新型雙功能抗瘢痕和組織纖維化寡聚核苷酸藥物的製作方法

2023-09-15 23:29:45 2

專利名稱：新型雙功能抗瘢痕和組織纖維化寡聚核苷酸藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種抗瘢痕和組織纖維化治療用的誘騙寡聚 核苷酸，更具體而言，涉及一種能夠同時與轉錄因子活化蛋白-KActivator protein-1, AP-1)和Smad3特異結合併抑制這兩個轉錄因子活性的誘騙寡聚核苷酸。本發明還涉及這 種寡聚核苷酸的製備及其在治療瘢痕和組織纖維化疾病中的應用。
背景技術：
病理性瘢痕是創面過度修復和組織纖維化的結果，不僅影響美觀，且可導致組織 和器官不同程度的功能障礙，甚至是某些疾病治療失敗的主要原因，如抗青光眼濾過術後， 濾過泡瘢痕的形成是導致抗青光眼手術失敗的主要原因。輸卵管阻塞再通術後瘢痕形成、 腹腔術後形成腸粘連致腸梗阻，以及因炎性等刺激因素所致的腎纖維化和肝纖維化等疾病 的發生均與組織過度修復和纖維化相關。因此，針對受創後組織過度修復和組織纖維化的 形成機制，設計、研發並製備治療病理性瘢痕和組織纖維化疾病的藥物成為本領域的研究 執佔之一。目前用於治療病理性瘢痕和組織纖維化的主要措施包括以下幾個方面(1)細胞 因子抑制劑如TGF-β 2的單克隆抗體、TGF-β 2受體阻滯劑、核心蛋白多糖(Decorin)、 TGF-β 2反義寡核苷酸(OGN)、IL-I受體阻斷劑、整合素抗體等；(2)抑制成纖維細胞的 增殖與遷移如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、絲裂黴素c(MMC)、伊洛馬司他(ilomastat)、蘇拉明 (Suramin)、光動力療法、β射線局部照射、Ρ21基因轉染等方法；(3)抑制早期炎症的發 生包括皮質類固醇及非激素類消炎藥兩類；(4)抑制膠原合成與收縮如β氨基丙腈 (β APN)、D青黴胺等；(5)增加細胞外基質的降解如組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、尿激 酶、肝素等；(6) —些中藥製劑抑制成纖維細胞的增殖如丹參、苦參鹼、川芎和積雪苷等。上述抗瘢痕和組織纖維化藥物對過渡性瘢痕形成和組織纖維化的治療具有一定 的療效，但也存在一些無法迴避的問題，如5-氟尿嘧啶和絲裂黴素是很強的細胞有絲分裂 抑制劑，毒副作用較大，可造成傷口不癒合等一些嚴重併發症；而針對TGF-β 2的抑制劑是 抗瘢痕和纖維化的研究熱點，雖然其也可減輕瘢痕的形成和組織纖維化，但也存在明顯不 足，首先，其不能抑制TGF-β 1和TGF-i3 3介導的瘢痕化和纖維化作用；其次，我們知道瘢痕 形成和纖維化是多個細胞因子綜合作用的結果，阻斷單一細胞因子的生物學效應並不能達 到徹底減少瘢痕形成和纖維化的目的；此外，如針對膠原等細胞外基質的合成與降解的藥 物，由於其不能消除細胞外基質合成的始動因素，以及阻滯成纖維細胞的增殖效應，其抗瘢 痕和纖維化的作用也就受到了限制。綜上所述，為了預防病理性瘢痕的形成和組織纖維化， 必須以病理性瘢痕形成和組織纖維化的關鍵環節為突破口，尋找特異高效的抗瘢痕和纖維 化藥物。傷口癒合是一個錯綜複雜的生物學過程，包括炎症產生、細胞增生、纖維組織增生 和組織重塑(瘢痕形成)四個階段。細胞因子在傷口癒合過程中佔有非常重要的作用，參與 傷口癒合的全過程，眾多的細胞因子形成網絡，共同調控成纖維細胞等各種效應細胞的增生和代謝活動，維持膠原等細胞外基質沉積與降解 之間的動態平衡，並對表皮細胞和血管內皮細胞的增殖、遷移和凋亡活動進行有秩序地調 節。正性和負性的細胞因子在調節傷口癒合的過程中保持平衡狀態，一旦平衡被打破，則會 出現增生性瘢痕或不癒合等病理性癒合。比如，伴有過渡炎症反應的傷口，由於IL-1、IL_6 等炎症因子大量分泌，造成細胞因子之間的平衡失調，最終導致增生性瘢痕的形成。TGF-β (transforming growth factor-β，TGF-β )是組織纖維化、創傷修復及 瘢痕形成的關鍵調控分子之一。研究表明，活化的TGF-β可通過與細胞膜上具有絲/蘇 氨酸激酶活性的TGF-β I型和II型受體結合，形成三聚體複合物，後誘導I型受體磷酸 化。磷酸化的I型受體特異性地識別並磷酸化激活TGF-β信號通路的胞內信號分子-Smad 蛋白家族中的受體調節型 Smads (Receptor-regulated Smads, R-Smads)(包括 Smad2 和 Smad3)，活化的R-Smads與Co-Smad (即Smad4)結合成為轉錄複合物，並進入細胞核內，直 接與靶基因啟動子或增強子內的一個回紋結構DNA序列(5' -GTCTAGAC-3')順式作用元 件，即Smad結合元件(Smad-binding element, SBE)特異性結合，調節TGF-β反應性靶基 因的轉錄和表達。已證實，許多參與傷口癒合和瘢痕形成的基因，如纖溶酶原激活劑抑制 物-I(PAI-I)、血小板源性生長因子(PDGF)、結締組織生長因子(CTGF)、纖維結合素、I型 和III型膠原等基因的增強子或啟動子內，均含有SBE反應元件。Smad轉錄複合物可直接上 調這些基因的轉錄和表達。另外，Smad轉錄複合物還可通過與AP-I (c-Fos和c_Jim)、FAST/ R)xH、ATF2、VDR等DNA結合蛋白(即轉錄因子)結合，與這些轉錄因子的信號通路發生交 互作用(Cross-talk)，以間接方式，調節TGF-β反應性基因的轉錄和表達，且這種間接方 式是TGF-β信號通路的主要調節方式。研究發現，Smad3的抑制劑柚皮素(Naringenin) 可明顯減弱TGF-β誘導的鼠肝星形細胞合成I型膠原、纖維連接蛋白和PAI-I等細胞外 基質的能力。此外，Smad3基因缺失小鼠肺泡纖維明顯減少，肺泡腔呈現進行性擴大，且將 TGF-β 1轉染入肺組織也不能誘導肺的纖維化。另外，值得注意的是，TGF-β信號通路除了 通過Smad信號通路轉導外，還可通過絲裂素蛋白活化激酶信號途徑(MAPK)介導，活化AP-I 等轉錄因子，調控靶基因的表達。活化蛋白-l(activator protein-1，ΑΡ-1)是一類由Fos蛋白和Jun蛋白同源 或異源二聚體組成的轉錄因子，能以許多基因啟動子或增強子內順式作用元件AP-I位 點(5' -TGAGTGA-3')，即佛波酯反應元件結合，參與介導多種與炎症、細胞增殖、組織纖 維化和細胞外基質沉積等相關基因的轉錄和表達。在傷口癒合的過程中，許多細胞因子 (TGF- β、PDGF, EGF、bFGF、IL-I、TNF 等)都能通過 MAPK 信號通路激活 AP-I，活化的 AP-I 進入細胞核內調節靶基因的表達。目前已證實，參與傷口癒合和瘢痕形成的許多基因，如 TGF-β、IL-I β、IL-8、ICAM-I、絲狀分裂控制蛋白_1 (MCP-I)、細胞周期素D1、纖維連接蛋 白、層粘連蛋白B、I型膠原、金屬蛋白酶組織抑制物-I(TIMP-I)等基因的啟動子或增強子 內均含有AP-I位點，其可調控這些基因的轉錄和表達。抑制AP-I的信號通路，可明顯減少 增生性瘢痕的形成和組織纖維化。綜上所述，Smad信號通路和AP-I信號通路是兩條與傷口癒合、瘢痕形成和組織纖 維化關係最為密切的信號通路。Smad信號通路主要參與TGF-β誘導的應答反應，還可上調 Ap-I的JunB亞基轉錄和表達，以及與c-Fos和c-Jun亞基結合，協助AP-I誘導與傷口癒合 和瘢痕形成相關基因的表達。而AP-I信號通路則是許多刺激因素的共同信使傳導分子，不僅介導傷口癒合早期的炎症反應相關基因的表達，還是傷口癒合和瘢痕形成相關基因的調 控者。此外，AP-I是傷口癒合和瘢痕形成過程中信號放大效應的始動者，其可被TGF-β活 化，而活化的AP-I又可上調TGF-β的表達，由此放大傷口癒合的信號。總之，Smad和AP-I 兩條信號通路相互協調，共同參與介導了傷口癒合和瘢痕的形成。由此，我們認為，如能同 時成功抑制這兩條信號通路，將能有效抑制傷口癒合過程中病理性瘢痕的形成和組織纖維 化。目前，同時針對這兩條信號通路的抑制劑國內外均未見報導。從Smads和AP-I的活化途徑不難看出，Smads和AP-I與靶基因啟動子或增強子內 的DNA順式作用元件結合是特異性的，只有直接幹預Smads和AP-I與DNA順式作用元件相 結合，才能達到真正意義上的特異性控制瘢痕的形成和組織纖維化，有效阻滯增生性瘢痕 形成和組織纖維化過程中的信號放大效應和成纖維細胞的過度增殖，減少細胞外基質的過 度合成，同時加強細胞外基質的降解速度。而對Smads和AP-I活化的上下遊途徑進行幹預 則難以達到這一目的。此外，在尋找阻斷Smads和AP-I的活化策略時，應把握「適度抑制」 原則，而不是「完全封閉/永久阻斷」。故研製特異性的Smads和AP-I抑制劑(而不是阻斷 劑)將為最終獲得高效、低副作用的理想抗瘢痕藥物提供可能。而應用轉錄因子「誘騙」策 略可達到同時拮抗Smads和AP-I活化的目的，且這一策略是實現這一理想治療病理性瘢痕 形成和組織纖維化的最佳選擇之一。自1996年第一個經美國FDA批准的轉錄因子E2F 「誘騙」策略(decoy strategy) 用於治療血管旁路移植術後新生內膜增生(neointimal hyperplasia in vein bypass grafts)病人以來，許多研究已經報導了該策略作為體內基因治療的效果。其基本原理是 合成與順式作用元件相一致的雙鏈寡聚脫氧核苷酸(被稱為誘騙ODNs)，轉染入細胞，競爭 性抑制轉錄因子與順式作用元件的結合，幹擾轉錄因子的DNA結合活性及其後續基因的表 達。由於該策略具有以下優點(1)潛在的藥物靶點(轉錄因子)；( 誘騙ODNs的合成相 對簡單且可靶向特異的組織；(3)不必弄清轉錄因子靶分子的精確分子結構；(4)誘騙ODNs 可阻斷與同一順式作用元件結合的多種轉錄因子的效應，且也可阻斷同一轉錄因子所調控 的多個靶基因的表達，其作用能力比反義ODNs更強。因此國外眾多學者一致認為該策略可 作為治療某些人類疾病一種有效的手段。目前，有關單獨靶向Smad或者AP-I的「誘騙」策 略，已應用於探討Smad和AP-I在癌症、心血管和腎臟等相關疾病中的作用機制，以及對這 些疾病的治療性研究，體外實驗和動物試驗結果已顯示出確切而誘人的結果。這與該策略 具有拮抗Smad或AP-I活性的特異性、競爭抑制性(不是完全阻斷)、使用時間及劑量的可 控性等特性有關。為此，我們以介導瘢痕形成和組織纖維化的關鍵調控分子Smads和AP-I為靶點， 應用核轉錄因子的誘騙策略，設計併合成可同時與Smad和AP-I結合，並具有同時抑制兩種 轉錄因子轉錄活性的雙功能誘騙寡核苷酸，同時證實此寡核苷酸能高效抑制成纖維細胞的 增殖，膠原的合成，有效阻止瘢痕的形成和組織纖維化。

發明內容
本發明的目的在於提供一種抗瘢痕和組織纖維化的核酸藥物。本發明所述藥物包含既能與AP-I高親和結合的AP-I順式作用元件，又能與Smad 高親和結合的Smad順式作用元件的雙鏈誘騙寡核苷酸。
其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括核心序列TGACXTCAGACA或CAGACATGACXTCA或 GTCTAGACTGACXTCA或其功能等價物，其中所述核苷酸序列中，X代表G或者缺失。其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括序列TGACGTCAGACA或TGACTCAGACA或其功能等 價物。其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括序列CAGACATGACGTCA或CAGACATGACTCA或其功 能等價物。其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括序列GTCTAGACTGACGTCA或GTCTAGACTGACTCA或 其功能等價物。優選的核酸，序列如下:ASCES101A 序列2 ；ASCES101B 序列3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ；ASCES102B 序列 9 ；ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。本發明是一系列序列特異的誘騙核酸，可特異性結合轉錄調控因子。本發明的藥 物通過下調smad和AP-I的轉錄活性，從而抑制成纖維細胞的過度增殖，以及細胞外膠原等 基質的分泌，達到治療病理性瘢痕和組織纖維化的目的。為此，本發明另一個目的在於，本發明的核酸在製備抗AP-I和Smad轉錄活性的藥 物中的應用。所述抗AP-I和Smad轉錄活性的藥物是治療AP-I和Smad異常表達或活化引 起的瘢痕化和組織纖維化相關疾病的藥物；所述藥物是治療纖維化疾病、異常傷口癒合、異 常骨生成、免疫/炎症相關疾病或抗青光眼濾過性手術後抗癒合的藥物。本發明的目的可通過以下措施來達到抗瘢痕和組織纖維化藥物的設計是將轉錄因子特異結合的序列作為藥物誘騙核 酸的核心序列，並適當增加核心序列的側翼長度，使其易形成空間結構，以加強藥物的穩定 性及與靶因子的親和力。藥物ASCES101、ASCES102和ASCES103系列是為調控AP-I和Smads的過度活化 而設計。將轉錄因子AP-I順式作用元件和轉錄因子Smads順式作用元件以不同的先後順 序融合成交錯重疊的寡核苷酸TGA(C/G)TCAGACA(序列1)、CAGACATGACGTCA(序列6)和 GTCTAGACTGACGTCA(序列10)，以這些寡核苷酸作為藥物誘騙核酸的核心序列，競爭結合 AP-I和Smads，抑制AP-I和Smads的轉錄活性，下調含AP-I和Smads增強子基因的表達， 從而抑制成纖維細胞的增殖、生長和細胞外基質的分泌，達到治療病理性瘢痕和組織纖維 化的目的。例如藥物ASCES101A由30個核苷酸的序列2組成，含上述核心序列1，並能通 過自身配對形成雙鏈線性DNA結構。藥物ASCES101B由28個核苷酸的序列3組成，含上述 核心序列1，並能通過自身配對形成雙鏈線性DNA結構。藥物ASCES101C由44個核苷酸組 成的序列4組成，含上述核心序列1，通過自身環化配對形成一個雙鏈DNA髮夾結構。藥物 ASCES101D由42個核苷酸組成的序列5形成，含上述核心序列1，通過自身環化配對形成一 個雙鏈DNA髮夾結構。藥物ASCES102A由M個核苷酸的序列7和8組成，含上述核心序列 6，兩個序列配對結合成雙鏈線性DNA結構。藥物ASCES102B由44個核苷酸的序列9組成， 含上述核心序列6，通過自身環化成雙鏈DNA髮夾結構。藥物ASCES103A由沈個核苷酸組 成的序列11和序列12組成，含上述核心序列10，兩個序列配對結合成雙鏈線性DNA結構。 藥物ASCES1(X3B由46個核苷酸組成的序列13形成，含上述核心序列10，通過自身環化配對 形成一個雙鏈DNA髮夾結構。總之，這些誘騙核酸藥物，可以設計為以AP-I和Smads順式作用元件交錯形成的序列為核心序列，核苷酸總數為12-46個，並易形成線性、髮夾、假結、 莖環、啞鈴等多種結構的雙鏈寡聚DNA分子。誘騙核酸藥物經DNA全自動合成儀合成，硫代化，脫保護，純化和凍幹，溶於水中， 定性定量測定分析後，進行體外篩選和藥效試驗，用成纖維細胞作為篩選體系，將細 胞加入96孔培養板，用RPMI1640完全培養液培養24h後，加入脂質體和上述誘騙核酸，繼 續於37°C，5%C02中培養48h。用ATP生物素螢光法測定細胞的增殖。篩選結果表明8種 誘騙核酸對細胞均有不同程度的抑制作用，其中ASCES101D的抑制作用最大。這些誘 騙核酸均可開發成為抗瘢痕和組織纖維化藥物。具有上述核苷酸核心序列結構的寡聚誘騙DNA可同時與AP-I和Smads結合，並抑 制AP-I和Smads與其順式作用元件的結合，從而抑制AP-I和Smads的轉錄活性，即抑制 AP-I和Smads調控各種含其順式作用元件的靶基因表達。此種結構寡聚誘騙DNA既可以以 DNA形式單獨存在，也可與其它核酸和多肽融和，或被甲基化、硫代化、鎖核酸化和硼烷磷酸 酯化等修飾，或進行個別鹼基的突變、缺失或替代，或與其它物質連接。無論以什麼形式存 在，含此結構DNA的物質可能表現出與AP-I和Smads結合，並抑制AP-I和Smads生物學活 性的作用。本發明通過細胞增殖試驗篩選，獲得的DNA不僅能夠競爭性阻斷AP-I與其順式作 用元件的結合，也能夠抑制Smad與其順式作用元件的結合，進而抑制含AP-I和Smads順式 作用元件的靶基因的表達，具有抗瘢痕和組織纖維化的功能，因而可以成為新的靶向AP-I 和Smads的抗瘢痕和組織纖維化藥物或藥物前體。本發明的DNA可以用於治療各種瘢痕和 組織纖維化相關疾病。可以將其作為藥物活性成分製備成藥物組合物，該組合物根據需要 可以加入一些藥物可接受的載體，可以採用製劑學常規技術製備該組合物，本發明的組合 物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優選的組合物是單位劑量的納米型噴霧劑、注射劑和軟 膏形式。本發明的誘騙DNA可通過化學方式合成，也可將含此序列的核苷酸與其它核酸或 多肽融合或進行化學修飾，用於抑制AP-I和Smads活性為目的的各種瘢痕相關疾病、各種 纖維化疾病以及其它相關疾病的治療，這對於設計和研製同時靶向AP-I和Smads的高效特 異抗瘢痕和組織纖維化藥物具有重要意義。本發明的優點與反義核酸和SiRNA相比，無論是作用機理還是作用效率，誘騙核酸均有著明顯 的差異結構存在明顯差異，反義核酸和siRNA為單鏈線性寡聚核酸，誘騙核酸是具有二級 結構的雙鏈DNA ；作用位點也存在明顯的差異，反義核酸和siRNA互補於靶基因的轉錄產物 mRNA的某段序列，而誘騙核酸則直接結合於轉錄因子(蛋白質)上；另外，用量上也存在明 顯的差異，一個拷貝基因可轉錄出200-300條mRNA，且mRNA具有瞬時性，需要大量的反義核 酸和siRNA才能達到抑制靶基因表達的目的。相反，一種轉錄因子可控制多種效應基因的 轉錄，且可被循環利用轉錄生成多拷貝的效應基因mRNA，然而一個拷貝的轉錄因子僅需要 一個拷貝誘騙分子即能封阻轉錄因子的活性，因此相對而言，誘騙核酸藥的用量較反義核 酸和siRNA的用量將少1-2個數量級。值得注意的是，因誘騙核酸的核心序列一般在6-12個鹼基對之間，鏈短易降解， 雙鏈不穩定，常溫下易解鏈。而無二級空間結構的誘騙核酸則不易與轉錄因子蛋白結合，因 此設計藥物時需要適當增加鹼基，加長鏈長，增強穩定性及與轉錄因子的親和性，其中以迴文結構、髮夾、十字、莖環和啞鈴狀等結構最佳。本發明將靶向AP-I和Smads的誘騙核酸有 機融合成一個核酸分子，如此一定程度上增加了誘騙核酸的長度，且這種長度的增加並不 是為了增加誘騙核酸長度，進而添加無效核酸序列，而是在增加長度的同時，賦予了誘騙核 酸的新功能。與若各自設計併合成AP-I和Smads的誘騙核酸，後將其混合成組合藥相比， 一方面減少了無效鹼基的參入量，節約了藥物合成的成本。另一方面又能避免兩種誘騙核 酸間可能相互交錯配對形成無效二聚體，而降低誘騙核酸的效用。另外，本發明在設計上 也充分考慮誘騙核酸的二級結構及其穩定性，因此誘騙核酸被設計成含有上述核心序列的 14-46鹼基之間，可合成出單鏈，自交形成雙鏈及其二級結構，也可各合成兩條單鏈，雜交形 成雙鏈。另外，因核酸在細胞內極易被核酸酶降解失去活性，因此需修飾保護，以增強其抗 降解能力，提高穩定性。硫代修飾為最常見的保護基團。本發明的另一目的是提供一種含有本發明誘騙核酸藥物的藥物組合物。本發明的誘騙核酸藥物可以將其作為藥物活性成分製備成藥物組合物，該組合物 根據需要可以加入一些藥物可接受的藥用載體，製備成任何藥用的劑型。其中，所述藥物活 性成分佔製劑總重量的0. 1-99. 9%，所述藥學上可接受的載體以重量計可以是製劑總重量 的0. 1-99. 9%。所述藥用載體包括生理鹽水等常用載體和緩衝液、脂質體、聚合物等，可以 採用製劑學常規技術製備該組合物。本發明的組合物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優選 的組合物是單位劑量的納米型噴霧劑、注射劑和軟膏形式。本發明所述的靶向AP-I和Smad 的誘騙核酸藥物對纖維細胞的增殖、生長和胞外基質分泌均有抑制作用，在製造抗瘢痕和 組織纖維化藥物中具有廣泛的應用價值及廣闊的市場前景。


圖1為ASCES系列誘騙核酸對TGF-1和TGF-2誘導的成纖維細胞的生長抑 制結果。圖2A為ELISA方法檢測ASCES系列誘騙核酸對AP-I與其順式作用元件結合競爭 性抑制實驗的結果。圖2B為ELISA方法檢測ASCES系列誘騙核酸對Smad與其順式作用元件結合競爭 性抑制實驗的結果。表1為流式細胞儀檢測ASCES系列誘騙核酸對TGF-I誘導的成纖維細胞細胞周期 影響的實驗結果表2為流式細胞儀檢測ASCES系列誘騙核酸對TGF-2誘導的成纖維細胞細胞周期 影響的實驗結果圖3A螢光素酶報告基因實驗檢測誘騙核酸對Ap-I反應性螢光素酶報告基因表達 的抑制效應。圖;3B螢光素酶報告基因實驗檢測誘騙核酸對Ap-I反應性螢光素酶報告基因表達 的抑制效應。
具體實施例方式實施例1、誘騙核酸藥物的製備和分析合成八種下述硫代誘騙核酸藥物:ASCES101A 序列2 ；ASCES101B 序列3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ；ASCES102B 序列 9 ； ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。陰性對照序列正義5' -TGTGGTCATGTGGTCATGTGGTCA-3『反義5, -TGACCACATGACCACATGACCACA-3『AP-I 陽性對照序列5' -TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3『Smad 陽性對照序列正義5 『 -ATGCAGACAATGCAGACAATGCAGACA-3 『反義5' -TGTCTGCATTGTCTGCATTGTCTGCAT-3『應用美國PE公司391型DNA合成儀，以亞磷醯胺固相合成法合成所設計的硫代誘 騙核酸。主要原料有四種二異丙基β -氰乙基亞磷醯胺單體腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C) 和胸苷(T)；四種控制孔徑玻璃粉(CPG)固相合成柱(A、G、C、T)。蓋帽試劑分別為乙酸酐/ 二甲基吡啶/四氫呋喃和1-甲基咪唑/四氫呋喃；硫代反應試劑=Beaucage試劑/乙腈；脫 三苯甲基試劑三氯乙酸/ 二氯甲烷；液體溶劑乙腈和三氯甲烷。合成規模為100D。鹼基 單體溶於無水乙腈中，濃度為100豪摩爾，其它試劑濃度及用量按照儀器操作手冊進行。合 成過程由儀器程序自動控制。合成產物置於裝有濃氨水的密封耐壓玻璃瓶中，於55°C 處理15小時，脫去核酸分子上各種鹼基保護基團和氨基保護基團。脫保護結束後，揮發脫 去大部分氨氣，凍幹得白色粉末狀粗製品，重溶於緩衝液中，用Wiarmacia Source 30 Q層 析及AKTA層析系統進行純化。純化樣品經G-15分子篩葡聚糖凝膠層析柱除鹽，後凍幹得 到白色絮狀核酸純品，儲存於-20°C，並取少量樣品進行純度和分子量分析。用毛細管電泳 法和高效液相層析法測其純度及分子量，要求純度均大於90%，DNA測序法測定序列完全 正確，核磁共振法測硫代化程度大於98. 5%。實施例2、八種ASCES系列誘騙核酸對L9W成纖維細胞的生長抑制復甦並接種成纖維細胞於細胞培養瓶，在37°C、5 % CO2條件下，用含10 % FBS 的RPMI 1640完全培養液培養細胞；待細胞匯合至70% -80%時，胰酶消化細胞，活細胞計 數後並將細胞濃度調整至2 X IO5個/ml ；於96孔板以每孔100 μ L細胞懸液接種細胞，培 養12小時；後更換成無血清培養液，將細胞隨機分成空白對照組、陽性對照組、陰性對照組 和八種ASCES藥物組，且每組設3復孔，其中空白對照組僅加入0. 6 μ 1/孔脂質體，其餘均 加入0. 6 μ 1/孔脂質體和終濃度為IOOnM的不同誘騙核酸；轉染5小時後，更換成含10% FBS的RPMI 1640完全培養液100 μ L，同時加入終濃度5ng/ml的TGF- β 1或TGF- β 2誘導 細胞增殖，在37°C、5% CO2條件下培養72h ；每孔加入ATP提取液100 μ L，混勻後室溫下放 置30min，取50 μ L細胞提取液於檢測板中，加入螢光素_螢光素酶50 μ L，混勻後置於螢光 分析儀進行檢測，測定每孔樣品的螢光值。並計算細胞生長抑制率，作為誘騙核酸抑制
細胞增殖的評價指標，細胞生長抑制率=(空白對照組螢光值-藥物組螢光值)/空白對照 組螢光值。細胞生長抑制實驗結果表明，較隨機誘騙核酸相比，本發明的八種ASCES序列藥 物以及AP-I和Smad陽性對照誘騙核酸均對細胞的生長均有明顯的抑制作用，其中 ASCES102A和ASCES102B對細胞的生長的抑制作用最強，明顯強於AP-I和Smad陽性 對照誘騙核酸，見圖1。實施例3、ELISA方法檢測誘騙核酸對AP-1和Smad與其順式作用元件結合的競爭 抑制實驗
分別將IOpmol的ASCES系列藥物稀釋於30 μ 1完全結合緩衝液，並以每孔30 μ 1 量加入包被了 Ap-I或Smad順式作用元件的96孔酶聯板(購自美國Active Motif公司的 TransAM Transcription factor assay kits)中；再TPAi秀導的 K—562 細胞核才由 提物(針對Smad則用TGF-β 1誘導的成纖維細胞核抽提物)稀釋於20 μ 1完全結合緩 衝液中，後依次加入96孔酶聯板中混勻，室溫孵育lh。注以3復孔進行各種樣品的檢測，實 驗分組如下空白陰性對照僅加入不含ASCES藥物和細胞核抽提物的50μ 1完全結合緩衝 液；空白陽性對照則為加入不含ASCES藥物，只含5 μ g核抽提物的50 μ 1完全結合緩衝液； 陰性對照則為加入同等濃度陰性對照誘騙核酸和5 μ g細胞核抽提物的50 μ 1完全結合緩 衝液；陽性對照則為加入同等濃度陽性對照誘騙核酸和5μ g細胞核抽提物的50μ 1完全結 合緩衝液；實驗組則為加入含IOpmol的ASCES系列藥物，以及5 μ g細胞核抽提物的50 μ 1 完全結合緩衝液。以200 μ 1/孔加入洗脫液洗滌3次，每次細化，去除洗滌液；以1 500 稀釋度用抗體結合緩衝液稀釋c-fos抗體或Smad3抗體，後以100 μ 1/孔加入稀釋的抗體， 室溫孵育Ih;再以200 μ 1/孔加入洗脫液洗滌3次，每次細化，去除洗滌液；以1 1000稀 釋度用抗體結合緩衝液稀釋羊抗兔IgG-HRP 二抗，後以100 μ 1/孔加入稀釋的二抗，室溫孵 育Ih ；再以200 μ 1/孔加入洗脫液洗滌4次，每次％iin，去除洗滌液；以100 μ 1/孔加入底 物反應液，室溫孵育2-20min，待陽性對照液變深藍色後，以100 μ 1/孔加入終止液終止反 應；於450nm和655nm雙波長檢測OD值。ASCES系列藥物對AP-1或Smad與其順式作用元 件結合的抑制百分數計算公式為(空白陽性對照OD-ASCES藥物OD)/空白陽性對照0D。結果表明，與隨機誘騙核酸對照相比，本發明的ASCES系列誘騙藥物均能明顯抑 制AP-I的DNA結合活性。但對Smad的DNA結合活性的抑制作用，除ASCES102A和ASCES102B 外，本發明的其它誘騙核酸對Smad的DNA結合活性雖也有一定的抑制作用，但抑制效應不 甚明顯，如圖2A和2B所示。實施例4、流式細胞儀檢測誘騙核酸對成纖維細胞細胞周期的影響將細胞以1\105個/平板接種於6011平板中，在371、5% CO2條件下，用含 10% FBS的RPMI 1640完全培養液培養細胞12小時；後更換成無血清培養液，將細胞隨機 分成空白對照組、陽性對照組、隨機誘騙核酸對照組以及ASCES102A和ASCES102B藥物組， 且每組設3復孔，其中空白對照組僅加入12 μ 1/孔脂質體，其餘均加入12 μ 1/孔脂質體和 終濃度為IOOnM的不同誘騙核酸；轉染5小時後，更換成含10% FBS的RPMI1640完全培養 液，同時加入終濃度5ng/ml的TGF-β 1或TGF-β 2誘導細胞，在37°C、5% CO2條件下培養 24h ；收穫細胞，300g離心5min，棄上清，後將細胞團重懸於殘留液體中；緩慢滴加200 μ 1 70%的乙醇進行細胞固定，在滴加乙醇的同時注意旋渦震蕩細胞。後將細胞於4°C放置 30min ；用2ml含2% BSA的PBS洗細胞一次，300g離心5min，棄上清，後將細胞團重懸於殘 留液體中；於細胞懸液中加入0. 5ml的Pl/foiase溶液，混勻，分析前室溫孵育15min。最後 進行流式細胞儀分析。如表1和表2顯示，與隨機誘騙核酸相比，AP-I陽性誘騙核酸、Smad陽性誘騙核 酸、ASCES102A和ASCES102B藥物處理的細胞，無論是TGF- β 1還是TGF- β 2誘導細胞均被 明顯阻滯於S期，特別是對TGF-β 2誘導細胞阻滯效應最為明顯。與AP-I和Smad的陽性 誘騙核酸相比，ASCES102A和ASCES102B藥物對細胞的阻滯效應得到明顯的增強。相比較 而言，雖沒有統計學差異，ASCES102B藥物對細胞的阻滯效應強於ASCES102A。
表1誘騙核酸對TGF-β 1誘導的細胞細胞周期的影響
權利要求
1.一種具有治療作用的核酸，其特徵在於，所述核酸為包含既能與AP-I高親和結合的 AP-I順式作用元件，又能與Smad高親和結合的Smad順式作用元件的雙鏈誘騙寡核苷酸。
2.根據權利要求1所述的核酸，其特徵在於，包括核心序列TGACXTCAGACA或 CAGACATGACXTCA或GTCTAGACTGACXTCA或其功能等價物，其中所述核苷酸序列中，X代表G 或者缺失。
3.根據權利要求2所述的核酸，其特徵在於，所述核心序列為TGACGTCAGACA或 TGACTCAGACA或其功能等價物；序列CAGACATGACGTCA或CAGACATGACTCA或其功能等價物； GTCTAGACTGACGTCA 或 GTCTAGACTGACTCA 或其功能等價物。
4.根據權利要求2所述的核酸，其特徵在於，所述核酸序列如下ASCES101A序列2 ； ASCES101B 序歹Ij 3 ；ASCES101C 序列 4 ；ASCES101D 序列 5 ；ASCES102A 序列 7 和序列 8 ； ASCES102B 序列 9 ；ASCES103A 序列 11 和序列 12 ；ASCES103B 序列 13。
5.權利要求1-3所述的任何一項核酸在製備抗AP-I和Smad轉錄活性的藥物中的應用。
6.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述抗AP-I和Smad轉錄活性的藥物是治 療AP-I和Smad異常表達或活化引起的瘢痕化和組織纖維化相關疾病的藥物。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述藥物是治療纖維化疾病、異常傷口愈 合、異常骨生成、免疫/炎症相關疾病或抗青光眼濾過性手術後抗癒合的藥物。
8.一種含有權利要求1所述的核酸的藥物組合物。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，含有藥物可接受的載體。
10.一種權利要求1所述的核酸的製備方法，其特徵在於，使用DNA合成儀合成。
全文摘要
本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種新型雙功能抗瘢痕和組織纖維化寡聚核苷酸藥物，所述核酸為包含既能與AP-1高親和結合的AP-1順式作用的元件，又能與Smad高親和結合的Smad順式作用的元件。
文檔編號C12N15/113GK102146411SQ201110001699
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者徐祥, 梁華平, 袁洪峰, 邢偉, 郭韡, 黃宏 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院