一種通過調控gln1基因表達提高S-腺苷甲硫氨酸產量的方法
2023-09-19 23:15:15
一種通過調控gln1基因表達提高S-腺苷甲硫氨酸產量的方法
【專利摘要】本發明涉及一種通過調控gln1基因表達提高S-腺苷甲硫氨酸產量的方法。首次揭示將穀氨醯胺合成酶的編碼基因轉入S-腺苷甲硫氨酸生產菌株，能夠顯著地提高S-腺苷甲硫氨酸生產菌株的S-腺苷甲硫氨酸產量。
【專利說明】—種通過調控glnl基因表達提高S-腺苷甲硫氨酸產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，更具體地，本發明涉及一種通過調控glnl基因表達提高S-腺苷甲硫氨酸產量的方法。
【背景技術】
[0002]S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)由 Cantoni 等人於 1%2 年發現，作為所有生物體內的重要甲基供體，並參與多種代謝反應，SAM在抑鬱症、肝臟疾病和關節炎治療領域都具有良好的臨床應用價值。因此，越來越多的研究人員利用代謝工程改變細胞的代謝途徑以獲得高產SAM的菌株。
[0003]在生物體內，以L-Met和ATP為前體，可經SAM合成酶(MAT)催化合成SAM (圖1)。其反應過程為，ATP的腺苷部分與L-Met的硫原子部分發生撞擊,使得腺苷結構與甲硫氨酸相結合，從而生成具有高能量的有機硫化物。
[0004]上述提高SAM合成酶活性是獲得SAM高產菌的一個重要策略。經研究發現在生物體內存在兩種SAM合成酶，它們是同工酶，編碼基因分別為saml和sam2，saml編碼SAM合成酶I是受產物抑制的 ，而sam2編碼的SAM合成酶II不受產物抑制，所以提高sam2基因的表達可以提高SAM合成酶的含量。因此人們利用受甲醇誘導的強啟動子AOX或者組成型的GAP調控sam2的表達，李東陽等將sam2基因導入pPIC3.5K轉化畢赤酵母GSl 15使得SAM合成酶酶活提高了 37倍，SAM最終產量達到了 1.58g/L。Yu等(Yu ZL, Wu XJ, LiDY, et al.Enhancement of the production of SAM by overexpression of SAM synthetase inPichia pastoris.Acta Biochimica et Biophysica Sinica.2003, 35:127 - 132)利用組成型的GAP啟動子調控SAM合成酶，導入GS115使得SAM產量顯著提高。
[0005]除了提高SAM合成酶的表達量，還能對SAM合成酶進行體外進化，以獲得高酶活的重組酶。本發明人前期工作中(Hu H, Qian JC, Chu J, et al.DNA shuffling of methionineadenosy I transferase gene leads to improved S-adenosyl-L-methionine production inPichia pastoris.J Biotechnol.2009，141(3):97-103)利用 DNA Shuffling 技術對 SAM 合成酶進行了體外進化，經過篩選獲得高酶活重組SAM合成酶基因dsl6和相應的高產菌株DS16。在搖瓶中，DS16的胞內SAM累積量為1.64g/L，SAM合成酶的酶活達到463U/g DCW，與表達酵母SAM合成酶的重組菌相比，分別提高了 102%和201%，有效改善了胞內SAM合成酶活性對SAM合成的限制。
[0006]本發明人前期工作中，利用易錯PCR對GAP啟動子進行突變，篩選得到了強度不一的啟動子，可對畢赤酵母內的基因表達進行有效調控。應用弱啟動子弱化cys4基因表達，使其克服營養缺陷型的缺點，得到一株SAM高產菌G12-CBS。通過搖瓶培養產量達到了133.2mg/gDCW，在5L罐中重組菌G12-CBS的SAM單位菌體產量達到了 146.8mg/gDCW。相比出發菌DS16，其單位菌體產量提高了 39.3%，體積產量提高了 48.8%。從發酵成本來看，G12-CBS消耗的外源L-Met量與出發菌株相比減少了 15%，其L-Met轉化率達到34.6%，t匕DS16(19.4% )提高了 78%。
[0007]以上改造都是基於對SAM相關代謝局部途徑的認識來選擇改造靶點的。但是，由於微生物代謝網絡的系統性和複雜性，從局部代謝途徑出發的改造往往具有一定的局限性。為了克服這一問題，本領域技術人員還需利用系統生物學的方法對細胞生理特性進行分析，從全基因組範圍尋找影響目標產物合成的改造靶點。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在於提供一種通過調控glnl基因表達提高S-腺苷甲硫氨酸產量的方法。
[0009]在本發明的第一方面，提供一種生產S-腺苷甲硫氨酸的方法，所述方法包括:
[0010](I)在S-腺苷甲硫氨酸生產菌株的基因組中引入外源的穀氨醯胺合成酶(GLNl)表達盒；
[0011](2)培養步驟(1)製備的菌株，從而生產S-腺苷甲硫氨酸。
[0012]在一個優選例中，所述的穀氨醯胺合成酶表達盒包括以下操作性連接的元件:AOXl啟動子、編碼穀氨醯胺合成酶的基因、轉錄終止序列(較佳地為TT)。
[0013]在另一優選例中，所述的在S-腺苷甲硫氨酸生產菌株是插入了 SAM合成酶基因dsl6,並弱化了 β -胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)的菌株。
[0014]在另一優選 例中，步驟(2)中，培養的方法包括:30±2°C、220±50rpm條件下進行誘導培養；每隔12±2h補入甲醇至其終濃度為1.2±0.2% (V/V);每隔24±4h補加L-Met (較佳地，加至終濃度為0.8-1.2g/L)，共誘導96±12h。
[0015]在另一優選例中，培養過程中調節ρΗ5.5-6.0。
[0016]在本發明的另一方面,提供一種改良的S-腺苷甲硫氨酸生產菌株,所述的菌株的基因組中引入了外源的穀氨醯胺合成酶(GLNl)表達盒。
[0017]在一個優選例中，所述的穀氨醯胺合成酶(GLNl)表達盒插入到S-腺苷甲硫氨酸生產菌株基因組的一號染色體的第1754722-1756086位鹼基處。
[0018]在另一優選例中，所述的穀氨醯胺合成酶(GLNl)表達盒包括以下操作性連接的元件:Α0Χ1啟動子、編碼穀氨醯胺合成酶的基因，轉錄終止序列(較佳地為TT)。
[0019]在另一優選例中，所述的改良的S-腺苷甲硫氨酸生產菌株是插入了 SAM合成酶基因dsl6，並弱化了 β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)表達的菌株。
[0020]在另一優選例中，在基因組四號染色體的第1550676個鹼基之後插入dsl6。
[0021]在另一優選例中，通過應用弱啟動子弱化cys4基因表達，較佳地，應用GAP弱啟動子(較佳地為G12)。
[0022]在本發明的另一方面，提供穀氨醯胺合成酶(GLNl)的用途，用於促進S-腺苷甲硫氨酸生產菌株生產S-腺苷甲硫氨酸。
[0023]本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1、S-腺苷甲硫氨酸的生物合成。[0025]圖2、GS115的基因組序列中可供同源重組的位點的示意圖。
[0026]圖3、pCmG (R-A-D)的構建過程。
[0027]圖4、質粒pAOX-gln構建過程。
[0028]圖5、重組菌G12/Gln構建過程。
[0029]圖6、PCR驗證GU/GlruM:Marker2，000 ;lanel_6:以 G12/Gln 基因組 DNA 為模板；lanel-3:引物 CYCTTF/DDKC-D(1024bp) ;lane4_6:引物 RH-U/AOXR-O(1622bp) ;lane7_8:以G12-CBS基因組DNA為模板，引物分別為RH-U/A0XR-0和CYCTTF/DDKC-D。
[0030]圖7、強化glnl基因對重組菌生長的影響。
[0031]圖8、強化glnl基因對重組菌SAM產量的影響。
【具體實施方式】
[0032]本發明人經過深入的研究，首次揭示將穀氨醯胺合成酶(GLNl)的編碼基因(glnl)轉入S-腺苷甲硫氨酸生產 菌株，能夠顯著地提高S-腺苷甲硫氨酸生產菌株的S-腺苷甲硫氨酸產量。
[0033]本發明人前期工作中，以S-腺苷甲硫氨酸生產菌株DS16、G12-CBS為對象，野生菌GS115基因組插入空載體(GS115/3.5K)作為對照菌，進行轉錄譜差異分析。比較導入強的SAM合成酶基因(DS16vs3.5K)，弱化SAM分解代謝途徑同時導入強的SAM合成酶基因(G12-CBS vs3.5K)，和弱化分解途徑(G12-CBS vs DS16)對菌株轉錄水平的影響，同時考察添加 L-Met (G12-CBS-72h vs G12_CBS_24h)對菌體轉錄的影響。
[0034]進行轉錄譜差異分析後，本發明人發現，相對於DS16，在重組菌G12-CBS中，glnl (編碼穀氨醯胺合成酶，催化穀氨酸和NH3生成穀氨醯胺)出現了顯著的下調，較之DS16下降了 2.0倍，這可能影響氮源的利用。在L-Met添加後，氮代謝相關基因的轉錄水平也出現了顯著的變化，glnl下調了 2.05倍。而gdh2(編碼穀氨酸脫氫酶，催化穀氨酸分解為酮戊二酸和NH3)出現了顯著的上調，上調了 4.09倍，本發明人推測這些變化可能影響氮源的利用。因此，本發明人以菌株G12-CBS(插入了 dsl6基因，並弱化了 cys4基因)為出發菌，進一步強化glnl表達，最終發現其可極其顯著地促進SAM合成。
[0035]如本文所用，「外源的」或「異源的」是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關係。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對於該目的基因來說是外源的。特定序列對於其所插入的細胞或生物體來說是「外源的」。
[0036]如本文所用，所述的「啟動子」是指一種核酸序列，其通常存在於目的基因編碼序列的上遊(5，端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的活性變異體，該變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。所述變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。
[0037]如本文所用，所述的「表達盒」是指包含有表達目的多肽(本發明中為GLNl多肽)所需的所有必要元件的基因表達系統，通常其包括以下元件:啟動子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等。這些元件是操作性相連的。
[0038]如本文所用，所述的「可操作性連接」是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如:啟動子區被置於相對於目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被「可操作地連接」到該核酸序列上。
[0039]NCBI已公開了 GLNl蛋白序列或glnl基因序列，因此,本領域人員易於犾得和製備這些基因。作為本發明的優選方式，所述的glnl具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0040]本發明還涉及glnl的多核苷酸變異體，其編碼與野生型基因編碼的胺基酸序列相同的多肽。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
[0041]本發明的glnl的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
[0042]為了優化S-腺苷甲硫氨酸生產菌株的S-腺苷甲硫氨酸的生產，本發明人作了廣泛地研究，找到了適合於進行改良的基因glnl，並構建了相應的構建物。
[0043]因此，本發明提供了一種構建物，所述構建物包括:glnl的表達盒。所述的表達盒具備基因表達所需的所有元件(包括啟動子、編碼DNA以及終止子等)，從而可完整地表達出相應的GLNl蛋白。
[0044]本領域已知的一些誘導型或組成型啟動子均適用於本發明、進行表達盒的構建。作為本發明的優選方式，所述的啟動子是甲醇誘導型啟動子AOXl啟動子。當用於增強基因的表達時，一些強啟 動子是優選的。
[0045]通常，所述的構建物位於表達載體上。因此，本發明還包括一種載體，它含有所述的構建物。所述的表達載體通常還含有複製起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建本發明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。為了實現在基因組上的基因定向敲除和基因定向重組，所述的表達載體還可設置合適的同源臂；同源臂的設置是本領域技術人員了解的。應理解，只要能夠實現對於本發明的S-腺苷甲硫氨酸生產菌株的改造，任何表達載體均可選用的。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀。
[0046]包含上述的適當多核苷酸序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主。在本發明的方法中，所述的宿主是S-腺苷甲硫氨酸生產菌株。作為本發明的優選方式，所述的S-腺苷甲硫氨酸生產菌株是酵母菌株，優選地是畢赤酵母菌株，包括各種經改造的畢赤酵母菌株；最優選的，S-腺苷甲硫氨酸生產菌株是G12-CBS菌株，該菌株插入了 SAM合成酶基因dsl6,並弱化了 β_胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)的菌株。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。
[0047]弱化基因表達的方法可以採用本領域已知的方法，作為本發明的優選方式，應用本發明人在先研究中提供的方法，即應用GAP弱啟動子來進行cys4基因的弱化表達。
[0048]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0049]材料與方法
[0050]1、質粒、菌株和培養基
[0051]實施例中所應用的質粒和菌株見表1和表2。
[0052]表1、質粒
[0053]
【權利要求】
1.一種生產S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特徵在於，所述方法包括: (1)在S-腺苷甲硫氨酸生產菌株的基因組中引入外源的穀氨醯胺合成酶表達盒； (2)培養步驟(1)製備的菌株，從而生產S-腺苷甲硫氨酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的穀氨醯胺合成酶表達盒包括以下操作性連接的元件=AOXl啟動子、編碼穀氨醯胺合成酶的基因、轉錄終止序列。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的在S-腺苷甲硫氨酸生產菌株是插入了 SAM合成酶基因dsl6，並弱化了 β-胱硫醚合成酶基因的菌株。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，培養的方法包括:30±2°C、220±50rpm條件下進行誘導培養；每隔12±2h補入甲醇至其終濃度為按照體積1.2±0.2% ;每隔 24±4h 補加 L-Met，共誘導 96±12h。
5.一種改良的S-腺苷甲硫氨酸生產菌株，其特徵在於，所述的菌株的基因組中引入了外源的穀氨醯胺合成酶表達盒。
6.如權利要求5所述的菌株，其特徵在於，所述的穀氨醯胺合成酶表達盒插入到S-腺苷甲硫氨酸生產菌株基因組的一號染色體的第1754722-1756086位鹼基處。
7.如權利 要求5所述的菌株，其特徵在於，所述的穀氨醯胺合成酶表達盒包括以下操作性連接的元件: AOXl啟動子、編碼穀氨醯胺合成酶的基因，轉錄終止序列。
8.如權利要求5所述的菌株，其特徵在於，所述的改良的S-腺苷甲硫氨酸生產菌株是插入了 SAM合成酶基因dsl6，並弱化了 β-胱硫醚合成酶基因表達的菌株。
9.穀氨醯胺合成酶的用途，其特徵在於，用於促進S-腺苷甲硫氨酸生產菌株生產S-腺苷甲硫氨酸。
【文檔編號】C12N1/19GK104017843SQ201410294493
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】錢江潮, 陸俊傑, 喬雪鋒, 武曉樂, 秦秀林, 儲炬, 莊英萍, 張嗣良 申請人:華東理工大學