基於納米模擬酶的可視化快速檢測生物酶、蛋白質及其抑制劑的方法與流程
2023-09-20 05:59:05
本發明屬於生物分析領域，具體涉及基於納米模擬酶的可視化快速檢測生物酶、蛋白質及其抑制劑的方法。
背景技術：
生物體內一系列的生化反應中無不具有相應的生物酶的參與。正是這些具有高選擇性、高催化活性的生物酶的調節，生物體才能完成複雜的高級生命活動。例如，乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase,AChE)是中樞神經系統中非常重要的一種生物酶，能夠催化腦內的乙醯膽鹼水解生成醋酸和膽鹼。研究表明，中樞神經系統中乙醯膽鹼酯酶的活性過低會導致乙醯膽鹼的大量累積，從而造成器官損傷甚至死亡。而乙醯膽鹼酯酶的活性如果過高，又會造成中樞神經系統內乙醯膽鹼含量過低，容易引起阿爾茨海默病以及腦硬化。因此，檢測乙醯膽鹼酯酶在生理學上和醫學上有著極為重要的意義。此外，有機磷類的農藥是現代農業中常用的一種高毒性的農藥試劑，它們雖然能夠有效殺滅農業害蟲，但是同樣對人體有著劇烈的毒性，因此檢測殘留在果蔬中的有機磷類的農藥對於人們健康極為重要。研究表明，有機磷類農藥是乙醯膽鹼酯酶的抑制劑，它們能夠高效地抑制其活性，因此，對乙醯膽鹼酯酶活性的檢測也能被用於有機磷類農藥的檢測。除了能夠產生H+的生物酶，還有一些酶能夠在生物催化過程中消耗H+。例如脲酶(urease)，它通過催化尿素水解產生氨氣和二氧化碳。在臨床上，細菌導致的脲酶活性上升往往是許多疾病的發病機制，如肝炎、肝昏迷，感染性結石和消化性潰瘍等。因此，檢測脲酶的活性在臨床上同樣具有極為重要的生理意義。而脲酶的許多抑制劑多是具有環境毒性的物質，對人體健康亦有傷害，因此對脲酶活性的檢測方法同樣可以用於這些高毒性物質的檢測。綜上所述，對生物酶/蛋白質的檢測不僅可以幫助人們對於從分子水平探索某些生理病理過程、信號傳導過程以及某些疾病的發病機制，而且對於治療相關疾病的藥物研究和開發也極具指導和參考價值，也為某些具有環境毒性的物質的檢測提供了新的方法和平臺。
傳統檢測生物酶/蛋白質活性的方法主要集中在高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)、毛細管電泳(Capillary electrophoresis，CE)、質譜(mass spectrum)、螢光成像(Fluorescence imaging,FI)等。然而這些經典方法在檢測生物酶/蛋白質活性時存在許多不足之處。首先，這些方法大多需要昂貴而複雜的儀器，需要專業化的儀器操作員進行操作，因此難以實現現場分析。其次，生物樣品需要複雜的前處理、預富集和分離等步驟，分析時間長，無法實現生物樣品中待測物的快速分析，時間解析度也較差。此外，生理環境異常複雜，許多生物酶/蛋白質在體內的濃度又很低，許多常規檢測手段難以實現其快速測定。因此，十分需要發展一種新型的檢測技術用於生物酶/蛋白質活性的快速、高靈敏、高選擇性檢測。
技術實現要素：
發明目的：本發明針對目前一些生物酶/蛋白質活性檢測方法存在的操作複雜、耗時長、靈敏度較差等現狀，通過利用某些可以模擬天然酶活性的納米材料，發展新原理實現對相關生物酶/蛋白質活性的快速、高選擇性、高靈敏性檢測。
本發明提供了一種可以模擬天然氧化酶活性的納米材料。該納米材料可以像某些天然酶一樣，無需額外的氧化劑(如過氧化氫等)直接利用氧氣實現對某些常用顯色劑的催化氧化，並產生顏色的變化。因此，我們也將該種納米材料稱之為納米模擬酶。利用這類納米模擬酶在模擬天然酶催化氧化顯色劑時其催化能力對pH依賴的特性，通過待測生物酶/蛋白質催化底物反應過程中對檢測試劑的pH值產生的變化，影響納米模擬酶的催化活性，從而得到相應的輸出信號，並通過合理的手段將這種輸出信號讀出，從而實現對待測物的分析。我們還發現在該檢測過程中如果加入某些反應促進劑，可以加速顯色反應的進行，並進一步提高檢測的靈敏度，減低檢測限。
技術方案：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種含有納米模擬酶的檢測試劑，該檢測試劑中包括有納米材料、顯色劑和反應促進劑。
其中，上述納米材料含有金屬或金屬氧化物中的一種或兩種。
其中，上述顯色劑為具有氧化還原特性的化合物。
其中，上述反應促進劑為含有高能磷酸鍵的生物分子，包括腺嘌呤核苷三磷酸，鳥嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸和其類似物中的一種或幾種，優選為ATP。
一種基於納米模擬酶的可視化快速檢測生物酶、蛋白質活性的方法，包括以下步驟：
1)納米模擬酶的製備：利用溼法化學製備能夠模擬天然酶的含有金屬或金屬氧化物的納米材料，經分離、純化並測定其濃度後備用；
2)檢測試劑緩衝液的製備：配製適合pH值及濃度的緩衝溶液待用；
3)檢測生物酶/蛋白質活性的檢測試劑的製備：取一定量的顯色劑、反應促進劑以及被測生物酶/蛋白質的反應底物加入到配製好的緩衝液中，混合均勻後待用；對於能夠釋放H+的生物酶/蛋白質，選用pH為7.0的磷酸緩衝液，而對於能夠消耗H+的生物酶/蛋白質，則選用pH為4.5的磷酸緩衝液；
4)生物酶/蛋白質活性的可視化檢測：將上述檢測試劑與含有待測檢測生物酶/蛋白質的樣品以及一定量的納米模擬酶混合後在37℃下孵育反應，然後根據檢測試劑顏色的變化或通過肉眼觀察對待測生物酶/蛋白質的活性進行半定量的判斷；或通過相應的儀器對待測生物酶/蛋白質的活性進行精確的測定和定量。
其中，上述步驟2)中緩衝溶液為pH為7.0或4.5，濃度為5mM的磷酸緩衝溶液。
其中，上述步驟3)中顯色劑為3,3,5,5-四甲基聯苯胺。
其中，上述生物酶為乙醯膽鹼酯酶和脲酶中的一種。
其中，上述反應促進劑為ATP。
一種基於納米氧化酶可視化生物酶/蛋白質抑制劑活性的方法，所述方法包括步驟1)～3)，還包括步驟4)生物酶/蛋白質對應抑制劑的可視化檢測：將已知活性的生物酶/蛋白質與對應的抑制劑混合後作用一段時間得到混合物，然後將該混合物與上述檢測試劑以及一定量的納米模擬酶混合後在37℃下孵育反應，最後根據檢測試劑顏色的變化或通過肉眼觀察對待測生物酶/蛋白質的抑制劑進行半定量的判斷；或通過相應的儀器對待測生物酶/蛋白質的抑制劑進行精確的測定和定量。
本發明的抑制劑為乙醯膽鹼酯酶抑制劑甲基對氧膦和他克林以及脲酶抑制劑F-。
本發明對待測生理活性小分子的定量檢測原理：該納米材料即納米模擬酶可以利用氧氣直接實現對顯色劑的催化氧化，產生顏色的變化。但是該催化氧化的能力在一定pH範圍內呈現出pH依賴的特性。一般而言，在pH偏中性時，催化能力較弱，產生的顏色較淺，而在pH偏酸性時，催化能力較強，產生的顏色較深。在某些反應促進劑如ATP的存在下，這種催化能力能夠得到有效增強，因此催化反應時間可以大大縮短。利用該特性，通過待測生物酶/蛋白質在催化相應底物反應過程中對溶液pH值的影響，對所用納米模擬酶活性原位進行調控，進行產生不同程度的顏色變化作為信號輸出，最終實現待測生物酶/蛋白質及其抑制劑的分析。
有益效果：本發明中該基於模擬天然酶的納米模擬酶的檢測方法所輸出的物理信號對待測體系中生物酶/蛋白質活性在一定濃度範圍內呈現非常好的線性關係，從而實現對待測目標的高靈敏檢測。該檢測體系幾乎不受其他常見的生物酶/蛋白質的幹擾，因此對目標待測物的檢測有著高度選擇性。此外該方法儀器簡單、操作簡便、成本低廉、需樣量少，既可以實現生物體內相關生物酶/蛋白質的快速可視化檢測，又能夠用於某些對人體健康具有威脅的有毒、有害物質的快速檢測，因此具有很高的實際應用價值。該技術用於這些生理物質檢測具有以下優點：1)該檢測方法對相應生物酶/蛋白質的檢測有著很高的靈敏度，可以滿足生物體內相關生物酶/蛋白質活性的檢測要求；2)選擇性好，其他生物酶/蛋白質活性沒有幹擾；3)反應快速，僅需5-10分鐘即可通過肉眼觀察到檢測試劑顏色的變化；4)操作簡便，僅憑肉眼就可以實現對待測物的半定量分析，依靠儀器則可以實現更加精準的定量；5)成本低廉，一方面，無需特意設計和合成對待測生物酶/蛋白質活性有選擇性響應的螢光探針分子或者其他生物識別單元，另一方面，所使用的納米材料取代了常用的天然酶試劑，使檢測成本得到了極大的降低；6)需樣量很小，檢測操作簡便，分析速度較快，可以實現床旁檢測以及臨場檢測。
附圖說明
圖1納米模擬酶nanoceria對乙醯膽鹼酯酶檢測的工作曲線；
圖2納米模擬酶nanoceria對乙醯膽鹼酯酶抑制劑甲基對氧膦檢測的工作曲線；
圖3納米模擬酶nanoceria對乙醯膽鹼酯酶抑制劑他克林檢測的工作曲線；
圖4納米模擬酶nanoceria對脲酶檢測的工作曲線；
圖5納米模擬酶nanoceria對脲酶抑制劑F-檢測的工作曲線。
具體實施方式
下面對本發明技術方案進行詳細說明，但是本發明的保護範圍不局限於所述實施例。
以納米氧化鈰(nanoceria)為所述納米模擬酶的例子，其化學式為CeO2。
以乙醯膽鹼酯酶及其抑制劑甲基對氧膦(methyl-paraoxon)、他克林(tacrine)和脲酶及其抑制劑氟離子(F-)所述生物酶/蛋白質及其抑制劑的例子。本發明所用試劑均可通過市售獲得。
所用顯色劑為3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)，所用反應促進劑優選為ATP。
本發明實施例中的U為酶活力單位，mU＝10-3U。
實施例1
1)納米模擬酶nanoceria製備：
將2.52g Ce(NO3)3溶解於100mL水和乙二醇的1:1混合溶液中，並加熱攪拌至60℃。然後在攪拌的條件下快速加入16mL新鮮氨水，在60℃下繼續攪拌3小時。將產物離心，並依次用水洗滌並離心3次後得到nanoceria粗產品。將該nanoceria粗產品分散於100mL濃度為15mg/mL的檸檬酸鈉溶液中，超聲30分鐘，待nanoceria與檸檬酸鈉充分作用之後，加入100mL乙醇，攪拌後離心分離，所得產物依次用1:1水和乙醇的混合液洗滌並離心3次後，分散於純水中。待計算、測量得到該分散液中nanoceria的濃度為14mg/mL，將得到的濃度為14mg/mL nanoceria分散液進行稀釋得到濃度為2.5mg/mL的nanoceria儲備液後保存，待用。
2)配製磷酸緩衝液：配製pH分別為7.0和4.5，濃度為5mM的磷酸緩衝溶液待用。
3)配製檢測生物酶/蛋白質活性的檢測試劑：將4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL乙醯膽鹼溶液(1.0M)加入180μL所製備的pH為7.0的濃度為5mM的磷酸緩衝溶液中，混合均勻後加入不同濃度的乙醯膽鹼酯酶(0、7、14、35、70、175、350、700、1400mU)以及1.5μL nanoceria儲備液(14mg/mL)，混合均勻後得到檢測試劑，將該檢測試劑置於37℃的水浴中反應，並利用紫外-可見分光光度計實時記錄652nm處吸光度值的變化。
由圖1可見，在存在乙醯膽鹼酯酶的情況下，652nm處的吸光度值不斷上升，說明所用TMB顯色劑被不斷氧化而顯色。其顯色速度隨著乙醯膽鹼酯酶的濃度上升而上升，說明隨著乙醯膽鹼酯酶濃度的提高，溶液pH的變化加快，TMB被納米模擬酶催化氧化的速度也隨之加快。以檢測時間為600s時，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應輸出(A652)，並將其對乙醯膽鹼酯酶的濃度作圖，其結果如圖1B所示。該檢測試劑在652nm處的吸光度值與所加入的乙醯膽鹼酯酶濃度在一定濃度範圍內呈現出非常好的線性關係(A652＝0.0024×[AChE]mU-1+0.137)，線性範圍為7mU～135mU，其最低檢測限為3.5mU(在該濃度下，其信號響應為噪音的3倍)。此外，通過對照實驗我們也同樣看到在不加入ATP的情況下，該方法對乙醯膽鹼酯酶的檢測靈敏度下降了一半(0.0012vs.0.0024)，檢測限也較高(25mU)，證明了反應促進劑ATP的加入可以顯著提高該方法的檢測性能。
實施例2納米模擬酶技術在乙醯膽鹼酯酶抑制劑甲基對氧膦和他克林檢測中的應用
先將1.5U乙醯膽鹼酯酶與不同濃度的甲基對氧膦(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μM)或他克林(0、0.5、5、50μM)混合後用濃度為5mM的磷酸緩衝液(pH 7.0)定容至50μL，在室溫下反應30分鐘。待酶活性被充分抑制後，用濃度為5mM的磷酸緩衝液(pH 7.0)稀釋該混合液至180μL，隨後加入4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL乙醯膽鹼溶液(1.0M)以及1.5μL nanoceria儲備液(14mg/mL)。混合均勻後將該試劑置於37℃的水浴中反應，並利用紫外-可見分光光度計實時記錄652nm處吸光度值的變化。
從圖2A中我們可以看到，隨著有機磷農藥甲基對氧膦濃度的上升，溶液的顏色也越淺，說明乙醯膽鹼酯酶的活性被甲基對氧膦所抑制，難以催化乙醯膽鹼的水解。以檢測時間為600s時，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應輸出(A652)，並將其與不加抑制劑時所記錄得到的A652的比值對甲基對氧膦的濃度作圖，其結果如圖2B所示。通過A652吸光度值的記錄，我們可以得到甲基對氧膦的準確濃度。利用該方法，如圖2B所示，即使10nM的甲基對氧膦也可以產生明顯的吸光度值的變化，說明該方法對甲基對氧膦的檢測有著很高的靈敏度。
他克林是另一種乙醯膽鹼酯酶的抑制劑，用於阿爾茨海默病的臨床治療。從圖3中我們同樣可以看到，隨著他克林濃度的上升，檢測試劑的顏色依次變淺，652nm處的吸光度值也隨之下降，說明該方法還能用於相關疾病藥物的篩選。
實施例3納米模擬酶技術在脲酶檢測中的應用
將4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL尿素(1.0M)加入180μL所製備的濃度為5mM的pH為4.5的磷酸緩衝溶液中，混合均勻後加入不同量的脲酶(0、7.5、15、37、5、75、187.5、375、750、1500mU)以及3μL nanoceria儲備液(2.5mg/mL)，混合均勻後將該試劑置於37℃的水浴中反應，並利用紫外-可見分光光度計實時記錄652nm處吸光度值的變化。
從圖4中可以看到，在存在脲酶的情況下，檢測溶液652nm處的吸光度值不斷下降。這是因為脲酶水解尿素產生氨而消耗H+，溶液體系pH逐漸升高，納米模擬酶nanoceria的催化氧化能力被逐漸抑制，TMB被催化氧化的速度也隨之減弱。同樣，652nm處的吸光度值與所加入的脲酶濃度在一定濃度範圍內呈現出非常好的線性關係。以檢測時間為600s時，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應輸出(A652)，並將其對脲酶的濃度作圖，其結果如圖4B所示，其線性範圍為0～750mU。此外，比較圖4B以及圖4D我們還發現，不使用ATP時所記錄得到的A652僅為使用ATP時的十分之一，顯示該方法對脲酶的檢測靈敏度下降至原來的十分之一，線性範圍也很窄(0～75mU)，證明了反應促進劑ATP的加入可以顯著提高該方法的檢測性能。
實施例4納米模擬酶技術在脲酶抑制劑F-檢測中的應用
先將1.5U脲酶與不同濃度的F-(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mM)混合後用濃度為5mM的磷酸緩衝液(pH 4.5)定容至50μL，在室溫下反應30分鐘。待酶活性被充分抑制後，用濃度為5mM的磷酸緩衝液(pH 4.5)稀釋該混合液至180μL，隨後加入4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL尿素(1.0M)以及3μL nanoceria儲備液(2.5mg/mL)。混合均勻後將該試劑置於37℃的水浴中反應，並利用紫外-可見分光光度計實時記錄652nm處吸光度值的變化。
從圖5中我們可以看到，隨著有F-濃度的上升，檢測溶液的顏色逐漸上升，說明脲酶的活性被F-所抑制，難以催化尿素的水解，檢測體系的pH變化也當然隨之減弱。以檢測時間為600s時，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應輸出(A652)，並將其與不加F-時的A652的比值對F-的濃度作圖，其結果如圖5B所示。利用該比值，我們可以得到F-的準確濃度。由圖5B所示，我們檢測得到F-能夠對1.5U脲酶的活力抑制一半的濃度約為750μM。這種方法也可以用於其他脲酶抑制劑的篩選。