抗骨橋蛋白嵌合抗體、其製備方法及其在製備治療骨質疏鬆藥物中的用途的製作方法

2023-09-18 22:19:25 2

專利名稱：抗骨橋蛋白嵌合抗體、其製備方法及其在製備治療骨質疏鬆藥物中的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥領域，更具體地，本發明公開了一種嵌合抗體、其製備方法及其用途。
背景技術：
骨質疏鬆症(Osteoporosis)是人類最為常見的一種代謝性骨病,其發病率已經躍居各種常見病的第七位。隨著社會的發展，人口老齡化的趨勢越來越明顯，與之相應的原 發性骨質疏鬆的發生率明顯增高，尤其是骨質疏鬆性骨折發病率很高，甚至有一定的死亡率，給社會、家庭和個人帶來巨大的經濟負擔。積極防治骨質疏鬆已成為老齡化社會衛生保健的突出問題。骨質疏鬆是以骨量減少，骨組織微細結構退化、破壞，導致骨的脆性增高和骨折危險性增加為特徵的一種全身性骨髂疾病(I)。引起骨質疏鬆的原因較多，但其根本原因是破骨細胞數量增多、功能亢進，骨吸收速率超過骨形成。因此，治療骨質疏鬆的策略大多為抑制破骨細胞。骨橋蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)，又稱為早期T淋巴細胞活化因子I (Eta-1)或分泌型磷蛋白I，含有Arg-Gly-Asp (RGD，精氨酸一甘氨酸一天門冬氨酸)三肽序列，分子量根據去磷酸化及糖基化形式的不同大約為44-66KD之間，是一種重要的多功能細胞夕卜基質蛋白(Eta_l (osteopontin) an early component of type-1 (cell-mediated)immunity. Science. 2000. 287 :860-864)。OPN在骨組織細胞、巨噬細胞、活化的T細胞及上皮細胞等多種細胞上表達，在介導細胞的趨化、粘附、增殖和遷移，腫瘤轉移，骨組織的礦化與重建，免疫調節，信號轉導，以及對感染性疾病的免疫能力等方面有著重要的作用(Osteoprotegerin Ligand Is a Cytokine that Regulates OsteoclastDifferentiation and Activation. Cell,1998. 93 :65-176. Osteopontin role in cellsignaling and cancer progression. TRENDS in Cell Biology 2006. 16 :79-87.)o0PN主要是通過RGD及非RGD兩個途徑與細胞表面的受體相結合而實現其功能(Inhibition ofArg-Gly-Asp(RGD)-mediated Cell Adhesion to osteopontin by a Monoclonal Antibodyagainst osteopontin. J. Bio. Chem. 1994. 269 :23280-23285)，RGD 途徑主要是與細胞表面的整合素受體(αγβ3、αγβ1、αγβ5)結合,而非RGD途徑主要是與某些⑶44的變異體(V6、V7)結合，從而介導細胞的多種生理功能(Intracellular Osteopontin Is anIntegral Component of the CD44-ERM Complex Involved in Cell Migration. JOURNALOF CELLULAR PHYSIOLOGY. 2000 :184 :118-130)。總的說來，細胞所分泌的OPN經過磷酸化、糖基化，然後再經過凝血酶的剪切等一系列表達後修飾作用，以多種形式存在於機體中，每種形式可能有其獨特的功能，但目前的研究還不能充分說明，有待進一步的研究與探討。目前已證實OC的增殖活化在關節炎病灶骨侵蝕的發病機制中起著決定性的作用，各個環節使OC過度增殖或異常活躍，打破了骨代謝的平衡，骨破壞佔據優勢。骨吸收的關鍵事件是OC連接到骨表面的礦化基質上，實驗證明OPN在OC拋錨的骨表面高度表達，而且OPN特異性受體一整合素也被證明優先表達於OC胞膜的相應區域。這可以證明在骨吸收的過程中，OPN通過連接整合素以及礦化的骨基質實現OC拋錨於骨吸收部位的骨礦化基質° Tani-Ishii 等(Osteopontin antisense deoxyoligonucIeotides inhibitbone resorption by mouse osteoclasts in vitro. J Periodontal Res,1997. 32 (6)480-6.)，在研究OPN對體外共培養體系中OC的分化和骨吸收的影響實驗中發現OPN反義寡核苷酸能夠減少抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽性細胞的數量，同時牙本質切片上的骨吸收面積減少了。研究發現，在鈣化組織中，OPN能夠誘導破骨細胞的聚集，促進礦化組織的吸收。將大鼠鈣化的骨盤植入其肌組織中，野生鼠的骨質吸收速度要比OPN基因敲除的大鼠快的多，而且OPN缺失的大鼠其骨盤機化的程度和破骨細胞粘附的數量也明顯減少(Osteopontin an interfacial extracellular matrix protein in mineralizedtissues. Connect Tissue Res. 1996 ;35 (1-4) :197-205)。但有學者的研究卻表明，OPN 對正常生理性的骨發生中破骨細胞的生成是沒有影響的，而僅僅在在病理條件下，OPN對破骨細胞生成具有有重要的促進作用。比如卵巢切除術後的小鼠(絕經後骨質疏鬆症模型)，破骨細胞數量明顯增加，然而OPN敲除小鼠的卵巢切除後，破骨細胞數量無明顯增加，骨質疏 松也明顯改善(Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-inducedbone resorption, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 8156-8160)。同樣的，在機械壓力所致的骨質吸收模型中，OPN缺陷小鼠也沒觀察到明顯的骨質吸收及破骨細胞的數量改變(Enhancement of ostaoclastic bone resorption and suppression of osteoblasticbone formation in response to reduced mechanical stress do not occur in theabsenoe of osteopontin，J. Exp. Med. 193 (2001) 399-404) 這些研究結果均表明，OPN 與破骨細胞的分化或者生物學功能是密切相關的。

發明內容
本發明的發明人克隆了人和小鼠OPN基因，真核表達了人和小鼠的OPN蛋白，並通過細胞融合-雜交瘤的方法製備了多株抗人OPN單克隆抗體。建立膠原誘導的DBA/1J小鼠關節炎模型、卵巢切除術(OVX)誘導的小鼠骨質疏鬆模型。在上述兩種模型中，發現鼠源1A18單克隆抗體能夠有效的保護骨質疏鬆症的發生。為此，對該株鼠源抗OPN抗體進行了嵌合改造，並進一步檢測其在上述骨質疏鬆模型中的作用。


圖I. 1A18重鏈(A)輕鏈(B)可變區的核苷酸序列圖2. 1A18重鏈恆定區(A)和輕鏈恆定區⑶的核苷酸序列圖3嵌合抗體H1A18純化後SDS-PAGE4.嵌合抗體H1A18與抗原結合活性比較圖5.嵌合抗體H1A18對CIA小鼠關節骨吸收的保護作用圖6.嵌合抗體H1A18對CIA小鼠尿液中D_pyr水平的影響圖7.嵌合抗體H1A18對CIA小鼠血清中TRAP5b水平的影響圖8.嵌合抗體H1A18對CIA小鼠破骨細胞數量的影響圖9. OVX模型小鼠經嵌合抗體H1A18治療後脛骨μ CT的變化
圖10. OVX模型小鼠經嵌合抗體H1A18治療後脛骨破骨細胞數量的變化圖11嵌合抗體H1A18對小鼠破骨細胞分化的影響圖12嵌合抗體H1A18對小鼠破骨細胞骨吸收功能的影響
具體實施例方式以下實施例、試驗例僅僅對本發明進行更進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例I. 1A18可變區基因克隆和序列測定收集5 X IO6 I X IO7 雜交瘤細胞 1A18 克隆，用 TRIzol (Invitrogen Cat. No. 15596-026)抽提其總RNA，根據小鼠抗體恆定區序列，設計引物如下HGSPl :5』 -GATACTGTGATCTGTTTG-3』HGSP2 :5， -TCGCAGATGAGTCTGGAC-3，HGSP3 :5， -ATGAACACACTCACATTG-3，LGSPl :5』 -GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3』LGSP2 :5， -AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3』LGSP3 :5， -TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3』採用Invitrogen 5』RACE kit (Cat. No. 18374-058)，分別以 HGSPl，LGSPl 為引物，合成第一鏈cDNA ;在TdT和dCTP作用下，給第一鏈cDNA 3』端加poly C尾；分別以HGSP2，HGSP3、LGSP2，LGSP3為5，引物，通過巢式PCR得到VH、VL的PCR產物；將PCR產物裝入PGEM-T載體中；挑取克隆抽提質粒，限制性內切酶鑑定得到陽性克隆，通過測序確定其序列。結果獲得1A18可變區序列，其重鏈、輕鏈可變區核苷酸序列分別為SEQ ID N0:1和SEQID NO :2(又見圖 I)。實施例2.抗OPN嵌合抗體H1A18輕、重鏈恆定區基因的克隆用淋巴細胞分離液(鼎國生物技術發展公司產品)分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產品)提取總RNA，根據文獻(Cell，1980，22 =197-207)和文獻(Nucleic Acids Research, 1982,10 :4071-4079)報導的序列分別設計引物採用 RT-PCR反應擴增抗體重鏈和輕鏈恆定區基因。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收並克隆到pGEM-Τ載體中，測序驗證後確認獲得了正確的克隆。結果獲得了輕、重鏈恆定區核苷酸序列分別為 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4(又見圖 2)。實施例3抗OPN嵌合抗體H1A18的構建及蛋白表達採用長引物重疊PCR(Overlapping PCR)的方法分別合成1A18的CDR移植抗體重、輕鏈可變區基因(HlAlSHa和HlAlSLa)，並使重鏈可變區基因的5』端含有限制酶位點HindIII, 端含有限制酶位點Nhe I，使輕鏈可變區的5』端含有限制酶位點HindIII，3』端含有人抗體輕鏈恆定區5』端的互補序列。針對重鏈和輕鏈基因，分別合成8段長為75bp左右且相互間有20bp重疊的寡核苷酸引物，經過三次重疊PCR合成基因(如圖I所示)①將引物a和b，c和d，e和f，g和h分別混合進行PCR反應，得到產物ab、cd、ef、gh。②將引物a、d與上一輪PCR產物ab、cd相混合後進行擴增，同樣將引物e、h與上一輪PCR產物ef、gh相混合進行擴增，分別得到產物ad和eh。③將引物a、h與上一輪PCR產物ad、eh相混合進行PCR擴增，得到產物ah，最後瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，回收目的條帶並克隆到PGEM-T載體中，篩選陽性克隆測序，分別得到pGEM-VHlA18Ha和pGEMT_VHlA18La。PCR採用Roche公司的高保真擴增系統，反應條件均為95°C 5分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，720C 55秒，30個循環；72°C 7分鐘。將構建成功的重鏈和輕鏈用脂質體法共轉染CHO細胞，篩選獲得穩定表達嵌合抗體細胞株，在無血清培養基重大量培養，Protein A柱親和層析純化，SDS-PAGE電泳檢驗抗體純度。結果表明抗體的純度在95%以上(如圖3)。實施例4嵌合抗體與抗原結合活性檢測
將構建成功的重鏈和輕鏈用脂質體法共轉染CHO細胞，篩選獲得穩定表達嵌合抗體細胞株，在無血清培養基重大量培養，Protein A柱親和層析純化後，蛋白定量。2ug/mlOPN包被ELISA板，用ELISA方法檢測嵌合抗體特異性結合OPN的活性。結果表明嵌合抗體H1A18的OPN結合活性與鼠源抗體C1A18基本相同。結果如圖4所示。實施例5嵌合抗體H1A18對CIA小鼠關節骨吸收的保護作用IOOug雞II型膠原和等體積的弗氏完全佐劑乳化後，經DBA/1J (雄性，8-10周)尾部皮下初次免疫；21天後進行再次免疫，即將IOOug雞II型膠原和等體積的弗氏不完全佐劑乳化後，尾部皮下再次免疫。將2次免疫後的小鼠分成2組，分別給予對照抗體(小鼠IgG, 200ug/body)、H1A18單抗(200ug/body) ；2組均腹腔給藥,從第二次免疫當天開始給藥，隔天給藥，連續六次。取H1A18單抗和對照治療組小鼠，於二次免疫後30天行X-ray檢測，觀察各發病關節的骨質破壞情況。結果如圖5，與對照治療組相比，H1A18單抗治療組小鼠各趾間關節骨吸收不明顯；H1A18單抗治療組骨礦物質密度明顯增加。提示H1A18單抗對骨吸收具有良好的保護作用。實施例6嵌合抗體H1A18對CIA小鼠尿液中D_pyr水平的影響收集不同治療組DBA/1J小鼠二次免疫後第30天的尿液，小鼠D-pyrELISA試劑盒檢測D-pyr(R&D公司)的水平。結果如圖6所示，H1A18單抗治療組尿液中D_pyr明顯低於對照組。提示H1A18單抗對骨吸收具有良好的保護作用。實施例7嵌合抗體H1A18對CIA小鼠血清中TRAP5b水平的影響收集不同治療組DBA/1J小鼠二次免疫後第30天的血液，小鼠TRAP5b ELISA試劑盒檢測TRAP5b的水平。結果如圖7所示，H1A18單抗治療組血清中TRAP5b明顯低於對照組。提示H1A18單抗對骨吸收具有良好的保護作用。實施例8嵌合抗體H1A18對CIA小鼠破骨細胞數量的影響於CIA小鼠二次免疫後30天取關節組織進行石蠟包埋切片，各實驗組組織切片脫蠟至水後，加入TRAP染色液，37°C水浴，避光孵育I小吋，蘇木精染色2分鐘，風乾，封片。結果如圖8所示,與對照治療組相比，H1A18單抗治療組破骨細胞數量減少。實施例90VX模型小鼠經嵌合抗體H1A18治療後脛骨μ CT的變化取6周雌性野生型Β6小鼠，1%戊巴比妥那麻酔，背部備皮，沿背部後正中線作ー長約O. 5 I. Ocm的皮膚切ロ，沿皮下組織分別向左右游離手術切ロ皮膚，先將皮膚切ロ向左側水平牽開約O. 5cm，透過菲薄的肌層，在切ロ視野中可見ー乳白色發亮的脂肪團，紫靠腎臟下極。用鑷子提起脂肪團表面的肌層，沿腰大肌外側緣用眼科剪縱形剪開肌層，長約O. 5cm，在該脂肪團中即可找到小鼠左側卵巣。行卵巣切除後，用5/0絲線單純縫合一針修復剪開的肌層，同法可切除小鼠右側卵巣。修復剪開的肌層，最後用5/0絲線ー針縫合皮膚切口。同上法假手術作為對照組。OVX後將WT小鼠分成2組，分別給予對照抗體(人IgG，200ug/body)、H1A18單抗(200ug/body);所有治療組均腹腔給藥,從OVX後8天開始給藥，隔4天給藥，連續七次。於OVX後36天取小鼠脛骨行μ CT檢測，觀測各個實驗組脛骨骨質疏鬆參數。結果如圖9，與對照治療組相比，Η1Α18單抗治療組脛骨的骨密度(BMD)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量顯著增加；而骨小梁間隙則下降。提示Η1Α18單抗對OVX所致的骨質破壞具有保護作用。實施例10. OVX模型小鼠經嵌合抗體Η1Α18治療後脛骨破骨細胞數量的變化OVX方法同10，各實驗組組織切片脫蠟至水後，加入TRAP染色液，37°C水浴，避光孵育I小時，蘇木精染色2分鐘，風乾，封片；各實驗組組織切片脫蠟至水後，加入蘇木精染色2分鐘，伊紅復染5分鐘，烘乾，封片。結果見圖10，與對照治療組相比，H1A18單抗治療組破骨細胞數量減少。提示H1A18單抗對OVX所致的骨質破壞具有保護作用。實施例11嵌合H1A18單抗對破骨細胞分化的影響 6-10周齡雄性B6小鼠斷頸處死，無菌條件下分離股骨及肱骨；剪斷兩側骨骺端，用Iml注射針頭將-MEM(含1000U/ml青黴素、1000U/ml鏈黴素，2mM/L的L-谷胺醯氨，10%胎牛血清，30ng/ml的M-CSF)輕輕衝洗骨髓腔；收集骨髓細胞混合液，於40 μ m濾網過濾並接種至直徑IOcm的培養皿中，37°C，5% CO2培養24h ;收集未貼壁的細胞，IOOOrpm離心5min，沉澱用-MEM(含1000U/ml青黴素，1000U/ml鏈黴素，2mM/L的L-谷胺醯氨，10%胎牛血清，30ng/ml的M-CSF，50ng/ml的RANKL)培養液重懸，計數並調整細胞濃度為I X 107/ml後接種於6孔培養扳中，每孔接種2ml ;培養48h後，PBS漂洗，以去除未黏附的細胞，以貼壁的骨髓單核細胞作為誘導破骨細胞的前體細胞；細胞每2天換液I次,每次換液50%。培養8天後用TRAP染色，TRAP+多核細胞(3個或3個以上)為破骨細胞。在WT小鼠破骨細胞分化過程中，加入不同濃度(5 μ g/ml, 10 μ g/ml, 20 μ g/ml,30 μ g/ml)HlA18單抗，PBS和30 μ g/ml人IgG作為對照，TRAP染色後，隨機取10個視野分別對不同濃度破骨細胞進行計數，結果如圖11，與人IgG組相比，20 μ g/ml和30 μ g/mlH1A18單抗組破骨細胞數量顯著減少，提示H1A18單抗可以抑制破骨細胞分化。實施例12嵌合H1A18單抗對破骨細胞骨吸收功能的影響分離B6小鼠骨髓單核細胞，調整細胞濃度為5X 105/ml後接種於預先置放骨片的96孔培養扳中，每孔接種200 μ 1，加入不同濃度H1A18單抗，細胞每2天換液I次，每次換液50%;誘導8天後,把貼有細胞的骨片取出，IM的氫氧化氨浸泡過夜；1 %甲苯胺藍染液室溫下染色3min，蒸餾水清洗後自然涼幹；光鏡下對破骨細胞吸收陷窩(圓形、橢圓形和臘腸等典型形態，邊界清楚的藍色異染區)觀察採像；利用IPP軟體(版本5. 0)對陷窩面積進行處理，每個實驗組取5個骨片進行統計分析。實驗結果見圖12，相比於對照抗體組，H1A18單抗對小鼠的破骨細胞骨吸收能力有抑制作用，而且具有劑量依賴性。
權利要求
1.一種抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18。
2.—種核酸分子，編碼權利要求I所述的抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18。
3.權利要求2所述的核酸分子，其中編碼抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18重鏈可變區的序列為SEQ ID NO :1，編碼抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18輕鏈可變區的序列為SEQ ID NO :2。
4.權利要求3所述的的核酸分子，其中編碼抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18重鏈恆定區的序列為SEQ ID NO :3，編碼抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18輕鏈恆定區的序列為SEQ ID NO :4。
5.權利要求I所述的抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18在製備治療骨質疏鬆藥物中的用途。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，更具體地，本發明公開了一種抗骨橋蛋白嵌合抗體H1A18，編碼此抗體的核酸分子及其在製備治療骨質疏鬆藥物中的用途。
文檔編號C12N15/13GK102757499SQ201110105740
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者戴建新, 李博華, 樊克興, 王華菁, 郭亞軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學