一種豆莢內特異表達毒蛋白的轉基因植物的製作方法

2023-09-19 23:20:15 1

專利名稱：一種豆莢內特異表達毒蛋白的轉基因植物的製作方法
技術領域：
生物、農業。
現有技術(與本發明最接近的技術)早在1991年，荷蘭的植物遺傳系統公司(Plant Genetic Syst.)就專利了用蘇雲金毒蛋白(BtToxin)轉化植物，進行農作物防蟲治蟲的技術(91-339820)，美國的Agracetus公司專利了用轉蠍毒和Bt雙價基因獲得植物抗蟲性的技術(91-173090)。此後，全世界已有許多家公司或大學相繼專利了用不同毒蛋白基因轉化植物，獲得抗蟲性技術。澳大利亞的Agric Genetics公司專利了在植物韌皮部中表達昆蟲毒蛋白或昆蟲代謝產物抑制劑蛋白、獲得抗蟲性的技術(93-094007)；Mycogen Plant Science公司在1995年專利了用人工合成的Bt基因和高表達啟動子獲得轉基因抗蟲植物的技術(95-384255)；美國Cornell大學則專利了傷害特異性表達啟動子指導的抗蟲性(93-134024)。
發明的目的防止昆蟲毒蛋白在植物可食用部位的累積，提高基因工程抗蟲植物對人類的安全係數。
隨著世界人口的不斷增長和對糧、棉、油的需求日益增加，農作物的高產穩產已成為農業發展的當務之急。蟲害是造成農業減產的重要原因之一，據估計，全球範圍內蟲害造成的損失約佔農作物總收穫量的10-15％，每年高達數千億美元。大豆食心蟲(Leguminivoraglycinivorella)是我國最主要的大豆害蟲，在全國、尤其是大豆主栽區——東北及黃淮海流域普遍發生，危害大豆的豆莢和籽粒，造成蟲口，碎粒等，增加自然脫粒，降低品質和產量。該蟲的主要生物學特性是食性單一，每年一代，只危害大豆和野生大豆，成蟲發生期短，幼蟲蛀入莢內取食豆粒。由於生產上主推品種抗蟲性不強，輪作體制不完善，近年來該蟲已呈蔓延趨勢，嚴重製約了我國的大豆生產。蟲害發生較輕時，蟲食率一般在5-10％左右，嚴重的年份和地區可高達30％以上，有的甚至達到40-50％！全國常年播種大豆1億畝左右，僅按5％的損失率算，就相當於每年減少播種面積500萬畝；若以每畝單產110公斤、每公斤售價2.30元計算，直接經濟損失高達12.65億元/年。因此，防治大豆食心蟲已經成為我國農業發展中的一個重要課題。
回顧害蟲防治方法和策略的演變過程，我們不難發現全世界都走了彎路。從本世紀40年代開始，由於化學農藥的問世，許多優秀的傳統農業技術，如害蟲的天敵、作物內在的抗性選擇及栽培措施的利用等均未能得到應有的重視。近半個世紀的生產實踐證明，長期、廣泛、大量、連續施用化學農藥，已經帶來了一系列破壞性副作用。第一，由於害蟲產生抗藥性，導致用藥量越來越大，用藥次數越來越頻繁，嚴重地汙染了環境，影響家禽家畜和野生動物的安全性，並威脅人類健康；第二，廣譜殺蟲劑往往導致害蟲的天敵迅速滅亡，害蟲因為失去天然競爭對手而繁殖失控，大大降低了防治效果，甚至引起周而復始的害蟲大爆發。據有關部門統計，1991至1994年間我國北方及長江流域棉區棉鈴蟲連續爆發，每年直接經濟損失約60億元，其中1992年更高達100億元。
因此，有效地防治害蟲是增加農業收入的關鍵措施之一，對我國國民經濟的發展有著舉足重輕的影響。但是，常規育種技術不僅周期長，效率相對較低，而且育成的品種往往帶有不良農業性狀，造成不同程度的產量、質量下降。用基因工程的手段將抗蟲基因引入農作物細胞中並使其穩定表達和遺傳，從而培育抗蟲作物新品種已經成為現代農業發展的方向。首先，抗蟲品種對作物具有連續保護作用，能在任何發育階段控制害蟲的發生；其次，抗蟲品種只殺死攝食害蟲，對非危害生物沒有影響；第三，抗蟲品種不汙染環境，不破壞生態平衡；第四，與常規育種或發展新型殺蟲劑相比，基因工程育種技術因為具有投資少、成本低、見效快等優點而在國內外獨樹一幟。
自從1983年世界上第一例轉基因菸草和馬鈴薯同時獲得成功以來，轉基因植物技術被廣泛應用於提高植物的抗逆性、改良作物品質，並不斷被用作生物反應器，生產有益於人類的化合物或多肽。有關轉基因植物的研究及其應用已經受到全世界科學家、各國政府部門和許多生物公司的關注。截止94年底，全球已有超過1500例轉基因植物進入大田試驗，說明基因工程已經成為作物品種改良的重要途徑。
最近的統計表明，蘇雲金桿菌毒蛋白基因(Bacillusthuringiensis，insecticidal crystal protein--ICP，又稱Bt-toxin)可能是世界範圍內應用最廣泛的抗蟲基因。比利時植物遺傳系統公司、美國孟山都公司和Agracetus公司及中國農科院生物中心都先後獲得了轉化Bt基因的菸草、番茄和棉花，其中有些已經開始在生產上發揮作用。通常情況下，蘇雲金桿菌的ICP蛋白以原毒素的形式進入昆蟲幼蟲的中腸道，並被蛋白水解酶水解成為毒性多肽分子。活化了的毒素能與敏感昆蟲中腸道上皮細胞表面受體相互作用，形成膜孔道，破壞細胞的滲透壓和離子平衡，引起細胞腫脹甚至裂解，幼蟲停止進食，飢餓而死。然而，Bt毒蛋白的應用也存在不少問題。一是ICP抗蟲譜相對較窄。雖然目前已分離到眾多的ICP基因，幾乎覆蓋了全部鱗翅目害蟲，但具體而言，每種ICP的抗蟲譜都較窄；二是昆蟲易對ICP產生耐受性。印度谷螟長期飼餵含有ICP的人工飼料後產生明顯的耐受性，其半致死劑量提高了250倍。其它許多昆蟲也在實驗條件下產生了不同程度的耐受性。研究表明，ICP毒性降低的主要原因是它與幼蟲中腸道上皮細胞表面受體的親和力降低了。因為轉基因植物往往使用單一ICP基因，昆蟲產生耐受性的問題將更為突出。
所以，儘快克服害蟲耐受性是當前抗蟲植物基因工程面臨的關鍵問題。科學上一般採用以下三種方法第一，同時使用兩個以上的ICP基因轉化農作物，即使害蟲對其中一種毒蛋白產生耐受性，也不至於喪失植物的抗蟲能力。這個方法可能並不好，因為前述印度谷螟等都是在飼餵混合Bt毒蛋白時產生耐受性的。第二，引入特異表達機制，使導入植物的ICP基因只在受害蟲攻擊侵害時或只在作物易受害蟲攻擊部位高效表達，減少產生耐受昆蟲種群的環境選擇壓。這個方法可能在一定程度上延緩害蟲耐受性的發生，但並不能從根本上解決問題。防止害蟲耐受性發生最有效的方法是聯合使用ICP或其它不同功能的、昆蟲特異性毒蛋白基因，如蠍毒基因、胰蛋白酶抑制劑基因、α-澱粉酶基因等，保證轉基因植物同時表達數個具有不同毒性機制的蛋白，既拓展了抗蟲譜，又使得昆蟲難以產生耐受性，具有廣闊的應用前景。問題在於，如果人類，尤其是嬰兒、小孩和老人，長期食用這些含有毒蛋白的轉基因種子，會不可避免地產生某些不良反應。而克隆分離豆莢特異表達基因的啟動子，將這個(些)啟動子插入BmkIT毒蛋白基因上遊，導入農桿菌中間載體後轉化大豆外植體，獲得具有抗蟲性、但種子中沒有任何毒蛋積累的新型工程大豆株系，可能是克服這個難題的唯一有效方法，肯定會在生產上發揮巨大的作用。
內容及方案克隆豆莢特異性表達基因並獲得指導這個(些)基因特異表達的啟動子，插入東亞鉗蠍昆蟲毒蛋白Bmk IT編碼區上遊，構成嵌合基因，通過介體導入植物染色體DNA中，獲得帶有豆莢特異表達啟動子和昆蟲毒蛋白基因Bmk IT的工程植物(見圖1)。該植物具有較強的抗蟲性，但種子內不積累或基本不積累(＜大豆總蛋白的0.0001％)昆蟲毒蛋白。
優點及效果1).該轉基因植物具有顯著的抗蟲性，能在很大程度上減輕蟲害，提高大豆的產量和品質；2).該大豆種子內沒有表達昆蟲毒蛋白，提高了人類食用安全係數。


圖1.嵌合啟動子的構建及基因在豆莢內的特異表達示意實施例本實驗設計方案為圖權利要求
1.一種豆莢內特異表達毒蛋白的轉基因植物，其特徵是(1)克隆得到控制植物豆莢內特異表達基因的啟動子；(2)將該啟動子克隆到昆蟲毒蛋白編碼區(基因)的5′上遊端；(3)所轉化基因只在豆莢內表達，該植物種子內沒有或只有極微量昆蟲毒蛋白的累積；(4)能顯著提高食用轉基因植物種子的安全性。
2.根據權利要求1(3)所述，其特徵在於將僅在豆莢內特異表達的啟動子與毒蛋白基因相連，構成嵌合基因和表達載體，轉化植物後獲得豆莢內表達毒蛋白，對昆蟲有毒殺作用，但種子內沒有這種毒蛋白積累的植株。
3.根據權利要求1(4)所述，其特徵在於這種轉基因植物種子食用的安全性，這一設想可以在玉米、豆類、花生和油菜等農作物品種及許多核果類木本植物上實現。
全文摘要
克隆控制豆莢內特異表達基因的啟動子；將該啟動子克隆到任何昆蟲毒蛋白編碼區(基因)的5′上遊端；用常規方法導入植物並獲得轉基因抗蟲株系；所轉化基因只在豆莢內表達，該植物種子內沒有或只有極微量昆蟲毒蛋白的累積；在農業生產上推廣這一技術後，能顯著提高食用轉基因植物種子的安全性。
文檔編號A01H1/06GK1143113SQ9610481
公開日1997年2月19日 申請日期1996年4月30日 優先權日1996年4月30日
發明者朱玉賢 申請人:北京大學