用於癌症檢測的血漿或血清標記及方法

2023-09-16 05:49:25 3

專利名稱：用於癌症檢測的血漿或血清標記及方法
技術領域：
本發明涉及基於PCR的方法，檢測血漿或血清標記，用於癌症的診斷、早期檢測、監測和群篩，更具體地，是對於結腸直腸癌的血漿或血清中β-連環蛋白(catenin)RNA和DNA的檢測。
背景技術：
結腸直腸癌(CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一。CRC新病例的數目自1975年以來一直在增加。大於70％的CRC病例是由散發性腺瘤或腺瘤狀息肉發展而來。早期檢測和手術切除息肉據信是防止良性息肉發展為惡性腫瘤從而降低CRC所致的死亡率的最有效的方法。
結腸直腸癌傳統的篩選方法包括乙狀結腸鏡檢、糞隱血試驗、結腸鏡檢及雙對照鋇劑灌腸。然而，這些傳統方法飽受限制，並且是侵入性的、花費高、預測值低或者造成低檢出率。例如，WO0142504(特此將其教導併入作為參考)公開了用於檢測血漿或血清中與胞外腫瘤相關的核酸的多步反應方法。需要進一步的改進。
β-連環蛋白最初是通過其與鈣粘著蛋白的相互作用鑑定的。最近證據表明其作為轉錄因子發揮作用，並在Wnt-信號傳導路徑中起著關鍵作用(WillertNusse，1998)。已經證明胞漿和核β-連環蛋白信號傳導的累積與廣泛種類腫瘤的生成密切相關(Morin，1999)。
已經發現利用免疫組織化學染色核β-連環蛋白的水平與結腸直腸腫瘤發生中假設的後續階段高度相關，其中陽染在正常組織中為0％、息肉為8％、腺瘤為92％，而癌瘤為100％。還已發現核β-連環蛋白信號似乎清楚地將息肉(非腺瘤狀息肉)與腺瘤(腺瘤狀息肉)區分開來。這將是CRC臨床診斷或早期檢測的有用標記，其中腺瘤被當作危險因素的終點。不過，基於核β-連環蛋白評價的這種診斷方法需要結腸鏡檢操作，隨後手術切除可疑組織。
因此，急需用於癌症早期檢測的有效、更少侵入性、更為準確的測試。本發明滿足了這種需要。
發明概述本發明提供了基於PCR(聚合酶鏈式反應)的方法或操作，檢測與β-連環蛋白相關的血清或血漿標記RNA和DNA，以提供有效、更少侵入性且更為準確的測試，用於結腸直腸及其它癌症類型的診斷、早期檢測、監測和群篩。應當理解，這種檢測血清中β-連環蛋白RNA和DNA的方法可應用於編碼β-連環蛋白相關蛋白的其它血漿和血清RNA和DNA。在一個實施方案中，所述RNA或DNA來自基因編碼的β-連環蛋白、α-連環蛋白、E-catherin及其它β連環蛋白相關蛋白。
本發明的方法包括檢測來自人類或動物的血清或血漿RNA或/和DNA作為診斷、早期檢測、監測、治療和群篩處於不同進程和臨床階段的腫瘤疾病的工具。本發明的一個優勢在於該方法非侵入性的性質，而第二優勢在於提高的樣品收集的方便性和靈敏度。
本發明多個實施方案的細節列於下文。這些實施方案僅用於舉例說明的目的，而且本發明的原理可以其它實施方案來實施。本發明的其它特點和優勢將由以下的說明和實施例而變得清楚。


為更全面地理解發明，現在就參考以下結合附圖所進行的詳細說明。在此強調為清楚討論起見，某些要素可能不予舉例說明。現在就參考以下結合附圖所進行的詳細說明，其中圖1a、圖1b和圖1c圖解說明了利用RT-PCR對來自結腸直腸癌瘤患者血漿的β-連環蛋白RNA的檢測。
圖2a和圖2b圖解說明了利用RT-PCR對來自患者的血液β-連環蛋白RNA進行結腸直腸腺瘤的檢測。
圖2c圖解說明了利用RT-PCR對來自患者的血液β-肌動蛋白RNA進行結腸直腸腺瘤的檢測。
圖3a、圖3b、圖3c、圖3d和圖3e圖解說明了對來自腺瘤或癌瘤患者以及正常對照的血清β-連環蛋白DNA的檢測。
發明詳述本發明披露了對用於結腸直腸癌早期檢測的靈敏且特異性的生物標記的研究。對解釋結腸直腸癌腫瘤發生的分子機制的超前理解有助於鑑定為數不多的致癌基因和腫瘤抑制劑作為潛在的結腸直腸癌形成和早期檢測的臨床生物標記。這些包括k-ras、APC、p53、MCC、DCC基因。然而，沒有一個候選標記能夠單獨提供滿意的檢出率。最近對癌症患者血樣中k-ras、APC和p53突變的基於PCR的檢測的確極大地提高了樣品收集的方便性。不過，檢出率通常低於由原發性腫瘤所觀察到的檢出率。例如，在對14個結腸直腸癌患者的研究中，其中有7個證實了k-ras突變，同一突變見於6個患者的血清。血清陽性率為86％(Anker 1997)。另一個研究表明雜合性丟失(LOH)、微衛星不穩定、k-ras及p53突變的血清陽性率分別為0、0、19和70％(Hibi 1998)。已在其它類型的癌症中獲得相似結果，其中見於血清DNA(脫氧核糖核酸)的遺傳變化傾向於比見於原發性腫瘤的遺傳變化更低(Kopreski 2001；Sozzi 1999；von Knobloch 2001)。
與其它相關研究相比，本發明利用血清β-連環蛋白DNA早期檢測結腸直腸癌可滿足作為早期檢測標記的標準1.該標記差異性地存在於正常及癌變前或腫瘤攜帶患者的血液中；2.該方法具有檢測直徑小至4mm的腺瘤狀息肉的能力；3.該方法簡便，具有高準確度；4.所需血樣量小(2-5ml)，並且樣品收集是通過非侵入性的正常抽血操作。從而，本發明提示血清或血漿中β-連環蛋白DNA水平，連同β-連環蛋白RNA水平，可為利用早已存在的儀器和試劑對結腸直腸癌進行有效準確測試的探索提供一種解決方法，因此適於對這種日益增長的常見癌症的大範圍群篩、早期檢測以及疾病監測。
實施例以下實施例旨在舉例說明，而並非限制本文所述發明的實施方案。具體地，在如下的討論中，列舉了眾多具體的細節，以為本發明公開提供透徹的理解。不過，本領域技術人員將會理解文中的有些技術無需此類具體細節就可能實施。在其它情況下，公知的要素或具體細節已被精簡或完全省略，這是因為對這些特徵的詳細討論被認為對於獲得對本發明公開的完整理解不是必要的，並且被認為是在相關技術領域普通技術人員的理解範圍之內的。
實施例1*在結腸直腸癌瘤患者的所有血漿樣品中檢測到β-連環蛋白RNA為檢測血漿β-連環蛋白的存在，利用將產生224bp基因外顯子3區的引物#1對來自癌瘤患者的兩份血樣進行RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈式反應)。由表達高水平β-連環蛋白的癌瘤提取的RNA樣品作為陽性對照包括在內。結果表明當反應中存在反轉錄酶(RT)時，兩份血漿和陽性對照RNA樣品中都產生224bp條帶，但不存在反轉錄酶則沒有條帶(圖1a)。利用內含子跨接引物(引物#2，表2)對其它10份血漿RNA樣品進行了RT-PCR分析。
數據顯示在所有10份患者血漿樣品中清楚地檢測到250bp的片斷(圖1a，泳道1-10)，提示β-連環蛋白RNA於癌瘤患者循環血中的存在。數據也證明所述反應是RT-依賴性的(圖1b，泳道12)。基因組DNA樣品作為PCR反應的陽性對照包括在內，並且如期出現450bp的條帶(圖1b，泳道11)。
為證明所述250bp條帶來自血漿中的RNA而非DNA模板，對未經DNase I事先處理的三份剩餘血漿RNA樣品進行測試。
凝膠上出現了兩種PCR產物由RNA擴增的250bp條帶，以及由DNA汙染的血漿RNA提取物擴增的450bp條帶。所有三份樣品在存在RT時均產生250和450bp的條帶(圖1b，泳道13-15)，而RNase處理的DNA樣品在不存在RT時觀察到單一的450bp條帶(圖1b，泳道1)。
利用上文所述的三種稍有區別的實驗設置對15個患者進行了癌瘤測試，並且數據顯示15個患者中有15個清楚地為血漿β-連環蛋白陽性。
實施例2*血漿RNA高比率地存在於癌瘤患者中，但不存在於健康個體中對來自具有可疑腺瘤個體的17份血漿樣品進行β-連環蛋白RNA的篩選。在來自具有可疑腺瘤個體的這17份血漿樣品中，通過250bp RT-PCR產物的存在表明其中11份是血漿陽性的；有6份發現是陰性的(圖2a，泳道1-11；圖2b，泳道1-6)。利用β-肌動蛋白序列特異性的引物對所述6份陰性樣品進行了RT-PCR測定(表2，引物#3)。在所有6份血漿樣品中檢測到β-肌動蛋白RNA(圖2c，泳道1-6)，說明這6份血漿RNA提取物具有可擴增級質量。在具有陰性β-連環蛋白信號的6個患者(表1，患者#10、14和16)中，後來的活組織檢查證實三人被診斷為腺瘤，兩人具有肉芽組織，而另一人具有擴張的淋巴間隙(表1，患者#1-3)。腺瘤患者中檢出百分率為79％(14人中的11人)。對10個健康受試者進行了平行的RT-PCR分析。10個健康對照中有9人表現出陰性血漿β-連環蛋白信號，但所有人都表現出陽性β-肌動蛋白RNA信號(圖2d和2e，泳道1-10)。他們中間只有1人具有相當弱的陽性信號(圖2d，泳道10)。
總結起來，利用RT-PCR分析對證實為癌瘤或腺瘤的32個患者的血漿進行了β-連環蛋白存在的檢查。結果顯示100％(15人中的15人)的癌瘤患者、79％(14人中的11人)的腺瘤患者和10％(10人中的1人)的健康志願者在其循環血中攜帶β-連環蛋白RNA。值得一提的是，具有微量血漿β-連環蛋白RNA、看似健康的受試者長期飽受結腸直腸不適之苦，偶爾伴有便血和腹瀉，儘管在內窺鏡檢查中未檢測到異常或潰瘍性結腸炎。具有可疑腺瘤的三個患者經同意也進行了血漿β-連環蛋白測試。所有後來經活組織檢查證實未患腺瘤的三個患者都是血漿信號陰性的。
已證明游離DNA存在於生理失調及癌症患者的循環血中，且該DNA可利用PCR測定檢測。
此外，已有報導證明特定基因序列的遺傳變化能夠在癌症患者的血清中檢測得到(Anker P 1997；Hibi K 1998；Kopreski MS2001；Sozzi G 1999；von Knobloch R 2001)。除血漿DNA之外，已在癌變而非健康個體中利用RT-PCR分析檢測到序列特異性RNA(Kopreski MS 1999；Lo KW 1999；Chen XQ 2000)。檢測血漿和血清DNA或RNA的PCR方法是否能夠實施用於癌症的診斷和預後，將主要地有賴於數據能夠如何良好地驗證腫瘤狀態或者甚至是癌變前的病變。例如，癌胚抗原(CEA)廣泛地在多種癌症以及在某些正常組織包括結腸組織中表達。與糖類抗原19-9(CA 19-9)一起，這些是CRC患者處理中兩個最常見的腫瘤標記。一般而言，通過蛋白含量的常規免疫化學測定，CEA標記產生從40到60％範圍的陽性檢出率。利用RT-PCR進行血清CEA RNA檢測已將檢測率從35％提高到約70％(Guadagni，2001)，另一個最近的研究證明酪氨酸mRNA存在於60％(6人中的4人)惡性黑色素瘤患者的血清之中，但不存在於任何正常對照血清之中(Kopreski 1999)。在我們目前的研究中，CRC檢測的陽性率對癌瘤患者而言為100％，而對腺瘤患者為79％。因而，血漿β-連環蛋白RNA似乎是CRC檢測有效的血清標記。
眼下，唯一非侵入性的CRC篩選方法是糞隱血試驗(FOBT)。若干研究發現在普通和高危患者中用FOBT篩選使死亡率降低16％。然而，這種測試的局限性在於低預測率(小於20％)。用於CRC篩選，尤其是腺瘤早期檢測的其它方法是柔性乙狀結腸鏡檢，在為數不多的病例對照研究中，它據稱使死亡率降低70％(綜述參見Scotiniotis I，1999)。這種測試靈敏並且是特異性的；不過，它在本質上是侵入性的。就這點而言，用於血清β-連環蛋白檢測的基於RT-PCR的方法可能確實提供了理想的用於普通和高危個體CRC篩選的工具。該方法可用於監測術後和化療患者。由於已知β-連環蛋白也與其它類型的癌症有關，我們目前用於檢測血清或血漿β-連環蛋白的發明可擴展至用於檢測、監測、篩選具有不同組織起源的癌症。這是首次報導並提示血漿β-連環蛋白RNA的存在具有診斷價值。
實施例3*腺瘤和癌瘤組織核β-連環蛋白信號的免疫化學染色在檢查的200多個病例中，92％的腺瘤和100％的癌瘤，但沒有一個正常組織表現出升高的核β-連環蛋白。為測定由來源於實施例1和2的患者獲得的腺瘤和癌瘤的核β-連環蛋白信號，對石蠟包埋的32個患者的腺瘤和癌瘤組織塊切片並進行核β-連環蛋白檢查。根據強度和陽性細胞百分比對免疫組織化學染色進行評分。表2顯示在所有組織樣本中觀察到β-連環蛋白的核易位。
實施例4*利用實時RT-PCR技術對健康個體和腺瘤或癌瘤患者的血液β-連環蛋白RNA進行定量利用實時反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)研究了腺瘤和癌瘤患者之間血漿β-連環蛋白的定量差異。結果表明β-連環蛋白mRNA的平均拷貝數與正常個體(n＝14；均值36；範圍從0到169)相比，腺瘤患者(n＝12；3個陰性；8個陽性；均值1.1×103；範圍從0.69×103到1.80×103)高30倍，而癌瘤患者(n＝18；均值2.2×104；範圍從0.67×104到4.4×104)高598倍。癌瘤患者的β-連環蛋白mRNA拷貝數比腺瘤患者高19倍。這些定量分析提供了清楚的證據血漿β-連環蛋白mRNA是差異性存在的、並且可作為診斷工具來區分健康受試者、腺瘤和癌瘤患者。
實施例5*結腸直腸腺瘤和癌瘤患者血清中β-連環蛋白DNA的檢測首先用從結腸直腸癌瘤患者提取的血清DNA樣品進行PCR分析。結果顯示在所有15份血清DNA樣品中觀察到359bp的條帶(圖3a，泳道1-16)。對確認患有從輕度到重度發育不良的腺瘤的10個患者進行了測試。在10個患者的9人中檢測到陽性條帶(圖3b，泳道1-11)。檢出率為90％。唯一的陰性病例(圖3b，泳道8)是可擴增的，因為在用RET特異性引物擴增後，它產生陽性156bp的條帶(圖3d，圖表下部，泳道13)。也對10個健康志願者對照進行了β-連環蛋白的PCR擴增。沒有一個血清樣品表現出β-連環蛋白陽性信號，而利用RET特異性引物清楚地檢測到陽性信號(圖3c，泳道1-10和1D，泳道1-11)。另外，平行進行了已知為陽性的癌瘤血清樣品，並且在瓊脂糖凝膠上顯示出典型的359bp條帶(圖3c，泳道11)。圖3c和圖3d的泳道12為PCR反應的陰性對照。
數據首次表明，血清β-連環蛋白DNA在所有的結腸直腸癌瘤患者中以及在10個結腸直腸腺瘤患者的9人中可檢測到，而所有10個健康個體不含血清β-連環蛋白DNA。該結果提示血液中β-連環蛋白DNA的存在與處於腫瘤形成前及惡性期的癌症的存在顯著相關，這也提示循環的β-連環蛋白來源於患者的腺瘤或癌瘤組織。本例的10個腺瘤患者中，血清β-連環蛋白陰性的個體(患者#9，表4)具有最小的腺瘤(直徑3.5mm，48mm3)。具有倒數第二小腺瘤(63mm3)的患者血液中表現出可擴增的β-連環蛋白DNA，提示本法的靈敏度將允許我們檢測至少小至63mm3的惡化前的腺瘤狀息肉。建議利用實時PCR分析對樣品中β-連環蛋白DNA的拷貝數進行定量。所述發現表明測量血液中β-連環蛋白DNA的水平為結腸直腸癌早期檢測提供了高度靈敏而非侵入性的方法。該方法可擴展至不同組織起源的癌症。
現在參照附圖，圖1總體上顯示了利用RT-PCR對結腸直腸癌瘤患者血漿的β-連環蛋白RNA的檢測。更具體地，圖1a顯示了利用β-連環蛋白外顯子引物對β-連環蛋白的RT-PCR擴增。泳道1-4，分離自兩個癌瘤患者的血液RNA樣品在存在(泳道1和3)和不存在(泳道2和4)RT酶時的RT-PCR反應；泳道5，作為陽性對照的由表達β-連環蛋白的癌瘤樣本提取的mRNA；泳道6，緩衝液對照。MRNA標記。圖1b顯示了利用β-連環蛋白內含子跨接引物對β-連環蛋白的RT-PCR擴增。泳道1-10，分離自十個癌瘤患者的DNAasa處理的血漿RNA；泳道11，作為PCR反應陽性對照的基因組DNA；泳道12，緩衝液對照。泳道13-17，分別來自泳道8-12而未經DNAase事先處理的樣品。圖1c顯示泳道1～3，用內含子跨接引物通過RT-PCR由三個患者分離的未經DNAase處理的β-連環蛋白RNA(250bp)；泳道4，陽性DNA對照；泳道5，陰性緩衝液對照。MDNA標記。
圖2顯示了利用RT-PCR對疑為結腸直腸腺瘤患者(圖2a-2c)的血液β-連環蛋白(圖2a和圖2b)和β-肌動蛋白(圖2c)RNA的檢測。A.泳道1-17，分離自17個患者的血漿RNA；泳道18，陽性DNA對照；泳道19，陰性對照。對來自10個健康對象(泳道1-10)血漿的血液β-連環蛋白(圖2d)和β-肌動蛋白(圖2e)RNA的檢測。泳道11，陽性DNA對照，泳道12，陰性緩衝液對照。
圖3顯示了對腺瘤或癌瘤患者及正常對照血清β-連環蛋白DNA的檢測。圖3a、圖3b和圖3c顯示利用β-連環蛋白特異性引物對分離自結腸直腸癌瘤患者的血清樣品進行PCR分析圖3a，泳道1-15；對結腸直腸腺瘤患者的分析圖3b，泳道1-10；對健康個體的分析圖3c，泳道1-10。圖3d利用RET特異性引物對具有陰性β-連環蛋白信號的血清樣品進行PCR反應。泳道1-10，如圖3c所示相同的健康個體的血清樣品；圖3d，泳道13如圖表圖3b，泳道8所示相同的血清樣品。分離自癌瘤的陽性對照基因組DNA圖3a，泳道16；圖3b，泳道11；圖3c，泳道11；圖3d，泳道11。陰性無細胞對照圖3a，泳道17；圖3b，泳道12；圖3c，泳道12；圖3d，泳道12。MHae IIIλDNA標記。
所應用的技術血樣和RNA提取通過經皮針從每個患者收集6-ml血樣到含乙二胺四乙酸鋰肝素的8-ml真空容器(Vacutaniners)中。血樣以4800rpm離心8分鐘。將血漿等分裝入聚丙烯管並貯存於-80℃，稍後用於RNA提取。RNA利用TRIZOL試劑盒(Life Technologies，USA)由血漿樣品提取，然後利用RNeasy柱(Qiagen，Germany)根據製造商的手冊純化。簡單講，將2ml各血漿樣品與1.6ml TRIZOL和0.4ml氯仿混合，以12,000rpm於4℃離心15分鐘。收集水相，利用RNeasy柱提取RNA。將分離的RNA溶於15μl DEPC處理過的水中。所述RNA樣品進一步用PCR級的脫氧核糖核酸酶I(DNase I)(LifeTechnologies)處理。在反應中，向15μl RNA樣品中各添加1μl的10×DNase I反應緩衝液和DNase I，並於室溫下溫育15分鐘，緊接著通過添加1μl 15mM EDTA並於65℃加熱5分鐘使DNase I失活，然後冰上冷卻備用RT-PCR反應。
血液RNA樣品的引物和RT-PCR反應血漿β-連環蛋白的檢測是由包括跨接在β-連環蛋白基因外顯子3和4之間的內含子序列在內的引物集合(表1)利用RT-PCR測定進行的。為比較起見，在有些PCR反應中也摻入了位於β-連環蛋白基因外顯子3之內的另外的引物序列集合。反轉錄反應根據製造商的指南(Qiagen，Germany)進行。PCR利用GeneAmp DNA擴增試劑盒中提供的試劑利用AmpliTaq Gold作為聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Foster City，CA)進行。PCR所用參數為40個循環，其中95℃初始變性10分鐘，緊接著94℃1分15秒、59℃(β-連環蛋白)1分30秒、72℃1分30秒，最終的延伸步驟為72℃10分鐘。PCR產物通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色分析。每個RT-PCR測定中包括陰性(水)對照。對所有具有陰性結果的樣品利用內含子跨接引物(表3)進行β-連環蛋白的RT-PCR測定，作為血漿提取的RNA可擴增性的對照。
DNA提取從凝結的血樣上清中取出血清，並以4800rpm離心8分鐘，緊接著小心地將血清等分裝入聚丙烯管並貯存於-20℃，稍後用於DNA提取。利用QIAamp DNA Mini試劑盒(Qiagen，HildenGermany)根據製造商的方案從200μl血清中分離DNA。所述DNA樣品用50μl dd H2O洗脫。
血液DNA樣品的引物和PCR反應β-連環蛋白的檢測是由側接β-連環蛋白基因第二和第三內含子的引物集合(表3)利用PCR測定進行的。PCR利用GeneAmpDNA擴增試劑盒中提供的試劑利用AmpliTaq Gold作為聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Foster City，CA)進行。PCR所用參數為40個循環，其中95℃初始變性10分鐘，緊接著94℃ 1分15秒、57℃(β-連環蛋白)及69℃(RET)1分30秒、72℃ 1分30秒，最終的延伸步驟為72℃ 10分鐘。PCR產物通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色分析。PCR產物通過直接的DNA測序證實。每個PCR測定中包括陰性(水)對照。對所有具有陰性結果的樣品進行RET基因的PCR測定，作為血清DNA樣品可擴增級質量的對照。編碼受體酪氨酸激酶的RET基因序列正常地存在於健康個體的循環血中(Matisa-Guiu 1998)。
免疫組織化學染色和評價β-連環蛋白的單克隆抗體(C19220)購自於TransductionLaboratoried(U.S.A.)。該抗體是針對小鼠β-連環蛋白的C-端(a.a.571-581)製備的，並對人類、大鼠和小鼠物種的β-連環蛋白具反應性。將4μm厚的組織切片置於矽烷塗敷的(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)玻璃載片上，過夜風乾，並由二甲苯和梯度乙醇再水合。抗原探尋和免疫化學染色在Ventana-ES自動免疫染色儀(Ventana，Tucson，Az)中按照說明進行。切片用Harris蘇木精復染，並在梯度乙醇中再水合後由封蓋膠(permount)封固。陰性對照通過用TBS替換β-連環蛋白抗體進行。陽性信號在光學顯微鏡下以10×40的放大倍數在4個視野中進行評價，而不知曉臨床結果。結果通過兩個獨立的觀察者手工評價，並且根據Remmele和Schicketanz並稍加改動(RemmeleSchicketanz，1993；Wong等，2001)，將數據表達為通過用「染色強度」乘以「陽性細胞百分比」獲得的IHC評分。在本研究中，所述IHC評分如下表示「-」＝無表達，1+＝弱表達，2+＝中等表達，3+＝強表達，而4+＝極強表達。
通過實時RT-PCR對血漿β-連環蛋白RNA的定量分析血漿β-連環蛋白RNA的拷貝數利用TagMan檢測系統(Heid等，1996)通過實時RT-PCR測量。PCR指數期內任何給定循環中螢光產物的含量與模板拷貝的初始數目成正比。記錄反應並利用配備有96-孔熱循環儀的ABI Prism 7700序列檢測儀(Perkin-ElmerApplied Biosystems，UK)分析。簡要地，將RNA樣品(50-100ng)與0.01單位的尿嘧啶N-糖基化酶溫育(50℃2分鐘)，並在25-μl寡聚(dT)-引物反應(體系)中於60℃進行30分鐘反轉錄。然後在正向和反向引物的存在下進行40個PCR循環(每個循環92℃20秒以及62℃1分鐘)之前，對cDNA模板進行5分鐘的92℃初始變性，然後用螢光淬滅基團6-羧基螢光素在5』端和螢光淬滅分子在3』端進行標記。
表1PCR反應中所用引物的序列

表2結腸直腸腺瘤和癌瘤患者的血漿β-連環蛋白RNA與其各自病變處核β-連環蛋白表達(IHC評分)的關聯

dys發育不良；N.A.不適用；N.D.未測。
表3PCR反應中所用的引物

表4.患者記錄

dys發育不良；N.A.不適用；N.D.未測。
儘管文中公開了多種實施方案，應當理解它們僅作為實施例提供，而不用於限制。因此，本發明的廣度和範圍不應當局限於上述示例性的實施方案，而只應當根據如下權利要求及其等同體限定。而且，上述優勢和特徵在所述實施方案中起作用，但不應當將權利要求的應用局限於實現任何或所用上述優勢的操作和構造。此外，特此將來自下列參考文獻的教導併入，作為任何意義上的參考Anker，P.，Lefort，F.，Vasioukhin，V.，Lyautey，J.，Lederrey，C.，Chen，X.Q.，Stroun，M.，Mulcahy，H.E.和Farthing，M.J.K-ras mutations are found in DNAextracted from the plasma of patients with colorectal cancer.Gastroenterology1121114-1120，1997.
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另外，文中的章節標題是為與法條37CFR 1.77的提示相一致而提供的，或者是提供組織線索。這些標題不應當限制或描述可由本發明公開產生的在任何權利要求中所列的發明的特徵。具體地，並且作為實例，儘管標題涉及「發明的技術領域」，權利要求不應當受限於該標題之下為描述所謂的發明領域所選的語言。再有，在「發明背景」中的技術描述不應當解釋為承認所述技術為本發明公開中任一發明的現有技術。「發明概述」也不能當作是對文中所列權利要求中陳述的發明的描述。此外，這些標題或本發明公開別處提及的單數形式的「發明」不應當用來證明本發明公開所主張的只有一個發明點。根據本發明公開所附多個權利要求的限制，可列舉多個發明，因此權利要求及其等同體限定了由此保護的發明。在所有情況下，權利要求的範圍應當參照說明書根據其自身來考慮，而不應當局限於文中所列標題。
權利要求書(按照條約第19條的修改)1.用於檢測患者的癌症的方法，包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中β-連環蛋白RNA的存在與否；和基於檢測出的β-連環蛋白RNA的存在確定癌症的存在。
2.根據權利要求1的方法，其中癌症為結腸直腸癌。
3.根據權利要求2的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白RNA的存在檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
4.根據權利要求1的方法，其中RNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
5.根據權利要求1的方法，其中患者為人類或動物。
6.用於檢測患者的癌症的方法，包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中β-連環蛋白DNA的存在與否；和基於檢測出的β-連環蛋白DNA的存在確定癌症的存在。
7.根據權利要求6的方法，其中癌症為結腸直腸癌。
8.根據權利要求7的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白DNA的存在檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
9.根據權利要求6的方法，其中DNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
10.根據權利要求6的方法，其中患者為人類或動物。
11.用於檢測患者的癌症的方法，包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中β-連環蛋白相關基因RNA的存在與否；和基於檢測出的β-連環蛋白相關基因RNA的存在確定癌症的存在。
12.根據權利要求11的方法，其中癌症為結腸直腸癌。
13.根據權利要求12的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白相關基因RNA的存在檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
14.根據權利要求11的方法，其中RNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
15.根據權利要求11的方法，其中患者為人類或動物。
16.用於檢測患者的癌症的方法，包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中β-連環蛋白相關基因DNA的存在與否；和基於檢測出的β-連環蛋白相關基因DNA的存在確定癌症的存在。
17.根據權利要求16的方法，其中癌症為結腸直腸癌。
18.根據權利要求17的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白相關基因DNA的存在檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
19.根據權利要求16的方法，其中DNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
20.根據權利要求16的方法，其中患者為人類或動物。
21.根據權利要求2、7、12或16的方法，其中結腸直腸癌為結腸直腸癌瘤或結腸直腸腺瘤。
22.用於確定患者存在癌瘤、存在腺瘤或者不存在癌瘤及腺瘤的方法，包括從患者抽取血清或血漿；測量患者血清或血漿中β-連環蛋白DNA或RNA的相對含量以及已知未患癌瘤或腺瘤的對照個人血清或血漿中β-連環蛋白DNA或RNA的相對含量；確定在患者血清或血漿中檢測到的β-連環蛋白DNA或RNA含量與在已知未患癌瘤或腺瘤的對照個人血清或血漿中檢測到的β-連環蛋白DNA或RNA含量的比率，其中大約30-80的比率表示存在腺瘤，大約超過500的比率表示存在癌瘤，而大約1的比率表示不存在癌瘤及腺瘤。
23.根據權利要求22的方法，其中癌瘤為結腸直腸癌瘤。
24.根據權利要求22的方法，其中腺瘤為結腸直腸腺瘤。
25.根據權利要求22的方法，其中DNA或RNA來源自下組之基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
26.根據權利要求22的方法，其中30的比率表示存在腺瘤。
27.根據權利要求22的方法，其中598的比率表示存在癌瘤。
28.根據權利要求22的方法，其中患者血清或血漿中β-連環蛋白DNA或RNA的相對含量以及已知未患癌瘤或腺瘤的對照個人血清或血漿中β-連環蛋白DNA或RNA的相對含量是利用實時反轉錄聚合酶鏈式反應測量的。
29.根據權利要求1、6、11或16的方法，其中檢測步驟是利用實時反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)完成的。
權利要求
1.用於檢測患者的非試床診斷的癌症的方法，所述方法包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中的β-連環蛋白RNA；和基於檢測出的β-連環蛋白RNA確定癌症的存在。
2.根據權利要求1的方法，其中確定癌症的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白RNA確定結腸直腸癌的存在。
3.根據權利要求2的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白RNA檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
4.根據權利要求1的方法，其中RNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
5.根據權利要求1的方法，其中患者為人類或動物。
6.用於檢測患者的非臨床診斷的癌症的方法，所述方法包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中的β-連環蛋白DNA；和基於檢測出的β-連環蛋白DNA確定癌症的存在。
7.根據權利要求6的方法，其中確定癌症的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白DNA確定結腸直腸癌的存在。
8.根據權利要求7的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白DNA檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
9.根據權利要求6的方法，其中DNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
10.根據權利要求6的方法，其中患者為人類或動物。
11.用於檢測患者的非臨床診斷的癌症的方法，所述方法包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中的β-連環蛋白相關基因RNA；和基於檢測出的β-連環蛋白相關基因RNA確定癌症的存在。
12.根據權利要求11的方法，其中確定癌症的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白相關基因RNA確定結腸直腸癌的存在。
13.根據權利要求12的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白相關基因RNA檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
14.根據權利要求11的方法，其中RNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
15.根據權利要求11的方法，其中患者為人類或動物。
16.用於檢測患者的非臨床診斷的癌症的方法，所述方法包括從患者抽取血清或血漿；檢測血清或血漿中的β-連環蛋白相關基因DNA；和基於檢測出的β-連環蛋白相關基因DNA確定癌症的存在。
17.根據權利要求16的方法，其中確定癌症的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白相關基因DNA確定結腸直腸癌的存在。
18.根據權利要求17的方法，其中確定結腸直腸癌的存在包括基於檢測出的β-連環蛋白相關基因DNA檢測瘤形成前的結腸直腸息肉。
19.根據權利要求16的方法，其中DNA來源自下組之一基因編碼的β-連環蛋白，基因編碼的α-連環蛋白，基因編碼的E-catherin，以及其它基因編碼的β-連環蛋白相關蛋白。
20.根據權利要求16的方法，其中患者為人類或動物。
全文摘要
一方面，本文提供了用於檢測患者的非臨床診斷的癌症的方法。在一個實施方案中，所述方法包括從患者抽取血清或血漿，然後檢測血清或血漿中的β－連環蛋白RNA。另外，在該實施方案中，所述方法包括基於檢測出的β－連環蛋白RNA確定癌症的存在。另一方面，本文提供了用於檢測患者的非臨床診斷的癌症的方法的另一個實施方案。在該實施方案中，所述方法包括從患者抽取血清或血漿，然後檢測血清或血漿中的β－連環蛋白DNA。另外，在該實施方案中，所述方法包括基於檢測出的β－連環蛋白DNA確定癌症的存在。還公開了用於檢測患者的非臨床診斷的癌症的相關方法，包括檢測血清或血漿中β－連環蛋白相關基因RNA以及β－連環蛋白相關基因DNA。
文檔編號C07H21/04GK1665830SQ03815228
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月27日 優先權日2002年6月28日
發明者蕭文鸞, 黃思銓 申請人:香港科技大學