用於樹突細胞的皰疹病毒載體的製作方法

2023-09-19 21:20:45

專利名稱：用於樹突細胞的皰疹病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠有效感染樹突細胞的減毒單純皰疹病毒。本發明還涉及在免疫治療方法中使用這樣的病毒以治療疾病。
為實現產生對抗腫瘤抗原或其它疾病相關抗原的治療免疫反應，需要滿足幾個條件。首先，需要鑑定其表達是腫瘤特異性或疾病特異性(或至少是選擇性)、並因此能夠作為免疫反應的靶起作用的分子。已經證明這項工作對於大多數普通腫瘤來說是非常困難的，但是例如宮頸癌因為在大多數情況下存在病毒癌基因E6和E7而得到解決，而對於其它腫瘤，已經開始鑑定出好的候選抗原。例如，MUC-1基因產物在許多腫瘤、包括90％的卵巢癌中過度表達。也已經鑑定了各種其它腫瘤相關抗原，所述腫瘤相關抗原中的任何一種都可以用於癌症的免疫治療。第二，在鑑定所述一種抗原/多種抗原後，需要將所述抗原以免疫原形式傳遞到免疫系統。為產生對於腫瘤排斥來說關鍵的細胞免疫反應，這意味著必須或者將所述蛋白傳遞進入宿主細胞的細胞質(對於高分子量蛋白抗原來說是一項困難的工作)，或者在基因送遞或DNA免疫接種後由所述宿主細胞本身合成所述蛋白。已經考慮用於該目的的病毒載體包括牛痘、腺病毒或逆轉錄病毒。
目前公認的提供最佳免疫刺激的細胞類型是淋巴樹突細胞(DC；例如見Girolomoni和Ricciardi-Castagnoli，1997)。DC確實顯示為能夠在體內刺激初次免疫反應的唯一細胞類型，此外甚至已經顯示DC能夠在某些情況下打破已經建立的耐受性。許多小組正在探索在自體過繼免疫治療方法中使用DC以刺激針對腫瘤的免疫反應，希望它們能夠顯示治療效果。這樣的方法涉及培養DC和/或從外周血中富集DC、在體外將抗原加載到DC、然後將所述DC重新引入患者體內。然而，該方法已經由於缺乏將抗原加載到這些細胞上的有效方法而受到阻礙。然而，最近的工作已經顯示通過肽脈衝DC(peptidepulsed DC)呈遞抗原已經在體內產生了抗腫瘤反應(Celluzzi等，1996；Zitvogel等，1996)。至於病毒載體，逆轉錄病毒並不能對樹突細胞產生高效率的基因送遞(Reeves等，1996；Aicher等，1997)，而在我們的工作中，與其它人報導的工作(Arthur等，1997)不一樣，只有腺病毒產生低效率的基因送遞。
我們以前已經測試並報導了單純皰疹病毒(HSV)能夠有效感染並送遞基因到樹突細胞(Coffin等，1998)，但未測量相關毒性。在此目的上HSV比其它載體系統具有許多優點，因為它能感染廣泛的細胞類型(包括一些用其它載體系統非常難感染的細胞類型，如Dilloo等，1997；Coffin等，1998)、易於操作、並且能夠接受大DNA插入片段，以允許多個基因的表達(由Coffin和Latchman 1996綜述)。對於一些癌症和傳染性疾病的治療來說，送遞多個基因到樹突細胞、然後將其重新引入體內可能是一種特別有前途的方法。
發明簡述我們以前已經發現與我們所掌握的其它載體不同，HSV可以有效地轉導樹突細胞(Coffin等，1998)，但沒有測試所轉導的樹突細胞的任何毒性效應以及功能大小(functional capability)。目前我們已經測試了多種HSV突變體，包括從基本上是野生型的病毒到具有防止在一些細胞類型中複製的突變(在非必需基因中的突變)或防止在所有細胞類型中複製的突變(在必需基因上的突變)的病毒，以及一些必需基因和非必需基因上的均有缺失的突變體。我們已經發現這些各種突變體在基因送遞效率以及所顯示的毒性水平(根據樹突細胞死亡估計)上有相當大的差異。
令人驚奇的是，我們已經發現(1)在ICP34.5、VMW65、vhs以及UL43上具有失活突變的病毒與所測試的其它能夠複製的病毒相比，其毒性更低並且對樹突細胞的基因送遞效率更高，包括以前報導的病毒(Coffin等，1998)以及許多測試過的不能複製的病毒。這是特別令人吃驚的，因為ICP34.5、VMW65、vhs以及UL43通常都被認為是非必需基因。例如，包括一個必需基因缺失(ICP34.5、VMW65、vhs以及ICP27突變)的相似病毒與該病毒相比，顯示低得多的基因送遞效率。此外，與測試過的其它病毒突變體不同，在所述靶細胞內證實表明有效的抗原加工的結果。這暗示轉導樹突細胞保留了在體內刺激有效免疫反應的功能能力。我們還發現(ii)與其它僅除去一個立即早期基因的突變體不同，在靶細胞中僅僅表達最低水平的立即早期基因(因此一般預期在靶細胞中僅有非常低水平的HSV基因表達)的病毒產生相似的結果。
這些結果顯示雖然使用HSV載體可以相對容易地獲得對樹突細胞的有效基因送遞，但為使所述細胞保持它們的抗原加工能力，必須仔細選擇在所述病毒中特定突變組合。因此，本發明第一次提供了針對樹突細胞的病毒載體，所述病毒載體提供高效的基因送遞，同時不有害地影響所感染的樹突細胞的抗原加工能力。
因此，本發明提供能夠有效感染樹突細胞並且不會防止所述感染細胞內有效的抗原加工的減毒皰疹病毒。所述皰疹病毒最好是人單純皰疹病毒。所述皰疹病毒更優選是單純皰疹病毒(HSV)，例如HSV1或HSV2或同源的病毒株。
在一個實施方案中(上面的實施方案(i))，本發明的皰疹病毒如果是HSV株的話，通常缺少有功能的UL43基因以及有功能的vhs基因或它們在其它病毒物種中的同功物。本發明的病毒最好還缺少有功能的HSV ICP34.5基因或它在其它病毒物種的同功物。本發明的病毒還可以缺失有功能的VMW65基因或它在其它病毒物種中的同功物，尤其是由於在所述基因中完全破壞其轉錄激活活性的突變而造成的缺乏。在第二個實施方案(上面的實施方案(ii))，本發明的皰疹病毒包含在不能互補(contemplate)所述病毒中所述缺失的細胞中最小化立即早期基因表達的突變。這樣的病毒包括，例如，在編碼ICP27和ICP4的基因上有失活突變、在vmw65編碼基因上具有去除其反式激活功能的失活突變(如vmw65突變，如在Ace等，1989或Smiley等1997中)的病毒。這樣的病毒還包括在每一個單獨的調節性立即早期基因(編碼ICP4、ICP27、ICP0和ICP22)上具有失活突變並且可選地失活剩下的非調節性立即早期基因ICP47的病毒。
在本發明的優選實施方案中，本發明的病毒或者是在至少四個基因上具有突變以致其缺乏有功能的vhs基因、有功能的UL43基因、有功能的ICP34.5基因以及有功能的VMW65基因(由於在所述VMW65基因上完全消除其轉錄激活活性的突變)的減毒HSV株，或者是包含使其至少缺乏有功能的ICP4基因、有功能的ICP27基因以及有功能的vmw65基因(由於在所述vmw65基因上完全消除其轉錄激活活性的突變)的突變的減毒HSV株，或者是包含使其至少缺乏有功能的ICP4基因、有功能的ICP27基因、有功能的ICP0基因以及有功能的ICP22基因的突變的減毒HSV株。
本發明還提供了帶有一個異源基因/多個異源基因的本發明的病毒。術語異源基因包括未在所述病毒基因組中發現的任何基因。所述異源基因可以是野生型基因的任何等位變異體，或者可以是突變基因。異源基因最好有效連接到允許所述異源基因在樹突細胞、最好是人類樹突細胞中表達的控制序列。因此，本發明的病毒可用於送遞異源基因到其將在其中表達的樹突細胞。
所述一個異源基因/多個異源基因最好編碼治療用途的多肽。所述一個異源基因/多個異源基因尤其可以編碼能夠改變免疫反應的多肽，例如細胞因子或其它免疫調製多肽。所述一個異源基因/多個異源基因也可以編碼在腫瘤細胞中存在但在非腫瘤細胞中不存在的抗原性多肽，或者與非腫瘤細胞相比在腫瘤細胞中向上調節的多肽。這在癌症治療中是有用的，因為本發明的感染樹突細胞可以用於刺激宿主免疫系統對腫瘤特異性或在腫瘤中廣泛存在的一種抗原/多種抗原起反應，導致腫瘤減小(tumor reduction)/腫瘤消退(tumorregression)。所述多肽抗原最好是細胞表面多肽或已經工程化以便能將它轉運到細胞表面的多肽(例如通過與信號肽融合)。所述異源基因也可以編碼寄生蟲來源、病毒來源或細菌來源的一種多肽/多種多肽，使得例如用本發明病毒感染的樹突細胞可用於在病原體感染宿主前或感染後刺激所述宿主的免疫系統產生針對所述病原體的免疫反應。所述一個異源基因/多個異源基因也可以編碼與其它疾病(如神經變性疾病，如亨廷頓氏病、Alzheimer氏病或帕金森病)有關的一種蛋白/多種蛋白，針對所述蛋白誘導免疫反應可能是有利的。
本發明還提供了帶有一個異源基因/多個異源基因的本發明的病毒，所述病毒用於人類和動物治療，尤其是通過免疫治療的人類和動物治療。例如，這樣的病毒可用於治療或預防腫瘤或寄生蟲感染、細菌感染或病毒感染。
還提供了用本發明的病毒轉導的樹突細胞。這樣的細胞可用於治療疾病的來自體內的方法，所述疾病如惡性腫瘤或病毒或細菌病原體的感染。發明詳述A.病毒本發明的減毒病毒能夠有效感染樹突細胞而不妨礙在所感染的細胞內發生的抗原加工。本發明的病毒最好能夠以感染複數1感染至少40％的細胞、更優選至少50、60、70或80％的細胞。使用本發明的病毒在個體細胞內獲得的表達水平/效率將根據所表達的多肽以及有效連接到編碼所述多肽的基因的控制序列而有所不同，但所述水平/效率至少與使用野生型病毒獲得的水平/效率一樣。此外，本發明的病毒顯示對感染細胞的低毒性。感染後細胞存活率最好在感染後第一天有至少50％，更優選在感染後第一天有至少60、70、80或90％。
為獲得降低的毒性同時保持對樹突細胞的有效感染以及樹突細胞中的抗原加工，本發明的病毒一般將缺少有功能的UL43基因和vhs基因(在HSV中)或其在其它病毒物種中的同源物或同功物。可以製造其它突變以進一步降低所述病毒的毒性，例如通過編碼vmw65的基因突變以便最小化所述蛋白的反式激活活性，以及/或者通過編碼ICP34.5的基因的失活突變。或者，或另外，所述病毒將包括最小化所述病毒立即早期基因表達的突變，可選地還包括其它突變。因此，本發明的病毒通常也可以發生ICP27、ICP4突變並且發生最小化所述蛋白的反式激活活性的vmw65突變，或用另一種方式在編碼ICP4、ICP27、ICP0和ICP22的每一個基因上都發生突變。本發明的病毒另外可以在編碼ICP47的基因上發生突變。
雖然本發明已經使用單純皰疹病毒進行了舉例描述，但應當理解可以修飾皰疹病毒科的其它病毒，以獲得降低的毒性同時保持對樹突細胞的有效感染以及樹突細胞中的抗原加工。尤其是當上面所述HSV基因(特別是UL43和vhs)的基因同源物存在於其它皰疹病毒物種中時，那麼將修飾這些同源物。或者或加之，帶有所述立即早期基因上的突變或導致立即早期基因表達降低的突變的病毒將是特別優選的。「同源物」意味著一個基因與對應的HSV基因具有序列同源性，所述同源性或者是胺基酸序列同源性或者是核酸序列同源性。HSV基因的同源物一般將與對應的HSV基因在胺基酸水平上至少15％相同、最好至少20％相同。例如豬皰疹病毒、假狂犬病病毒的prv43基因與UL43有23％相同(Powers等，1994)。
測量核酸和蛋白質同源性的方法是本領域內眾所周知的。例如，UWGCG軟體包提供可以用於計算同源性的BESTFIT程序(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12387-395)。
同樣，可以用PILEUP和BLAST算法排列序列(例如在AltschulS.F.(1993)J.Mol.Evol.36290-300；Altschul，S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所述)。進行BLAST分析的軟體可以通過國立生物技術信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開地獲得。
對這樣的程序可以有許多不同的設置。依照本發明，可以使用默認設置。
可以使用多種方法鑑定HSV基因的同源物，例如在中到高嚴格性條件下(例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，在約50℃到約60℃下)，用包含全部或部分所述HSV基因的探針探測由其它病毒製得的基因組文庫或cDNA文庫。或者，也可以使用簡併PCR獲得物種同源物，其中使用設計為靶向所述變異體和同源物內編碼保守胺基酸序列的序列的引物。所述引物將包含一個或多個簡併位點，並在嚴格條件下使用，所述嚴格條件低於用於使用單序列引物針對已知序列克隆序列的條件(例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，在約40℃下)。
為安全性的目的，本發明的病毒是減毒的，一般它們在靶細胞中不能有效複製。可以或者除去為減毒目的改變的病毒區(完全或部分)，或者可以使所述病毒區變得沒有功能，或者用其它序列、尤其是異源基因序列取代所述病毒區。已經描述了用作病毒載體的所有病毒組的減毒突變。例如，可以通過在ICP34.5和/或必需基因如ICP4和ICP27上的突變使HSV變得無毒。1.單純皰疹病毒i.病毒當本發明的所述病毒是單純皰疹病毒時，所述病毒可以衍生自例如HSV1或HSV2株或它們的衍生物，最好是HSV1。衍生物包括含有HSV1和HSV2株的DNA的類型間(inter-type)重組體。一般按照本文所述的方法測試，衍生物與HSV1或HSV2基因組優選有至少70％序列同源性，更優選有至少80％序列同源性，甚至更優選有至少90或95％序列同源性。可以用於獲得本發明的病毒的其它衍生物包括已經在需要在本發明的病毒中功能性失活的基因中有突變的株，例如在ICP34.5上具有突變的1716株(MacLean等，1991)、R3616株和R4009株(Chou和Roizman，1992)以及R930株(Chou等，1994)、在ICP4上具有缺失的d120株(DeLuca等，1985)、在ICP27上具有缺失的d27-1株(Rice和Knipe，1990)或在ICP27和ICP4上都具有缺失的d92株(Samaniego等，1995)。使用這些株將減少產生本發明的突變HSV株所需的步驟數目。
在描述各種HSV基因時使用的術語與在Coffin和Latchman，1996中的一樣。
ii.互補細胞系當本發明的單純皰疹病毒缺少特定有功能的必需基因(例如編碼ICP4或ICP27的基因)時，可以使用表達該必需基因的細胞系繁殖本發明的所述病毒。例如，當所述病毒缺乏有功能的ICP27基因時，可以使用V27細胞(Rice和Knipe，1990)、2-2細胞(Smith等，1992)或B130/2細胞(WO98/30707)繁殖所述病毒，最好使用B130/2細胞繁殖所述病毒。當所述病毒缺少有功能的ICP4基因時，可以使用表達ICP4的細胞系例如E5細胞(DeLuca等，1985)繁殖所述病毒。當所述病毒缺乏有功能的ICP4基因和有功能的ICP27基因時，可以使用表達ICP4和ICP27的細胞系(如E26細胞；Samaniego等，1995)繁殖所述病毒，當所述病毒另外還缺少有功能的vmw65基因時，可以使用還包含vmw65的非HSV同源物(如馬皰疹病毒基因12或牛皰疹病毒的BTIF)的細胞系繁殖所述病毒。
可以共轉染哺乳動物細胞，產生表達ICP27的細胞系，如用包含能在所述細胞中表達的有功能的HSV ICP27基因的載體(最好是質粒載體)以及編碼選擇標記(如新黴素抗性)的載體(最好是質粒載體)共轉染哺乳動物細胞，如Vero細胞或BHK細胞。然後使用本領域內技術人員已知的方法(例如Rice和Knipe，1990中所述方法)，例如根據其支持ICP27-HSV株生長的能力，進一步篩選含有選擇標記的克隆，以確定哪些克隆還表達有功能的ICP27。
如上產生不允許ICP27-突變HSV株回復到具有有功能的ICP27的株的細胞系，確保包含有功能的ICP27基因的載體不包含與保留在ICP27-突變病毒中的序列有重疊(即同源)的序列。
當本發明的HSV株在其它必需基因(例如ICP4)上包含失活修飾時，互補細胞系將以如針對ICP27所述的同樣方式互補所述修飾的必需基因。例如，在包含ICP27以及ICP4突變的HSV株的情況下，使用同時表達ICP27和ICP4的細胞系(如E26細胞(Samaniego等，1995))。可以以針對ICP27所述的相似方式構造表達其它必需基因的HSV株。B.突變方法可以通過本領域內眾所周知的幾種技術使所提到的各種病毒基因在功能上失活。例如，可以通過缺失、置換或插入使它們在功能上失活，其中最好通過缺失。缺失可以除去所述基因的部分或整個基因。例如，可以造成僅一個核苷酸的缺失，以造成移碼。然而，最好製造更大的缺失，例如缺失至少25％、更優選缺失至少50％的整個編碼序列和非編碼序列(或者，以絕對數表示，至少10個核苷酸、更優選至少100個核苷酸、最優選至少1000個核苷酸)。尤其優選除去整個基因以及一些側翼序列。插入的序列可以包括下面描述的異源基因。尤其優選在ICP27或ICP4中插入異源序列。在VMW65基因的情況下，由於它編碼必需的結構蛋白，因此並不缺失整個基因，而是製造完全破壞VMW65轉錄激活IE基因的能力的小的失活突變(如在Ace等，1989或Smiley等，1997中所述)。
通過本領域技術人員眾所周知的同源重組方法在所述皰疹病毒中製造突變。例如，用包含側翼有同源HSV序列的突變序列的載體、最好是質粒載體與HSV基因組DNA一起轉染。所述突變序列可以包含通過常規技術構造的缺失、插入或取代。插入可以包括選擇標記基因，如lacZ或GFP，以通過例如α-半乳糖苷酶活性或螢光篩選重組病毒。C.異源基因和啟動子可以修飾本發明的病毒以攜帶一個異源基因/多個異源基因。術語「異源基因」包括任何基因。雖然異源基因一般是在皰疹病毒基因組中不存在的基因，但可以使用皰疹病毒基因，只要所述編碼序列不與其天然連接的病毒控制序列有效連接。所述異源基因可以是野生型基因的任何等位變異體，或所述異源基因可以是突變基因。術語「基因」包括至少能被轉錄的核酸序列。因此，該定義包括編碼mRNA、tRNA和rRNA的序列。然而，本發明涉及多肽的表達，而不是tRNA和rRNA的表達。編碼mRNA的序列將可選地包括與翻譯的編碼序列天然地或以其它方式連接的部分或全部5′和/或3′轉錄但不翻譯的側翼序列。它還可以可選地包括與轉錄序列正常連接的相關轉錄控制序列，例如轉錄終止信號、聚腺苷酸化位點和下遊增強子元件。
可以通過HSV株與例如攜帶側翼有HSV序列的一個異源基因/多個異源基因的質粒載體的同源重組，將所述一個異源基因/多個異源基因插入病毒基因組中。使用本領域內眾所周知的克隆技術，可以將所述一個異源基因/多個異源基因導入包含皰疹病毒序列的合適質粒載體。可以將所述一個異源基因/多個異源基因在任何位點插入病毒基因組，只要所述病毒仍然能夠繁殖。優選將所述一個異源基因/多個異源基因插入必需基因。異源基因可以插入病毒基因組內的多個位點。
所述一個異源基因/多個異源基因的轉錄序列最好有效連接到允許所述一個異源基因/多個異源基因在樹突細胞中表達的控制序列，所述樹突細胞最好是哺乳動物樹突細胞、更優選是人類樹突細胞。術語「有效連接」指並列(juxtaposition)，其中所述組成部分處於允許它們按照它們所固有的方式起作用的關係。與編碼序列「有效連接」的控制序列是以這樣一種方式連接在所述方式下，在適合所述控制序列的條件下完成所述編碼序列的表達。
所述控制序列包含允許所述一個異源基因/多個異源基因表達的啟動子以及轉錄終止的信號。從在哺乳動物樹突細胞、最好是人類樹突細胞中有功能的啟動子中選擇所述啟動子。所述啟動子可以衍生自真核基因的啟動子序列。例如，它可以是衍生自在其中發生異源基因表達的細胞的基因組，所述細胞最好是哺乳動物樹突細胞，更優選是人類樹突細胞。至於真核啟動子，它們可以是以遍在的方式作用的啟動子(如β-肌動蛋白啟動子、微管蛋白啟動子)或者是以組織特異性方式作用的啟動子(例如丙酮酸激酶基因的啟動子)。它們也可以是應答特定刺激的啟動子，例如結合類固醇激素受體的啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠類白血病毒長末端重複(MMLV LTR)啟動子或皰疹病毒基因的啟動子。
HSV LAT啟動子以及包含LAT啟動子區的元件的啟動子是特別優選的，因為有可能獲得所述異源基因在潛伏期內的長期表達。尤其這樣的表達盒是特別優選的所述表達盒主要包含LAT P2區，它本身並不作為啟動子，但是與啟動子和異源基因以該順序連接。
術語「長期表達」是用來指在用本發明的單純皰疹病毒感染的細胞中表達異源基因，甚至在所述單純皰疹病毒已經進入潛伏期後表達所述異源基因。所述表達最好在感染後持續至少兩周，更優選持續至少一個月或兩個月，甚至更優選在細胞的生存期內持續。
表達盒還可以包含以該順序有效連接到所述HSV LAT P2區的第二啟動子和第二異源基因，而且所述第二啟動子和第二異源基因處於與所述第一啟動子和第一異源基因相反的取向，其中所述第二啟動子和第二異源基因與所述第一啟動子和第一異源基因相同或不同。由此構建了處於相反取向、側翼有單一LAT P2區的一對啟動子/異源基因，所述單一LAT P2區允許異源基因對的長期表達，所述異源基因對可以是相同或不同的，由相同或不同的啟動子驅動。此外，所述第一異源基因的產物可以在合適生理條件下調節所述第二異源基因的表達(反之亦然)。
可以使用本領域內技術人員熟知的常規克隆技術製造包含一個異源基因/多個異源基因和控制序列的表達盒以及其它合適的構造物(見例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)。所述LAT P2區在此定義為HSV1株17+的HSV1核苷酸118866-120219(GenBank HE1CG從Pst I-BstXI位點起)、並包括該區的片段或衍生物，其中包括其它HSV1株和HSV2株的同源區，所述LAT P2區能夠為它們所連接的啟動子提供長期表達能力。
所述啟動子是誘導型也是有利的，以便可以在所述細胞的生存期內調節所述異源基因的表達水平。誘導型意味著使用所述啟動子獲得的表達水平是可以調節的。例如，在將多於一個異源基因插入HSV基因組的優選實施方案中，一個啟動子將包含對以前報導的tet阻抑物/VP16轉錄激活物融合蛋白應答的啟動子(Gossen和Bujard，1992，Gossen等，1995)，並驅動需要調節的異源基因的表達。所述第二啟動子將包含驅動所述tet阻抑物/VP16融合蛋白表達的強啟動子(如CMV IE啟動子)。因此，在這個例子中，所述第一異源基因的表達將取決於四環素存在與否。
此外，可以通過添加其它調節序列來修飾這些啟動子中的任何一個，所述調節序列如增強子序列(包括HSV LAT區的元件)。也可以使用包含來自上面所述的兩個或更多個不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子，例如MMLV LTR/LAT融合啟動子(Lokensgard等，1994)或包含LAT區的元件的啟動子(見上文)。
異源基因一般編碼治療用途的多肽。例如，為促進特異性針對特定腫瘤的免疫反應，需要用指導一種腫瘤抗原/多種腫瘤抗原表達的本發明的病毒轉染樹突細胞。腫瘤抗原可以對一種腫瘤細胞是特異性的，或者由於所述抗原的表達的向上調節，所述抗原在該腫瘤細胞中以比非該類型腫瘤細胞中水平更高。尤其優選所述腫瘤抗原在所述腫瘤細胞表面表達，例如細胞表面受體或細胞粘著蛋白。腫瘤抗原的例子包括在多種腫瘤(包括卵巢癌)中過量表達的MUC-1基因產物(Gendler等，1990)、與宮頸癌有關的人乳頭瘤病毒蛋白E6和E7。尤其優選引發T細胞反應的腫瘤抗原。
異源基因也可以編碼能夠改變免疫反應的多肽，例如細胞因子(如α、β或γ-幹擾素、白細胞介素(包括IL-1、IL-2)、腫瘤壞死因子或胰島素樣生長因子I或II)或其它免疫調製蛋白。
異源基因也可以編碼用作疫苗的抗原性多肽。這樣的抗原性多肽最好衍生自致病生物，例如寄生蟲、細菌或病毒。這樣的抗原性多肽的例子包括C型肝炎病毒抗原、B型肝炎表面抗原或核心抗原、HIV抗原、瘧疾抗原、百日咳毒素、霍亂毒素或白喉毒素。
異源基因也可以包括標記基因(例如編碼β-半乳糖苷酶或綠螢光蛋白的基因)或其產物調節其它基因表達的基因(例如轉錄調節因子，包括上文所述的tet阻抑物/VP16轉錄激活物融合蛋白)。
基因治療和其它治療應用很可能要求給予多種基因。多基因的表達對於治療多種病理狀況是有利的。皰疹病毒是唯一合適的，因為它們沒有其它病毒載體系統的受到限制的包裝能力。因此在它的基因組中可以容納多個異源基因。例如，有至少兩種達到該目的的方法。例如，可以將多於一個的異源基因和相關控制序列或者在病毒基因組中的單一位點或者多個位點引入特定HSV株。還有可能如上所述，使用以相反取向相對的啟動子對(相同或不同的啟動子)，這些啟動子每一個都驅動異源基因(相同或不同的異源基因)的表達。D.樹突細胞可以通過多種方法分離/製備樹突細胞，例如或者直接從外周血純化，或者例如通過用G-CSF處理CD34+前體細胞轉移進外周血後產生，或者直接從骨髓中純化它們。可以用GM-CSF/IL-4混合物處理來自外周血的粘附性前體(Inaba等，1992)，或者可以用GM-CSF和TNF-α處理來自骨髓的非粘附性CD34+細胞(Caux等，1992)。可以從人類志願者的外周血中常規製備DC，製備方法類似Sallusto和Lanzavecchia，1994的方法，使用純化的外周血單核細胞(PBMC)並用GM-CSF和IL-4處理粘附性細胞2小時。然後使用磁珠從這些細胞中去除CD19+B細胞和CD3+、CD2+T細胞(見Coffin等，1998)。也可以用其它方法製備樹突細胞。E.治療用途本發明的病毒以及用本發明的病毒感染的樹突細胞可用於治療方法。尤其是表達腫瘤抗原的本發明的病毒以及用本發明的病毒感染的樹突細胞可用於治療癌症的方法中。具體地說，本發明的病毒以及用本發明的病毒感染的樹突細胞可用於抑制哺乳動物、包括人類的各種腫瘤的生長，例如卵巢、宮頸和子宮內膜的腫瘤以及癌症，例如乳癌、肺癌、膀胱癌和結腸癌。其它生長可能被抑制的腫瘤包括肉瘤(如軟組織肉瘤和骨肉瘤)以及血液性惡性腫瘤如白血病。可用表達腫瘤抗原的本發明的病毒和/或用本發明的病毒感染的樹突細胞治療的癌症的特定例子包括黑素瘤、白血病、宮頸癌和卵巢癌。
本發明的病毒以及用本發明的病毒感染的樹突細胞可用於治療或預防致病性感染的方法中，所述致病性感染如寄生蟲感染、細菌感染或病毒感染。在這種情況下，在感染前可以給予所述病毒/樹突細胞以刺激所述宿主中的保護性免疫反應，或在感染後給予所述病毒/樹突細胞，刺激宿主免疫系統以克制所述感染。F.給予因此，本發明的皰疹病毒可以用於向需要治療的人或動物送遞治療性基因。使用本發明的皰疹病毒送遞治療性基因可用於治療，例如，惡性腫瘤以及病原感染。
一種進行治療的方法涉及如上所述在本發明的皰疹病毒的基因組中插入治療性基因，然後將得到的重組病毒與藥學上可接受的載體或稀釋劑結合以產生藥用組合物。合適的載體以及稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩衝液。配製所述組合物以進行腸胃外給予、肌肉內給予、靜脈內給予、皮下給予或經皮給予。
可以通過將包含本發明的病毒的組合物給予患者，在體內用本發明的病毒感染樹突細胞。以這樣一種方式給予所述藥用組合物所述方式使得包含治療性基因的所述病毒可以在合適區域引入細胞。所給予的病毒的量在從104到1010pfu的範圍內，最好在105到108pfu的範圍內，更優選在約106到107pfu的範圍內。當進行注射時，一般給予從10μl到1ml、最好給予100μl到1ml的在藥學上可接受的合適載體或稀釋劑中的病毒。
另一種方法涉及從外周血或骨髓中分離/製備樹突細胞，然後在體外用本發明的病毒感染所述細胞。然後一般將轉導後的樹突細胞給予患者，其中給予方法是肌肉內注射、腹膜內注射、皮下注射或靜脈內注射，或者直接注射進所述患者的淋巴結，最好直接注射進淋巴結。一般給予所述患者104到108的轉導樹突細胞，最好給予所述患者105到107細胞，更優選給予所述患者約106細胞。
所述的給予途徑以及劑量僅僅作為參考，因為有經驗的執業醫師將能夠依據例如患者的年齡、體重和病況容易地確定對於任何特定患者的最佳給予途徑以及劑量。
本發明將參照下面的實施例進行敘述，下面的實施例將僅是例證性而非限制性的。
對於在VMW65上具有突變的病毒，在用於培養病毒的培養基中加入3mM六亞甲基二乙醯胺(hexamethylene-bisacetamide)(HMBA)(McFarlane等，1992)。
(i)17+/pR20.5/UL43使用標準方法，將一個來自質粒pR20.5的盒通過與純化的HSV117+株基因組DNA的同源重組插入UL43座位，所述盒包含處於相反的背對背取向並由HSV LAT區序列(核苷酸118，866-120，219)分開的RSV/lacZ/pA序列以及CMV/GFP/pA序列。首先將所述pR20.5盒在單一Nsi I位點插入包含UL43側翼區的質粒(Coffin等，1996)，產生質粒pR20.5/43。由於在所述20.5盒的一側插入了編碼Srf I的寡核苷酸，因此可以用Srf I將所述盒從它的pGEM5(Progema)質粒主鏈上切除下來。從pRc/RSV(Invotrogen)上切下RSV啟動子，從pCH110(Pharmacia)上切下lacZ/pA，從pcDNA3(Invitrogen)上切下CMV/pA，並從pEGFP-N1(Clontech)上切下GFP，以構造質粒pR20.5。
(ii)17+/pR20.5/US5通過將所述pR20.5盒插入US5側翼區(質粒pΔUS5)，將所述pR20.5盒插入HSV1的US5座位，產生質粒pR20.5/US5，隨後將其與純化的HSV1 17+株基因組DNA一起同源重組進入BHK細胞，產生病毒株17+/pR20.5/US5。通過將來自HSV1的包含US5編碼區的BamH I-EcoN I片段(核苷酸136，289-131，328)克隆進質粒pAT153，產生質粒pΔUS5。將pR20.5插入US5基因中在核苷酸137，945的單一Sac I位點。
(iii)17+/27-/pR20質粒pR20用於同源重組進純化的HSV 17+株DNA。質粒pR20含有插入ICP27側翼區(pACYC184[NBL]中HSV1核苷酸11095-113273和核苷酸116869-118439允許在連接所述兩個片段的單一MluI位點上進行插入)的LAT P2(HSV1核苷酸118866-120219)/CMV/lacZ盒。使用B130/2細胞純化表達LacZ的噬菌斑。
(iv)1764/pR20.5/UL43質粒pR20.5/43用於同源重組進純化的HSV 1764株DNA(Coffin等，1996)並純化表達GFP和LacZ的噬菌斑。HSV 1764株是其中兩個ICP34.5拷貝都已缺失並且在VMW65基因上帶有失活突變的17+株(Ace等，1989)。
(v)1764/pR20.5/US5質粒pR20.5/5用於同源重組進純化的HSV 1764株DNA，並純化表達GFP和LacZ的噬菌斑。
(vi)in1814/pR15質粒pR15用於同源重組進in1814株中編碼病毒體宿主中斷蛋白(virion host shutoff protein)(UL41)的基因(Ace等，1989)。質粒pR15包含vhs側翼區，同時在UL41基因中的單一Nru I位點插入了由HSV LAT/MMLV LTR嵌合啟動子(基本與Lokensgard等，1994所報導的相同)驅動的lacZ基因。純化表達LacZ的噬菌斑。
(vii)1764/pR15質粒pR15用於同源重組進純化的HSV 1764株DNA，並純化表達LacZ的噬菌斑。
(viii)1764/27-/pR20.5/vhs將所述pR20.5盒在單一Nru I位點插入vhs側翼區，將得到的質粒(pR20.5/vhs)用於同源重組進純化的HSV 1764/27-株DNA。使用B130/2細胞純化表達lacZ以及GFP的噬菌斑。通過同源重組除去lacZ基因、缺失ICP27座位周圍的核苷酸113322-115743，從1764/27-/pR20株(通過將質粒pR20同源重組進HSV 1764株DNA並選擇表達lacZ的噬菌斑而產生)產生1764/27-株。
(ix)1764/pR15/MSVGFP/UL43將MSV LTR啟動子/GFP盒在單一NsiI位點插入UL43側翼區，產生質粒pMSVGFP/43。然後pMSVGFP/43用於同源重組進純化的HSV 1764/pR15株基因組DNA，並純化表達lacZ和GFP的噬菌斑。
(x)1764/27-/4-/pR20.5使用互補ICP27和ICP4的B4/27細胞，通過將一個盒插入ICP4側翼區(在質粒pDICP4中缺失核苷酸124，945-125，723[Not I-Not I；編碼ICP34.5]的HSV-1核苷酸123，459-126，774[Sau3a I-Sau3a I]和131，730-134，792[Sph I-Kpn I]，由單一Xba I和Sal I位點分開)並重組進入病毒1764/27-株(見上文)，構建病毒1764/27-/4-/pR20.5株，其中所述盒包含被HSV1 LAT序列(Pst I-BstXI-核苷酸118，866-120，219[Pst I-BstXI]GenBank file helcg)分開並以背對背的取向分別由CMV和RSV啟動子驅動的GFP(E-GFP；Clontech)和lacZ。選擇X-gal染色/綠色螢光的噬菌斑並進一步純化。通過將pSG130BS、質粒p4/2(編碼ICP4編碼區、啟動子區以及poly A區)以及pMAMneo(Invitrogen)共轉染進BHK細胞，製備細胞系B4/27。然後選擇新黴素抗性克隆。實施例1使用HSV載體可以將基因有效地送遞到樹突細胞這些試驗目標在於確定使用基本是野生型的HSV病毒時，HSV能否感染樹突細胞並送遞基因到樹突細胞。使用0.1到10之間的感染複數(MOI)。在本文中每種情況下，如下感染1×105樹突細胞溫和沉澱樹突細胞，重懸浮於約100μl DMEM病毒懸浮液，37℃溫育1小時，然後轉移到盛有2ml RPMI/10％FCS+100ng/ml GM-CSF，50ng/ml IL-4的24孔板中。在試驗的其餘時間內將這些板在37℃/5％CO2下培養。這些試驗使用病毒17+/pR20.5/UL43和17+/pR20.5/US5，每種病毒都通過在不同的基因(UL43或US5)插入pR20.5盒而發生了突變。UL43和US5以前都鑑定為是HSV在培養物中的生長所非必需的，並且不影響在小鼠模型體內感染的動力學。通過在感染24小時後在螢光顯微鏡下計算GFP陽性細胞的數目，評估基因送遞的效率。下面表1所示的結果顯示HSV可以有效地送遞基因到樹突細胞。
結果-表1
實施例2樹突細胞相對不允許HSV生長，UL43的失活進一步降低了生長為確定實施例1中觀察到的有效基因送遞是否是由於所述病毒的裂解性複製，如實施例1，在以0.1到10的MOI感染樹突細胞的情況下繪製生長曲線，並根據時間定量病毒生長。以24小時的間隔，將培養基樣品在BHK細胞上測定滴度(BHK細胞允許HSV的生長)，並計算噬菌斑的數目。
結果-表2在樹突細胞培養基中的總病毒(pfu)
如上面表2所示，這些試驗顯示雖然在用HSV感染的樹突細胞培養物中發生有限的增殖性感染，但這僅在低MOI時是明顯的(尤其是缺失US5的病毒)。UL43的失活而不是US5的失活進一步降低了這種有限的增殖性感染。看起來在所述樹突細胞培養物中可以發生野生型HSV的緩慢轉換，這由於UL43的失活而被降低，但這並不伴隨著顯著的樹突細胞死亡(見實施例3)。以前沒有發現UL43的失活影響HSV的生長動力學(Maclean等，1991)。實施例3不同的HSV突變體顯示不同水平的基因送遞效率以及在樹突細胞中不同水平的毒性如實施例1，將上面所述的病毒株(i)-(x)以0.1到10的MOI感染樹突細胞。定期取兩份樣品(培養物的2×100μl)，一份樣品根據所測試的具體病毒中插入的種類，觀察GFP表達(螢光顯微鏡檢術)和/或用X-gal染色，如下進行X-gal染色溫和地沉澱細胞並重懸浮於固定液(0.8％戊二醛10分鐘)，然後用X-gal緩衝液處理(見Coffin等，1996)並在37℃溫育2小時。另一份樣品用錐蟲藍染色(活細胞不能被染色)，將未染色細胞的數目作為細胞在原始培養物中的數目的百分率進行計數。在每一組單獨試驗中，試驗重複兩次並且一般一次測試三種病毒，病毒(i)用作內部對照以估計(allow for)樹突細胞製備間的任何變化。結果以MOI＝1顯示。
結果-表3
*許多細胞被X-gal染成藍色，但藍色染色非常淺。
不能精確定量Z 見實施例5ND 未做病毒(見材料和方法)(i)17+/pR20.5/UL43，(ii)17+/pR20.5/US5，(iii)17+/27-/pR20，(iv)1764/pR20.5/UL43，(v)1764/pR20 5/US5，(vi)in1814/pR15，(vii)1764/pR15，(viii)1764/27-/pR20.5/vhs，(ix)1764/pR15/MSVGFP/UL43，(x)1764/27-/4-/pR20.5。
這些結果顯示不同的基因缺失組合產生各種基因送遞效率以及毒性缺乏組合的病毒，與原始病毒(i)和(ii)相比，一些組合改善了一種特性或另一種特性或兩種特性，而在其它組合中基因送遞效率或細胞存活率降低。去除一個必需的立即早期基因(ICP27)看起來產生明顯最小毒性的病毒，但基因送遞效率顯著降低。發現帶有失活的非必需基因的組合(ICP34.5、VMW65、vhs和UL43)的病毒實現基因送遞效率(至少對於GFP如此，見實施例4)以及缺乏毒性的最好組合，該基因送遞效率明顯大於所測試的其它病毒中的任何一種，其中所述非必需基因中的每一種以前都已分別顯示在體內降低毒性(除UL43外)。然而，也具有最小毒性的病毒(x)顯示產生高水平的GFP和lacZ RNA表達(見下)，雖然通過螢光可以檢測到更少GFP，但其表達水平與病毒(ix)相似。然而，也具有最小毒性的病毒(x)產生高水平的GFP和lacZ RNA表達(見下)，雖然通過螢光可以檢測到更少GFP，但其表達水平與病毒(ix)相似。使用抗HSV ICP27、ICP4、ICP0、ICP22和ICP47抗體的蛋白質印跡分析以前已經顯示該病毒在不互補所述病毒中的缺陷(即ICP27、ICP4和vmw65上的突變)的細胞中僅表達非常低水平的任何立即早期基因。實施例4UL43、ICP34.5、vhs和VMW65失活突變的HSV產生這樣的結果該結果表明在轉導樹突細胞中發生所送遞抗原的有效蛋白水解加工缺失UL43、ICP34.5、vhs和VMW65的病毒產生高度有效的GFP送遞。另一方面，LacZ活性雖然在許多細胞中存在，但感染後24小時僅以非常低的水平存在，處於X-gal染色的極限值上。這提高了lacZ和GFP都在所述細胞中有效產生的可能性，但lacZ活性由於對lacZ抗原的有效蛋白水解加工而明顯降低了，正如在完全有功能的樹突細胞中所預期的那樣。所述lacZ基因從相同的啟動子開始轉錄，與在樹突細胞中產生強X-gal染色的病毒相同。因此，假如lacZ的加工在所述細胞內發生，那麼通過RNA印跡雜交分析應當容易地檢測到lacZ mRNA和GFP mRNA處於相當的水平，但通過蛋白質印跡分析檢測到的lacZ蛋白水平應當顯著降低。
使用來自樹突細胞的RNA和蛋白質(在每種情況下以1×105細胞/泳道提取)進行RNA印跡分析和蛋白質印跡分析，所述樹突細胞用17+/pR20.5/UL43或者1764/pR15/MSVGFP/UL43以MOI為1感染。然後用或者抗LacZ抗體(Promega)或者抗GFP抗體(Quantum)探測蛋白質印跡。用LacZ基因(用HindIII和BamH I從pCH110(Pharmacia)切下)或GFP基因(用Not I和HindIII從pEGFP-N1(Clontech)切下)探測RNA印跡。使用標準方法(Sambrook等，1989)，通過放射性(RNA印跡)或非放射性(蛋白質印跡；ECL，Amersham)方式進行RNA印跡和蛋白質印跡。
結果蛋白質印跡顯示(i)在用17+/pR20.5/UL43感染的樹突細胞中有效檢測到lacZ以及GFP。在每種情況下，在預期分子量處觀察到單條確定的帶，同時還可見一些更小更弱的帶。
(ii)如用X-gal染色所預期的，雖然對1764/pR15/MSV/GFP/UL43容易地檢測到GFP，但在預期分子量處的lacZ蛋白水平顯著降低。
在每種情況下，蛋白質印跡顯示預期大小的強而確定的帶，不論細胞用17+/pR20.5/U143或用1764/pR15/MSVGFP/UL43感染。
這些結果顯示雖然lacZ mRNA在用1764/pR15/MSVGFP/UL43和17+/pR20.5/UL43感染後的樹突細胞中有效產生，但對於1764/pR15/MSVGFP/UL43，該RNA或者未被翻譯，或者lacZ蛋白在翻譯後迅速被降解，以致通過蛋白質印跡可檢測到的全長蛋白的水平顯著降低。考慮到樹突細胞在抗原加工中的作用，後者可能是實際情況，因為假如這樣一種送遞的抗原以有效方式受到加工，這就是所預期的情況。因此，這樣的有效抗原加工不會在其它測試的突變體中發生(除了在下面的實施例5中)，因為在每種情況下可以見到強X-gal染色。因此，為了使病毒遞送的抗原的抗原加工在樹突細胞中發生，必須仔細選定用於遞送的正確病毒突變體。實施例5僅有可能表達最小立即早期基因的HSV也允許對樹突細胞的有效、低毒的基因送遞並產生這樣的結果該結果表明在轉導樹突細胞中發生所送遞抗原的加工如上面實施例4，比較蛋白質印跡以及RNA印跡(這裡對於RNA使用狹線印跡法)。比較在用17+/pR20.5/UL43、1764/pR15/MSVGFP/UL43或1764/27-/4-/pR20.5感染的樹突細胞的提取物中LacZ和GFP的蛋白水平以及RNA水平。
結果除了1764/27-4-/pR20.5感染細胞不同外，該試驗的結果如實施例4中一樣。這裡，雖然與17+/pR20.5/UL43和1764/pR15/MSVGFP/UL43感染的細胞一樣可以檢測到相等水平的GFP和lacZ RNA，但通過蛋白質印跡僅檢測到相當低水平的GFP，該水平顯著低於用17+/pR20.5/UL43或1764/pR15/MSVGFP/UL43感染的細胞的水平。因此在1764/27-/4-/pR20.5的情況下，可以檢測到相對於根據lacZ和GFP特異性RNA的量所預期的蛋白水平而言更低水平的lacZ蛋白以及GFP蛋白(而不是如前面實施例4中對於1764/pR15/MSVGFP/UL43而言僅僅更低水平的lacZ蛋白)，而所述lacZ和GFP特異性RNA的量就實施例4和實施例5中測試的所有病毒而言是相似的。該結果指出與測試過的其它病毒中的任何一種不同，在用1764/27-/4-/pR20.5送遞基因後，lacZ和GFP都承受蛋白水解加工，例如在有功能的樹突細胞中可以預期的蛋白水解加工。這暗示了除使用1764/pR15/MSVGFP/UL43送遞基因後提供的功能性外，還有其它功能性。
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Virol 624510-452權利要求
1.一種減毒皰疹病毒，該減毒皰疹病毒能夠有效感染樹突細胞，同時不妨礙在所感染的細胞內發生的抗原加工。
2.依照權利要求1的病毒，所述病毒是單純皰疹病毒1或2。
3.依照權利要求1或2的病毒，所述病毒缺乏有功能的UL43基因和有功能的vhs基因或它們的有功能的等同物。
4.依照權利要求1到3中任一項的病毒，所述病毒缺乏有功能的ICP34.5基因或其有功能的等同物。
5.依照權利要求1到4中任一項的病毒，所述病毒由於在VMW65基因上完全破壞其轉錄激活活性的突變，缺乏有功能的VMW65基因或其有功能的等同物。
6.依照權利要求3的病毒，所述病毒還缺乏有功能的ICP34.5基因或其有功能的等同物。
7.依照權利要求6的病毒，所述病毒由於在VMW65基因上完全破壞其轉錄激活活性的突變，缺乏有功能的VMW65基因或其有功能的等同物。
8.依照權利要求1到7中任一項的病毒，所述病毒至少缺乏一種有功能的立即早期基因。
9.依照權利要求8的病毒，其中所述立即早期基因選自編碼ICP0、ICP4、ICP22、ICP27的基因以及它們的同功物。
10.依照權利要求9的病毒，所述病毒缺乏有功能的編碼ICP4的基因以及有功能的編碼ICP27的基因，並且所述病毒在編碼VMW65的基因上有完全破壞其轉錄激活活性的失活突變。
11.依照權利要求9或10的病毒，所述病毒缺乏有功能的編碼ICP0、ICP4、ICP22和ICP27的基因。
12.依照權利要求3到11中任一項的病毒，所述病毒缺乏有功能的編碼ICP47的基因。
13.依照前面所述權利要求中任一項的病毒，所述病毒包含一個異源基因。
14.依照權利要求13的病毒，其中所述異源基因有效連接到允許所述異源基因在樹突細胞中表達的控制序列。
15.依照權利要求13或14的病毒株，其中所述異源基因編碼治療用途的多肽。
16.依照權利要求13到15中任一項的病毒，其中所述異源基因編碼一種多肽，與非腫瘤細胞相比，所述多肽的表達水平在腫瘤細胞中或在腫瘤細胞表面上增加；或者所述異源基因編碼在腫瘤細胞中或腫瘤細胞表面存在但在非腫瘤細胞中不存在的多肽；或者所述異源基因編碼能夠改進免疫反應的多肽。
17.依照權利要求13到16中任一項的病毒，其中所述異源基因編碼寄生蟲來源、病毒來源或細菌來源的多肽。
18.依照權利要求13到17中任一項的病毒，其中所述異源基因編碼腫瘤抗原。
19.依照權利要求11到17中任一項的病毒，所述病毒包含一種以上的異源基因。
20.依照前面所述權利要求中任一項的病毒，所述病毒能夠有效感染人類樹突細胞，同時不妨礙在所感染的細胞內發生的抗原加工。
21.依照前面所述權利要求中任一項的病毒，所述病毒能夠感染從外周血或骨髓分離或製備的樹突細胞。
22.用依照權利要求1到21中任一項的病毒感染的樹突細胞。
23.依照權利要求22的樹突細胞，所述樹突細胞是人類樹突細胞。
24.依照權利要求1到21中任一項的病毒或依照權利要求22或23的細胞，所述病毒或細胞用於治療人體或動物體的方法。
25.產生依照權利要求23或24的細胞的方法，所述方法包括用依照權利要求1到21中任一項的病毒在體外或體內感染樹突細胞。
26.一種藥用組合物，該藥用組合物包含依照權利要求1到21中任一項的病毒或依照權利要求22或23的細胞，以及一種藥學上可接受的載體或稀釋劑。
27.依照權利要求1到21中任一項的病毒或依照權利要求22或23的細胞的用途，所述病毒或細胞用於生產治療或預防病原感染的藥物，或用於生產治療或預防癌症的藥物，或用於生產在基因治療中使用的藥物。
28.依照權利要求27的用途，它是生產用於治療或預防病毒感染的藥物的用途。
29.依照權利要求18的病毒用途，它是生產用於治療或預防癌症的藥物的用途。
30.依照權利要求27或28的用途，它是生產用於這樣的方法中的藥物的用途在所述方法中所述樹突細胞在感染後送回體內；或者在所述方法中在將所述病毒給予人體或動物體後在體內感染所述樹突細胞。
31.對人類或動物個體進行基因治療的方法或對受治療的動物個體治療或預防病原感染或癌症的方法，所述方法包括給予需要治療的個體有效量的依照權利要求1到21中任一項的病毒或依照權利要求22或23的細胞。
全文摘要
能夠有效感染樹突細胞同時不防止所感染的細胞內抗原加工的減毒皰疹病毒。所述減毒皰疹病毒以及用所述病毒感染的樹突細胞用於治療疾病的免疫治療方法。
文檔編號A61K48/00GK1384884SQ9981137
公開日2002年12月11日 申請日期1999年8月2日 優先權日1998年7月31日
發明者R·S·科芬, B·查因 申請人:拜奧維克斯有限公司