利用人工調控元件及其文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法

2023-09-19 23:21:50 2

專利名稱：利用人工調控元件及其文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法
技術領域：
本發明涉及利用人工調控元件及其文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法。
背景技術：
基因表達調控技術是代謝工程的核心技術之一。目前在改造微生物提高目標產品合成能力時，常用的一種策略是通過質粒過表達的方法對基因的表達進行調控，提高某個或某幾個關鍵酶的活性，從而增強微生物合成目標產品的代謝流量。質粒過表達時，通常使用的都是誘導型啟動子(如laC、trc、ara等啟動子)來調控基因的表達。然而，這種方法有三大弊端。第一，由於需要添加乳糖、IPTG、阿拉伯糖等昂貴的誘導劑來誘導這些啟動子的表達，在生產大宗化學品時使用這些誘導型啟動子在經濟上是不可行的。第二，基於質粒的表達有很多弊端質粒的維持對宿主細胞會造成很大的代謝負荷，尤其是高拷貝的質粒； 很多質粒的遺傳穩定性不好；只有低拷貝數質粒的複製和細胞的繁殖是同步進行的，因此也只有它們在所有的細胞中保持一致的拷貝數；很多化合物的合成需要在細胞中構建出一條複雜的代謝途徑，因此需要引入包含多個基因的長DNA片段，而大部分質粒都比較難攜帶長DNA片段。第三，為了使微生物合成目標產品的代謝流達到最大，必須精確控制合成途徑中各個基因的表達強度，使它們達到協同表達的狀態。目前廣泛使用的誘導型啟動子其強度都是固定的，不能滿足精確調控基因表達強度的需求。因此，很有必要獲得一系列具有不同表達強度的調控元件，能對基因的表達進行精確調控。通過使用具有不同表達強度的人工調控元件，直接在染色體上對基因的表達進行精確調控，可以很好地解決上述的質粒過表達所帶來的問題。原核生物主要在轉錄水平對基因表達進行控制，因此啟動子是最主要的調控元件。近些年來，科學家們開發出多種構建組成型啟動子文庫的技術來對基因表達進行調控(Jens0n，1998，WO 98/07846 ；彼得·魯戴爾·簡森，1999，CN 1233287A ；Alper et al. ,2005, PNAS, 102 :12678-12683 ； Hartner et al. ,2008, Nucleic Acids Res, 36 :e76 ;Rud et al. ,2006, Microbiology, 152 :1011-1019 ；Meynial-Salles et al.，2005，Appl EnvironMicrobiol,71 :2140-2144) 一種技術是通過改造啟動子-10和-35區域的間隔序列來控制啟動子的強弱(Jenson， 1998，WO 98/07846 ；彼得·魯戴爾·簡森，1999，CN 1233287A)；另一種技術是通過使用易錯PCR(error-prone PCR)技術在原始啟動子序列上造成隨機突變(Alper et al. ,2005, PNAS, 102 :12678-12683).這兩種技術均能夠獲得基因表達強度差異很大的一組啟動子文庫，這些啟動子隨後能被從質粒轉移到染色體上，從而實現在染色體上對基因表達的調控。 另一種構建啟動子文庫的方法是利用隨機切割的染色體DNA片段。^gram研究小組利用運動發酵單胞菌染色體DNA的Sau3AI酶切片段構建了啟動子文庫，用於篩選在克雷伯氏菌中能很好表達歐文氏菌內切葡聚糖酶的啟動子，從而提高細胞工廠將纖維素轉化為乙醇的能力(Zhou et al. ,2001, Appl Environ Microbiol,67 :6-14)。
基因的表達強度除了受啟動子的調控，還受到啟動子上遊區序列、信使RNA穩定區序列和核糖體結合位點序列的影響。目前，關於構建啟動子上遊區、信使RNA穩定區和核糖體結合位點調控元件的報導還比較少。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種利用人工調控元件文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法。本發明所提供的利用人工調控元件文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法，包括以下步驟將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為人工調控元件文庫。所述微生物染色體上待調控基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。所述人工調控元件文庫為啟動子文庫、啟動子與核糖體結合位點之間的信使RNA 穩定區文庫、核糖體結合位點文庫、啟動子上遊區文庫中的一種或幾種。所述啟動子文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個含6個特定鹼基或6 個隨機鹼基的啟動子-35核心區域、一個含6個特定鹼基或6個隨機鹼基的啟動子-10核心區域、一個在-35和-10核心區域之間的含10-20個特定鹼基或10-20個隨機鹼基的中間區域、一個含特定鹼基的啟動子上遊區、一個含特定鹼基的信使RNA穩定區、一個含特定鹼基的核糖體結合位點。所述信使RNA穩定區文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個含特定鹼基的啟動子上遊區、一個含特定鹼基的啟動子、一個在啟動子與核糖體結合位點之間的含
5-50個隨機鹼基的信使RNA穩定區、一個含特定鹼基的核糖體結合位點。所述核糖體結合位點文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個含特定鹼基的啟動子上遊區、一個含特定鹼基的啟動子、一個含特定鹼基的信使RNA穩定區、一個含
6-20個隨機鹼基的核糖體結合位點。所述啟動子上遊區文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個在啟動子-35核心區域上遊的含5-1000個隨機鹼基的區域、一個含特定鹼基的啟動子、一個含特定鹼基的信使RNA穩定區、一個含特定鹼基的核糖體結合位點。所述啟動子文庫的序列為序列表中的序列1和序列2。所述信使RNA穩定區文庫的序列為序列表中的序列9。所述核糖體結合位點文庫的序列為序列表中的序列18。所述啟動子上遊區文庫的序列為序列表中的序列17。所述將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為人工調控元件文庫，還包括以下步驟通過PCR的方法擴增出一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、抗性標記基因、人工調控元件文庫、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含 40-3000個鹼基的片段(作為右同源臂)。使用同源重組的方法，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為抗性標記基因和人工調控元件文庫。
所述抗性標記基因為氨苄青黴素抗性基因、卡納黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、 四環素抗性基因、安普黴素抗性基因中的一種或幾種。所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色體上待調控基因為大腸埃希氏菌的β -半乳糖苷酶基因(IacZ)、 1-脫氧-木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)。本發明的另一個目的是提供一種人工調控元件的構建方法。本發明所提供的人工調控元件的構建方法包括以下步驟將微生物染色體上標記基因的原始調控區域替換為人工調控元件文庫，獲得一系列具有不同調控強度的人工調控元件。通過測定該標記基因編碼蛋白的活性，確定各個人工調控元件的強度。所述微生物染色體上標記基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色體上標記基因為大腸埃希氏菌的β -半乳糖苷酶基因(IacZ)。本發明的又一個目的是提供一種利用具有特定強度的人工調控元件調控微生物染色體上基因表達強度的方法。本發明提供的利用具有特定強度的人工調控元件調控微生物染色體上基因表達強度的方法，包括以下步驟將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為人工調控元件。所述微生物染色體上待調控基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。所述人工調控元件為一段含有特定鹼基的DNA序列，其具有特定的表達強度，包括啟動子上遊區、啟動子、信使RNA穩定區和核糖體結合位點。所述人工調控元件的序列為序列表中的序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列 8、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列19。所述將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為具有特定表達強度的人工調控元件，包括以下步驟通過PCR的方法擴增出一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、抗性標記基因、 一個具有特定表達強度的人工調控元件、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為右同源臂)。使用一步同源重組的方法，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為抗性標記基因和具有特定表達強度的人工調控元件。所述抗性標記基因為氨苄青黴素抗性基因、卡納黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、 四環素抗性基因、安普黴素抗性基因中的一種或幾種。所述將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為具有特定表達強度的人工調控元件，還包括以下步驟使用兩步同源重組的方法，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為具有特定表達強度的人工調控元件。首先通過PCR的方法擴增出第一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、抗性標記基因、果聚糖蔗糖轉移酶基因、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為右同源臂)。進行第一步同源重組，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為抗性標記基因和果聚糖蔗糖轉移酶基因。通過PCR的方法擴增出第二段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、一個具有特定表達強度的人工調控元件、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為右同源臂)。進行第二步同源重組，將抗性標記基因和果聚糖蔗糖轉移酶基因替換為具有特定表達強度的人工調控元件。所述抗性標記基因為氨苄青黴素抗性基因、卡納黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、 四環素抗性基因、安普黴素抗性基因中的一種或幾種。所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色體上待調控基因為大腸埃希氏菌的1-脫氧-木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)、l-脫氧-木酮糖5-磷酸還原異構酶基因(dxr)、4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇合成酶基因(ispD)、4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇激酶基因(ispE)、 (E) -4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸合成酶基因(ispG)、(E) -4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸還原酶基因(ispH)、異戊醯焦磷酸異構酶基因(idi)、法尼二磷酸合成酶基因 (ispA)；成團泛菌(Pantoea agglomerans)的犛牛兒基犛牛兒基二磷酸(GGPP)合成酶基因 (crtE)、β -胡蘿蔔素環化酶基因(crtX)、番茄紅素β -環化酶基因(crtY)、八氫番茄紅素去飽和酶基因(crtl)、八氫番茄紅素合成酶基因(crtB)。


圖1為大腸埃希氏菌啟動子文庫I(P-Libl)構建的示意圖。圖2為大腸埃希氏菌啟動子文庫1 (P-Libl)中40個重組子的β -半乳糖苷酶的酶活。所顯示的酶活是和大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後β-半乳糖苷酶酶活的相對值。圖3為大腸埃希氏菌啟動子文庫2(P_Lib2)構建的示意圖。圖4為大腸埃希氏菌啟動子文庫2(P_Lib2)中157個重組子的β-半乳糖苷酶的酶活。所顯示的酶活是和大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後β-半乳糖苷酶酶活的相對值。圖5為大腸埃希氏菌信使RNA穩定區文庫1 (M-Libl)構建的示意圖。圖6為大腸埃希氏菌信使RNA穩定區文庫1 (M-Libl)中175個重組子的β -半乳糖苷酶的酶活。所顯示的酶活是和大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後β-半乳糖苷酶酶活的相對值。圖7為大腸埃希氏菌啟動子上遊區文庫I(U-Libl)構建的示意圖。圖8為大腸埃希氏菌啟動子上遊區文庫I(U-Libl)中100個重組子的β -半乳糖苷酶的酶活。所顯示的酶活是和大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後β-半乳糖苷酶酶活的相對值。圖9為大腸埃希氏菌核糖體結合位點文庫I(R-Libl)構建的示意圖。
圖10為大腸埃希氏菌核糖體結合位點文庫1 (R-Libl)中134個重組子的β -半乳糖苷酶的酶活。所顯示的酶活是和大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後β-半乳糖苷酶酶活的相對值。圖11為信使RNA穩定區文庫I(M-Libl)中的7個重組子和大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後在不同培養條件下的半乳糖苷酶的酶活。所顯示的酶活是和大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後β -半乳糖苷酶酶活的相對值。圖12為使用人工調控元件和一步同源重組法對大腸埃希氏菌染色體上的基因表達進行調控的示意圖。圖13為pTrc99A_M質粒構建的示意圖。圖14為pACYC184-M質粒構建的示意圖。圖15為pTrc99A-M_crt質粒構建的示意圖。圖16為pACYC184-M_crt質粒構建的示意圖。圖17為使用人工調控元件Μ1-12、Μ1-64、Μ1-30、Μ1-46、Μ1-37、Μ1-93對大腸埃希氏菌 MG1655 的 dxs，dxr，ispD, ispE, ispG, ispH, idi, ispA 基因的表達進行調控後，β-胡蘿蔔素產量的變化。所顯示的胡蘿蔔素產量是和大腸埃希氏菌MG1655i3-胡蘿蔔素產量的相對值。圖18為使用人工調控元件和兩步同源重組法對大腸埃希氏菌染色體上的基因表達進行調控的示意圖。A為第一步同源重組，B為第二步同源重組。圖 19 為 pXZ001、pXZ002、pXZ003-crt 質粒構建的示意圖。圖20為使用人工調控元件Μ1-64、Μ1-46、Μ1-37、Μ1-93對大腸埃希氏菌QL002的 crt基因表達進行調控後，β -胡蘿蔔素產量的變化。β -胡蘿蔔素產量是和QL002的相對值。圖21為使用人工調控元件文庫對大腸埃希氏菌crt-Ml-93-FRT的dxs基因表達進行調控的示意圖。圖22為使用人工調控元件文庫對大腸埃希氏菌crt-Ml-93-FRT的dxs基因表達進行調控後，隨機挑選的17個重組子的β -胡蘿蔔素產量的變化。β -胡蘿蔔素產量是和 crt-Ml-93-FRT 的相對值。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、大腸埃希氏菌啟動子文庫1 (P-Libl)的構建大腸埃希氏菌啟動子文庫1 (P-Libl)構建的策略是通過Red同源重組技術將大腸埃希氏菌ATCC 8739(公眾可從天津工業生物技術研究所獲得，記載過大腸埃希氏菌ATCC 8739 的非專利文獻是 Zhang, X. , K. Τ. Shanmugam, L. 0. Ingram. 2010. Fermentation of glycerol tosuccinate by metabolically engineered strains of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 76 :2397-2401)染色體上的β -半乳糖苷酶(IacZ)基因的啟動子替換為人工啟動子文庫1 (P-Libl)(圖1)，再通過測定β -半乳糖苷酶的酶活來確定各個啟動子的強度。
基於噬菌體λ 的 PL 啟動子序歹Ij (Love et al.，1996，Gene, 176 :49-53)設計了啟動子文庫1 (P-Libl)，序列為序列表中序列1。其特徵為啟動子-35和-10核心區域之間是17個隨機鹼基；-35區上遊15個鹼基和-10區下遊6個鹼基與PL啟動子序列相同。通過兩步PCR法擴增得到用於同源重組的DNA片段II。以pKD4質粒(公眾可從天津工業生物技術研究所獲得，記載過PKD4質粒的非專利文獻是Datsenko，K. Α.，and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 97 :6640-6645.)的 DNA 為模板，使用引物IacI-FRT和PLl-FRT擴增出DNA片段I。引物序列為IacI-FRT GCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGTAGGCTG GAGCTGCTTC,PLl-FRT :TCCTGCTGATGTGCTCAGTATC(N 17)TGTCAACACCGCCAGAGATAACATATGAATATC CTC。擴 ±曾體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbufferl0ul> dNTP(10mM each dNTP) Iul、DNA模板20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環)；98°C 變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸1分鐘30秒(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。接著以DNA片段I為模板，使用引物IacI-FRT和IacZ-R擴增出DNA片段II。引物序列為IacZ-R :ACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAGGTCAGTGCGTC CTGCTGATGTGCT。DNA 片段 II 包括 IacI 基因上遊的 50 個鹼基(up50) ,FRT-Km-FRT 片段、P_Libl、PL 的信使RNA穩定區(message-RNA stabilizing，m_L)、lacZ基因的核糖體結合位點(RBS)、 IacZ基因起始密碼子後的32個鹼基(lacZ』)(圖1)。通過Red同源重組技術將大腸埃希氏菌ATCC 8739染色體上的β -半乳糖苷酶 (IacZ)基因的啟動子替換為P-Libl。其中，IacI基因的上遊區域(上遊50個鹼基，相對於起始密碼子的-50-0的區域)在同源重組中用做左同源臂；IacZ基因的核糖體結合位點和部分IacZ基因(RBS: :lacZ』，相對於起始密碼子的-18-+32的區域)在同源重組中用做右同源臂(圖1)。首先將PKD46質粒(公眾可從天津工業生物技術研究所獲得，記載過pKD46
Datsenko, K. Α. ， and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 97 :6640-6645)通過氯化鈣轉化法轉化至大腸埃希氏菌ATCC 8739。然後將DNA片段 II電轉至帶有PKD46的大腸埃希氏菌ATCC 8739。電轉條件為首先準備帶有pKD46質粒的大腸埃希氏菌ATCC 8739的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入200ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad 公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. ^v。電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37°C孵育2小時。取200ul菌液分別塗在含有5個卡那黴素的LB平板上，39°C過夜培養，去除pKD46質粒。IOOOul菌液一共得到了 250個克隆，重組效率為1250重組子/ug DNA。
隨機選取了 40個重組菌株(P1-1到P1-40)，在LB培養基中培養4小時，進行 β -半乳糖苷酶的酶活測定。另外，分別添加(0. ImM)和不添加IPTG，在LB培養基中培養大腸埃希氏菌ATCC 8739，測定β-半乳糖苷酶的酶活。酶活測定的具體步驟如下(1)挑取平板上的單菌落過夜培養，按1/100的比例接種至含有:3ml LB培養基的試管中，37°C、220轉培養約4h，0D600約為2. 0左右，對照菌株大腸埃希氏菌ATCC 8739在培養至0D600約0. 3 時加入IPTG (終濃度為0. ImM)。(2)取Iml的菌液，12000rpm離心lmin，用Iml的Z-buffer 重懸菌體，進行清洗後，12000rpm離心一分鐘，棄上清液。並將菌體重懸於Z-buffer中。(3) 使用分光光度計，在420nm的吸光值下，調整菌體的0D420至1. 0。(4)取Iml 0D420為1. 0 的菌液，加入2滴氯仿和1滴SDS (0.1%)，於漩渦振蕩器上振蕩10秒。(5)取上述破碎後的細胞菌液lOOul，加入900ul的Z-buffer，並置於的水浴中預熱2min，同時設置對照。(6)將上述體系中加入 200ul 的 ONPG(O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside)， 混勻後置於水浴中，開始計時，直到反應體系中出現可以檢測到的黃色，加入500ul碳酸鈉 (IM)終止反應並停止計時。(7)將反應體系移出水浴，每個體系中加入1. 3ml的純水後，離心將菌體除去，在420nm處測定體系中o-nitrophenol的吸光值。(8)酶活計算條件當吸光值0D420 = 1時，相當於每毫升菌液中含有切108個細胞；IO9個細胞含有150ug的蛋白； 在420nm處，lnmol/ml o-nitrophenol具有的吸光值為0. 0045。酶活計算公式0D420X3ml/ (0. 0045X75ugX0. 001XT)，T 為反應時間。不用IPTG誘導時，大腸埃希氏菌ATCC 8739的β -半乳糖苷酶酶活為0. 02U/mg蛋白。大腸埃希氏菌ATCC 8739經過誘導後的β-半乳糖苷酶酶活為1.9U/mg蛋白。P-Libl 文庫中隨機挑選的40個重組菌株的半乳糖苷酶酶活為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的 0. 05-0. 7 m (圖 2)。實施例2、大腸埃希氏菌啟動子文庫2 (P-Lib2)的構建為了提高同源重組的效率，擴大啟動子文庫的庫容，構建了大腸埃希氏菌的啟動子文庫2(P-Lib2)。在構建P-Lil32時，將左同源臂的長度由50個鹼基延長至500個鹼基 (IacI上遊的500個鹼基，相對於IacI起始密碼子的-500-0的區域)(圖3)。P-Lib2的序列為序列表中序列2。其特徵是啟動子-35核心區和-35區上遊的 15個鹼基與P-Libl相同；-10核心區序列改變為TATAAT ；啟動子-35和-10核心區之間是 14個隨機鹼基和TGR。-10核心區下遊序列改變為6個隨機鹼基。通過兩步PCR法擴增得到用於同源重組的DNA片段IV (圖3)。首先，以P-Libl中的重組菌株Pl-I的基因組DNA為模板，使用引物lacl-up500和pL-down-35擴增出DNA片段III。引物序列為lacl-up500 CGGGCGACGTTTGCCGCTTCTGAAAACC,pL-down-35 TGTCAACACCGCCAGAGA。然後，以DNA片段III為模板，使用引物lacl_up500和lacZ_PL_R2擴增出DNA片段IV。引物序列為lacZ-pL-R2 :AATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATT(N6) ATTATAYCA(N14)TGTCAACACCGCCAGAGA。DNA 片段 IV 包括 IacI 基因上遊的 500 個鹼基(up500) ,FRT-Km-FRT 片段、P_Lib2、 IacZ基因的信使RNA穩定區(mRS)、核糖體結合位點(RBQ和起始密碼子後的12個鹼基(lacZ，)(圖 3)。通過Red同源重組技術將大腸埃希氏菌ATCC 8739染色體上的β -半乳糖苷酶 (IacZ)基因的啟動子替換為P_Lil32。其中，IacI基因的上遊區域(上遊500個鹼基，相對於 IacI起始密碼子的-500-0的區域)在同源重組中用做左同源臂；IacZ基因的信使RNA穩定區、核糖體結合位點和部分IacZ基因(mRS: :RBS: lacZ』，相對於起始密碼子的-38-+12 的區域)在同源重組中用做右同源臂(圖幻。首先將PKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至大腸埃希氏菌ATCC 8739。然後將DNA片段IV電轉至帶有pKD46的大腸埃希氏菌ATCC 8739。電轉條件為首先準備帶有pKD46質粒的大腸埃希氏菌ATCC 8739的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ngDNA片段IV，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm 的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. 5kv。 電擊後迅速將ImlLB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37°C孵育2 小時。取IOOul菌液分別塗在含有10個卡那黴素的LB平板上，39°C過夜培養，去除pKD46 質粒。IOOOul菌液一共得到了 2500個克隆，重組效率為12500重組子/ug DNA。隨機選取了 157個重組菌株(P2-1到P2-157)，在LB培養基中培養4小時，進行 β-半乳糖苷酶的酶活測定。另外，測定大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後的β-半乳糖苷酶酶活。P-LiM文庫中隨機挑選的157個重組菌株的β-半乳糖苷酶酶活分布均勻，為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的0. 2-3. 3倍(圖4)。其中，64%重組菌株的活性要高於大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的活性。對重組菌株Ρ2-53、Ρ2-49、Ρ2-33、Ρ2-39、Ρ2-30、Ρ2-15的啟動子區域進行測序，測序引物為lacl-up500和lacZ-373。引物序列為lacZ-373 :AGTAACAACTCGTCGGATTCT。重組菌株P2-53、P2-49、P2-33、P2-39、P2-30、P2-15 的 β -半乳糖苷酶酶活分別為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的0. 4、0. 5、2. 0、2. 0、2. 1、3. 3倍。重組菌株Ρ2-53的人工調控元件序列為序列表中序列3 ；重組菌株Ρ2-49的人工調控元件序列為序列表中序列 4 ；重組菌株Ρ2-33的人工調控元件序列為序列表中序列5 ；重組菌株Ρ2-39的人工調控元件序列為序列表中序列6 ；重組菌株Ρ2-20的人工調控元件序列為序列表中序列7 ；重組菌株Ρ2-15的人工調控元件序列為序列表中序列8。實施例3、大腸埃希氏菌信使RNA穩定區文庫1 (M-Libl)的構建為了提高基因轉錄後信使RNA的穩定性，在啟動子和核糖體結合位點之間構建了信使RNA穩定區文庫(M-Libl)。M-Libl的序列為序列表中序列9，其特徵是啟動子序列和P-Lil32中強度最高的啟動子P2-15序列一樣；信使RNA穩定區的序列為18個隨機鹼基和RiieI酶切位點序列。通過兩步PCR法擴增得到用於同源重組的DNA片段VI (圖5)。首先，以重組菌株 P2-15的基因組DNA為模板，使用引物lacl-up500和pL-down-3擴增出DNA片段V。引物序列為pL-down-3 :GGCTCAATTATATCAACG。然後，以DNA片段V為模板，使用引物lacl_up500和lacZ-pL_R3C擴增出DNA片段VI。引物序列為lacZ-pL"R3C :TGTAAAACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(N18)GGCTCAATTATATCAACG。DNA 片段 VI 包括 IacI 基因上遊的 500 個鹼基(up500) ,FRT-Km-FRT 片段、P2-15、 M-LibUlacZ基因的核糖體結合位點(RBS)和起始密碼子後的38個鹼基(lacZ』)(圖5)。通過Red同源重組技術將大腸埃希氏菌ATCC 8739染色體上的β -半乳糖苷酶 (IacZ)基因的啟動子和信使RNA穩定區替換為Ρ2-15和M-Libl。其中，IacI基因的上遊區域(上遊500個鹼基，相對於起始密碼子的-500-0的區域)在同源重組中用做左同源臂； IacZ基因的核糖體結合位點和部分IacZ基因(RBS lacZ』，相對於起始密碼子的-12-+38 的區域)在同源重組中用做右同源臂(圖幻。首先將PKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至大腸埃希氏菌ATCC 8739。然後將DNA片段VI電轉至帶有pKD46的大腸埃希氏菌ATCC 8739。電轉條件為首先準備帶有pKD46質粒的大腸埃希氏菌ATCC 8739的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ngDNA片段VI，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm 的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. 5kv。 電擊後迅速將ImlLB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37°C孵育2 小時。取IOOul菌液分別塗在含有10個卡那黴素的LB平板上，39°C過夜培養，去除pKD46 質粒。IOOOul菌液一共得到了 4000個克隆，重組效率為20000重組子/ug DNA。隨機選取了 175個重組菌株(M1-1到M1-175)，在LB培養基中培養4小時，進行 β-半乳糖苷酶的酶活測定。另外，測定大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後的β-半乳糖苷酶酶活。M-Libl文庫中隨機挑選的175個重組菌株的β-半乳糖苷酶酶活分布均勻，為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的0. 03-7倍(圖6)。對重組菌株Μ1-12、Μ1-64、Μ1-30、Μ1-46、Μ1-37、Μ1-162、Μ1-93 的人工調控元件進行測序，測序引物為lacl-up500和lacZ-373。重組菌株Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、Ml-37、Ml-93、M1-162 的 β -半乳糖苷酶酶活分別為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的0. 1、0. 4、0. 8、1. 7、2. 5、5、4. 9倍。重組菌株 Μ1-12的人工調控元件序列為序列表中序列10 ；重組菌株Μ1-64的人工調控元件序列為序列表中序列11 ；重組菌株Μ1-30的人工調控元件序列為序列表中序列12 ；重組菌株Μ1-46 的人工調控元件序列為序列表中序列13 ；重組菌株Μ1-37的人工調控元件序列為序列表中序列14 ；重組菌株Μ1-93的人工調控元件序列為序列表中序列15 ；重組菌株Μ1-162的人工調控元件序列為序列表中序列16。實施例4、大腸埃希氏菌啟動子上遊區文庫1 (U-Libl)的構建為了進一步提高基因表達強度，在啟動子的上遊構建了啟動子上遊區文庫 (U-Libl)。U-Libl的序列為序列表中序列17，其特徵為=U-Libl位於啟動子-35核心區上遊，共M個鹼基，其中9個隨機鹼基，其餘為富含AT的序列。通過兩步PCR法擴增得到用於同源重組的DNA片段VIII (圖7)。以M-Libl中的重組菌株Μ1-93的基因組DNA為模板，使用引物lacl-up500和pL-down-5擴增出DNA片段
VII。引物序列為pL-down5 CATATGAATATCCTCCTTAG然後，以DNA片段VII為模板，使用引物lacl-up500和pL_UP_l擴增出DNA片段
VIII。引物序列為pL-UP"1 CATGCTAACAATACGGGCTCAATTATATCAACGTTGTTATCTCTTGTCAANNNNTTTTNNAAAAffAffffTT TNNNCATATG AATATCCTC。DNA片段VIII包括IacI基因上遊的500個鹼基(up500)、FRT-Km-FRT片段、 U-Libl、P2-15、M-93、IacZ基因的核糖體結合位點(RBS)和起始密碼子後的38個鹼基 (lacZ，)(圖 7)。將大腸埃希氏菌Ml-93染色體上的FRT-Km-FRT片段去除，得到大腸埃希氏菌M1-93-FRT。具體步驟如下將質粒pFT-A(公眾可從天津工業生物技術研究所獲得， 記載過 PFT-A 質粒的非專利文獻是 Datsenko，K. A.，and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K—12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA，97 :6640-6645.)轉化於 Ml-93 感受態細胞中，在 LB AmplOO 平板上30°C過夜培養；在250ml三角瓶中，將單克隆接種於10ml LB Amp50液體培養基中，150rpm，30°C 培養至 0D0. 1 ；加入 50ul 的氯四環素(chlorotetracyclin, 5mg/ml)終濃度0. 025mg/ml，繼續生長他；在LB平板上劃線，39 °C培養；抗性消失的菌株命名為 M1-93-FRT。通過Red同源重組技術在大腸埃希氏菌M1-93-FRT染色體上的β -半乳糖苷酶 (IacZ)基因的啟動子Ρ2-15前加入U-Libl。其中，IacI基因的上遊區域(上遊500個鹼基，相對於起始密碼子的-500-0的區域)在同源重組中用做左同源臂；啟動子和信使RNA 穩定區(Ρ2-15::Μ1-93，相對於轉錄起始位點的-35-+15的區域)在同源重組中用做右同源臂(圖7)。首先將pKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至大腸埃希氏菌M1-93-FRT。然後將DNA片段VIII電轉至帶有pKD46的大腸埃希氏菌M1-93-FRT。電轉條件為首先準備帶有pKD46質粒的大腸埃希氏菌M1-93-FRT的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ngDNA片段VIII，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用 MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. 5kv0電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37°C孵育2小時。取IOOul菌液分別塗在含有10個卡那黴素的LB平板上，39°C過夜培養，去除pKD46質粒。IOOOul菌液一共得到了 20000個克隆，重組效率為100000重組子/ug DNA。隨機選取了 100個重組菌株，在LB培養基中培養4小時，進行β-半乳糖苷酶的酶活測定。另外，測定大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後的β-半乳糖苷酶酶活。U-Libl 文庫中隨機挑選的100個重組菌株的半乳糖苷酶酶活分布均勻，為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的1. 0-5. 0倍(圖8)。實施例5、大腸埃希氏菌核糖體結合位點文庫1 (R-Libl)的構建核糖體結合位點文庫R-Libl的序列為序列表中序列18。其特徵為核糖體結合位點的核心區序列為AGGAGR，在它的上遊和下遊分別有1和6個隨機鹼基。通過兩步PCR法擴增得到用於同源重組的DNA片段Χ(圖9)。首先，以重組菌株 Ρ2-15的基因組DNA為模板，使用引物lacl-up500和pL-down4擴增出DNA片段IX。引物序列為pL-down4 TGTGAAATTGTTATCCGC。然後，以DNA片段IX為模板，使用引物lacl-up500和lacZ-PL-R4擴增出DNA片段X。引物序列為lacZ-PL-R4 :CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCAT(N6)CTCCTNTGTGAAATTGTTATCCGC。DNA片段X包括IacI基因上遊的500個鹼基(up500)、FRT-Km-FRT片段、P2-15、 IacZ基因的mRS、R-LibU IacZ基因起始密碼子後的50個鹼基(lacZ』)(圖9)。通過Red同源重組技術將大腸埃希氏菌ATCC 8739染色體上的β -半乳糖苷酶 (IacZ)基因的核糖體結合位點替換為R-Libl。其中，IacI基因的上遊區域(上遊500個鹼基，相對於起始密碼子的-500-0的區域)在同源重組中用做左同源臂；部分IacZ基因 (lacZ』，相對於起始密碼子的+1-+50的區域)在同源重組中用做右同源臂(圖9)。首先將 PKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至大腸埃希氏菌ATCC 8739。然後將DNA片段X電轉至帶有PKD46的大腸埃希氏菌ATCC 8739。電轉條件為首先準備帶有pKD46質粒的大腸埃希氏菌ATCC 8739的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ngDNA片段X， 冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. ^v。電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37°C孵育2小時。取IOOul菌液分別塗在含有10個卡那黴素的LB 平板上，39°C過夜培養，去除pKD46質粒。IOOOul菌液一共得到了 4000個克隆，重組效率為 20000 重組子 /ug DNA。隨機選取了 134個重組菌株，在LB培養基中培養4小時，進行β-半乳糖苷酶的酶活測定。另外，測定大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後的β-半乳糖苷酶酶活。R-Libl 文庫中隨機挑選的134個重組菌株的半乳糖苷酶酶活分布均勻，為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的0. 005-5. 3倍(圖10)。對重組菌株R1-9的核糖體結合位點區進行測序，測序引物為lacl-up500和 lacZ-373。重組菌株Rl_9的β -半乳糖苷酶酶活分別為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的3. 5倍。重組菌株R1-9的人工調控元件序列為序列表中序列19。實施案例6、人工調控元件在不同培養條件下的強度測定選取信使RNA穩定區文庫I(M-Libl)中的重組菌株Ml-12、Ml-64、Ml-30、Μ1-46、 Μ1-37、Μ1-93、Μ1-162(β-半乳糖苷酶酶活分別為大腸埃希氏菌ATCC 8739誘導後的0. 1、 0. 4,0. 8,1. 7,2. 5,5. 0,4. 9倍)分別在LB培養基、LB+5%葡萄糖及ΑΜ1+5%葡萄糖中培養 4小時，進行半乳糖苷酶的酶活測定。另外，測定大腸埃希氏菌ATCC 8739經IPTG誘導後的半乳糖苷酶酶活。在LB+5%葡萄糖培養條件下，大部分人工調控元件的強度和LB培養條件相當 (80% -108% )。只有兩個調控元件的強度有明顯降低Μ1-46是LB培養條件的53%，M1-12 是LB培養條件的60%。在AMl+5%葡萄糖培養條件下，大部分人工調控元件的強度和LB 培養條件相當(76%-112%)。只有M1-162這一個調控元件的強度有明顯降低，是LB培養條件的69% (圖11)。這些結果表明，我們構建的人工調控元件在不同培養條件下的強度比較一致，屬於組成型表達。實施案例7、使用人工調控元件和一步同源重組法對大腸埃希氏菌染色體上的基因表達進行調控通過一對通用的引物，採用一步同源重組法可以將大腸埃希氏菌染色體上基因的原始調控區域替換為具有各種強度的人工調控元件(圖12)。本實施案例將大腸埃希氏菌萜烯類化合物合成途徑中的1-脫氧-木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，1-脫氧-木酮糖5-磷酸還原異構酶基因(dxr)，4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇合成酶基因(ispD)， 4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇激酶基因(ispE)，(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶基因(ispG)，(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸還原酶基因(ispH)，異戊醯焦磷酸異構酶基因(idi)，法尼二磷酸合成酶基因(ispA)的原始調控區域替換為M1-12、 Μ1-64、Μ1-30、Μ1-46、Μ1-37、Μ1-93這六種人工調控元件，研究其對β -胡蘿蔔素合成的影響。上遊引物為gene-up-FRT，包括待調控基因原始調控區域外的50個鹼基和與FRT 序列同源的20個鹼基。下遊引物為gene-RBS-down，包括和大腸埃希氏菌IacZ基因的核糖體結合位點同源的15個鹼基和待調控基因起始密碼子後的50個鹼基。對於dxs基因，使用dxs-up-FRT和dxs-RBS-down引物，以信使RNA穩定區文庫 I(M-Libl)中的重組菌株M1-93為模板，擴增出DNA片段dxs-Ml-93，用於同源重組(圖12)。 引物序列為dxs-up-FRT :ACTACATCATCCAGCGTAATAAATAAACAATAAGTATTAATAGGCCCCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCdxs-RBS-down :GTGGAGTCGA CCAGTGCCAG GGTCGGGTAT TTGGCAATATCAAAACTCAT AGCTGTTTCC TGGTT通過Red同源重組技術將大腸埃希氏菌MG1655(公眾可從天津工業生物技術研究所獲得，記載過大腸埃希氏菌K-12MG1655的非專利文獻是Blattner et al.，1997，The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K_12Science, 277 :1453-1462.)染色體上的dxs基因的原始調控區域替換為M1-93。首先將pKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至大腸埃希氏菌MG1655。然後將DNA片段dxs-Ml-93電轉至帶有pKD46的大腸埃希氏菌 MG1655。電轉條件為首先準備帶有PKD46質粒的大腸埃希氏菌MG1655的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ngDNA片段，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的 Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. ^v。電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37 °C孵育2 小時。取IOOul菌液分別塗在含有卡那黴素的LB平板上，39°C過夜培養，去除pKD46質粒。 得到重組菌株dxs-Ml-93-FKF。採用同樣的方法，使用dxs-up-FRT和dxs-RBS-down引物，以信使RNA穩定區文庫I(M-Libl)中的重組菌株Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、M1-37為模板，擴增出DNA片段 dxs-Ml-12、dxs-Ml-64、dxs-Ml-30、dxs-Ml-46、dxs-Ml-37，和大腸埃希氏菌 MG1655 同源重組後獲得重組菌株 dxs-Ml-12-FKF、dxs-Ml-64-FKF、dxs-Ml-30-FKF、dxs-Ml-46-FKF、 dxs-Ml-37-FKFo採用同樣的方法，使用dxr-up-FRT和dxr-RBS-down引物，將dxr基因的原始調控區域替換為Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、M1-37、M1-93這六種人工調控元件，得到重組菌株 dxr-Ml-64-FKF、dxr-Ml-12-FKF、dxr-Ml-30-FKF、dxr-Ml-46-FKF、dxr-Ml-37-FKF、 dxr-Ml-93-FKF。引物序列為dxr-up-FRT :ATCGGCTGGCGGCGTTTTGCTTTTTATTCTGTCTCAACTCTGGATGTTTCGTGTAGGC TGGAGCTGCTTCdxr-RBS-down :GTGCTGCAAC CAATCGAGCC GGTCGAGCCC AGAATGGTGAGTTGCTTCATAGCTGTTTCCTGGTT採用同樣的方法，使用ispD-up-FRT和ispD-RBS-down引物，將ispD基因的原始調控區域替換為Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、Ml-37、M1-93這六種人工調控元件， 得到重組菌株 ispD-Ml-12-FKF、ispD-Ml-64-FKF、ispD-Ml-30-FKF、ispD-Ml-46-FKF, ispD-Ml-37-H(F、ispD-Ml-93-FKF。引物序列為ispD-up-FRT :TGCCTGACGCGTCGAAGCGCGCACAGTCTGCGGGGCAAAACAATCGATAA GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCispD-RBS-down :AATCCGGCCG CCGGAACCAC GGCGCAAACA TCCAAATGAGTGGTTGCCAT AGCTGTTTCC TGGTT採用同樣的方法，使用i spE-up-FRT和i spE-RBS-down引物，將i spE基因的原始調控區域替換為Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、Ml-37、M1-93這六種人工調控元件， 得到重組菌株 ispE-Ml-12-FKF、ispE-Ml-64-FKF、ispE-Ml-30-FKF、ispE-Ml-46-FKF, ispE-Ml-37-H(F、ispE-Ml-93-FKF。引物序列為ispE-up-FRT :ACGGTGGTCAACGCATCAAGTTAAAAATGGATAACTGGATAGTGAAATAA GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCispE-RBS-down :ATGTATAAM ACAGATTAAG TTTTGCCGGA GAGGGCCACTGTGTCCGCAT AGCTGTTTCC TGGTT採用同樣的方法，使用i spG-up-FRT和i spG-RBS-down引物，將i spG基因的原始調控區域替換為Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、Ml-37、M1-93這六種種人工調控元件， 得至丨j 重組菌株 ispG-Ml-12-FKF、ispG-Ml-64-FKF、ispG-Ml-30-FKF、ispG-Ml-46-FKF, ispG-Ml-37-H(F、ispG-Ml-93-FKF。引物序列為i spG-up-FRT GCCGAACAATCACCGGCGCAGTAACAGACGGGTAACGCGGG AGATTTTTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCispG-RBS-down :ACGTMATAC GTGTTGATTT TCTACGTTGA ATTGGAGCCTGGTTATGCAT AGCTGTTTCC TGGTT採用同樣的方法，使用i spH-up-FRT和i spH-RBS-down引物，將i spH基因的原始調控區域替換為Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、Ml-37、M1-93這六種人工調控元件， 得至丨j 重組菌株 ispH-Ml-12-FKF、ispH-Ml-64-FKF、ispH-Ml-30-FKF、ispH-Ml-46-FKF, ispH-Ml-37-n(F、ispH-Ml-93-FKF。引物序列為i spH-up-FRT TCATTTTGATATTGAAGTGCTGGAAATCGATCCGGCACTGGAGGCGTAAC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCi spH-RBS-down CGGTCTACCC CGGCACAAAA ACCACGCGGG TTGGCCAACAGGATCTGCATAGCTGTTTCC TGGTT採用同樣的方法，使用idi-up-FRT和idi-RBS-down引物，將idi基因的原始調控區域替換為Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、Ml-37、M1-93這六種人工調控元件，得到重組菌株 idi-Ml-12-FKF、 idi-Ml-64-FKF、 idi-Ml-30-FKF、 idi-Ml-46-FKF、 idi-Ml-37-FKF、 idi-Ml-93-FKF。引物序列為idi-up-FRT :TCACTTGGTTAATCATTTCACTCTTCAATTATCTATAATGATGAGTGATC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
idi-RBS-down :CCCGTGGGAA CTCCCTGTGC ATTCAATAAA ATGACGTGTTCCGTTTGCAT AGCTGTTTCC TGGTT採用同樣的方法，使用i spA-up-FRT和i spA-RBS-down引物，將i spA基因的原始調控區域替換為Ml-12、Ml-64、Ml-30、Ml-46、Ml-37、M1-93這六種種人工調控元件， 得至丨j 重組菌株 ispA-Ml-64-FKF、ispA-Ml-12-FKF、ispA-Ml-30-FKF、ispA-Ml-46-FKF、 ispA-Ml-37-H(F、ispA-Ml-93-FKF。引物序列為ispA-up-FRT CTGACAATGAAGACGCCTCTCTAACCCCTTTTACACCGGACAATGAGT AAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCispA-RBS-down :GCCTGGTTGGCCTGCTTAACGCAGGCTTCGAGTTGCTGCGGAAAGTCCATAGCTG TTTCCTGGTT為了驗證 dxs，dxr, ispD，ispE，isp G，ispH，idi，ispA 基因表達調控後對 β-胡蘿蔔素合成的影響，將胡蘿蔔素合成途徑引入到MG1655調控後的重組菌株中，測定 β-胡蘿蔔素合成能力的變化。首先將β -胡蘿蔔素合成途徑的基因克隆到ρ (:99Α-Μ和pACYC184_M質粒中。pTrc99A-M質粒的構建如圖13所示通過PCR方法在pTrc99A質粒(公眾可從天津工業生物技術研究所獲得，記載過pTrc99A質粒的非專利文獻是Amarm E，Ochs B, Abel KJ. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli.Gene. 1988,69(2) :301-15.)中的 IacI 基因前面引入I^acI、SpeI和NdeI酶切位點，在rrnB T2轉錄終止子的後面加上I^acI酶切位點， 具體步驟如下以引物 99A-Fl-PacI-SpeI_NdeI 禾Π 99A-Rl_PacI 為引物，pTrc99A 為模板進行 PCR 擴增，得到片段I，以99A-F2/99A-R2為引物，pTrc99A為模板進行PCR擴增，得到片段II。 引物序列為99A-Fl-PacI-SpeI-NdeI TTAATTAACTAGTCATATG GGCATGCATTTACGTTGACA99A-Rl-PacI :TTAATTAA AGAAACGCAAAAAGGCCATC99A-F2 CATTCAAATATGTATCCGCTCA99A-R2 CGCAGGAAAGAACATGTGAG擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) Iul、DNA模板20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為:98°C預變性2分鐘(1個循環)；98°C 變性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸40sec(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。擴增產物片段I包含IacI基因、IacIq片段、多克隆位點及rrnB終止密碼子在內的約1900bp 的片段，擴增產物片段II包含氨苄青黴素抗性基因和PMBl複製起始位點的約1700bp的片段。PCR產物用PCR清洗試劑盒清洗後(PCR清洗試劑盒購自Biomiga公司)，用DpnI (購自 NEB公司)分別處理片段I和片段II。酶切體系及條件為40ul PCR產物，5ul IOXbuffer 4，lulDpnI，37°C孵育1小時，PCR清洗試劑盒清洗片段I和片段II，磷酸化處理片段I。磷酸化體系為8ul要處理的PCR片段於70°C水浴處理5min，加Iul T4DNA連接酶緩衝液(購自NEB公司)、0. 5ul T4多聚核苷酸激酶(購自NEB公司)，37°C，60min, 60°C溫浴20min滅活磷酸化酶，PCR清洗試劑盒清洗磷酸化片段。快連酶連接兩片段，連接體系為2. 5ul片段I，2. 5ul片段II，5ul 2X快連buffer，0. 5ul快速連接酶(購自NEB公司)，輕輕混合、 室溫反應5分鐘後加入50ul Transl-IO感受態細胞中(購自北京全式金生物技術有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置於冰上2分鐘。加入500ul LB培養基，200rpm, 37°C孵育1小時。取200ul菌液塗在含有氨苄青黴素的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行酶切驗證，證明在IacI基因前面引入I^acI、SpeI和NdeI酶切位點，在rrnB T2終止子的後面加上I^acI酶切位點，命名為 ρ χθθΑ-Μ。pACYC184-M質粒的構建如圖14所示通過PCR方法在pACYC184質粒(公眾可從天津工業生物技術研究所獲得，記載過PACYC184-M質粒的非專利文獻是Rose，R. Ε. The nucleotide sequence of pACYC 184. Nucleic Acids Res. 1988,16(1) ,355.)中引入了 pTrc99A質粒的IacI基因、IacIq片段、多克隆位點及rrnB終止密碼子，並在IacI基因前面引入I^acI、SpeI和NdeI酶切位點，在rrnB T2終止子的後面加上I^acI酶切位點，具體步驟如下以引物 99A-Fl-PacI-SpeI_NdeI 禾Π 99A-Rl_PacI 為引物，pTrc99A 為模板進行 PCR 擴增，得到片段I，以184-F2U84-R2為引物，pACYC184為模板進行PCR擴增，得到片段II。 引物序列為184-F2 GGGAGAGCCTGAGCAAACT184-R2 CGATGATAAGCTGTCAAACATGA擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) Iul、DNA模板20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為:98°C預變性2分鐘(1個循環)；98°C 變性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸40sec(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。擴增產物片段I包含IacI基因、laclq、多克隆位點及rrnB終止密碼子在內的約1900bp的片段，擴增產物片段Π包含氯黴素抗性基因和pl5A複製起始位點約2200bp的片段。將PCR 產物用PCR清洗試劑盒清洗後(PCR清洗試劑盒購自Biomiga公司)，用DpnI (購自NEB公司)分別處理片段I和片段II酶切體系及條件為40ul PCR產物，5ul 10 Xbuffer 4，Iul DpnI，37°C孵育1小時，PCR清洗試劑盒清洗片段I和片段II。磷酸化處理片段I，磷酸化體系為8ul要處理的PCR片段於70°C水浴處理5min，加Iul T4DNA連接酶緩衝液(購自NEB 公司)、0. 5ul T4多聚核苷酸激酶(購自服8公司)，37°〇，601^11，601溫浴201^11滅活磷酸化酶，PCR清洗試劑盒清洗磷酸化片段。快連酶連接兩片段，連接體系為2. 5ul片段I， 2. 5ul片段II，5ul 2 X快連buffer，0. 5ul快速連接酶(購自NEB公司)，輕輕混合、室溫反應5分鐘後加入50ul Transl-IO感受態細胞中(購自北京全式金生物技術有限公司)， 冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置於冰上2分鐘。加入500ul LB培養基，200rpm, 37°C 孵育1小時。取200ul菌液塗在含有氯黴素的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行酶切驗證，證明在IacI基因前面引入PacI、SpeI和NdeI酶切位點，在rrnB T2轉錄終止子的後面加上I^acI酶切位點，命名為 pACYC184-M。β -胡蘿蔔素合成途徑基因在成團泛菌(Pantoea agglomerans)中成簇存在在同一操縱子下，該操縱子包含犛牛兒基犛牛兒基二磷酸(GGPP)合成酶基因(crtE)、，β-胡蘿蔔素環化酶基因(crtX)，番茄紅素β-環化酶基因(crtY)，八氫番茄紅素去飽和酶基因(crtl)，八氫番茄紅素合成酶基因(crtB)、β-胡蘿蔔素羥化酶基因(crtZ)基因，大腸埃希氏菌中的焦磷酸法尼脂(FPP)可依次經crtE、crtB、crtl、crtY基因編碼酶的催化，產生β-胡蘿蔔素。以Crt-cluster-f、Crt-cluster-r為引物，以成團泛菌(Pantoea agglomerans，CGMCC編號1. 2M4。購買自中國普通微生物菌種保藏中心)的基因組總DNA 為模板，擴增crtEBIXY基因。引物序列為Crt-cluster-f :CTGTGAATTCAAGGAGATATACCATGATGACGGTCTGTGCAGAACrt-cluster-r TTGCAGTCGACGCTGCGAGAACGTCA其中下劃線部分分別為EcoRI和MlI酶切位點，紅字部分為人工RBS。擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) Iul、DNA模板20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環)；98°C 變性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸2分鐘(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。 擴增產物包含crtE、crtX、crtY、crtl和crtB基因，約5800bp鹼基。將β-胡蘿蔔素合成途徑的crtEXYIB基因克隆到pTrc99A-M質粒中，過程如圖15 所示。用EcoRI和Mil酶切crtEBIXY基因擴增的PCR片段，同時用EcoRI和Mil酶切 pI^C99A-M質粒，連接兩片段。連接體系為lul ρ (:99Α-Μ酶切產物，4ul酶切後的PCR產物，5ul快連buffer，0. 5ul快速連接酶(購自NEB公司)，輕輕混合、室溫反應5分鐘後加入 50ulTransl-Tl感受態細胞中(購自北京全式金生物技術有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即至於冰上2分鐘。加入500ul LB培養基，200rpm，37°C孵育1小時。取200ul 菌液塗在含有氨苄青黴素的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明crt系列基因插入到pTrc99A-M 多克隆位點的EcoRI和Mil處，命名為pTrc99A-M-crt。將β-胡蘿蔔素合成途徑的crtEXYIB基因克隆到pACYC184-M質粒中，過程如圖 16所示。用PacI酶切pACYC184-M。同時用PacI酶切p^TrcggA-M-crt，切膠回收約7. 8kb 片段，與I^cI酶切pACYC184-M的片段相連，轉化Top 10感受態細胞(購自北京全式金生物技術有限公司)，冰浴30分鐘，42°C熱激30秒，立即至於冰上2分鐘。加入500ul LB培養基，200rpm, 37°C孵育1小時。取200ul菌液塗在含有氯黴素的LB平板上，過夜培養後， 挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明crt系列基因插入到pACYC184-M的PacI酶切處，命名為pACYC184_M_crt。採用電轉化法將pACYC184-M-crt 轉化到 MG1655、dxs-Ml-12-FKF、 dxs-Ml-64-FKF、 dxs-Ml-30-FKF、 dxs-Ml-46-FKF、 dxs-Ml-37-FKF、 dxs-Ml-93-FKF、 dxr-Ml-12-FKF、 dxr-Ml-64-FKF、 dxr-Ml-30-FKF、 dxr-Ml-46-FKF、 dxr-Ml-37-FKF、 dxr-Ml-93-FKF、 ispD-Ml-12-FKF、 ispD-Ml-64-FKF、 ispD-Ml-30-FKF、 ispD-Ml-46-FKF、 ispD-Ml-37-FKF、 ispD-Ml-93-FKF、 ispE-Ml-12-FKF、 ispE-Ml-64-FKF、 ispE-Ml-30-FKF、 ispE-Ml-46-FKF、 ispE-Ml-37-FKF、 ispE-Ml-93-FKF、 ispG-Ml-12-FKF、 ispG-Ml-64-FKF、 ispG-Ml-30-FKF、 ispG_Ml-46_FKF、 ispG-Ml-37-FKF、 ispG_Ml-93_FKF、 ispH-Ml-12-FKF、 ispH-Ml-64-FKF、 ispH-Ml-30-FKF、 ispH-Ml-46-FKF、 ispH-Ml-37-FKF、 ispH-Ml-93-FKF、 idi-Ml-12-FKF, idi-Ml-64-FKF, idi-Ml-30-FKF, idi-Ml-46-FKF, idi-Ml-37-FKF,idi-Ml-93-FKF、 ispA-Ml-12-FKF、 ispA-Ml-64-FKF、 ispA-Ml-30-FKF、 ispA_Ml_46-FKF、 ispA-Ml-37-FKF、ispA_Ml-93_FKF 中。通過測定丙酮萃取的β-胡蘿蔔素在450nm下的吸收來確定β -胡蘿蔔素產量， 並計算其對細胞濁度(0D600nm)的相對值。在5ml含34ug/ml氯黴素的LB培養基中培養含 pACYC184-M-crt 質粒的 MG1655 以及 dxs，dxr, ispD, ispE, ispG, ispH, idi, ispA 基因表達調控後的重組菌株。30°C、220rpm培養M小時。取2ml菌液於4000rpm離心lOmin， 用滅菌水清洗一遍，加Iml丙酮55°C、黑暗條件下萃取15min，14，OOOrpm離心lmin，在紫外分光光度計453nm下測定β -胡蘿蔔素含量，結果如圖17所示。dxs基因調控後的β-胡蘿蔔素含量是野生菌的1.3-3. 5倍，效果最好的是Μ1-37 調控元件；dxr基因調控後的β -胡蘿蔔素含量是野生菌的0. 7-2. 3倍，效果最好的是 Μ1-30調控元件；ispD基因調控後的β -胡蘿蔔素含量是野生菌的0. 3-1. 4倍，效果最好的是Μ1-93調控元件；ispE基因調控後的β-胡蘿蔔素含量是野生菌的0. 9-1. 4倍，效果最好的是Μ1-30調控元件；ispG基因調控後的β-胡蘿蔔素含量是野生菌的0. 9-1. 2倍，效果最好的是Μ1-37調控元件；ispH基因調控後的β -胡蘿蔔素含量是野生菌的0. 3-1. 2倍，效果最好的是Μ1-64調控元件；idi基因調控後的β -胡蘿蔔素含量是野生菌的0. 4-2. 1倍， 效果最好的是Μ1-37調控元件；ispA基因調控後的β -胡蘿蔔素含量是野生菌的1. 6-2. 3 倍，效果最好的是Μ1-30調控元件；實施案例8、使用人工調控元件和兩步同源重組法對大腸埃希氏菌染色體上的基因表達進行調控一步同源重組法在完成基因表達調控後，在細胞染色體上會留下FRT-Km-FRT片段，雖然通過FLP的作用能夠將Km抗性標記去除，但是仍然會留下一個FRT片段。採用兩步同源重組法可以將大腸埃希氏菌染色體上基因的原始調控區域替換為具有各種強度的人工調控元件(圖18)，操作完後還不留下任何DNA片段。在第一步同源重組時，將待調控基因的原始調控區域替換為cat-sacB片段(圖18A)；在第二步同源重組時，將cat-sacB片段替換為具有各種強度的人工調控元件(圖18B)。通過PCR的方法擴增出用於第一輪同源重組的DNA片段gene-cat-sacB。上遊引物為gene-up-Km，包括待調控基因原始調控區域外的50個鹼基和與cat基因上遊序列同源的20個鹼基。下遊引物為gene-sacB-down，包括和sacB基因下遊序列同源的20個鹼基和待調控基因起始密碼子後的50個鹼基。通過PCR的方法擴增出用於第二輪同源重組的DNA片段。上遊引物為gene-up-P， 包括待調控基因原始調控區域外的50個鹼基和人工調控元件啟動子區的20個鹼基(轉錄起始點的-50到-31位點)。下遊引物為gene-RBS-down，包括和大腸埃希氏菌IacZ基因的核糖體結合位點同源的15個鹼基和待調控基因起始密碼子後的50個鹼基。採用兩步同源重組法將大腸埃希氏菌MG1655的dxs基因的原始調控區域替換為人工調控元件M1-93。首先以pBM002質粒(來源於合肥百邁生物技術有限公司)為模板，使用dxs-up-cat和dxs-sacB-down引物，擴增出用於第一步同源重組的DNA片段 dxs-cat-sacB。弓丨物序列為dxs-up-cat :ACTACATCATCCAGCGTAATAAATAAACAATAAGTATTAATAGGCCCCTG GGAGAAAATACCGCATCAGG
dxs-sacB-down :GTGGAGTCGA CCAGTGCCAG GGTCGGGTAT TTGGCAATATCAAAACTCAT GCGTTGGCCGATTCATTA。以M1-93為模板，使用dxs-up-P和dxs-RBS-down引物，擴增出用於第二步同源重組的DNA片段dxs-Ml-93。引物序列為dxs-up-P :ACTACATCATCCAGCGTAATAAATAAACAATAAGTATTAATAGGCCCCTG TTATCTCTGGCGGTG TTGACdxs-RBS-down :GTGGAGTCGA CCAGTGCCAG GGTCGGGTAT TTGGCAATATCAAAACTCAT AGCTGTTTCC TGGTT首先將pKD46質粒通過電轉化法轉化至大腸埃希氏菌MG1655。然後將DNA片段dxs-cat-sacB電轉至帶有pKD46的大腸埃希氏菌MG1655。電轉條件為首先準備帶有 PKD46質粒的大腸埃希氏菌MG1655的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ngDNA片段dxs-cat-sacB，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用 MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. 5kv0電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37°C孵育2小時。取200ul菌液塗在含有氯黴素的LB平板上，過夜培養後，挑選5個單菌落進行PCR驗證(使用引物dxs-up/ dxs-down進行驗證)。挑選一個正確的單菌落，將其命名為dxs-cat-sacB。將pKD46質粒通過電轉化法轉化至dxs-cat-sacB，然後將DNA片段dxs-Ml_93 電轉至帶有PKD46質粒的dxs-cat-sacB，電轉條件為首先準備帶有pKD46質粒的 dxs-cat-sacB的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ng DNA片段 dxs-Ml-93，冰上放置 2 分鐘，轉移至 0. 2cm 的 Bio-Rad 電擊杯。使用 Microf3Ulser(Bic)-Rad 公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. ^v。電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200rpm, 37°C孵育4小時，去除pKD46質粒。將菌液轉移至含有10% 蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養基Q50ml燒瓶中裝50ml培養基)，培養M小時後在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養基上劃線培養。經過PCR驗證(使用引物dxs-up/ dxs-down進行驗證)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為dxs-Ml-93。採用電轉化法將pACYC184-M_crt轉化到dxs-Ml-93，測定β -胡蘿蔔素的合成能力。dxs-Ml-93 (pACYC184-M-crt)合成β -胡蘿蔔素的能力和
dxs-Ml-93-FKF (pACYC184_M_crt)的基本一樣。實施案例9、使用人工調控元件對大腸埃希氏菌染色體上的外源基因表達進行調控成團泛菌的crtEXYIB基因可以催化焦磷酸法尼脂(FPP)經一系列反應合成 β-胡蘿蔔素。首先將crtEXYIB基因通過兩步同源重組的方法整合至大腸埃希氏菌ATCC 8739染色體的IdhA位點。用於兩步同源重組的質粒構建過程如圖19所示。第一步，以大腸埃希氏菌ATCC 8739基因組DNA為模板，用引物ldhA-up/ ldhA-down，擴增大腸埃希氏菌ATCC 8739的乳酸脫氫酶基因ldhA。引物序列為ldhA-up GATAACGGAGATCGGGAATG ；ldhA-down :CTTTGGCTGTCAGTTCACCA。擴增體系NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP (IOmM each dNTP) Iul、DNA模板20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ul)0.5ul、蒸餾水33.5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環)； 98°C變性10秒、58 °C退火10秒、72°C延伸40sec(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。擴增產物為乳酸脫氫酶基因ldhA，並將其克隆到pEASY-Blimt克隆載體上。克隆體系為lul PCR擴增產物、Iul pEASY-Blunt克隆載體，輕輕混合、室溫反應5分鐘後加入50ul Transl-Tl感受態細胞中(購自北京全式金生物技術有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激 30秒，立即置於冰上2分鐘。加入250ul LB培養基，200rpm，37°C孵育1小時。取200ul菌液塗在含有卡那黴素的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體pEASY-Blimt上插入了乳酸脫氫酶基因ldhA，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為pXZOOl。第二步，以pXZOOl質粒DNA為模板，用引物ldhA-l/ldhA_2進行PCR擴增，得到 pXZOOl質粒的DNA擴增片段，引物序列如下IdhA-I TCTGGAAAAAGGCGAAACCT ；ldhA-2 :TTTGTGCTATAAACGGCGAGT。擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) Iul、DNA模板20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環)；98°C 變性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸2分鐘(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。 PCR擴增產物包含pEASY-Blimt載體和乳酸脫氫酶基因編碼基因上下遊的400個左右鹼基。第三步，以pBM002質粒(來源於合肥百邁生物技術有限公司)為模板，用引物4162-F/4162-R進行PCR擴增，得到含有氯黴素基因(Cam)和果聚糖蔗糖轉移酶基因 (sacB)DNA片段，連接至第二步的PCR擴增產物。引物序列如下4162-F GGAGAAAATACCGCATCAGG4162-R :GCGTTGGCCGATTCATTA擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) Iul、DNA模板20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性1分鐘(1個循環)；98°C 變性10秒、60°C退火10秒、72°C延伸2分鐘(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。 PCR含有氯黴素基因(Cam)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)DNA片段的約3000bp左右的鹼基。將第二步得到PCR擴增產物用PCR清洗試劑盒清洗後，DpnI處理；將第三步得到 PCR擴增產物用PCR清洗試劑盒清洗後，磷酸化處理該片段，將兩片段連接。取轉化後菌液 200ul塗在含有卡納黴素和氯黴素的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行酶切驗證，證明將氯黴素基因(Cam)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)插入到pEASY-Blimt載體和乳酸脫氫酶基因編碼基因上下遊的 400bp同源臂中間，命名為pXZ002。第四步，以pXZ002質粒DNA為模板，用引物ldhA-up/ldhA-down進行PCR擴增， 得到 PXZ002 質粒的 DNA 擴增片段。擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOuUdNTPdOmM each dNTP) lul、DNA 模板 20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (2. 5U/ul) lul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環)；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸1分鐘40秒(30個循環)；72°C延伸5分鐘(1個循環)。DNA片段I包含乳酸脫氫酶編碼基因上遊400個左右鹼基、Cat-sacB DNA片段、乳酸脫氫酶編碼基因下遊400個左右鹼基。將DNA片段I用於第一次同源重組。 首先將PKD46質粒。通過氯化鈣轉化法轉化至大腸埃希氏菌ATCC 8739，然後將DNA片段I 電轉至帶有PKD46的大腸埃希氏菌ATCC 8739。電轉條件為首先準備帶有pKD46質粒的大腸埃希氏菌ATCC 8739的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ngDNA 片段I，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. 5kv0電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200轉，37 °C孵育2小時，去除pKD46質粒。取200ul菌液塗在含有氯黴素的LB平板上，過夜培養後，挑選5個單菌落進行PCR驗證(使用引物ldhA-up/ ldhA-down進行驗證，正確的菌落擴增產物為3700bp左右的片段)。挑選一個正確的單菌落，將其命名為QL001。第五步，將pTrc99A-M_crt質粒經I^acI酶切，切膠回收約81Λ片段，Klenow補平末端後與第二步中得到的PCR片段相連。取轉化後菌液200ul塗含卡那黴素的LB平板上， 過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行酶切及測序驗證，結果表明crtEXYIB基因插入到pEASY-Blunt載體和乳酸脫氫酶基因編碼基因上下遊的400bp同源臂中間，命名為pXZ003-crt。第六步，以pXZ003_crt質粒DNA為模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down擴增出 DNA 片段 II，擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) 1. 5ul、DNA 模板 20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2. 5U/ul) Iul、蒸餾水32. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘 (1個循環)；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸7分鐘(30個循環)；72°C延伸10 分鐘(1個循環)。DNA片段II的核苷酸序列如序列表中序列3所示。DNA片段II包含乳酸脫氫酶編碼基因上遊400個左右鹼基、trc啟動子、crtEXYIB基因、rrnB T2轉錄終止子和乳酸脫氫酶編碼基因下遊400個左右鹼基。DNA片段II用於第二次同源重組。首先將 PKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至QL001，然後將DNA片段II電轉至帶有pKD46質粒的 QLOO1，電轉條件為首先準備帶有PKD46質粒的QL001的電轉化感受態細胞；將50ul感受態細胞置於冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2. 5kv0電擊後迅速將 Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，200rpm，37°C孵育4小時，去除 PKD46質粒。將菌液轉移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養基Q50ml燒瓶中裝 50ml培養基)，培養M小時後在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養基上劃線培養。 經過PCR驗證(使用引物ldhA-up/crtE-r進行驗證，正確的菌落擴增產物為4500bp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為QL002。crtE-r引物序列如下crtE-r TTAACTGACGGCAGCGAGTT通過一對通用的引物，採用一步同源重組法可以將外源基因crtEXYIB的trc啟動子替換為具有各種強度的人工調控元件。本案例將外源基因crtEXYIB的trc啟動子替換為Μ1-64、Μ1_46、Μ1-37、Μ1_93這四種人工調控元件，研究其對胡蘿蔔素合成的影響。
上遊引物為ldhA-up-FRT，包括IdhA基因上遊的50個鹼基和與FRT序列同源的 20個鹼基。下遊引物為crt-RBS-down，包括和IacZ基因的核糖體結合位點同源的15個鹼基和crtE基因起始密碼子後的50個鹼基。引物序列為ldhA-up-FRT :ATTAAATTTGAAATTTTGTAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAGTGTAGG CTGGAGCTGCTTCcrtE-RBS-down :GCATCGCTGTGTATGAAATTGACGTGTTGTTCTGCACAGACCGTCATCATAGCTG TTTCCTGGTT使用crt-up-FRT 和 crt-RBS_down 引物，以 M-Libl 中的重組菌株 M1-64、M1-46、 Ml-37、M1-93 為模板，擴增出 DNA 片段 crt_Ml_64、crt_Ml_46、crt-Ml-37、crt-Ml-93, 和 QL002 同源重組後獲得重組菌株 crt-Ml-64-FKF、crt-Ml-46-FKF、crt-Ml-37-FKF、 crt-Ml-93-FKFo測定QL002、cr t-M1 _64-FKF、cr t-M1-46-FKF、cr t-M1 _37-FKF、 crt-Ml-93-FKF3 -胡蘿蔔素，結果見圖 20。crt-Ml-64-FKF, crt-Ml-46-FKF, crt-Ml-37-FKF、crt-Ml-93-FKF 的 β -胡蘿蔔素產量分別是 QL002 的 2. 7,1. 7、3、3. 3 倍。另外，將pTrc99A-M_crt質粒轉化入大腸埃希氏菌ATCC 8739，測定β -胡蘿蔔素產量，其是QL002的2倍。由此可見，單拷貝crt基因整合在染色體上的工程菌生產β-胡蘿蔔素的能力比質粒高表達的效果要好。實施案例10、使用人工調控元件文庫對大腸埃希氏菌染色體上的基因表達進行調控建立人工調控元件文庫對大腸埃希氏菌染色體上的dxs基因進行表達調控，從而提高胡蘿蔔素的產量(圖21)。首先消除crt-Ml-93-FKF中的卡納黴素抗性基因，將質粒pFT_Amp通過鈣轉化方法轉化crt-Ml-93-FKF，將轉化液塗於含氨苄青黴素的LB平板上，30°C過夜培養，挑3個菌落接種於IOml含氨苄青黴素的LB液體培養基中，30°C，220rmp培養至0D600 = 0. 1左右， 加氯四環素誘導6h，在LB平板上劃線，39°C過夜培養。挑單菌落分別在LB、帶氨苄青黴素的LB、帶卡納黴素的LB平板上劃線，驗證是否消除卡納黴素抗性基因和pFT-Amp質粒。只在LB平板上生長，在帶氨苄青黴素的LB、帶卡納黴素的LB平板上不能生長的菌落即為正確消除卡納黴素抗性基因的菌株。挑取正確菌株，命名為crt-Ml-93-FRT。以 dxs-up480F/dxs-RBSL-down 為引物，以 dxs-Ml-93_FRT 的基因組 DNA 為模板進行PCR，得到用於同源重組的DNA片段dxs-R-Lib 1，該片段包括dxs基因上遊480bp同源臂、 M1-93人工調控元件及可變RBS區(圖21)。引物序列為dxs-up480F :AGTGGTATTGCCGGAATGdxs-RBSL-down :GTGGAGTCGACCAGTGCCAGGGTCGGGTATTTGGCAATATCAAAACTCATNNNNN NYCTCCTGGTTTAAACGTACATG採用一步同源重組的方法將dxs-R-Libl插在dxs基因前面，調控dxs基因的表達。dxs-R-Libl的PCR擴增及一步同源重組方法參見實施案例7，將dxs-R-Libl片段電轉化至crt-Ml-93-FRT，3(TC、75rmp培養2h，取200ul塗於含卡那黴素的LB板，39°C過夜培養，因為dxs-Ml-93-FRT含有crtEXYIB基因和M1-93人工調控元件，可以產生β -胡蘿
卜素，所以菌落顏色為黃色。在dxs基因前插入dxs-R-Libl後，強度高的人工調控元件將使dxs基因表達更高，使菌株產生β-胡蘿蔔素更多，菌落更黃。從構建dxs調控元件庫中挑取17株顏色較深的菌株，在含卡那黴素的LB液體培養基中培養，測定β-胡蘿蔔素含量，結果見圖22。dxs-8、dxs-15、dxs-16這三個重組子的β -胡蘿蔔素含量最高，分別為 crt-Ml-93-FRT 的 1. 7、1. 7、1. 8 倍。 另外，還將crt-Ml-93-FRT的dxs的原始調控區域替換為M1-37，得到菌株 dxs-Ml-37-FKF2，其β -胡蘿蔔素含量為crt_Ml-93_FRT的1. 6倍。因此，通過人工元件文庫來調控dxs基因表達比用特定強度的人工調控元件調控dxs基因表達的效果更好。
權利要求
1.一種利用人工調控元件文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法，包括以下步驟將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為人工調控元件文庫。 所述微生物染色體上待調控基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。所述人工調控元件文庫為啟動子文庫、啟動子與核糖體結合位點之間的信使RNA穩定區文庫、核糖體結合位點文庫、啟動子上遊區文庫中的一種或幾種。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述啟動子文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個含6個特定鹼基或6個隨機鹼基的啟動子-35核心區域、一個含6個特定鹼基或6個隨機鹼基的啟動子-10核心區域、一個在-35和-10核心區域之間的含10-20個特定鹼基或10-20個隨機鹼基的中間區域、一個含特定鹼基的啟動子上遊區、一個含特定鹼基的信使RNA穩定區、一個含特定鹼基的核糖體結合位點。所述信使RNA穩定區文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個含特定鹼基的啟動子上遊區、一個含特定鹼基的啟動子、一個在啟動子與核糖體結合位點之間的含5-50 個隨機鹼基的信使RNA穩定區、一個含特定鹼基的核糖體結合位點。所述核糖體結合位點文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個含特定鹼基的啟動子上遊區、一個含特定鹼基的啟動子、一個含特定鹼基的信使RNA穩定區、一個含6-20 個隨機鹼基的核糖體結合位點。所述啟動子上遊區文庫為一段含有隨機鹼基的DNA序列，其包括一個在啟動子-35核心區域上遊的含5-1000個隨機鹼基的區域、一個含特定鹼基的啟動子、一個含特定鹼基的信使RNA穩定區、一個含特定鹼基的核糖體結合位點。
3.根據權利要求1-2所述的方法，其特徵在於 所述啟動子文庫的序列為序列表中的序列1和序列2。 所述信使RNA穩定區文庫的序列為序列表中的序列9。 所述核糖體結合位點文庫的序列為序列表中的序列18。 所述啟動子上遊區文庫的序列為序列表中的序列17。
4.根據權利要求1-3所述的方法，其特徵在於所述將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為人工調控元件文庫，包括以下步驟通過PCR的方法擴增出一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、抗性標記基因、人工調控元件文庫、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含40-3000 個鹼基的片段(作為右同源臂)。使用同源重組的方法，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為抗性標記基因和人工調控元件文庫。所述抗性標記基因為氨苄青黴素抗性基因、卡納黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、四環素抗性基因、安普黴素抗性基因中的一種或幾種。
5.根據權利要求1-4所述的方法，其特徵在於 所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色體上待調控基因為大腸埃希氏菌的半乳糖苷酶基因(IacZ)U-脫氧-木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)。
6.一種人工調控元件的構建方法，包括以下步驟將微生物染色體上標記基因的原始調控區域替換為人工調控元件文庫，獲得一系列具有不同調控強度的人工調控元件。通過測定該標記基因編碼蛋白的活性，確定各個人工調控元件的強度。所述微生物染色體上標記基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色體上標記基因為大腸埃希氏菌的半乳糖苷酶基因(IacZ)。
8.一種利用具有特定強度的人工調控元件調控微生物染色體上基因表達強度的方法， 包括以下步驟將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為人工調控元件。所述微生物染色體上待調控基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。所述人工調控元件為一段含有特定鹼基的DNA序列，其具有特定的表達強度，包括啟動子上遊區、啟動子、信使RNA穩定區和核糖體結合位點。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述人工調控元件的序列為序列表中的序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、 序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列19。
10.根據權利要求8-9所述的方法，其特徵在於所述將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為具有特定表達強度的人工調控元件，包括以下步驟通過PCR的方法擴增出一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、抗性標記基因、一個具有特定表達強度的人工調控元件、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為右同源臂)。使用一步同源重組的方法，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為抗性標記基因和具有特定表達強度的人工調控元件。所述抗性標記基因為氨苄青黴素抗性基因、卡納黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、四環素抗性基因、安普黴素抗性基因中的一種或幾種。
11.根據權利要求8-9所述的方法，其特徵在於所述將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為具有特定表達強度的人工調控元件，包括以下步驟使用兩步同源重組的方法，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為具有特定表達強度的人工調控元件。首先通過PCR的方法擴增出第一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、抗性標記基因、果聚糖蔗糖轉移酶基因、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為右同源臂)。進行第一步同源重組，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為抗性標記基因和果聚糖蔗糖轉移酶基因。通過PCR的方法擴增出第二段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段(作為左同源臂)、一個具有特定表達強度的人工調控元件、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含 40-3000個鹼基的片段(作為右同源臂)。進行第二步同源重組，將抗性標記基因和果聚糖蔗糖轉移酶基因替換為具有特定表達強度的人工調控元件。所述抗性標記基因為氨苄青黴素抗性基因、卡納黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、四環素抗性基因、安普黴素抗性基因中的一種或幾種。
12.根據權利要求8-11所述的方法，其特徵在於 所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。所述微生物染色體上待調控基因為大腸埃希氏菌的1-脫氧-木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)、l-脫氧-木酮糖5-磷酸還原異構酶基因(dxr)、4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇合成酶基因(ispD)、4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇激酶基因(ispE)、(E)-4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸合成酶基因(ispG)、(E) -4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸還原酶基因(ispH)、異戊醯焦磷酸異構酶基因(idi)、法尼二磷酸合成酶基因(ispA)； 成團泛菌(Pantoea agglomerans)的犛牛兒基犛牛兒基二磷酸(GGPP)合成酶基因(crtE)、 β -胡蘿蔔素環化酶基因(crtX)、番茄紅素β -環化酶基因(crtY)、八氫番茄紅素去飽和酶基因(crtl)、八氫番茄紅素合成酶基因(crtB)。
全文摘要
本發明公開了利用人工調控元件及其文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法。本發明所提供的利用人工調控元件及其文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法包括以下步驟通過PCR的方法擴增出一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區域上遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段、抗性標記基因、人工調控元件文庫或是一個具有特定表達強度的人工調控元件、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下遊序列同源的一段含40-3000個鹼基的片段；將該DNA片段電轉化入微生物體內，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區域替換為人工調控元件文庫或是一個具有特定表達強度的人工調控元件。
文檔編號C12N15/10GK102286517SQ20111015517
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者盧焦, 張學禮, 朱欣娜, 李清豔, 趙婧 申請人:天津工業生物技術研究所