產油酵母和真菌中類胡蘿蔔素的產生的製作方法

2023-09-16 13:30:30

專利名稱：：產油酵母和真菌中類胡蘿蔔素的產生的製作方法產油酵母和真菌中類胡蘿蔔素的產生相關申請案本申請案主張2005年3月18日申請的美國臨時申請案第60/663,621號的權益，所述申請案的內容是以全文引用的方式併入本文中。
技術領域：
無
背景技術：
類胡蘿蔔素是由某些有機體(包括光合作用有機體)(例如，植物、藻類、藍藻)和一些真菌自然產生的有機色素，其顏色在黃色到紅色的範圍內。類胡蘿蔔素負責使胡蘿蔔呈橙色，同時也是導致火烈鳥和鮭魚呈粉紅色和龍蝦與小蝦呈紅色的原因。然而，動物無法產生類胡蘿蔔素並且必須通過飲食來接收類胡蘿蔔素。工業上將類胡蘿蔔素色素(例如，(3-胡蘿蔔素和蝦青素(astaxanthin))用作食品和飼料原料的成分，從而提供營養功能並增強消費者的可接受性。舉例來說，蝦青素廣泛用於鮭魚水產養殖業中以使其具有其野生對應物的橙色特徵。一些類胡蘿蔔素還是維生素A的前體。同時，類胡蘿蔔素具有抗氧化劑特性，並且可具有多種健康益處(例如，參看Jyo廳chi等人，淑r.Owcer16:93，1991;Giovan露ci等人，丄胸Z.OmcerJ組87:1767,1995;Miki，A一.C7iem63:141，1991;Chew等人，AH"'c匿er版19:1849,1999;Wang等人，A油'm!'cr。"gew"C7ze誠/^44:2452，2000)。一些類胡蘿蔔素(諸如(3-胡蘿蔔素、番茄紅素和葉黃素)當前是作為營養補充劑銷售。一般來說，產生類胡蘿蔔素的生物系統在工業上極難操作和/或因僅產生低水平的化合物而使工業規模分離無法實行。因此，工業上使用的大多數類胡蘿蔔素都是通過化學合成製備。故需要經改良的能產生類胡蘿蔔素的生物系統。先前已對基因工程設計某些細菌或真菌以產生較高水平的類胡蘿蔔素進行一些嘗試(例如，參看Misawa等人，/.歷wec/mo/.59:169，1998;Visser等人，FEMS4:221,2003)。然而，仍需要允許以較高產量生產並且更易於分離的經改良系統。
發明內容本發明提供用於生物學生產類胡蘿蔔素的經改良系統。一方面，本發明涵蓋在產油生物體中生產類胡蘿蔔素是合乎需要的這一發現。不希望受任何特定理論的束縛，本發明提出，如果將類胡蘿蔔素螯合於脂質體中，那麼生物系統就能夠積累較高水平的所述化合物。然而，不管絕對水平是否較高，積累於產油生物體脂質體內的類胡蘿蔔素都可通過脂質體的分離而輕易地分離。因此，本發明提供產生一種或一種以上類胡蘿蔔素的產油真菌(例如，包括酵母或其它單細胞真菌)。本發明還提供構造所述酵母和真菌的方法；使用所述酵母和真菌產生類胡蘿蔔素的方法；和使用在所述產油酵母或真菌中所產生的類胡蘿蔔素製備含有類胡蘿蔔素的組合物(諸如食品或飼料添加劑，或營養補充劑)的方法。具體來說，本發明提供用於產生含有一個或一個以上產油和/或產類胡蘿蔔素修飾的酵母和真菌的系統和方法，與缺乏所述修飾的其它相同生物體相比，所述修飾使所述生物體的產油能力提高和/或改變其產生類胡蘿蔔素的能力。本發明另外涵蓋脂質積累系統可用於產生和/或分離親脂劑(諸如(但不限於)類異戊二烯或類異戊二烯衍生的化合物)的通用識別。因此，根據本發明，需要工程設計生物體以產生所述親脂劑和/或積累脂質。所屬領域技術人員根據包括隨附權利要求在內的本發明將對本發明的各個其它方面顯而易見。定義/^類4^,/^素參像如本文所使用的術語"產類胡蘿蔔素修飾"是指如本文所述的對宿主生物體進行的調節一種或一種以上類胡蘿蔔素的產量的修飾。舉例來說，產類胡蘿蔔素修飾可增加一種或一種以上類胡蘿蔔素的產量，和/或可改變不同類胡蘿蔔素的相對產量。大體上，本發明的產類胡蘿蔔素修飾可為任何化學、生理學、基因或其它修飾，與不經歷相同修飾的其它相同生物體中所產生的一種或一種以上類胡蘿蔔素的水平相比，所述修飾適當地改變宿主生物體中由所述生物體所產生的所述類胡蘿蔔素的產量。然而，在大部分實施例中，產類胡蘿蔔素修飾將包含通常引起一種或一種以上所選類胡蘿蔔素產量增加的基因修飾。在一些實施例中，所選類胡蘿蔔素為蝦青素、P-胡蘿蔔素、角黃素、葉黃素、番茄紅素、八氫番茄紅素、玉米黃素和/或玉米黃素或蝦青素的變體(例如，糖苷化、酯化玉米黃素或蝦青素)中的一種或一種以上。在一些實施例中，所選類胡蘿蔔素為一種或一種以上葉黃素和/或其變體(例如，糖苷化、酯化葉黃素)。在某些實施例中，所選葉黃素選自由蝦青素、葉黃素、玉米黃素、番茄紅素和其變體組成的群組。在一些實施例中，所選類胡蘿蔔素為蝦青素、(3-胡蘿蔔素、角黃素、葉黃素、番茄紅素和玉米黃素和/或玉米黃素或蝦青素的變體中的一種或一種以上。在一些實施例中，類胡蘿蔔素為卩-胡蘿蔔素。在一些實施例中，所選類胡蘿蔔素為蝦青素。在一些實施例中，所選類胡蘿蔔素為除(3-胡蘿蔔素以外的物質。/^類4^,A,多/i":如本文所使用的術語"產類胡蘿蔔素多肽"是指在細胞中產生類胡蘿蔔素的過程中所涉及的任何多肽，且其可包括除產生類胡蘿蔔素的過程外的其它過程中所涉及的多肽，但所述多肽的活性會(例如)通過清除類胡蘿蔔素生產中直接涉及的類胡蘿蔔素多肽所利用的底物或反應物而影響一種或一種以上類胡蘿蔔素的生產程度或產量。產類胡蘿蔔素多肽包括類異戊二烯生物合成多肽、類胡蘿蔔素生物合成多肽和類異戊二烯生物合成競爭劑多肽，所述術語已於本文中定義。所述術語還涵蓋可能影響脂質體中類胡蘿蔔素積累的程度的多肽。類4^,/^素在所屬領域中應將術語"類胡蘿蔔素"理解為是指由類異戊二烯路徑中的中間體得到的一類結構不同的色素。類胡蘿蔔素生物合成中的約定步驟為由香葉基香葉基焦磷酸形成八氫番茄紅素。類胡蘿蔔素可無環或為環狀，並且可含或可不含氧，因此術語類胡蘿蔔素包括胡蘿蔔素與葉黃素。總的來說，類胡蘿蔔素為具有在形式上衍生自五碳化合物IPP的共軛多烯碳骨架的碳氫化合物，包括三萜(c3q二-阿樸類胡蘿蔔素(C3qdiapocarotenoid))和四砲(Cu)類胡蘿蔔素)，以及其氧化衍生物和例如長度為C35、C5。、C6。、C7。、Cso或其它長度的其它化合物。許多類胡蘿蔔素都具有強吸光特性，並且其長度可在超過C2(K)的範圍內。C30二-阿樸類胡蘿蔔素通常是由6個類異戊二烯單元組成，所述類異戊二烯單元是以使類異戊二烯單元的排列在分子中心處倒轉從而使兩個中心甲基呈1,6位關係而剩餘非末端甲基呈1,5位關係的方式連接。在形式上，所述C30類胡蘿蔔素可通過以下方法從具有具共軛雙鍵的長中心鏈的無環C3qH42結構獲得(i)氫化；(ii)脫氫；(iii)環化；(W)氧化；(v)酯化/糖基化；或這些方法的任何組合。C化類胡蘿蔔素通常是由八個類異戊二烯單元組成，所述類異戊二烯單元是以使類異戊二烯單元的排列在分子中心處倒轉從而使兩個中心甲基呈1,6位關係而剩餘非末端甲基呈1,5位關係的方式連接。在形式上，所述C4。類胡蘿蔔素可通過以下方法從具有具共軛雙鍵的長中心鏈的無環C4oH56結構獲得(i)氫化；(ii)脫氫；(iii)環化；(iv)氧化；(v)酯化/糖基化；或這些方法的任何組合。這類C4o類胡蘿蔔素中還包括由碳骨架重排或(形式上)移除部分所述結構而產生的某些化合物。自然界中已鑑別出超過600種不同的類胡蘿蔔素；某些常見類胡蘿蔔素已描繪於圖1中。類胡蘿蔔素包括(但不限於)花黃素、金盞花紅素、金盞花黃素、蝦青素、角黃素、辣椒紅素、p-隱黃素、a-胡蘿蔔素、(3-胡蘿蔔素、P，V-胡蘿蔔素、5-胡蘿蔔素、s-胡蘿蔔素、海膽酮、3-羥基海膽酮、3'-羥基海膽酮、Y-胡蘿蔔素、V-胡蘿蔔素、4-酮基卞胡蘿蔔素、；-胡蘿蔔素、a-隱黃素、脫氧屈曲黃素、硅藻黃素、7，8-二脫氫蝦青素、二脫氫番茄紅素、巖藻黃素、巖藻黃醇、異胡蘿蔔素(isorenieratene)、P-異胡蘿蔔素、萵苣黃素(lactucaxanthin)、葉黃素、番茄紅素、myxobactone、新葉黃素、鏈孢紅素、羥基鏈孢紅素、多甲藻素、八氫番茄紅素、玫紅品、玫紅品糖苷、4-酮基-玉紅黃素、管藻黃素、球形烯、球形酮、螺菌黃素、圓酵母素、4-酮基-圓酵母素、3-羥基-4-酮基-圓酵母素、烏利奧利德(uriolide)、乙酸烏利奧利德、紫黃素、玉米黃素-(3-二糖苷、玉米黃素和C30類胡蘿蔔素。此外，類胡蘿蔔素化合物包括這些分子的衍生物，其可包括羥基-、甲氧基-、氧基-、環氧基-、羧基-或醛式官能團。另外，所包括的類胡蘿蔔素化合物包括酯(例如，糖苷酯、脂肪酸酯)和硫酸酯衍生物(例如經酯化葉黃素)。類欽,A素f激會成多嚴術語"類胡蘿蔔素生物合成多肽"是指一種或一種以上類胡蘿蔔素的合成過程中所涉及的任何多肽。僅舉幾例，這些類胡蘿蔔素生物合成多肽例如包括八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶(或去飽和酶)、番茄紅素環化酶、類胡蘿蔔素酮酶、類胡蘿蔔素羥化酶、蝦青素合酶、類胡蘿蔔素s羥化酶、番茄紅素環化酶((3和s亞單位)、類胡蘿蔔素葡糖基轉移酶和醯基輔酶A:二醯基甘油醯基轉移酶。類胡蘿蔔素生物合成多肽序列的代表性實例提供於表17-25中。基像如本文所使用的術語"基因"一般是指編碼多肽的核酸，其視情況包括可影響一種或一種以上基因產物(即，RNA或蛋白質)的表達的某些調控元件。岸嚴如本文所使用的術語"異源"是指基因或多肽，即指並非自然存在於表達基因或多肽的生物體中的所述基因或多肽。應了解，一般來說，當對異源基因或多肽進行選擇以將其引入宿主細胞和/或通過宿主細胞表達時，可選擇異源基因或多肽的特定原始生物體對於實踐本發明並不重要。有關的需要考慮的事項可包括(例如)潛在來源與宿主生物體在進化過程中如何緊密相關；或原始生物體與已進行其它相關多肽序列選擇的其它原始生物體的關係如何。^"主一智應如本文所使用的"宿主細胞"為已根據本發明進行處理從而能積累脂質和/或表達一種或一種以上如本文所述的類胡蘿蔔素的酵母細胞或真菌細胞。如本文所使用的術語"經修飾宿主細胞"為含有根據本發明的至少一種產油修飾和/或至少一種產類胡蘿蔔素修飾的宿主細胞。經分庸如本文所使用的術語"經分離"意謂已將經分離的實體與至少一種先前與其締合的組分分開。當已將大部分其它組分移除時，所述經分離實體"經純化"。分離和/或純化可使用所屬領域已知的任何技術進行，例如包括分餾、萃取、沉澱或其它分離方法。^^座二靡主激會;^一競爭魂/多/力如本文所使用的術語"類異戊二烯生物合成競爭劑多肽"是指在細胞中的表達會降低進入類胡蘿蔔素生物合成路徑的可用香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的水平的多肽。舉例來說，類異戊二烯生物合成競爭劑多肽包括對GGPP之前的類異戊二烯中間體起作用從而產生較少GGPP的酶(例如參看圖5)。角鯊烯合酶就為--種根據本發明的類異戊二烯生物合成競爭劑多肽；代表性角鯊烯合酶序列提供於表16中。異戊二烯基二磷酸合酶和對羥基苯甲酸(PHB)聚異戊二烯基轉移酶也為根據本發明的其它類異戊二烯生物合成競爭劑多肽；代表性異戊二烯基二磷酸合酶和PHB聚異戊二烯基轉移酶多肽分別提供於表29和表30中。^^應二/煮f激會成多教術語"類異戊二烯生物合成多肽"是指類異戊二烯的合成過程中所涉及的任何多肽。舉例來說，如本文所論述，乙醯乙醯輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、IPP異構酶、FPP合酶和GGPP合酶為類異戊二烯生物合成的甲羥戊酸路徑中所涉及的所有酶。出於本發明的目的，這些蛋白質中的每一種也是類異戊二烯生物合成多肽，並且這些酶的代表性實例的序列提供於表7-15中。^^j二席磁徑在所屬領域中應將"類異戊二烯路徑"理解為是指產生或利用五碳代謝物焦磷酸異戊酯(IPP)的代謝路徑。如本文所論述，有兩種不同的路徑可產生常見的類異戊二烯前體IPP—"甲羥戊酸路徑"和"非甲羥戊酸路徑"。術語"類異戊二烯路徑"一般足以涵蓋這兩種類型的路徑。由IPP生物合成類異戊二烯是通過若干個五碳異戊二烯亞單位聚合發生。源自IPP的類異戊二烯代謝物具有不同的尺寸和化學結構，包括環狀與無環分子。類異戊二烯代謝物包括(但不限於)單萜、倍半萜、二萜、固醇和多萜醇(諸如類胡蘿蔔素)。產^參像如本文所使用的術語"產油修飾"是指如本文所述對宿主生物體進行的調節所述宿主生物體的所需產油能力的修飾。在一些情況下，宿主生物體將因具有積累佔其細胞乾重至少約20%的脂質的能力而為產油生物體。儘管如此，仍然需要根據本發明對此類生物體施行產油修飾，例如以增加(例如，在一些情況下可能降低)其總脂質積累，或調節其所積累的一種或一種以上特定脂質的類型或一種或一種以上特定脂質的量(例如，增加三醯基甘油的相對積累)。在其它情況下，宿主生物體可能為不產油生物體(但可能含有其它生物體中用於積累脂質的一些酶和調控組分)，並且可能需要根據本發明進行產油修飾以便能夠產油。本發明還預期對不產油宿主菌株施行產油修飾，從而使其產油能力增加，甚至即使在經修飾後，其可能也不是如本文所定義的產油生物體。大體上，產油修飾可為任何化學、生理學、基因或其它修飾，與未經歷產油修飾的其它相同生物體相比，所述修飾使宿主生物體的產油能力適當地改變。然而，在大部分實施例中，產油修飾將包含通常引起一種或一種以上產油多肽的產量增加和/或活性增強的基因修飾。在一些實施例中，產油修飾包含至少一種化學、生理學、基因或其它修飾；在其它實施例中，所述產油修飾包含一種以上化學、生理學、基因或其它修飾。在利用一種以上修飾的某些方面，所述修飾可包含化學、生理學、基因或其它修飾的任何組合(例如，一種或一種以上基因修飾和化學或生理學修飾)。產勸^#:如本文所使用的術語"產油多肽"是指細胞脂質積累過程中所涉及的任何多肽，且其可包括除脂質生物合成外的其它過程中所涉及的多肽，但其活性將(例如)通過清除脂質積累直接涉及的產油多肽所利用的底物或反應物而影響一種或一種以上脂質積累的程度或水平。舉例來說，如本文所論述，在其它蛋白質中乙醯輔酶A羧化酶、丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、ATP-校檬酸裂解酶、蘋果酸酶和AMP脫氨酶都涉及於細胞脂質積累中。一般來說，預期降低丙酮酸脫羧酶或異檸檬酸脫氫酶的活性和/或增強乙醯輔酶A羧化酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和/或AMP脫氨酶的活性將促進產油能力。出於本發明的目的，這些蛋白質中的每一種都為產油多肽，且這些酶的代表性實例的序列提供於表1-6中。產^:術語"產油"是指生物體積累佔其細胞乾重至少約20%的脂質的能力。在本發明的某些實施例中，產油酵母或真菌可積累佔其細胞乾重至少約25%的脂質。在其它實施例中，本發明的產油酵母或真菌可積累佔其細胞乾重在約20%-45%範圍內的脂質。在其它實施例中，產油生物體可積累佔其細胞乾重多達約70%的脂質。在本發明的一些實施例中，產油生物體可積累佔總脂質積累極大分率的三醯基甘油形式的脂質。在某些實施例中，所積累的大部分脂質都為三醯基甘油的形式。另外或其它，所述脂質可以胞內脂質體或油體的形式積累。在某些實施例中，本發明利用自然產油的酵母或真菌。在一些方面，自然產油的生物體可經處理(例如，以基因方式、化學方式或其它方式處理)從而進一步增加生物體中所積累的脂質的水平。在其它實施例中，如本文所述對自然不產油的酵母或真菌進行處理(例如，以基因方式、化學方式或其它方式處理)以積累脂質。出於本發明的目的，紅酵母(Xa"f/z叩/i;y〃om，M&"dron^w)(紅法夫酵母(屍/wJ^r/zo&zyma))和產朊假絲酵母(Ca"AWa油'fc)為自然不產油的真菌。^^i":如本文所使用的術語"多肽"一般具有其在所屬領域中公認的含義，即具有至少三個胺基酸的聚合物。然而，本術語還用於指特殊功能種類的多肽，諸如產油多肽、產類胡蘿蔔素多肽、類異戊二烯生物合成多肽、類胡蘿蔔素生物合成多肽和類異戊二烯生物合成競爭劑多肽。就每一所述種類而言，本說明書都提供所述多肽的己知序列的若干實例。然而，所屬領域技術人員將理解，預期術語"多肽"一般不僅足以涵蓋具有本文所述(或本文特別提及的參考文獻或資料庫中所述)的完整序列的多肽，而且還涵蓋表示所述完整多肽的功能片段(即，保留至少一種活性的片段)的多肽。此外，所屬領域技術人員應了解，蛋白質序列一般容許在不破壞活性的情況下存在某種取代。因此，如本文所使用的相關術語"多肽"涵蓋任何多肽，其保留活性且與相同種類的另一多肽共有至少約30%-40%，通常大於約50%、60%、70%或80%的整體序列一致性，且另外通常包括至少一個具有更高一致性(通常大於90%)的區域，或甚至在一個或一個以上卨度保守的區域中具有95%、96%、97%、98%或99%的一致性(例如，異檸檬酸脫氫酶多肽通常共有保守AMP結合基序；HMG-CoA還原酶多肽通常包括高度保守的催化結構域(例如參看圖7);乙醯輔酶A羧化酶通常具有羧基轉移酶結構域；例如參看Downing等人，C/z亂齒.93:484,1980;Gil等人，CeW41:249，1985;Jitrapakdee等人C"/rP驗!'"4:217,2003;美國專利第5,349,126號，所述參考文獻中每一者都是以全文引用的方式併入本文中)，通常涵蓋至少3-4個且通常多達20個或更多個胺基酸。^"^翁主^,(sourceorganism):如本文所使用的術語"原始生物體"是指特定多肽序列可發現於自然界的生物體。因此，舉例來說，如果在宿主生物體中表達一種或一種以上異源多肽，那麼將在自然界中表達所述多肽(和/或最初對其基因進行克隆)的生物體被稱為"原始生物體"。如果在宿主生物體中表達一種以上異源多肽，那麼可利用一種或一種以上原始生物體來獨立選擇各異源多肽。應理解，自然含有相關多肽序列的任何生物體和所有生物體都可用作本發明的原始生物體。代表性原始生物體包括(例如)動物、哺乳動物、昆蟲、植物、真菌、酵母、藻類、細菌、藍藻、古細菌和原生動物原始生物體。激L4-7Z)描述某些常見類胡蘿蔔素。廚2描述足量的乙醯輔酶A和NADPH如何在產油生物體的胞質中積累從而允許產生顯著水平的胞質脂質。酶1,丙酮酸脫羧酶；2，蘋果酸脫氫酶；3，蘋果酸酶；4，丙酮酸脫氫酶；5,檸檬酸合酶；6，ATP-檸檬酸裂解酶；7,擰檬酸/蘋果酸移位酶。像3A//MS描述通常在真核生物(包括真菌)中運作的甲羥戊酸類異戊二烯生物合成路徑。房4描述通常在細菌和植物質體中運作的甲羥戊酸非依賴性類異戊二烯生物合成路徑(也稱為DXP路徑)。房5描述類異戊二烯生物合成路徑中的中間體和如何將其饋入其它生物分子(包括類胡蘿蔔素和非類胡蘿蔔素化合物，諸如固醇、類固醇和諸如維生素E或維生素K的維生素)的生物合成路徑中。凰6A-6Z)描述各種類胡蘿蔔素的生物合成路徑。圖6A突出描述產生各種環狀和無環葉黃素的分支路徑；圖6B繪示產生二環和單環類胡蘿蔔素(包括蝦青素)的某些紅酵母(X^Wror/zo"s)路徑；圖6C繪示將p-胡蘿蔔素轉化成多種其它類胡蘿蔔素(包括蝦青素)中的任一種的互連路徑；圖6D描述由鏈孢紅素合成環狀類胡蘿蔔素和常見植物與藻類葉黃素的可能途徑。房7A-7C繪示某些代表性真菌HMG-CoA還原酶多肽的比對。如所見，這些多肽在催化區內具有極高一致性，且還具有複雜的跨膜結構域。在本發明的一些實施例中，這些跨膜結構域被破壞或移除，使得(例如)極度活躍型式的多肽得以產生。房SA-SD描述例證中產生且詳細描述的質粒的示意性代表圖。具體實施例方式如上文所述，本發明涵蓋類胡蘿蔔素可合乎需要地在產油酵母和真菌中產生這一發現。根據本發明，通過處理宿主細胞來產生具有以下特性的菌株(即，菌株包括例如自然存在的菌株、先前已經修飾的菌株等)(i)積累經常為細胞質油體形式且通常佔細胞乾重至少約20%的脂質；且(ii)產生佔細胞乾重至少約1%且在一些實施例中為至少約3%-20%的水平的類胡蘿蔔素。隨後，使用這些經處理的宿主細胞產生類胡蘿蔔素，從而能夠輕易地分離分配到脂質體中的類胡蘿蔔素。一般說來，需要使本發明細胞中的產油能力與類胡蘿蔔素產量平衡，使得能達成儘可能最低的所需產油水平，從而將能夠利用並且轉入產物生物合成中的實質上所有的其它碳都轉入類胡蘿蔔素生產路徑中。在本發明的一些實施例中，這一戰略涉及工程設計產油細胞；在其它實施例中，其涉及工程設計細胞以積累比細胞在缺乏此工程設計的情況下積累的脂質水平高的脂質，尤其細胞質脂質，即使經工程設計的細胞可能無法達到如本文所定義的"產油"時也是如此。在其它實施例中，產油宿主細胞積累脂質的程度實際上已降低，因此剩餘的碳可用於類胡蘿蔔素的生產中。涼主續所屬領域技術人員將易於理解，存在自然產油或自然產生類胡蘿蔔素的各種酵母和真菌菌株。所述菌株中的任一種都可用作本發明的宿主菌株，並且可經工程設計或另外經處理以產生本發明的產油、產類胡蘿蔔素菌株。或者，也可使用自然不產油也自然不產類胡蘿蔔素的菌株。此外，甚至當特定菌株具有自然的產油或產生類胡蘿蔔素的能力時，也可如本文所述對其自然能力進行調節，從而改變脂質和/或類胡蘿蔔素的產量。在某些實施例中，工程設計或處理菌株將導致對所產生的脂質和/或類胡蘿蔔素的類型的改變。舉例來說，菌株可自然產油和/或產類胡蘿蔔素，然而，可對菌株進行工程設計或修飾，從而改變所積累的脂質的類型或改變所產生的類胡蘿蔔素的類型。3選擇特定酵母或真菌菌株用於本發明中時，一般會需要選擇培養特性適於工業規模生產的菌株。舉例來說，一般(但通常非必需)需要避免絲狀生物體，或對生長條件具有特別罕見或嚴苛要求的生物體。然而，當應用允許利用絲狀生物體的工業規模生產條件時，可將這些絲狀生物體選作宿主細胞。在本發明的一些實施例中，當可視情況將宿主細胞直接調配成食品或飼料添加劑，或視需要調配成營養補充劑時，需要利用可食用生物體作為宿主細胞。為便於生產，本發明的一些實施例利用易於以基因方法處理、適於分子遺傳學(例如，尤其可經已確立或可用載體有效轉化；視情況可例如連續併入和/或整合多個基因；和/或具有已知的基因序列等)、無複雜的生長要求(例如，對光的需求)、嗜溫(例如，優選的生長溫度在約25。C-32'C的範圍內)、能夠吸收多種碳源和氮源和/或能夠生長到高細胞密度的宿主細胞。另外或其它，本發明的各個實施例將利用生長為單一細胞而非多細胞生物體(例如，菌絲體)的宿主細胞。一般來說，當根據本發明需要利用自然產油的生物體時，任何可修飾且可培養的產油生物體都可使用。在本發明的某些實施例中，所使用的酵母或真菌屬包括(但不限於)布拉氏黴屬(別a/^Zea)、假絲酵母屬(Om^to)、隱球菌屬(Co^ococow)、小克銀漢黴屬(amm'ng/umze^)、油脂酵母屬(Zi/wm;yc")、被孢黴屬(Mom'erWZa)、毛黴菌屬(Mwcor)、須黴屬(P/z;ycom;yces)、腐黴屬(Pyf/z!'Kn)、紅冬孢酵母屬(尺/ioco印o"'(^"m)、紅酵母屬(i/u^WoraZ。)、毛孢子菌屬(rn'c/o印oro2)和耶氏酵母屬(yarravWa)。在某些特殊實施例中，所使用的生物體種類包括(但不限於)三孢布拉氏黴(別d"/eafn'印ora)、鐵紅假絲酵母(OmdWap^c/iem'ma)、C.rewt。M/!'、熱帶假絲酵母(C.fro/n'caZ")、彎曲隱球菌(Oypfococcwsc"rvafws)、刺孢小克銀漢黴菌(Cw"m'"g/zame〃aecA!."wZafa)、綺麗小克銀漢黴(CWega"s)、高大毛黴(C.j'apom'ca)、斯達氏油月旨酵母(Zj'po/nyc"W。^ey!')、產油油脂酵母a.Z!'po/en)、高山被孢黴(MoWewWaa&&a)、深黃被孢黴(M"a&e仏'"a)、拉曼被孢黴(Af.rawumm'a"fl)、葡酒色被孢黴(M.v!'Mflcea)、巻枝毛黴(MwcorcZrc!'"e〃o/de5)、布氏須霄(P/z;yco/n;yce51Wa&esZecmt^)、田奇雌腐毒(f;yf/u'Mmz>regw/are)、圓紅冬孢酉孝母菌(/f/jodo^onWwmtora/oz'rf")、粘紅酵母(/^odotora/ag&rim、)、瘦弱紅酵母(i.grac"^)、牧草紅酵母(i.gram!'m'5)、粘質紅酵母(i.rawdtogZ"OM)、i.p/"z'coto、出芽短梗絲孢酵母(rn'c/w印oro/z/wW/(3/w)、皮月夫毛孢子菌(Tcwto"ram)禾口角軍月旨耳，氏酉孝母(yarraiW(3h'poZyrica)。在這些自然產油的菌株中，一些菌株也可自然產生類胡蘿蔔素而一些菌株不能。在大多數情況下，自然存在的產類胡蘿蔔素、產油酵母或真菌僅產生低水平的類胡蘿蔔素(佔細胞乾重小於約0.05%)。有時會產生較高水平的卩-胡蘿蔔素，但一般不會觀察到高水平的其它類胡蘿蔔素。總的來說，可將自然產油但不產生類胡蘿蔔素(例如，產生小於約0.05%細胞乾重的類胡蘿蔔素、不產生所關注的類胡蘿蔔素)的任何生物體用作本發明的宿主細胞。在一些實施例中，生物體為來自諸如(但不限於)假絲酵母屬、隱球菌屬、小克銀漢黴屬、油脂酵母屬、被孢黴屬、腐黴屬、毛孢子屬和耶氏酵母屬等種屬的酵母或真菌；在一些實施例中，所述生物體屬於包括(但不限於)高山被孢黴和解脂耶氏酵母種類的生物體。相比之下，本發明可將任何自然產油、產類胡蘿蔔素的生物體用作宿主細胞。一般來說，本發明可用於增加流入自然產生類胡蘿蔔素的生物體(尤其是除布拉氏黴屬和須黴屬外的生物體)中的類異戊二烯路徑中的碳，和/或將產生一種類胡蘿蔔素(例如(3-胡蘿蔔素)轉變成產生另一種類胡蘿蔔素(例如蝦青素)。根據本發明，引入一種或一種以上產類胡蘿蔔素修飾(例如，增加一種或一種以上內源性或異源性產類胡蘿蔔素多肽的表達)可達成這些目標。在本發明的某些實施例中，所利用的產油、產類胡蘿蔔素生物體為例如屬於諸如(但不限於)布拉氏黴屬、毛黴菌屬、須黴屬、紅冬孢酵母屬和紅酵母屬等種屬的酵母或真菌；在一些實施例中，所述生物體屬於諸如巻枝毛黴和粘紅酵母的種類。當需要將自然不產油的菌株用作本發明的宿主細胞時，不產油酵母或真菌屬包括(但不限於)麴黴屬(A印ergWw)、葡萄孢屬(5Wry&)、尾孢屬(Cercwpora)、鐮孢菌屬(Fwan'wm)(赤黴屬(G!'Me/"e〃a))、克魯維酵母屬(幻wyveram;yc")、鏈孢黴屬(7Vwra印ora)、青黴屬(Pem'c""wm)、畢赤酵母屬(P!'c/z!'a)(漢森氏酵母屬(//cm""Wa))、柄鏽菌屬(屍Kcdm'a)、酵母菌屬(5^cc/uzram;ycej)、小核菌屬(5Weroriwm)、木黴屬(7Wc/rodermfl)和紅酵母屬(XaW/zop/^/omyc")(法夫屬(PAa#!'a));在一些實施例中，所述生物體的種類包括(但不限於)鉤巢麴黴(A^erg〃^m'^Za/w)、黑麴黴(A.m'ger)、土麴黴(4.fer固s)、灰葡萄孢菌(Bof"7ze固)、菸草尾孢(Cerco，ram'co"anae)、藤倉鐮孢黴(Ft^m'wm/^說wro!')(玉蜀黍赤黴(G!'Mere〃azeae))、乳酸克魯維酵母(iOw;yverom:yceWacn、)、乳酸克魯維酵母tocf")、粗糙鏈孢黴(iVewra印oracra^a)、巴斯得畢赤酵母(P!'c/u'apaWtm'5)、獨特鏽菌(cfori""a)、釀酒酵母(Sacc/iaramyc")、齊整小核菌(5Wera"wmro的")、裡氏木黴(TWc/zoderma和紅酵母(Xawr/z(9p/z;yW畫;yc"(紅法夫酵母(r/jotfozyma))。應理解，如本文所使用的術語"不產油"涵蓋自然具有積累脂質、尤其細胞質脂質的某種能力但未積累達到足以成為如本文所定義的"產油"的程度的菌株；和不會自然具有積累額外脂質(例如膜外脂質)的任何能力的菌株。另外應理解，在本發明的一些實施例中，即使經修飾細胞無法成為如本文所述的產油細胞，但其足以增加特定宿主細胞的自然產油水平。與自然產油的生物體一樣，一些自然不產油的真菌自然產生類胡蘿蔔素，而其它生物體則不能。可合意地用作本發明的宿主細胞的不會自然產生類胡蘿蔔素(例如，產生小於約0.05%細胞乾重的類胡蘿蔔素、不產生所關注的類胡蘿蔔素)的自然不產油真菌屬包括(但不限於)麴黴屬、克魯維酵母屬、青黴菌屬、酵母菌屬和畢赤酵母屬；種類包括(但不限於)黑麴黴和釀酒酵母。不會自然產生類胡蘿蔔素且可合意地用作本發明的宿主細胞的自然不產油真菌屬包括(但不限於)葡萄孢屬、尾孢屬、鐮孢菌屬(赤黴屬)、鏈孢黴屬、柄鏽菌屬、小核菌屬、木黴屬和紅酵母屬(法夫屬)；種類包括(但不限於)紅酵母(紅法夫酵母)。如上文所論述，可將多種生物體中的任一種用作本發明的宿主細胞。在本發明的某些實施例中，宿主細胞將為解脂耶氏酵母細胞。解脂耶氏酵母的優勢例如包括遺傳學和分子生物學易處理、基因組序列的可用性(例如參看Sherman等人A^c/^'cAci^32(Databaseissue):D315-8，2004)、對各種節省成本的生長條件的適合性和生長到高細胞密度的能力。此外，解脂耶氏酵母為自然產油生物體，因此可能需要比其它生物體所需的處理少的處理即可產生產油、產類胡蘿蔔素的解脂耶氏酵母菌株。另外，已對解脂耶氏酵母取得豐富的工業規模生產經驗。釀酒酵母也特別因為其實驗易處理性和研究者已對所述生物體積累豐富經驗而成為本發明的有用宿主細胞。儘管在高碳條件下培養酵母菌可能導致乙醇產量的增加，但這一般可通過方法和/或基因改變來處理。其它有用的宿主包括實驗上易處理並且自然產類胡蘿蔔素的紅酵母(紅法夫酵母)。紅酵母(紅法夫酵母)菌株可產生若干種類胡蘿蔔素，包括蝦青素。黑麴黴和高山被孢黴分別積累大量的療檬酸和脂肪酸；高山被孢黴還可產油。鏈孢黴屬或赤黴屬也極為有用。其自然不產油且傾向於產生極少量的類胡蘿蔔素，因此可能需要根據本發明進行廣泛修飾。從實驗角度看，認為鏈孢黴屬和赤黴屬相對易於處理。這兩者都為絲狀真菌，因此，由於克服對所述菌株的利用是必需的，故工業規模生產將成為一種挑戰。巻枝毛黴為另一種可用的有用種類。儘管其分子遺傳學比一些其它的生物體不易理解，但由於其自然產生p-胡蘿蔔素，故可能需要比其它可用種類少的修飾。可對布拉氏黴進行分子遺傳學修飾，但可能需要大量嘗試。另外，由於例如可能需要將兩種交配型混合，故節省成本的發酵條件可為一項挑戰。須黴屬真菌也可能成為有可能引起發酵過程中的挑戰的原因，並且這些真菌還可能比若干種其它潛在的宿主生物體不易於處理。所屬領域技術人員應理解，對用於本發明中的特定宿主細胞的選擇還將影響(例如)對將要引入所述細胞的任何異源多肽所利用的表達序列的選擇，並且還會影響培養條件的各個方面等。現已對本發明中所利用的不同宿主細胞的不同基因調控要求、蛋白質靶向序列要求和培養要求有所了解(例如參看，關於耶氏酵母屬的Barth等人FZMSMk油'oZ/ev.19:219,1997;Madzak等人瓜ofec/moZ.109:63,2004;例如參看，關於紅酵母屬的Verdoes等人￡"v!'rawM!'cra&oZ69:3728-38，2003;Visser等人FEMSYeastRes4:221-31，2003;Martinez等人AntonieVanLeeuwenhoek.73(2):147-53,1998;Kim等人ApplEnvironMicrobiol.64(5):1947-9，1998;Wery等人Gene.184(1):89-97,1997;例如參看，關於酵母菌屬的Guthrie和FinkM"/zo&hfim戸oZ。g;y194:1-933,1991)。舉例來說，在某些方面，可有益地包括宿主細胞的靶向序列(或其密切相關的類似物)以指引異源蛋白質亞細胞定位。因此，可將所述有用的靶向序列加到異源序列中以用於具活性的適當胞內定位。在其它方面(例如，線粒體靶向序列的加入方面)，可去除異源靶向序列或使所選異源序列改變(例如，改變或移除原始生物體植物葉綠體耙向序列)。工薦沒^產浙虔力所有活的生物體都合成脂質以用於其膜和各種其它結構中。然而，大部分生物體都不會積累超過其細胞乾重約10%的總脂質，且所述脂質中的大部分一般會保留在細胞膜內。已進行大量生物化學工作來定義賦予微生物產油能力所必需的代謝酶(主要是出於工程設計單細胞油作為花生四烯酸和二十二碳六烯酸的工業來源的目的；例如參看RatledgeS!'oc/u'mk86:807,2004，所述文獻的全部內容都是以引用的方式併入本文中)。儘管在本發明之前，這項生物化學工作相當引人注目，但尚無有關通過基因工程設計編碼關鍵代謝酶的基因已重新建立產油能力的報導。應注意，當在碳過量和氮或其它養分有限的條件下生長時，產油生物體通常僅積累脂質。在這些條件下，生物體易於耗盡有限的養分，但持續吸收碳源。"過量"的碳將被引入脂質生物合成中，因此脂質(通常為三醯基甘油)通常以團體的形式積累於胞質中。一般說來，普遍認為，為能夠產油，生物體需在胞質中產生乙醯輔酶A和NADPH，隨後這兩種物質可由脂肪酸合酶機器利用而產生脂質。在至少一些產油生物體中，乙醯輔酶A是通過催化以下反應的ATP-檸檬酸裂解酶的作用而產生於胞質中(1)檸檬酸+C0A+ATP—乙醯-(:(^+草醯乙酸+ADP+P"當然，為了使ATP-檸檬酸裂解酶在胞質中產生適量的乙醯輔酶A，其必須首先具有可用的其底物檸檬酸庫。檸檬酸是通過三羧酸(TCA)循環而產生於所有真核細胞的線粒體中，且可通過檸檬酸/蘋果酸移位酶而移到胞質中(以交換蘋果酸)。在大多數產油生物體和一些不產油生物體中，在線粒體中作為TCA循環的部分運作的酶異檸檬酸脫氫酶具有強AMP依賴性。因此，當將線粒體中的AMP耗盡時，這種酶將失去活性。當異檸檬酸脫氫酶無活性時，異檸檬酸會積累於線粒體中。隨後這一經積累的檸檬酸可能通過順烏頭酸酶的作用而與檸檬酸達到平衡。因此，在低AMP條件下，檸檬酸會積累於線粒體中。如上文所述，可輕易地將線粒體中的檸檬酸轉運到胞質中。認為在產油生物體中起始導致細胞質檸檬酸積累(且因此乙醯輔酶A積累)的級聯的AMP耗儘是因上文所提及的養分耗盡而發生。當使產油細胞在存在過量碳源的情況下而在限制氮或一些其它養分的條件下生長時，將強烈誘導催化以下反應的AMP脫氨酶的活性(2)AMP—肌苷5'-—磷酸+NH3。這種酶活性的增加將耗盡胞質與線粒體中的細胞AMP。普遍認為耗盡線粒體中的AMP會使AMP依賴性異檸檬酸脫氫酶失活，從而導致檸檬酸積累於線粒體中，且因此在胞質中積累。這一系列事件以圖解描述於圖2中。如上文所述，產油能力需要胞質乙醯輔酶A與胞質NADPH。認為在許多產油生物體中，適量的胞質NAPDH是通過蘋果酸酶(圖2中的酶3)作用而提供。然而，一些產油生物體(例如，油脂酵母屬和一些假絲酵母屬)中似乎不具有蘋果酸酶，因此顯然其它酶可提供可比擬的活性，但預期專用的NADPH來源可能為脂肪酸合成所需(例如參看Wynn等人，Mc油'。Z145:1911，1999;Ratledge脅A一.Mc油.oZ.51:1，2002，所述文獻各自是以全文引用的方式併入本文中)。因此，根據本發明，可通過修飾胞質乙醯輔酶A和/或NADPH產生中所涉及的一種或一種以上多肽的表達或活性來增強宿主生物體的產油能力。舉例來說，根據本發明修飾乙醯輔酶A羧化酶、丙酮酸脫羧酶、異梓檬酸脫氫酶、ATP-擰檬酸裂解酶、蘋果酸酶和AMP脫氨酶中一種或一種以上酶的表達或活性可增強產油能力。根據本發明可利用或獲得從而增強產油能力的示範性多肽包括(但不限於)那些分別提供於表1、表2、表3、表4、表5和表6中的乙醯輔酶A羧化酶、丙酮酸脫羧酶、異檸檬酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和AMP脫氨酶多肽。在本發明的一些實施例中，當使用產油宿主細胞時，與產油能力相關的酶和調控組分已處於適當位置，但可視需要(例如)通過改變一種或一種以上產油多肽的表達或活性和/或通過引入一種或一種以上異源產油多肽來進行修飾。在使用不產油宿主細胞的本發明的那些實施例中，一般預期將引入至少一種或一種以上異源產油多肽。本發明不僅涵蓋引入異源產油多肽，而且還涵蓋調節異源或內源產油多肽的表達或活性水平，包括(例如)改變組成性或可誘導性表達模式。在本發明的一些實施例中，表達模式經調節從而能夠無需在限制養分的條件下生長以誘導產油能力。舉例來說，可利用包含調控序列(例如，啟動子元件、終止子元件)的改變和/或加入的基因修飾，以賦予對表達模式的特定調控。所述基因修飾可與內源基因組合利用(例如，用於調控內源產油多肽)；或者，可包括所述基因修飾從而賦予對至少一種異源多肽(例如，產油多肽)表達的調控。舉例來說，包括(但不限於)Tefl、Gpdl啟動子在內的啟動子可與內源基因和/或異源基因組合使用以用於修飾內源產油多肽和/或異源產油多肽的表達模式。類似地，示範性終止子序列包括(但不限於)使用解脂耶氏酵母XPR2終止子序列。在一些實施例中，將至少一種產油多肽引入宿主細胞中。在本發明的一些實施例中，將多種(例如兩種或兩種以上)不同的產油多肽引入相同的宿主細胞中。在一些實施例中，多種產油多肽含有來自相同原始生物體的多肽在其它實施例中，多種多肽包括獨立地選自不同原始生物體的多肽。根據本發明可引入宿主細胞中或在宿主細胞中進行修飾的各種產油多肽的代表性實例包括(但不限於)提供於表1-6中的那些多肽。如上文所述，預期這些多肽中至少一些(例如，蘋果酸酶和ATP-檸檬酸裂解酶)應合意地協調作用，且可能與一種或一種以上脂肪酸合酶組分一起作用，因此，在本發明的一些實施例中，將需要利用兩種或兩種以上來自相同原始生物體的產油多肽。總的說來，用於本發明中的產油多肽的原始生物體包括(但不限於)布拉氏黴、假絲酵母屬、隱球菌屬、小克銀漢黴屬、油脂酵母屬、被孢黴屬、毛黴菌屬、須黴屬、腐黴屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、毛孢子菌屬、耶氏酵母、麴黴、葡萄孢屬、尾孢屬、鐮孢菌屬(赤黴屬)、克魯維酵母屬、鏈孢黴屬、青黴屬、畢赤酵母屬(漢森氏酵母屬)、柄鏽菌屬、酵母菌屬、小核菌屬、木黴屬和紅酵母屬(法夫屬)。在一些實施例中，乙醯輔酶A羧化酶、ATP-檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和/或AMP脫氨酶多肽的原始物種包括(但不限於)鉤巢麴黴、新型隱球菌(07ptococcwMo/ormaw)、藤倉鐮孢黴、乳酸克魯維酵母、粗糙鏈孢黴、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(ScWzoMccAaram》"5pom6e)、玉米黑粉菌(t/幼7叫oma)Yfo)和解脂耶氏酵母；在一些實施例中，丙酮酸脫羧酶或異檸檬酸脫氫酶多肽的原始物種包括(但不限於)粗糙鏈孢黴、紅酵母屬紅酵母(紅法夫酵母)、黑麴黴、釀酒酵母、巻枝毛黴、粘紅酵母、產朊假絲酵母、高山被孢黴和解脂耶氏酵母。工程皮W類教,A,遊產主類胡蘿蔔素是由類異戊二烯前體合成，所述前體中有一部分還涉及在類固醇和固醇的生產中。大部分常見類異戊二烯生物合成路徑(有時稱為"甲羥戊酸路徑")大致描述於圖3中。如圖所示，乙醯輔酶A經由羥甲基戊二醯輔酶A(HMG-CoA)而轉化成甲羥戊酸。隨後將甲羥戊酸磷酸化且轉化成五碳化合物異戊烯基焦磷酸(IPP)。使IPP異構化為二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)後，與額外的IPP分子進行的三個連續縮合反應將產生十碳分子香葉基焦磷酸(GPP)，隨後產生十五碳分子法尼基焦磷酸(FPP)且最終產生二十碳化合物香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)。經一些生物體(尤其細菌)利用且有時稱為"甲羥戊酸非依賴性路徑"的可選類異戊二烯生物合成路徑描述於圖4中。這一路徑是由從丙酮酸和甘油醛-3-磷酸合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)起始。隨後DOXP經由圖4中所示的一系列反應而轉化成IPP，其異構化成為DMAPP且隨後經由GPP和FPP而轉化成如圖3所示且如上文所論述的GGPP。己對多種生物體中類異戊二烯生物合成中所涉及的各種蛋白質進行鑑別並對其特性進行描述。此外，類異戊二烯生物合成路徑中的各個方面在真菌、細菌、植物和動物王國中始終保守。舉例來說，已對多種生物體和細胞中與圖3中所示的乙醯乙醯輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、IPP異構酶、FPP合酶和GGPP合酶對應的多肽進行鑑別，並且將其從所述生物體和細胞中分離。多種所述多肽的代表性實例提供於表7-15中。可利用或獲得--種或一種以上選自表7-15中任一表所提供的多肽的多肽以用於本發明的方法和組合物中。根據本發明，可通過修飾類異戊二烯生物合成過程中所涉及的一種或一種以上蛋白質的表達或活性來調節宿主生物體中類胡蘿蔔素的產量。在一些實施例中，所述修飾涉及將一種或一種以上異源類異戊二烯生物合成多肽引入宿主細胞中；另外或其它，可對一種或一種以上內源或異源類異戊二烯生物合成多肽的表達或活性進行修飾。考慮到類異戊二烯生物合成多肽組分的可觀保守性，預期異源類異戊二烯生物合成多肽甚至在顯著差異的生物體中通常也會起作用。此外，引入一種以上異源類異戊二烯生物合成多肽應為合乎需要的，在許多情況中，來自不同原始生物體的多肽將一起起作用。在本發明的一些實施例中，將多種不同的異源類異戊二烯生物合成多肽引入相同的宿主細胞中。在一些實施例中，所述多種多肽僅含有來自相同原始生物體的多肽(例如，相同原始生物體的兩種或兩種以上序列或源自相同生物體的序列)；在其它實施例中，所述多種多肽包括獨立地選自來自不同原始生物體的多肽的多肽(例如，至少兩種獨立原始生物體的兩種或兩種以上序列，或源自至少兩種獨立原始生物體的序列)。在利用異源類異戊二烯生物合成多肽的本發明的一些實施例中，原始生物體包括(但不限於)布拉氏黴屬、假絲酵母屬、隱球菌屬、小克銀漢黴屬、油脂酵母屬、被孢黴屬、毛黴菌屬、須黴屬、腐黴屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、毛孢子菌屬、耶氏酵母、麴黴屬、葡萄孢屬、尾孢屬、鐮孢菌屬(赤黴屬)、克魯維酵母屬、鏈孢黴屬、青黴屬、畢赤酵母屬(漢森氏酵母屬)、柄鏽菌屬、酵母菌屬、裂殖酵母菌屬、小核菌屬、木黴屬、黑粉菌屬和紅酵母屬(法夫屬)的真菌。在某些實施例中，原始生物體屬於以下種類，包括(但不限於)新型隱球菌、藤倉鐮孢黴、乳酸克魯維酵母、粗糙鏈孢黴、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、玉米黑粉菌和解脂耶氏酵母。如上文所述，類異戊二烯生物合成路徑中還涉及非類胡蘿蔔素化合物的生產，諸如固醇、類固醇和維生素(諸如維生素E或維生素K)。因此對類異戊二烯生物合成路徑中的中間體起作用並且將其轉入非類胡蘿蔔素化合物的生物合成中的蛋白質為類胡蘿蔔素生物合成的間接抑制劑(例如參看圖5，其說明將類異戊二烯中間體引導到其它生物合成路徑中的點)。因此，認為所述蛋白質為類異戊二烯生物合成競爭劑多肽。預期降低所述類異戊二烯生物合成競爭劑多肽的水平或活性將使根據本發明的宿主細胞中類胡蘿蔔素的產量增加。在本發明的一些實施例中，可降低或去除宿主細胞中內源類異戊二烯生物合成競爭劑多肽的產量或活性。在一些實施例中，可通過用麥角固醇生物合成路徑中的小分子酶抑制劑處理宿主生物體來達成所述類異戊二烯生物合成競爭劑多肽活性的降低或去除。麥角固醇生物合成路徑中的酶例如包括角鯊烯合酶、角鯊烯環氧酶、2,3-氧代角鯊烯-羊毛閨醇環化酶、細胞色素P450羊毛固醇14a-脫甲基酶、C-14固醇還原酶、C-4固醇甲基氧化酶、SAM:C-24固醇甲基轉移酶、C-8固醇異構酶、C-5固醇去飽和酶、C-22固醇去飽和酶和C-24固醇還原酶。認為這些酶中的每一種都為類異戊二烯生物合成競爭劑多肽。還可認為這些酶的調控劑為類異戊二烯生物合成競爭劑多肽(例如，酵母蛋白Sutl(Genebank寄存編號JC4374GI:2133159)和Mot3(Genebank寄存編號NP—013786GI:6323715))，其可具有或可不具有其它生物體中的同系物。在其它實施例中，可通過降低泛醌生物合成路徑的活性來達成類異戊二烯生物合成競爭劑多肽活性的降低或去除。泛醌生物合成中的約定步驟為由哺乳動物中的酪氨酸或苯丙氨酸或細菌中的分支酸形成對羥基苯甲酸(PHB),隨後使PHB與異戊二烯前體縮合，導致異戊二烯基的加成。這一反應是由PHB-聚異戊二烯基轉移酶催化。泛醌的類異戊二烯側鏈是由異戊二烯基二磷酸合酶確定。由PHB與十異戊二烯基二磷酸的縮合反應產生的3-十異戊二烯基-4-羥基苯甲酸將經歷其它修飾(其包括羥基化、甲基化和脫羧)，以便形成泛醌(CoQlO)。因此，抑制導致法尼基焦磷酸成為擴展類異戊二烯的異戊二烯基二磷酸合酶或抑制PHB聚異戊二烯基轉移酶可用於增加類胡蘿蔔素生物合成中可用類異戊二烯的量。(異戊二烯基二磷酸合酶和PHB-聚異戊二烯基轉移酶的實例分別描述於表29和30中)。已知的類異戊二烯生物合成競爭劑酶的小分子抑制劑包括(但不限於)薩拉哥酸(zaragosicacid)(包括其類似物，諸如TAN1607A(BiochemBiophysResCommun1996年2月15日，219(2):515匿520))、RPR107393(3-羥基-3-[4-(喹啉-6-基)苯基]-l-氮雜雙環[2-2-2]辛烷二鹽酸鹽;JPharmacolExpTher.1997年5月，281(2):746-52)、ER-28448(5-(N-[2-丁烯基-3-(2-甲氧基苯基)]-N-甲基氨基)-l,l-亞戊基雙(膦酸)三鈉鹽;JournalofLipidResearch,第41巻，1136-1144,2000年7月)、BMS-188494(TheJournalofClinicalPharmacology,1998;38:1116-1121)、TAK-475(l-[2-[(3R，5S)-l-(3-乙醯氧基-2,2-二甲基丙基)-7-氯-1，2,3,5-四氫-2-氧代-5-(2,3-二甲氧基苯基)-4，1-苯並氮雜卓-3-基]乙醯基]哌啶-4-乙酸;EurJPharmacol2003年4月11日；466(1-2):155-61)、YM-53601((E)-2-[2-氟匿2-(亞喹嚀環-3-基)乙氧基]-9H-昨唑單鹽酸鹽；BrJPharmacol.2000年9月；131(l):63-70)或抑制角鯊烯合酶的角鯊抑素I(squalestatinl)、抑制角鯊烯環氧酶的特比萘芬(terbinafine)、抑制細胞色素P450羊毛固醇14a-脫甲基酶的各種唑類和抑制C-14固醇還原酶和C-8固醇異構酶的芬普福(fe叩ropimorph)。在其它實施例中，可利用異源類異戊二烯生物合成競爭劑多肽(無論功能性或非功能性多肽；在一些實施例中，可使用顯性陰性突變體)。一種可用於本發明中的特殊類異戊二烯生物合成競爭劑多肽為已從多種生物體中鑑別出來並予以表徵的角鯊烯合酶；表16中包括角鯊烯合酶多肽序列的代表性實例。在利用角鯊烯合酶(或角鯊烯合酶的變體)的本發明的一些實施例中，原始生物體包括(但不限於)粗糙鏈孢黴、紅酵母(紅法夫酵母)、黑麴黴、釀酒酵母、巻枝毛黴、粘紅酵母、產朊假絲酵母、高山被孢黴和解脂耶氏酵母。類胡蘿蔔素生物合成路徑從形成GGPP點處與類異戊二烯生物合成路徑分開。類胡蘿蔔素生物合成中的約定步驟為通過由八氫番茄紅素合酶(通常稱為crtB，參看圖6)催化的兩個GGPP分子頭-頭縮合來形成八氫番茄紅素。經一系列各自使共軛雙鍵的數量增加2個的脫氫反應將八氫番茄紅素經由鏈孢紅素轉化成番茄紅素。所述路徑可在產生番茄紅素之前和之後的多個點處分叉，因此可產生多種類胡蘿蔔素。舉例來說，環化酶對番茄紅素起作用將產生Y-胡蘿蔔素；而以去飽和酶對番茄紅素起作用將產生3,4-二脫氫番茄紅素。Y-胡蘿蔔素是通過環化酶作用而轉化成P-胡蘿蔔素。P-胡蘿蔔素可經加工成多種產物中的任一種(例如參看圖6C)，包括蝦青素(經由海膽酮、羥基海膽酮和芬尼黃質(phoenicoxanthin))。根據本發明，可通過修飾類胡蘿蔔素生物合成中所涉及的一種或一種以上蛋白質的表達或活性來調節宿主生物體中類胡蘿蔔素的產量。如所述，在一些實施例中，需要將自然產生一種或一種以上類胡蘿蔔素的生物體用作宿主細胞。在一些其它情況中，關注的焦點將為(例如)通過增加自然產生的類胡蘿蔔素的合成中所涉及的一種或一種蛋白質的水平和/或活性，和/或通過降低競爭性生物合成路徑中所涉及的一種或一種以上蛋白質的水平或活性來增加所述類胡蘿蔔素的產量。另外或其它，在一些實施例中，將需要產生一種或一種以上並非宿主細胞自然產生的類胡蘿蔔素的產量。根據本發明的一些實施例，將需要將一種或一種以上異源產類胡蘿蔔素多肽引入宿主細胞中。如所屬領域技術人員顯而易見，可使用多種異源多肽中的任一種；例如將考慮選擇產量有待增強的特定類胡蘿蔔素。本發明不僅涵蓋引入異源產類胡蘿蔔素多肽，而且還涵蓋調節異源或內源產類胡蘿蔔素多肽的表達或活性，例如包括改變組成性或可誘導性表達模式。在本發明的一些實施例中，表達模式經調節，從而能夠無需在限制養分的條件下生長以誘導產油能力。舉例來說，可利用包含調控序列(例如，啟動子元件、終止子元件)的改變和/或加入的基因修飾，以賦予對表達模式的特定調控。所述基因修飾可與內源基因組合利用(例如，用於調控內源產類胡蘿蔔素多肽)；或者，可包括所述基因修飾從而賦予對至少一種異源多肽(例如，產類胡蘿蔔素多肽)的表達的調控。舉例來說，包括(但不限於)Tefl、Gpdl啟動子在內的啟動子可與內源基因和/或異源基因組合使用以用於修飾內源產類胡蘿蔔素多肽和/或異源產類胡蘿蔔素多肽的表達模式。類似地，示範性終止子序列包括(但不限於)使用解脂耶氏酵母XPR2終止子序列。如圖6和文獻中所述，類胡蘿蔔素生物合成中所涉及的蛋白質包括(但不限於)八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶、番茄紅素環化酶、類胡蘿蔔素酮酶、類胡蘿蔔素羥化酶、蝦青素合酶(見於一些原始生物體中的單一多功能酶，通常具有酮酶與羥化酶活性)、類胡蘿蔔素s羥化酶、番茄紅素環化酶(卩和s亞單位)、類胡蘿蔔素葡糖基轉移酶和醯基輔酶A:二醯基甘油醯基轉移酶。這些類胡蘿蔔素生物合成多肽的代表性實例序列提供於表17-25中。由於葉黃素的環狀端基上存在含氧官能團，故可將其與其它類胡蘿蔔素相區別。舉例來說，葉黃素和玉米黃素在其每一末端環結構上都含有單一羥基，而蝦青素在每一末端環上都含有酮基與羥基。這一特性使得葉黃素的極性比胡蘿蔔素(諸如卩-胡蘿蔔素和番茄紅素)的極性強，且因此使其在脂肪和脂質中的溶解性顯著降低。巳發現自然存在的葉黃素通常是呈末端羥基酯(即脂肪酸單酯和二酯)的形式。在某些種類的細菌中，其還作為糖苷存在。通過加入酯部分可極大地改變葉黃素的溶解性和可分散性，且已知酯化也可影響指定類胡蘿蔔素的可吸收性和/或生物可用性。本發明的目的在於使積累於產油酵母的胞內三醯基甘油酯部分內的特定葉黃素的量最大化，且達成這一目標的一個機制為增加所積累的葉黃素產物的疏水性。一種達成這一目的的方式是對目標葉黃素化合物的脂肪醯基單酯和/或二酯的產生進行工程設計。多種酶可起到酯化類胡蘿蔔素的作用。舉例來說，已在若干種細菌種類中鑑別出類胡蘿蔔素葡糖基轉移酶(例如參看表24)。此外，在三醯基甘油生物合成的最後步驟中起作用的醯基輔酶A:二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)和醯基輔酶A:單醯基甘油醯基轉移酶(MGAT)很可能在葉黃素酯化反應中起到額外作用。代表性DGAT多肽展示於表25中。此外，其它酶可對類胡蘿蔔素和具有類似結構的分子(例如固醇)進行特異性修飾並且可用於修飾和酯生產中。在本發明的一些實施例中，類胡蘿蔔素生物合成多肽的潛在原始生物體包括(但不限於)自然產類胡蘿蔔素的自然產油或不產油真菌屬。這些真菌屬包括(但不限於)葡萄孢屬、尾孢屬、鐮孢菌屬(赤黴屬)、毛黴菌屬、鏈孢黴屬、須黴屬、柄鏽菌屬、紅酵母屬、小核菌屬、木黴屬和紅酵母屬。示範性種類包括(但不限於)粗糙鏈孢黴、紅酵母(紅法夫酵母)、巻枝毛黴和粘紅酵母。當然，類胡蘿蔔素是由多種不同的生物體產生，諸如植物、藻類、酵母、真菌、細菌、藍藻等。任何所述生物體都可為本發明的類胡蘿蔔素生物合成多肽的原始生物體。應理解，根據本發明對宿主細胞所作的特定產類胡蘿蔔素修飾將受需要產生何種類胡蘿蔔素影響。舉例來說，類異戊二烯生物合成多肽與大多數類胡蘿蔔素的生產相關。類胡蘿蔔素生物合成多肽也廣泛相關。酮酶尤其與角黃素的生產相關，而羥化酶與葉黃素和玉米黃素的生產相關。羥化酶與酮酶(或蝦青素合酶)尤其可用於生產蝦青素。類教,A素遊產仝莉分庸如上文所論述，脂質體在產油生物體中的積累一般是通過在存在過量碳源和有限氮源的情況下生長相應生物體來誘導。先前已針對多種不同的產油生物體確立用於誘導所述積累的特定條件(例如參看Wolf(編)W匿o證w"onaZ戸似Wofec/moZogy第1巻，Springer-Verlag，Berlin,Germany,第313-338頁；Zip油18(9):623,1983;涵'a"/￡平35(3):313'1997;嵐MZcra編.腸&c/mo,.30(1):75,2003;腸w離rec/m。Z.95(3):287,2004，各所述文獻都是以全文引用的方式併入本文中)。一般來說，在允許積累佔細胞乾重至少約20%的脂質的條件下培育本發明的經修飾宿主細胞將是合乎人意的。在其它實施例中，本發明的經修飾宿主細胞是在允許積累佔其細胞乾重至少約15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或甚至80%或更多脂質的條件下生長。在某些實施例中，所利用的宿主細胞為自然產油且經誘導以產生所需水平的脂質的細胞。在其它實施例中，宿主細胞為自然產生脂質但已經工程設計以增加脂質產量從而產生所需含量的脂質且達成積累的細胞。在一些實施例中，本發明的宿主細胞並非自然產油的細胞，但已經工程設計以產生脂質從而能獲得所需水平的脂質產生。所屬領域技術人員將理解，一般說來，有效誘導原始生物體中脂質積累的生長條件也可能對於誘導已引入原始生物體的產油多肽的宿主細胞中脂質的積累有用。當然，根據宿主細胞的特徵，可能需要進行修飾，所述修飾是在所屬領域技術人員的技術範圍內。所屬領域技術人員還應理解，一般需要確保本發明的經修飾宿主細胞產生所需類胡蘿蔔素是在與誘導產油能力從而使類胡蘿蔔素積累於脂質體中相關的適當時間時發生。在一些實施例中，需要誘導不會自然產生類胡蘿蔔素的宿主細胞中產生類胡蘿蔔素，從而產生可檢測水平的類胡蘿蔔素。在某些方面，不會自然產生某種(某些)類胡蘿蔔素的宿主細胞能夠產生其它類胡蘿蔔素(例如，某些宿主細胞可自然產生卩-胡蘿蔔素，但可能不會自然產生蝦青素)；在其它方面，所述宿主細胞不會自然產生任何類胡蘿蔔素。在其它實施例中，將需要增加自然產生低水平類胡蘿蔔素的宿主細胞中類胡蘿蔔素的產量，從而使所述類胡蘿蔔素的可檢測水平增加。在某些方面，自然產生類胡蘿蔔素(例如，卩-胡蘿蔔素)的宿主細胞還產生其它類胡蘿蔔素(例如，蝦青素)；在其它方面，自然產生類胡蘿蔔素(例如(3-胡蘿蔔素)的細胞不產生其它類胡蘿蔔素。在本發明的某些實施例中，將需要積累佔細胞乾重大於至少約1%的水平的類胡蘿蔔素(即，考慮所有所產生的類胡蘿蔔素的總量)。在一些實施例中，積累於脂質體中的總類胡蘿蔔素將達到佔其總細胞乾重至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%、至少約20%或更高的水平。在本發明的某些實施例中，將需要實現佔細胞乾重大於至少約1%的脂質體中類胡蘿蔔素積累的總含量(即，考慮所有所產生的類胡蘿蔔素的總量)。在一些實施例中，積累於脂質體中的總類胡蘿蔔素將達到佔其總細胞乾重至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%、至少約20%或更高的水平。已證實，細菌產類胡蘿蔔素基因可轉移到其它生物體中，且因此尤其適用於本發明中(例如參看Miura等人，App/.Mz'croWoZ.64:1226，1998)。在其它實施例中，可能需要利用來自其它原始生物體的基因，諸如植物、藻類或微藻類；這些生物體將提供酮酶和羥化酶多肽的多個潛在來源。其它有用的原始生物體包括多肽的真菌、酵母、昆蟲、原生動物和哺乳動物來源。在某些實施例中，巻枝毛黴多功能八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶和粗糙鏈孢黴八氫番茄紅素脫氫酶基因都可在解脂耶氏酵母中表達。隨後，粗糙鏈孢黴羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的催化結構域的過度表達，和/或用角鯊烯合酶抑制劑薩拉哥酸處理經修飾的解脂耶氏酵母菌株將進一步增加類胡蘿蔔素的產量。最後，編碼類胡蘿蔔素羥化酶和類胡蘿蔔素酮酶的副球菌(Paracoccwma;rMW'!')基因將在解脂耶氏酵母產(3-胡蘿蔔素菌株中表達，且這一修飾將導致蝦青素的積累。可在能採用的其它產油或不產油宿主生物體中使用利用相同的同源或功能類似的產類胡蘿蔔素多肽進行的增強類胡蘿蔔素生產的類似方法。應注意，對於產生一種以上類胡蘿蔔素的本發明的生物體來說，通過調節生長條件來調節所產生的個別類胡蘿蔔素的相對量有時是可能的。舉例來說，據報導，控制培養期間培養物中的溶解氧濃度可調控某些類胡蘿蔔素(例如卩-胡蘿蔔素、海膽酮、(3-隱黃素、3-羥基海膽酮、asteroidenone、角黃素、玉米黃素、金盞花紅素、金盞花黃素和蝦青素)的相對產量(例如參看Tsubokura等人的美國專利第6,825,002號，所述專利的完整內容是以引用的方式併入本文中)。尤其在針對蝦青素生產的本發明的實施例中，通常將需要利用一個或一個以上來自自然產蝦青素生物體的基因。但當擬表達多種異源多肽時，可能需要利用相同的原始生物體或利用密切相關的原始生物體。本發明所提供的一個優勢在於，除允許產生高水平的類胡蘿蔔素外，由於所產生的化合物積累於產油生物體內的脂質體中，故本發明還使這些所產生的化合物易於分離。己於多種產油生物體中確立分離脂質體的方法和系統(例如參看美國專利第5，164，308號、第5,374,657號、第5，422，247號、第5，550，156號、第5,583,019號、第6，166，231號、第6,541,049號、第6,727,373號、第6,750,048號和第6,812,001號，所述專利中每一者都是以全文引用的方式併入本文中)。簡單來說，經常通過噴霧千燥、過濾或離心從培養物中回收細胞。在一些情況下，將細胞均質化且隨後使其經歷超臨界液體萃取或溶劑萃取(例如，用諸如氯仿、己垸、二氯甲烷、甲醇、異丙醇、乙酸乙酯等溶劑)，得到粗油性懸浮液。如所屬領域所知，可視情況將所述油性懸浮液加以精製。經精製的油狀物可直接用作詞料或食品添加劑。另外或其它，可使用常規技術從油狀物中分離出類胡蘿蔔素。考慮到類胡蘿蔔素一般對氧化反應敏感，故本發明的許多實施例中都在類胡蘿蔔素分離過程中和/或分離之後使用氧化穩定劑(例如，生育盼、維生素C、促長啉(ethoxyquin)、維生素E、BHT、BHA、TBHQ等或其組合)。另外或其它，可使用例如以蛋白質微膠囊化以增加氧化的實體障壁和/或改進處理(例如參看美國專利申請案2004/0191365)。l遂根據本發明產生的類胡蘿蔔素可用於多種應用中的任一種中，例如開發其生物或營養特性(例如，抗氧化劑、抗增生等)和/或其色素特性。舉例來說，根據本發明，類胡蘿蔔素可用於藥物(例如參看，Bertram,iVw化Zev.57:JS2，J999;Singh等人，Onco"gy12:1643，l朔；Rock,泡畫coZ.75:185,1997;Edge等人，/.屍/iofoc/jemPAoto編41:189，1997;美國專利申請案2004/0116514;美國專利申請案2004/0259959)、食品補充劑(例如參看，Koyama等人，/./Vwtoc/^mP/zWc^/oZ9.'2<55,1991;Bauernfeind，Carare"o油asco/orart"AprecM"ory,AcademicPress,NY，1981;美國專禾U申請案2004/0115309;美國專利申請案2004/0234579)、電光應用、動物飼料添加劑(例如參看，Krinski,P,CTz綴.66:1003,1994;Polazza等人，￡Wz;y,Z.213:403,1992)、化妝品(作為抗氧化劑和/或作為化妝品，包括芳香劑；例如參看美國專利申請案2004/0127554)等中。根據本發明產生的類胡蘿蔔素還可用作製備其它化合物(例如類固醇等)的中間體。舉例來說，蝦青素和/或其酯可用於多種醫藥應用和健康食品中，包括治療發炎性疾病、哮喘、異位性皮炎、敏感症、多發性骨髓瘤、動脈硬化症、心血管疾病、肝病、腦血管疾病、血栓症、血管生成相關疾病(包括癌症、風溼病、糖尿病視網膜病變、黃斑變性和腦部病症)、高脂質血症、腎缺血、糖尿病、高血壓、腫瘤增生和轉移和代謝病症。此外，類胡蘿蔔素和蝦青素可用於預防和治療疲勞、改善由發炎性疾病引起的腎病的腎功能並且預防和治療其它與生活習慣相關的疾病。另外，已發現蝦青素作為各個生物學過程的抑制劑的作用，包括白細胞介素抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、磷酸酯酶A2抑制劑、環氧化酶-2抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、毛細管內皮細胞增生抑制劑、脂肪氧化酶抑制劑。例如參看，20060126公開的日本公開案第2006022121號(20051017申請的JP申請案第2005-301156號)、20060119公開的日本公開案第2006016408號(20051017申請的JP申請案第2005-301155號)、20060119公開的日本公開案第2006016409號(20051017申請的JP申請案第2005-301157號)、20060119公開的日本公開案第2006016407號(20051017申請的JP申請案第2005-301153號)、20060112公開的日本公開案第2006008717號(20051017申請的JP申請案第2005-301151號)、20060112公開的日本公開案第2006008716號(20051017申請的JP申請案第2005-301150號)、20060112公開的日本公開案第2006008720號(20051017申請的JP申請案第2005-301158號)、20060112公開的日本公開案第2006008719號(200510H申請的JP申請案第2005-301154號)、20060112公開的日本公開案第2006008718號(20051017申請的JP申請案第2005-301152號)、20060112公開的日本公開案第2006008713號(20051017申請的JP申請案第2005-301147號)、20060112公開的日本公開案第2006008715號(20051017申請的JP申請案第2005-301149號)、20060112公開的日本公開案第2006008714號(200510H申請的JP申請案第2005-301148號)、20060112公開的日本公開案第2006008712號(20051017申請的JP申請案第2005-301146號)。應理解，在本發明的一些實施例中，將由如本文所述的經處理宿主細胞產生的類胡蘿蔔素併入上下文中的宿主細胞的終產物(例如，食品或詞料補充劑、藥物、化妝品、含染料物品等)中。舉例來說，可將宿主細胞凍幹、冷凍乾燥、冷凍或以其它方式滅活，且隨後可將全細胞併入終產物中或用作終產物。也可在併入所述產物中之前對宿主細胞進行處理(例如經由溶解)以增加生物可用性。另外或其它，終產物中可僅併入一部分從全細胞中分離的宿主細胞(例如，按尺寸、溶解性分離)。舉例來說，在本發明一些實施例中，將脂質小滴從宿主細胞中分離，並且將其併入終產物中或用作終產物。在其它實施例中，分離類胡蘿蔔素本身或個別類胡蘿蔔素化合物並且將其再調配成終產物。如上文所述，脂肪酸和糖苷酯為自然界中可見的主要類胡蘿蔔素酯，但可合成其它酯(例如，用有機酸或無機磷酸)以產生有用的產物形式。對於傳遞而言，也可將類胡蘿蔔素酯調配成酯鹽的形式(例如參看，美國專利公開案第20050096477號)。併入指定產物中的類胡蘿蔔素的量可視產物和所涉及的特定類胡蘿蔔素而顯著變化。劑量可例如在小於0.01重量％到大於1重量％、10重量％、20重量％、30重量％或更多產物的範圍內；在一些情況下，所述類胡蘿蔔素可包含100%產物。在本發明的一些實施例中，將一種或一種以上所產生的類胡蘿蔔素併入食品或飼料(例如，食品補充劑)組分中。根據本發明，對可併入類胡蘿蔔素的食品的類型並未特別限制，且其包括飲料，諸如茶、果汁和酒；甜食，諸如果子凍和餅乾；含脂肪食品和飲料，諸如奶製品；加工食品，諸如米和軟米(或粥)；嬰兒配方等。在本發明這一方面的一些實施例中，由於類胡蘿蔔素可促進併入某些含脂肪食品中，故在可食用脂質體內併入所述類胡蘿蔔素可為有益的。可併入本發明所產生的類胡蘿蔔素的飼料的實例(例如)包括寵物食品，諸如貓食、狗食等；觀賞魚、養殖魚或甲殼動物等的飼料；農場動物(包括家畜且另外包括水產養殖業中餵養的魚或甲殼動物)的飼料。可併入本發明所產生的類胡蘿蔔素的食品或飼料物質優選可合乎作為預定接受者的生物體的口味。這一食品或飼料物質可具有當前對食品物質己知的任何物理特性(例如，固體、液體、軟)。在本發明的一些實施例中，可將一種或一種以上所產生的類胡蘿蔔素併入化妝品中。所述化妝品的實例(例如)包括護膚品(例如，洗液、乳液、面霜等)、唇膏、防曬化妝品、化妝品、香水、日用品(例如，牙膏、漱口水、防口臭試劑、固體肥皂、液體肥皂、洗髮精、護理液)等。在一些實施例中，將一種或一種以上所產生的類胡蘿蔔素併入藥物中。所述藥物的實例(例如)包括各類片劑、膠囊、飲用劑、錠劑、漱口劑等。在一些實施例中，所述藥物適於局部應用。並未對劑型作特別限制，且其包括膠囊、油、顆粒劑、濃縮細粒(granulasubtilae)、凍乾粉(puWeres)、片劑、丸劑、錠劑等。由於油和充油膠囊在製造過程中無成分分解，且由於易於將本發明的含類胡蘿蔔素脂質小滴併入油基調配物中，故其可提供額外優勢。可根據所屬領域中已確立的技術(例如包括如美國藥典(UnitedStatesPharmacopoeia)中所述的常用程序)製備本發明的藥物。可將根據本發明產生的類胡蘿蔔素併入任何含色素的產品(例如包括織物、油漆等)中。還可將其併入作為環境指示劑的產品中，或用作檢測劑的諸如生物感應器的儀器中。例證下表26描述以下例證中所使用的解脂耶氏酵母菌株表26:解脂耶氏酵母菌株tableseeoriginaldocumentpage32(ZTC7、XW2遊PEX77的基因型未經交叉確定，也未關於ATCC菌株進行驗證。)本文所述的所有基礎分子生物學和DNA操作程序一般是根據Sambrook等人或Ausubel等人所述進行(SambrookJ，FritschEF，ManiatisT(編).1989.A/Wec"^rC7om'"g:ALaZwraroryMa"wa/.ColdSpringHarborLaboratoryPress:NewYork;AusubelFM，BrentR,KingstonRE,MooreDD，SeidmanJG，SmithJA，StruhlK(編).1998.C加/Vofocok!.nMo/ecw/ar5ZoZogy.Wiley:NewYork)。產flf樹造類遊,A,蘑樣^處教產生用於構造產類胡蘿蔔素菌株的質粒。以下部分將描述編碼產類胡蘿蔔素多肽的質粒的產生。這些研究中所使用的質粒和有關其構造的細節描述於表27中。其它質粒構造細節和對其用途的描述可見於相關章節的內容中。除非另作說明，否則所有PCR擴增都使用NRRLY-1095基因組DNA作為模板。下文中所述的f/ZA5基因為具有上述wra2-2/營養缺陷型的等位基因。G屍Z)7和r五F/啟動子是來自解脂耶氏酵母，且XPi2終止子也是來自解脂耶氏酵母。GGW為編碼解脂耶氏酵母基因的基因，所述解脂耶氏酵母基因編碼香葉基香葉基焦磷酸合酶。核酸編碼序列和pMB4591與pMB4683的經編碼Ggsl蛋白如下所示atggattataacagcgcggatttcaaggagatatggggcaaggccgccgacaccgcgctgctgggaccgtacaactacctcgccaacaaccggggccacaacatcagagaacacttgatcgcagcgttcggagcggttatcaaggtggacaagagcgatctcgagaccatttcgcacatcaccaagattttgcataactcgtcgctgcttgttgatgacgtggaagacaactcgatgctccgacgaggcctgccggcagcecattgtctgtttggagtcccccaaaccatcaactccgccaactacatgtactttgtggctctgcaggaggtgcteaagctcaagtcttatgatgccgtctccattttcaccgaggaaatgatcaacttgcatagaggtcagggtatggatotctactggagagaaacactcacttgcccctcggaagacgagtatctggagatggtggtgcacaagaccggtggactgtttcggctggctctgagacttatgctgtcggtggcatcgaaacaggaggaccatgaaaagatcaactttgatctcacacaccttaccgacacactgggagtcatttaccagattctggatgattacctcaacctgcagtccacggaattgaccgagaacaagggattctgcgaagatatcagcgaaggaaagttttcgtttccgctgattcacagcatacgcaccaacccggataaccacgagattctcaacattctcaaacagcgaacaagcgacgcttcactcaaaaagtacgccgtggactacatgagaacagaaaccaagagtttcgactactgcctcaagaggatacaggccatgtcactcaaggcaagttcgtacattgatgatctagcagcagctggccacgatgtctccaagctacgagccattttgcattattttgtgtccacctctgactgtgaggagagaaagtactttgaggatgcgcagtgamdynsadfkeiwgk:aadtallgpynylannrghnirehliaafgavikvdksdletishitkilhiissllvddvednsmlrrglpaahclfgvpqtinsanymyfvalqevlklksydavsifteeiniiilhrgqgmdlywretltcpsedeylemvvhktgglfrlalrlmlsvaskqedhekinfdlthltdtlgviyqilddylnlqsteltenkgfcedisegkfsf^lihsirtnpdnheilnilkqrtsdaslkkyavdymrtetksfdyclkriqamslkassyiddlaaaghdvsklranhyfvstsdceerkyfedaq。表27:質粒tableseeoriginaldocumentpage33pMB4535PCR2.11.2kbWM5PCR產物M04471&M04472pMB4589p柳粉5,"/+S一J1.2幼G屍D/啟動子^T/w/+脂u-0./4幼ZP/2終止子(MV+M04568&M04591;M04566&M04593pMB4590pMB4535(X/w/+印e"0.4kbr￡:F/後動7+脂u.0.14kbX屍K2終止子(iVwI+M04571&M04592;M04566&M04593pMB4591pMB4590,/+Mm"1.0kbGGS7(Swl+MfeI)M04534&M04544pMB4597pMB4534(Acc651+5pel)GPD7啟動子&XPi2終止子來自pMB4589pMB4603pMB4597(Rsril+Mul)殘餘主鏈&r￡f7啟動子fferll+來自pMB4590pMB4616pMB4529(Rsr11+Spel)殘餘主鏈&GP￡7啟動子cOT72終止子(i^7/+Spe/J來自pMB4589pMB4629pMB4616(Rsr11+她/)殘餘主鏈&T￡F/啟動子Ww7/+來自pMB4590pMB4631pMB4603(Kpnl+Nhel)1.2toGPD7啟動子fKpn/+M04568&M04659pMB4628pMB4603參看1ApMB4637pMB4629(版/+MW參看1DpMB4638pMB4629carS(z一J參看1BpMB4660pMB4638(+t/iM3J參看icpMB4662p細紛腳e/+M。"1.8幼WM3#疑S犯"M04684&M04685參看icpMB4683pMB4662(Vicc65/+"toOGGW#度"Acc65/來@pMB4591pMB4692pMB4662(Acc65/+M師0.4kbr肌^動764cc65/+0.55kbcrtZ+M&"參看1EpMB4698pMB4629,e/+她/)0.9tocrtW+M師參看1FpMB4599pBluescriptSKII-(Eco尺V)1.9kbcar朋基齒M04525&M04541pMB4606pBluescriptSKII，c。司1.9kbca^基房MO4530&M04542pMB4613pMB4599一65;+參看文中pMB4619pBluescriptSKII-(^am///參看文中上表27中所提及的某些寡核苷酸如下所示M044715'-CTGGGTGACCTGGAAGCCTTM044725'-AAGATCAATCCGTAGAAGTTCAGM044755'-AAGCGATTACAATCTTCCTTTGGM044765'-CCAGTCCATCAACTCAGTCTCAM044775'-GCATTGCTTATTACGAAGACTACM044785'-CCACTGTCCTCCACTACAAACACM045345'匿CACAAACGCGTTCACTGCGCATCCTCAAAGTM045445'-CACAATCTAGACACAAATGGATTATAACAGCGCGGATM045665'-CACAAACTAGTTTGCCACCTACAAGCCAGATM045685'-CACAAGGTACCAATGTGAAAGTGCGCGTGATM045715'-CACAAGGTACCAGAGACCGGGTTGGCGGM045915'-CACAAGCGGCCGCGCTAGCATGGGGATCGATCTCTTATATM045925'-CACAAGCGGCCGCGCTAGCGAATGATTCTTATACTCAGAAGM045935'-CACAAGCGGCCGCACGCGTGCAATTAACAGATAGTTTGCCM046595'-CACAAGCTAGCTGGGGATGCGATCTCTTATATC1A:產生編碼八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶的dMB4628(feW。-cari^Z^^/2):由巻枝毛黴(ATCC90680)基因組DNA使用M04525和M04541擴增含內含子的carW戶.-M045255'-CACAAACGCGTTTAAATGGTATTTAGATTTCTCATTM045415'-CACAATCTAGACACAAATGCTGCTCACCTACATGGA;並且用T4聚核苷酸激酶使所得1.9kb片段磷酸化。將所得片段的平末端與經EcoRV裂解的pBluescriptSKII接合，得到pMB4599。將來自pMB4599的1.9kbX&al-MZwI片段插入Mzel-和M&I-裂解的pMB4603中，得到pMB4628。編碼含內含子的核酸的序列和pMB4628的經編碼CarRP蛋白如下所示atgctgctcacctacatggaagtccacctctactacacgctgcctgtgctgggcgtcctgtcctggctgtcgcggecgtactacacagccaccgatgcgctcaaattcaaatttctgacactggttgccttcacgaccgcctccgcctgggacaactacattgtctaccacaaggcgtggtcctactgccccacctgcgtcaccgctgtcattggctacgtgcccttggaggagtacatgttcttcatcatcatgactctgttgaccgtggcattcaccaatctggtgatgcgctggcacctgcacagcttctttatcaggcctgaaacgcccgtcatgcagtccgtcctggtccgtcttgtccccataacagcc廿attaatcactgcatacaaggcttgggtaagcaaacaaacaaatgatgtgccgcatcgcattttaatattaaccattgcatacacagcatttggcggtccctggaaagccactgttctacggatcatgcattttgtggtacgcctgtccggttttggccttattgtggtttggtgctggcgagtacatgatgcgtcgtccgctggcggtgctcgtctccattgcgctgcccacgctgtttctctgctgggtcgatgtogtcgctattggcgccggcacatgggacatttcgctggccacaagcaccggcaagttcgtcgtgccccacctgcccgtggaggaattcatgttctttgcgctaattaataccgttttggtatttggtacgtgtgcgatcgatcgcacgatggcgatcctccacctgttcaaaaacaagagtccttatcagcgcccataccagcacagcaagtcgttcctccaccagatcctcgagatgacctgggccttctgtttacccgaccaagtgctgcattcagacacattccacgacctgtccgtcagctgggacatcctgcgcaaggcctccaagtccttttacacggcctctgctgtctttcccggcgacgtgcgccaagagctcggtgtgctatacgccttttgcagagccacggacgatctctgcgacaacgagcaggtccctgtgcagacgcgaaaggagcagctgatactgacacatcagttcgtcagcgatctgtttggccaaaagacaagcgcgccgactgccattgactgggacttttacaacgaccaactgcctgcctcgtgcatctctgccttcaagtcgttcacccgtttgcgccatgtgctggaagctggagccatcaaggaactgctcgacgggtacaagtgggatttggagcgtcgctccatcagggatcaggaggatctcagatattactcagcttgtgtcgccagcagtgttggtgaaatgtgcactcgcatcatactggcccacgccgacaagcccgcetcccgccagcaaacacagtggatcattcagcgtgcgcgtgaaatgggtctggtactccaatatacaaacattgcaagagacattgtcaccgacagcgaggaactgggcagatgctacctgcctcaggattggcttaccgagaaggaggtggcgctgattcaaggcggccttgcccgagaaattggcgaggagcgattgctctcactgtcgcatcgcctcatctaccaggcagacgagctcatggtggttgccaacaagggcatcgacaagctgcccagccattgtcaaggcggcgtgcgtgcggcctgcaacgtctatgcttccattggcaccaagctcaagtcttacaagcaccactatcccagcagagcacatgtcggcaattcgaaacgagtggaaattgctcttcttagcgtatacaacctttacaccgcgccaattgcgactagtagtaccacacattgcagacagggaaaaatgagaaatctaaatacca世aa;mlltymeYhlyytlpvlgvlswlsrpyytatdalkfkfltlvafttasawdnyivyhkawsycptcvtavigyvpleeymffihxitlltvaftnlvmrwhlhsffirpetpvmqsvlvrlvpitallitaykawhlavpgkplfygscilwyacpvlallwfgageymmrrplavlvsialptlflcwvdYvaigagtwdisatstgkfvvphlpveeftnffalintvlvfgtcaid加ailhlfknkspyqrpyqhsksfmqilemtwafclpdqYlhsdtfhdlsvswdilrkasksfytasavfpgdvrqelgvlyafcratddlcdneqvpvqtrkeqlilthqfVsdlfgqktsaptaidwdfyndqlpascisafksftrlrhveagaikelldgykwdlerrsirdqedlryysacvassvgemctriilahadkpasrqqtqwiiqraremgWlqytniardivtdsedgrcylpqdwltekevaliqgglareigeerlIslshrliyqadelmYYankgidklpshcqggvraacnvyasigtklksykhhypsrahvgnskrveiallsvyraytapiatsstthcrqgkmmlnti或者，還將pMB4599用作模板以供使用M04318、M04643、M04644和M04639進行的PCR擴增並產生0.5kb和0.95kb片段M043185'-GTAAAACGACGGCCAGTM046435'-CACACGGTCTCATGCCAAGCCTTGTATGCAGTGATTAAM046395'-CCACTGTGTTTGCTGGCGGM046445'-CACACGGTCTCTGGCATTTGGCGGTCCCTGGAAA，隨後分別用Acc65I與&"I和^al與P，MI裂解所述片段。將這些片段與已經Ao:651和PpwMI消化的pMB4599接合，得到具有無內含子car/屍的pMB4613。可將來自pMB4613的1.85kbXZal-Af&I片段插入AT/^I-和A//MI—裂解的pMB4603中得到pCarRPdelI。1B:產生編碼八氫番茄紅素脫氫酶的pMB4638Ge/7。-c『萬A￡>￡7):由巻枝毛黴(ATCC90680)基因組DNA使用MO4530和M04542擴增含內含子的car5:MO45305'-CACAAACGCGTTTAAATGACATTAGAGTTATGAACM045425'-CACAATCTAGACACAAATGTCCAAGAAACACATTGTC，並且用T4聚核苷酸激酶將所得1.9kb片段磷酸化，且將平末端與經EcoRV裂解的pBS-SKII-接合，得到pMB4606。隨後將pMB4606用作模板以供使用M04318與M04648和M04646與M04647和M04343與M04645進行的PCR擴增M043185'-GTAAAACGACGGCCAGTM046485'-CACAAGGTCTCAAGCACGCATCCCGGAACTGM046465'-CACACGGTCTCAGGCATGTCGCCCTACGATGCM046475'-CACACGGTCTCATGCTTGCACCCACAAAGAATAGGM043435'-CAGGAAACAGCTATGACM046455'-CACACGGTCTCTTGCCCATATACATGGTCTGAAACG，產生0.4kb和0.85kb和0.7kb的片段，隨後分別用Acc651與^al和和與S證HI裂解所述片段。將這些片段與己經Acc65I和^mffl切斷的pBS-SKII-接合，得到具有無內含子"""5的pMB4619。將來自pMB4619的1.75kbX&al-M&I片段插入A^I-和MM-裂解的pMB4629中，得到pMB4638。所得核酸編碼序列和pMB4638的經編碼CarB蛋白如下所示imageseeoriginaldocumentpage38atgtecaagaaacaGattgtcattatcggtgctggcgtgggtggcacggctacagctgctcgtttggcccgcgaaggcttcaaggtcactgtggtggagaaaaacgactttggtggcggccgctgctGCttgatccatcacc紹ggccatcgctttgatcagggcccgtcgctctacctgatgcccaagtactttgaggacgcctttgccgatctggacgagcgcattcaagaccacctggagctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcactttgacgacggtgagtcgatccagctgtcgtctgacttgacacgcatgaaggctgaattggaccgcgtggagggcccccttggttttggccgattcctggatttcatgaaagagacacacatccactacgaaagcggcaccctgattgcgctcaagaagaatttcgaatecatctgggacctgattcgcatcaagtacgctccagagatctttcgcttgcacctgtttggcaagatctacgaccgcgc憂ccaagtacttcaagaccaagaagatgcgcatggcattcacgtttcagaccatgtatatgggcatgtcgccctacgatgcgcctgctgtctacagcctgttgcagtacaccgagttcgctgaaggcatctggtatccccgtggcggcttcaacatggtggttcagaagctagaggcgattgc咖gcaaa3gtacgatgccg3gtttatctacaatgcgcctgttgc固gatt犯c3ccgatgatgccacc咖caagtg3C3ggtgtaaccttggaaaatggccacatcatcgatgccgatgcggttgtgtgtaacgcagatctggtctatgcttatcacaatctgttgcctccctgccgatggacgcaaaacacactggcttccaagaaattgacgtcttcttccatttccttctactggtccatgtccaccaaggtgcctcaattggacgtgcacaacatc鵬ggccgaggcttatcaggagagctttgacgaaatcttcaaggactttggcctgccttctgaagcctccttctacgtcaatgtgccctctcgcatcgatccttctgctgctcccgacggcaaggactctgtcattgtcttggtgcctattggtcatatgaagagcaagacgggcgatgcttccaccgagaactacccggccatggtggacaaggcacgcaagatggtgctggctgtgattgagcgtcgtctgggcatgtcgaatttegccgacttgattgagcatgagcaagtcaatgatcccgctgtatggcagagcaagttcaatctgtggagaggctcaattctgggtttgtctcatgatgtgcttcaggtgctgtggttccgtcccagcacaaaggattctaccggtcgttatgataacctattctttgtgggtgcaagcacgcatcccggaactggtgttcccattgtccttgcaggaagcaagctcacctctgaccaagttgtcaagagctttggaaagacgcccaagccaagaaagatcgagatggagaacacgcaagcacctttggaggagcctgatgctgaatcgacattccctgtgtggttctggttgcgcgctgccttttgggtcatgtttatgttcttttacttcttccctcaatccaatggccaaacgcccgcatcttttatcaataatttgttacctgaagtattccgcgttcataactctaatgtcatttaa;mskkhMigagvggtataarlaregflcYtvvekndfgggrcslihhqghrfdqgpslylmpkyfedafadlderiqdhlellrcdnnykvhfddgesiqlssdltrmkaddrvegplgfgrfldfinkethihyesgtlialkknfeshvdlirikyapeifrlhlfgkiydraskyfktkkmrmaftfqtmynigmspydapavysllqytefaegiwyprggfhmYvqkleaiakqkydaefiynapvakintddatkqvtgvtlenghiidadawcnadlvyayhnilppcrwtqntlaskkltsssisfywsTnstkvpqldvhniflaeayqesfdeifkdfglpseasfyvnvpsridpsaapdgkdsvivlvpighrnksktgdastenypamvdkarkinvlavieiTlgmsnfadieheqYndpavwqskfnwrgsilglshdvlqvlwfrpstkdstgrydnlffvgasthpgtgvpivlagskltsdqvvksfgktpkprldemei]tqap〗eepdaestfjvwfwlraafWvmfhiffyff^qsngqtpasfinnllpevfrvhiisnviID:產生PMB4637和編碼截短型HMG1的pTef-HMG為產生HMG-CoA還原酶基因(其還編碼源自釀酒酵母的77個胺基酸的前導序列)的截短型變異體，合成以下寡核苷酸引物O5'-TTCTAGACACAAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTGA弓l物P5'-CATTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATC引物Q5'-GTTCTCTGGACGACCTAGAGGM046585'匿CACACACGCGTACACCTATGACCGTATGCAAAT。使用基因組DNA作為模板，使用引物O和P來擴增編碼Met-Ala的0.23kb片段，隨後擴增釀酒酵母的Hmgl蛋白的殘基530到604。使用基因組DNA作為模板，使用引物Q和M04658擴增編碼解脂耶氏酵母的Hmgl蛋白的C末端448個殘基的1.4kb片段。將這些片段與適當的克隆載體接合，並且通過測序來驗證所得質粒，將其命名為pOP和p'QM04658。用X^I和AwI釋放OP片段，並且用Af"el和MM釋放QM04658。隨後將這些片段與經」W"/和MZw/切斷的r￡F//7表達載體pMB4629接合以產生TefHMG。或者，可在無如上表所述的釀酒酵母序列的情況下，使用引物M04658(如上文所述)和M04657修飾來自解脂耶氏酵母的自然/ZM(^基因，從而得到pMB4637:M046575'-CACACTCTAGACACAAAAATGACCCAGTCTGTGAAGGTGG。所得核酸編碼序列和pMB4637的經編碼Hmgl,蛋白如下所示atgacccagtctgtgaaggtggttgagaagcacgttcctatcgtcattgagaagcccagcgagaaggaggaggacacctcttctga卿ctccattgagctgactgtcggaaagcagcccaagcccgtgaccgagacccgttctctggacgacctagaggctatcatgaaggcaggtaagaccaagcttctggaggaccacgaggttgtcaagctctctctcgagggcaagcttcctttgtatgctcttgagaagcagcttggtgacaacacccgagctgttggcatccgacgatctatcatctcccagcagtctaataccaagactttagagacctcaaagcttccttacctgcactacgactacgaccgtgtttttggagcctgttgcgagaacgttattggttacatgcctctccccgttggtgttgctggccccatgaacattgatggcaagaactaccacattcctatggccaccactgagggttgtcttgttgcctcaaccatgcgaggttgcaaggccatcaacgccggtggcggtgttaccactgtgcttactcaggacggtatgaeacgaggtccttgtgtttccttcccctctctcaagcgggctggagccgctaagatctggcttgattccgaggagggtctcaagtccatgcgaaaggccttcaactccacctctcgatttgctcgtctccagtctcttcactctacccttgctggtaacctgctgtttattcgattccgaaccaccactggtgatgccatgggcatgaacatgatctccaagggcgtcgaacactctetggccgtcatggtcaaggagtacggcttccctgatatggacattgtgtctgtctcgggtaactactgcactgacaagaagcccgcagcgatcaactggatcgaaggccgaggcaagagtgttgttgccgaagccaccatccctgctcacattgtcaagtctgttctcaaaagtgaggttgacgctcttgttgagctcaacatcagcaagaatctgatcggtagtgccatggctggctctgtgggaggtttcaatgcacacgccgcaaacctggtgaccgccatctaccttgccactggccaggatcctgctcagaatgtcgagtcttccaactgcatcacgctgatgagcaacgtcgacggtaacctgctcatctccgtttccatgccttctatcgaggtcggtaccattggtggaggtactattttggagccccagggggctatgctggagatgcttggcgtgcgaggtcctcacatcgagacccccggtgccaacgcccaacagcttgctcgcatcattgcttctggagttcttgcagcggagctttcgctgtgttctgctcttgctgccggccatcttgtgcaaagtcatatgacccacaaccggtcccaggctcctactccggccaagcagtctcaggccgatctgcagcgtctacaaaacggttcgaatatttgcatacggtcatagtntqsvkvvekhvpiviekpsekeedtssedsieltvgkqpkpvtetrslddleaimkagktklledhevvklslegklplyale]cqgdntravgirrsiisqqsntktletsklpyhydydrvfgaccenvigymplpvgvagpmnidgknyhipmattegclvastmrgckainagggYttvltqdgmtrgpcvsf^slkragaakiwldseeglksmrkafiistsrfarlqslhstlagnllfirfitttgdamg認miskgvehslavnwkeygfpdindivsvsgnyctdkkpaainwiegrgksvvaeatipahivksvlksevdarvdnisknligsamagsvggfoahaanlvtaiylatgqdpaqnvessncitlmsnvdgnllisvsmpsievgtigggtilepqgamlemlgvrgphietpganaqqlariiasgvlaaelslcsalaaghlvqshmthnrsqaptpakqsqadlqrlqngsnicirs。IE:產生編碼胡蘿蔔素羥化酶的PMB4692(WM3gWp-cwZ):基於新鞘氨醇桿菌(yVovo印/u'"goWwnawm。"c!'voraiw)的蛋白質序列，使用解脂耶氏酵母密碼子偏性合成以下胡蘿蔔素羥化酶(CrtZ)ORF序列ttctagacacaaaaatgggtggagccatgcagaccctcgctgctatcctgatcgtcctcggtacagtgctcgctatggagtttgtcgcttggtcttctcataagtotatcatgcatggc憂cggatggggatggcatagagaccatcacgas:ccccatgagggatttcttgagaagaatgacttatacgccatcgttggcgctgccctctcgatactcatgtttgccctcggctctcccatgatcatgggcgctgacgcctggtggcccggaacctggatcggactcggtgtcctcttctatggtgtcatcta(accctcgtgcacgacggtctggtgcaccaacgatggtttagatgggtgcctaaacgaggttacgccaaacgactcgtgcaggcccataagctgcaccacgccaccattggcaaggaaggaggcgtctcattcggtttcgtgttcgcccgagateccgccgttctgaagcaggagcttcgagctcaacgagaagcaggtatcgccgtgctgcgagaggctgtggacggct咖cgcgt使用X&"/和M^/裂解這一序列，並且將其連同來自pMB4629的Acc65/-Mze/r￡F/啟動子片段與經Acc65/和MZm/切斷的pMB4662接合，從而得到pMB4692。上文以粗體下劃線標示核酸編碼序列。所得pMB4692的經編碼crtZ蛋白如下所示mggamqtlaailivlgtvlamefvawsshkyinihgfgwgwhrdhhephegflekndlyaivg油ilmfalgspmimgadawwpgtwiglgvlfygviytlvhdgWhqrwfrwvpkrgyakrWqahklhhaligkeggvsfgfvfardpavlkqdraqreagiavlreavdg。1F:產生編碼胡蘿蔔素酮酶的pMB4698/g/7p-c"W)--基於具有從馬尾藻海(SargassoSea)(Genebank寄存編號AACY01034193.1)分離的環境序列(evvironmentalsequence)的蛋白質序列，合成以下胡蘿蔔素酮酶(CrtW)ORF序列ttctagac織aaaatgactcgatctatttcctggccttccacctactggcacctcc犯ccctcctgttcttcttgggtcgcaaacgaattctctcctcaagcccgaaaaggtctegtcctcgctggtctcattggttccgcttggetgcttaetctcggacttggcttttcccttcccctccatcaaacgagctggcttctcatcggttgt:ctcgttctccttagatctttcctgcacaccggactttttatcgttgcccatg3cgctatgcacgcttctcttgttcctgaccaccctggccttaaccgttggattggacgtgtctgtcttctcatgtatgctggactctcct3C犯3犯3tgCtgCCg3犯tC3CCgtCg3CacC3CC犯gCCCCtg油aC3gttg犯g8CCCtg3Ct3CC犯Cg3tgC3Ct犯caacaatatcctcgactggtacgttcactttatgpgaaattacctcggatggcaacaattgcttaatctctcttgcgtttggctcgetctcaccttccgtgtttctgactactctgctcaattcttccacctgctccttttctctgtccttcctctcatcgtctcctectgtcaactcttcctcgtgggaacctggctgccacaccgacgaggcgctactactcgacccggcgttaccactcgatccctgaacttccaccctgctctttccttcgctgcttectaccacttcggttaccaccgtgaacaccatgaatctccctctactecttggttccaacttcctaaactccgagaaggttctctcatctaaacgcgt。使用《7"/和MZw/裂解這一序列，並且將其與經A%e/和MZw/切斷的pMB4629接合，從而得到pMB4698。上文以粗體下劃線標示核酸編碼序列。所得pMB4698的經編碼crtW蛋白如下所示-mtrsiswpstywhlqpscsswvanefspqarkglvlagligsawUtlglgfslplhqtswlligdvlIrsflhtglfivahdamhasrvpdhpglnrwigrvcllmyaglsykrccrnhrrhhqapetvedpdyqrctimnildwyvhfingnylgwqqllnkcvwatfrvsdysaqffh〗l〗fsvlplivsscqlflvgtwlphrrgattrpgvttrslnfhpalsfaacyhfgyhrehhespstpwfq〗pklregsli。工薦沒^嚴燈,氏^母"潛》/7類教蘿/v素產量2A:產生表達香葉基香葉基焦磷酸合酶和八氫番茄紅素脫氫酶的解脂耶氏酵母--用WA5上遊已經^p/裂解的pMB4591(fe/7p-GGW)轉化MF350(A^rSwra2-27Zew2-35鑑別在"ra2位點處載有質粒的Ura+轉化株，並將其命名為MF364。隨後用AZ)W處已經S印/裂解的pMB4638("/7p-c『S)將其轉化，並且選擇在位點處具有質粒的原養型轉化株。將所述轉化株命名為MF502。2B:產生表達香葉基香葉基焦磷酸合酶、八氫番茄紅素脫氫酶和八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶的解脂耶氏酵母:用已經S印/處理的pMB4628("/7p-ca^P)轉化MF502。選擇兩天或三天生長後在轉化培養板(具有1%葡萄糖和0.1呢穀氨酸[YNBglut]的YNB瓊脂)上呈無色、橙色或深橙色的九個原養菌落。在3(TC下於YPD中生長4天後，兩個菌落、即MF597和MF600(呈深橙色者)產生大於每克細胞乾重(DCW)4mg的胡蘿蔔素。Southern分析揭示基因組DNA中具有來自MF597和MF600的不同單一/(/^/-//zVzrf///譜帶，並無譜帶表示在Ze"2-270處發生同源整合。2C:產生表達八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶和八氫番茄紅素脫氫酶的解脂耶氏酵母:用S印/裂解的pMB4628轉化ATCC201249(MArAwra3-W2Ze"2-270ty"-/7)。匯集數百個Leu+菌落，使其再生長並且用C/尺A3上遊己經SaZ/裂解的pMB4660(r五F/p-cflrfl)對其進行轉化。選擇在30。C下於YNBglut加0.6mM賴氨酸上培養5天後呈亮黃色的一個菌落(稱為MF447)，並且發現在YPD中生長4天後，其產生每克細胞乾重0.2mg胡蘿蔔素。用1g/L5-氟乳清酸和經選擇的Ura—分群激發MF447。意外地是，發現其都保留與其親本相同的黃色外觀，這表明功能性[/尺A3基因未隨著功能性CarB酶的喪失而喪失。Southern分析證實，由KpnI-HindIII消化MF447DNA得到的兩個片段都含有L7M3p雜交序列，其中僅一個序列還與c^"5雜交。另一序列在MF578中缺乏，選擇Ura3—分群以供進一步處理。質粒營救(plasmidrescue)和對菌株MF447、MF597(實例2c)和MF600(實例2c)中涵蓋carRP內含子的DNA序列的分析揭示，外顯子1與外顯子2相鄰，且彼此由缺乏初始內部Sspl位點(存在於pMB4628中)的內含子序列分離。2D:產生表達八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶、八氫番茄紅素脫氫酶和香葉基香葉基焦磷酸合酶的解脂耶氏酵母:用已經SaW(t/iA3上遊)或經(GGWORF內)裂解的pMB4683(fe/7p-GGW)轉化MF578。在兩種情況下，Ura+Leu+菌落在YNBglut+Lys和YPD上都呈亮橙色，並且當如上文所述生長時，若干菌落產生大於每克細胞乾重4mg胡蘿蔔素。如通過Southern分析所推斷，一個菌落、即MF633在GGW位點處含有單一質粒拷貝。其它菌落出現非同源或更複雜的整合。2E:產生表達八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶、八氫番茄紅素脫氫酶和香葉基香葉基焦磷酸合酶的解脂耶氏酵母:使MF364與MF578雜交，並且將來自所得二倍體的孢子接種於YPD上在3(TC下培養2到3天。通過PCR篩選存在"/p-carS、^/p-cariP和化介-GGS/的橙色Leu+Ade—Ura—菌落，且篩選在YPD培養基中生長後具有高類胡蘿蔔素產量(大於每克細胞乾重4mg)的菌落。選擇滿足這些標準並且展現對5-氟乳清酸的抗性(表明其具有"ra3-302等位基因)的菌落以供進一步研究，且在下文中將其稱為GBRPua菌株。選擇所述菌株以供進一步分析和修飾用。房,應謬汰^母—銀遊^萃歡類^蘿/v素使用YPD培養基(1%酵母萃取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖)對所產生的菌株進行搖瓶測試。在30。C下使125ml燒瓶中的20ml培養物生長。從72-96小時培養物中採集解脂耶氏酵母細胞，並且進行萃取以確定類胡蘿蔔素的形式和數量。將1.8ml培養物放入Eppdendorf管中。使細胞顆粒化，並用1mlH20洗滌兩次。第二次洗滌後，將再懸浮的細胞轉移到頂部具有刺孔的經預先稱重的卡口瓶蓋管(snap-captube)中，並且將細胞凍幹整夜。乾燥完成後，對管稱重以便計算細胞乾重。將0.25ml來自相同搖瓶的培養物放入2ml螺口瓶蓋管中以用於類胡蘿蔔素萃取。使細胞顆粒化，並且抽吸上清液。可在-80'C下冷凍並儲存球狀細胞。將等體積的立方氧化鋯顆粒和1ml冰冷的萃取溶劑(含有0.01%丁基羥基甲苯(BHT)的50/50v/v己烷與乙酸乙酯的混合物)加到細胞小球中。隨後在4'C下以最大速度攪動(Mini-BeadBeater-8，BioSpecProducts,Inc.)混合物5分鐘。接著，以最大速度使混合物旋轉1分鐘，並且收集上清液，且將其保藏於冷的16ml玻璃小瓶中。將剩餘細胞碎片再萃取至少3次，但未加入氧化鋯顆粒；將所有上清液都匯集於所述16ml玻璃小瓶中。萃取後，在4。C下於Sorva11臺式離心機中以2000rpm使玻璃小瓶旋轉5分鐘，並且將上清液轉移到新的冷16ml玻璃小瓶中。使用SpeedVac濃縮上清液(室溫下在暗處)，並且將樣本儲存於-2(rC或-80'C下直到即將進行HPLC分析。在進行HPLC分析前，將樣本再懸浮於1ml冰冷的溶劑中且隨後將其轉移到冷的琥珀色小瓶中。在整個方案中，需要注意避免與氧、光、熱和酸接觸。遞過朋LC著眾類遊蘿/v素遊產量為對類胡蘿蔔素進行分析，將樣本再懸浮於冰冷的萃取溶劑(含有0.01%丁基羥基甲苯(BHT)的50/50v/v己烷與乙酸乙酯的混合物)中。在25。C下，使用裝備有WatersXBridgeC18柱(3.5pm，2.1x50mm)禾口ThermoBasic8保護柱(2.1x10mm)的Alliance2795HPLC(Waters)拆分類胡蘿蔔素；將確認的類胡蘿蔔素樣本用作標準品。流動相和流動速率展不於下文中(溶劑A-乙酸乙酯；溶劑B-水；溶劑C:甲醇；溶劑D^乙腈)。注入體積為10pL。檢測器為Waters9%光電二極體陣列檢測器。親脂性分子的滯留時間包括蝦青素(1.159分鐘)、玉米黃素(1.335分鐘)、(3-阿樸-8'-胡蘿蔔醛(2.86分鐘)、麥角固醇(3.11分鐘)、番茄紅素(3.69分鐘)、P-胡蘿蔔素(4.02分鐘)和八氫番茄紅素(4.13分鐘)。蝦青素、玉米黃素、(3-阿樸-8'-胡蘿蔔醛、番茄紅素和(3-胡蘿蔔素是在475nm下檢測，而麥角固醇和八氫番茄紅素是在286nm下檢測。表28:親脂性分子的滯留時間tableseeoriginaldocumentpage44實辨5,i/MG-a^還嚴蘑遊薪短形^遊表達f/志類^蘿/v素產著潛》/7為增加類胡蘿蔔素產量，通過引入HMG-CoA還原酶基因的截短變異體來增加通過類異戊二烯路徑的碳流。在一種方法中，將HMG-CoA還原酶基因(其還編碼源自釀酒酵母菌Hmgl的77個胺基酸的前導序列)的截短變異體引入GRPBua菌株(如上文實例2E中所述)中。可在GRPBua菌株中用S加5/、S"C/或5犯36/裂解質粒pTefHMG以指引在We/位點處的整合，或用SamHI裂解以指引在HMG7位點處的整合，或用Eco/V裂解以促進隨機整合，從而使其恢復成腺嘌呤原養型。篩選類胡蘿蔔素產量增加的所得Ade+轉化株。或者，可在無如上文實例1D所述的釀酒酵母序列的情況下修飾來自解脂耶氏酵母的自然//MG7基因，從而得到pMB4637。可如關於pTefflMG所述對這一質粒進行消化，並且將其轉化到GRPBua菌株中，且如所述，篩選類胡蘿蔔素產量增加的所得轉化株。在另一種方法中，可利用粗糙鏈孢黴HMG-CoA還原酶基因的截短變異體，並且將其引入解脂耶氏酵母菌株中。為產生適於表達異源HMG-CoA還原酶的質粒，通過用G屍Z)啟動子代替/CX/啟動子並通過加入賦予腐草黴素(phleomycin)抗性的序列來對p641P(Yeast2001;18(2001):97-113)進行修飾。用以下兩種引物來擴增解脂耶氏酵母基因組DNA:GPDdist:5'CACACGGTacctgtaggttgggttgggtgGPDprox:5'CACACGGATCCtgtttaattcaagaatgaatatagagaagagaag，並且用Sam肌禾nK/m/裂解所得片段(0.7kb)，且將其與Sam/f/-和^n7-裂解的p641P接合，產生質粒"p641Pgpd"。隨後在鉤巢麴黴GPD啟動子的控制下，將We基因從pBCphleo(Silar,FungalGeneticsNewsletter42:73)切除'得到3.2kbJ5d/-Bam///片段，並以使flam/Z/位點與GPZ)啟動子最接近的方向將所述片段插入"p641Pgpd"中唯一的S纖H/位點中，得至ij"p641Pgpdble"。用以下兩種引物擴增粗糙鏈孢黴基因組DNA:Neuhmgfwd:5'CACACGGATCCACATCAACAatggcatctgccacccttccccNeuhmgrev:5'CACACGGATCcaagtgctgacgcggaacttg，且用^un肌裂解所得片段，並以正確的方向將其插入5a/nHI消化的"p641Pgpdble"中。所得質粒"pZg"含有在組成性GPD啟動子控制下編碼粗糙鏈孢黴羥甲基戊二醯輔酶A還原酶(Genebank寄存編號XP—324892)的截短型胞質催化結構域的序列。可將這一質粒引入上文實例2E中所產生的解脂耶氏酵母菌株中，並通過其對腐草黴素(100)ig/ml)的抗性選擇轉化株。如上文所述，測試所得轉化株的(3-胡蘿蔔素產量。實辨6../>素麥眾蘑*教,,f廚蘑基歷歹/乂產類遊,/>素遊,l,汰^母廣樣^"產全煮為將胡蘿蔔素羥化酶和胡蘿蔔素酮酶引入產類胡蘿蔔素的解脂耶氏酵母中，可依次將上文實例1E和1F中所述的pMB4692和pM4698引入GRPBua菌株(如實例2E中所述)中。為引入pMB4692,可用&//或^K/裂解質粒以指引在位點處的整合，或用J^a/裂解以促進隨機整合，從而選擇尿嘧啶原養型。篩選在YPD中產生玉米黃素的具有pMB4692的GRPBuaUra+轉化株。用pMB4698(其可經P;^Af/、或萬&vC/裂解以指引在"e/位點處的整合，或用EcoRV裂解以促進隨機整合)轉化產玉米黃素細胞，並且篩選產生蝦青素的原養型菌落。或者，質粒轉化的順序可顛倒，其中首先轉化pMB4698並且關於腺嘌呤原養型選擇轉化株。篩選產生角黃素的具有pMB4698的GRPBuaAde+轉化株。用pMB4692轉化產角黃素的GRPBua[pMB4698]細胞，並且篩選產生蝦青素的原養型菌落。在另一種方法中，可將來自副球菌的類胡蘿蔔素酮酶和類胡蘿蔔素羥化酶基因引入上文實例2中所述的菌株中，以便將f3-胡蘿蔔素轉化成蝦青素。用以下兩種引物擴增副球菌基因組DNA:CrtZfwd:5'CACACCGTCTCAAatgaccaatttcctgatcgtcgtcCrtZrev:5'CACACAGATCtcacgtgcgctcctgcgcc，且用S^iB/裂解所得片段，用DNA聚合酶的Klenow片段進行修飾，並用SgZ//裂解。將這一片段插入PmZ/-和5￡3附///-裂解的pINA1269(J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2(2000):207-216)中，所述質粒含有/z/^W啟動子、X屍72終止子、可選1￡[/2基因和在大腸桿菌中選擇和繁殖必需的序列。所得質粒"pA"含有在/z/^W啟動子控制下編碼副球菌(c"Z基因)(Genebank寄存編號CAB56060.1)胡蘿蔔素羥化酶的序列。"pYEGlTEF"是通過用L/P2終止子代替XPW2終止子如下進行修飾。用Aw//消化pINA1291，用DNA聚合酶的Klenow片段進行修飾並用Ecoi/裂解，且將含有ZJP2r的小片段與已經Sac//消化、在存在dNTP的情況下經T4DNA聚合酶修飾並經Eco尺/裂解的"pYEGlTEF"接合。將所得質粒稱為"pYEGlTEF-LIP2t"。為擴增類胡蘿蔔素酮酶基因，用以下兩種引物擴增副球菌基因組DNA:CrtWfwd:5'CACACCCTAGGCCatgagcgcacatgccctgcCrtWrev:5'CACACAAGCTTtcatgcggtgtcccccttg,且用Avr//和裂解所得片段，並將其插入Avr//-和裂解的"pYEGlTEF-LIP2t"中。所得質粒"pBt"含有在組成性T￡F/啟動子控制下編碼胡蘿蔔素酮酶(mW基因)(Genebank寄存編號CAB56059.1)的序列。為將兩個表達盒併入單一質粒中，將"pBt"用CZa/裂解，用DNA聚合酶的Klenow片段修飾，並用Eco//裂解，且分離含crtW的片段，將其與經A^f/裂解的磷酸化寡核苷酸接頭對混合5'AATTCGCGGCCGCT禾卩5'AGCGGCCGCG,並且將其與經WW/消化的"pA"接合。所得質粒"pABt"含有7TF/p/c"W/ZJ屍2f盒和/^4d/cWZ^T/2f盒以及可選擇的Z^f/2基因。可將"pABt"引入上文實例4中所述的解脂耶氏酵母菌株(TEi^p/aZ-//^3/^"/^4d/cari屍/L/屍2f,GPDp/ffilfGi教叛)中，並關於亮氨酸原養型選擇轉化株。實激7,編礙扇盡，會藤遊簏街,氏,母五iG9基歷遊敘分關活導遂類遊,/v素產量譜J77A.為使編碼角鯊烯合酶的基因部分失活，將相鄰的FOZJ基因中斷，從而引起對甲醯四氫葉酸的需求。隨後，用部分跨越所述兩個基因的突變誘發DNA片段轉化這一菌株，並且篩選角鯊烯合酶活性降低的Fol+轉化株。合成以下寡核苷酸弓I物K5'-CCTTCTAGTCGTACGTAGTCAGC;弓l物L5'-CCACTGATCTAGAATCTCTTTCTGG，並且將其用於使用P/"聚合酶進行的對跨越大部分屍OL3基因的2.3kb解脂耶氏酵母基因組DNA片段的擴增。將所得片段用裂解並磷酸化，隨後將其與已經7&"I裂解、在存在dNTP的情況下經T4DNA聚合酶(T4po1)處理且隨後經X&a/裂解的pBluescriptSK—接合。接著，將稱為pBS-fo13的所得質粒用Acc65/和￡coi/裂解，以如上所述的T4po1處理，並且將其與來自pMB4529的3,4kbEco/V-Spe/AZ)W片段(經T4po1處理)接合。可用Bs/W/和X&a/裂解所得質粒pBSfol3Aade以釋放5.5kb片段，使用所述片段將上文所述的GRBPua菌株轉化成腺嘌呤原養型。篩選需要甲醯四氫葉酸的所得Ade+轉化株，並且通過PCR分析篩選同源整合的所述轉化株。可用通過使用以下引物且以解脂耶氏酵母基因組DNA作為模板的突變誘發PCR擴增所產生的3.5kbDNA片段轉化具有所得/bOzUZ)E/等位基因的菌株引物M5'-GGCTCATTGCGCATGCTAACATCG;引物N5'-CGACGATGCTATGAGCTTCTAGACG。使用所得含有FOZJORF的N末端四分之三序列和￡iG9ORF的C末端十分之九序列的片段轉化菌株。通過對諸如薩拉哥酸、伊曲康唑(itraconazole)或氟康唑(fluconazole)的藥劑的敏感性篩選角鯊烯合酶活性降低的所得F01+Ade—轉化株。此外，篩選類胡蘿蔔素產量增加的所得轉化株。7B.或者，可克隆7A中所產生的PCR片段並且以移除基因的3'-未翻譯區域的方式加以改變。以此片段替代/b/WAZ)五7的中斷處將導致角鯊烯合酶表達減少[Schuldiner等人(2005),Cell123:507-519][Muhlrad和Parker(1999),RNA5:1299陽1307]，這可如7A中所述予以證實。這一方法也可用於使用標記中斷^G93'-UTR的Fol+Ade—菌株中。7C.在另一方法中，可使用質粒改組(plasmidshuffling)技術[Boeke等人(1987)，MethodsEnzymol.154:164-175]並且使用藥物敏感性作為表型來鑑別釀酒酵母中部分缺陷的i7G9等位基因。可使用標準分子遺傳學技術將缺陷型基因轉移到解脂耶氏酵母中。實激S,^類^/g二錄主笏會成競爭效多l遊,翁，必湮產類新蘿/v素嚴街,氏摩綠麥樣導資類教,/v素產蘆潛身如上文所述，用角鯊烯合酶抑制劑薩拉哥酸(0.5pM薩拉哥酸)處理實例2中所產生的培養物並監測卩-胡蘿蔔素的產量。實激9:/^^產浙激;^潔母^"樣在釀酒酵母菌株中過度表達編碼粗糙鏈孢黴ATP-檸檬酸裂解酶、釀酒酵母AMP脫氨酶和巻枝毛黴胞質蘋果酸酶的兩個亞單位的基因，以便增加總脂質含量。可將使用相同的同源或功能類似的產油多肽進行的增強脂質產量的類似方法用於諸如紅酵母(紅法夫酵母)的其它宿主生物體中。使用QiagenRNAEasy試劑盒(Qiagen，Valencia,CA.)由粗糙鏈孢黴培養物所製備的凍幹生物菌體來製備信使RNA。隨後，以含有mRNA模板和以下引物對中的任一者的兩個反應進行RT-PCR。acll:1fwd:5'CACACGGATCCTATAatgccttccgcaacgaccg1rev:5'CACACACTAGttaaatttggacctcaacacgaccc;acl2:2fwd:5'CACACGGATCCAATATAAatgtctgcgaagagcatcctcg2rev:5'CACACGCATGCttaagcttggaactccaccgcac。用^el和SamHI裂解由acll反應得到的片段，並且用SamHI和印/zI裂解由acl2反應得到的片段，且將兩個片段與已經W&I和S/^I消化的Yep24—起接合，得到質粒"pl2"。使用以下引物由釀酒酵母基因組DNA擴增雙向041/-/0啟動子gall0:5'CACACGGATCCaatmcaaaaattcttactttttttttggatggacgall:5'CACACGGATCCttttttctccttgacgttaaagtatagagg,且用Samm裂解所得0.67kb片段，並以任一方向將其與Bamffl消化的"pl2"接合以得至U"plgal2"禾口"plgall"，其分別含有GAL/-ac〃/O4ZJ0-ac/2和GAZJ0-ac/〃GAZJ-"c/2(Genebank寄存編號:ad/,CAB91740.2;ad2,CAB91741.2)。為擴增編碼AMP脫氨酶的釀酒酵母基因和適於表達此基因的啟動子，在單獨反應中使用以下兩個引物對擴增釀酒酵母基因組DNA:AMD1ORF:AMDlfwd:5'CACACGAGCTCAAAAatggacaatcaggctacacagagAMDlrev:5'CACACCCTAGGtcacttttcttcaatggttctcttgaaattgGAL7p:gal7prox:5'CACACGAGCTCggaatattcaactgtttttttttatcatgttgatggal7dist:5'CACACGGAtccttcttgaaaatatgcactctatatcttttag,且用S"cl和裂解由AMD1反應得到的片段(2.4kb),並且用SamHI和SpW裂解由GAL7反應得到的片段(0.7kb)，且將兩個片段與己經7V/zel和5amHI消化的YEp13一起接合，得到質粒"pAMPD"。這一質粒具有在半乳糖可誘導的GAL7啟動子控制下編碼AMP脫氨酶的釀酒酵母基因AMD7。如上文所述，由凍幹的巻枝毛黴生物菌體製備信使RNA並且將mRNA模板用於以兩種引物進行的RT-PCR反應中MAEfwd:5'CACACGCTAGCTACAAAatgttgtcactcaaacgcatagcaacMAErev:5'CACACGTCGACttaatgatctcggtatacgagaggaac，且用和SWI裂解所得片段，並且將其與X&I-和X/wI-消化的pRS413TEF(Mumberg，D等人(1995)Gene，156:119-122)接合，得到質粒"pTEFMAE"，其含有在組成性reF/啟動子控制下編碼巻枝毛黴胞質NADP+依賴性蘋果酸酶(E.C.1丄1.40;mce基因；Genebank寄存編號AY209191)的序列。將質粒"plgal2"、"pAMPD"和"pTEFMAE"依次轉化到釀酒酵母菌株中以保留尿嘧啶("plgal2")、亮氨酸("pAMPD")和組氨酸("pTEFMAE")原養型(Guthrie和FinkM"/io心！Vt五nz;ymotogy194:1-933,1991)。遵循在如實例3中所述的缺乏尿嘧啶、亮氨酸和組氨酸的合成完全(SC)培養基中或在2步驟發酵方法中進行的搖瓶測試，測試所得轉化株中的總脂質含量。在所述2步驟方法中，將1.5ml來自含有缺乏尿噴症、亮氨酸和組氨酸的SC培養基的整夜2ml旋轉管培養物中的細胞離心，以蒸餾水洗滌並且將其再懸浮於適於脂質積累的20ml限氮培養基(30g/L葡萄糖、1.5g/L酵母萃取物、0.5g/LNH4C1、7g/LKH2P04、5g/LNa2HP04-12H20、1.5g/LMgS04-7H20、0.08g/LFeCl3-6H20、0.01g/LZnS04-7H20、0.1g/LCaCl2-2H20、0.1mg/LMnS04-5H20、0.1mg/LCuS04-5H20、0.1mg/LCo(N03)2-6H20;pH5.5(JAmOilChemSoc70:891-894(1993)))中。使用螢光探針、尼羅紅(NileRed)分析經修飾和對照釀酒酵母菌株的胞內脂質含量(JMicrobiolMeth(2004)56:331-338)。簡單來說，用尼羅紅對在緩衝液中稀釋的細胞染色，在488nm下激發，並且獲取400nm-700run波長範圍內的螢光發射光譜，且將其與未經尼羅紅染色的細胞的相應光譜相比較。為證實由快速評估方法得到的結果，如所述，通過對由幹細胞直接轉甲基酯化得到的總脂肪酸進行氣相色譜分析來測定總脂質含量(ApplMicrobiolBiotechnol.2002Nov;60(3):275-80)。未經轉化的釀酒酵母菌株在YPD和脂質積累培養基中生長後分別產生6%和10%的總脂質(以細胞乾重計)。表達多種產油多肽的酵母菌株在YPD和脂質積累培養基中生長後分別產生17%和25%的總脂質。實激川，遊弄嚴教蘿/v素經眾磨歹M產類遊蘿/v素嚴箭,氏,淳薪葸樣^"產主J^見素用已經裂解的pMB4692轉化MF578(fe/-carif通過PCR分析推斷含有fe/-CtZ的若干Ura+菌落能夠在YPD搖瓶中產生玉米黃素，且在一種情況下，所有胡蘿蔔素都耗盡。本說明書全文參考以下各表表l.乙醯輔酶A羧化酶多肽的實例行Genbaiik寄存編號GenbankGI行Genbank寄存編號GenbankGI1XP4藝34909760641CAG08536472265202XP3295803241820442NP724636245864603XP3867564612440543NP610342245864584XP3677023997262344NP0010844501855XP5017215054850345NP446374167588046EAK997084644040246EAL63219604651207XP4572115041312847NP921034375334648NP9826124518489448T0708474380999XP4492365029364949AAP788963226494010NP5932711911418350AAO629032912337011NP014413632434351BAA07012110025312XP4553555031066752AAL020561555894713T425311127273753AAG405631186992714AAA2007317150454D864832529389415EAL201765025746955T07920743,16XP5713165826832056A57710213009917XP4022444術656657AA062卯22912337618S602002133343582208491A158858419BAA24410280417359T09538743810220P32874170819260CACI98751205706721S55089743808861AAP788973226494222NP卿8364538285962T02235743809523CAE014713252657663AAG40564118柳2824AAR37018400，4864E864832529389325NP001...5716428365CAC841612097557426NP7766492780634166T07081743809727CAI252715620587867CAC198761205706928XP鵬835182861129NP9421343867997130NP9421313867996031NP9421353867997432NP9421363867997733AAP941223311288534NP07152911559962352006242A74096436AAS136854240589637NP5986654897602538Q酒52柳31139XP5482505709178340XP31407158385597表2.丙酮酸脫羧酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage52tableseeoriginaldocumentpage53表4.ATP-檸檬酸裂解酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage53tableseeoriginaldocumentpage54表5.蘋果酸酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage54tableseeoriginaldocumentpage55tableseeoriginaldocumentpage56tableseeoriginaldocumentpage57tableseeoriginaldocumentpage58tableseeoriginaldocumentpage59tableseeoriginaldocumentpage60表9.HMG-CoA還原酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage61表io.甲羥戊酸激酶多肽的實例行Genbank寄存編號GenbankGI45XP5035585055216746XP5363235708480347XP57145058268588tableseeoriginaldocumentpage62tableseeoriginaldocumentpage63表12.甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage64tableseeoriginaldocumentpage65表13.IPP異構酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage66tableseeoriginaldocumentpage67表14.FPP合酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage68行Genbank寄存編號GenbankGI89CAA87327116017890BAD207294777623491BAC5387330頻4292BAB694901599131393NP9745654257293794CAA08918567860995AAP862673252773196AA0177353052295397AAK7願1464713998AAL733571847891999AA06355229124957100CA腿7156498227101NP70115523508486102XP—47418050929305103AAL7335818478922104EAH柳9544167328105NP49302717508563106CAE7171139580204107XP48722051766977表15.GGPP合酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage70tableseeoriginaldocumentpage71tableseeoriginaldocumentpage72tableseeoriginaldocumentpage73表n.八氫番茄紅素脫氫tableseeoriginaldocumentpage74tableseeoriginaldocumentpage75tableseeoriginaldocumentpage76tableseeoriginaldocumentpage77tableseeoriginaldocumentpage78表18.八氫番茄紅素合酶多肽和番茄紅素環化酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage79tableseeoriginaldocumentpage80tableseeoriginaldocumentpage81行Genbank寄存編號GenbankGI273ZP00245047575031274ZP00268048763469275ZP00271048766450276ZP00279148782680277ZP00289248832182278ZP00291648834623279ZP00303648849426280ZP00326948893702281ZP00335152007802282ZP00348753730362283ZP00350153759405284ZP00359153798896285ZP00362854030691表19.類胡蘿蔔素酮酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage83tableseeoriginaldocumentpage84表20.類胡蘿蔔素羥化酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage85tableseeoriginaldocumentpage86tableseeoriginaldocumentpage87tableseeoriginaldocumentpage88tableseeoriginaldocumentpage89tableseeoriginaldocumentpage90tableseeoriginaldocumentpage91表25.醯基輔酶A:二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage91tableseeoriginaldocumentpage92tableseeoriginaldocumentpage93tableseeoriginaldocumentpage94tableseeoriginaldocumentpage95表29:異戊二烯基二磷酸合酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage95tableseeoriginaldocumentpage96表30:PHB-聚異戊二烯基轉移酶多肽的實例tableseeoriginaldocumentpage96tableseeoriginaldocumentpage97所屬領域技術人員將認識到或僅使用常規實驗就能夠確定本文所述的本發明的特定實施例的許多等效內容。本發明的範圍不打算受限於上文的實施方式，而是如以下權利要求中所述。權利要求1.一種重組真菌，其特徵在於a.所述真菌因可以積累佔其細胞乾重至少約20％的脂質而為產油真菌；且b.所述真菌產生至少一種類胡蘿蔔素，並且其可積累佔其細胞乾重至少約1％的所產生的類胡蘿蔔素；其中所述真菌包含至少一種選自由產類胡蘿蔔素修飾、產油修飾和其組合組成的群組的修飾，且其中所述至少一種修飾改變所述真菌的產油能力、賦予所述真菌產油能力、賦予所述真菌產生佔其細胞乾重至少約1％的水平的所述至少一種類胡蘿蔔素的能力或賦予所述真菌產生至少一種所述真菌不會自然產生的類胡蘿蔔素的能力。2.根據權利要求l所述的真菌，其中所述真菌是自然產油的。3.根據權利要求1所述的真菌，其中所述真菌不是自然產油的。4.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的真菌，其中所述真菌不會自然產生所述至少一種類胡蘿蔔素。5.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的真菌，其中所述真菌自然產生所述至少--種類胡蘿蔔素。6.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的真菌，其中所述真菌不會自然產生至少一種類胡蘿蔔素。7.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的真菌，其中所述真菌自然產生至少一種類胡蘿蔔素。8.根據權利要求1所述的真菌，其中所述真菌是以單一細胞的形式生長。9.根據權利要求1所述的真菌，其中所述真菌為酵母。10.根據權利要求1至9中任一權利要求所述的真菌，其中所述真菌含有至少一種產油修飾。11.根據權利要求IO所述的真菌，其中所述至少一種產油修飾賦予所述真菌產油能力。12.根據權利要求10所述的真菌，其中所述至少一種產油修飾改變所述真菌的產油能力。13.根據權利要求IO所述的真菌，其中所述真菌另外包含至少一種產類胡蘿蔔素修飾，其中所述產類胡蘿蔔素修飾賦予所述真菌產生佔其細胞乾重至少約1%的水平的所述至少一種類胡蘿蔔素的能力，或賦予所述真菌產生至少一種所述真菌不會自然產生的類胡蘿蔔素的能力。14.根據權利要求10至13中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產油修飾增加至少一種產油多肽的表達或活性。15.根據權利要求10至13中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產油修飾降低至少一種產油多肽的表達或活性。16.根據權利要求10至13中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產油修飾增加至少一種產油多肽的表達或活性，並且降低至少一種其它產油多肽的表達或活性。17.根據權利要求11所述的真菌，其中所述真菌是紅酵母(X訓化叩/iy〃om;yc"deniiraWzows)(紅法夫酵母(P/z,z'ar/ioiioz;yma))。18.根據權利要求11所述的真菌，其中所述真菌是釀酒酵母(Sacc/zarom;yc"cerev"ae)。19.根據權利要求14或15所述的真菌，其中所述至少一種產油多肽選自由以下多肽組成的群組乙醯輔酶A羧化酶多肽、丙酮酸脫羧酶多肽、異檸檬酸脫氫酶多肽、ATP-檸檬酸裂解酶多肽、蘋果酸酶多肽、AMP脫氨酶多肽和其組合。20.根據權利要求14或15所述的真菌，其中所述至少一種產油多肽為至少一種選自由表1到表6中任一表中的多肽組成的群組的多肽。21.根據權利要求14至16中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產油修飾包含在所述真菌中表達至少一種異源產油多肽。22.根據權利要求21所述的真菌，其中所述至少一種產油修飾包含表達至少一種編碼所述至少一種異源產油多肽的異源基因。23.根據權利要求21所述的真菌，其中所述至少一種異源產油多肽包含動物多肽、哺乳動物多肽、昆蟲多肽、植物多肽、真菌多肽、酵母多肽、藻類多肽、細菌多肽、藍藻多肽、古細菌多肽或原生動物多肽。24.根據權利要求21所述的真菌，其中所述至少一種異源產油多肽包含至少兩種異源產油多肽。25.根據權利要求24所述的真菌，其中所述至少兩種異源產油多肽是來自單一原始生物體。26.根據權利要求24所述的真菌，其中所述至少兩種異源產油多肽是來自至少兩種不同的原始生物體。27.根據權利要求1至9中任一權利要求所述的真菌，其中所述真菌含有至少一種產類胡蘿蔔素修飾。28.根據權利要求27所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾賦予所述真菌產生佔其細胞乾重至少約1%的水平的所述至少一種類胡蘿蔔素的能力。29.根據權利要求27所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾賦予所述真菌產生至少一種所述真菌不會自然產生的類胡蘿蔔素的能力。30.根據權利要求27所述的真菌，其中所述真菌另外包含至少一種產油修飾，其中所述產油修飾改變所述真菌的產油能力或賦予所述真菌產油能力。31.根據權利要求27至30中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾賦予所述真菌產生選自由達到佔所述真菌的細胞乾重的以下水平組成的群組的所述至少一種類胡蘿蔔素的能力至少約2%、至少約3%、至少約5%和至少約10%。32.根據權利要求27至31中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種類胡蘿蔔素選自由蝦青素、f3-胡蘿蔔素、角黃素、玉米黃素、葉黃素、番茄紅素和其組合組成的群組。33.根據權利要求27至31中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種類胡蘿蔔素主要為蝦青素。34.根據權利要求27至31中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾增加產類胡蘿蔔素多肽的表達或活性。35.根據權利要求27至31中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾降低產類胡蘿蔔素多肽的表達或活性。36.根據權利要求27至31中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾增加至少一種產類胡蘿蔔素多肽的表達或活性並且降低至少一種其它產類胡蘿蔔素多肽的表達或活性。37.根據權利要求34至36中任一權利要求所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾包含表達至少一種異源產類胡蘿蔔素多肽。38.根據權利要求37所述的真菌，其中所述至少一種產類胡蘿蔔素修飾包含表達至少一種編碼所述至少一種異源產類胡蘿蔔素多肽的異源基因。39.根據權利要求34或35所述的真菌，其中所述產類胡蘿蔔素多肽選自由以下多肽組成的群組類異戊二烯生物合成多肽、類胡蘿蔔素生物合成多肽、類異戊二烯生物合成競爭劑多肽和其組合。40.根據權利要求39所述的真菌，其中所述類異戊二烯生物合成多肽選自由以下多肽組成的群組乙醯乙醯輔酶A硫解酶多肽、HMG-CoA合酶多肽、HMG-CoA還原酶多肽、甲羥戊酸激酶多肽、磷酸甲羥戊酸激酶多肽、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶多肽、IPP異構酶多肽、FPP合酶多肽和GGPP合酶多肽。41.根據權利要求39所述的真菌，其中所述類胡蘿蔔素生物合成多肽選自由以下多肽組成的群組八氫番茄紅素合酶多肽、八氫番茄紅素脫氫酶多肽、番茄紅素環化酶多肽、類胡蘿蔔素酮酶多肽、類胡蘿蔔素羥化酶多肽、蝦青素合酶多肽、類胡蘿蔔素s羥化酶多肽、類胡蘿蔔素葡糖基轉移酶多肽、番茄紅素環化酶(P和s亞單位)多肽和醯基輔酶A:二醯基甘油醯基轉移酶多肽。42.根據權利要求39所述的真菌，其中所述類異戊二烯生物合成競爭劑多肽選自由角鯊烯合酶多肽、異戊二烯基二磷酸合酶和PHB聚異戊二烯基轉移酶組成的群組。43.根據權利要求39所述的真菌，其中所述產類胡蘿蔔素多肽選自由表7-25、表29和表30中任一表中的多肽中的任一種和其組合組成的群組。44.根據權利要求37所述的真菌，其中所述至少一種異源產類胡蘿蔔素多肽包含動物多肽、哺乳動物多肽、昆蟲多肽、植物多肽、真菌多肽、酵母多肽、藻類多肽、細菌多肽、藍藻多肽、古細菌多肽或原生動物多肽。45.根據權利要求37所述的真菌，其中所述至少一種異源產類胡蘿蔔素多肽包含至少兩種異源產類胡蘿蔔素多肽。46.根據權利要求45所述的真菌，其中所述至少兩種異源產類胡蘿蔔素多肽是來自單一原始生物體。47.根據權利要求45所述的真菌，其中所述至少兩種異源產類胡蘿蔔素多肽是來自至少兩種不同的原始生物體。48.根據前述權利要求中任一權利要求所述的真菌，其中所述真菌積累所產生的至少一種類胡蘿蔔素達到選自由以下水平組成的群組的水平佔所述真菌的細胞乾重大於約1%、大於約2%、大於約3%、大於約5%和大於約10%。49.根據前述權利要求中任一權利要求所述的真菌，其特徵在於所述真菌積累細胞質體形式的脂質。50.根據權利要求49所述的真菌，其中所述至少一種類胡蘿蔔素積累於所述細胞質油體中。51.—種解脂耶氏酵母(KirravWaZ^o一〖c。)菌株，其包含一種或一種以上選自由產油修飾、產類胡蘿蔔素修飾和其組合組成的群組的修飾，使得所述菌株積累佔其細胞乾重1%到10%的至少一種類胡蘿蔔素。52.根據權利要求51所述的菌株，其另一特徵在於，其積累佔其細胞乾重20%到50%的脂質。53.根據權利要求52所述的菌株，其中所述菌株積累佔其細胞乾重20%到50%的細胞質油體形式的脂質。54.根據權利要求51所述的菌株，其中所述菌株包含選自由以下修飾組成的群組的產類胡蘿蔔素修飾a.表達選自由以下多肽組成的群組的多肽缺乏N端跨膜結構域的截短型內源HMG-CoA還原酶多肽、乙醯乙醯輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、FPP合酶和GGPP合酶；b.表達選自由以下多肽組成的群組的異源多肽八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶、番茄紅素環化酶、類胡蘿蔔素酮酶、類胡蘿蔔素羥化酶和其組合；c.降低選自由以下多肽組成的群組的內源多肽的表達或活性角鯊烯合酶多肽、異戊二烯基二磷酸合酶多肽和PHB聚異戊二烯基轉移酶多肽；和其組合。55.根據權利要求51至54中任一權利要求所述的菌株，其中所述菌株積累佔其細胞乾重1%-10%的(3-胡蘿蔔素。56.根據權利要求51所述的菌株，其中所述菌株包含選自由以下修飾組成的群組的產類胡蘿蔔素修飾a.表達選自由以下多肽組成的群組的多肽缺乏N端跨膜結構域的截短型內源HMG-CoA還原酶多肽、乙醯乙醯輔酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、FPP合酶和GGPP合酶；b.表達選自由以下多肽組成的群組的異源多肽八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶、番茄紅素環化酶、類胡蘿蔔素酮酶、類胡蘿蔔素羥化酶、蝦青素合酶、類胡蘿蔔素s羥化酶、番茄紅素環化酶((3和s亞單位)、類胡蘿蔔素葡糖基轉移酶、醯基輔酶A:二醯基甘油醯基轉移酶和其組合；c.降低內源角鯊烯合酶多肽的表達或活性；和其組合。57.根據權利要求51至53或56中任一權利要求所述的菌株，其中所述菌株積累佔其細胞千重1%-10%的奸青素或葉黃素。58.—種產生類胡蘿蔔素的方法，所述方法包含以下步驟a.在允許產生所述類胡蘿蔔素的條件下，培養前述權利要求中任一權利要求所述的真菌；b.和分離所述所產生的類胡蘿蔔素。59.根據權利要求58所述的方法，其中所述分離步驟包含分離培養基以獲得至少一個富含類胡蘿蔔素的部分。60.根據權利要求58所述的方法，其中所述培養步驟包含在允許將所述類胡蘿蔔素積累於細胞質油體中的條件下培養所述真菌，且所述分離步驟包含分離從所述細胞質油體得到的油。61.根據權利要求5S所述的方法，其中所述類胡蘿蔔素選自由以下物質組成的群組蝦青素、P-胡蘿蔔素、角黃素、玉米黃素、葉黃素、番茄紅素和其組合。62.根據權利要求58所述的方法，其中所述類胡蘿蔔素包含蝦青素。63.—種製備含有類胡蘿蔔素的食品或詞料添加劑的方法，所述方法包含以下步驟a.在允許產生所述類胡蘿蔔素的條件下，培養權利要求1至57中任一權利要求所述的真菌；b.分離所述類胡蘿蔔素；和c.將所述經分離的類胡蘿蔔素與一種或一種以上其它食品或飼料添加劑組分組全文摘要本發明提供用於生產表達類胡蘿蔔素的經工程設計的產油酵母或真菌的系統。文檔編號C12P23/00GK101218352SQ200680008816公開日2008年7月9日申請日期2006年3月20日優先權日2005年3月18日發明者喬舒亞·特魯哈特,凱文·T·馬登,理察·貝利申請人:米克羅比亞精確工程公司