高免疫原性狂犬病毒固定株的選育及其在疫苗開發中的應用的製作方法

2023-09-16 12:34:45 10

專利名稱：高免疫原性狂犬病毒固定株的選育及其在疫苗開發中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種狂犬病毒固定株的選育方法及其應用，具體涉及一種高免疫原性狂犬病毒固定株的選育及其在狂犬病疫苗開發中的應用。
背景技術：
狂犬病是一種嚴重的致死性流行病。感染狂犬病毒後一旦出現臨床症狀，存活的預後極差，死亡幾乎不可避免。目前全球超過25億人生活在狂犬病流行區而受到該疾病的威脅，每年導致5萬多人死亡，其中半數以上是年齡小於15歲的兒童，他們是感染狂犬病的高危人群。中國也是狂犬病流行高發區，狂犬病死亡率長期居於中國各類法定傳染病首位。由於沒有任何針對狂犬病的有效治療藥物能夠成功得到應用，研發狂犬病疫苗(包括人用疫苗和動物用疫苗)成為控制疾病危害的唯一有效手段。人用狂犬病疫苗的研發歷史已超過百年。鑑於狂犬病的超高致死率，疫苗品種更新換代的需求比其他流行病疫苗更為迫切，研發更為安全有效的新一代人用狂犬病疫苗成為疫苗開發的熱點。國內外研發了種類繁多的人用狂犬病疫苗新品種，包括全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等。在這些不同類型人用狂犬病疫苗研發品種中，全病毒滅活疫苗的保護效果是最好的，也是目前唯一得到臨床應用的人用狂犬病疫苗。預計在未來相當長的一段時期，人用狂犬病疫苗的更新換代，依然將以全病毒滅活疫苗技術路線為重點。其中，Vero細胞疫苗以其安全性好、成本低以及適應於工業化生產等優勢，成為國內外人用狂犬病疫苗研發的主流。現有的人用狂犬病疫苗存在免疫失敗的問題，Vero細胞疫苗也不例外，尤其是針對嚴重暴露於狂犬病毒的人群， 免疫失敗比例較高。導致免疫失敗的重要原因之一是疫苗生產用毒種免疫原性不夠高。對於嚴重暴露於狂犬病毒的人群，如果疫苗生產用毒種免疫原性偏低，普通的抗原劑量就不足以保證疫苗的免疫保護效果，而進一步提高抗原劑量又可能導至免疫人群出現嚴重的不良免疫反應。通過提高疫苗生產用毒種的免疫原性，就有可能在不增加抗原劑量、保證安全性的前提下大幅度提高疫苗對所有免疫人群的保護效果。因此，高免疫原性疫苗生產用毒種的選育對人用狂犬病疫苗更新換代、進一步提高疫苗免疫保護效果、降低狂犬病的發病率和死亡率具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種高免疫原性狂犬病毒固定株的選育方法，尤其是能用Vero細胞進行大規模、高產率培養的高免疫原性狂犬病毒固定株的選育方法。本發明的另一目的是提供新的狂犬病毒固定株。具體涉及所述的狂犬病毒固定株，能以Vero細胞作培養基質高滴度培養；與國內外現有的狂犬病毒固定株相比，免疫原性更高；病毒基因組鹼基序列及病毒蛋白質胺基酸序列與國內外現有的狂犬病毒固定株不同，且這些基因組鹼基序列的差異和蛋白胺基酸序列的差異能穩定遺傳，在以VeiO細胞進行連續傳代過程中至少15代以內保持不變。本發明還提供了以此選育方法得到的狂犬病毒固定株在開發人用或動物用疫苗中的應用。為了實現上述目的，本發明採用的技術方案如下:
Cl) 鼠腦毒種的擴增和純化
從國內外被普遍認可的病毒保藏機構取回aG株或其他經動物腦組織傳代建株的狂犬病毒固定株，病毒接種20-25日齡豚鼠腦腔，豚鼠出現典型狂犬病症狀時無菌條件下取腦，加入維持液A (含0.5%牛白蛋白的M199培養基，PH7.0—8.0)後研磨腦組織製成勻漿，高速離心除去沉澱，上清液經蔗糖密度梯度超速離心3-5小時，收取蔗糖濃度為45%-55%的組份，透析去除蔗糖，稀釋製成滴度為9.0-10.0LogLD50/ml病毒懸液；
(2)鼠腦病毒對Vero細胞的適應培養
從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲取的Vero細胞，貼壁培養24-72小時，胰蛋白酶消化並離心收集細胞；加入含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培養基，PH7.0-8.0 ；含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培養基優選:0.01% — 0.1%胰蛋白酶、0.1-1mMEDTA、0.5—1%牛血清白蛋白的M199培養基，PH7.0—8.0 ;製成密度為5X 105_2X IO6Cells/ml的細胞懸液；按病毒:細胞為1:1——I: 100的量加入步驟(I)製備的病毒懸液，25-40°C條件下放置10-60分鐘；加入含5-10%牛血清的M199培養基，PH7.0-8.0，接種細胞培養瓶，接種量0.5-lX105cells/cm2, 37°C條件下貼壁培養；24_48小時後培養液更換成含0.5%牛血清白蛋白的M199培養基，PH7.0-8.0，30_34°C條件下貼壁培養；96_144小時後收穫培養液，蔗糖密度梯度超速離心純化和濃縮病毒，製備病毒懸液，為低代次細胞適應病毒; (3)Vero細胞培養病毒在裸鼠腦組織中擴增
步驟(2)得到的病毒懸液接種裸鼠腦腔，動物出現典型狂犬病症狀時無菌條件下取腦，按步驟一同樣方法製備病毒懸液；
低代次細胞適應病毒培養液病毒滴度較低；動物腦組織是狂犬病毒天然培養基質，故可用動物腦組織擴增Vero細胞適應病毒，提高滴度；國內外大多使用豚鼠腦、小鼠腦、兔腦或羊腦擴增狂犬病毒，但這些動物不適合用於高免疫原性的狂犬病毒擴增，因為這些動物都具有健全的免疫系統，高免疫原性的病毒會導至動物產生細胞凋亡等免疫反應而形成負選擇，影響選育效果；裸鼠是免疫缺陷動物，故本發明使用裸鼠。(4) 病毒在裸鼠腦組織和VeiO細胞上交替傳代
重複步驟(2)和步驟(3)，病毒在裸鼠腦組織和Vero細胞上交替傳代2_10次，優選5_8次，最優選6次,製備6代Vero細胞傳代培養的病毒懸液；
(5)本步驟可使Vero細胞適應的病毒突變體(包括高免疫原性的突變體)不斷得到優
選
病毒在VeiO細胞上連續傳代
步驟(4)得到的病毒懸液接種貼壁培養的Vero細胞，32-34°C培養72-168小時，收穫病毒培養液，小鼠腦腔法測定病毒滴度，並在Vero細胞上連續傳代，直到病毒滴度高於7.5LogLD50/ml ；
(6)本步驟可使Vero細胞適應的病毒突變體(包括高免疫原性的突變體)進一步得到優選
病毒單克隆純化、篩選和保存建株
步驟(5)得到的滴度高於7.5LogLD50/ml的病毒培養液，按文獻方法製備Vero細胞的病毒蝕斑，微型注射器吸取單斑病毒培養液，經Vero細胞擴大培養，收穫病毒培養液，小鼠腦腔法測定培養液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法測定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活標定病毒免疫原性，選取病毒滴度高於7.5LogLD5(l/ml、免疫原性比活高於2.0的多個單斑病毒培養液分別進行分裝、冷凍乾燥後保存於_20°C冰箱；
對保存的毒種進行基因組序列分析，並與起始鼠腦毒種比較，病毒基因組的鹼基序列和病毒蛋白的胺基酸序列均出現明顯差異；
(7)選育毒種的傳代穩定性分析
步驟(6)得到的若干株候選毒種，在Veix)細胞上連續傳15代以上，每代或隔三代進行一次檢定:小鼠腦腔法測定培養液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法測定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活標定病毒免疫原性、病毒基因組序列分析和病毒蛋白胺基酸序列分析測定毒種遺傳穩定性，選取以上各項檢定數據至少15代以內保持穩定的候選毒種作為疫苗生產用毒種；上述的百分含量為質量百分含量。選育毒種在狂犬疫苗研發中的應用 步驟(7)選育的疫苗生產用毒種，接種方瓶、轉瓶或生物反應器培養的VeiX)細胞，32-34 °C培養72-168小時，收穫病毒培養液，小鼠腦腔法測定培養液病毒滴度，均高於
7.0LogLD5Q/ml ； β -丙內脂方法或甲醛方法滅活病毒，NIH方法測定原液效力，均高於
5.0IU/ml ;蔗糖密度梯度超速離心方法純化滅活後的病毒培養液，收取45-55%蔗糖濃度的組份，透析法除蔗糖，測蛋白含量，按5ug/ml蛋白含量分裝，加入人血白蛋白作保護劑，冷凍乾燥製成疫苗，NIH方法測定原液效力，均高於2.5IU/劑；ELISA方法測抗原含量，均不高於效力值的1/2，所述的VeiO細胞為非洲綠猴腎細胞。本發明的優點在於:以該方法選育的新狂犬病毒固定株，可在Veix)細胞上高滴度擴增；擴增的病毒具有比現有的狂犬病毒固定株更高的免疫原性；新狂犬病毒固定株在Vero細胞上連續多次傳代依然保持生物學、遺傳學和其他特性的穩定性。基於這些特徵，新狂犬病毒固定株可用於大規模、工業化生產免疫保護效果更好、安全性更高的狂犬病疫苗。與市售的各種狂犬病疫苗比較:用同樣的ELISA試劑盒測定抗原量，同樣條件下的NIH方法測定效力。結果這些疫苗的ELISA抗原量值均高於效力值。表明本發明選育的狂犬病毒固定株免疫原性至少是現有疫苗生產用毒種的2倍以上。


圖1:GNV12毒株與標準株4aG的免疫原型關鍵蛋白(G蛋白)胺基酸序列比較； 說明:圖1為GNV12毒株與標準株4aG的免疫原性關鍵蛋白(G蛋白)胺基酸序列比較，
其中174位氨基標準株4aG為脯氨酸(P )，GNVl2毒株為絲氨酸(S )，308位胺基酸標準株4aG為纈氨酸(V)，GNV12毒株為異亮氨酸(I)。圖2:GNV12毒株的原始保存株與第15代Vero細胞傳代株G蛋白胺基酸序列比較；
說明:圖2為GNV12毒株的原始保存株與第15代VeiO細胞傳代株G蛋白胺基酸序列比較。經過15代的的傳代，毒株的胺基酸序列保持穩定。圖3:GNV12毒株培養液密度梯度離心純化圖
說明:以GNV12毒株為疫苗生產用毒種，Veix)細胞為培養基質，病毒培養液經濃縮後進行蔗糖密度梯度超速離心紫外分光光度儀檢測各組分光吸收，分組分收集不同蔗糖濃度的組分。
具體實施例方式以下用實施例對本發明舉例說明，旨在闡述本發明的最佳實施方案，但本發明的保護範圍並不限於此實施例。實施例1 病毒株Gtl的製備
將凍幹狂犬病毒固定株4aG株乾粉懸浮於注射用水,用維持液A (含0.5%牛血白蛋白的M199培養基，PH7.0—8.0)稀釋10倍，腦腔接種體重45_50g豚鼠，0.1ml/只；96小時後無菌取腦，3個鼠腦合併，加入12ml維持液A，勻漿器製成勻漿；高速離心(10000XG，30分鐘，4°C)去除沉澱；上清液置於密度梯度為30-60%的蔗糖層上進行超速離心(80000—100000 XG, 240分鐘，4°C )，分組份收集溶液，測定各組份溶液的蔗糖含量和抗原量；合併蔗糖濃度為45-55%的組份，裝入分子截留為30K的透析袋，在維持液A中透析除糖，得到病毒懸液，編號G0。實施例2 病毒株GV1的製備
24—72小時貼壁培養的Vero細胞，胰蛋白酶消化後用維持液B (0.01% — 0.1%胰蛋白酶、0.1—lmM EDTA、0.5 — 1%牛血清白蛋白的M199培養基，PH7.0 — 8.0)製成密度為4X106cellS/ml的細胞懸液；按病毒:細胞為1:1一1: 100的量加入實施例1製備的Gtl病毒懸液，37 °C條件下放置，定時搖勻；30分鐘後接種細胞培養瓶，接種量5X 105-2X 106cells/ml,加入培養液A(含0.5%牛白蛋白的M199培養基，PH7.0—8.0)，37°C條件下貼壁培養；48小時後去培養液A，加入維持液B (含0.5%牛血清白蛋白的M199培養基，PH7.8)，30-34°C條件下貼壁培養；144小時後收穫培養液，按實施例1相同方法進行蔗糖密度梯度超速離心純化和濃縮病毒，製備病毒懸液，編號GV1 ;小鼠腦腔法測定病毒滴度為 4.6 LogLD50/mL.
實施例3 病毒株GNV1的製備
實施例2製備的GV1病毒懸液，，腦腔接種體重8-10g裸鼠，接毒量20ul/只，72-96小時後無菌取腦，按實施例1相同方法製備病毒懸液，編號GNV115小鼠腦腔法測定病毒滴度為
8.02 LogLD50/ml。實施例4 病毒株GNV6的製備
實施例3製備的GNVi病毒，按實施例2和實施例3方法進行VeiO細胞和裸鼠交替傳代，重複5次,製備Vero細胞培養毒種,該毒種累計經6次Vero細胞傳代,編號為GNV6,小鼠腦腔法測定病毒滴度為6.55 LogLD5tlAil。
實施例5
病毒株GNV9的製備
48小時貼壁培養的VeiO細胞，去原培養液，加入維持液B，同時接種實施例4製備的GNV6病毒液，接毒量為MOI = 0.01 —1.0，32— 34°C條件下靜置培養，144小時後收穫培養液，小鼠腦腔法測定病毒滴度；重複此過程，使病毒株GNV9在Vero細胞上連續傳代3次,收穫病毒液，編號為GNV9，小鼠腦腔法測定病毒滴度為7.83 LogLD5tlAil。實施例6 病毒株GNV12的製備
10cm2塑料培養皿培養Vero細胞，長滿至單層時去培養液，加入0.4ml實施例5製備的並經IO3倍稀釋的GNV9病毒液，搖動培養皿使病毒液均勻塗布到細胞層上，37°C靜置45分鐘，加入8ml半固體M199培養基(含50mM Hepes-0.lmg/ml甲基纖維素-0.5%牛白蛋白的M199培養基，PH7.8—8.0) 34°C、5%C02條件下培養144小時，倒置顯微鏡下可見因病毒侵蝕的細胞病變斑，挑選5個病變斑，編號分別為GNVltl-U GNV1(l-2、GNV1(l-3、GNV1(l-4、GNV10-5,微型注射器吸出蝕斑中央的培養液0.1ml,接種到長滿單層Veix)細胞的12孔板，每孔加入2ml維持液B，32—34°C、5%C02條件下培養144小時，收穫病毒培養液，編號分別為GNV11-UGNVn-2、GNVn-3、GNVn_4、GNVn-5 ;每個編號分別吸取Iml病毒培養液，轉接至長滿單層Vero細胞的175cm2培養瓶，加入50ml維持液B，32— 34°C、5%C02條件下培養144小時，收穫病毒培養液，編號分別為GNV12-1、GNV12-2、GNV12-3、GNV12-4、GNV12-5 ；ELISA方法測狂犬病毒抗原量、小鼠腦腔法測狂犬病毒滴度、NIH方法測培養原液的狂犬病毒保護效力，結果見表1:
表1 5個單克隆純化毒株三項疫苗相關指標檢測結果
權利要求
1.高免疫原性狂犬病毒固定株的選育，其特徵在於:包括如下步驟: (1)鼠腦毒種的擴增和純化 從國內外被普遍認可的病毒保藏機構取回aG株或經動物腦組織傳代建株的狂犬病毒固定株，病毒接種於20-25日齡豚鼠腦腔，豚鼠出現典型狂犬病症狀時，無菌條件下取腦，加入維持液A:含0.5%牛白蛋白的M199培養基，PH7.0—8.0後，研磨腦組織製成勻漿，高速離心除去沉澱，上清液經蔗糖密度梯度超速離心3-5小時，收取蔗糖濃度為45%-55%的組份，透析去除蔗糖，稀釋製成滴度為9.0-10.0LogLD50/ml病毒懸液； (2)鼠腦病毒對VeiO細胞:非洲綠猴腎細胞的適應培養 貼壁培養24-72小時的Vero細胞，用胰蛋白酶消化並離心收集細胞；加入含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培養基，PH7.0-8.0，製成密度為5X 105_2X 106cells/ml的細胞懸液；按病毒:細胞為1:1——I: 100的量加入步驟(I)製備的病毒懸液，25-40°C條件下放置10-60分鐘；加入含5-10%牛血清的M199培養基，PH7.0-8.0，接種細胞培養瓶，接種量0.5X IO5-1X 105cells/cm2，37°C條件下貼壁培養；24_48小時後培養液更換成含0.5%牛血清白蛋白的M199培養基，PH7.0-8.0，30_34°C條件下貼壁培養；96_144小時後收穫培養液，蔗糖密度梯度超速離心純化和濃縮病毒，製備病毒懸液，為低代次細胞適應病毒； (3)Vero細胞培養病毒在裸鼠腦組織中擴增 步驟(2)得到的病毒懸液接種裸鼠腦腔，裸鼠出現典型狂犬病症狀時，無菌條件下取腦，按步驟一同樣方法製備病毒懸液； 病毒在裸鼠腦組織和Vero細胞上交替傳代 重複步驟(2)和步驟(3)，病毒在裸鼠腦組織和VeiO細胞上交替傳代2-10次，製備Vero細胞傳代培養的病毒懸液；` (5)可使Vero細胞適應的病毒突變體包括高免疫原性的突變體不斷得到優選的方法: 病毒在VeiO細胞上連續傳代 步驟(4)得到的病毒懸液接種貼壁培養的Vero細胞，32-34°C培養72-168小時，收穫病毒培養液，小鼠腦腔法測定病毒滴度，並在Vero細胞上連續傳代，直到病毒滴度高於`7.5LogLD50/ml ； (6)可使VeiO細胞適應的病毒突變體包括高免疫原性的突變體進一步得到優選 病毒單克隆純化、篩選和保存建株 步驟(5)得到的滴度高於7.5LogLD50/ml的病毒培養液，按文獻方法製備Vero細胞的病毒蝕斑，微型注射器吸取單斑病毒培養液，經Vero細胞擴大培養,收穫病毒培養液，小鼠腦腔法測定培養液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法測定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活標定病毒免疫原性，選取病毒滴度高於7.5LogLD5(l/ml、免疫原性比活高於2.0的多個單斑病毒培養液分別進行分裝、冷凍乾燥後保存於_20°C冰箱； 對保存的毒種進行基因組序列分析，並與起始鼠腦毒種比較，病毒基因組的鹼基序列和病毒蛋白的胺基酸序列均出現明顯差異； (7)選育毒種的傳代穩定性分析 步驟六得到的若干株候選毒種，在VeiO細胞上連續傳15代以上，每代或隔三代進行一次檢定:小鼠腦腔法測定培養液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法測定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活標定病毒免疫原性、病毒基因組序列分析和病毒蛋白胺基酸序列分析測定毒種遺傳穩定性，選取以上各項檢定數據至少15代以內保持穩定的候選毒種作為疫苗生產用毒種； 上述的百分含量為質量百分含量。
2.根據權利要求1所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的選育，其特徵在於:所述的病毒在裸鼠腦組織和VeiO細胞上交替傳代5-8次，製備VeiO細胞傳代培養的病毒懸液。
3.根據權利要求1或2所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的選育，其特徵在於:所述的病毒在裸鼠腦組織和VeiO細胞上交替傳代6次，製備VeiO細胞傳代培養的病毒懸液。
4.根據權利要求1所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的選育，其特徵在於:所述的含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培養基中胰蛋白酶的濃度為0.01%—0.1%, EDTA的濃度為0.1 — ImM、牛血清白蛋白的濃度為0.5 —1%。
5.高免疫原性狂犬病毒固定株在狂犬疫苗研發中的應用，其特徵在於:應用方法如下: 將選育的疫苗生產用毒種，接種方瓶、轉瓶或生物反應器培養的Vero細胞，32-34°C培養72-168小時，收穫病毒培養液，小鼠腦腔法測定培養液病毒滴度，均高於7.0LogLD5ciAil ；β-丙內脂方法或甲醛方法滅活病毒，NIH方法測定原液效力，均高於5.0IU/ml ;蔗糖密度梯度超速離心方法純化滅活後的病毒培養液，收取45-55%蔗糖濃度的組份，透析法除蔗糖，測蛋白含量，按5ug/ml蛋白含量分裝，加入人血白蛋白作保護劑，冷凍乾燥製成疫苗，NIH方法測定原 液效力；ELISA方法測抗原含量。
全文摘要
本發明涉及高免疫原性狂犬病毒固定株的選育及其在疫苗開發中的應用，屬於生物技術領域；該方法包括如下步驟(1)鼠腦毒種的擴增和純化，(2)鼠腦病毒對Vero細胞的適應培養，(3)Vero細胞培養病毒在裸鼠腦組織中擴增，(4)病毒在裸鼠腦組織和Vero細胞上交替傳代，(5)病毒在Vero細胞上連續傳代，(6)病毒單克隆純化、篩選和保存建株，(7)選育毒種的傳代穩定性分析，獲得的候選毒種作為疫苗生產用毒種進行應用；以該方法選育的新狂犬病毒固定株，可在Vero細胞上高滴度擴增；擴增的病毒具有比現有的狂犬病毒固定株更高的免疫原性；在Vero細胞上連續多次傳代依然保持生物學、遺傳學和其他特性的穩定性，可用於大規模、工業化生產免疫保護效果更好、安全性更高的狂犬病疫苗。
文檔編號C12N7/00GK103146655SQ201310099700
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月27日 優先權日2013年3月27日
發明者艾文, 沈名鋒, 劉鈿蓮 申請人:廣州銀河陽光生物製品有限公司