誘導或調節免疫反應的方法

2023-09-19 23:24:15 2

專利名稱：誘導或調節免疫反應的方法
技術領域：
本發明涉及一種多核苷酸，由這種多核苷酸編碼或衍生的多肽和蛋白質的應用，以及所述多核苷酸、多肽和蛋白質的用途，並且涉及誘導或調節對抗原的免疫反應的方法，進一步涉及測定個體對於給定抗原的免疫狀態的方法。具體地，本發明涉及促軸素(axotrophin)，也稱作MARCH VII適當地在脊椎動物，例如哺乳動物中誘導或調節對於外源或自身抗原的免疫反應的應用。本發明還提供分離的促軸素以及由促軸素編碼或衍生的多肽和核苷酸，包含上述一種或多種的組合物和測定方法。
如本文所用的，提及促軸素包括提及與促軸素鑑定序列具有至少75％和優選至少90％序列同一性的多核苷酸或多肽序列。發現促軸素在個體的免疫反應中發揮重要作用，使得它在多種分子生物學領域技術人員已知的技術中的許多應用成為可能，如用作雜交探針，用作PCR引物，用於陣列中，用於計算機可讀介質中，用於對全長基因進行測序，用於蛋白質的重組生產，和用於生成反義DNA或RNA，其化學類似物等等。
鑑定出來的多核苷酸和多肽序列在，例如，診斷學、法醫學、基因圖譜、鑑定是造成遺傳病症或其它遺傳特徵的原因的突變、評估生物多樣性、用作表達測定中的引物和產生許多其它類型的依賴於DNA和胺基酸序列的數據和產品中具有多種用途。促軸素是已知的並且促軸素基因的詳細資料可以見於GenBank資料庫和其它地方，有各種編號包括AK022973和NM_022826.2(人)和AF155739和NM_020575(鼠)。人促軸素蛋白質序列可以在編號NP_073737.1下找到而鼠促軸素蛋白質可以在NP_065600.1下找到。這些序列在下面分別以序列識別號001-004給出。促軸素是被鑑定為在小鼠胚胎、神經和造血幹細胞中富集的216種基因中的一種，如在Science，Vol298，597-600 18 October 2002中所述，並且表明(在表1中)參與信號和遍在蛋白途徑。於2001年出版的Genes Development 152660-2674公開了小鼠蛋白促軸素具有RING-CH結構域並且是正常腦發育所必需的並且促軸素基因的破壞可以導致神經變性和胼胝體發育不全。從已出版的文獻中幾乎不能得知有關促軸素功能的信息。
本發明人現在發現促軸素在基因組、mRNA和/或蛋白質水平上誘導或調節對抗原的免疫反應。據信調節可以通過反義DNA或RNA或結合分子來控制。另外，已經發現促軸素調節T淋巴細胞增殖並調節白血病抑制因子(LIF)的釋放，例如如下面實施例中所示的從活化的T淋巴細胞中釋放。WO03/052424披露了c-kit(CD117)，STAT3，幹細胞因子(SCF)和LIF在耐受性免疫反應中得以提高，並且這些可以用於調節對抗原產生的免疫反應。LIF鼠序列可以以SWISSPROTP09056獲得。人序列可以以SWISSPROT P15018獲得。
本發明提供促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸誘導或直接或間接調節對抗原的免疫反應的應用，所述抗原可以是「外源」抗原(例如同種異體的，異種的，原核的，病毒的或合成的)或自體的(「自身的」)抗原。
免疫反應可以在離體、體內或體外細胞群中操縱。
提及與本發明相關的任何免疫反應的「調節」都包括調節細胞群的表型發育和維持，所述細胞群調節對給定抗原的免疫性。
本文提及「衍生自」促軸素的物質包括，例如，反義序列包括RNAi，單鏈或多鏈的，和結合促軸素的多肽或多核苷酸的小分子，包括抗體特別是單克隆抗體。提及「直接或間接」衍生自促軸素的物質包括任何這些多核苷酸或小分子。
本文提及「多肽」包括蛋白質並且特別是成熟蛋白質。
本發明還提供促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸在生產藥物中的應用，所述藥物直接或間接地誘導或調節脊椎動物對抗原的免疫反應，所述抗原可以是「外源」抗原(例如同種的，異種異體的，原核的，病毒的或合成的)或自體的(「自身的」)抗原。
根據本發明生產的藥物適於治療個體以減輕移植組織、細胞或器官的排斥。
本發明進一步提供促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸調節LIF表達的應用。LIF可以誘導或直接或間接調節脊椎動物對抗原的免疫反應，所述抗原可以是「外源」抗原(例如同種異體的，異種的，原核的，病毒的或合成的)或自體的(「自身的」)抗原。
適當地，由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸使得對LIF敏感的癌性免疫細胞離體或在體內被靶標。
不希望被任何理論所束縛，據信促軸素還在基因組和/或蛋白質水平上調節Foxp3和SOCS3的表達並且這在T細胞調節中起作用。
本發明在另外的實施方案中提供了促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸在體內、離體或體外環境中於細胞群裡誘導或調節T細胞增殖的應用。T細胞優選為T淋巴細胞。
有利地，本發明可以用於引導脊椎動物例如哺乳動物的免疫反應接受移植的器官、組織、細胞、基因或基因產物、人造物質，或任何其它用於體內的物質，例如為了治療的目的。本發明特別可應用於幹細胞在治療或其它方面中的使用。
可以利用促軸素的免疫抑制性活性保護引入的生物材料免受免疫攻擊，例如在細胞移植中，來治療疾病，包括神經變性疾病，用於移植的組織如骨髓，皮膚，軟骨，骨，腱，肌肉包括心肌，血管，角膜，神經細胞，胃腸細胞及其它，以及用於移植的器官包括腎，肝，胰包括胰島細胞，心臟和肺。
適當地，可以在離體宿主免疫細胞中改進由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸或影響促軸素活性的調節性多肽或多核苷酸序列的表達以改變免疫反應來接受引入的生物材料。或者，或另外，可以離體對促軸素在生物材料中的表達進行調節以便當引入體內時攜帶免疫調節特性。
促軸素通過上調或下調T淋巴細胞以及實現NK細胞和其它細胞群的細胞溶解活性可以用於治療免疫病症包括重度聯合免疫缺陷病(SCID)。這些免疫缺陷可能是遺傳性的或由病毒性(例如HIV)以及細菌性或真菌性感染造成的，或可能源自自身免疫病症。更具體地，由病毒性、細菌性、真菌性或其它感染引起的傳染性疾病可以利用由促軸素編碼或衍生的蛋白質或多核苷酸進行治療，包括由HIV、肝炎病毒、皰疹病毒、分枝桿菌、數種利什曼原蟲、數種瘧疾引起的感染和各種真菌性感染如念珠菌病以及在加強免疫系統通常可能是需要的情況下，例如在癌症的治療中。
利用由促軸素編碼或衍生的蛋白質或多核苷酸可以治療的自身免疫病症包括，例如，結締組織疾病、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、自身免疫性肺炎、吉蘭-巴雷症候群、自身免疫性甲狀腺炎、胰島素依賴性糖尿病、重症肌無力、移植物抗宿主疾病和自身免疫性炎性眼病。本發明的這種蛋白質(或其拮抗劑，包括抗體)還可以用於治療變態反應和過敏症(例如，過敏反應、血清病、藥物反應、食物過敏、昆蟲毒液過敏、肥大細胞增生症、過敏性鼻炎、過敏性肺炎、蕁麻疹、血管性水腫、溼疹、特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、多形性紅斑、多形糜爛性紅斑、變應性結膜炎、特應性角膜結膜炎、性病性角膜結膜炎、巨乳頭狀結膜炎和接觸性過敏症)，如哮喘(特別是變應性哮喘)或其它與呼吸有關的問題。
在使用促軸素中，下調可能是抑制或阻抑已進行中的免疫反應的形式或者可能涉及防止免疫反應的誘導。
在免疫反應過程中促軸素在下調或防止一種或多種功能中例如在減少幹擾素γ釋放中的應用可以用於組織、皮膚和器官移植的情況和用於移植物抗宿主疾病(GVHD)。通過下調促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸上調攻擊性免疫反應也是有用的。免疫反應的上調可以是增強現存免疫反應或引發初始免疫反應的形式。例如，增強免疫反應可以用於病毒感染的情況中，包括全身性病毒性疾病如流感和感冒。促軸素的調節適當地促進T細胞介導的針對腫瘤細胞的免疫反應。
促軸素的多肽可能參與調節哺乳動物細胞，包括，例如，單核細胞、成纖維細胞、嗜中性白細胞、T細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、上皮和/或內皮細胞的趨化性或化動活性。本發明提供趨化性或化動組合物例如包含促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的蛋白質、抗體、結合伴侶，或調節劑，在創傷和其它組織損傷的治療中，以及在局部感染的治療中提供特別益處。例如，淋巴細胞、單核細胞或嗜中性粒細胞吸引到腫瘤或感染部位上可以導致針對所述腫瘤或感染因子的增強的免疫反應。
本發明還可以適當地用於引導免疫系統允許接受與自身免疫疾病或病症相關的抗原，或對該抗原至少減弱的攻擊性反應，可以在自體免疫反應中引發先天性或適應性免疫反應。
另外，本發明可以用來引導免疫反應排斥器官、組織、細胞、病原體如原核生物、酵母或真菌、寄生蟲或病毒、基因或基因產物、人造物質、或任何其它可以侵入或進入身體內或在體內生成的物質；其中該物質是有害的、致病的(例如贅生性組織或感染組織)或對宿主患者有害的。
本發明還可以用來在接種疫苗後增強針對抗原的免疫反應的程度，特別是在目前的疫苗接種方法在產生針對生物製劑的保護性免疫排斥反應中成功有限的情況之下，所述生物製劑包括例如與細菌戰相關的生物製劑。
本發明的特別有利的方面是由特異抗原激活產生的反應的特異性。可以將免疫反應指向由體內信號途徑調節引發的耐受性或攻擊。在用抗原刺激後，可以按照本發明的各方面將響應細胞指向耐受性或攻擊並且非響應細胞不受調節性適應影響。靶抗原自身觸發響應細胞或響應細胞群；只能響應其它抗原的細胞不被觸發，所以不能接受此時針對相關抗原的耐受性或攻擊的引導。作為備選或補充，免疫細胞可以離體導向調節耐受性或攻擊。可以取出免疫細胞，例如血液和/或脾的免疫細胞，在返回到個體之前用抗原處理並且導向耐受性或攻擊。
如本文所用的，術語「抗原」具有本領域一般理解的意義並且包括任何天然產生的、重組的或合成的產物如多肽，其可以進行糖基化。術語抗原還包括蛋白質載體和非蛋白質分子如類固醇、碳水化合物或多核苷酸的複合物。
在本文中抗原還用來指任何包含多種抗原和抗原表位的物質，例如細胞或組織、器官、移植物、事實上脊椎動物，例如哺乳動物的免疫系統可以對其產生免疫反應的任何物質。
所述抗原可以是與人或動物疾病相關的病原性生物的抗原。引發動物疾病的生物包括例如口蹄疫病毒、新城疫病毒、狂犬病病毒和沙門氏菌屬(Salmonella)物種。引發人類疾病的生物包括例如細菌如沙門氏菌屬物種包括鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)和傷寒沙門菌(S.typhi)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)如金黃色葡萄球菌(S.aureus)、百日咳、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、病原性大腸桿菌(E.coli)、分枝桿菌物種如結核分枝桿菌(M.tuberculosis)和副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)。病毒生物包括例如HIV-1或HIV-2(其包括病毒抗原gp160/120)、HBV(其包括表面或核心抗原)、HAV、HCV、HPV(例如HPV-16)、HSV-1或-2、EB病毒(EBV)、親神經性病毒、腺病毒、巨細胞病毒、脊髓灰質炎病毒和麻疹病毒。
天花和炭疽熱也是目標病原體並且可以將其用於本發明。真核病原體包括酵母，如白色念珠菌(C.albicans)，麴黴菌，血吸蟲，原生動物，變形蟲，瘧原蟲，包括例如瘧疾，弓形體，賈第鞭毛蟲和利什曼原蟲。
所述抗原還可以是腫瘤相關抗原。這些抗原包括CEA、α胎兒蛋白(AFP)、neu/HER2、多態內皮粘蛋白(PEM)、N-CAM和Lewis Y。
所述抗原可以是異常表達的抗原，如p53或病毒性修飾的抗原。
諸如上述的抗原可以以純化自所述生物的培養物的蛋白質形式，或更加優選地通過所需抗原的重組生產而獲得。還可以通過化學合成生產抗原，例如採用自動肽合成儀如可以商購的合成儀。
只要保留所需活性就可以使用適當的片段，而非野生型多肽。技術人員能夠輕易地以保守方式，例如不破壞功能，對任何多肽的胺基酸序列進行改變。
本發明的另一方面提供一種在個體中調節對抗原的免疫反應的方法，該方法包括向所述個體提供促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸。
這種提供可以通過施用一種或多種多肽，或可以通過施用編碼所述多肽的多核苷酸。另一種方法包括施用上調所述多肽表達的物質，例如通過結合相關基因的啟動子或其它調節元件。
本發明還提供一種調節個體對抗原的免疫反應的方法，該方法包括施用影響在個體中的促軸素活性的物質。
可以上調在個體中由促軸素直接或間接表達的多肽的量，從而提高或加強活性，或下調，從而降低或減弱活性。提高的活性與促進免疫耐受性相關，而降低的活性與促進針對抗原的免疫反應，即攻擊性反應相關。
因而，按照本發明提供了一種控制免疫系統對於給定抗原的反應的方法，例如提高個體免疫系統對抗原的耐受性，所述方法包括向所述個體施用促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸或提高由促軸素直接或間接表達的多肽的量或活性的物質。
另外，按照本發明提供了一種加強或提高個體的免疫系統針對抗原的攻擊性反應的方法，所述方法包括向所述個體施用降低由促軸素直接或間接表達的多肽的量或活性的物質。
物質可以通過結合或與其相互作用來降低由促軸素直接或間接表達的多肽的量或活性。這種物質可以是例如具有適當結合特異性的抗體分子，或其它結合所述多肽的肽基或非肽基分子。可以通過例如下調相關基因的啟動子功能或通過處理編碼mRNA以減少翻譯(例如通過反義或dsRNA抑制，RNAi，或核酶消化)或藉助於促進所述多肽降解的物質，例如利用遍在蛋白化可以減少所述多肽的產生。
物質可以通過結合，例如通過結合編碼多核苷酸序列的啟動子或增強子區以提高啟動子功能來提高由促軸素直接或間接表達的多肽的量或活性。
本發明的另一方面提供一種增強個體中針對抗原的攻擊性免疫反應，或提供增強的攻擊性免疫反應或減弱的攻擊性免疫反應，或促進個體中耐受性的方法，所述方法包括向所述個體施用包含抗原或編碼抗原的多核苷酸的組合物以及施用包含由促軸素直接或間接表達的多肽或改變這種多肽在個體中的量或活性的物質的組合物。
可以將兩種或多種組合物作為組合製劑提供用於同時或連續施用。
促軸素的表達產生的物質，例如LIF的水平可以通過編碼多核苷酸，或通過內源性表達水平的改變，或通過多肽活性的改變，例如藉助於小分子或其它活性劑進行改變，以便調節個體免疫系統對目標抗原顯示的耐受性或攻擊性的存在或程度。本發明可以在多種情況下使用，包括關於計劃的移植，關於病原體或其它異物的潛在刺激，關於宿主的轉化細胞，例如癌細胞或病毒感染細胞，以及在自身免疫病症中對免疫系統的調節。
按照本發明調節或影響的攻擊性免疫反應可以是不適當的免疫反應，例如在自身免疫疾病中，或適當的免疫反應，例如對病原體的免疫反應。
已經發現促軸素在脊椎動物例如哺乳動物包括人中提供免疫反應的調節。適當地所述反應為脊椎動物中對抗原的耐受性免疫反應。
在另一個實施方案中，本發明提供促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸用於測定免疫狀態的應用。促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸適用於臨床醫學或獸醫學中。
本發明還提供一種確定個體免疫狀態的方法，所述方法包含測定促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸在測試樣品中的表達水平，所述樣品包括從所述個體中取出或獲得的組織、細胞和/或體液，並將測試樣品的水平與對照樣品的水平進行比較，其中在測試樣品中的水平大於對照樣品中的水平表示個體中的免疫狀態包含耐受性免疫反應，或者其中在測試樣品中的水平低於對照樣品中的水平表示個體中的免疫狀態包含攻擊性免疫反應。
可以利用免疫狀態的測定評估與對抗原的免疫反應，對患病組織如腫瘤的免疫反應，對移植組織，細胞或其它材料的耐受性相關的個體的免疫狀態(例如當需要減弱或免除對受體的免疫抑制療法時表明對器官同種異體移植物或異種移植物的耐受性狀態)。因而，這種測定可以用在診斷情況中，以確定個體的免疫系統的狀態。它可以用來評估正在進行的治療的益處或成功。
所述方法對於確定個體的免疫狀態特別有益，所述個體具有組織或細胞移植物並且任選地正在進行治療。適當地，對包含外周血的測試樣品確定所述水平。在此提及「個體」包括動物以及人。
另一方面提供所公開的促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸或在個體中改變其量或活性的物質，在生產加強或減弱個體中針對抗原的攻擊性免疫反應或改變免疫系統對抗原的耐受性的藥物中的應用，或在本文列出的治療方法中的應用。這種藥物一般用於與抗原相關的疾病或病症的治療或預防，所述抗原可以是病原體、患病細胞如腫瘤，或待移植的材料，如器官、組織或細胞。
一般，以分離的和/或純化的，即基本上純的形式提供根據本發明的這種物質。在優選的實施方案中，所述物質在一種組合物中，其中它適當地代表至少80％活性成分，優選至少90％，更加優選至少95％並且特別是98％(以組合物的重量計)。
由促軸素編碼或衍生的多肽或影響這種多肽的活性或量的肽基物質，例如通過與它結合(如抗體分子)或通過與影響由編碼基因的表達所述多肽產生的啟動子元件結合，或可以用於本發明的任何方面或實施方案中的其它多肽，可以通過重組表達進行生產。
要按照本發明的實施方案給予個體的物質可以根據需要以「預防上有效的量」或「治療上有效的量」進行給藥。預防效果可以足以加強或減弱個體對隨後抗原刺激的攻擊性免疫反應(根據需要的是針對抗原的攻擊性免疫反應還是耐受性反應)。最優選地所述效果足以防止個體患由於隨後的抗原刺激而產生的一種或多種臨床症狀。治療效果足以加強或減弱個體對先發生的反應的攻擊性免疫反應，優選地足以完全或部分地拮抗所述反應，例如在自身免疫病症或在移植排斥中。最優選地所述效果足以改善一種或多種臨床症狀。實際給藥的量，給藥的速率和時間將根據待治療疾病的性質和嚴重性決定。治療的處方，例如劑量決定等，是在全科醫師和其它醫生的職責之內，一般考慮待治療的病症，個體患者的狀況，給藥部位，給藥方法和醫生已知的其它因素。上述技術和方案的例子可以見於Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.(ed)，1980。
本發明還提供對本發明多核苷酸具有特異性的核酶，其基於促軸素的核苷酸序列。
此外，本發明還包括生產用於治療免疫系統疾病或與免疫系統相關疾病的藥物的方法，包括施用調節促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的整體活性的化合物或其它物質。化合物和其它物質能夠在靶基因/蛋白表達或靶蛋白活性的水平上實現這種調節。
在另一方面本發明提供分離的促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸，包括重組DNA分子，克隆的基因或其簡併變體，特別是天然產生的變體如剪接變體，等位變體，反義多核苷酸分子，和特異性識別存在於這些多肽上的一種或多種表位的抗體，以及產生這些抗體的雜交瘤。
本發明的多核苷酸序列還包括獨特性識別或體現促軸素的序列信息的促軸素的節段。通過克隆適當的多核苷酸序列並根據本領域已知的方法在載體中表達它可以生產分離的多核苷酸序列。
本發明的多核苷酸還包括在嚴格雜交條件下與(a)促軸素的互補體；(b)編碼促軸素的多核苷酸序列；(c)作為促軸素的等位變體的多核苷酸；(d)編碼由促軸素編碼或衍生的物種同源物(例如正同源物(ortholog))或(e)編碼包含任一種由促軸素編碼或衍生的多肽的特定結構域或截斷的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。
作為提供免疫反應的手段，離體、原位或在體內適當地通過使用載體，更加具體地為病毒載體(例如，腺病毒，腺伴隨病毒，或逆轉錄病毒)，或離體通過使用物理的DNA轉移方法(例如，脂質體或化學處理)適當地進行編碼由促軸素編碼或衍生的多肽的功能性基因的遞送。可以使用裸DNA或RNA來體內表達編碼的基因產物。利用直接注射或使用基因槍(Yang等，1990)或任何其它適合技術，如局部地可以遞送裸DNA例如用於治療銀屑病。轉化的或轉染的或者進行遺傳工程改造以包含促軸素或由其編碼或衍生的多核苷酸或表達促軸素多肽的細胞可以用來遞送功能物質。
在另一方面，本發明提供用於表達促軸素，由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸序列的載體，該載體包含促軸素或編碼促軸素的多核苷酸序列，例如與其互補或其反向的多核苷酸序列，啟動子序列和終止序列。
可以使用病毒載體以遞送促軸素或由它編碼的多核苷酸用於體內適當地進行生產。促軸素或由促軸素編碼的多核苷酸可以用在基因治療方法中，所述多核苷酸編碼多肽或其它肽分子進行根據本發明的應用。這需要使用合適的用於表達的調節元件和合適的用於體內遞送表達單元(編碼序列和調節元件)至宿主細胞的載體。多種載體，包括病毒載體和質粒載體，是本領域已知的，見例如美國專利號5,252,479和WO 93/07282和無數的其它出版物。特別地，許多病毒已經被用作基因轉移載體，包括乳多空病毒，如SV40，牛痘病毒，皰疹病毒，包括HSV和EBV，以及逆轉錄病毒。許多現有技術中的基因治療方案已經使用滅活的鼠逆轉錄病毒。已經開發出許多腺病毒和腺伴隨病毒載體。病毒載體的替代方案包括由脂質體和直接DNA攝取和受體介導的DNA轉移介導的轉移。
由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽的表達適當地在誘導型調節元件的控制下，在此情況中內源基因的調節序列可以被同源性重組所替代。可以使用基因靶向以便用分離自不同基因的調節序列或由遺傳工程方法合成的新調節序列替換基因現有的調節區。這些調節序列可以由啟動子，增強子，支架結構附著區，負調節元件，轉錄起始位點，調節蛋白結合位點或所述序列的組合組成。或者，影響RNA或產生的蛋白質的結構或穩定性的序列可以通過靶向替換，去除，添加，或修飾。這些序列包括聚腺苷化信號，mRNA穩定性元件，剪接位點，用於增強或改進蛋白質的運輸或分泌特性的前導序列，或改變或提高蛋白質或RNA分子的功能或穩定性的其它序列。
抑制多肽表達的其它方法包括通過本領域已知的方法將反義分子導入本發明的多核苷酸，它們的互補體，它們的轉錄RNA序列，或RNA的翻譯產物中。另外，可以利用定向缺失方法，或通過插入負調節元件如組織特異性的沉默子來抑制本發明的多肽。「基因沉默」技術由Fire等在EP-A-1042462和Nature Vol 391 pp 806-811，″Potent andspecific genetic interference by double stranded RNA in Celegans″中公開。
如本文所用的術語「分離的」指與至少一種其它組分(例如，多核苷酸或多肽)分離的多核苷酸或多肽，所述其它組分與所述多核苷酸或多肽一起存在於它的天然來源中。在一個實施方案中，在只有正常存在於相同溶液中的溶劑、緩衝劑、離子或其它組分(如果有什麼區別的話)存在時發現所述多核苷酸或多肽。術語「分離的」和「純化的」並不包括存在於其天然來源中的多核苷酸或多肽。
如本文所用的術語「簡併性變體」包括與根據本發明的序列不同，但是由於簡併性編碼與它相同的多肽序列或具有至少75％和優選地至少90％序列同一性的序列的核苷酸序列。
可以在多核苷酸陣列上提供收集的促軸素的序列信息或對它的識別信息。在一個實施方案中，在多核苷酸陣列上提供序列信息的程序段以檢測包含促軸素或促軸素節段的多核苷酸。可以設計所述陣列來檢測與促軸素的完全匹配或錯配。還能夠以計算機可讀形式提供收集的信息。
如本文所述，本發明進一步提供經遺傳工程改造以包含促軸素或根據本發明的載體的細胞。適當地根據本發明的細胞，優選宿主細胞，已經用促軸素或另一種本發明的多核苷酸進行轉化或轉染以表達促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽序列。可以採用已知的轉化、轉染或感染方法。
用於在多種不同細胞中克隆和表達多核苷酸或多肽的系統是已知的。合適的宿主細胞包括細菌、真核細胞如哺乳動物和酵母細胞，和杆狀病毒系統。本領域現有的用於異源多肽表達的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞，HeLa細胞，幼倉鼠腎細胞，COS細胞和許多其它細胞。常用的優選細菌宿主為大腸桿菌。
又一個方面提供一種方法，其包括將多核苷酸導入宿主細胞中。所述導入，其一般可以(特別是對於體外導入)非限制性地稱作轉化，可以採用任何現有技術。
對於真核細胞來說，合適的技術可以包括磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖，電穿孔，脂質體介導的轉染和利用逆轉錄病毒或其它病毒的轉導，例如用牛痘病毒，或對於昆蟲細胞，用杆狀病毒。對於細菌細胞來說，合適的技術可以包括氯化鈣轉化，電穿孔和利用噬菌體的轉染。作為備選，可以採用多核苷酸的直接注射。在鑑定包含目標多核苷酸的克隆中可以使用標記基因如抗生素抗性或敏感性基因，如本領域所公知的。
導入後可以引發或允許由多核苷酸的表達，例如通過在適於基因表達的條件下培養宿主細胞(其可以包括真正轉化的細胞，儘管更有可能所述細胞為轉化細胞的後代)，從而產生編碼的肽或多肽。如果所述肽或多肽偶聯到合適的信號前導肽上得以表達，它可以從細胞分泌到培養基中。在表達產生後，可以根據情況從宿主細胞和/或培養基中分離和/或純化肽或多肽，並且隨後根據需要使用，例如在組合物的配製中使用。
適當地，在體內細胞中表達的促軸素的多核苷酸與對於宿主細胞異源的驅動細胞中多核苷酸的表達的調節序列有效連接。這些方法可以用來提高或降低本發明的多核苷酸的表達。本發明還涉及生產促軸素多肽的方法，包括在允許表達所需多肽的條件下在合適的培養基中使本發明細胞的培養物生長，並從培養物或從宿主細胞中純化所述多肽。優選的實施方案包括那些，其中由這種方法生產的蛋白質是所述蛋白質的成熟形式以及任何其它保留成熟蛋白任何功能活性的多肽。在優選的實施方案中，由促軸素編碼或衍生的多肽用於生成特異性結合所述多肽的抗體。這些抗體，特別是單克隆抗體，可以用於檢測或量化組織中的多肽，特別是為了免疫診斷的目的。通過重組方法可以全部或部分生產本發明的多肽但是也可以進行化學合成。
這種方法可以包括將抗體分子群與促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽接觸並選擇所述群中結合和/或影響多肽或多核苷酸活性的一種或多種抗體分子。
利用諸如噬菌體展示，動物免疫系統的旁路直接參與(by-passing direct involvement of an animal′s immune system)等技術，可以常規地獲得抗體分子。代替或除了免疫動物之外，獲得所披露抗體分子的方法還可以包括在噬菌體顆粒表面上展示抗體分子群，每個顆粒都包含展示於其表面上的編碼抗體分子的多核苷酸。多核苷酸可以取自展示抗體分子的噬菌體顆粒，所述抗體分子能夠結合一種或多種目標肽，以便進行操作和/或用於生產編碼的抗體分子或其衍生物(例如融合蛋白，包括恆定區或其它胺基酸的分子，等等)。例如如在US-A-5643768，US-A-5658754，WO95/11922中所公開的，可以使用核糖體或多核糖體，而不是使用用於展示的噬菌體(如例如在WO92/01047中的)。
可以向非人哺乳動物施用一種或多種肽以使它們接觸由該哺乳動物的免疫系統產生的抗體分子群，隨後可以從該哺乳動物中獲取能夠結合所述肽的一種或多種抗體分子，或可以從該哺乳動物中獲取產生這些抗體分子的細胞。可以將所述哺乳動物處死。
如果細胞取自哺乳動物，這些細胞可以用來生產所需的抗體分子，或者可以使用後代或衍生細胞系。具體地這些後代或衍生細胞系可以包括雜交瘤細胞。
可以單獨地或混合地以分離的形式提供抗體分子。可以以分離形式提供多種抗體分子。
在不含汙染物如能夠結合其它多肽的抗體和/或不含血清組分的意義上，分離出根據本發明的優選抗體。對於一些目的來說單克隆抗體是優選的，儘管多克隆抗體也在本發明的範圍之內。
可以以許多方式對根據本發明有用的抗體進行修飾。事實上術語「抗體分子」應當被視為涵蓋包含抗體抗原結合結構域使它能夠結合抗原或抗原表位的抗體片段和衍生物。能夠結合抗原或其它結合伴侶的抗體片段例子是由VL，VH，CL和CH1結構域組成的Fab片段；由VH和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；由VH結構域組成的dAb片段；分離的CDR區和F(ab′)2片段，包括在鉸鏈區通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段。還包括單鏈Fv片段。
可以在由促軸素編碼或衍生的蛋白質或多核苷酸存在時離體培養細胞以便產生所需的免疫反應，例如對隨後的允許導入免疫原性生物材料的體內再導入的免疫抑制。在其它應用中，阻止促軸素的表達或抑制促軸素的活性可能是有利的以便增強針對抗原的攻擊性免疫活性。可以適當地採用反義療法或基因療法來負調節由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的表達。
通過用異源啟動子全部或部分地替換天然產生的啟動子而進行允許、提高或降低內源促軸素多肽表達的細胞或組織的修飾以提供提高的多肽表達，從而使細胞在較高水平上表達所述蛋白或者顯示響應於藥物化合物的誘導表達。
在另一方面，本發明提供控制，例如通過向細胞導入促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽提高自體的或其它幹細胞或前體細胞和/或免疫細胞的離體生產。在為了治療目的，特別是為了調節免疫反應進行體內遞送之前對細胞進行處理。
在優選的實施方案中，可以在一種或多種特異性分化因子(例如對於給定T細胞受體(「TCR」)的靶抗原)以及對該抗原的反應存在時離體培養來自個體的淋巴細胞，利用由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的上調和下調，對所述抗原進行改變、修飾或量化以便對耐受性進行調節或使所述反應對所述抗原具有攻擊性。離體衍生的分化克隆可以進行繁殖並且可以用來治療受體，特別是原始供體，以調節免疫反應。例如，在接納器官移植物自身之前可以使受體對外源器官同種異體移植物具有特異耐受性。
通過由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸、類似物，包括片段和融合蛋白、抗體和其它結合蛋白和在免疫反應中直接抑制或激活具有促軸素活性的多肽的化合物可以提供本發明方法中的免疫反應的調節或誘導。
根據本發明的多核苷酸分子和載體可以以分離的和/或純化的形式提供，例如以基本上純的或同質的形式。術語「分離」可以用來反映所有這些可能性。
根據本發明使用的肽、多肽、抗體、多核苷酸或其它分子或物質可以配製成組合物，並且可以用於藥物領域。
本發明還涉及包含分離的促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸以及可藥用的稀釋劑、載體或賦形劑的組合物，所述稀釋劑、載體或賦形劑為適當無毒的並且不應幹擾活性成分的功效。載體或其它物質的確切性質可以取決於給藥途徑，例如口服、靜脈內、經皮或皮下、鼻、肌內、腹膜內途徑。
所述稀釋劑、載體或賦形劑可以是凝膠、油或脂質體的形式，並且獨立地和優選地包含親水性物質，例如水。載體或其它物質的確切性質可以取決於給藥途徑，例如口服、靜脈內、經皮或皮下、鼻、肌內、腹膜內途徑。
口服用的組合物可以是片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可以包括固體載體如明膠或助劑。液體藥物組合物一般包括液體載體如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成的油。可以包括生理鹽水溶液，葡萄糖或其它糖溶液或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
對於靜脈內、經皮或皮下注射，所述活性成分將適當地為胃腸外可接受的水溶液形式，其是無熱原的並且具有合適的pH、等滲性和穩定性。本領域相關技術人員完全能夠利用，例如，等滲載體製備合適的溶液如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸化林格注射液。根據需要，可以包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。
可以單獨或與其它治療聯合施用所述組合物，所述聯合治療可以是同時或連續的，這取決於要治療的病症和備選的或另外的治療的有效性。
在本發明中，可以將組合物施用於個體，特別是人和其它靈長類動物。可以對人或其它哺乳動物施用，例如嚙齒類動物如小鼠、大鼠或倉鼠、豚鼠、兔、綿羊、山羊、豬、馬、牛、驢、狗或貓。向非人哺乳動物遞送不必是為了治療目的，而是可用於實驗環境，例如用於研究對目標抗原的免疫反應的機制，例如對抗癌症、病原體等等的保護作用。
通過將促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽或其結合片段用於藥物篩選技術中，本發明對篩選化合物特別有用。
本發明提供一種篩選化合物的方法，包括將包含待篩選的一種或多種化合物的測試樣品與選自促軸素，由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽和這種多核苷酸或多肽的片段的結合劑接觸並確定所述化合物是否已經結合到所述結合劑上。
所述結合劑可以是任何合適的形式，包括載體、細胞或組合物，並且以已知的篩選化合物的方式使用。
在這種測試中採用的多肽、多核苷酸或片段可以是在溶液中游離的，固定於固體支持物上，載於細胞表面上或位於細胞內。一種藥物篩選的方法利用以重組多核苷酸穩定轉化的真核或原核宿主細胞，所述細胞表達促軸素多肽或其片段。可以在競爭性結合測定中針對這些轉化的細胞篩選化合物。這些細胞，是存活的或固定的形式，可以用於以已知的方式進行結合測定。
可以利用分離的促軸素的蛋白質和多核苷酸獲得和鑑定結合到由相應於促軸素的開放閱讀框(「ORF」)編碼或衍生的多肽上或結合到由促軸素編碼或衍生的多肽的特定結構域上的物質。
本發明提供一種鑑定結合到促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸上的物質的篩選方法，包括(a)將某種物質與促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽接觸；(b)測定所述物質是否結合到所述多核苷酸或多肽上；和(c)檢測在所述物質和所述多核苷酸或多肽之間形成的複合物的形成，從而如果形成了複合物，則對所述物質進行檢測。
在優選的篩選方法中，將化合物與促軸素的多肽或多核苷酸在細胞中接觸足夠的時間以便與所述多肽或多核苷酸形成該化合物的多肽複合物，其中所述複合物驅動受體基因序列在細胞中的表達，並且通過檢測報導基因序列表達來檢測所述複合物。
本發明還提供一種試劑盒，其包含促軸素或多核苷酸探針和/或單克隆抗體，和任選地用於實施本發明的方法的定量標準品。
本發明進一步提供一種診斷方法以鑑定促軸素或多肽或編碼促軸素的多核苷酸在測試樣品中的存在或表達，所述方法利用多核苷酸探針或促軸素的抗體，任選地與合適的標記綴合或結合。
本發明提供一種用於檢測促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽的診斷方法，包括(a)將待測試由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽是否存在的樣品與結合到由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽上的化合物接觸；(b)確定所述化合物是否結合到所述樣品的組分上；和(c)檢測在所述樣品和所述蛋白質或多核苷酸之間形成的複合物的形成，從而如果形成了複合物，則對所述多肽或多核苷酸進行檢測。
優選地所述診斷方法包括將樣品在嚴格雜交條件下與退火到促軸素的多核苷酸上的多核苷酸引物接觸並且擴增退火的多核苷酸，從而如果擴增了多核苷酸，則在樣品中檢測促軸素的多核苷酸。
在優選的實施方案中，用來評估個體免疫反應的診斷方法包括從個體中獲得測試樣品，例如血液，將測試樣品與針對促軸素或由促軸素編碼或衍生的多核苷酸或多肽的一種或多種抗體或一種或多種多核苷酸探針一起溫育，並測定所述多核苷酸探針或抗體與測試樣品內組分的結合。
根據本發明的實施方案的測定法可以採用ELISA，蛋白質印跡法，免疫組織化學，鑑定藥物在經誘導的針對調節耐受性，無反應性或缺失，對抗排斥的傾向性方面對免疫反應的影響和任何其它本領域現有的合適技術。
可以對含有cDNA和/或mRNA的製劑進行測試。由於RNA酶的廣泛存在RNA比DNA更難以操作，這是可以進行cDNA分析的一個原因。
不過，由於對測試樣品中的所有多核苷酸或者甚至是整個目標基因進行測序一般在時間上或付出勞動上沒有效率，可以採用使用一個或多個引物對的特異性擴增反應如PCR來擴增多核苷酸中的目標區域，如果其存在於樣品中的話。這可以定量地進行，允許測定測試樣品中促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的量。
利用特異性探針可以篩選多核苷酸。這種探針在序列中對應於相關基因的區域，或者在適當嚴格的條件下對應其互補體，這種探針特異性雜交到測試多核苷酸上表示目標多核苷酸分子的存在，並且這也能夠進行量化以提供測試樣品中這種多核苷酸分子的量的指徵。
在PCR中可以類似地使用特異性寡核苷酸引物以特異性擴增特定的序列，如果其存在於測試樣品中的話。
一種方法可以包括一種或多種(例如兩種)探針或引物雜交到靶多核苷酸上。當所述多核苷酸是雙鏈DNA(例如cDNA)時，雜交之前一般先進行變性以產生單鏈DNA。所述雜交可以作為PCR方法的一部分，或作為不涉及PCR的探針雜交方法的一部分。使用選自許多本領域技術人員已知的篩選方法鑑定成功的雜交事件並且可以允許存在於原始樣品中的多核苷酸的量的定量。
利用本領域技術人員已知的多種技術中的任何一種可以測量探針結合到靶多核苷酸(例如DNA)上。例如，可以對探針進行放射性、螢光或酶學標記。探針雜交可以採用標準的印跡技術。
例如通過從諸如脾細胞的細胞或生物組織或體液，尿，唾液，糞便，口腔拭子，活檢組織或血液中提取多核苷酸可以提供多核苷酸的測試樣品。
可以檢驗測試樣品中特異性結合成員的結合伴侶的存在，所述特異性結合成員如抗體分子(或抗體的混合物)，對多肽或目標多肽是特異的。在測定結合之前，通過與特異性結合成員如抗體分子在合適的進行特異性結合的條件下接觸可以對樣品進行測試，例如利用所討論的報導系統。當使用一組抗體時，可以對每種抗體採用不同的報導標記從而能夠確定每種抗體的結合。
可以使用特異性結合成員如抗體分子將它的結合伴侶多肽從測試樣品中分離和/或純化，以允許進行所述多肽的測序和/或生化分析以便確定它是否具有促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的序列和/或特性。利用自動測序機器進行胺基酸測序是本領域的常規技術。
例如可以將包含一種或多種多肽的測試樣品作為粗製的或部分純化的細胞或細胞裂解物製劑提供，例如使用組織或細胞，如來自脾或體液，優選血液。
其它測試可以包括使用取自測試動物、個體、受試者或患者的血液或脾細胞，以及用抗原離體刺激細胞以確定對於該抗原的攻擊性或耐受性反應的存在或缺乏。
合適的探針可以，例如，用於確定特異性mRNA分子是否存在於細胞或組織中，或用於從染色體DNA中分離類似的多核苷酸序列，例如如由Walsh等(Walsh，P.S等，1992，PCR Methods Appl 1241-250)所描述的。它們可以通過切口平移，Klenow填補反應，PCR，或本領域已知的其它方法進行標記。合適的探針，其製備和/或標記在Sambrook，J.等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY；或Ausubel，F.M.等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，NewYork N.Y.中進行了詳細闡述。
將本說明書中提及的所有文件都併入作為參考。通過下列非限制性實施例和附圖對本發明進行說明。
實施例1
移植耐受性比較同種異體耐受性與同種異體排斥的基因表達模式在小鼠中，通過在血管化心臟移植物的受體中的CD4/CD8阻抑可以誘導感染調節型耐受性。一旦建立，這種移植耐受性就很強並且分離的「耐受性」脾細胞顯示強烈的免疫調節特性，能夠對具有完全免疫能力的原初受體施加供體特異性的同種異體耐受性。利用BALB/c-耐受型CBA[H-2k]小鼠，我們在一系列時間點並且與BALB/c-排斥型CBA[H-2k]小鼠脾細胞的相同離體系列相比較分析了對供體(BALB/c[H-2d])抗原的脾細胞反應。排斥的主要特徵是快速的幹擾素γ的釋放。相反地，在耐受性中幹擾素γ低並且比在對第三種抗原(C57BI10[H-2b])的反應中釋放的更少。致敏耐受性的陽性標誌是STAT3和c-kit的高度表達，和LIF的釋放。在此我們給出了四種基因陣列的化合物比較(耐受性與排斥，在48h，和在123h)，其中出現了相對少數的差異表達的基因。在排斥中，有幹擾素γ和粒酶B mRNAs的強烈進行性擴增。在耐受性中，Emk和促軸素在123h時都得以上調。缺少Emk的小鼠發生自身免疫疾病(Hurov等，Mol Cell Biol，2001)。缺少促軸素的小鼠在發育過程中顯示異常的軸突移動。總之，我們的結果提示了在發育調節和免疫調節之間的聯繫，並且強調了促軸素在調節型耐受性中的可能作用。
材料和方法生成BALB/c-致敏的CBA小鼠利用Chen所描述的技術[Chen Z.K.，Cobboid，S.P.，Waldmann，H. Metcalfe，S.M.Amplification of natural regulatory immunemechanisms for transplantation tolerance.Transplantation 62，1200-1206(1996)]，10-12周齡的CBA小鼠(H2k)接受了完全錯配的血管化BALB/c(H2d)心臟移植物至頸部。如以前所述[Chen，Z.K.，Cobbold，S.P.，Waldmann，H.Metcalfe，S.M.Amplificationof natural regulatory immune mechanisms for transplantationtolerance.Transplantation 62，1200-1206(1996)]利用阻抑CD4和CD8的mAbs通過21天的隔天治療期產生耐受性。至少在移植100天之後從耐受型受體中分離BALB/c-耐受型CBA脾細胞用於離體分析。為了進行比較，給10-12周齡的未處理CBA小鼠移植BALB/c尾部皮膚，其到第10天時出現排斥，或移植BALB/c心臟，其在第7天出現排斥。在第14天收集BALB/c-排斥型CBA脾細胞用於離體分析。根據Home Officelicence under the Animals(Scientific Procedures)Act 1986，UK實施所有操作。
離體培養培養條件已經在別處進行了詳細描述[Metcalfe，S.M.Moffatt-Bruce，S.D.An ex vivo model of toterance versusrejectionComparison of STAT1，STAT4，STAT5 and STAT6.Clin.Chem.and Lab.Med.38，1195-1199(2000)]。簡言之，反應性脾細胞獲得自BALB/c-耐受型CBA，或BALB/c-排斥型CBA小鼠，並在總共10ml的添加了10％FCS的生長培養基中使用4×107反應細胞和6×107刺激細胞，通過受輻照的BALB/c脾細胞(供體抗原)離體刺激耐受型和排斥型細胞群。48h後，取出耐受型和排斥型脾細胞各一瓶用於總RNA製備。在第120h時用另外的7×107刺激性脾細胞加強第二對瓶(一個為耐受型的，一個為排斥型的)，然後在第123h時收穫。收穫時，將細胞收集到冰上，在用0.25％胰酶短暫處理後包括任何粘附細胞。在將細胞重懸至均勻後，取1.5ml的試樣用於RNA提取。在冰冷的0.1％BSA/PBS中洗滌後，將細胞收集入無菌的15ml的Falcon離心管中並於1600rcf在+4℃下沉澱5min。棄去上清液並將試管中的上清液殘留物擦乾淨，然後將細胞重懸於預冷的Trizol試劑中，渦旋，隨後立即保存在-80℃下。每6×106細胞使用1ml Trizol。
RNA分離將樣品置於室溫並在加入1ml氯仿之前放置10分鐘，並渦旋成乳液。在15分鐘後於1600rcf在40℃下將樣品離心10分鐘。將上層相轉移到無RNA酶的Eppendorff管的400μl等分試樣中並加入等體積的異丙醇。在輕輕混合併放置15分鐘後，於13,000g在40℃下將樣品離心10分鐘。移除並棄去上清液。將RNA沉澱在350μl的75％乙醇中洗滌並於7500g在40℃下沉澱5分鐘。吸去上清液並將沉澱風乾20分鐘。通過50μl DH2O溶解和連續轉移將每種樣品的等份RNA沉澱收集在一起；使用第二份50μl來從每隻管中連續收集洗液，給出100μl DH2O中的最終樣品總體積。將這保存於80℃直到轉移至Hinxton Hall的MRC HGRC用於cRNA的用戶服務製備和通過標準方法使用Affymetrix U74晶片的陣列。
基因陣列利用dChip軟體[Wong，C.U.W.H.，PNAS USA，98，31，2001]準備組合陣列的分析。
結果匹配的耐受型和排斥型樣品對的組合的48h和123h陣列給出129種顯示差異表達的基因。為了鑑定在耐受性或在排斥中顯示偏向表達的那些基因，將結果以三種方式進行歸類顯示從48h到123h陽性轉變的那些基因(表1)；在123h時具有高度表達的那些基因(表2)；和顯示從48h到123h陽性轉變的那些基因(耐受型)，而排斥對應物顯示陰性轉變(表3)。
在從48h到123h表達提高的基因中，10個是在耐受型培養物中，提高1.71倍到4.00倍。在排斥反應中相同基因的表達既不顯示表達的提高也不顯示表達的降低(表1(a))。值得特別注意的是促軸素，一種新發現的幹細胞基因；與細胞周期和細胞遷移相關聯的細胞周期調節蛋白B2；可能在染色質重構中發揮作用的組蛋白H2A-X；和ELKL基序激酶，也稱作Erk，是調節免疫反應和保護以避免自身免疫傷害所必需的。表1(b)顯示在排斥中表達提高的5種基因。這種提高也是對排斥特異性的，除了粒酶B在耐受性和排斥中都有兩倍提高；不過在排斥中粒酶B mRNA的實際水平比在耐受性中高六倍。在排斥中幹擾素γmRNA的12倍提高與我們先前的發現，即在這些培養物中的高干擾素γ蛋白釋放相一致。
在四種陣列的情況中，在123h時顯示高度表達的那些基因中，15個是在耐受型組中(表2(a))並且包括促軸素。在排斥中，在表2(b)中按照表達水平的順序歸類了13種基因，其中粒酶B和幹擾素γ為最高。所以這種分析方法對於粒酶B和幹擾素γ顯示出與表型的相關性，並且再次認定促軸素與耐受性相關，儘管實際的表達水平並不高。進行了進一步的分析，鑑定了在耐受性中顯示提高的表達而在排斥中顯示降低的表達的那些基因(表3)。這揭示了參與染色體結構和重構的組蛋白H2A-X；ELKL基序激酶；剪接因子3b亞基1(SF3b-155)，其作為mRNA剪接複合物的一部分起作用並且可能參與外顯子去除；和細胞周期調節蛋白B2，細胞周期的調節劑並且當與cdc2.複合時還參與細胞遷移。
表1a和1b顯示提高的表達的基因(48h對123h)
表2a和2b在四種陣列的情況中在123h時顯示高度表達的基因
表3.在耐受性中顯示提高的表達並且在排斥中顯示降低的表達的基因
實施例2幹細胞基因axot與LIF的調節和T淋巴細胞的促有絲分裂活化作用相關幹細胞自我更新的「乾性質(stemness)」1對它們在器官形成過程中分化的控制，是再生醫學新領域的基礎。白血病抑制因子(LIF)對於這種控制來說是關鍵性的，其作為幹細胞分化的抑制因子起作用2，3。LIF和axot，一種新的幹細胞基因1，4，也與免疫耐受性相關的發現提示了乾性質和免疫性之間的關係。為了探索這種關係我們已經研究了是否來自axot-/-小鼠的免疫細胞有別於axot+/+同窩出生仔畜的那些免疫細胞。我們發現(i)促軸素的存在涉及T，而非B淋巴細胞增殖的衰減；(ii)促軸素的缺乏導致T細胞細胞因子的過度釋放；和(iii)LIF的acot基因劑量依賴性抑制。這是第一個證據，即由LIF介導的命運確定(fate determination)可能與促軸素相關聯，並且證明了乾性質和免疫耐受性之間的共同性，其可能有助於接受為了治療性組織再生而植入的幹細胞同種異體移植物。
幹細胞方面的命運確定是發育中的重要特徵，提供了整個生物體內多能性自我更新與分化功能之間的平衡。在再生醫學中，了解幹細胞的命運確定的分子基礎是重要的，如果它們要成功地用於疾病的治療中。命運確定途徑還在免疫系統中發揮關鍵作用，其中微調反應性以確保對自身組織的保護性耐受性同時能夠攻擊外來病原體。儘管對調節性耐受性途徑了解得不多，最近的論證，即單個基因，foxp3，能夠使原初CD4+T細胞分化成調節性T細胞(Treg)5，6，7，暗示了″master″的存在變換為免疫性方面的命運確定。我們最近發現對於幹細胞調節常見的免疫耐受性的特徵，提出了兩個重要的問題「乾性質」信號在自身免疫性中是通過抑制免疫效應細胞的終末分化發揮作用嗎？異源幹細胞是通過「乾性質」信號傳導使同種異體免疫反應偏向同種異體耐受性，從而有利於成功的治療性移植嗎？此論文描述了我們如何發現在胚胎、神經元和造血幹細胞中表達的促軸素1，不僅參與T淋巴細胞反應性的調節，還參與LIF的調節，由此提供了一種免疫調節的新概念。
已經在以往的研究中利用離體模型比較了相對於免疫攻擊與免疫耐受性相關的分子事件8。這來自這樣的小鼠，其中完全錯配的心臟移植物，正常情況下到第7天被排斥，在CD4和CD8的短期阻抑後被無限期地接受(參考文獻9)。一旦建立，這種移植耐受性就能使自身永久存在並且分離的「耐受型」脾細胞顯示強大的免疫調節特性，當注入具有完全免疫能力的原初受體時能夠施加供體特異性的同種異體耐受性。我們對耐受型脾細胞，相對於來自已經被致敏排斥相同供體型的小鼠的脾細胞的離體反應進行了特徵鑑定，排斥的主要特徵是快速的幹擾素γ釋放和編碼幹擾素γ和粒酶B的基因的強烈擴增表達。明顯相反地，耐受性顯示與乾性質一樣的特徵，這些特徵是LIF的釋放和c-kit(幹細胞因子(SCF)受體)和STAT3(響應於SCF和LIF活性的轉錄3的信號轉導物和激活劑)的增多。我們發現LIF和耐受性的關係在克隆的Treg中也是明顯的，顯示與Th1和Th2克隆相反的高水平的LIF釋放。在基因水平上，耐受性與新發現的幹細胞基因，axot(Genbank編號AF155739)的強烈誘導相關。為了檢驗我們的假設，即乾性質和耐受性是相關聯的，我們研究了促軸素是否影響免疫反應性。
我們首先考慮對有絲分裂原的淋巴細胞反應性。將Axot無效(axot-/-)小鼠與表達一個axot等位基因(雜合的，axot+/-)或兩個等位基因(野生型；axot+/+)的同窩出生仔畜進行比較。從脾中新分離完整的細胞群並且我們利用伴刀豆球蛋白A(conA)作為T細胞有絲分裂原，或利用脂多糖(LPS)作為B細胞有絲分裂原測量有絲分裂活化。我們還通過比較48h和72h時的DNA合成尋找對於響應性的任何動物學作用。由於激活的淋巴細胞顯示同步化進入細胞周期，S期峰出現在48h(參考文獻10)，我們推理與axot+/+細胞相比，在axot無效細胞中DNA合成的一致減弱將表明由於缺少促軸素而喪失有絲分裂響應性。不過，當與野生型細胞相比時，T細胞增殖的水平在axot無效細胞中顯示顯著的提高。這並非由改變的動力學引發，因為axot-相關的差別在48h和72h都相似(

圖1a，圖1b)。所以促軸素似乎抑制T細胞的增殖性反應。另外，由於雜合的axot+/-T細胞顯示中間的高增殖，所述抑制似乎對axot基因的劑量敏感。與T細胞明顯相反，B淋巴細胞增殖並未被促軸素顯著改變(圖1c，圖1d)。我們推斷促軸素在有絲分裂刺激後在使T，而非B淋巴細胞增殖衰減中發揮作用。在7天時間內在axot+/+，axot+/-，或axot-/-脾細胞的培養物中沒有發生自發的有絲分裂。
作為axot無效脾細胞中功能性的進一步測試，我們測量了在對有絲分裂原的響應中的細胞因子釋放。在axot無效和axot雜合的細胞培養物中，conA處理之後促軸素的缺乏與白介素2(IL2)的兩倍提高相關(圖2a)。這種IL2等值揭示了IL2並不是T細胞增殖的限制性因子，其中有四倍的差異。脾臟B細胞並不釋放IL2(圖2b)而T和B細胞都在對其各自的有絲分裂原的響應中釋放IL10。再者，只有conA-處理的培養物被促軸素的缺乏所影響，在axot+/-和axot-/-細胞培養物中都有IL10的十倍提高(圖2c，圖2d)。這些發現顯示促軸素的部分或全部減少導致來自活化T細胞的IL2和IL10兩者的一般性增加，但是對於從活化B細胞中釋放IL10沒有影響。還測量了幹擾素γ和IL4並且顯示與在conA-處理的培養物中對於IL2所發現的相似的axot相關的增加，如在圖1的圖法中所詳述的。LPS處理的培養物對於幹擾素γ和IL4為陰性。
出乎意料的是，我們發現在對conA的響應中LIF的釋放被促軸素強烈地抑制並且這種抑制是基因劑量依賴性的(圖2)。不管axot基因型如何在LPS處理的培養物中都沒有LIF。基於LIF濃度與axot基因劑量的關係，我們假設基因劑量與促軸素的表達水平相關。因而LIF釋放和T細胞增殖看來都受到促軸素的決定性影響並且我們的結果與三者之間的相互依賴性聯繫相一致。
通過表型和組織學結構的分析，我們探索了促軸素對淋巴器官表型組成的影響。如下通過FACS分析對細胞亞群進行鑑定表達T細胞標記物CD3，CD4和CD8；B細胞標記物CD19；T細胞和調節性耐受型T細胞的激活標記物，CD25；和樹狀突細胞的標記物，CD205和DC33D1的細胞。這些標記物中沒有一個顯示axot+/+，axot+/-，和axot-/-同窩出生仔畜之間的差異表達(圖3)。類似地，脾和胸腺的組織學評估顯示在這三種axot基因型之間無顯著性差異。
命運確定由遺傳程序所控制，所述遺傳程序通過改變小環境中細胞因子相互作用的性質和頻率而得以改變，所述小環境是對於全能和多能幹細胞，以及對於前體細胞的分化而言的。LIF除了是神經生成細胞因子外12，還是幹細胞自我更新的重要決定子11。在顯示了至少在激活的T細胞內促軸素可以作為LIF的負調節物起作用後，我們提出LIF表達與促軸素表達功能性相聯繫，促軸素在協調LIF釋放的正和負調節中發揮作用。這將使促軸素成為一種通過LIF的命運確定的潛在調節劑。促軸素的分子功能尚有待測定並且促軸素可能如何影響LIF釋放尚不清楚。將來的工作將包括這種關係的闡釋，探索促軸素對LIF基因表達13，以及對通過LIF-R/gp130複合物調節LIF誘導的信號傳導14，15，16，17的影響。
作為工作模型，我們提出由促軸素調節的LIF活性與免疫耐受性相關。LIF可以將原初T細胞引導向響應於所呈遞抗原的相對未分化的，非攻擊性的表型，其中呈遞的環境直接或間接地引發產生耐受性的LIF活性(例如通過不成熟的或調節性樹突細胞進行的抗原呈遞18， 19和相關的維生素D活性20，或由於CD4/CD8(參考文獻9)或CD28(參考文獻21)的功能改變而導致的減弱的T細胞反應性)。此後，後生變化，包括foxp3和ROG的表達18，和Id轉錄因子的誘導22，將為了可遺傳的Treg活性而穩定耐受性表型。在幹細胞生物學和調節性免疫耐受性之間的聯繫與免疫相關疾病的治療性幹涉和與器官移植受體的免疫抑制性治療有直接相關性。該工作還對幹細胞用於再生醫學具有主要牽連，因為我們發現的特性可以提高患者中移植的幹細胞的成功結果。
總之，我們已經發現促軸素抑制成體小鼠中的T淋巴細胞增殖反應性並且促軸素能夠作為LIF的負調節劑而起作用，暗示促軸素通過LIF起作用來調節T細胞。
方法小鼠利用基因捕獲插入生成axot無效BALB/c小鼠並通過基因組DNA的PCR分析對來自雜合親本的同窩出生仔畜進行基因型分析以鑑定先前詳述的axot+/+，axot+/-和axot-/-幼畜。從5月齡的同窩出生仔畜中獲得脾、胸腺和淋巴結並在細胞製備進行下面所述分析之前置於冰上。淋巴結組織產生非常少的細胞並被棄去。還從axot+/+，axot+/-和axot-/-同窩出生仔畜中取脾和胸腺進行組織學分析。將這些器官解剖開並固定於70％乙醇中。將固定的組織包埋在石蠟塊中並進行切片，隨後利用標準方法以蘇木精和曙紅進行染色。
增殖測定將脾細胞和胸腺細胞從每種器官中取出並收集在無菌的生長培養基[添加了10％FCS(GibcoTMInvitrogen Co.)，200mM L-穀氨醯胺，100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素(Sigma Chemical Co.)的RPMI-1640(GibcoTMInvitrogen Co.)]中。洗滌細胞懸浮液，重懸於生長培養基中並利用血球計進行計數。
將細胞以每孔5×105有核細胞接種於平底96孔NunclonTM組織培養平板中的100μl生長培養基裡並於37℃，5％CO2中孵育48h或72h。在開始時加入50μg/mL的LPS，(Sigma Chemical Co.)和10μg/mL的conA(ICN Biochemicals，USA)作為有絲分裂原。所有的實驗都以一式三份進行。緊接在收穫之前，收集上清液進行ELISA分析並將細胞在預熱的包含最終濃度為1μCi/mL的甲基-[3H]胸苷(TRK686，比活性80Ci/mmol，Amersham Biosciences)的GM中孵育2小時。利用Filtermate196，Packard收集器收穫細胞並利用Packard TopCount.NXTTM微平板閃爍和發光計數器進行計數。
為了測定LIF對Con A刺激的影響，將BALB/c axot+/+脾細胞和胸腺細胞在Con A(2μg/mL或10μg/mL)以及500pg/mL或1000pg/mL rmLIF(Santa Cruz Biotechnology，SC-4378)存在時進行孵育。如上所述測量有絲分裂發生。對照以各自的濃度只包括GM，只包括conA，和只包括LIF。
ELISA對於幹擾素γ(DY485)，IL2(DY402)，IL4(DY404)，IL10(DY417)使用DuoSetELISAS而對於LIF(MLF00)使用QuantikineMlmmunoassay，來自R D Systems，在96孔Falcon平板中對48h的培養物上清液進行ELISA。通過利用微軟Excel軟體處理光密度數據建立標準曲線並利用標準曲線確定細胞因子濃度。
流式細胞測量術將脾細胞和胸腺細胞懸浮液進行RBC排除並在與下面詳述的各種單克隆抗體混合之前於FACS染色溶液(1xPBS中的0.2％BSA和0.1％疊氮化鈉)中洗滌，這些單克隆抗體被直接或間接地與藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸螢光素(FITC)綴合。PE-大鼠抗小鼠CD19(557399)，PE-倉鼠抗小鼠TCRα鏈(553172)和大鼠抗小鼠樹突細胞克隆33D1(551776)來自Pharmingen。大鼠抗小鼠CD205-FITC(MCA949F)，小鼠抗大鼠IgG2a重鏈-FITC(MCA278F)和小鼠抗大鼠IgG2b鏈-FITC來自Serotec Ltd.而兔抗小鼠CD25(IL2Ra)和山羊抗兔IgG(H L)-PE(4050-89)分別來自Santa Cruz Biotechnology和SouthernBiotechnology Associates。抗CD4(YTS177.9.6)和抗CD8(YTS105.18.10)由牛津大學(University of Oxford)Stephen Cobbold教授贈予。在配備了CellQuest軟體的Becton Dickinson FACSCalibur儀器上進行分析。
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22.Ying，Q.L.，Nichols，J.，Chambers，I. Smith，A.BMPinduction of Id proteins suppresses differentiation and圖例圖1.
由來自axot+/+，axot+/-和axot-/-同窩出生仔畜的脾細胞進行的DNA合成和細胞因子釋放(a)用conA(左手圖示)或LPS(右手圖示)刺激了48h(上圖)或72h(下圖)的脾細胞的H3-胸苷標記。在對每種基因型減去各自的背景對照後顯示了DNA合成和標準偏差。背景對照都小於300cpm。(b)在用conA(上圖)或LPS(下圖)刺激後48h時在上清液中IL2和IL10的水平。還測量了幹擾素γ和IL4幹擾素γ只存在於conA培養物上清液中，對於axot+/+，axot+/-和axot-/-培養物來說濃度分別為538pg/ml，1410pg/ml，和909pg/ml。IL4也只發現於conA培養物上清液中並且對於axot+/+，axot+/-和axot-/-培養物來說濃度分別為121pg/ml，263pg/ml，和92pg/ml。對於每種EILSA的擬合良度回歸分析如下IL2，R2＝0.946；IL4，R2＝0.925；IL10，R2＝0.939；和幹擾素γR2＝0.937。
圖2.
促軸素對於LIF釋放的影響在48h的conA(左圖)或48h的LPS(右圖)刺激後LIF從axot+/+，axot+/-和axot-/-同窩出生仔畜的脾細胞中釋放出來。對於擬合良度的回歸分析為R2＝0.999。
圖3.
來自axot+/+和axot-/-小鼠同窩出生仔畜的脾和胸腺的表型特徵製備完整的脾和胸腺細胞群，如材料和方法中所述的那樣進行染色和分析。將FACs數據以直方圖形式用負染色的截斷值來給出，所述負染色由穿過CD4，CD8，CD3，CD19，DC33d1，和CD25染色的每個數據組的垂直線來顯示。小鼠axot+/+和axot-/-基因型如上面每個圖中所示。還分析了axot+/-脾細胞和胸腺細胞並給出與所示那些相同的結果。CD205染色始終為陰性。
序列表序列表110Susan Marie Metcalfe120誘導或調節免疫反應的方法160421012112728212mRNA213人4001ggtggctggt tctgcgccgg atccgggaga ggggcgggcg ccattgtgct tcgctgccga60ctgcatttcc tcagtcacgg gcctagaact ccaaggagaa aggcggcgaa aaatctttaa120gaatggagtc taaaccttca aggattccaa gaagaatttc tgttcaacct tccagctcct180taagtgctag gatgatgtct ggaagcagag gaagtagttt aaatgatacc tatcactcaa240gagactcttc atttagattg gattctgaat atcagtctac atcagcatca gcatctgcgt300caccatttca atctgcatgg tatagtgaat ctgagataac tcagggagca cgctcaagat360cgcagaacca gcaacgggat catgattcaa aaagacctaa actttcctgt acaaactgta420ctacctcagc tgggagaaat gttggaaatg gtttaaacac attatcagat tcatcttgga480ggcatagtca agttcctaga tcttcatcaa tggtacttgg atcatttgga acagacttaa540tgagagagag gagagatttg gagagaagaa cagattcctc tattagtaat cttatggatt600atagtcaccg aagtggtgat ttcacaactt catcatatgt tcaagacaga gttccttcat660attcacaagg agcaagacca aaagaaaact caatgagcac tttacagttg aatacatcat720ccacaaacca ccaattgcct tctgaacatc agaccatact aagttctagg gattccagaa780attctttaag atcaaatttt tcttcaagag aatcagaatc ttcccgaagc aatacgcagc840ctggattttc ttacagttca agtagagatg aagccccaat cataagcaat tcagaaaggg900ttgtttcatc tcaaagacca tttcaagaat cttctgacaa tgaaggtagg cggacaacga960ggagattgct gtcacgcata gcttctagca tgtcatctac ttttttttca cgaagatcta1020gtcaggattc cttgaataca agatcattga attctgaaaa ttcttacgtt tctccaagaa1080tcttgacagc ttcacagtcc cgtagtaatg taccatcagc ttctgaagtt cccgataata1140gggcgtctga agcttctcag ggatttcgat ttcttaggcg aagatggggt ttgtcatctc1200ttagccacaa tcatagctct gagtcagatt cagaaaattt taaccaagaa tctgaaggta1260gaaatacagg accatggtta tcttcctcac ttagaaatag atgcacacct ttgttctcta1320gaaggaggcg agagggaaga gatgaatctt caaggatacc tacctctgat acatcatcta1380gatctcatat ttttagaaga gaatcaaatg aagtggttca ccttgaagca cagaatgatc1440ctcttggagc tgctgccaac agaccacaag catctgcagc atcaagcagt gccacaacag1500gtggctctac atcagattcg gctcaaggtg gaagaaatac aggaatatca gggattcttc1560ctggttcctt attccggttt gcagtccccc cagcacttgg gagtaatttg accgacaatg1620tcatgatcac agtagatatt attccttcag gttggaattc agctgatggt aaaagtgata1680aaactaaaag tgcgccttca agagatccag aaagattgca gaaaataaaa gagagcctcc1740ttttagagga ctcagaagaa gaagaaggtg acttatgtag aatttgtcaa atggcagctg1800catcatcatc taatttgctg atagagccat gcaagtgcac aggaagtttg cagtatgtcc1860accaagactg tatgaaaaag tggttacagg ccaaaattaa ctctggttct tcattagaag1920ctgtaaccac ctgtgaacta tgtaaagaga agttggagct taacctggag gattttgata1980ttcatgaact acatagagct catgcaaatg aacaagctga gtatgagttt atcagctctg2040gtctctacct agtggtgtta ttgcacttgt gcgaacaaag cttttctgat atgatgggaa2100atacaaatga accaagcaca cgtgtccgat ttattaacct tgcaagaact cttcaggcac2160
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權利要求
1.促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸直接或間接地誘導或調節個體和/或離體細胞群對抗原的免疫反應的應用。
2.促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸在生產直接或間接地誘導或調節個體和/或離體細胞群對抗原的免疫反應的藥物中的應用。
3.根據權利要求1或權利要求2的應用，其中所述免疫反應是在脊椎動物中，其中所述個體具有組織或細胞移植物。
4.促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸或在個體中改變其量或活性的物質在生產加強或減弱針對抗原的攻擊性免疫反應或改變免疫系統對抗原的耐受性的藥物中的應用。
5.促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸對於測定免疫狀態的應用。
6.一種在個體中控制免疫系統對於給定抗原的反應的方法，所述方法包括向個體施用促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸或提高由促軸素直接或間接表達的多肽的量或活性的物質。
6.根據權利要求5的方法，包括加強或提高個體的免疫系統針對抗原的攻擊性反應的方法，所述方法包括向個體施用降低由促軸素直接或間接表達的多肽的量或活性的物質。
7.一種確定個體免疫狀態的方法，所述方法包含測定促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸在測試樣品中的表達水平，所述樣品包括從個體中取出或獲得的組織、細胞和/或體液，並將測試樣品的水平與對照樣品的水平進行比較，其中在測試樣品中的水平大於對照樣品中的水平表示個體中的免疫狀態包含耐受性免疫反應，個體中的免疫狀態包含攻擊性免疫反應。
8.分離的促軸素，由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸。
9.一種生產促軸素多肽的方法，包括在允許表達促軸素多肽的條件下在培養基中使細胞的培養物生長，並從培養物或從宿主細胞中純化所述多肽。
10.一種用於表達促軸素，由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸序列的載體，所述載體包含促軸素或編碼促軸素的多核苷酸序列，啟動子序列和終止序列。
11.一種包含促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸以及可藥用的稀釋劑、載體或賦形劑的組合物。
12.一種篩選化合物的方法，包括將包含一種或多種待篩選的化合物的測試樣品與選自促軸素，由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸和這種多核苷酸或多肽的片段的結合劑接觸並確定所述化合物是否已經結合到所述結合劑上。
13.根據權利要求12的方法，用於鑑定結合到促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸上的物質，其包括(a)將某種物質與促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸接觸；(b)確定所述物質是否結合到所述多核苷酸或多肽上；和(c)檢測在所述物質和所述多核苷酸或多肽之間形成的複合物的形成，從而如果形成了複合物，則對所述物質進行檢測。
14.根據權利要求13的方法，其中將所述化合物在細胞中與促軸素或促軸素的多肽或多核苷酸接觸，其中所述複合物驅動受體基因序列在細胞中的表達，並且通過檢測報導基因序列表達來檢測所述複合物。
15.一種試劑盒，其包含i)一種多核苷酸或多肽探針和/或單克隆抗體，所述探針或抗體包含促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸；和任選地ii)用於實施根據任一項在前權利要求的方法的定量標準品。
16.一種檢測促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的診斷方法，其包括(a)將待測試由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸是否存在的樣品與結合到由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸上的化合物接觸；(b)確定所述化合物是否結合到所述樣品的組分上；和(c)檢測在所述樣品和所述蛋白質或多核苷酸之間形成的複合物的形成，從而如果形成了複合物，則對所述多肽或多核苷酸進行檢測。
17.一種評估個體的免疫反應的診斷方法，包括從個體中獲得測試樣品，將所述測試樣品與一種或多種促軸素或由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸的抗體或多核苷酸探針一起溫育並測定所述多核苷酸探針或抗體與測試樣品內組分的結合。
18.根據權利要求16或17的方法，其中步驟(c)包括用離體免疫細胞群進行測試。
19.根據權利要求16或17的方法，其中步驟(c)包括體內測試。
20.結合到由促軸素編碼或衍生的多肽或多核苷酸上的化合物在生產藥物中的應用，所述藥物用來治療個體和/或離體細胞群以調節對於抗原的免疫反應。
全文摘要
公開了促軸素，也稱作MARCH VII適當地在脊椎動物，例如哺乳動物中誘導或調節對於外源或自身抗原的免疫反應的應用。作為本發明的其它方面還提供了分離的促軸素以及由促軸素編碼或衍生的多肽和核苷酸，包含上述一種或多種的組合物和測定方法。
文檔編號C12Q1/00GK1929855SQ200580007275
公開日2007年3月14日 申請日期2005年1月31日 優先權日2004年1月29日
發明者蘇珊·瑪麗亞·梅特卡夫 申請人:蘇珊·瑪麗亞·梅特卡夫