地說，給予100)Lig該抗體的動物體內的水平總是比給予1mg該抗體的小鼠體內發現的水平低。C.靜脈內給予兩月齡APPV""小鼠1mgMab266，從每隻小鼠耳又25jal血漿樣品。如上文所述對所述血漿樣品進行NDGGE,然後進行蛋白質印跡分析，不同之處是生物素化3D6結合後用鏈黴抗生物素1251(Amersham)檢測，然後暴露於螢光成像屏。根據與標準曲線的比較估計複合物水平，標準曲線如下製備用已知量Ap與飽和水平Mab266結合併相似4企測。據估計，結合Mab266的Ap肽的量是約100ng/ml，比以前測定的這些小鼠中的內源A(3肽水平約100pg/ml增加約1000倍。這也與APpV口F腦中AP沉積前的AP肽水平(50-100ng/g)相似；APPV717FTg小鼠中的人APP和人Ap幾乎僅在腦中產生。因此，看起來Mab266在血漿中的存在象是Ap肽接受器，便利A(3肽從CNS到血漿的淨流出。所述增加的淨流出可能是由於A卩從CNS到血漿的流出增加，同時防止血漿中的A(3再次進入腦。如下確認螯合A(3肽的正確大小APpV""小鼠注射1mgMab266後24小時獲得的20(iL血漿樣品在TRIS-tricineSDS-PAGE凝膠上電泳，在使用結合蛋白G的珠暴露於蛋白G之前或之後，用抗A(3抗體6E10進行蛋白質印跡分析。檢測到蛋白G除去的帶位於4-8kD,與Ap肽單體、可能有二聚體的存在一致。D.用PBS(11=7)或者500|Lig生物素化Mab266(即m266B)(n=9)腹膜內處理兩月齡APPV""小鼠。在注射前和注射後24小時，使用Johnson-Wood,K.等，屍rac,胸/.5W.園(1997)94:1550-1555;和Bales,K.R.等，A^we(1997)17:263-264的ELISA方法的改進形式，分析血漿中的總A(3肽。通過用m3D6包被的96孔Optiplate(Packard,Inc.)測量結合m266B的總Af3。稀釋的血漿樣品和標準品(各種濃度的Ap仰和m266B)在所述包被的板中溫育過夜，應用1251-鏈黴抗生物素測定總Ap/m266B複合物的量。此外，在24小時的時間點，首先用蛋白G處理血漿樣品以定量未結合Mab266的Ap肽，然後通過ELISA測定CSF中的ApT。tal和Ap42。在注射PBS的動物中，注射前後血漿Ap肽水平都是140pg/ml。注射Mab266的小鼠體內血漿水平在注射前相似，但未結合Mab266的A(3肽的水平在注射後24小時檢測不到。還測量了CSF中的水平，CSF代表CNS內的細胞外區室，CSF中的分子濃度在某種程度上反映腦內細胞外空間中的物質濃度。從小腦延髓池區室分離CSF。用戊巴比妥麻醉小鼠，取出從頭顱骨基部到第一推骨的肌肉系統。如下收集CSF:在解剖顯微鏡下，用微量針小心刺穿覆蓋延髓池的蛛網膜，吸取CSF到聚丙烯微量移液管中。注射24小時後，發現注射Mab266的小鼠的CSF中總A(3肽增加，與注射PBS的小鼠相比，在CSF中獲得的A^2增加約兩倍。使用變性凝膠電泳以及隨後使用A(342特異性抗體21F12的蛋白質印跡分析確認了這一點。在另一個實驗中，三月齡APPV717FTg小鼠靜脈內注射PBS或者Mab266,如下評價CSF中的A(340水平和A|342水平為測量Ap4。，使用特異性針對A|34。的單克隆抗體m2G3。用125I-鏈黴抗生物素取代鏈黴抗生物素-HRP試劑，改變文獻所述ELISA方法(Johnson-Wood,K.等，屍rac.JcaAOS^(1997)94:1550-1555)成為RIA。對於血漿樣品和CSF樣品，在緩衝液中缺乏胍的非變性條件下進行所述程序。為評價腦勻漿中碳酸鹽可溶和不溶性A卩，樣品與100mM碳酸鹽，40mMNaCl,pH11.5(4。C)勻漿，IO，OOOxg離心15分鐘，如文獻所述(Johnson-Wood,K.等，/Voc.TVa,/.Jc^/.Sc/.(1997)94:1550-1555)和上文列出的程序，評價上清液(可溶)和沉澱(不溶性)中的A(3。通過改良的RIA測量血漿中的Ap/Mab266複合物。對小鼠注射生物素化Mab266(Mab266B),在多個時間點分離血漿。通過用m3D6包被的96孑LOptiplate(Packard,Inc.)測量結合Mab266的總A|3。稀釋的血漿樣品和標準品(各種濃度的Af34o和Mab266B)在所述包被的板中溫育過夜，應用1251-鏈黴抗生物素測定總Ap/Mab266B複合物的量。靜脈內注射Mab266三小時後，CSF中Ap40水平增加兩倍，A(342沒有顯著增加。然而，在24小時和72小時，CSF中的Ap4。和Ap42都增加兩到三倍。使用變性凝膠分析和隨後對匯集的CSF的A(3蛋白質印跡分析獲得相似結果。Ap通過腦間隙液的流出(CSF水平在某種程度上反映出這種流出)可能引起所觀察到的CSFA(3增加。意義重大的是，CSFAp肽水平的變化並不是由於Mab266進入CSF引起的，因為在注射後24小時測量到的水平低於Mab266血漿水平的0.1%,不足以引起這些變化。這些結果提示抗體在血流中的存在引起AP肽流出腦實質，進入CSF。在已經注射Mab266並如上所述分析CSF的同一小鼠的腦皮質勻漿內，測量可溶於PBS或碳酸鹽緩衝液的AP肽形式。觀察到在皮質勻漿中這些溶解型的相似增加。實施例7Mab266在體外作為AI3肽接受器起作用構建作為體外系統的透析室，測試Mab266作為Ap肽接受器的能力。將lmL人CSF置於聚丙烯管的頂室內，該頂室由一塊特定截斷值為10-100kD的透析膜將其與底室分開，底室內盛有含或不含1jigMab266的75jiLPBS。在不同時間點將底室內的物質加載到酸尿素凝膠，然後用6E10針對AP肽進行蛋白質印跡分析，看起來3小時後達到平衡。樣品在蟻酸中變性，達到80%(體積比)的終濃度，然後用)3-巰基乙醇(1%)還原。樣品在0.9M乙酸電泳緩沖液內電泳(陽極到陰極)通過4%-35%的聚丙烯醯胺梯度凝膠，所述梯度凝膠含6M尿素、5%(體積比)冰乙酸和2.5%TEMED。轉移到硝酸纖維素之前，中和凝膠的酸性pH。然後使用標準蛋白質印跡技術鑑定Ap。檢測到的帶對應於4kD。3小時後，通過ELISA分析頂室和底室(1^4)，由此確定從頂室移除的A(3的量。圖1顯示存在和不存在Mab266的情況下，不同分子量截斷值獲得的結果。如圖顯示，雖然當將PBS置於底室內時僅有最小量的AP肽穿過膜，但當存在Mab266、分子量截斷值是25kD的情況下，50%的A(3肽在底室中受到螯合；當分子量截斷值增加到100kD時穿過膜的量增加，吸引幾乎100%的A(3肽穿過膜。33還觀察到抗N末端AP抗體3D6和10D5能夠在該系統中吸引A卩肽穿過膜，雖然所述抗體不能在實施例1所述測定中螯合A(3肽。這些結果顯示針對A(3肽的抗體在這些條件下有足夠親和力螯合生理溶液中的所述肽，使其與其它結合蛋白質分離，但對於位置13-28的表位有免疫反應性的Mab如266實際上更有效、以更高親和力結合。在相似的測定中，如DeMattos,R.B.等,/腸/.CTz謹.(1998)273:4206-4212;Sun,Y.等,乂(1998)18:3261-3272所述方法純化的星形細胞分泌的apoE4對於增加底室內A(3肽量有孩t小但在統計學上顯著的效應。當用多克隆IgG或BSA取代Mab266時，沒有觀察到明顯效應。實施例8A[3肽從CNS流出到血漿A.將1pgA(340溶解於5pL小鼠CSF,保持其可溶，然後將其注射入野生型Swiss-Webster小鼠小腦延髓池的蛛網膜下腔，在此之前所述小鼠已經接受PBS(11=3)或200昭生物素化Mab266(n=3)的靜脈內注射。在處理後的不同時間點，通過ApELISA測定小鼠血漿中的APT。w，在APELISA中使用3D6作為包被抗體，並使用與過量生物素化266混合的A(3標準品。從每隻動物取出血漿樣品後，將每份血漿樣品與過量生物素化266混合，以在ELISA中進行A|3檢測。在注射PBS的小鼠中，30-60分鐘後檢測到0.15ng/ml水平的峰值，即最低限度可檢測量的肽，在此之後所述水平基本上是零。然而，在給予Mab266的小鼠中，60分鐘後血漿Ap肽達到在注射PBS的小鼠中所檢測到水平的330倍水平(約50ng/ml),在180分鐘後達到約90ng/ml的值。B.將200|ug(11=3)或600)ag(n-3)靜脈內注射入兩月齡APPV717F小鼠，重複該程序。以上述劑量將Mab266靜脈內注射入3月齡APPV717F+/+小鼠。在靜脈注射前和注射後的不同時間點，通過RIA測定結合Mab266的A卩血漿濃度。圖2顯示來自一隻有代表性的小鼠的詳細結果。發現結合單克隆抗體Mab266的Ap的濃度在4天內從150pg/ml的基礎水平增加到超過100ng/ml的水平。通過分析該曲線上的早期時間點，確定在存在飽和水平所述抗體的情況下，APpV""Tg小鼠APT。ta,進入血漿的淨速率是42pg/ml/分鐘。Mab266在野生型和APPV717FTg小鼠體內對血漿A(3水平的效應以及所述抗體對CSF中AP濃度的效應顯示循環Mab266的存在改變CNS和血漿間八3流動或轉運平#。實施例9Mab266對腦中Ap的效應對四月齡APPV717F+/+小鼠腹膜內注射鹽水、Mab266(500昭)或對照鼠IgG(100Pharmigen),每2周處理一次，共進行5個月。在九月齡處死小鼠，測定皮質中的Ap沉積。如Holtzman,D.M.等,7Vewro/.(2000)97:2892-2897所述，在用兔淘選A(3抗體(QCB,Inc.)覆蓋背海馬後，立即定量皮質中所述抗體鑑定的呈現Ap免疫反應性的面積％。結果顯示於圖3A。在該鼠齡，每組約一半動物仍然沒有開始出現A(3沉積。然而，在用266處理的組中，皮質中帶有>50%Ap的小鼠的。/o顯著更少(P二0.02,x'檢驗法)。雖然九月齡APPV""小鼠出現大量A(3沉積，但有很大可變性，約50%顯示沒有沉積，約50%顯示有大量沉積。在PBS和IgG處理的動物中，6/14和5/13小鼠有超過50%皮質被Ap染色覆蓋，而用Mab266處理的14隻小鼠中僅有一隻達到該染色水平。在9月齡時，所有組中幾乎50%的動物沒有發展出Ap沉積。後者看起來是由於我們使用的實驗動物中各個小鼠的親本來源，因為即使研究的所有小鼠都證實是APPV717F+/+,但僅在從4/8育種對獲得的小鼠中觀察到高水平A(3沉積(高病理幼仔)。來自其它4個育種對的小鼠看起來沒有Ap沉積(低病理幼仔)。使用親本來源作為共變量，M266對於降低AP沉積有強烈、顯著的效應(p:0.0082,圖3B)。實施例10在APPV717FTg小鼠中外周注射Mab並不結合澱粉樣斑為確定在5個月內腹膜內注射的Mab266是否結合腦中的Ap，利用來自包含Ap沉積並且已經用Mab266、鹽水或對照IgG治療的9月齡APPV717F+/+Tg小鼠的腦切片。如文獻所述進行組織加工和免疫染色(Bales,K.R.等，淑訓G麼/.(1997)17:263-264)。用螢光素標記的抗小鼠IgG(Vector,Inc.)溫育來自所有組動物的組織，然後在螢光顯微鏡下檢查。在任何組中沒有觀察到Ap沉積的特異性染色。與此相反，當在用抗小鼠IgG溫育所述切片前應用Mab266於所述切片，則可以清楚地卩險測到Ap沉積。實施例11給予抗體266對於24月齡轉基因半合子PDAPP小鼠的認知的效應使用16隻半合子轉基因小鼠(APPV71,。研究開始時所述小鼠約24月齡。所有注射都是腹膜內注射(i.p.)。一半小鼠每周注射磷酸鹽緩沖液(PBS,"對照")，另一半接受溶解於PBS中的500微克小鼠抗體266。注射在7周(42天)內進行，總共注射6次。最後一次注射後3天,基本如J.—C.Dodart等,Ba/mv/ora/7Vewmy".ewce,113(5)982-990(1999)所述，使用目標認知任務評價動物行為。計算認知指數(TbX100)/(TB-TA)。結果顯示於下面表l。表l.認知指數的統計學描述認知指數(分鐘)tableseeoriginaldocumentpage37對24月齡半合子轉基因小鼠每周給予500微克抗體266與行為顯著變化有關。抗體處理的轉基因小鼠具有與野生型對照動物相似的認知指數[J.-C.Dodart等]。認知指數上的差異在0.001概率水平上具有統計學顯著性。認知指數的增加表明用結合(3澱粉樣蛋白肽胺基酸13-28區的抗體處理將逆轉在該阿耳茨海默氏病小鼠模型中記錄到的行為障礙。因此，給予結合p澱粉樣蛋白肽胺基酸13-28區的抗體將治療疾病如阿耳茨海默氏病和Down氏症候群，並將阻止通常與疾病進程有關的認知下降。如上所述，用小鼠抗體266處理7周的24月齡動物的腦海馬(包括扣帶區和頂皮質)覆蓋後，立即定量皮質中的澱粉樣蛋白負荷(用抗AP抗體3D6或21F12染色後被免疫反應性材料覆蓋的面積％)。結果顯示於下表。處理組間的差異在統計學上並不顯著。表2.用小鼠266抗AB抗體處理後APPV717F+、鼠中的澱粉樣斑負荷澱粉樣斑負荷(％)tableseeoriginaldocumentpage37對於這些年齡非常大的動物，才艮據用3D6或21F12測量，用小鼠抗體266處理與PBS處理組相比並不導致顯著不同的澱;盼樣負荷。此外，與更年輕的動物中的澱粉樣蛋白負荷相比，Ap負荷確實更多並且顯著增加(見下文)，所述更年輕的動物在目標認知任務中不能分辨新對象與熟悉的對象。最驚人的是，這些結果證明抗A(3抗體能夠逆轉認知缺陷，而不需降低澱粉樣負荷本身。處理7周後，m266處理組的認知指數與24月齡野生型動物預期的認知指數沒有顯著不同！這指出在這些轉基因動物中完全逆轉認知下降。實施例12給予抗體266對於年輕轉基因半合子PDAPP小鼠的認知的效應使用五十四(54)只純合子轉基因小鼠(APPV"")。二十三(23)只小鼠在研究開始時約二月齡。其餘小鼠在研究開始時約四月齡。處理時間五個月。因此，在研究終止時，小鼠約七(7)個月齡或約九(9)個月齡。所有注射都是腹膜內注射(i.p.)。每隻"PBS'，對照組的小鼠每周接受磷酸鹽緩衝溶液注射(PBS;200^L)。"IgG"對照組的每隻小鼠每周接受IgGlKl同種型對照注射(100昭/小鼠/周)。每隻"高劑量"組的小鼠每周接受溶解於PBS中的500微克抗體266注射("HD")。"低劑量組"中的每隻小鼠每周接受溶解於PBS中的100微克抗體266注射("LD")。如上面實施例10所述，最後一次注射後三天，使用目標識別任務評價動物行為，計算辨別指數，辨別指數是花費在新對象上和花費在熟悉對象上的時間差異。結果顯示於下表3。結果按照研究結束時小鼠的年齡分組。表3.辨別指數的統計學描述tableseeoriginaldocumentpage39p<0.05…p〈0.0001將這些數據結合起來，支持這樣一個結論給予針對AP中間域的抗體266緩解7-9月齡APPV717F轉基因小鼠中的斑沉積，並逆轉以前特徵鑑定的行為損害。用針對Ap肽中間域的抗體治療患者將抑制或防止一般與疾病進程有關的認知下降，並逆轉所述認知下降。受處理動物的辨別指數與同齡野生型小鼠預期的辨別指數在統計學上沒有顯著不同。因此，就如在更老的動物中一樣(實施例10)，用m266處理在這些更年輕的轉基因動物中完全逆轉認知下降。實施例13合成人源化抗體266細胞和抗體。從ATCC(Manassas,VA)獲得小鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0，置於37。CC02培養箱中，在含10%FBS(Cat#SH32661.03，HyClone，Logan,UT)的DME培養基中維持。小鼠266雜交瘤細胞首先在含10%FBS(HyClone),10mMHEPES,2mM穀氨醯胺，0.1mM非必需胺基酸，1mM丙酮酸鈉，25嗎/ml慶大黴素的RPMI-1640培養基中培養，然後在含2%低IgFBS(Cat#30151.03，HyClone)的無血清培養基(HybridomaSFM,Cat#12045-076，LifeTechnologies,Rockville,MD)中擴展到滾瓶中的2.5升體積。使用蛋白GSepharose柱，通過親和層析從所述培養物上清純化小鼠單克隆抗體266(Mu266)。使用EZ隱LinkSulfo-NHS-LC-LC-生物素(Cat#21338ZZ,Pierce,Rockford,IL)製備生物素化Mu266。克隆不同區cDNA。使用TRIzol試劑(LifeTechnologies)從約107雜交瘤細胞提取總RNA,使用PolyATractmRNA分離系統(Promega,Madison,WI),按照供應商的方法分離poly(A)+RNA。使用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(Clontech，PaloAlto,CA),按照供應商的方法合成雙鏈cDNA。使用分別與小鼠K鏈和Y鏈恆定區退火的3'引物，以及在SMARTRACEcDNA擴增試劑盒中提供的5'通用引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增輕鏈和重鏈的可變區cDNA。對於VL5,-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3'[SEQIDNO:13]PCR，3'引物具有如下序列其中殘基17-46與小鼠Ck區雜交。對於VHPCR,3'引物具有如下簡併序列AGT5'-TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-3'T[SEQ工DNO:14]其中殘基17-50與小鼠Y鏈CHI雜交。將VL和VHcDNA亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)，進行序列測定。使用螢光雙脫氧鏈終止劑(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)，按照廠家的指導通過PCR循環測序反應進行DNA測序。在377型DNA測序儀(AppliedBiosystems)上分析所述測序反應。構建人源化266(Hu266)可變區。如Queen等[屍rac.A^/.爿cW.86:10029-10033(1988)]所述人源化小鼠抗體V區。根據序列同源性，選擇人V區構架作為Mu266CDR的受體。使用電腦程式ABMOD和ENCAD[Levitt,M.,J.Mol.Biol.168:595-620(1983)]構建可變區的分子模型。用Mu266的對應殘基取代人源化V區中預期接觸CDR的胺基酸。取代重鏈殘基46、47、49和98，取代輕鏈殘基51。將人源化V區中在同一V區亞型內稀有的胺基酸取代為共有胺基酸，消除可能的免疫原性。取代輕鏈殘基42和44。使用長度從約65鹼基到80鹼基的八種重疊合成寡核苷酸，構建和擴增輕鏈和重鏈可變區基因[He,X,Y.等，J.Immunol.160:029-1035(1998)]。所述寡核香酸成對退火，用DNA聚合酶I的Klenow片段延伸，產生四個雙鏈片段。變性所獲得的片段，成對退火，然後用Klenow延伸，產生兩個片段。變性這些片段，成對退火，再次延伸，產生全長基因。使用延伸高保真PCR系統(RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)，通過PCR擴增所得產物。所述PCR擴增片段通過凝膠純化並克隆進pCR4Blunt-TOPO載體。確認序列後，用MIuI和XbaI消化所述VL和VH基因，凝膠純化，分別亞克隆進用於表達輕鏈和重^i的載體，產生pVk-Hu266和pVgl-Hu266(分別見本文的圖6和圖7)[Co,M.S.等，J，Immunol.148:1149-1154(1992)]。從這些質粒表達的成熟人源化266抗體具有SEQIDNO:11的輕鏈和SEQIDNO:12的重鏈。穩定轉染。使用GenePulser儀器(BioRad,Hercules,CA),如所述(Co等，1992)應用360V和25|iF，通過電穿孔完成對小鼠骨髓瘤Sp2/0的穩定轉染。轉染前，用Fspl線性化pVk-Hu266和pVgl-Hu266質粒DNA。用20嗎pVk-Hu266和40|agpVgl-Hu266轉染約107Sp2/0細胞。將轉染細胞懸浮於含10%FBS的DME培養基，然後接種幾個96孔板。48小時後，應用選擇培養基(含10%FBS，HT培養基補加劑，0.3mg/ml黃噪呤和1pg/ml黴酚酸的DME培養基)。開始選擇後約10天，如下所述通過ELISA分析培養物上清中的抗體生成。高產量克隆在含10%FBS的DME培養基中擴增，然後進一步分析抗體表達。選定克隆然後在雜交瘤SFM中培養。通過ELISA測量抗體表達。用100fil在0.2M石友酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH9.4)中的1嗎/ml山羊抗人IgG、Fcy片段特異性多克隆抗體(Cat弁109-005-098,JacksonImmunoResearch，WestGrove,PA)包泮皮96孑LELISA板(Nunc-Immuno板，Cat#439454,NalgeNunc，Naperville，IL),在4。C過夜。用洗滌緩沖液(含0.1。/oTween20的PBS)洗孔後，用400piSuperblock封閉緩衝液(Cat#37535，Pierce)封閉孔30分鐘，然後用洗滌緩沖液洗滌。用ELISA緩沖液(含1%BSA和0.1%Tween20的PBS)合適稀釋含Hu266的樣品，然後應用於ELISA板(每孔100Hl)。使用人源化抗CD33IgGl單克隆抗體HuM195(Co等，1992，見上文)作為標準品。所述ELISA板在室溫下溫育2小時，然後用洗滌緩衝液洗孔。然後將100^ELISA緩沖液中的1/1,1000稀釋HRP綴合山羊抗人k多克隆抗體(Cat#1050-05，SouthernBiotechnology,Birmingham,AL)應用於每個孔。每孔在室溫下溫育1小時並用洗滌緩衝液洗滌後，每孔中加入100piABTS底物(Cat#507602和Cat弁506502,KirkegaardandPerryLaboratories,Gaithersburg，MD)。在每孑L中加入100(^12%草酸，終止顯色。使用OPTImax樣吏量滴定板讀數器(MolecularDevices,MenloPark,CA),在415nm讀出吸光度寸直。純化Hu266。將其中一個高度表達Hu266的Sp2/0穩定轉染子(克隆1D9)改為在雜交瘤SFM中培養，然後擴展到滾瓶中的2升。當細胞生存力達到10%或更低時，收穫用過的培養物上清，並加載到蛋白ASepharose柱。用PBS洗滌該柱，然後用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5),0.1MNaCl洗脫抗體。洗脫蛋白對2升PBS透析，更換3次，然後過濾通過0.2jum濾膜，隨後於4。C貯存。通過在280nm處測量吸光度確定抗體濃度(lmg/ml=1.4A，)。根據標準程序，在4-20。/。梯度膠(Cat#EC6025,Novex,SanDiego,CA)上，在Tris-甘氨酸緩衝液中進行SDS-PAGE。減少純化的人源化266抗體，在SDS-PAGE凝膠上電泳。整個抗體顯示分子量約25kDa和50kDa的兩條帶。這些結果與根據胺基酸組成計算的輕鏈和重鏈或重鏈片段的分子量一致。實施例14人源化266抗體的體外結合特性在一個比較ELISA中，比較小鼠266抗體(用生物素化小鼠266在0.2M碳酸鈉/碳酸氬鈉緩沖液(pH9.4)中綴合BSA的p-澱粉樣蛋白肽(l-42)(10pg/ml)包被96孔ELISA板(Nunc-Immuno板，Cat#439454,NalgeNunc),在4。C過夜。如下製備所述A卩l-42-BSA綴合物將7.5mgAp"2-Cys43(C末端半胱氨酸A^-",AnaSpec)溶解於500^L二曱基亞^1，然後立即加入1,500(aL蒸餾水。將兩(2)毫克馬來醯亞胺激活的牛血清白蛋白(Pierce)溶解於200juL蒸餾水。完全混合兩種溶液，在室溫下靜置兩(2)小時。使用凝膠層析柱將未反應的肽與Ap^2-Cys-BSA綴合物分離開。使用ELISA板洗滌器，用含0.r/oTween20的磷酸鹽緩衝液(洗滌緩衝液)洗孔，然後每孔加入300Superblock試劑(Pierce)封閉孔。封閉30分鐘後，用洗滌緩沖液洗孔，除去多餘液體。一式三份，加入在ELISA緩衝液中生物素化Mu266(0.3|ug/ml終濃度)和竟爭抗體(Mu266或Hu266;開始終濃度為750pg/ml，順序3倍稀釋)的混合物，每孔達到lOOiil終體積。作為無竟爭物的對照，加入100pi0.3|Lig/ml生物素化Mu266。作為背景對照，加入100^tlELISA緩衝液。所述ELISA板在室溫下溫育90分鐘。用洗滌緩沖液洗板後，每孔加入100^1|ug/mlHRP綴合鏈黴抗生物素(Cat#21124,Pierce)。所述板在室溫下溫育30分鐘，然後用洗滌緩衝液洗滌。為進行顯色，加入100pl/孔ABTS過氧化物酶底物(Kirkegaard&PerryLaboratories)。加入100fil/孔2%草酸，終止顯色。在415nm處讀出吸光度值。吸光度值針對竟爭物濃度的對數作圖，使用本領域內眾所周知的方法，作符合數據點的曲線(使用Prism)，並確定每種抗體的IC50。小鼠266的平均IC50是4.7ng/ml(三個獨立實驗，標準差=1.3嗎/ml)，人源化266的平均IC50是7.5|ug/mL(三個獨立實驗，標準差=1.1昭/ml)。如上所述進行第二組的三個實驗，測得小鼠266的平均IC50是3.87)Lig/mL(SD=0.12昭/mL),人266的平均IC50是4.0Hg/mL(SD=0.5jag/mL)。在這些結果的基礎上，我們得出結論人源化266具有與小鼠抗體266非常相似的結合特性。因此，我們預期人源化266具有與小鼠266非常相似的體外和體內活性，並將在人體內表現與小鼠266在小鼠體內表現的相同效應。實施例15小鼠抗體266和4G8的體外結合特性使用BIAcore生物傳感器2000測定抗體親和力(XNKd/Ka)，用BIAevaluation(v.3.1)軟體分析數據。使用N-乙基-N-二甲基氨丙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺(EDC/NHS),將捕獲抗體(兔抗小鼠)通過游離氨基綴合到生物傳感器晶片(CM5)流動細胞2的羧基上。將非特異性兔IgG綴合到流動細胞1上，作為背景對照。單克隆抗體被捕獲，產生300共振單位(RU)。然後使澱粉樣蛋白卩1-40或1-42(BiosourceInternational,Inc.)以遞減濃度(1000倍到0.1倍KD)流過所述晶片。為再生晶片，使用甘氨酸-HCl(pH2)洗滌，從所述晶片上洗脫結合的抗Ap抗體。使用不含澱粉樣蛋白(3的對照注射作為對照，以進行基線扣除。分析顯示結合相和解離相的傳感器克數(Sensorgram),確定Kd和Ka。使用該方法，發現小鼠抗體266對於APw。和對於A(3w2的親和力都是4pM。4G8對APMo的親和力是23nM，對ApM2的親和力是24nM。儘管266和4G8對A(3的親和力存在6000倍的差距，但它們都結合Ap胺基酸13到28之間的表位，有效從人CSF中螯合A(3。因此，在測定抗體螯合A(3的能力以及提供本發明有利而驚人的益處時，極為重要的是表位的位置，而不是結合親和力。實施例16使用Biacore方法和溶解性肽對小鼠抗體266的表位作圖BIAcore是測量分子相互作用的自動生物傳感器系統[KarlssonR.等，J.Immunol.Methods145:229-240(1991)]。BIAcore相對於其它結合測定的優點是可以測量抗原結合而不必標記或固定所述抗原(即所述抗原保持更接近天然的構象)。基本如上文實施例12所述，使用BIAcore方法評價各種澱粉樣蛋白p肽片段與小鼠抗體266的結合，不同之處是使用含Tween20的HEPES緩沖鹽溶液進行所有稀釋，注射A(BioSourceInternational)的多種片段，並注射每種片段的單一濃度(440nM)。澱粉樣蛋白(3片段1-28、12-28、17-28和16-25結合小鼠抗體266，而A(3片段1-20、10-20和22-35並不結合。片段1-20、10-20和22-35以對Ap這些區已知的表位特異性結合其它Mab。使用該方法，小鼠抗體266的結合表位看起來是位於A)3的胺基酸17到25之間。由於結合通常發生在所述表位的至少3個殘基，我們可以進一步推斷所述表位在殘基19-23之間。實施例17人源化抗體266的體外結合特性基本如上文實施例15中所述，確定如上文合成和純化的人源化266抗體的親和力(KD=Kd/Ka)。使用該方法，發現人源化266對Api.24的親和力是4pM。序列表ELILILLYANDCOMPANY和WASHINGTONUNIVERSITY螯合澱粉樣蛋白P肽的人源化抗體8792/272中國01808430.32002-08-21PCT/USOl/061912001-02-26<150〉60/184,6012000-02-2460/254,465<151〉2000-12-08《150〉60/254,4982000-12-0816<170〉Patentlnversion3.1<210〉1PRTMussp<400〉1ArgSerSerGinSerLeulieTyrSerAspGlyAsnAlaTyrLeuHis15101527PRT〈213>Mussp.2LysValSerAsnArgPheSer15<210〉39〈212〉PRT<213〉Mussp.〈400〉3SerGinSerThrHisValProTrpThr1545PRT<213〉Mussp.4ArgTyrSerMetSer155〈211〉17<212〉PRT<213〉Mussp.5GinlieAsnSerValGlyAsnSerThrTyrTyrProAspThrValLys151015Gly63PRT<213〉Mussp.<400〉6GlyAspTyr17113<212〉PRT人工序列<223〉人源化抗體<220〉〈221〉MISC—FEATURE<222〉(2)..(2)<223〉位置2的Xaa是Val或Ile<220〉〈221〉MISC_FEATURE<222〉(7)..(7)<223〉位置7的Xaa是Ser或ThrMISC—FEATURE(14)..(14)<223〉位置14的Xaa是Thr或SerMISC—FEATURE(15).■(15)位置15的Xaa是Leu或Pro〈221〉MISC一FEA，E〈222〉(30).,(30)位置30的Xaa是lie或Val<220〉<221〉MISC_FEATURE<222〉(50)..(50)〈223〉位置50的Xaa是Arg、Gln，或Lys<221〉MISC—FEATURE(88)..(88)〈223〉位置88的Xaa是Val或Leu<220〉〈221〉MISC—FEATURE<222〉(105)..(105)<223〉位置105的Xaa是Gin或Gly〈220〉<221〉MISC—FEATURE(108)..(108)<223〉位置108的Xaa是Lys或Arg〈220〉MISC_FEATURE(109)..(109)位置109的Xaa是Val或Leu<400〉7AspXaaValMetThrGinXaaProLeuSerLeuProValXaaXaaGly151015GinProAlaSerlieSerCysArgSerSerGinSerLeuXaaTyrSer202530AspGlyAsnAlaTyrLeuHisTrpPheLeuGinLysProGlyGinSer354045ProXaaLeuLeulieTyrLysValSerAsnArgPheSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie65707580SerArgValGluAlaGluAspXaaGlyValTyrTyrCysSerGinSer859095ThrHisValProTrpThrPheGlyXaaGlyThrXaaXaaGlulieLys100105110Arg8〈211〉112〈212〉PRT人工序列<220〉人源化抗體<220〉MISC—FEATURE(1)..(1)〈223>位置1的Xaa是Glu或GinMISC—FEATURE(7).■(7)位置7的Xaa是Ser或Leu〈220〉<221〉MISC_FEATURE(46)..(46)位置46的Xaa是Glu、Val、Asp或Ser<221〉MISC_FEATURE<222〉(63).(63)位置63的Xaa是Thr或Ser<220〉<221〉MISC—FEATURE(75)..(75)<223〉位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr<220〉〈221〉MISC—FEATURE<222〉(76)..(76)<223〉位置76的Xaa是Lys或Arg<220〉<221〉MISC—FEATURE<222〉(89)..(89)位置89的Xaa是Glu或AspMISC—FEATURE<222〉(107)..(107)<223〉位置107的Xaa是Leu或Thr<400〉8SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerArgTyr202530SerMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuXaaLeuVal354045AlaGinlieAsnSerValGlyAsnSerThrTyrTyrProAspXaaVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnXaaXaaAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaXaaAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaSerGlyA印TyrTrpGlyGinGlyThrXaaValThrValSerSer100105110〈210〉9<211〉113PRT人工序列<220〉<223〉人源化抗體9AspValValMetThrGinSerProLeuSerLeuProValThrLeuGly151015GinProAlaSerlieSerCysArgSerSerGinSerLeulieTyrSer202530AspGlyAsnAlaTyrLeuHisTrpPheLeuGinLysProGlyGinSer354045ProArgLeuLeulieTyrLysValSerAsnArgPheSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie65707580SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysSerGinSer859095ThrHisValProTrpThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105110Arg10112PRT〈213〉人工序列〈223〉人源化抗體10GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerArgTyr202530SerMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluLeuVal354045AlaGinlieAsnSerValGlyAsnSerThrTyrTyrProAspThrVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaSerGlyAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer100105110〈210〉11219PRT<213〉人工序列<223〉人源化抗體11AspValValMetThrGinSerProLeuSerLeuProValThrLeuGly151015GinProAlaSerlieSerCysArgSerSerGinSerLeulieTyrSer202530AspGlyAsnAlaTyrLeuHisTrpPheLeuGinLysProGlyGinSer354045ProArgLeuLeulieTyrLysValSerAsnArgPheSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie6570758054SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysSerGinSer859095ThrHisValProTrpThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105110ArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGlu115120125GinLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPhe130135140TyrProArgGluAlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGin145150155160SerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinA印SerLysAspSer165170175ThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGlu180185190LysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSer195200205ProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys210215〈210〉12442〈212〉PRT<213〉人工序列人源化抗體12GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerArgTyr202530SerMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluLeuVal354045AlaGinlieAsnSerValGlyAsnSerThrTyrTyrProAspThrVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaSerGlyA印TyrTrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer100105110AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys115120125SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr130135140PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer145150155160GlyValHisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSer165170175LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGinThr180185190TyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys195200205LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys210215220ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro225230235240LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys245250255ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp260265270TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu275280285GluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu290295300HisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn305310315320LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGly325330335GinProArgG]uProGinValTyrThrLeuProProSerArgAspGlu340345350LeuThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr355360365ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsn370375380AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe385390395400LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsn405410415ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr420425430GinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys435440<210〉13<211〉46<212〉DNA合成核苷酸13tatagagctcaagcttggatggtgggaagatggatacagttggtgc46〈210〉14<211〉50DNA合成核苷酸15<211〉16PRT〈213>人工序列<220〉15ArgSerSerGinSerLeuValTyrSerAspGlyAsnAlaTyrLeuHis1510151617〈212〉PRT〈213〉人工序列人源化抗體〈400〉16GinlieAsnSerValGlyAsnSerThrTyrTyrProAspSerValLys151015Gly59權利要求1.特異性結合Aβ的位置13-28中所包含的表位的抗體在製備用於預防或治療臨床前或臨床阿耳茨海默氏病的藥物中的用途。2.權利要求l的用途，其中所述抗體抑制與阿耳茨海默氏病相關的澱粉樣斑形成或毒性溶解性AP物質的效應。3.權利要求l的用途，其中所述抗體減少與阿耳茨海默氏病相關的AP澱粉樣斑或降低與阿耳茨海默氏病相關的毒性溶解性A(3物質的#丈應。4.權利要求l的用途，其中所述抗體預防、治療或逆轉與阿耳茨海默氏病相關的認知下降。5.權利要求l的用途，其中所述抗體改善阿耳茨海默氏病患者的i人知。6.權利要求l的用途，其中所述抗體從血液或腦脊液的大分子複合物中螯合AP。7.權利要求1-6中任一項的用途，其中所述抗體是人源化抗體。8.權利要求7的用途，其中所述抗體包含人構架。9.權利要求7的用途，其中所述抗體包含人源化構架。全文摘要描述了一種預防性以及治療性治療特徵在於澱粉樣斑形成的病症的方法。所述方法使用的人源化抗體螯合人體生物學液體中可溶性Aβ肽，或者優先特異性結合澱粉樣蛋白β肽Aβ位置13-28包含的表位。文檔編號A61PGK101670105SQ20081021467公開日2010年3月17日申請日期2001年2月26日優先權日2000年2月24日發明者D·M·霍爾茨曼,K·R·巴勒斯,M·瓦斯奎茨,N·特蘇魯施塔,R·德馬託斯,保羅S·M申請人:華盛頓大學;伊萊利利公司