口蹄疫病毒病毒(fmdv)共有蛋白質、其編碼序列及由其製備的疫苗的製作方法

2023-09-16 14:34:10

專利名稱：口蹄疫病毒病毒(fmdv)共有蛋白質、其編碼序列及由其製備的疫苗的製作方法
驟還可包括測量電穿孔細胞的阻抗，相對於測量的阻抗調整脈衝能量的能量水平以維持電穿孔細胞中的恆定電流，其中測量和調整步驟在脈衝能量的壽命內進行。電穿孔步驟還可包括按照以分散模式遞送脈衝能量的脈衝序列模式將脈衝能量遞送至多個電極。還提供了診斷被FMDV感染的哺乳動物的方法，其中所述方法包括從哺乳動物分離液體樣品，從哺乳動物的液體樣品分離抗體，以及將從步驟b分離的抗體與已用權利要求3的疫苗接種的對照哺乳動物相比較，其中對照哺乳動物只具有針對FMDV VPI-4蛋白的抗體，被感染的FMDV哺乳動物具有針對FMDV VP1-4蛋白和FMDV非結構蛋白的抗體。非結構蛋白可以是FMDV 2C、3A和3D聚合酶。提供了分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼具有如下的蛋白質的序列一個或多個具有或不具有前導序列的選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、
28、30、32、34、36、38、40和42中的一個或多個的序列、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段的序列、與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、
34、36、38、40和42具有80%或更多同源性的變體、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段及其互補序列。在某些實施方案中，所述核酸序列選自具有或不具有前導序列的SEQ ID N0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41、其互補序列、其編碼至少20個胺基酸的片段、其互補序列、與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、
29、31、33、35、37、39和41具有80%同源性的核酸分子、其互補序列、其編碼至少20個胺基酸的片段及其互補序列。提供了疫苗，所述疫苗包含此類核酸分子和/或一種或多種蛋白質，所述蛋白質選自具有或不具有前導序列的 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段、與SEQ ID NO :2、4、6、8、
10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 具有 80%或更多同源性的變體和其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段。還提供了組合物，其包含一種或多種選自具有或不具有前導序列的SEQ ID NO 2,
4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 的蛋白質、其包含至少20 個胺基酸的免疫原性片段、與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、
30、32、34、36、38、40和42具有80%或更多同源性的變體和其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段。提供了用於在哺乳動物中引起抗一個或多個FMDV病毒亞型的免疫反應的方法。所述方法包括使用此處公開的疫苗並且，在某些實施方案中，可包括如下步驟給哺乳動物的組織施用編碼具有FMDV免疫原性序列的蛋白質的核酸分子；和以有效地允許DNA質粒進入細胞的恆定電流用脈衝能量對組織的細胞進行電穿孔。還提供了用於在按照本文中公開的方法接種的哺乳動物中診斷被FMDV感染的哺乳動物的方法。所述方法包括從接種的哺乳動物分離液體樣品，和檢測未包括在所述疫苗中的FMDV蛋白和/或抗未包括在所述疫苗中的FMDV蛋白的抗體的存在。這類FMDV蛋白和/或抗這類FMDV蛋白的抗體的存在表明接種的哺乳動物已被FMDV感染。發明詳述 已產生了用於融合蛋白的共有胺基酸序列，所述融合蛋白包含來自不同血清類型的多種FMDV蛋白和單個FMDV蛋白。還產生了編碼所述蛋白質的核酸分子。 在本發明的一個方面，存在融合蛋白，包含共有FMDV蛋白VPI、VP2、VP3、VP4和/或3C和編碼此類蛋白的核酸，所述融合蛋白可被產生並且用於疫苗中從而為哺乳動物提供抗跨一個或多個FMDV亞型(包括A、Asia I、O、C、SAT1、SAT2和SAT3)的口蹄疫的保護作用。在本發明的另一個方面，存在來自兩個不同亞型的融合蛋白，包含共有FMDV蛋白VPl和編碼此類蛋白的核酸，所述融合蛋白可被產生並且用於疫苗中從而為哺乳動物提供抗跨一個或多個FMDV亞型(包括A、Asia I、O、C、SATl、SAT2和SAT3)的口蹄疫的保護作用。在本發明的另一個方面，存在的共有FMDV蛋白VPl和編碼它們的核酸序列。它們/可被產生並且用於疫苗中從而為哺乳動物提供抗跨一個或多個FMDV亞型(包括A、Asia I、O、C、SATl、SAT2和SAT3)的口蹄疫的保護作用。然而不受特定理論的束縛，抗一個或多個MDV亞型的VP1、VP2、VP3和/或VP4的共有胺基酸序列的疫苗將提供在引發有效的抗每一個FMDV亞型內的大部分種類的免疫反應(體液、細胞或兩者)中是有效的一大組表位。本發明涉及使用FMDV亞型的這些共有胺基酸VPl、VP2、VP3和/或VP4序列產生待用於疫苗(所述疫苗用於給哺乳動物施用以提供抗FMDV的預防性保護)的適當的質粒和蛋白質。同樣地，本發明還涉及使用FMDV VPUVP2.VP3和/或VP4抗原的這些共有序列鑑定和區分已被適當接種並且未被感染的哺乳動物與已被FMDV感染(通過對針對FMDV的非結構蛋白質例如3D聚合酶的抗體的檢測)的哺乳動物的診斷方法。然而不受特定理論的束縛，VPl為抗VPl的共有胺基酸序列的疫苗的優良免疫原性靶。VPl為優勢免疫原。I.定義本文中所使用的術語僅僅為了描述特定實施方案並且無意進行限定。除非上下文中明確另有說明，否則說明書和所附權利要求中所使用的單數形式「一種/個(a)」、「一種/個(an) 」和「該/所述(the) 」包括複數所指物。對於本文中數值範圍的引用，明確地包括以相同的精度存在於其間的每一個插入數值。例如，對於6-9的範圍，除了 6和9外還包括數值7和8，對於範圍6. 0-7. 0，明確地包括數值 6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9 和 7. O。a.佐劑本文中所使用的「佐劑」可以意指添加至本文中描述的DNA質粒疫苗以增強口蹄疫病毒(FMDV)抗原(其由在下文中描述的DNA質粒和編碼核酸序列編碼)的抗原性的任何分子。b.抗體「抗體」可意指種類IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗體或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab' ) 2、Fd和單鏈抗體、雙抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物。抗體可以是從哺乳動物的血清樣品分離的抗體、多克隆抗體、親和純化的抗體或其混合物，所述抗體顯示足夠的對期望的表位或來源於其的序列的結合特異性。c.編碼序列
本文中所使用的「編碼序列」或「編碼核酸」可以意指包含編碼蛋白質的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列還可包括起始信號和終止信號，所述起始信號和終止信號有效地連接於能夠在對其施用了所述核酸的個體或哺乳動物的細胞中指導表達的調控元件(包括啟動子和多腺苷酸化信號)。d.互補序列本文中所使用的「互補序列(Complement) 」或「互補的(complementary) 」可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的沃爾森-克裡克(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen喊基配對。e.共有區或共有序列本文中所使用的「共有區」或「共有序列」可以意指基於特定流感抗原的多個亞型 的比對分析構建的合成的核酸序列或相應多肽序列，其可用於誘導抗特定流感抗原的多個亞型或血清型的廣泛免疫。共有FMDV抗原可包括VPI、VP2、VP3、VP4和C2蛋白酶核苷酸和胺基酸序列。同樣地，還可將合成抗原例如融合蛋白操作成共有序列(或共有抗原)。f.恆定電流本文中所使用的「恆定電流」定義了在被遞送至相同組織的電脈衝的持續時間中被組織或界定所述組織的細胞接收或經受的電流。電脈衝源自從本文中描述的電穿孔裝置。該電流在電脈衝的壽命期間以恆定的安培度保持在所述組織中，因為本文中提供的電穿孔裝置具有反饋元件，從而優選具有瞬時反饋。反饋元件可在整個脈衝持續過程中測量組織(或細胞)的電阻並且引起電穿孔裝置改變其電能輸出(例如，增加電壓)，這樣相同組織中的電流在整個電脈衝過程中(在微秒的量級上)以及脈衝之間保持恆定。在某些實施方案中，反饋元件包括控制器。g.電流反饋或反饋本文中所使用的「電流反饋」或「反饋」可互換使用並且可以意指提供的電穿孔裝置的活動響應，其包括測量電極之間的組織中的電流和相應地改變由EP裝置遞送的能量輸出，以將電流維持在恆定水平上。該恆定水平是由用戶在開始脈衝序列或電處理之前預先設置的。反饋可通過電穿孔裝置的電穿孔組件例如控制器來實現，因為其中的電路能夠連續監控電極之間的組織中的電流並且將該監控的電流(或組織內的電流)與預設電流相比較，以及不斷地進行能量輸出調整以將監控的電流維持在預設水平上。由於反饋迴路為模擬閉合環反饋，因此其可以是瞬時的。h.分散電流本文中所使用的「分散電流」可以意指從本文中描述的電穿孔裝置的各種針電極陣列傳遞的電流的模式，其中所述模式使待被電穿孔的組織的任何區域上的電穿孔相關熱應激的發生降至最低或優選消除其發生。i.電穿孔本文中可互換使用的「電穿孔」、「電通透作用(electro-permeabilization) 」或「電動力學增強(electro-kinetic enhancement) 」( 「EP」)可以指使用跨膜電場脈衝來在生物膜上誘導極微小的路徑(孔)；它們的存在允許生物分子例如質粒、寡核苷酸、siRNA,藥物、離子和水從細胞膜的一側穿過進入另一側。j.反饋機制
本文中所使用的「反饋機制」可以指通過軟體或硬體(或固件)進行的過程，所述過程接收和比較期望的組織的阻抗(在遞送脈衝能量之前、期間和/或之後)與預設值(優選電流)，然後調整所遞送的脈衝能量以達到所述預設值。可通過模擬閉環迴路進行反饋機制。k 片段本文中所使用的「片段」可以意指核酸的一部分，所述部分編碼能夠在哺乳動物中引起與至少一個FMDV亞型例如A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2或SAT3的非片段引起的免疫反應大體上相似的免疫反應的多肽。所述片段可以是選自本發明的各種編碼核苷酸序列(包括SEQ ID NO :1-7和15-21)的至小一個的DNA片段。所述片段可包括SEQ ID N0:l、3、
5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的核酸序列的至少 10%,至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%。片段可包括 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、 35、37、39和41的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%，提供的片段包括胺基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271或275的一個或多個。所有此類片段也可任選地不包括胺基酸。DNA片段在長度上可以為30或更多個核苷酸，在長度上為45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多、720或更多、780或更多、840或更多、900或更多、960或更多、1020或更多、1080或更多、1140或更多、1200或更多、1260或更多、1320或更多、1380或更多、1440或更多、1500或更多、1560或更多、1620或更多、1680或更多、1740或更多、1800或更多、1860或更多、1820或更多、1880或更多、1940或更多、2000或更多、2600或更多、2700或更多、2800或更多、2900或更多、2910或更多、2920或更多、2930或更多、2931或更多、2932或更多、2933或更多、2934或更多、2935或更多、2936或更多、2937或更多或2938或更多個核苷酸。DNA片段可包括免疫球蛋白前導序列例如IgE或IgG序列的編碼序列。DNA片段可少於10個核苷酸、少於20、少於30、少於40、少於50、少於60、少於75、少於90、少於120、少於150、少於180、少於210、少於240、少於270、少於300、少於360、少於420、少於480、少於540、少於600、少於660、少於720、少於780、少於840、少於900、少於960、少於1020、少於1080、少於1140、少於1200、少於1260、少於1320、少於1380、少於1440、少於1500、少於1560、少於1620、少於1680或少於1740個核苷酸、少於1800、少於1860、少於1820、少於1880、少於1940、少於2000、少於2600、少於2700、少於2800、少於2900、少於2910、少於2920、少於2930、少於2931、少於2932、少於2933、少於2934、少於2935、少於2936、少於2937或少於2938個核苷酸。「片段」還可表示能夠在哺乳動物中引起與至少一個FMDV亞型例如A、Asia 1、C、
0、SAT1、SAT2或SAT3的非片段引起的免疫反應大體上相似的免疫反應的多肽片段。片段可以是選自本發明的各種編碼多肽序列(包括SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42)的至少一個的多肽片段。可分析多肽片段以接觸由公共可獲得的資料庫例如LosAlamos國家實驗室的FMDV序列資料庫提供的至少一個抗原性表位。蛋白質的片段可包括 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少95 %。多肽可包括免疫球蛋白前導序列例如IgE或IgG的胺基酸序列。多肽片段在長度上可為30或更多個胺基酸，在長度上可為45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多或710個胺基酸或更多胺基酸。肽片段在長度上可少於10個胺基酸、少於20、少於30、少於40、少於50、少於60、少於75、少於90、少於120、少於150、少於180、少於210、少於240、少於270、少於300、少於360、少於420、少於480、少於540、少於600、少於660、少於700、少於701、少於702、少於703、少於704、少於705、少於706、少於707、少於708、少於709或少於710個胺基酸。I.同源性可使用 Clustalff (http: IIwm. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index, html)產生 多個序列比對的同源性。m.同一性本文中所使用的「相同的」或「同一性」在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中可以意指序列具有指定百分比的在指定區域內相同的殘基。可如下計算百分比通過任選地將兩個序列對齊，在指定的區域中比較兩個序列，測定兩個序列中在其上存在相同殘基的位點的數目以產生匹配位點的數目，將匹配位點的數目除以指定區域的位點總數，然後將結果乘以100來產生序列同一性的百分比。在其中兩個序列具有不同長度或比對產生一個或多個交錯末端並且指定的比較區域只包括單一序列的情況下，將單個序列的殘基包括在計算的分母中而非分子中。當比較DNA和RNA時，可認為胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等同的。可手工或通過使用計算機序列算法例如BLAST或BLAST 2. 0來計算同一性。n.阻抗當討論反饋機制時可使用本文中所使用的「阻抗」，可按照歐姆定律將其轉換成電流值，從而使得能夠與預設電流進行比較。0.免疫反應本文中使用的「免疫反應」可以意指宿主的免疫系統例如哺乳動物的免疫系統響應FMDV共有序列的引入(通過提供的DNA質粒疫苗)的激活。免疫反應可以以細胞或體液反應或兩者的形式存在。p.核酸本文中所使用的「核酸」或「寡核苷酸」或「多核苷酸」可意指至少兩個共價連接在一起的核苷酸。單鏈的描述也確定了互補鏈的序列。因此，核酸還包括被描述的單鏈的互補鏈。核酸的許多變體可用於與給定的核酸相同的目的。因此，核酸還包括大體上相同的核酸及其互補序列。單鏈提供了可在嚴格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴格雜交條件下雜交的探針。核酸可以是單鏈或雙鏈的，或可包含雙鏈和單鏈序列的部分。核酸可以是DNA (基因組DNA和cDNA)、RNA或雜交體，其中核酸可包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及鹼基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥嘌呤)的組合。核酸可通過化學合成法或通過重組法獲得。
核酸通常包括磷酸二酯鍵，雖然可包括核酸類似物，所述核酸類似物可具有至少一個不同的連接例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或0-甲基亞磷醯胺連接以及肽核酸主鏈和連接。其它核酸類似物包括具有帶正電荷主鏈(positive backbone)、非離子型主鏈和非核糖主鏈的核酸類似物，包括美國專利No. 5，235，033和5，034，506 (將所述專利通過引用併入本文)中描述的核酸類似物。包括一個或多個非天然存在或修飾的核苷酸的核酸也包括在核酸的定義內。修飾核苷酸類似物可位於例如核酸分子的5'末端和/或3'末端。核苷酸類似物的代表性實例可選自糖-或主鏈-修飾的核糖核苷酸。然而應當指出，包含非天然存在的核鹼基而非天然存在的核鹼基的核鹼基修飾的核苷酸即核糖核苷酸，例如在5-位上被修飾的尿苷或胞苷例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8_位上被修飾的腺苷和鳥苷例如8-溴鳥苷；脫氮核苷酸例如7-脫氮-腺苷；0_和N-燒基化的核苷酸例如N6-甲基腺苷也是合適的。2' -OH-基團可被選自H、OR、R、滷素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團替代，其中R為C1-C6烷基、烯基或炔基並且齒素為F、Cl、Br或I。修飾核苷酸還包括通過例如Krutzfeldt等人,Nature (2005年10月30日)，Soutschek等人，Nature 432 :173-178(2004)和美國專利公布No. 20050107325 (將所述文獻和專利公布通過引用併入本文)中描述的羥脯氨醇連接與膽固醇綴合的核苷酸。修飾核苷酸和核酸還可/包括鎖核酸(locked nucleic acid) (LNA)，如美國專利No. 20020115080 (將其通過引用併入本文)中所描述的。其它修飾核苷酸和核酸描述於美國專利公布No. 20050182005(將其通過引用併入本文)中。可因多個原因進行磷酸核糖主鏈的修飾例如以增加這類分子在生理環境中的穩定性和半衰期，以增強穿過細胞膜的擴散，或作為生物晶片上的探針。可製備天然存在的核酸和類似物的混合物；可選擇地，可製備不同核酸類似物的混合物和天然存在的核酸與類似物的混合物。q.有效連接的本文中所使用的「有效連接的」可以意指基因的表達處於與其空間上連接的啟動子的控制之下。啟動子可位於處於其控制之下的基因的5'(上遊)或3'(下遊)。啟動子與基因之間的距離可以與所述啟動子所源自的基因中啟動子與其控制的基因之間的距離大致相同。這在本領域是已知的，該距離的變化可被容納而不喪失啟動子功能。r.啟動子本文中所使用的「啟動子」可以意指能夠賦予、激活或增強核酸在細胞中表達的合成或天然來源的分子。啟動子可包括一個或多個特異性轉錄調控序列以進一步增強表達和/或改變相同基因的空間表達和/或時間表達。啟動子還可包括離轉錄的起始位點多至數千鹼基對的遠側增強子或抑制元件Oppressor element)。啟動子可源自包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲和動物的來源。啟動子可組成型地或差異地(針對其中表達發生的細胞、組織或器官或針對表達發生時所處的發育階段，或響應外部刺激例如生理應激、病原體、金屬離子或誘導劑)調節基因組件的表達。啟動子的代表性實例包括細菌噬菌體17啟動子、細菌噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、Iac操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或SV40晚期啟動子和CMV IE啟動子。s.嚴格雜交條件本文中所使用的「嚴格雜交條件」可以意指在其下第一核酸序列(例如，探針)將與例如核酸的複雜混合物中的第二核酸序列(例如，靶)雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的並且在不同的情況下不同。嚴格條件可經選擇為比特定序列在確定的離子強度PH下的熱解鏈溫度(thermal melting point) (Tm)低約5_10°C。Tm可以是平衡時50%的與革巴互補的探針與靶序列雜交(由於靶序列過量存在，因此在Tm下，50%的探針在平衡時被佔據)所處的溫度(在確定的離子強度、PH和核酸濃度下)。嚴格條件可以是這樣的條件，其中鹽濃度低於約I. OM的鈉離子，例如在pH 7. 0至8. 3下約0. 01-1. OM的鈉離子濃度(或其它鹽)並且溫度為至少約30°C (對於短探針(例如，約10-50個核苷酸)而言)和至少約60°C (對於長探針(例如，超過約50個核苷酸)而言)。嚴格雜交還可通過添加去穩定劑例如甲醯胺來獲得。對於選擇性或特異性雜交，正信號可以為至少2至10倍於本底的雜交。示例性嚴格雜交條件包括下列條件50%甲醯胺，5x SSC和1% SDS，於42°C下溫育，或5x SSC，1% SDS，於65°C下溫育，在65°C下於0.2x SSC和0. I % SDS中進行洗滌。t.大體上互補本文中所使用的「大體上互補」可以意指第一序列與8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或
更多個核苷酸或胺基酸的區域上與第二序列的互補序列具有至少60%、65%、70%、75%、80 %、85 %、90 %、95 %、97 %、98 %或99 %的同一性，或兩個序列在嚴格雜交條件下雜交。u.大體上相同的本文中所使用的「大體上相同的」可以意指第一與第二序列在8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100或更多個核苷酸或胺基酸的區域上具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90^^95^^97^^98%或99%的同一性，或對於核酸而言，如果第一序列與第二序列的互補序列大體上互補。V.亞型或血清型在本文中可互換所使用並且關於FMDV病毒的「亞型」或「血清型」意指FMDV病毒抗原的遺傳變體，以便一個亞型與不同亞型可被免疫系統識別區分開來。w.變體本文中所使用的針對核酸的「變體」可以意指(i)參照的核苷酸的部分或片段；(ii)參照的核苷酸序列或其部分的互補序列；(iii)與參照的核酸或其互補序列大體上相同的核酸；或(iv)在嚴格條件下與參照的核酸、其互補序列或與其大體上相同的序列雜交的核酸。針對肽或多肽的「變體」意指在胺基酸序列上相異在於胺基酸的插入、缺失或保守置換，但保留至少一種生物活性的肽或多肽。變體還可以指具有在胺基酸序列上與參照蛋白質大體上相同的胺基酸序列的蛋白質，所述蛋白質保留至少一種生物活性。胺基酸的保守置換，即用具有相似性質(例如，親水性、帶電荷區域的程度和分布)的不同胺基酸替代胺基酸，在本領域被認為通常包括較小的改變。這些較小的改變可部分地通過考慮胺基酸的親水指數來鑑定，如本領域中所理解的。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157 :105-132 (1982)。胺基酸的親水指數基於其疏水性和電荷的考慮。在本領域中已知具有相似親水指數的胺基酸可被置換並且仍保持蛋白質功能。在一個方面，具有為±2的親水指數的胺基酸被置換。胺基酸的親水性也可用於展現可導致保留生物功能的蛋白質的置換。在肽的上下文中胺基酸的親水性的考慮允許計算該肽的最大局部平均親水性，這是已被報導與抗原性和免疫原性充分相關的有用測量。美國專利No. 4，554，101，通過引用整體併入本文。具有相似親水性值的胺基酸的置換可導致保留生物活性例如免疫原性的肽，這在本領域是被理解的。可利用彼此具有在±2內的親水性值的胺基酸進行置換。胺基酸的疏水性指數和親水性值都受到該胺基酸的特定側鏈影響。與該觀察相一致地，與生物功能相容的胺基酸置換經理解取決於胺基酸(特別是這些胺基酸的側鏈)的相對相似性，如通過疏水性、親水性、電荷、大小和其它性質所揭示的。X.載體本文中所使用的「載體」可以意指包含複製起始點的核酸序列。載體可以是質粒、細菌噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RN A載體。載體可以是自主複製染色體外載體或整合入宿主基因組的載體。2. FMDV 蛋白本文中提供了能夠在哺乳動物中引起抗一個或多個口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應的抗原。所述抗原可以是包含衣殼蛋白VPl、VP2、VP3、VP4、其共有序列、其變體、其片段或其組合的FMDV抗原。FMDV抗原可來自FMDV亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2或SAT3。FMDV抗原可包含至少一個抗原性表位，所述表位可以對於可針對其誘導免疫反應的特定FMDV免疫原是有效的。FMDV抗原的空病毒衣殼蛋白VP1-4提供了一整套存在於完整FMDV病毒中的免疫原性位點和表位。共有FMDV抗原序列可源自來自一個FMDV亞型的多種FMDV病毒的FMDV抗原序列。共有FMDV抗原可包括VP1、VP2、VP3和VP4 FMDV亞型共有蛋白質序列，其可以是共有VP1-4蛋白。共有VP1-4蛋白可包括至少一個FMDV蛋白3C的切割位點。蛋白3C的切割位點可存在於共有VP1-4蛋白的每一個共有VP1、VP2、VP3和VP4序列之間。蛋白3C對共有VP1-4蛋白的切割可切割共有VP1-4蛋白以產生共有VPl-蛋白、共有VP2-蛋白、共有VP3-蛋白和共有VP4蛋白。可選擇，天然蛋白水解切割位點可存在於每一個共有抗原序列之間，例如胺基酸序列SEQ ID NO 45 RGRKRRS0提供了包含共有VP1、VP2、VP3和VP4以及蛋白酶3C的共有序列的融合蛋白。存在分別作為亞型 A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2 和 SAT3 的共有序列的 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12 和 14。SEQ ID NO : 16為共有3C蛋白酶序列。提供了包含共有VP1、VP2、VP3和VP4的融合蛋白。存在SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28和30，它們分別為亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2和SAT3的共有序列。SEQ ID NO :32、34、36和38分別為VPl亞型Asia、O、A和C的共有序列。這些序列包括IgE前導序列SEQ ID NO :44，所述前導序列在每一種情況下可被不同前導序列置換或可被缺失且被甲硫氨酸置換。SEQ ID NO :40和42為VPl的兩個共有序列的融合蛋白。SEQ ID NO :40為共有VPl亞型A和VPl亞型C。SEQ ID NO 42為共有VPl亞型Asia和VPl亞型O。這些序列包括IgE前導序列SEQ ID NO :44，所述前導序列在每一種情況下可被不同前導序列置換或可被缺失且被甲硫氨酸置換。此外，蛋白質可以為SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的片段。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的20%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的20%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的30%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的40%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的50%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的60%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的70%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的80%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的90。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的95 。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的96%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的97%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的98%。在某些實施方案中，蛋白質為共有蛋白質的99%。此外，蛋白質與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性。在某些實施方案中，蛋白質具有80%同源性。在某些實施方案中，蛋白質具有90%同源性。在某些實施方案中，蛋白質具有95%同源性。在某些實施方案中，蛋白質具有96%同源性。在某些實施方案中，蛋白質具有97%同源性。在某些實施方案中，蛋白質具有98%同源性。在某些實施方案中，蛋白質具有99%同源性。此外，蛋白質為與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白質的片段。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的20%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的20%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的30%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的40%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的50%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的60%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的70%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的80%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的90%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的95%。在某些實施方案中，p蛋白質為同源蛋白質的96%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的97%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的98%。在某些實施方案中，蛋白質為同源蛋白質的99%。3.編碼序列本文中提供了能夠在哺乳動物中引起抗一個或多個口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應的抗原的編碼序列。抗原可以是包含衣殼蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、其共有序列、其變體、其片段或其組合的FMDV抗原。FMDV抗原可來自FMDV亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2或SAT3。FMDV抗原可包含至少一個抗原性表位，所述表位可以對於可針對其誘導免疫反應的特定FMDV免疫原是有效的。FMDV抗原的空病毒衣殼蛋白VP1-4提供了一整套存在於完整FMDV病毒中的免疫原性位點和表位。共有FMDV抗原序列可源自來自一個FMDV亞型的多種FMDV病毒的FMDV抗原序列。共有FMDV抗原可包含VP1、VP2、VP3和VP4FMDV亞型共有蛋白質序列，其可以是共有VP1-4蛋白。共有VP1-4蛋白可包含至少一個FMDV蛋白3C的切割位點。蛋白3C的切割位點可存在於共有VP1-4蛋白的每一個共有VP1、VP2、VP3和VP4序列之間。蛋白3C對共有VP1-4蛋白的切割可切割共有VP1-4蛋白以產生共有VPl-蛋白、共有VP2-蛋白、共有VP3-蛋白和共有VP4蛋白。可選擇，天然蛋白水解切割位點可存在於每一個共有抗原序列之間，例如胺基酸序列SEQ ID NO :45 :RGRKRRS。提供了包含共有￥ 1、￥ 2、￥ 3和￥ 4以及蛋白酶3C的共有序列的融合蛋白的編 碼序列。存在分別作為亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2和SAT3的共有序列的SEQ ID NO:
1、3、5、7、9、11和 132。
SEQ ID NO :15編碼共有3C蛋白酶序列。提供了包含共有VPI、VP2、VP3和VP4的融合蛋白的編碼序列。存在SEQ ID NO
17、19、21、23、25、27 和 29，它們分別為亞型 A、Asia I、C、O、SATU SAT2 和 SAT3 的共有序列。SEQ ID NO :31、33、35和37分別編碼VPl亞型Asia、O、A和C的共有序列。這些序列包括IgE前導序列SEQ ID NO :44的編碼序列，所述編碼序列在每一種情況下可被不同前導序列的編碼序列置換或可被缺失且僅被起始密碼子置換。SEQ ID NO :40和42為VPl的兩個共有序列的融合蛋白。SEQ ID NO :40為共有VPl亞型A和VPl亞型C。SEQ ID NO 42為共有VPl亞型Asia和VPl亞型O。這些序列包括IgE前導序列SEQ ID NO :44，所述前導序列在每一種情況下可被不同前導序列的編碼序 列置換或可被缺失且僅被起始密碼子置換。此外，編碼序列可編碼可為SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的片段的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的20%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的30%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的40%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的50%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的60%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的70%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的85%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的90%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的95%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的96%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質的97%的蛋白質。此外，編碼序列編碼與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、
30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼具有80%同源性的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼具有90%同源性的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼具有95%同源性的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼具有96%同源性的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼具有97%同源性的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼具有98%同源性的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼具有99%同源性的蛋白質。此外，編碼序列編碼作為與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白質的片段的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的20%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的30%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的40%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的50%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的60%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的70%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的80%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的90%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的95%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的96%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的97%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的98%的蛋白質。在某些實施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質的99%的蛋白質。此外，編碼序列可以為SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的片段、在某些實施方案中，片段為SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的 20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 %,80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。此外，編碼序列可以與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、
31、33、35、37、39和41同源。在某些實施方案中，編碼序列與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、
15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 具有 80 % ,90 % ,95 % ,96 % ,97 % ,98 %
或99%同源性。此外，編碼序列可以與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、
31、33、35、37、39和41的片段同源。在某些實施方案中，片段為SEQ ID NO :1、3、5、7、9、
11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的 20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，並且所述編碼序列與SEQ ID N0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的片段具有 80%,90%,95%,96%、97%、98%或 99% 同源性。4.質粒本文中提供了能夠以有效地引起哺乳動物的免疫反應的量在哺乳動物的細胞中表達一種或多種FMDV抗原的載體。所述載體可包括編碼FMDV抗原的異源核酸。載體可以為質粒。所述質粒對於利用編碼FMDV抗原的核酸轉化細胞是有用的，培養所述轉化的宿主細胞，將其維持在其中FMDV抗原的表達發生的條件下。所述質粒可包含編碼選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的FMDV抗原、其片段、其同源序列和同源序列的片段的核酸。所述質粒還可包含起始密碼子或前導序列(所述密碼子和序列可位於編碼序列的上遊)和終止密碼子(其可位於編碼序列的下遊)。起始和終止密碼子可與編碼序列在框內。質粒還可包含有效地連接於編碼序列的啟動子。有效地連接於編碼序列的啟動子可以是來自猿猴病毒40(SV40)的啟動、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重複(LTR)啟動子、莫洛尼病毒啟動子、禽類白血病病毒(ALV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子例如CMV立即早期啟動子、EB病毒(Epstein Barr virus) (EBV)啟動子或勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子。啟動子還可以是來自人基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或人金屬硫蛋白的啟動子。啟動子還可以是組織特異性啟動子，例如肌肉或皮膚特異性啟動子(天然或合成的)。此類啟動子的實例描述於第US20040175727號美國專利申請公布(將其內容通過弓I用整體併入本文)中。質粒還可包括多腺苷酸化信號，其可位於編碼區的下遊。多腺苷酸化信號可以是SV40多腺苷酸化信號、LTR多腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號、人生長激素(hGH)多腺苷酸化信號或人￠-珠蛋白多腺苷酸化信號。SV40多腺苷酸化信號可以是來自pCEP4質粒(Invitrogen, San Diego, CA)的多腺苷酸化信號。質粒還可包括編碼序列的上遊增強子。增強子可以為人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或病毒增強子例如來自CMV、FMDV、RSV或EBV的增強子。多核苷酸功能增強描述於美國專利No. 5，593，972、5，962，428和W094/016737 (將每一個專利的內容通過引用整體併入本文)中。質粒還包括哺乳動物複製起始點以在細胞中染色體外維持質粒和產生多拷貝的質粒。質粒可以是來自Invitrogen (San Diego, CA)的pVAXl、pCEP4或pREP4,其可包括EB病毒的複製起始點和細胞核抗原EBNA-I編碼區，其可產生高拷貝附加型複製而無需整合。質粒的主鏈可以是PAV0242。質粒可以是複製缺陷型腺病毒5型(Ad5)質粒。質粒還可包含調控序列，其可以十分適合在已將質粒施入其中的細胞中進行基因表達。編碼序列可包含密碼子，所述密碼子可以允許編碼序列在宿主細胞中更高效地轉錄。編碼序列可包含Ig前導序列。所述前導序列可位於編碼序列的5』。由該序列編碼的共有蛋白質可包含N-末端Ig前導序列，然後共有蛋白質。N-末端Ig前導序列可以為IgE 或 IgG0
質粒可以是pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.),可將其用於在大腸桿菌(Escherichia coli) (E. coli)中進行蛋白質生產。質粒還可以是 pYES2 (Invitrogen,San Diego, Calif.),可將其用於在酵母的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)株中進行蛋白質生產。質粒還可具有MAXBAC 完整杆狀病毒表達系統(Invitrogen, SanDiego，Calif.)，可將其用於在昆蟲細胞中進行蛋白質生產。質粒還可以是pcDNA I或pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.),可將其用於在哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中進行蛋白質生產。質粒可包含一個或多個編碼序列，所述編碼序列編碼來自一個或多個亞型例如Asia、A、O、C、SATU SAT2 和 SAT3 的 VP1、VP2、VP3、VP4 和 3C 中的一個或多個。在某些實施方案中，質粒包含來自亞型Asia、A、O、C、SATl、SAT2或SAT3的多個不同的共有FMDV抗原VP1、VP2、VP3、VP4和3C的編碼序列。在某些實施方案中，質粒包含來自亞型Asia、A、O、C、SATl、SAT2或SAT3的多個不同的共有FMDV抗原VPl、VP2、VP3和VP4的編碼序列。在某些實施方案中，質粒包含來自亞型Asia、A、0和C中的兩個亞型的兩個不同的共有FMDV抗原VPl，例如來自亞型Asia的VPl和來自亞型0的VPl或來自t亞型A的VPl和來自亞型C的VPl。在某些實施方案中，質粒包含共有FMDV抗原VPl例如VPl亞型Asia、VPl亞型A、VPl亞型0或VPl亞型C的編碼序列。編碼序列可由全部由有效連接的啟動子調控的不同DNA質粒例如具有由一個或多個啟動子調控的編碼序列(所述編碼序列包含多種共有FMDV抗原)的DNA質粒編碼。5.疫苗然而不受科學理論束縛，可用於引起廣泛抗FMDV的免疫反應(體液、細胞或兩者)的疫苗可包含上文中所示的一個或多個編碼序列，即編碼一種或多種來自亞型(選自FMDV亞型例如 A、As ia I、C、0、SATI、SAT2、SAT3 或其組合)的蛋白質 VPI、VP2、VP3、CVP4 和 3C的核酸序列。編碼序列還可包括包含同源序列、片段和片段的同源序列的那些編碼序列。可選擇地或此外，誘導抗FMDV免疫反應的組合物還可包括一種或多種選自FMDV亞型例如A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3 或其組合的蛋白質。本文中提供了能夠在哺乳動物中產生抗一個或多個FMDV亞型的免疫反應的疫苗。所述疫苗可包含上述質粒。疫苗可包含多種各自針對一個或多個FMDV亞型例如A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的質粒。疫苗還可包含本身針對一個或多個FMDV亞型例如A、Asia I、C、O、SATU SAT2、SAT3或其組合的FMDV抗原。疫苗還可包括針對來自世界的特定區域例如亞洲、歐洲和南非(sub-Africa)的FMDV亞型的質粒。可選擇地或此外，疫苗還可包括一個或多個FMDV亞型例如A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的蛋白質。疫苗還可包括本身針對一個或多個FMDV亞型例如A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的FMDV抗原。疫苗還可包括針對來自世界的特定區域例如亞洲、歐洲和南非的FMDV亞型的質粒和/或蛋白質。可提供疫苗以誘導治療性或預防性免疫反應。疫苗還可包含編碼FMDV C3蛋白酶的核酸，其可以是共有C3蛋白酶核酸。共有蛋白質3C核酸可以是蛋白3C編碼序列。可選擇地或此外，疫苗還可包含FMDV C3蛋白酶，例如共有C3蛋白酶例如蛋白3C。疫苗還可包含編碼全長或部分VP1-4編碼序列和全長或部分C3編碼序列的嵌合基因。可選擇地或此外，疫苗還可包含含有全長或部分VP1-4以及全長或部分C3的融合蛋白。/
本文中提供了根據本發明的藥物組合物,所述藥物組合物包含約I納克至約IOmg的DNA。在某些實施方案中，根據本發明的藥物組合物包含1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 納克，或至少 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895. 900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995 或 1000 微克，或至少 I. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5、8、8. 5,9,9. 5 或 IOmg 或更多；和 2)達到並且包括 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 納克，或達到並且包括 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895. 900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995 或 1000 微克，或達到並且包括 I. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5或IOmg之間的DNA。在某些實施方案中，根據本發明的藥物組合物包含約5納克至約IOmg的DNA。在某些實施方案中，根據本發明的藥物組合物包含約25納克至約5mg的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約50納克至約Img的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約0. I至約500微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約5至約250微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約10至約200微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約15至約150微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約20至約100微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約25至約75微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約30至約50微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約35至約40微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA0在某些實施方案中，藥物組合物包含約10微克至約100微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約20微克至約80微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約25微克至約60微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約30納克至約50微克的DNA。在某些實施方案中，藥物組合物包含約35納克至約45微克的DNA。在某些優選實施方案中，藥物組合物包含約0. I至約500微克的DNA。在某些優選實施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在某些優選實施方案中，藥物組合物包含約25至約250微克的DNA。在某些優選實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA。
根據待使用的施用模式配製根據本發明的藥物組合物。在其中藥物組合物為可注射藥物組合物的情況下，它們是無菌、無熱源和無微粒的。優選使用等滲製劑。通常地，用於等滲性的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在某些情況下，等滲溶液例如磷酸緩衝鹽溶液是優選的。穩定劑包括明膠和白蛋白。在某些實施方案中，向製劑中加入血管收縮劑。優選地藥物組合物為疫苗，更優選為DNA疫苗。所述疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗可包含多個相同或不同的質粒，所述質粒包含一種或多種共有前列腺抗原的核酸編碼序列。DNA疫苗可包含一種或多種核酸序列,所述核酸序列編碼一種或多種共有前列腺抗原。當DNA疫苗包含超過一種共有前列腺抗原的編碼序列時，所有此類序列可存在於單個質粒上，或每一種此類序列可存在於不同質粒上。在某些實施方案中，疫苗可包含編碼與一種或多種共有前列腺抗原組合的一種或多種共有前列腺抗原的核酸序列。DNA 疫苗公開於美國專利 No. 5，593，972,5, 739，118,5, 817，637,5, 830，876、5，962，428,5, 981，505,5, 580，859,5, 703，055 和 5，676，594 (將所述專利通過引用整體並
入本文)中。DNA疫苗還可包含抑制其整合入染色體的元件或試劑。疫苗可以是前列腺抗原的RNA。可將RNA疫苗引入細胞。疫苗可以是包含上述基因構建體或抗原的重組疫苗。疫苗還可包含一種或多種共有前列腺抗原，所述抗原以一種或多種蛋白質亞單位或一種或多種包含一種或多種共有抗原的減毒病毒顆粒的形式存在。減毒疫苗可以是減毒活疫苗、殺死的疫苗和使用重組載體遞送編碼一種或多種共有前列腺抗原的外源基因的疫苗，以及亞單位和蛋白質疫苗。減毒活疫苗的實例，使用重組載體遞送前列腺抗原的那些疫苗、亞單位疫苗和糖蛋白疫苗，描述於美國專利 No. :4，510，245 ;4，797，368 ;4，722，848 ;4，790，987 ;4，920，209 ;5，017，487 ；5，077，044 ;5，110，587 ;5，112，749 ;5，174，993 ;5，223，424 ;5，225，336 ;5，240，703 ；5，242，829 ;5，294，441 ;5，294，548 ;5，310，668 ;5，387，744 ;5，389，368 ;5，424，065 ；5，451，499 ；5, 453，364 ；5, 462，734 ；5, 470，734 ；5, 474，935 ；5, 482，713 ；5, 591，439 ；5，643，579 ；5, 650，309 ；5, 698，202 ；5, 955，088 ；6, 034，298 ；6, 042，836 ；6, 156，319 和6，589，529 (將所述專利各自通過弓I用併入本文)中。疫苗可包含與其它疫苗組分例如FMDV蛋白或編碼蛋白質的表達載體組合的質粒。可將提供的疫苗用於誘導免疫反應,包括治療性或預防性免疫反應。可產生針對共有前列腺抗原的抗體和/或殺傷T細胞。可分離此類抗體和細胞。疫苗還可包含藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可以是功能分子如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑。藥學上可接受的賦形劑可以是轉染促進劑，其可包括表面活性劑，例如免疫刺激複合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷醯脂質A)、胞壁醯肽、醌類似物、媒介物(vesicle)例如角鯊烯和角鯊烯、透明質酸、脂質、脂質體、鈣離子、病毒蛋白質、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒或其它已知的轉染促進劑。 轉染促進劑為聚陰離子、聚陽離子，包括聚-L-谷氯酸(LGS)或脂質。轉染促進劑為聚-L-穀氨酸，更優選地，聚-L-穀氨酸以低於6mg/ml的濃度存在於疫苗中。轉染促進劑還可包括表面活性劑例如免疫刺激複合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷醯脂質A)、胞壁醯肽、醌類似物以及媒介物(vesicle)例如角鯊烯和角鯊烯，還可將透明質酸與基因構建體結合施用。在某些實施方案中，DNA質粒疫苗還可包括轉染促進劑例如脂質、脂質體(包括卵磷脂脂質體或本領域已知的其它脂質體)如DNA-脂質體複合物(參見例如W09324640)、鈣離子、病毒蛋白質、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒或其它已知的轉染促進劑。優選地，轉染促進劑為聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-穀氨酸(LGS)或脂質)。疫苗中轉染劑的濃度低於4mg/ml，低於2mg/ml，低於lmg/ml，低於0. 750mg/ml，低於0. 500mg/ml,低於 0. 250mg/ml,低於 0. 100mg/ml,低於 0. 050mg/ml 或低於 0. 010mg/ml。藥學上可接受的賦形劑可以是佐劑。所述佐劑可以是在替代質粒中表達或作為與疫苗的上述質粒組合的蛋白質進行遞送的其它基因。佐劑可選自《-幹擾素(IFN-ci)、^ -幹擾素(IFN- ￠), Y-幹擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF a、TNF ^、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(cutaneous T cell-attracting chemokine)(CTACK)、上皮胸腺表達趨化因子(epithelial thymus-expressed chemokine) (TECK)、黏膜結合上皮趨化因子(mucosae-associated epithelial chemokine) (MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86 (包括具有缺失信號序列和任選地包含來自IgE的信號肽的IL-15)。佐劑可以為 11-12、11-15、0^0(、了￡0(、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF a、TNF0、GM_CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 或其組合。可用作佐劑的其它基因包括這樣的基因，所述基因編碼MCP_1、MIP-la、MIP_lp、IL-8、RANTES, L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50. 95、PECAM、ICAM-U I CAM-2, I CAM-3, CD2、LFA-3、M-CSF, G-CSF, IL-4,IL-18的突變形式、⑶40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、天胱酶 ICE、Fos、c_jun、Sp-I、Ap-I、Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、幹擾素應答基因、NFkB, Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配體、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片段。疫苗還可包括1994年4月I日提交的美國專利No. 021,579(將其通過引用整體併入本文)中描述的基因疫苗促進劑。可根據待使用的施用模式配製疫苗。可注射疫苗藥物組合物可以是無菌、無熱源和無微粒的。可使用等滲製劑或溶液。用於等滲性的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收縮劑。等滲溶液可包含磷酸緩衝鹽溶液。疫苗還可包含穩定劑(包括明膠和白蛋白)。穩定化可允許製劑在室溫下或環境溫度下長期穩定，例如向疫苗製劑中加入LGS或聚陽離子或聚陰離子。6.遞送疫苗的方法本文中提供了用於遞送疫苗以提供FMDV抗原的基因構建體和蛋白質 的方法，所述FMDV抗原包含使它們特別有效地抗FMDV的免疫原(可誘導針對其的免疫反應)的表位。可提供遞送疫苗或接種的方法以誘導治療性和預防性免疫反應。接種方法可在哺乳動物中產生抗多個FMDV亞型的免疫反應。可將疫苗遞送至個體以調節哺乳動物的免疫系統的活性和增強免疫反應。疫苗的遞送可以是以核酸分子的形式轉染FMDV抗原，所述核酸在細胞中表達並且被遞送至細胞的表面，然後免疫系統識別所述抗原並且誘導細胞、體液或細胞及體液反應。通過給哺乳動物施用上述疫苗，可將疫苗的遞送用於在哺乳動物中誘導或引起抗多種FMDV病毒的免疫反應。在將疫苗和質粒遞送入哺乳動物的細胞後，轉染的細胞將表達和分泌從疫苗注射的每一種質粒的共有衣殼。這類分泌的衣殼蛋白將被免疫系統識別為外來物，並且將產生抗它們的抗體。這類抗體將由免疫系統維持並且允許快速清除隨後的FMDV攻擊。可給哺乳動物施用疫苗以引起哺乳動物的免疫反應。哺乳動物可以是人、靈長類動物、非人靈長類動物、母牛、牛、綿羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科動物(bovid)、鹿、豪豬、大象、駱馬、羊駝、小鼠、大鼠和雞。a.聯合治療可將疫苗與其它蛋白質或基因組合施用，所述基因編碼a-幹擾素、Y-幹擾素、血小板衍生生長因子(I3DGF)、TNF a、TNF0、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達趨化因子(TECK)、黏膜結合上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86 (包括具有缺失信號序列和任選地包含來自IgE的信號肽的IL-15)、IL-12、IL-15、CTACK, TECK、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF a、TNF^、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50. 95、PECAM、ICAM-U I CAM-2, I CAM-3, CD2、LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4,IL-18的突變形式、⑶40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、天胱酶 ICE、Fos、c_jun、Sp-I、Ap-I、Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、來活的 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、幹擾素應答基因、NFkB, Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配體、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片段或其組合。還可將疫苗與CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或其功能片段組合施用。
可通過不同途徑(包括口服、胃腸外、舌下、經皮膚、經直腸、轉黏膜、局部、通過吸入、通過頰部施用、胸膜內、靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌內、鼻內、硬膜內和關節內途徑或其組合)施用疫苗。為了進行獸醫學使用，可按照標準獸醫實踐將組合物配製為適當地可接受的製劑。獸醫可容易地確定最適合於具體動物的給藥方案和施用途徑。可以通過常規注射器、無針注射裝置、「微粒轟擊基因槍(microprojectile bombardment gone guns)」或其它物理方法例如電穿孔(「EP」)、「水動力學法(hydrodynamic method) 」或超聲波來施用疫苗。可利用幾個公知的技術將疫苗的質粒遞送至哺乳動物，所述技術包括利用和不利用體內電穿孔的、脂質體介導的、納米顆粒促進的重組載體例如重組腺病毒、重組腺病毒相關病毒和重組牛痘的DNA注射(也稱為DNA接種)。可通過DNA注射以及體內電穿孔來遞送FMDV抗原。b.電穿孔可使用電穿孔裝置來實現通過疫苗的質粒的電穿孔進行的疫苗施用，所述電穿孔 裝置被構造用來將脈衝能量(所述脈衝能量產生與由用戶輸入的預設電流相似的恆定電流)遞送至哺乳動物的期望的組織。電穿孔裝置可包括電穿孔組件和電極總成(electrodeassembly)或把手總成(handle assembly)。電穿孔組件可包括並且整合有電穿孔裝置的各種元件中的一個或多個元件，包括控制器、電流波形發生器、阻抗測試儀、波形記錄器、輸入元件、狀態報告元件、通信埠、存儲組件(memory component)、電源和電源開關。電穿孔可使用幫助利用質粒轉染細胞的VGXP Cellectra 系統來實現。電穿孔組件可用作電穿孔裝置的一個元件，並且其它元件是與電穿孔組件通信的分開的元件(或組件)。電穿孔組件可用作電穿孔裝置的超過一個元件，其仍然可與電穿孔裝置的與所述電穿孔組件分開的其它元件通信。作為一個電機或機械裝置的部分存在的電穿孔裝置的元件可以不限為可用作一個裝置的元件或彼此通信的分開的元件。電穿孔組件可以能夠遞送在期望的組織中產生恆定電流的脈衝能量，並且包括反饋機制。電極總成可包括將多個電極按空間排布的電極陣列，其中電極總成接收來自電穿孔組件的脈衝能量，並且通過電極將所述脈衝遞送至期望的組織。多個電極中的至少一個在遞送脈衝能量的過程中是中性的，並且測量期望的組織中的阻抗，以及將所述阻抗傳達給電穿孔組件。反饋機制可接收測量的阻抗並且可調整通過電極組件遞送的脈衝能量以維持恆定電流。多個電極可以以分散模式遞送脈衝能量。多個電極可通過處於程控次序(programmed sequence)下的電極的控制以分散模式遞送脈衝能量,所述程控次序由用戶輸入至電穿孔組件。程控次序可包括多個按次序遞送的脈衝，其中通過至少兩個有效電極和一個測量阻抗的中性電極遞送多個脈衝的每一個脈衝，並且其中通過至少兩個有效電極中的不同一個和測量阻抗的一個中性電極遞送多個脈衝的隨後的脈衝。可通過硬體或軟體來進行反饋機制。可通過模擬閉環迴路來進行反饋機制。反饋可每50 ii s、20 ii S、10 ii s或I ii s發生一次，但優選為實時反饋或瞬時反饋(S卩，大體上即時，如通過用於測定響應時間的可用技術測定的)。中性電極可測量期望的組織中的阻抗並且將所述阻抗傳達給反饋機制，然後反饋機制響應於該阻抗並且調整脈衝能量以將恆定電流維持在與預設電流相似的值上。反饋機制可在脈衝能量的遞送過程中連續且即時地維持恆定電流。
可幫助遞送本發明的DNA疫苗的電穿孔裝置和電穿孔方法的實例包括屬於Draghia-Akli等人的美國專利No. 7，245，963、由Smith等人提交的美國專利公布No. 2005/0052630(將所述專利和專利公布的內容通過引用整體併入本文)中描述的那些裝置和方法。可用於幫助遞送DNA疫苗的其它電穿孔裝置和電穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未決和共同擁有的美國專利申請No. 1/874072(所述申請根據35 USC119(e)要求2006年10月17日提交的美國臨時申請No. 60/852，149的利益)和2007年10月10日提交的美國臨時申請No. 60/978，982(將全部所述專利申請通過引用整體併入本文)中提供的那些裝置和方法。Draghia-Akli等人的美國專利No. 7，245，963描述了標準電極系統以及它們用於幫助將生物分子引入身體或植物內的選定組織的細胞中的用途。標準電極系統可包括多個針電極；皮下注射針；提供從程序控制的恆定電流脈衝控制器至多個針電極的導電連接的電連接器；和電源。操作員可緊握多個被安裝在支持結構上的針電極並且將它們牢固地插入身體或植物內的選定組織。隨後通過皮下注射針將生物分子遞送到選定組織。啟動程序控制的恆定電流脈衝控制器，將恆定電流電脈衝施加至多個針電極。所施加的恆定電流電脈衝幫助將生物分子引入多個電極之間的細胞。將美國專利No. 7，245，963的全部內容通 過引用併入本文。由Smith等人提交的美國專利公布2005/0052630描述了可用於有效地促進將生物分子弓I入身體或植物內的選定組織的細胞的電穿孔裝置。電穿孔裝置包括電動裝置(「EKD裝置」)，其操作由軟體或固件指定。EKD裝置基於用戶控制和脈衝參數的輸入在陣列中的電極之間產生一系列程序控制的恆定電流脈衝模式，並且允許存儲和獲取電流波形數據。電穿孔裝置還包括具有針電極的陣列的可替換電極盤、用於注射針的中央注射通道和可移動的導盤。將美國專利公布2005/0052630的整體內容通過引用併入本文。美國專利No. 7，245，963和美國專利公布2005/0052630中描述的電極陣列和方法可適合於不僅深滲透到組織例如肌肉，而且還深滲透到其它組織或器官中。由於電極陣列的構型的原因，還可將注射針(遞送選擇的生物分子)完全插入靶器官中，將注射垂直於靶組織施用至利用電極預先描繪的區域中。美國專利No. 7，245，963和美國專利公布2005/005263中描述的電極優選為20_長和21規格。此外，預期在某些整合電穿孔裝置和其用途的實施方案中，存在下列專利中描述的電穿孔裝置1993年12月28日公布的美國專利5，273，525，2000年8月29日公布的美國專利6，110, 161,2001年7月17日公布的6，261，281和2005年10月25日公布的6，958，060，以及2005年9月6日公布的美國專利6，939，862。此外，在本文中預期涵蓋2004年2月24日公布的美國專利6，697，669 (其涉及使用多種裝置的任一種遞送DNA)和2008年2月5日公布的美國專利7，328，064(涉及注射DNA的方法)中提供的主題的專利。將上述專利通過引用整體併入本文。c.製備疫苗的方法本文中提供了用於製備疫苗的方法。在某些實施方案中，所述方法為製備包含DNA質粒的疫苗的方法。在最終通過亞克隆步驟克隆入哺乳動物表達質粒後，可使用本領域已知的方法將DNA質粒用於在大規模發酵罐中接種細胞培養物。將質粒轉化入可相容的宿主細胞，在其中FMDV抗原的表達發生的條件下培養和維持所述細胞。可通過裂解細胞從培養物或從培養基回收FMDV抗原，分離抗原。可將分離的VP1-4共有蛋白質用於作為抗體的天然來源用於疫苗。可使用自動化合成儀，通過重組技術產生FMDV抗原，也可將所述FMDV抗原用於產生分離的基本上純的FMDV抗原。這些技術可用於引入FMDV的特定亞型的FMDV抗原的變體。可使用已知裝置和技術的組合配製或製備與本發明的EP裝置一起使用的DNA質粒，但優選地使用最優化的質粒製備技術製備它們，所述技術描述於2007年5月23日提交的得到許可的共同未決的美國臨時申請No. 60/939,792中。在某些實施例中，可以以大於或等於10mg/mL的濃度配製用於這些研究的DNA質粒。除了 2007年7月3日公布的美國專利No. 60/939792中描述的那些裝置和方案(包括得到許可的美國專利No. 7，238，522中描述的那些裝置和方法)外，製備技術還包括或整合對於本領域技術人員來說是公知的不同裝置和方案。將上文中提及的申請和專利(美國專利No. 60/939，792和美國專利No. 7，238，522)分別地通過引用整體併入本文。d.用於製備VP1-4表達構建體的方法通過首先使用來自FMDV亞型Asia、O、A、C、SATU SAT2和SAT3的至少10個不同序列最優化所述FMDV亞型之一的VP1、VP2、VP3和VP4胺基酸序列來構建多靶向性FMDVDNA疫苗。產生各自編碼亞型最優化的VP1-4蛋白的核酸。將亞型最優化的VP1-4核酸序列克隆為連接編碼序列，VP通過間插FMDV蛋白3C蛋白酶切割位點分隔。在操縱子的控制下將最優化的VP1-4編碼序列插入表達載體pVAX或pAV0242。將IgE前導序列置於最優化的VP1-4編碼序列的上遊以便編碼的蛋白質包括N末端IgE前導序列。將兩個終止密碼子置於VP1-4編碼序列的3』末端。此外，通過使用來自FMDV亞型Asia 1、0、A、C、SAT1、SAT2和SAT3的至少10個不同序列最優化所述FMDV亞型之一的3C核酸序列來構建編碼FMDV蛋白3C的核酸。產生編碼亞型最優化的3C蛋白的核酸，將其克隆入pVAX或pAV0242質粒。e.使用疫苗作為標記的方法本文中還提供了區分用疫苗接種的哺乳動物與被FMDV感染的哺乳動物的方法。所述方法可包括從哺乳動物取樣，從所述樣品分離哺乳動物的抗體。已用疫苗接種的哺乳動物可具有僅特異於FMDV抗原的空衣殼蛋白即針對FMDV亞型A、Asia I、0、C、SAT1、SAT2、 SAT3或其組合的病毒外殼蛋白VP1-4的抗體。已被FMDV感染的哺乳動物將具有抗特定FMDV亞型例如A、Asia 1、0、C、SAT1、SAT2或SAT3的FMDV病毒外殼蛋白VP1-4的抗體和此外抗FMDV的非結構(NS)蛋白的抗體。FMDV的NS蛋白可包括蛋白酶3C蛋白酶以及FMDV蛋白2C、3A、3B和3D(聚合酶)。所述方法可包括鑑定抗FMDV的NS蛋白例如高度抗原性3D蛋白的抗體。所述方法還包括比較接種的哺乳動物的血清樣品以確定FMDV NS蛋白的存在或不存在。感染的哺乳動物具有抗FMDV的NS蛋白的抗體，然而接種的哺乳動物不具有抗NS蛋白的抗體，因為該哺乳動物具有充足的抗FMDV感染的免疫力。所述方法可包括區分具有針對VP1-4的抗體的哺乳動物與具有針對FMDV的VP1-4和3D聚合酶的抗體的哺乳動物。通常，可使用試劑。試劑可以是VP1-4或NS蛋白例如3D聚合酶。利用FMDV抗體分離來自哺乳動物的樣品，將其與所述試劑反應以鑑定FDMV抗體的特異性。可從哺乳動物分離所述方法的樣品，其可包括來自血液的血清樣品、唾液、眼淚、腦脊髓液、眼房水、胸膜液、心包液、淋巴結液、chime、乳糜、膽汁、尿、滑液、嘔吐物、腹膜液、糞便水(Stool water)、精液、羊水、奶、血清、間質液和胰液。用於進行診斷測試的方法包括對特定FMDV蛋白例如VP1-4和3D聚合酶進行利用來自哺乳動物的[35S]甲硫氨酸-標記的細胞裂解物的免疫沉澱、蛋白質印跡和免疫印跡。可以以多種公知的檢測系統執行本文中描述的檢測方法以確定針對FMDV VPI-4或3D聚合酶的抗體在測試樣品或對照樣品中的存在。檢測系統可包括從結合至特定FMDV蛋白例如VP1-4和3D聚合酶的檢測標記產生的信號與預定值之間的螢光或其它方式的比較以確定針對FMDV VP1-4或3D聚合酶的抗體在測試樣品中的存在或不存在。預定值可以是從測試樣品測量的信號對從對照樣品測量的信號的比率。通常，測試樣品產生高於從對照樣品測量的平均信號3個標準差的信號，所述對照樣品不包含可被認為是FMDV 3D聚合酶陽性並由此被認為是感染的哺乳動物的FMDV 3D聚合酶抗體。
可選擇地，可將儀器例如密度計用於測量可檢測標記的數值。可使用Sackett 等人，Clinical Epidemiology A Basic Science for Clinical Medicine,p. 106-107 (Little Brown and Co. , 1985)的方法，利用接受操作者曲線(ReceiveOperator Curve) ( 「R0C」)測定預定值。預定值可基於通過突光成像儀或上述其它方法產生的相對光單位。簡而言之，可從對應於診斷測試結果的每一個可能值的真陽性率(即，靈敏度)和假陽性率(即，100%特異性)對的曲線測定預定值。與左上角最接近的曲線上的預定值(即，包圍最大面積的值)是最精確的預定值，並且產生比通過此方法測定的預定值更高的信號的樣品被認為是陽性的。可選擇地，可將預定值沿著曲線向左偏移以使假陽性率降至最低。(a)免疫印跡法可將檢測方法用於免疫印跡檢測系統以在測試樣品或對照樣品中檢測針對FMDVVP1-4或3D聚合酶的抗體。免疫印跡法可使用固體支持物以固定試劑。免疫印跡法可使用兩個分別的對照樣品(即，第一對照和第二對照)，可將所述樣品固定在固體支持物上。免疫印跡法可使用3個分開的、不連續對照樣品(即，第一對照、第二對照和第三對照)。如果存在超過一種的對照樣品，則對照可以彼此相同或彼此不同。對照樣品中的兩種樣品可以相同(例如，第一對照與第二對照)。如果對照樣品中的兩種樣品相同，則對照樣品之一的濃度(第一對照或第二對照或如果存在3種對照，則第一對照或第三對照或第二對照或第三對照的水平)可高於(或大於)其它對照。對照樣品可在濃度上高於另一種對照，並且可被稱為「高對照」。以比高對照更低的濃度固定在條帶、盤或薄板上的對照可被稱為「低對照」。低對照對高對照的濃度比可以為約I : 2至約I : 10，優選約I : 5至約I : 6。例如，第一對照可以為低對照並且第二對照可以為高對照。可選擇地，第一對照可以為高對照並且第二對照可以為低對照。以另一個例子為例，3個對照檢測系統可包括低對照和高對照以及第三對照(其可被用於例如驗證樣品添加)。低對照和高對照可以為人血漿(其中低對照對高對照的比率為約I : 2至約I : 10)並且第三對照可以為SDB Chagas或人血眾。在流過式分析形式(flow-through format)中，可將固體支持物上的固定的試劑浸入含有測試樣品的溶液中。可選擇地，可將固體支持物與稀釋劑一起置於反應盤(reaction tray)中，然後向反應盤中加入測試樣品。使用本文中先前描述的相同時間和技術將測試樣品和試劑溫育充足的時間。可使用本文中先前描述的技術除去未結合的測試樣品。在該形式中，當測試樣品通過膜時，測試樣品中針對VP1-4或NS結構蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體可結合固定的試劑(和至少一種對照)。可加入至少一種檢測試劑(例如本文中先前描述的包含可檢測標記的檢測試劑)。至少一種檢測試劑可結合每一個試劑-抗體複合物(當含有檢測試劑的溶液流過條帶時形成的)。為了確定針對VP1-4或NS結構蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體在測試樣品中的存在或不存在，可如上所述使用截斷值或如下更詳細地論述的通過比較由一個或多個對照產生的一個或多個信號的強度來檢測結合的檢測試劑。當可將上述低對照和高對照用於流過式分析形式中時，可通過鑑定來自可檢測標記的信號在每一個試劑的測試條帶(或斑或點)上的存在來確定針對VP1-4或NS結構蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體在測試樣品中的存在或不存在。如果信號在試劑的測試條帶上得到鑑定，那麼使用0至4+的等級將該檢測到的信號的強度與來自低對照條帶(或斑或點)和高對照條帶(或斑或點)的信號的強度相比較。當無條帶可見時讀數為O。可將低對照條帶和高對照條帶的強度分別確定為1+(對於低對照)和3+(對於高對照)。具有/可與低對照的強度相比較的強度的測試條帶可被評級為I+。具有低對照的強度與高對照的強度之間的強度的條帶可被評級為2+。具有可與高對照的強度相比較的強度的條帶可被評級為3+。高於高對照的條帶強度的條帶強度可被評級為4+。(b)競爭性測定可將檢測方法用於競爭性檢測系統來鑑定具有針對VP1-4或NS結構蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體的測試樣品。可將所述試劑固定在上述固體支持物上。隨後可將固定的試劑與被可檢測標記的競爭性抗體接觸，已知所述競爭性抗體結合所述試劑並且與測試樣品中的針對VP1-4或NS結構蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體競爭。還可將固定的試劑與測試樣品接觸。來自可檢測地標記的抗體的信號在含有針對VP1-4或NS結構蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體的測試樣品中可能更低，因為兩組抗體都競爭所述固定的試劑。f.診斷試劑盒本文中提供了用於進行鑑定已用疫苗接種的哺乳動物與被FMDV感染的哺乳動物的診斷方法的試劑盒。所述試劑盒提供了材料，所述材料允許鑑定已被FMDV感染的哺乳動物以鑑定抗FS蛋白(包括FMDV的3D聚合酶蛋白)的抗體對僅針對接種的哺乳動物的空衣殼蛋白VP1-4的抗體。測試試劑盒可包括一種或多種試劑例如用於實施一個或多個根據本發明的免疫測定的試劑。測試試劑盒通常包括具有一個或多個容器的包裝，所述容器裝有試劑如一種或多種分開的組合物或任選地其中允許試劑的相容性的混合物。測試試劑盒還可包括從用戶的角度來看可能是想要的其它材料，例如緩衝液、稀釋液、標準和/或用於樣品處理、洗滌或進行測定的任何其它步驟的任何其它材料。根據本發明的試劑盒可包括固相和附著至固體支持物的試劑。可將試劑盒用於進行夾心免疫測定法，且試劑盒可包括標記的檢測抗體。標記的檢測抗體可以是抗人IgG標記抗體。所述試劑盒還可包括可檢測的標記物。測試試劑盒可包括至少一種直接標記物例如吖啶-9-甲醯胺。根據本發明的測試試劑盒還可包括至少一種間接標記物。如果所使用的標記物通常需要指示劑來產生可檢測的信息，那麼測試試劑盒可包括一種或多種適當的指示劑。測試試劑盒可包括用於進行本發明的一個或多個免疫測定法的說明書。可將本發明的試劑盒中包括的說明書粘貼至包裝材料或可將其以包裝說明書的形式包括在試劑盒中。雖然說明書通常是書寫或印刷的材料，但它們不限於此。本發明涉及能夠存儲此類說明書並且將它們傳送至終端用戶的任何介質。這樣的介質包括但不限於電子存儲介質(例如，磁碟、磁帶、盒式忙存器(cartridge)、晶片)、光學介質(例如，⑶ROM)等。如本文中所使用的，術語「說明書」可包括提供該說明書的網際網路站的地址。
實施例實施例I
重組VP1-4的表達通過使用上述最優化的VP1-4和3C表達質粒進行體內翻譯測定來表達亞型最優化的VP1-4蛋白和最優化的3C蛋白。此類蛋白的翻譯在SDS-PAGE凝膠上產生預期的條帶。為了確認VP1-4蛋白的表達，將編碼亞型最優化的VP1-4蛋白和N末端IgE前導序列的核酸克隆入HIS-標記細菌表達載體。也將編碼亞型最優化的3C蛋白的核酸克隆入HIS-標記細菌表達載體。使用細菌表達系統表達最優化的VP1-4和3C蛋白，使用鎳柱分離來進行親和層化。使用SDS-PAGE凝膠分析純化的蛋白質。SDS-PAGE顯示預期的條帶。實施例2接種方法為了測試DNA質粒的功效，用最優化的VP1-4-和3C-編碼pVAX質粒免疫Balb/C小鼠。將空PVAX和人IL-15-編碼pVAX載體用作對照。在第O、14和28天每天免疫小鼠3次。在最後一次免疫後3天處死免疫小鼠。收集小鼠的血清，分析其抗-VP1、-VP2、-VP3和-VP4ELISA。將來自實施例I的HIS-標記的重組蛋白用作捕捉抗原。pVAX對照的血清不能識別任何亞型最優化的VP1-4。相反地，用亞型最優化的VP1-4DNA疫苗免疫的小鼠產生針對亞型最優化的VPl、-2、-3和-4的抗體，這表明最優化的VP1-4融合疫苗正引起小鼠產生抗所有4種VP的免疫反應。實施例3製備表達構建體構建多靶向性FMD DNA疫苗。首先用來自每一個亞型的至少10個不同的序列對來自亞型Asial、O、A、C、SATl、SAT2和SAT3的VPl序列進行共有序列最優化。然後，將兩個VPl序列插入在一個啟動子下，並且通過兩個連續切割位點分隔。將IgE前導序列插入在第一 ORF之前，將兩個終止密碼子插入在第二 ORF之後。第一質粒編碼Asia和0 VPl，其為1362bp。編碼A和C VPl的第二質粒為1356bp。第三和第四質粒靶向具有第一編碼SATl和SAT2 VPl以及第二編碼SAT3 VPl的南非亞型。實施例4重組VP1-4的表達隨後利用體外翻譯測定法表達克隆的質粒。所有單個VPl構建體_A、Asia、C和0的翻譯-產生預期的條帶[約24. 5kDa]並且A+CVP1和Asia+0 VPl結構域產生更高的二聚體條帶。它們構建件體具有用於免疫沉澱中的FLAG-表位。實施例5接種方法為了確認抗FMD的免疫反應，我們從所有4種VPl亞型(A、Asia、C和0)重組共有FMDV VPl序列(在N端以下劃線標示IgE前導序列)產生重組FMD VPl蛋白。將蛋白質克隆入HIS-標記的細菌表達載體，然後表達載體。通過鎳柱分離來純化蛋白質，以箭頭標不表達的蛋白質。然後為了測試DNA質粒的功效，免疫Balb/C小鼠。使用CELLECTRA電穿孔利用每次免疫15 y g DNA來免疫小鼠。存在7個免疫組
I. pVax2. pVax-FMDV VPlA+pVAXl-IL-153.pVax-FMDV VPl Asia+pVAXl-IL-154. pVax-FMDV VPl C+pVAXl-IL-155.pVax-FMDV VPl 0+pVAXl_IL_156.pVax-FMDV VPl A-C+pVAXl_IL_157. pVax-FMDV VPl Asia-O+pVAXl-IL-15在第0、14和28天免疫小鼠3次，在最後一次免疫後3天處死小鼠。收集小鼠的血清，分析其抗VPl ELISA。將重組蛋白質用作捕捉抗原。來自pVAX對照小鼠的血清不能識別A、Asia、C和0 VPl蛋白。相反地，用A、Asia、C和0 DNA疫苗免疫的小鼠產生分別針對A、Asia、C和0 VPl蛋白的抗體。更重要地，用VPl A-C或API Asia-O疫苗免疫的小鼠產生針對所有4種VPl亞型的抗體，這表明共有-VPl融合疫苗正產生抗所有4種亞洲-歐洲FMD亞型的免疫反應。ctggagctgc ccaccgacca ccacggcgtg Ucggcxacc tggtggacag ctacgcctac 600 atgcgcaacg gctgggacgt ggaggtgagc gccgtgggca accagttcaa cggcggctgc 660 ctgctggtgg ccatggtgcc cgagtggaag gagttcgaca cccgcgagaa gtaccagctg 720 wcnctgttoc Cccwnc3gttn&Jtc&3gncnc cgnwcnwwca tgwccgnccwnBtcancgtg *7030 ccctacctgg gcgtgaaccg ctacgaccag tacaagaagc acaagccctg gaccctggtg 84-0 gtgatggtgg tgagcccrcct gaccgtgaac accgccgccc agatcaaggt gtacgccaac 900 atcgccccca cctacgtgca cgtggccggc gacrqctgcccaOQcaaggaggg catcttcccc 960 gtggcctgcg ccgacggcta cggcggcctg gtgaccaccg accccaagac cgccgacccc 1020 gcctacggca aggtgtacaanocc ccccgc accaactacc ccggccgctt caccaacctg 1080 Ctgg3c%gg ccgmggcctg Ccccwccttc ctgtgottcg wogftjcggcwajgccctsucgtg 11-40 accacccgca ccgacgagac ccgcctgctgQrqccaagttccrqaogtgacrqccl: ggccorQccaag 1200 cacatgagca Woacctacct gagcgQTQcatc gcccagtact acacccacrqta cacrQcggcacc 1260 atcaacctgc acttcatgtt caccggcagc accgacagca aggcccgcta catggtggcc 1320 tacatccccc ccgOQcgtgga gacccccccc gacacccccCTQagcgccfQccorqc ccactgcatc 1380 cacgccgagt gggacaccgOQoor-fgawoagc aagttcacct tcaOQcatccc ctacQrqtgaQrqc 1440 gccQTQccgact ac 扣 cctacac cgccaQrqcgac accQTQccOQacraa Ocaccaacgtcrqcaggcrqctgg 1500 gtgtgcgtgt accagatcac ccacggcaag gccgagaacg acaccctggt ggtgagcgtg 1560 a 的 ccrqccggca aggacttcgaOQntgccrqcctg cccatcQrqacc cccgccacfQca 的 accacccracc 1620 accggcgaga gcgccgaccc cgtgaccacc accgtggaga actacggcgg cgagacccag 1680 gtgcagcgcc gccaccacac cgacgtgggc ttcatcatgg acccrqcttcgtQTQaa Watcaac 174*0 agccccaagc ccacccacgt gatcgacctg atgcagaccc accagcacgg cctggtgggc 1800 gccctgctgc gcgccgccac ctactacttc agcgacctgg aOQatcgtggt 的 cQrQccacQrqac 1860 ggcctgacct gg%gcccaa cggcgccccc gagagcgccc tgagcaacac cagcaacccc 1920 Wccgcct 以 C&3如nwOJggococ cttc&Jcnogc ctggccctgc Cctwcwccgcocccnyccgc lVOODo OQtgctggcca ccgtgtacaa cggcaccagc aagtacaccCTQtgacraccragcaop門 3Qrqnngnngc 204-0 ggcgacctgg gcagcctggc cgcccgcgtg gccaagcagc tgcccgccag cttcaactac 2100 ggcgccatca aggccgacac catccacgaQTQotgctggtgcoqcatgaagcg cgccgagctg 2160 Iiactgcgtga^crq33gnocgtcrQgccctgaaQrq的 tgaagQrqcca ygwwcaccct 的 atcgtgacc 2220 gagagcggcg ccccccccac cgacctgcaOQaacrQatggtgar-fgggcaacac caaCTQcccgtg 2280 aqwaqctgatcc tgg&:cggcaw gaccgtggcc&itctgctgcgoowccggcgt gttcggcacn2340 gcctacctgg tgccccgcca cctgttcgcc gagaagtaccfQwoaagatcat 的 ctgorqaccrQQTQc 2 辦 00 cgcgccatga ccQrqacagccfqa ctaccCTQcgtg ttcQrQacrqttcffq&JQTQ&Jr1-caaggt gaagggccaoq24^60 gacatgctga gcgacgccgc cctgatggtg ctgcaccgcg gcaaccgcgt gcgcgacatc 2520 accaaQTQcact tcccrQcQrqacac cgcccQTQcatg aacrQaaQraggca cccccgtggt gggcgtgatc 2S80
〔0§2J
29aacaacgccg acgtgggccg cctgatcttc agcggcgagg ccctgaccta caaggacatc2640
gtggtgtgca tggacggcga caccatgccc ggcctgttcg cctacaaggc cgccaccaag2700
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acccacagcg ccggcggccg caacggcgtg ggctactgca gctgcgtgag ccgcagcatg2820
ctgctgaaga tgaaggccca catcgacccc gagccccacc acgagggcct gatcgtggac2880acccgcgacg tggaggagcg cgtgcacgtg atgtga 2916
SEQ ID NO:2共有序列VP1-VP4亞型A和共有序列C3
Met Leu Asn Gly Asp Trp Lys Ala Lys Val Gln Arg Lys Leu Lys GlyAla Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly AsnThr Gly Ser He He Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala He Ser Gly Gly Ser Asn GluGly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn AsnAsp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu Phe GlyAla Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu GIu Thr Thr Leu Leu Glu AspArg lie Leu Thr Thr Arg Asn GIy His Thr Thr Ser Thr Thr GIn SerSer Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ser Thr Thr Glu Asp His Val AlaGly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu ArgPhe Phe Lys Lys Phe Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Pro Phe GlyHis Leu His Lys Leu Glu Leu Pro Thr Asp His His Gly Val Phe GlyHis Leu Val Asp Ser TyrAla Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val GluVal Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val AlaMet VaI Pro Glu Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr Gln LeuThr Leu Phe Pro His Gln Phe He Ser Pro Arg Thr Asn Met Thr AlaHis He Thr Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr LysLys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro Leu ThrVal Asn Thr Ala Ala Gln He Lys Val Tyr Ala Asn lie Ala Pro ThrTyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly He Phe ProVal Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr Asp Pro LysThr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro Pro Arg Thr AsnTyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala Glu Ala Cys ProThr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val Thr Thr Arg ThrAsp Glu Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser Leu Ala Ala LysHis Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser GIy He AIa GIn Tyr Tyr Thr GInTyr Ser Gly Thr He Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly Ser Thr AspSer Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr He Pro Pro Gly Val Glu ThrPro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys He His Ala Glu TrpAsp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser He Pro Tyr Val SerAla Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr Thr AsnVal Gln Gly Trp Val Cys Val Tyr Gln He Thr His Gly Lys Ala GluAsn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu LeuArg Leu Pro He Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala Thr Gly Glu SerAla Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr GlnVal Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Gly Phe He Met Asp Arg PheVal Lys He Asn Ser Pro Lys Pro Thr His Val He Asp Leu Met GlnThr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr
權利要求
1.一種核酸，所述核酸包含編碼具有如下的蛋白質的序列一個或多個具有或不具有前導序列的選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中的一個或多個的序列、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段的序列、與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42具有80%或更多同源性的變體、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段及其互補序列。
2.權利要求I所述的核酸，其中所述序列選自具有或不具有前導序列的編碼序列的SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41、其互補序列、其編碼至少20個胺基酸的片段、其互補序列、與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41具有80%同源性的核酸分子、其互補序列、其編碼至少20個胺基酸的片段及其互補序列。
3.權利要求I所述的核酸，其包含編碼選自具有或不具有前導序列的SEQID NO :2,4,6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 的蛋白質的序列。
4.權利要求I所述的核酸，其包含選自SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和 41 的序列。
5.權利要求1-4中任一項所述的核酸,其中所述前導序列為IgE前導序列。
6.權利要求1-5中任一項所述的核酸，其中所述核酸為質粒。
7.權利要求1-6中任一項所述的核酸，其中所述核酸為作為表達載體的質粒。
8.一種疫苗，其包含權利要求1-7中任一項所述的核酸和/或一種或多種蛋白質，所述蛋白質選自具有或不具有前導序列的SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段、與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 具有 80%或更多同源性的變體、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段及其互補序列。
9.權利要求8所述的疫苗，其還包含佐劑。
10.權利要求8所述的疫苗，其還包含選自IL-12和/或IL-15或編碼IL-12和/或IL-15的核酸序列的佐劑。
11.一種組合物，其包含一種或多種選自具有或不具有前導序列的SEQ ID NO :2,4,6,8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 的蛋白質、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段、與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有80%或更多同源性的變體、其互補序列、其包含至少20個胺基酸的免疫原性片段及其互補序列。
12.—種在哺乳動物中引起抗一個或多個FMDV病毒亞型的免疫反應的方法，包括施用根據權利要求8所述的疫苗。
13.權利要求12所述的方法，其中所述疫苗包含核酸分子，所述方法包括步驟 a)給所述哺乳動物的組織施用所述核酸分子；和 b)以有效地允許DNA質粒進入細胞的恆定電流利用脈衝能量對所述組織的細胞進行電穿孔。
14.權利要求13所述的方法，其中步驟a)包括將所述DNA質粒疫苗注射入真皮內、皮下或肌肉組織。
15.權利要求13或14所述的方法，其中預設用於遞送至所述組織的電流並且脈衝能量處於等於所述預設電流的恆定電流。
16.權利要求13-15中任一項所述的方法，其中所述電穿孔步驟還包括 (a)測量所述電穿孔細胞的阻抗； (b)相對於測量的阻抗調整所述脈衝能量的能量水平以維持所述電穿孔細胞中的恆定電流； 其中所述測量和調整步驟在所述脈衝能量的壽命內進行。
17.權利要求13-16中任一項所述的方法，其中所述電穿孔步驟包括按照以分散模式遞所述送脈衝能量的脈衝序列模式將所述脈衝能量遞送至多個電極。
18.權利要求12-17中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物未被FMDV感染並且所述免疫反應是保護性免疫反應。
19.權利要求12-17中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物未被FMDV感染並且所述免疫反應是治療性免疫反應。
20.一種在用權利要求8所述的疫苗接種的哺乳動物中診斷被FMDV感染的哺乳動物的方法，所述方法包括 a)從所述哺乳動物分離液體樣品；和 b)檢測未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白和/或抗未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白的抗體的存在，其中未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白和/或抗未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白的抗體的存在表明所述哺乳動物已被FMDV感染。口蹄疫病毒病毒(FMDV)共有蛋白質、其編碼序列及由其製備的疫苗發明領域
本發明涉及合成的共有(consensus) 口蹄疫病毒(FMDV)免疫原性蛋白和編碼此類蛋白的核酸分子、抗FMDV的疫苗、用於誘導抗FMVD的免疫反應的方法、用於區分被FMDV感染的個體與已接種的抗FMDV的個體的方法以及預防性和/或治療性免疫個體以抗FMDV的方法。
發明背景
口蹄疫是馴養和野生偶蹄動物(包括牛、豬、山羊和鹿)的高度接觸性傳染病，其在宿主細胞中快速複製並且傳播至接觸易感性動物。該疾病的特徵在於發熱、跛行以及舌、足、口鼻部和乳頭的水皰性病變，從而導致成年動物的高發病率但死亡率較低。病原體(causative agent)為口蹄疫病毒(FMDV)(細小RNA病毒科的口瘡病毒屬的種的類型)。FMDV為由二十面體衣殼(具有4種結構蛋白VP1-4，每一種蛋白60個拷貝)包圍的約8500個鹼基的單鏈正義RNA基因組並且在抗原性上高度可變，具有幾個亞型(包括A、Asia 1、0、C、SAT1、SAT2和SAT3)。最近口蹄疫在許多先前無疾病國家(包括1997年在臺灣、2001年在英國和荷蘭的暴發)以及在幾個南美國家的出現已提高了對該經濟破壞性病毒的認識。此外，全世界都在關注可能的恐怖分子襲擊可能利用FMDV攻擊例如1000億美元/年畜牧業的國家。
先前控制FMDV的措施包括宰殺感染的或接觸傳染病的動物和排除汙染。如果國家在最近暴發後3個月呈現無FMDV狀況，則因FMDV暴發而宰殺它們的家畜的國家才可有重新開始家畜活動。國家通常將接種動物以治療FMDV暴發用作最後一著，因為已接種動物並且未宰殺動物的國家必須等待整整一年來恢復無FMD狀態。然而國家期望在任何FMDV暴發之前接種它們的動物並且能夠保持它們的無FMD狀態。
過去，FMDV疫苗包括化學滅活的完整病毒抗原和佐劑；然而，對此存在不利方面，因為其需要昂貴的高汙染製造設施來生產疫苗。在過去25-30年中，研究者一直努力開發在單次接種後提供保護作用的疫苗。這些努力包括從病毒顆粒純化的VP1、生物工程改造的VPU VPl肽、化學合成VPl肽、表達VPl表位的活載體的使用、利用編碼VPl表位的DNA的接種以及使用從FMDV感染的培養物產生的全長衣殼蛋白VP1-4或通過複製缺陷型人腺病毒5型(Ad5)載體進行的VP1-4的遞送。所有這些方法僅給接種的動物提供有限數量的跨所有FMDV病毒亞型的表位。
因此，在本領域存在對診斷FMDV感染的哺乳動物的疫苗和方法的需要，所述疫苗和方法適合於提供抗跨FDMV的不同亞型的多個表位的保護作用。發明概要
本文中提供了分離的核酸，所述核酸包含編碼口蹄疫病毒亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3、SAT4的VP1-4的共有胺基酸序列的序列或其互補序列。所述核酸可包括選自(a) SEQ ID NO :17-23 ； (b)編碼24-30的胺基酸序列的核苷酸序列；(c) (a)的80%變體；和(a)或(b)的互補序列的序列。還提供了包含異源序列的載體，其中所述異源序列由上述序列組成。
本文中還提供了能夠在哺乳動物中產生抗多個口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應的疫苗，其中所述疫苗包含包括有效地連接於編碼序列(其編碼包含來自一個或多個FMDV亞型的衣 殼蛋白VP1-4的共有FMDV抗原)的啟動子的DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑，其中DNA質粒能夠在哺乳動物的細胞中以有效地引起哺乳動物的免疫反應的量表達共有FMDV抗原。所述疫苗可產生抗FMDV亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的免疫反應。疫苗的質粒的編碼序列可具有選自SEQ ID NO :1-7或其組合的FMDV抗原。疫苗的質粒的編碼序列還可包括N末端前導序列,其中所述前導序列為IgG或IgE。疫苗的質粒還可在編碼序列的3』末端之後包含多腺苷酸化序列。疫苗的質粒還可包括編碼來自亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2或SAT3的共有FMDV 3C蛋白酶的核苷酸序列。FMDV 3C蛋白酶的核苷酸序列可以為SEQ ID NO 15並且可由SEQ ID NO 16所示的胺基酸序列編碼。可對疫苗的質粒進行密碼子最優化。FMDV抗原的編碼序列還可包括VP1-4和3C蛋白酶(包括SEQ ID NO :7-14)。疫苗的藥學上可接受的賦形劑可以是佐劑並且所述佐劑可以為IL-2或IL-15。疫苗的藥學上可接受的賦形劑可以是轉染促進劑。轉染促進劑可以是濃度低於6mg/ml的聚陰離子、聚陽離子或脂質例如聚-L-穀氨酸。可給豬、反芻動物、人或靈長類動物施用疫苗。所述疫苗可引起體液或細胞或體液及細胞反應。
本文中還提供了能夠在哺乳動物中產生抗多個口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應的疫苗，其中所述疫苗包括一種或多種包含有效地連接於編碼序列(編碼包含來自選自亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的一個或多個FMDV亞型的衣殼蛋白VP1-4的共有FMDV抗原)的啟動子的DNA質粒和其藥學上可接受的賦形劑，其中所述DNA質粒能夠在哺乳動物的細胞中以有效地引起哺乳動物的免疫反應的量表達共有FMDV抗原。FMDV抗原的編碼序列可選自SEQ ID NO :1-7或其組合。疫苗的質粒還可包括編碼亞型A、Asial、C、O、SATl、SAT2或SAT3的FMDV的共有3C蛋白酶的核苷酸序列，並且可包括SEQ ID NO 15所示的核苷酸序列。可給哺乳動物例如豬、反芻動物、人或靈長類動物施用疫苗。疫苗可在哺乳動物中引起免疫反應例如體液、細胞或體液及細胞反應。
本文中還提供了能夠在哺乳動物中產生抗多個FDMV亞型的免疫反應，其中所述疫苗包含包括一個或多個編碼口蹄疫病毒(FMDV)亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2或SAT3的衣殼蛋白VP1-4的共有胺基酸序列的抗原和其藥學上可接受的賦形劑。FMDV抗原的編碼胺基酸序列可以是SEQ ID勵24-30。藥學上可接受的賦形劑可以是選自11-2和11-15的佐劑。疫苗的藥學上可接受的賦形劑可以是轉染促進劑。轉染促進劑可以是濃度低於6mg/ml的聚陰離子、聚陽離子或脂質例如聚-L-穀氨酸。還可給哺乳動物例如豬、反芻動物、人或靈長類動物施用疫苗。疫苗可在哺乳動物中引起免疫反應例如體液、細胞或體液及細胞反應。
本文中還提供了用於在哺乳動物中引起抗多個FMDV病毒亞型的免疫反應的方法，包括將權利要求I或21的DNA質粒疫苗遞送至哺乳動物的組織並且以有效地允許DNA質粒進入細胞的恆定電流利用脈衝能量對組織的細胞進行電穿孔。方法中權利要求I的DNA質粒的遞送可包括將DNA質粒疫苗注射入真皮內、皮下或肌肉組織。可通過預設電流來遞送所述方法的DNA質粒，並且脈衝能量處於等於當前電流的恆定電流。方法的電穿孔步
全文摘要
本文中提供了包含FMDV亞型A、Asia1、C、O、SAT1、SAT2和SAT3的口蹄疫FMDV VP1-4外殼蛋白的共有胺基酸序列的核酸以及表達所述序列的質粒和疫苗。本文中還提供了使用上述疫苗產生抗一個或多個FMDV亞型的免疫反應的方法，以及辨別利用所述疫苗接種的哺乳動物和被FMDV感染的哺乳動物的方法。
文檔編號A61K39/135GK102712931SQ201080050528
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月2日 優先權日2009年11月2日
發明者B·費拉羅, D·B·韋納, D·R·科恩, K·穆圖瑪尼, M·P·拉馬納坦, N·Y·薩德賽, P·A·布朗, R·A·鮑林, 嚴健 申請人:賓夕法尼亞大學託管會, 英諾維歐藥業股份有限公司