帶有標準探針的dna微陣列以及包含該陣列的試劑盒的製作方法

2023-09-19 23:09:35 6

專利名稱：帶有標準探針的dna微陣列以及包含該陣列的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及到對檢體中含有對具有目的鹼基序列的核酸量的定量分析有用的DNA微陣列。更具體講，涉及到使用在固相上固定了帶有與檢體中含有的具有目的鹼基序列的核酸互補的鹼基序列的核酸探針的DNA微陣列，進行定量分析時，可使定量精度提高的DNA微陣列以及利用該DNA微陣列進行檢出操作中利用的檢測用試劑盒。
背景技術：
作為基於雜交法的基因DNA的檢出、測定法的發展，有關在基板上固定多種核酸探針，用於對檢體樣品中所含有的基因DNA同時進行多次檢出試驗的基因晶片(DNA晶片、微陣列)的研究近年來進步神速。利用這樣的基因晶片(DNA晶片、微陣列)對檢體樣品中含有的基因DNA進行檢出、測定的方法預期可應用在分子生物學研究、遺傳疾患、傳染病診斷等各個領域。
基因晶片的基本形態是依據雜交法，將用於檢出目的基因DNA的多種具有與目的基因鹼基序列互補的鹼基序列的單鏈核酸片段以陣列狀固定在玻璃等基板表面。作為雜交探針被利用的具有與目的基因互補的鹼基序列的單鏈核酸片段一般利用稱為寡DNA的通過化學合成的DNA寡聚物，或利用稱為cDNA的以來自生物組織基因作為模板通過酶生物合成的互補鏈DNA片段等。關於單鏈核酸片段向基板表面的固定，如果使用寡DNA，例如象US5474796(或、特表平9-500568號公報、申請人ProtoGene Laboratories)所述方法那樣，大致有預先將末端固定在基板上，然後在基板上依次合成DNA分子本身，做成固定的核酸片段的方法，以及例如象特開平11-187900號公報(申請人佳能株式會社)所述方法那樣，通過另一途經合成寡DNA後、利用各種結合手段，將核酸片段固定在基板上的方法。
作為將另外途經製備的核酸片段固定於基板上的手段，有各種各樣的方式，例如利用基板帶有的電荷和核酸片段的電荷的吸附固定法，以及將聚-L-賴氨酸、氨基矽烷偶聯劑等被覆基板表面，利用該被覆膜使固定效率提高的固定法等。
現在，一般使用的DNA微陣列不搭載用於含有目的鹼基序列的核酸的定量分析的特別探針等。以往，無論是利用在固相表面的依次合成法製作的DNA微陣列，還是利用裂隙針法製作的DNA微陣列，由於內含起因於該製作方法的偏差，例如利用核酸配列的合成效率的偏差、由裂隙針點頭滴到基板的探針液量的偏差，以及固定率的偏差等，在定量精度、再現性中都存在問題。而有人提出了可解決這些DNA微陣列製作時偏差使用噴墨的製作法(特開平11-187900號公報)等。
另一方面，對於供通過DNA微陣列進行基因檢查的檢體，由於靈敏度的問題，一般都對含有目的鹼基序列的核酸實施擴增操作，獲得摻入了同時可檢測的標記物的擴增產物。該擴增操作的基本技術稱為PCR，在美國專利第4683195、第4683202、第4965188等有記載。然而，PCR在其擴增反應過程中含有很多控制困難的要素，例如，即使是對同一樣品同時進行擴增時，擴增產物的收率也會出現從數倍至數十倍之間的偏差。為了解決這個擴增產物產率不確定性，進行很多研究，發明了競爭(Competitive)PCR法等。競爭PCR法在P.D.Siebert等人論文(Nature359；557-558(1992)，Bio Techniques 14；244-249(1993))等有詳細報導。而作為其它的方法，如向從患者等採取的檢體中添加已知量的作為內標準的核酸，在含有目的鹼基序列的核酸擴增反應進行的同時內標準核酸也進行擴增，由該內標準核酸的擴增率推定含有目的鹼基序列的核酸的擴增率的手法等。

發明內容
如上所述，使用DNA微陣列，在對含有目的鹼基序列的核酸進行定量分析時，存在著影響其定量的各種各樣的不穩定因素。
首先在DNA微陣列製作時，存在著來自固定於基板上探針量的偏差的精度、再現性的低可靠性。另外，存在著起因於PCR法中的含有目的鹼基序列的核酸擴增效率的不確定性，檢體所含的具有目的鹼基序列核酸的擴增率中存在著偏差。以往，這些不同因素的偏差利用另外的各種方法對他們分別進行檢定後，供使用DNA微陣列的定量分析，對分析結果根據各個檢定結果進行修正後，得到實際的定量。
這些多種類的檢定操作都是非常繁雜的，另外由於需要長時間操作，所以在處理多個檢體時，檢定操作成為阻礙其工作效率的要因。
本發明正是要解決上述課題，本發明的目的在於提供使這些檢定操作顯著簡化，對檢體中含有目的鹼基序列的核酸進行定量，測定時可以獲得其修正數據的DNA微陣列，以及此時利用的檢定用試劑盒。
本發明人為了解決上述課題，進行了銳意研究，發現了在製作DNA微陣列時，作為探針的固定法，通過採用利用噴墨將另外途經製作的核酸探針塗布、固定在基板上的製作法(特開平11-187900號公報)，除了含有目的鹼基序列的核酸的檢出用核酸探針之外，在同一DNA微陣列上還並用內標準用探針和/或外標準用探針，通過同樣手法固定的DNA微陣列，可以使這些檢定操作顯著簡化。根據這些見解，本發明人在使用上述的DNA微陣列的檢測操作中也考察了用於使這些檢定操作精度更高、運用簡便的試劑盒，從而完成本發明。
即，本發明的DNA微陣列是在基板上固定了用於檢測檢體中所含的具有目的鹼基序列的核酸分子的帶有與該目的核酸分子的鹼基序列互補的鹼基序列的核酸探針的DNA微陣列中，其特徵在於含有選自用於對上述檢體中所含的上述含有目的鹼基序列的核酸分子的含有濃度進行定量的含有該目的鹼基序列的核酸的擴增反應檢定用中添加的一種以上的內標準用探針、檢出操作以及探針量檢定用中添加的一種以上的外標準用探針、用於對通過與形成上述核酸探針同樣的手法形成的上述探針的存在量或密度進行檢定的一種以上的探針中的一種以上的探針。此時固定在基板上的該內標準用探針和/或該外標準用探針最好是以4點以上的量或密度的一系列群固定在基板上。
另外，固定於DNA微陣列上的該內標準用探針優選由與來自內標準核酸擴增反應產物的不同鏈長相對應的二種以上的探針構成。另外，該外標準用探針對於添加的外標準核酸，優選由含有任意核酸鹼基數的非互補鹼基序列的二種以上探針構成。
另外，該內標準用探針和外標準用探針如果是在基板上固定了合成核酸的探針更好。此時該合成核酸的鏈長最好是15鹼基～75鹼基長。
另外，本發明的DNA微陣列，當具備內標準用探針時，在對含有目的鹼基序列的核酸進行擴增反應時內標準核酸與含有該目的鹼基序列的核酸同時擴增，對擴增反應的擴增效率進行測定，但本發明也提供該內標準核酸的擴增反應用引物組的發明。即本發明涉及的引物組，是在作為進行含有目的鹼基序列核酸的擴增反應時，與含有該目的鹼基序列的核酸同時進行擴增的內標準核酸的擴增反應用引物組，其特徵在於，將來自含有目的鹼基序列的核酸的擴增產物的鏈長與來自該引物組參與的內標準核酸的擴增產物的鏈長設計成相同。
另外，本發明也一併提供檢測用試劑盒，該試劑盒是含有上述內標準核酸的擴增反應用引物組，適合利用本發明的DNA微陣列對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測用途的檢測用試劑盒。即本發明的目的鹼基序列檢測用試劑盒是在作為利用DNA微陣列在對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測時，在對具有該目的鹼基序列的核酸進行擴增反應時，包含與含有該目的鹼基序列的核酸同時擴增的內標準核酸擴增反應用引物組的檢測用試劑盒，其特徵在於，當來自上述含有目的鹼基序列的核酸的擴增產物的鏈長為二種以上時，包含二種以上對應於這不同鏈長的權利要求7所述的引物組。此時，可以做成例如特徵如下的目的鹼基序列檢測用試劑盒該多個引物組包含各1種以上擴增產物鏈長200bp以下用、200～500bp用、500～2000bp用、2000bp以上用的引物。
另外，在本發明的目的鹼基序列檢測用試劑盒中，是在作為利用DNA微陣列在對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢出時，在對該含有目的鹼基序列的核酸進行擴增反應時，包含與具有該目的鹼基序列的核酸同時擴增的內標準核酸的檢測用試劑盒，優選是特徵如下的試劑盒作為內標準核酸包含二種以上與檢測目的鹼基序列沒有同源性的來自微生物的核酸或來自病毒的核酸。
另外，本發明的DNA微陣列當備有外標準用探針時，本發明也一併提供檢測用試劑盒，該試劑盒是含有上述外標準核酸，適合利用本發明的DNA微陣列對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測用途的檢測用試劑盒。即本發明的這個目的鹼基序列檢測用試劑盒，是在利用DNA微陣列對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測時，含有添加到檢體的外標準核酸的檢測用試劑盒，其特徵在於，包含二種以上作為用可檢測標記物標記的合成核酸的外標準核酸。而此時該標記物可以是螢光物質、放射性物質、發光物質中的任一個。
另外，在本發明的DNA陣列中，核酸探針由單鏈核酸構成，具體來說，由單鏈核酸構成的核酸探針可以由DNA、RNA、PNA(肽核酸)、cDNA(互補DNA)、cRNA(互補RNA)中的任一個構成。另外，DNA微陣列也可以做成由作為核酸探針的單鏈核酸和通過對該核酸探針雜交而導入的靶核酸兩方構成的形態的DNA微陣列。


圖1表示本發明實施方式的一例，是表示內標準用探針、外標準用探針、外標準核酸、以及內標準核酸的擴增用引物組、該擴增產物的圖。
圖2表示本發明的DNA微陣列的一實施方式模式，是表示DNA微陣列中具備的內標準用探針的配置圖。
圖3是表示在利用本發明的DNA微陣列的定量分析中，用於利用DNA微陣列中具備的外標準用探針算出探針固定化率的標準曲線的做成例子的圖。
圖4是表示在利用本發明的DNA微陣列的定量分析中，用於利用DNA微陣列中備有的內標準用探針算出PCR擴增倍率時的標準曲線以及因擴增產物的核酸鏈長不同造成的檢測靈敏度不同的圖。
圖5表示本發明的生物晶片的構成的一個例子的平面配置和斷面形狀(AA中的斷面)模式圖。
圖6是表示對於生物晶片，測定的2次離子強度和DNA形成密度(每一探針點的DNA分子數)的關係圖。
具體實施例方式
本發明的第一個方式是在DNA微陣列上搭載內標準用探針。
所謂內標準用探針從廣義上講是用於對為了輔助含有目的鹼基序列的核酸的定量利用的內標準核酸進行檢出的探針。指的是作為具有與檢體中存在量已判明的內標準核酸(基因)互補的鹼基序列，可與內標準核酸(基因)結合的核酸探針，通過測定內標準核酸的存在量和含有目的鹼基序列核酸存在量的相對比，可以對含有目的鹼基序列的核酸進行定量的探針。例如，在生物體細胞中，形成細胞骨架的基因(看家基因)的轉錄產物由於其表達量變動很小，而表達量也比較多，所以常常作為內標準核酸使用。具體來說，可例舉如GAPDH或β-肌動蛋白的mRNA、核糖體RNA等。
另外，所謂狹義的內標準核酸指的是在利用以PCR為代表的核酸擴增反應，進行核酸量的擴增或為了在含有目的鹼基序列的核酸中添加可檢測的標記物進行擴增反應時向檢體中添加已知量的具有已知鹼基序列的核酸。在檢體中添加的狹義內標準核酸選擇在進行含有目的鹼基序列的核酸的擴增反應或標記反應時，以與含有目的鹼基序列的核酸同樣效率進行擴增或標記的核酸。擴增反應或標記反應後，通過對添加的內標準核酸量進行定量，可以算出擴增倍率或標記付加率，另外，作為相對於內標準核酸存在量的相對比可以求出含有目的鹼基序列的核酸的存在量。
本發明的第二個方式，是在DNA微陣列上搭載針對外標準核酸的探針(外標準用探針)。
所謂外標準核酸主要是指是以修正DNA微陣列製作工序和/或檢測、測定工序中的偏差等目的添加到檢體中的含有已知鹼基序列的核酸。具體來說，可以使用向合成DNA、質粒DNA等純度高的核酸中導入了可檢測、定量的標記物後的核酸。而附加在這樣的外標準核酸的標記是事先對其標記效率等進行了檢定的標記。該外標準核酸只要是與DNA微陣列的種類(對象基因)無關的，具有與檢測目的的鹼基序列沒有同源性的鹼基序列，在整個DNA微陣列可以使用都相同的序列。外標準用探針是具有與上述外標準核酸互補的鹼基序列，可有選擇結合的核酸探針。
外標準核酸、外標準用探針通過同時使用數種類的組，可以進行DNA微陣列具有的性能、即定量性的檢定。具體來說，例如，準備搭載了3種以上、最好是5種以上的外標準用探針的DNA微陣列，將與此對應的標記過的外標準核酸各個種類的每一種改變濃度(已知量)後添加到含有目的鹼基序列的核酸檢測操作中。通過畫出這些外標準核酸的檢出量的曲線，可以做成標準曲線。另外，使用一種外標準核酸和外標準用探針組時，也可以對固定在DNA微陣列的探針量進行檢定。即使用一種類的組，也可以對DNA微陣列間(基板間)探針固定效率的偏差進行修正。該方法首先是將外標準用探針以3階段以上、最好是5階段以上濃度固定於DNA微陣列上。通過使充足量的已標記過的外標準核酸反應，對與微陣列結合的外標準核酸的量進行測定，可以測定實際固定在DNA微陣列上的探針分子數比。
本發明的第三個方式是為了更有效、而且更簡便利用上述的第一以及第二方式的DNA微陣列的檢出、定量法使用的檢測用試劑盒。
在利用具備內標準用探針的DNA微陣列的檢測試劑盒中，包含內標準核酸的擴增用引物組。另外，在利用具備外標準用探針的DNA微陣列的檢測試劑盒中包含用可檢測和定量的標記物標記的、而且其標記率已檢定的外標準核酸。這些核酸無論哪一個都要對應於內標準用探針、外標準用探針，作為至少一種，根據需要也可以是數種～十幾種為一組，整合在檢定用試劑盒中。
內標準核酸的擴增用引物組由於各種必要的條件不同，其內容可變化。首先在以內標準核酸為模板的擴增反應中，為了生成含有與內標準用探針互補的鹼基序列的擴增產物，必須設定引物組的鹼基序列(對應位置)。另外，同時也必須留意在對核酸進行擴增時，以含有目的鹼基序列的核酸作為模板，不要生成不優選的擴增產物。還有，作為內標準，為了使定量性的精度提高，在含有目的鹼基序列的核酸的擴增反應中生成的擴增產物的核酸鏈長和使用本試劑盒含有的擴增用引物對內標準核酸進行擴增時得到的擴增產物的核酸鏈長要避免差異過大。具體來說，將來自內標準核酸的擴增產物的核酸鏈長設定數階段，優選選擇使得來自內標準核酸的擴增產物的鏈長某一個與來自含有目的鹼基序列的核酸的擴增產物的鏈長相同。例如，製備得到的擴增產物鏈長可為200bp以下、200～500bp、500～2000bp、2000bp以上4種的四種引物組，優選選擇與來自含有目的鹼基序列的核酸的擴增產物的鏈長相適合的引物組。不用說，將該擴增產物鏈長的設定範圍進一步細分，製備多個引物組也沒有任何問題。
用作內標準核酸的核酸最好使用可以獲得的含有已知鹼基序列、而且純度高的核酸，例如，在分子生物、醫療領域中一般市售的核酸，例如可以利用質粒載體、噬菌體DNA、微生物基因組等。特別是由於質粒載體、噬菌體DNA等純度高、可以比較簡單地獲得單一種類的樣品，因此更適用。
另外，用可檢出、定量的標記物標記的、其標記率已檢定的外標準核酸也適合利用可以獲得的含有已知鹼基序列、而且純度高的核酸，例如，合成DNA、質粒載體等更適用。合成DNA由於標記效率穩定，而且每分子量的標記率高，因此特別優選。
此外，在本發明的DNA微陣列中內標準用探針和外標準用探針雙方都具備的方式更好。此時檢定用試劑盒最好做成具備內標準核酸的擴增用引物組和外標準核酸雙方的試劑盒。
還有，外標準探針、內標準探針在分別進行處理時可以使用相同的探針(的序列)。但在同時使用時，由於競爭需要使用不同的序列(不同種類)的探針。濃度標準探針可與外標準探針兼用。
本發明還提供DNA陣列本身的分析方法。以下用具體的實施方式進行說明。
在以往的利用TOF-SIMS法的定量分析中，存在以下的問題。即、其測定條件、具體來說存在著1次離子的照射條件(加速能、入射角、離子種類、照射量)、2次離子的檢出條件(能幅)、以及樣品為絕緣體時，存在著由於因帶電修正被脈衝照射的電子線引起的脫離，以及帶電中和的程度等不同，被檢測的2次離子強度也不同的問題。
特別是樣品為絕緣體時，標準樣品和被測定樣品在照射1次離子時的帶電狀況不一定要相同。因此，為了達到高定量性，每改變一次樣品，都需要嚴格使測定條件最適化，最適化不充分時，就會喪失測定結果的精度。另外，標準曲線的做成需要與作為測定對象的濃度的水準數相同數目的標準樣品，所以帶來繁瑣的操作。
另外，按照P.Lazzeri等報導的那樣旋塗法製作核酸晶片的標準樣品時，如果在很大面積平均，雖然可做到濃度再現性好的塗布形成，但在TOF-SIMS法的點大小的測定領域、具體來說，在每一個從數10μm2到數100μm2的微小區域，不能說塗布面內的均一性充分，對測定結果的可靠性帶來很大的問題。本發明為了解決上述課題，提供通過可達到高定量性的飛行時間型2次離子質量分析(TOF-SIMS)法對在基板上以矩陣狀配置許多核酸相關物質(探針)的所謂核酸晶片探針進行分析的核酸晶片的分析方法，以及利用該分析方法簡便決定存在於配置在核酸晶片上的核酸探針點的核酸量、即形成密度(每一探針點的核酸量)的可能的方式的DNA微陣列。
本發明人為了解決上述課題進行銳意研究，發現除了配置在核酸晶片上的形成密度未知的核酸探針點之外，如果與上述核酸探針點形成同樣的手法在基板表面的一部分設置每一點的平均核酸密度已判明的濃度基準用核酸探針點，對於該濃度基準用核酸探針點進行2次離子質量分析檢出的2次離子信號強度作為基準，可以通過2次離子質量分析法決定配置在基板上的未知濃度的核酸探針點的核酸濃度，還有，該定量性表現出很好的再現性。
另外，在本實施方式的DNA微陣列中，由單鏈核酸構成的核酸探針和通過對該核酸探針雜交導入的靶核酸兩方也可以存在於該基板上。
還有，本實施方式作為在基板上以矩陣狀配置了由許多核酸相關物質構成的核酸探針的DNA微陣列的製造方法，其特徵是在DNA微陣列，在上述核酸探針點形成的基板表面的一部分設置每一點的平均核酸密度已確定的濃度基準用的核酸探針點，至少包括在上述基板上形成矩陣狀核酸探針的工序，和在上述核酸探針點形成的基板表面的一部分中，通過與上述核酸探針點形成相同手法，形成每一點的平均核酸密度已確定的濃度基準用核酸探針點的工序。本實施方式的DNA微陣列，其特徵是在DNA微陣列基板上的一部分形成已經形成的探針點的核酸濃度已知的區域，由在該區域通過TOF-SIMS法檢測的2次離子強度做成標準曲線，使用該標準曲線，由在DNA微陣列基板上的其它區域檢測的2次離子強度決定固定在該探針點的核酸探針的核酸量(形成密度)。
即、在本實施方式的DNA微陣列中，在許多核酸相關物質以矩陣狀配置在基板上的所謂DNA微陣列形成的基板上的一部分設置每一點核酸濃度已知的核酸探針點，通過TOF-SIMS法進行定量測定時，用作濃度基準。另外，作為每一點的核酸濃度已知的核酸探針點，在DNA微陣列基板上通過形成階段式改變了核酸濃度的核酸探針點，此時可以做成標準曲線，可以進行具有更高定量性的測定。對於一般在濃度基準中利用的每一點核酸濃度已知的核酸探針點，使用用通過另外途經在同一製作條件製作的核酸探針點，預先通過化學分析每一點含有的核酸濃度已決定的核酸探針點。
本發明中的DNA微陣列一般來說使用外形尺寸為1cm×1cm、1英寸×1英寸(25.4mm×25.4mm)、或玻片尺寸(例如、26mm×76mm)的基板製作，探針點矩陣被做成配置在內部的平面形態。本發明就象已敘述的那樣，採用利用TOF-SIMS法分析的手段，利用設置在同一基板內的上述濃度基準，可以高精確度地對固定於DNA微陣列表面的各矩陣點的核酸探針的濃度進行檢定。
在本實施方式的DNA微陣列中，配置在基板上的核酸探針就象下面所述的那樣，最好是通過共價鍵固定於基板上。為了在共價鍵的固定中利用，例如在基板表面處理過程中，對該基板表面用結合了氨基的矽烷偶聯劑(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧矽烷)和交聯劑N-馬來醯亞胺己醯氧琥珀醯亞胺(EMCS)處理，做成形成被膜的形態也是有效的。
在決定每點含有的核酸濃度時利用的化學分析中，通過對形成許多核酸濃度分別被階段式改變的核酸探針的多個DNA微陣列，例如進行酸處理，將核酸探針從基板分離，對該溶液中含有的核酸探針量、該核酸中的磷的量利用微量分析手段進行分析，通過另外方法進行定量。核酸中磷量的定量中利用的微量分析手段沒有特別限定，最好是高靈敏度、而且高精度的手段，例如ICP-MS法等。ICP-MS法中的磷檢測限度為10ppb程度，為了進行定量，至少需要該值的2～3倍、即20～30ppb程度。另外作為樣品量(溶液量)最低限度需要1ml。
而另一方面，利用下面的噴墨法形成核酸探針時，即使在1英寸×3英寸面積上形成例如200行×300列程度的矩陣大小的核酸探針也並不那麼困難。另外，噴墨法中的1次吐出量表現出高再現性，可以高準確度地推定其平均值(pl級)。另外，在上述濃度基準用點的製作利用的吐出溶液中的探針DNA濃度(μM級)不用說要預先設定。
除了這些值以外，使用吐出量中的探針DNA的固定量(減去經水洗等沒有固定的部分的量、數10％的水平)，為了獲得上述ICP-MS分析所必需的樣品量應當從基板上洗脫的核酸探針點總數可以進行一定程度推定。具體來說，在上述標準條件下製作核酸晶片時，每一類的濃度(μM級)，在平均200行×300列程度的矩陣大小·點的吐出量(pl級)的DNA微陣列，需要使用數10枚。
另外，關於附設在DNA微陣列上的濃度基準用點，每一濃度的核酸濃度已知的探針點數雖然沒有特別限定，但形成多個最好。
本實施方式使用根據在階段式改變核酸濃度的濃度基準用核酸探針點多個間進行檢測的2次離子信號強度做成的標準曲線，可以決定未知濃度的核酸探針點的核酸濃度。此時，通過本發明的分析方法，使用在飛行時間型2次離子質量分析中檢測的2次離子強度在達到更高定量性方面是有效的。
而上述所謂2次離子強度不是計數率，最好是在一定條件下，一定時間計數的積分強度。正確作法是將1次離子劑量作為所謂的static條件的1×1012/cm2以下的一定值，作為由一定面積放出的下面2次離子的計數值(計數的數)。而1次離子的劑量至少需要1×1014/cm2以下。
在利用TOF-SIMS法的測定中，作為利用的1次離子可以使用Cs+離子、Ga+離子或Ar+離子。作為2次離子種類，如來自探針核酸、以及通過雜交導入的靶核酸為單鏈核酸、更具體講為DNA、RNA、cDNA(互補DNA)、cRNA(互補RNA)時構成核酸的骨架的磷酸的P-、PO-、PO2-、PO3-等。另外，由鹼基類脫去質子後的產物，即鹼基類為腺嘌呤時C5H4N5-(134a.m.u.)、為鳥嘌呤時C5H4N5O-(150a.m.u.)、為胞嘧啶時C4H4N3O-(110a.m.u.)、為胸腺嘧啶時C5H5N2O2-(125a.m.u)也可作為2次離子種類檢測。另外，對於核酸探針為RNA探針時，除了取代胸腺嘧啶，對來自尿嘧啶的C4H3N2O2-(111a.m.u)進行檢測以外，可以對與DNA探針同樣的2次離子進行檢測。以作為構成DNA微陣列的基板，例如使用玻璃等絕緣物基板時，與1次離子照射合併，並用的電子線照射需要考慮到1次離子脈衝幅度、頻率以及樣品的電容率、以及玻璃基板的厚度後，決定合適的照射條件。
在本發明的DNA微陣列分析方法中，其特徵是將起因於核酸的2次離子強度相應於1次離子照射的掃描，作為二維圖像，進行定量表示。
實施例以下舉出實施例，對本發明進行更具體說明。這裡給出的實施例雖然是本發明最好實施方式的例子，但本發明並不限定於這樣的實施例所示的方式。
(實施例1)作為內標準用核酸的製備作為內標準用核酸選擇含有已知鹼基序列的質粒DNApUC118(3，162bp、寶酒造株式會社制)。為了做成PCR的模板，按照常規方法，用限制酶EcoR I切斷上述質粒pUC118，做成直鏈DNA。然後經瓊脂糖凝膠電泳確認切斷狀況後，對限制酶切斷反應液通過酚處理、乙醇沉澱，回收目的直鏈DNA。將回收的直鏈DNA按照終濃度為10ng/μl(2.4pmol/ml)溶解於TE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA)中，作為內標準用核酸溶液。
(實施例2)內標準用核酸的擴增用引物的製備根據實施例1製備的直鏈狀DNApUC118 EcoR I Digest的鹼基序列信息，作為PCR用引物選擇如下面表1所示的正向引物5種P1～P5、反向引物4種RP1～RP4。

(P1-PR4序列編號10-18)表1中所示位置表示以限制酶EcoR I的切斷部位的最前頭作為位置1進行編號時，該引物鹼基序列的位置。表1中反向引物，RP1～RP4表示互補鏈上鹼基序列的位置。
表1所示的鹼基序列的各引物合成後，通過高效液相層析(HPLC)進行純化，分別按照終濃度為10pmol/μl溶解於TE緩衝液，作為引物溶液。
圖1示出了以實施例1製備的內標準用核酸pUC118 EcoR I Digest作為模板，使用表1所示引物，進行PCR擴增反應得到的擴增產物的鏈長，以及被利用的正向引物和反向引物的組合。而在反向引物中，通過另一種途經準備在5』末端進行了螢光標記(羅丹明)的引物，進行與上記未標記引物同樣處理後作為螢光標記引物溶液。
(實施例3)內標準用探針的製備根據實施例1製備的直鏈狀質粒DNApUC118 EcoR I Digest的鹼基序列信息，設定以下內標準用探針。
表2

(B-H序列編號1-4)表2中所示位置表示以限制酶EcoR I的切斷部位的最前頭作為位置1進行編號時，該探針鹼基序列的位置。
表2所示鹼基序列的4種內標準用探針合成後，作為用於固定在DNA微陣列上的官能團，按照常規方法分別向各核酸的5』末端導入巰基。官能團導入後進行純化、冷凍乾燥。冷凍乾燥的內標準用探針於冷庫中在-30℃下保存。
圖1表示內標準用探針4種進行雜交的靶鹼基序列的位置。另外，對於各PCR擴增產物也一併示出了靶鹼基序列的位置。
(實施例4)外標準核酸的製備由實施例1準備的直鏈狀質粒pUC118 EcoR I Digest的序列信息設定以下的外標準核酸。
表3

(A-G序列編號5-8)表3中所示位置是表示以限制酶EcoR I的切斷部位的最前頭作為位置1進行編號時，該外標準核酸的鹼基序列位置。該4種外標準核酸具有與表2所示4種內標準用探針互補的鹼基序列。
表3所示鹼基序列的外標準核酸4種分別作為檢測、定量用標記，合成後按照常規方法在各核酸的5』末端導入螢光色素(羅丹明)。螢光標記導入後進行純化，將其溶解於TE緩衝液(終濃度為5μM)，作為外標準核酸溶液。該外標準核酸溶液加入到實施遮光處理的容器上，於冷庫中在-30℃下保存。
圖1對於4種外標準核酸也示出了具有與他互補的鹼基序列的上記4種內標準用探針進行雜交的靶鹼基序列的位置，以及其鹼基序列位置。
(實施例5)DNA微陣列的製作[1]玻璃基板的清洗將合成石英玻璃基板(尺寸25mm×75mm×1mm、飯山特殊玻璃公司制)放入到耐熱性、耐鹼性的槽中，浸入到製備到所定濃度的超音清洗用的清洗液中。於清洗液中浸泡過夜後，進行20分鐘超聲清洗。然後，將基板從清洗液中取出，用純水輕輕洗涮後，於超純水中進行20分超聲清洗。然後將基板於加熱到80℃的1N氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘。再進行純水清洗和超純水清洗，準備DNA晶片用的清洗好的石英玻璃基板。
表面處理將矽烷偶聯劑；KBM-603(信越矽公司生產)按照終濃度1wt％溶解於純水中，於室溫攪拌2小時。然後將清洗好的玻璃基板浸入到矽烷偶聯劑水溶液，於室溫放置20分鐘。取出玻璃基板，用純水輕輕清洗基板表面後，向基板兩面吹氮氣，使其乾燥。然後將乾燥的基板於加熱到120℃烘箱中烘烤1小時，完成表面的偶聯劑處理。隨著該氨基矽烷偶聯劑處理的完成，在基板表面導入了氨基。
另外，準備按照終濃度0.3mg/ml將同仁化學研究所公司生產的N-馬來醯亞胺己醯氧琥珀醯亞胺(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido、以下、略為EMCS)溶解於二甲基亞碸與乙醇的1∶1(體積比)混合溶劑中的EMCS溶液。烘烤結束後，將玻璃基板放冷，然後於室溫在製備的EMCS溶液中浸泡2小時。通過這樣處理，經矽烷偶聯劑處理導入表面的氨基與EMCS的琥珀醯亞胺基反應，將來自EMCS的馬來醯亞胺基導入基板表面。將從BMCS溶液取出的玻璃基板用先前提到的二甲基亞碸和乙醇的混合溶劑清洗。再用乙醇清洗後，將實施了表面處理的玻璃基板在氮氣氛圍下乾燥。
探針DNA利用實施例3製備的4種內標準用探針，按照下述表4所示組成表，配製溶解於純水，具有各種濃度的溶液、混合溶液。各內標準用探針溶液在製備後按照一定量分成小份，進行冷凍乾燥，除去水分。
表4
通過B J印表機吐出DNA、製備含有與基板結合的甘油7.5wt％、硫二甘醇7.5wt％、尿素7.5wt％、Acetylenol EH(川研フアインケミカル公司制)1.0wt％的水溶液。然後將如表4所示的預先製備為小份的27種探針溶液冷凍乾燥物加到所定量的上述混合溶劑，溶解至規定濃度。將得到的DNA探針溶液填充到泡沫噴墨印表機(商品名BJF-850佳能公司制)用墨盒，裝到印字頭上。
另外，這裡使用的泡沫噴墨印表機是可改造成為能進行平板印刷的印表機。另外該泡沫噴墨印表機根據所定的文件作成方法，通過輸入印字圖樣，向對應的圖樣吐出點，在約120微米孔距，可以點印約5微微升的DNA溶液。
然後，使用該改造泡沫噴墨印表機，對於1枚表面處理後玻璃基板，按照圖2所示配列順序，分別點印27種探針溶液。確認進行了目的點印字後，於加溼盒內靜置30分鐘，使玻璃基板表面的馬來醯亞胺基和DNA探針5』末端的巰基反應。
清洗反應30分鐘後，通過含有100mM的NaCl的10mM磷酸緩衝液(pH7.0)將殘留在表面的DNA溶液衝洗掉，得到在玻璃基板表面固定了點印成矩陣狀的單鏈DNA基因晶片(DNA探針·陣列基板)。
(實施例6)通過外標準核酸對基板進行檢定製備8枚實施例5製作的DNA微陣列。對於這8枚DNA微陣列，浸入到以下所示組成的封閉液，於室溫放置3小時，實施封閉處理。
表5封閉溶液組成

另外，製作8種含有下面表6所示組成的外標準核酸的雜交溶液。而雜交溶液的基本溶劑是100mM NaCl、10mM磷酸緩衝液(pH7.0)(以下、稱為基本緩衝液)，將表6所示的外標準核酸單獨或混合物溶解於該基本緩衝液中，無論是單獨，還是混合，合計的終濃度為30nM。
表6

記入表6中外標準核酸欄的省略號是表3所示的外標準核酸名稱第一個文字，表示含有該外標準核酸。
封閉處理結束後，用基本緩衝液淋洗DNA微陣列。將封閉處理後的DNA微陣列各1枚浸入到準備的8種雜交溶液中，用乙烯薄膜密封。於45℃進行3小時雜交反應。
反應結束後，將DNA微陣列從乙烯薄膜中取出，進行以下清洗。
2×SSC+0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS) 55℃ 5分鐘×3次0.1×SSC.室溫1分鐘×1次，其中，2×SSC的組成為NaCl 17.5g/l、檸檬酸三鈉2水合物8.8g/l，用氫氧化鈉溶液調整到pH7.0。
清洗結束後，用氣流除去液體，進行乾燥。乾燥後用DNA陣列掃描儀(GenePix 4000B、Axon公司制)，測定各個點的螢光量。測定數據用DNA陣列掃描附帶的解析軟體(GenePix Pro 3.0)進行解析。
(實施例7)固定探針的密度檢定由測定的螢光量求各探針的密度比。如表7所示。
表7

密度比是以Ink No.5的DNA探針固定密度作為100％時，作為對他的相對比求出的。另外各外標準核酸的標記率表示通過另一方法測定，用其標記率進行修正的密度比。
表7中Ink No.1～4的密度比(螢光量)不到理論值的200％的是由於探針核酸的固定量達到了基板容許量(飽和量)。
另外，表4中所示的Ink No.17～27混合探針的各探針密度比分別表示依據對應的各探針濃度的單獨探針密度比的值。
(實施例8)使用外標準核酸的標準曲線的做成由實施例7結果，檢定各探針固定量，使用該修正數據做成標準曲線。
具體來說，使用實施例5製作的DNA微陣列，與實施例6同樣進行雜交實驗。但外標準核酸的添加量為如下所述的混合量。外標準核酸的混合比為A-Rho66.7％(20nM)C-Rho25.0％(7.5nM)E-Rho6.7％(2.0nM)G-Rho1.7％(0.5nM)按照與實施例6同樣步驟進行測定和解析。
使用測定結果和實施例7求出的探針密度的修正值，做成標準曲線。圖3表示做成的標準曲線。
(實施例9)使用PCR產物做成標準曲線使用實施例1製備的內標準用核酸、以及實施例2製備的內標準用引物，做成PCR擴增產物的標準曲線。
首先使用表8的內標準用引物的組合，按照常規方法進行PCR擴增反應。PCR反應液組成如下所示。另外，在本實施例使用的反向引物中，使用了在實施例3中準備的5』末端進行了螢光標記的引物。
PCR反應液PCR預混合反應液(2×) 25μlpUC118 EcoR I Digest 1μl混合引物(表8) 6μl純水 18μl/總計 50μl溫度循環(92℃10秒 62℃15秒 72℃30秒24循環)表8

*表示帶有螢光標記反應後進行凝膠過濾，對PCR擴增產物進行純化。用TE緩衝液調整容量後，測定240nm的吸光度和螢光量，對核酸量和螢光標記量進行定量，求出標記率。
使用求出標記率的內標準擴增產物，與實施例8同樣進行雜交反應，測定起因於與探針結合的內標準擴增產物的螢光量。
使用內標準擴增產物標記率和實施例7求出的探針密度的修正值，由測定結果做成標準曲線。圖4表示做成的標準曲線。
研究圖4所示的標準曲線，可以看出，標準曲線斜率存在的差異與擴增產物分子量(鏈長)有關。即，為了更準確地對含有目的鹼基序列的核酸進行定量，判斷需要具有目的鹼基序列核酸的擴增產物和採用可給出具有同等鏈長的內標準擴增產物的引物組合。
以下實施例表示使用通過與核酸探針形成相同手法形成的在上述探針的存在量或密度檢定用添加的濃度標準用探針的例子。
(實施例10)圖5是表示在基板上結合許多點狀探針的探針陣列的平面配置和斷面構造的模式圖。501為在任意條件下製作的探針群，502為核酸濃度已知的探針群。在斷面圖中，503為基板、504為由有機物質構成的表面處理層、500為核酸探針。以下就圖5例舉的構成的探針陣列，對於應用眾所周知的方法(特開平11-187900號公報記載的方法9)進行製作的工序進行說明。
〔1〕玻璃基板的清洗和〔2〕表面處理與實施例5同樣進行。
〔3〕探針DNA的合成委託DNA合成業者(ベツクス)，合成序列編號9的單鏈核酸(dT的40聚體)。另外，對於序列編號1的單鏈DNA的5』末端在合成時使用巰基修飾劑(グレンリサ一チ)，導入巰基(SH)。DNA合成後，通過常規方法進行脫保護、DNA的回收，另外，在純化中使用HPLC。從合成到純化為止的一系列工序都委託合成業者。
序列編號95』-HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTT
TTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 3』〔4〕通過熱噴墨印表機吐出DNA、和與基板的結合將〔3〕所述的序列編號1的單鏈DNA按照終濃度8μM溶解於含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％、硫二甘醇7.5wt％、乙炔醇(商品名Acetylenol EH；川研フアインケミカル公司制)1wt％的溶液。
另外，將使用作為熱噴墨法一種的泡沫噴墨法的泡沫噴墨印表機BJF-850(佳能)用的印表機頭BC-50(佳能)改造成可以吐出數100μl溶液。將實施了這樣改造的噴頭搭載到改造成可向作為平板的石英基板上吐出墨水的吐出描圖機上。向該噴頭的改造槽部注入數100μl上述DNA溶液，將EMCS處理基板裝到吐出描圖機上，向EMCS處理表面點印。另外，點印時的吐出量為4pl/Droplet，點印的範圍向基板上20mm×30mm範圍吐出200dpi、即以127μm的孔距吐出。在該條件下，點成矩陣(157行236列)狀的點的直徑約為50μm。
點印結束後、將基板於加溼盒內靜置30分鐘，使基板表面的馬來醯亞胺基和核酸探針5』末端的巰基(-SH)反應，固定DNA探針。然後，用純水清洗基板，保存在純水中。DNA結合基板(DNA晶片)在通過TOF-SIMS分析之前吹氮氣，進行乾燥，於真空乾燥器中進一步乾燥。通過這樣的條件，製作共計15枚DNA晶片。
另外，點印中使用的DNA溶液中的序列編號1的單鏈DNA濃度選擇5μM、2.5μM，通過同樣操作製作各25枚、35枚DNA晶片。將以上3種作為標準DNA晶片。
然後，在與上述同樣條件下製作使用單鏈DNA的一般溶液濃度(約8μM)的DNA晶片。但在該DNA晶片中，從端部的第1行到第3行使用在標準DNA晶片製作中使用的同樣單鏈DNA溶液三種。即，在基板最端部的第1行，配置以濃度10μM的DNA溶液形成的探針點，在第2行，以濃度5μM的DNA溶液形成的探針點，在第3行以濃度2.5μM的DNA溶液形成的探針點。另外，使用其它組的DNA濃度8μM溶液製作從端部的第1行至第3行以外的行(第4行至第157行)。而探針陣列的數目可以任意設定。
(實施例11)核酸晶片上的核酸的定量將用3種DNA濃度製作的標準DNA晶片分別用酸清洗之後，使DNA探針溶解後，在該酸溶液不飛散的條件濃縮至1ml以下。然後向該濃縮溶液中加超純水1ml進行定容。將該溶液導入ICP-MS裝置後測定P(磷)的重量。以該值為基礎，考慮測定的點數(點印的數)，決定用各濃度製作的DNA探針的(每1點的)DNA分子數的平均值。另外，在各DNA濃度下製作的基板的枚數在考慮ICP-MS裝置中的P的檢出限界濃度(約10ppb)和各基板上的DNA分子數之後決定，並不限定於實施例10給出的枚數。
(實施例12)TOF-SIMS測定將圖5所示的DNA晶片移到飛行時間型二次離子質量分析裝置(TOFSIMS IVION TOF社)的分析室，在表1的條件下照射直至1次離子的注入劑量達到1×1012atoms/cm2為止，對其間檢出的2次離子PO3-(質荷比78.958amu(アトムマスユニツト))進行累計，求累積強度。圖6表示在從第1行至第3行的各DNA濃度的點位置測定的2次離子強度的平均值和DNA的形成密度(每1點的DNA分子數)的對應關係。其中，在對探針DNA進行固定之前，將在表面處理後基板測定PO3-的強度作為背景值。
確認各行的點中的DNA形成密度與2次離子強度成比例。在相同測定條件下，對於將噴墨印表機吐出的DNA溶液中的核酸濃度定為8μM形成的核酸探針，進行TOF-SIMS測定時，由PO3-的計數的數求出的各點中的DNA形成密度(每1點的DNA分子數)大約為2.0×107，在任意選擇的10個點內的偏差在20％以下。
表9 TOF-SIMS的測定條件

(實施例13)形成密度分布的圖像表示對實施例12使用的相同樣品的多個核酸探針進行設定後，在樣品面進行1次離子掃描，使發生的2次離子對應於各掃描點來表示，將在各掃描點得到的P-的強度分為多個階段，設定類似色彩，對P-的強度分布，即核酸的面密度(每一探針點的核酸分子數)形成密度的分布進行定量比較。
產業上利用的可能性就象以上說明的那樣，通過本發明可以提供簡便、且詳細的分析的DNA微陣列。具體來說，在進行實際目的的核酸檢測操作的同時，可以簡便實施檢定操作。另外，在同時進行該檢定操作本身時，結果可以得到高精度的檢定結果。因此，通過利用本發明的DNA微陣列，在目的核酸分子的定量分析中的定量性精度顯著提高。另外，在該定量分析操作中，對應於本發明的DNA微陣列，作為檢測用試劑盒通過使用內標準擴增用引物、外標準核酸，利用者可以非常簡便地利用本發明。另外，通過在晶片基板上備有通過與上述核酸探針點形成相同的手法形成的、每點的平均核酸密度的濃度已經決定的基準用核酸探針點，配置在基板上的未知濃度的核酸探針點的核酸濃度可以通過2次離子質量分析法決定，與以往方法比較，再現性、定量性提高。
通過使用本發明的手法，可以提高DNA微陣列製品的可靠性。另外，也可以將以矩陣狀配置在DNA微陣列內的核酸探針點的形成密度分布作為圖像表示。
序列表110 佳能株式會社120 帶有標準探針的DNA微陣列以及包含該陣列的試劑盒130 CF017338160 18170 PatentIn version 3.1210 1211 18212 DNA213 人工220
223 探針400 1actggccgtc gttttaca 18210 2211 20212 DNA213 人工220
223 探針400 2gtgagctatg agaaagcgcc 20210 3211 20212 DNA213 人工220
223 探針
400 3ggtatcttta tagtcctgtc 20210 4211 20212 DNA213 人工220
223 探針400 4ggccttttgc tcacatgttc 20210 5211 18212 DNA213 人工220
223 外標準400 5tgtaaaacga cggccagt 18210 6211 20212 DNA213 人工220
223 外標準400 6ggcgctttct catagctcac 20210 7211 20212 DNA213 人工
220
223 外標準400 7gacaggacta taaagatacc 20210 8211 20212 DNA213 人工220
223 外標準400 8gaacatgtga gcaaaaggcc 20210 9211 40212 DNA213 人工220
223 探針400 9tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 40210 10211 18212 DNA213 人工220
223 引物400 10gagacaataa ccctgata 18
210 11211 18212 DNA213 人工220
223 引物400 11ccttaacgtg agttttcg 18210 12211 18212 DNA213 人工220
223 引物400 12gcttggagcg aacgacct 18210 13211 18212 DNA213 人工220
223 引物400 13gagtcgacct gcaggcat 18210 14211 20212 DNA213 人工220
223 引物
400 14ggttggactc aagacgatag 20210 15211 18212 DNA213 人工220
223 引物400 15taagttgggt aacgccag 18210 16211 18212 DNA213 人工220
223 引物400 16agggcgctgg caagtgta 18210 17211 18212 DNA213 人工220
223 引物400 17cgtttcggtg atgacggt 18210 18211 20212 DNA213 人工
220
223 引物400 18gcggtaatac ggttatccac 20
權利要求
1.DNA微陣列，是在基板上固定了為了檢測檢體中所含的具有目的鹼基序列的核酸分子使用的帶有實質上與該目的核酸分子的鹼基序列互補的鹼基序列的核酸探針的DNA微陣列中，其特徵在於，含有選自在含有該目的鹼基序列的核酸的擴增反應檢定用而添加的一種以上的內標準用探針、檢出操作以及探針量檢定用中添加的一種以上的外標準用探針、通過與形成上述核酸探針同樣的手法形成的上述探針的存在量或密度進行檢定用探針中的一種以上的探針。
2.DNA微陣列，是在基板上固定了為了檢測檢體中所含的具有目的鹼基序列的核酸分子使用的帶有實質上與該目的核酸分子的鹼基序列互補的鹼基序列的核酸探針的DNA微陣列中，其特徵在於，從為了對上述檢體中所含的具有上述目的鹼基序列的核酸分子的含有濃度進行定量，含有向含有的一種以上的該目的鹼基序列的核酸的擴增反應檢定用中添加的內標準用探針、一種以上的檢出操作以及探針量檢定用中添加的外標準用探針選擇出的一種以上的探針。
3.權利要求2所述的DNA微陣列，其特徵是固定在基板上的該內標準用探針和/或該外標準用探針按照4點以上的量或密度以一系列的組固定在基板上。
4.權利要求2所述的DNA微陣列，其特徵是該內標準用探針由相對於與來自內標準核酸的擴增反應產物的不同鏈長的二種以上的探針構成。
5.權利要求2所述的DNA微陣列，其特徵是該外標準用探針由相對於添加的外標準核酸的含有任意核酸鹼基數的互補鹼基序列的二種以上的探針構成。
6.權利要求2所述的DNA微陣列，其特徵是該內標準用探針和外標準用探針是將合成核酸固定在基板上。
7.權利要求6所述的DNA微陣列，其特徵是該合成核酸的鏈長為15鹼基～75鹼基長。
8.引物組，是在作為利用DNA微陣列對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測時，在對具有該目的鹼基序列進行擴增反應時，與含有該目的鹼基序列的核酸同時擴增的內標準核酸的擴增反應用引物組，其特徵是來自含有目的鹼基序列的核酸的擴增產物的鏈長與來自該引物組參與的內標準核酸的擴增產物的鏈長被設計成相同。
9.目的鹼基序列檢測用試劑盒，是在利用DNA微陣列對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測時，作為在對含有該目的鹼基序列的核酸進行擴增反應時，包含與含有目的鹼基序列的核酸同時擴增的內標準核酸的擴增反應用引物組的檢測用試劑盒，其特徵是當來自上述含有目的鹼基序列的核酸的擴增產物的鏈長為二種以上時，包含二種以上對應於不同鏈長的權利要求8所述的引物組。
10.權利要求8所述的目的鹼基序列檢測用試劑盒，其特徵是多個該引物組包含各1種以上的擴增產物鏈長200bp以下用、200～500bp用、500～2000bp用、2000bp以上用的引物。
11.目的鹼基序列檢測用試劑盒，是在作為利用DNA微陣列對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測時，作為含有添加到檢體中的外標準核酸的檢測用試劑盒，其特徵是包含二種以上的用可檢測的標記物標記的合成核酸的外標準核酸。
12.權利要求9所述的目的鹼基序列檢測用試劑盒，其特徵是該標記物是螢光物質、放射性物質、發光物質中的任一種。
13.目的鹼基序列檢測用試劑盒，是在利用DNA微陣列對含有目的鹼基序列的核酸進行定量檢測時，在含有該目的鹼基序列的核酸的擴增反應時作為包含與含有目的鹼基序列的核酸同時擴增的內標準核酸的檢測用試劑盒，其特徵是作為內標準核酸包含二種以上的與檢測目的鹼基序列沒有同源性的來自微生物的核酸或來自病毒的核酸。
14.DNA微陣列，是由許多核酸相關物質構成的探針點以矩陣狀配置在基板上的DNA微陣列，其特徵是在上述核酸探針點形成的基板表面的一部分具備通過與上述核酸探針點形成相同手法形成的每一點平均核酸密度已確定的存在量或密度檢定用的核酸探針點。
15.權利要求14所述的DNA微陣列，其特徵是作為上述濃度基準用的核酸探針點具備具有多個階段的平均核酸密度的每一點核酸密度已決定的多種核酸探針點。
16.權利要求14所述的DNA微陣列，其特徵是每一點的平均核酸密度已決定的核酸探針點另外通過化學分析決定該每點的平均核酸密度。
17.權利要求16所述的DNA微陣列，其特徵是作為上述化學分析手段，使用通過誘導偶合等離子體質量分析法(Inductively CoupledPlasma Mass Spectrometry、以下略為ICP-MS)，決定該每點的平均核酸密度。
18.權利要求14所述的DNA微陣列，其特徵是上述核酸探針由單鏈核酸構成。
19.權利要求14所述的DNA微陣列，其特徵是在該基板上配置由單鏈核酸構成的核酸探針和通過對該核酸探針雜交導入的靶核酸的兩方。
20.DNA微陣列的分析方法，是在基板上以矩陣狀配置了由許多核酸相關物質構成的核酸探針點的DNA微陣列的分析方法，其特徵是在上述核酸探針點形成的基板表面的一部分設置通過與上述核酸探針點的形成相同的手法形成的每點平均核酸密度已經決定的濃度基準用的核酸探針點，作為上述濃度基準用核酸探針點，具備具有多個階段的平均核酸密度的每點平均核酸密度已經決定的多種核酸探針點，相對於具有上述多個階段的平均核酸密度的多種核酸探針點，使用根據進行2次離子質量分析時檢出的2次離子的信號強度做成的標準曲線，通過2次離子質量分析法決定配置在基板上的未知濃度的核酸探針點核酸濃度。
21.權利要求20所述的方法，其特徵是作為上述2次離子質量分析使用飛行時間型2次離子質量分析法。
22.權利要求21所述的方法，其特徵是在上述2次離子質量分析檢測的2次離子強度以1次離子的劑量作為選擇在1×1014/cm2以下的一定值時，是由1次離子照射的一定面積放出的來自上述核酸探針的特定的2次離子的積分強度(計數的數)。
23.權利要求21所述的方法，其特徵是在上述2次離子質量分析中檢測的2次離子強度，在將1次離子的劑量作為選擇在1×1012/cm2以下的一定值時，是由1次離子照射的一定面積放出的來自上述核酸探針的特定的2次離子的積分強度(計數的數)。
24.權利要求21～23中任一項所述的方法，其特徵是作為在上述2次離子質量分析中檢測的2次離子，可以利用由從腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的各鹼基脫去一個氫原子的陰離子、或P-、PO-、PO2-、PO3-構成的來自核酸探針的2次離子種類選擇的陰離子。
25.權利要求21～24中任一項所述的方法，其特徵是設置根據在上述2次離子質量分析中檢測的2次離子的強度，對應於1次離子的照射位置以二維表示的2次離子強度的圖像表示檢測結果的工序。
26.DNA微陣列的製造方法，是由許多核酸相關物質構成的核酸探針以矩陣狀配置在基板上的DNA微陣列的製造方法，其特徵是在DNA微陣列中，在形成上述核酸探針點的基板表面的一部分設置每一點的平均核酸密度已確定的濃度基準用的核酸探針點時，至少具有在上述基板上形成矩陣狀核酸探針的工序，在上述核酸探針點形成的基板表面的一部分中，通過與上述核酸探針點形成相同手法，形成每一點的平均核酸密度已確定的濃度基準用核酸探針點的工序。
全文摘要
本發明提供在基板上固定了為了檢測檢體中所含的具有目的鹼基序列的核酸分子使用的帶有實質上與該目的核酸分子的鹼基序列互補的鹼基序列的核酸探針的DNA微陣列，是特徵如下的DNA微陣列含有從用於檢定靶核酸的一種以上的內標準用探針、用於檢出操作以及探針量檢定的一種以上的外標準用探針、用於對通過與上述核酸探針形成同樣的手法形成的上述探針的存在量或密度進行檢定的探針選擇出的一種以上的探針。
文檔編號C12Q1/68GK1668923SQ0381681
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月23日 優先權日2002年6月24日
發明者川口正浩, 岡本尚志, 高瀨博光, 橋本浩行 申請人:佳能株式會社