用於抗瘧疾疫苗的通用t細胞表位的製作方法

2023-09-20 00:25:10 2

專利名稱：用於抗瘧疾疫苗的通用t細胞表位的製作方法
技術領域：
本發明涉及有效誘發針對瘧疾的保護性免疫的疫苗，特別是包含在不同遺傳背景的個體中誘發T細胞應答的通用T細胞表位之疫苗。
背景技術：
目前全世界感染4至5億人口的由瘧疾引起的公共健康問題由於多藥抗藥性寄生物株和殺蟲劑抗性蚊子載體的出現而日趨嚴重。這些發展導致人們更加努力以提供有效的疫苗，從而防止由於瘧疾，特別是惡性瘧原蟲(P.falciparum)造成的死亡和發病。惡性瘧原蟲是毒性最強的瘧原蟲種類。
在哺乳動物宿主中，瘧疾感染是由瘧疾生物的遊動子孢子期開始的，子孢子通過已感染蚊子的叮咬被注射到血液循環中。通過子孢子表面膜的一個主要成分環子孢子(CS)蛋白質與肝細胞表面上的特異性受體之間的相互作用，子孢子定位於宿主的肝細胞。在胞內複製並從破裂的肝細胞中釋放後，寄生物入侵血紅細胞，開始了瘧疾紅細胞循環；此感染階段造成臨床疾病，且對惡性瘧原蟲而言可以致死。
瘧疾疫苗開發主要集中於CS蛋白質，其存在於子孢子和寄生物的肝臟期。特異於CS蛋白質的重複區內免疫結構域B細胞表位(NANP)3肽的單克隆抗體和多克隆抗體可中和嚙齒類、靈長類和人類瘧疾種類的子孢子的感染性(Nardin等人，實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)15620，1982)。然而，因(NANP)3肽在疫苗中的使用僅導致有限的免疫應答，很可能由於低表位密度和/或缺乏合適的T細胞表位(Herrington等人，自然(Nature)328257，1987)。
本發明人利用衍生自4名人類志願者的CD4+T細胞克隆確定了寄生物衍生的T細胞表位，上述四名志願者是通過反覆接觸由惡性瘧原蟲瘧疾感染的蚊子誘發的叮咬處而免疫的。當這些志願者中的三名受到感染性惡性瘧原蟲子孢子攻擊時，如血液期感染的總缺乏所示，他們未受瘧疾感染(Herringto等人，Am.J.Trop.Hyg.45535，1991)。
利用衍生自這些子孢子免疫的志願者的CD4+T細胞克隆，鑑別了兩種T細胞表位，一個位於重複區，一個位於惡性瘧原蟲CS蛋白質的C-末端。包含於重複區N-末端的T細胞表位稱為T1，由交替的NVDPNANP重複組成(Nardin等人，科學(Science)，2461603，1989)。T1表位與含有(NANP)3B細胞表位的羰基端重複區相鄰，但與之抗原性不同。特異性識別源自N-末端重複區的多種組合的肽且含有NVDPNANP的人類CD4+T細胞克隆不能應答(NANP)3重複肽。T1重複表位在目前測序的所有惡性瘧原蟲分離株中均保守，因此，期望將其包含於疫苗中以誘導與不同地理區域中的寄生物反應的免疫應答。
由子孢子特異的人類CD4+T細胞克隆鑑別的第二種T細胞表位包含於惡性瘧原蟲NF54株CS蛋白質的橫跨編號為326-345的胺基酸殘基的肽(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)(Moreno等人，國際免疫(Int.Immunol.)3997，1991；Moreno等人，免疫學雜誌(J.Jmmunol.)151489，1993)。此表位顯示可被細胞毒性的和非細胞毒性的II類限制性人CD4+T細胞克隆和I類限制性CD8+CTL識別。
326-345胺基酸序列的獨特性在於其覆蓋了CS蛋白質的多態區以及保守區RII(Dame等人，科學225593，1984)。保守的RII+含有與肝細胞受體相互作用以起始瘧疾生活周期的胞內期的寄生物配體。肽特異性人CD4+T細胞識別326-345肽內的一系列表位，所有這些表位覆蓋所有瘧原蟲屬(Plasmodium)種類的CS蛋白質中所發現的保守性RII。
通過衍生自經多次接觸瘧疾感染的蚊子的叮咬而免疫的人類志願者之CD4+T細胞定義的T*表位這一事實，暗示此肽序列在接觸子孢子上天然CS蛋白質後經過HLA II類分子的高效加工用於提呈。設想含有此寄生物衍生的T細胞表位之疫苗可誘發在天然感染過的個體中的記憶應答，且能通過在自然條件下連續接觸寄生物維持疫苗誘導的免疫。
在誘導針對瘧疾寄生物前紅細胞期的細胞免疫和體液免疫中，II類限制性CD4+T細胞起中心作用(Nardin等人，免疫學年鑑(Ann.Rev.Immunol.)，11687，1993)。如果合成瘧疾疫苗中含的T細胞表位僅與有限範圍的II類分子結合，則疫苗可能無法在不同遺傳背景的個體中引發免疫反應。早期研究顯示惡性瘧原蟲CS蛋白質的(NANP)3重複在居住於瘧疾地方病區的天然感染個體中誘導低的或無法檢測的T細胞反應(Herrington等人，自然328257，1987；Etlinger等人，免疫學雜誌，140626，1988；Good等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)851199，1988)。
因此，本領域需要包含在致免疫組合物及疫苗中的寄生物衍生的T細胞表位，其結合絕大多數(如果不是全部的話)II類分子，從而在不同遺傳背景的個體中提供針對瘧疾的保護性免疫。
附圖簡述

圖1A為EBV-B 9008細胞與生物素化肽溫育獲得的螢光的直方圖。圖1B為EBV-B 9065細胞與生物素化肽溫育獲得的螢光的直方圖。
圖2A為利用DR4(DRB1*0401)II類分子的肽競爭ELISA的圖示。測試了多種濃度的競爭物肽326-345、T1或(NANP)3，以考察其抑制生物素化指示物肽GFK(A)7與可溶性DR分子結合的能力。肽/MHC複合物被捕獲到抗DR單克隆抗體包被的ELISA板上，經過與HRP-親和素和過氧化物酶底物溫育顯色。圖2B為利用DR13(DRB1*1301)II類分子的肽競爭ELISA的圖示，如圖2A所述進行。
圖3A是利用可溶性DQ9(DQA1*0201/DQB1*0303)II類分子如圖2A所述進行的肽競爭試驗的圖示。圖3B是利用可溶性DQ7(DQA1*0501/DQB1*0301)II類分子如圖2A所述進行的肽競爭試驗的圖示。
圖4A是在用50μg(T1)4MAP腹膜內免疫的小鼠中測得的抗MAPELISA效價的圖示。圖4B是在用50μg(T*)4MAP腹膜內免疫的小鼠中測得的抗MAP ELISA效價的圖示。圖4C是在用50μg(T*T1)4MAP腹膜內免疫的小鼠中測得的抗MAP ELISA效價的圖示。
發明概述本發明包含引發針對瘧疾的保護性免疫的致免疫組合物。該組合物包括第一種瘧疾衍生的含有「通用」T細胞表位的肽，其在不同遺傳背景的哺乳動物中引發抗瘧疾T細胞反應。如此處所用，「不同遺傳背景」的哺乳動物無限制的包括表達多種MHC II類單元型的哺乳動物。在一個實施方案中，通用T細胞表位包含EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列。優選的，本發明的組合物還包括至少一種第二種瘧疾衍生的含有B細胞表位的肽，其在哺乳動物中刺激抗瘧疾抗體的產生。該組合物還可包括額外的T細胞表位。該組合物優選的配製成疫苗，其中還可包含藥學可接受的載體或稀釋劑，以及任選地佐劑。
在另一方面，本發明提供了在易感哺乳動物中用於抑制瘧疾生物繁殖的方法，優選地通過在哺乳動物中引發針對瘧疾的保護性免疫。通過向哺乳動物施用致免疫有效量的致免疫組合物和如上述的疫苗實施這些方法。發明詳述本說明書中引用的所有專利申請、專利及參考文獻均全文引用作為參考。對於不一致的地方，本發明的描述包括定義均加以控制。定義1.「致免疫組合物」是在宿主生物中引發體液和/或細胞免疫反應的組合物。
2.「B細胞表位」如此處所用，是指在哺乳動物宿主中引發特異性抗體(即識別寄生物及免疫原性分子的抗體)產生的肽或其它免疫原性分子或其片段。
3.「通用」T細胞表位如此處所用，是指以II類或I類限制性方式活化T細胞功能的方式結合到多種MHC II類分子上的肽或其它免疫原性分子或其片段。活化的T細胞可以是輔助細胞(CD4+)和/或細胞毒性細胞(II類限制性CD4+和/或I類限制性CD8+)。在一個實施方案中，通用T細胞表位包括EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列。在另一個實施方案中，通用T細胞表位基本上由EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列組成。如此處所用，「基本上組成」表位的肽序列包括這樣的肽，其中的一個或多個胺基酸可以被刪除或替換，但仍保持結合多種MHC II類分子和/或活化攜帶這種分子的細胞之T細胞功能的能力。應當知曉一個或多個胺基酸的刪除或替換可能改變該肽結合一種或多種MHC II類分子的能力，但仍能與多種其它MHC II類分子結合。
瘧疾特異性或寄生物特異性通用T細胞表位可在一般人群中分別增強或誘發天然感染的和未感染的個體中的寄生物特異性T細胞。
4.「衍生自」特定生物或特定多肽的肽表位包括見於特定多肽內的全部或部分胺基酸序列，且由該生物的基因組編碼。應當知曉，當用作致免疫組合物的部分時，此肽之序列相對於其所衍生自的多肽可以改變，而不影響此改變了的肽引發特異於該肽所衍生自的多肽的免疫反應。
5.「多抗原肽」(MAP)指從多聚賴氨酸核形成的肽多聚體，且含有分支的用於肽偶聯的骨架(Tam，免疫學方法雜誌(J.Immunol.Meth.)19617，1996；Nardin等人，免疫學進展(Adv.Immunol.)60105，1995)。
本發明提供了用於引發針對瘧疾，特別是針對惡性瘧原蟲的保護性免疫的致免疫組合物和方法。該組合物包括一種或多種下列成分(i)至少一種瘧疾衍生的肽，其包含能在不同遺傳背景的被接種人中引發抗瘧疾T細胞反應的通用T細胞表位；且(ii)至少一種瘧疾衍生的肽，其包含能刺激針對瘧疾性生物的子孢子期的抗瘧疾(即中和)抗體產生的B細胞表位。優選的，本發明的致免疫組合物包括至少一種B細胞表位和至少一種T細胞表位，最優選的是一種通用T細胞表位。B細胞表位優選地引發特異性識別並結合瘧疾環子孢子(CS)蛋白質的抗體產生。該組合物還可包含衍生自其它瘧疾成分並與之反應的B細胞表位和/或T細胞表位，如稱為Thrombospondin相關粘附(匿名)蛋白質(TRAP)，也稱為子孢子表面蛋白質2(SSP2)的惡性瘧原蟲子孢子表面蛋白質；LSAI；hsp70；SALSA；STARP，Hep17；MSA；RAP-1和RAP-2。
在一個實施方案中，B細胞表位和通用T細胞表位成分摻入到多抗原肽(MAP)中，形成含有高表位密度的合成大分子多肽。用於MAP合成的方法公開於(Tam，美國國家科學院院報，855409，1988；Tam，酶學方法(Meth.Enzymol.)1687，1989)。
本發明包含衍生自瘧原蟲屬的種類的B細胞表位和T細胞表位，包括但不限於惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)、蛋形瘧原蟲(P.ovale)、賴氏瘧原蟲(P.reichenowi)、諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)、大皮瘧原蟲(P.lynomolgi)、巴西瘧原蟲(P.brasilianum)、P.yoelii、柏氏瘧原蟲(P.berghei)和查氏瘧原蟲(P.chabaudi)。表位一般包含衍生自瘧原蟲蛋白質的至少5個胺基酸殘基，優選地至少7個殘基，最優選的至少10個殘基。B細胞表位可用本領域周知的方法鑑別，如通過(i)製備其序列衍生自瘧原蟲種類的CS蛋白質的合成肽；和(ii)在一個模型系統中檢測合成肽引發抗瘧疾抗體的能力。瘧疾特異性B細胞表位和T細胞表位公開於Nardin等人，免疫學年鑑，11687，1993。
在一個優選的實施方案中，本發明的致免疫組合物包括帶有瘧疾B細胞表位(NANP)3的一種肽和帶有由惡性瘧原蟲NF54株CS蛋白質胺基酸殘基編號326-345的胺基酸EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT表示的通用T細胞表位，或由其衍生的免疫原性變體。在另一優選的實施方案中，本發明的致免疫組合物包括(NANP)3、EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT和T1表位。在其它分離株和其它瘧疾種類中的相關序列在327、328、331、335和339位點具有相同的脂肪族殘基和芳香族殘基模式。認為這些殘基代表了在II類或I類分子的肽結合裂隙中用於肽的結合的關鍵錨點。相應的，共有這些結構特徵和/或有效地結合不同的II類或I類分子的涉及EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT的序列可用於本發明。
其它用於本發明的通用T細胞表位可利用下述用於EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT的實驗方法加以鑑別。通用T細胞瘧疾表位的鑑定在本發明實施中，瘧疾特異性通用T細胞表位利用下述一種或多種方法鑑定(i)實驗性測量體外不同的瘧疾衍生的肽與分離的II類多肽之間的相互作用；和(ii)計算機分析不同肽序列以鑑定高親和力II類等位基因特異性基序。將體外測量的相互作用與體內致免疫性相關聯，如當用含有這些T細胞表位的多抗原肽免疫時不同遺傳背景的小鼠的免疫反應所測。類似地，預計含有通用T細胞表位的衍生自惡性瘧原蟲TRAP/SS2的一種肽已被實驗性地顯示在體外結合多種II類分子。這些用於鑑定通用T細胞受體的方法在下面更詳細描述。I.體外試驗材料與方法肽如早先所述進行多抗原肽(MAP)的合成(Tam，美國國家科學院院報，855409，1988)。基於Boc肽化學的固相肽合成用於在利用賴氨酸的α和ε氨基構建的四叉核上合成T細胞表位。構建了2個單表位MAP，其中縮寫為(T1)4的僅含有T1表位(DPNANPNV)2，縮寫為(T*)4的僅含有惡性瘧原蟲NF54株的CS蛋白質的326-345 T細胞表位EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT。也構建了含有T*和T1表位(T*T1)4的四叉雙表位MAP，以帶賴氨酸核遠端的T*表位的36mer序列合成。
氨基端生物素化的T1、326-345和(NANP)3肽均購自AnaSpect(Anaheim，CA)。用HPLC使肽純度高於90％，且用質譜分析證實肽的生物素化。小鼠四隻近交系的6～8周齡小鼠獲自Jackson實驗室，BarHarbor，ME。通過三次腹膜內注射50μg單表位或雙表位的MAP免疫由5～10隻A/J(H-2a)、C57B1/10(H-2b)、BALB/c(H-2d)和C3H(H-2k)系小鼠組成的組，其中MAP在弗氏佐劑中乳化。每次免疫接種後14～22天收集血清用於血清學試驗。血清學試驗ELISA用單表位或雙表位MAP作為抗原進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)(Munesingh等人，歐洲免疫學雜誌，123015，1991)。封閉的MAP包被的ELISA孔與PBS/0.05％Tween/2.5％BSA中2倍稀釋的血清一起溫育。清洗後，用過氧化物酶標記的抗鼠IgG(γ鏈特異)(Kirkeggard和Perry，Gaithersburg，MD)和ABTS(2，2′-連氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉磺酸)/H2O2)作為底物，檢測結合的抗體。利用具有高於免疫前血清平均值+3S.D的O.D值之最終血清稀釋度作為終點，測定每組的幾何平均效價(GMT)。
IFA利用戊二醛固定的惡性瘧原蟲子孢子和FITC標記的抗鼠IgG進行間接免疫螢光試驗(IFA)，以檢測結合的抗體。從按蚊(Anopheles)的唾液腺中分離子孢子，該蚊通過用衍生自體外血液期培養物的惡性瘧原蟲(NF54株)配子母細胞飼養而感染。肽結合試驗肽與表達特定II類分子的細胞的結合生物素化肽與特定單元型的EBV-B細胞或用DR分子轉染的L細胞的結合用流式細胞術評估(Busch等人，免疫學方法，1341，1990)。對提呈肽至T1特異性CD4+T細胞克隆的EBV-B細胞系9065和9008測試其結合生物素化T1、(NANP)3或326-345肽的能力。
對於流式細胞術，在每個U型底96孔板的孔中將EBV-B細胞或L細胞(2×105細胞)與等體積(100μl)生物素化肽(200μg/ml)溫育。在冰上溫和攪拌溫育4小時後，通過清洗去除未結合的肽。為增加螢光信號的靈敏度，用雙層FITC-親合素標記細胞，方法是先與FITC-親合素D溫育，再與生物素化抗親合素D溫育，並再次與FITC-親合素DCS溫育(Vector，Burlingame，CA)。在FACS分析前加入磺化丙錠(2.8μg/ml)以使活細胞上的孔開放(gating)。
肽結合ELISA利用肽結合ELISA測量與可溶性DR或DQ分子相互作用的肽(Hammer等人，實驗醫學雜誌，1802353，1994)。通過用1％NP-40和多種蛋白酶抑制劑混合物進行裂解和提取，從約109EBV-B細胞獲得II類分子。由在Sepharose-蛋白質A-抗II類Mab柱上免疫親和純化細胞提取物中的II類分子，其中柱是利用特異於DR(ATCCHB-55)或DQ(ATCC 144或SPV-L2)分子的Mab構建的。
純合EBV-B細胞系用作每個DR肽競爭試驗的II類分子來源DR1-HOM-2(DRB1*0101)、DR3-WT49(DRB1*0301)、DR4-BSM或PREISS(DRB1*0401)、DR7-EKR(DRB1*0701)、DR8-BM9(DRB1*0801)、DR11-SWEIG(DRB1*1101)和DR13-HHKB(DRB1*1301)。
從L細胞轉染子L416.3分離DR2a(DRB5*0101)分子。用衍生自SWEIG EBV-B細胞的可溶性DQ7分子(DQA1*0501/DQB1*0301)進行DQ肽競爭試驗。在昆蟲細胞中用杆狀病毒表達體系產生DQ9αβ二聚體(DQA1*0201/DQB1*0303)。
在肽結合試驗中，最佳濃度的純化的DR或DQ分子與生物素化指示物肽(在含有2％正辛基葡糖苷的檸檬酸-磷酸緩衝液)、PMSF、EDTA和蛋白酶抑制劑一起加入到96孔板的各個孔。pH7的結合緩衝液用於所有的DQ和DR試驗，除了DRB1*0701結合緩衝液的pH為5。室溫(RT)或37℃溫育過夜後，將肽/II類複合物轉移到用抗DRMabL234抗體(15μg/ml)或抗DQ MabHB144(3.5μg/ml)包被的孔中。經兩小時溫育後，用PBS+1％Tween清洗各孔，通過加入鹼性磷酸酶標記的鏈親和素和底物對硝基磷酸苯酯(Kierkeggard和Perry，Gaithersburg，MD)顯現捕獲得生物素化肽/II類分子複合物。在Titertek MC Multiscan ELISA讀數儀上(Flow labs)用405nm濾光片測定光密度。
為增加靈敏度，已知最佳結合到不同DR等位基因上的生物素化指示物肽用於肽競爭試驗。含有等位基因特異性結合基序的多聚丙氨酸設計物肽用作指示物肽，因為這些肽允許在結合親和中以100倍增加或降低的競爭物檢測。在DR1、4、7和13試驗及在DQ試驗中生物素化Gly-Phe-Lys-(Ala)7(稱為GFK(A)7)用作指示物肽。DR3試驗使用生物素化IAYD(A)5，DR8試驗利用生物素化GYR(A)6L指示物肽。利用生物素化肽UD4即設計用於最優結合所有DR4同種異型體的YPKFVKQNTLKAA也進行了DR4競爭試驗。利用髓鞘鹼性蛋白質MBP的生物素化肽也測量了與DR2(DRB5*0101)分子的結合。
對於肽競爭試驗，最佳濃度的生物素化指示物肽(0.1μM-5μM)與10倍稀釋的未標記的競爭性肽T1、胺基酸326-345或(NANP)3(0.01μM-100μM)溫育。在每個競爭性試驗中，包括作為陽性對照的一種未標記的特定II類結合特異性肽，以測定相對親合性。未標記的競爭物肽與生物素化指示物肽競爭結合II類分子的能力通過測量光密度(O.D.)顯示。用公式
計算抑制百分率。測定了需要抑制生物素化指示物肽結合之50％的競爭物肽的濃度(IC50)，且當IC50小於100μM作為肽與II類分子結合的指示。結果CS T細胞表位同與細胞結合的II類分子之結合人CD4+T細胞克隆衍生自子孢子免疫的志願者，其在DR或DQII類分子中識別惡性瘧原蟲CS蛋白質的T細胞表位。特異於惡性瘧原蟲CS蛋白質的326-345T細胞表位(T*)的克隆由多種DR等位基因限制，包括DR1、DR4、DR7或DR9。最近明確了位於惡性瘧原蟲CS蛋白質重複區的T1表位的遺傳限制。特異於DQ而非DR分子的單形決定簇的單克隆抗體明顯抑制T1肽特異性T細胞克隆的增殖反應。當表達子孢子免疫的T細胞供體(DRB1*1502/*1301，DQB1*0602/*0603)的DR/DQ單元型被用作APC時，僅有表達DQB1*0603的細胞可提呈T1肽至T細胞克隆。
然而，從對遺傳限制的研究得到的CS肽特異性T細胞數目受到子孢子免疫的志願者數目少的局限。為了獲得關於在T1和326-345T細胞表位的提呈中有潛在功能之II類分子的範圍的其它信息，利用確定的單元型或DR轉染子進行體外結合試驗。a).利用特定II類單元型的EBV-B細胞的結合試驗為了測定已知單元型的EBV-B是否能用於篩選可結合CS蛋白質的分子，檢測細胞系與生物素化T1和326-345肽的結合。已知幾乎不被人T細胞識別的生物素化(NANP)3肽也進行檢測。已知一個表達DR4(BSM)和一個表達DR7(EKR)的這兩個EBV-B細胞系均作為APC能行使將326-345肽提呈至DR4和DR7限制性T細胞克隆的功能。如流式細胞術所測，結合到BSM和EKR細胞系上的生物素化326-345肽分別帶有平均螢光通道值(MFC)251和242。然而，未獲得可檢測到的與這些細胞結合的T1表位或生物素化(NANP)3肽(MFC＜35)。
在反轉的試驗中，檢測了已知能作為針對T1肽特異性T1細胞克隆的APC行使功能的EBV-B細胞系其結合可檢測水平的生物素化CS肽的能力。未測得生物素化T1肽與EBV-B細胞系9008和9065的結合(圖1A和圖1B)，這些細胞系表達DRB1*1501/DQB1*0602/0603和DRB1*1301/DQB1*0603單元型。相反，326-345肽分別以MFC403和758與這兩類EBV-B細胞(9008或9065)結合。b).結合DR轉染的L細胞由於EBV-B細胞表達多種II類同型體，用326-345肽獲得的陽性螢光可反應出與DR和/或DQ，或其它HLA分子結合。通過測量生物素化CS肽與DR轉染的L細胞的相互作用，測定了肽結合的II類特異性。
在不同轉染子表面上的DR之表達水平與在EBV-B細胞上觀察到的類似，用抗DR(L243)單克隆抗體染色後其MFC範圍從443-964。
表1生物素化瘧疾肽與DR轉染的鼠L細胞的結合<
>a生物素化CS肽(100μg/ml)與由DRA1*0101和DRB1*0401、*0701或*1501基因轉染的鼠L細胞結合，用FACS測量。結果表示為平均螢光通道值(MFC)。
b在各個轉染子上II類表達的證明，是用特異於人II類分子(MabL234)或陰性對照Mab(3D11)(50μg/ml)的Mab染色。
當生物素化T1肽或(NANP)3肽與DR轉染的細胞系溫育時未觀察到明顯的螢光。生物素化326-345肽結合用DRB1*0401和*0701轉染的細胞，MFC分別為217和203，這與特異於326-345肽的DR4及DR7限制性CD4+T細胞克隆的等位基因特異性一致。此外，326-345肽也顯示與DRB1*1501轉染的L細胞結合(MFC167)，這與觀察到的同DR15陽性9008EBV-B細胞系的結合一致(圖1A)。CS T細胞表位與可溶性II類分子的結合為了測量肽結合親和力，且為了排除與表達在人和鼠細胞系上的非MHC細胞表面分子的非特異性相互作用，利用可溶性II類分子進行肽競爭結合試驗。
1.DR分子為了增加肽結合試驗的靈敏度和特異性，利用生物素化指示物肽GFK(A)7進行競爭試驗，該肽是一種與DR分子有高親和力的多聚丙氨酸肽，其親和力可經受具100倍親和力的肽競爭。如多種濃度的冷競爭物肽的劑量反應曲線所示，326-345肽(不是T1或(NANP)3肽)可有效抑制生物素化GFK(A)7指示物肽與可溶性DR4分子結合(圖2A)。
在用可溶性DR13分子(圖2B)的肽競爭試驗中檢測326-345肽時可獲得類似的結果。抑制50％的生物素化GFK(A)7肽結合(IC50)所需的326-345肽濃度與DR4(IC500.2μM)和DR13(IC500.33μM)肽競爭試驗中相類似。無論T1肽還是(NANP)3肽在最高測試濃度均不能檢測到抑制(IC50＞100μM)。
利用所選的針對各DR等位基因有最佳結合的不同生物素化指示物肽，進行了一系列肽結合競爭試驗，結果總結於表2。
表2利用可溶性DR分子的肽結合競爭試驗
a結果以IC50表示，即抑制50％的生物素化指示肽結合所需的未標記的競爭物肽的濃度(μM)。抑制百分率的計算基於存在不同濃度的競爭性肽(100-0.001μM)時獲得的O.D。IC50＜100μM表示陽性肽結合。
衍生於流感血凝素的已知為陽性競爭物肽的HA307-319也包括於每次試驗中，目的是為了確定CS肽與每個DR等位基因結合的相對親和力。
基於這些試驗，326-345肽可顯示與編碼DR1、DR4、DR7、DR8、DR11和DR13 II類分子的DRB1*基因產物結合(圖2，表2)。對於由DRB5*0101(IC5080μM)編碼的DR3分子(IC5070μM)和DR2a分子的結合，326-345肽是弱競爭物。對於在肽結合試驗中測試的任何一種可溶性DR分子均未能檢測到與T1肽或(NANP)3肽的明顯結合。
如IC50以及與HA307-319肽相比的相對親和力的測定，326-345肽與各個DR基因結合的親和力均不同。在DR4、7、8等位基因中，326-345CS肽的結合與通用HA肽類似，其IC50的HA307-319/CS326-345比例分別為1.4、0.25和0.5。然而，326-345肽與DR1和DR11結合的相對親和力較低，IC50比例分別為0.005和0.025。
2. DQ分子DR結合試驗的結果表明326-345肽可結合多種DR分子，而T1肽和(NANP)3肽不能與測試的任何DR分子有高親和力的結合。為測定是否DQ-6限制性T1表位可結合到其它DQ等位基因，利用可溶性DQ分子進行肽競爭。
構建了用於肽競爭試驗的可溶性DQ7(DQA1*0501/B1*0301)和DQ9(DQA1*0201/B1*0303)分子。在每個試驗中包含一種衍生自不變鏈的胺基酸83-101的已知DQ結合肽CLIP83-101，以測定CS與可溶性DQ分子的結合的相對親和力。
已知與DQ6分子結合的T1肽不能與DQ7或DQ9分子結合(圖3)。類似地，(NANP)3肽不能與CLIP83-101肽競爭結合其它DQ等位基因。
相反，326-345肽可與CLIP肽競爭結合DQ分子。利用可溶性DQ9分子的競爭性試驗中，326-345肽的IC50為2μM，結合親和力在用CLIP83-101肽獲得的範圍中(IC50，0.5μM)(圖3A)。用DQ7分子也能檢測到326-345肽的結合(IC5020μM)，雖然與CLIP肽相比其肽/DQ分子相互作用的親和力較弱(IC500.5μM)。含有T*T1表位的合成肽疫苗的免疫原性a.用含CS T細胞表位的單表位MAP免疫接種肽結合試驗的結果表明326-345肽能與寬範圍的II類分子結合，而T1肽在T細胞試驗中顯示僅與DQ6分子可檢測的結合。為了測定326-345肽與T1肽的寬及窄的遺傳限制性是否與體內的致免疫性相關，在不同系的小鼠中測定針對含有326-345表位或含有T1表位的多抗原肽(MAP)的免疫反應。初步研究測得326-345表位含有B細胞表位及T細胞表位，因此用抗MAP抗體反應作為在MAP免疫的小鼠中的功能性II類限制性T輔助細胞指示物。
與體內326-345肽對多種II類分子的結合相符，僅含326-345序列的單表位MAP(縮寫為T*)在所有測試的4個種系小鼠中引發抗肽反應(圖4B)。反應的大小為遺傳限制性的，在BALB/c(H-2d)和C57B1(H-2b)中獲得高水平抗肽抗體，在A/J(H-2a)小鼠中為中等水平。所有高度和中度反應種系的小鼠在用326-345MAP免疫後均產生相似水平的抗肽抗體(SEM＜10％)。然而，在C3H(H-2k)中獲得的抗體反應較低且多變，僅有2/5的MAP免疫的小鼠以可檢測到的抗體水平應答。
相反，應答含有326-345表位的(T*)4MAP時，含有T1表位的單表位MAP僅在一隻H-2b小鼠中引發抗肽抗體反應(圖4A)，這與先前公開的結果相符(36)。應答T1表位NH2-末端重複的小鼠的遺傳限制因此與觀察到的(NANP)3序列的羧基端重複相同，其帶有僅由C57B1(H-2b)小鼠識別的T輔助細胞。
為了測定由含重複T1或326-345序列羧基端的MAP引發的抗肽抗體能否識別惡性瘧原蟲子孢子上的CS蛋白質，進行間接免疫螢光試驗(IFA)。已發現，用含有惡性瘧原蟲CS蛋白質的羧基端序列的MAP構建體免疫接種，經常會引發不能與子孢子反應的高水平的抗肽抗體。與這些早期發現相符，僅那些識別CS蛋白質重複區的抗MAP抗體與子孢子反應。因此，雖然用(T*)4免疫接種的BALB/c小鼠產生最高的抗326-345抗體效價(ELISA GMT 163,840)，但未檢測到與惡性瘧原蟲子孢子的反應性(IFA＜80)。相反，應答用單表位(T1)4MAP免疫的單一鼠種系C57B1可產生與惡性瘧原蟲子孢子相類似的抗T1肽ELISA效價(GMT 327,680)和IFA效價(163,840)，其中單表位(T1)4MAP含有NH2-末端重複T細胞表位(圖3A)。
b.用雙表位MAP免疫接種肽結合試驗的結果以及在不同小鼠種系中的免疫原性研究表明326-345肽可為多種人和鼠II類分子識別。為了測定在合成疫苗中包括326-345T細胞表位是否能克服應答惡性瘧原蟲CS蛋白質重複區的免疫遺傳限制性，合成了一個含有與T1表位串聯的326-345表位的雙表位(T*T1)4MAP。
在用(T*T1)4MAP免疫的小鼠中抗MAP抗體的反應表明(如用單表位(T*)4MAP所發現的)所有4個種系的小鼠應答免疫接種且產生高水平的抗肽抗體(圖4C)。在不同種系中抗(T*T1)4MAP抗體反應的數量級顯示如用單表位(T*)4MAP免疫的小鼠中獲得的相同序位，即BALB/c，C57B1＞A/J＞C3H。
在雙表位免疫的小鼠中抗MAP抗體反應的動力學十分迅速(圖4C)。在C57B1小鼠中單劑量的(T*T1)4MAP後可檢測到高於105的抗MAP效價。在C3H小鼠中觀察到最低的抗體效價；然而，與用單表位MAP免疫的小鼠相反，所有用雙表位(T*T1)4MAP免疫的小鼠中產生抗MAP抗體。
更重要地，抗體反應的精確特異性的分析表明用(T*T1)4MAP免疫的所有種系的小鼠均產生與惡性瘧原蟲子孢子反應的抗體(表3)。如用先前含有惡性瘧原蟲CS蛋白質重複的MAP構建體所示，如(T1)4MAP ELISA所測，抗重複抗體水平與用雙表位MAP免疫的小鼠血清對惡性瘧原蟲子孢子的反應性正相關。
表3.用雙表位(T*T1)4MAP免疫引發的抗體的精細特異性
結果以對第三次腹膜內(i.p.)注射在弗氏佐劑中的(T*T1)4MAP獲得的血清之GMT表示。用雙表位或單表位MAP作為抗原進行ELISA。IFA基於戊二醛固定的惡性瘧原蟲(NF54)子孢子。
在不同小鼠種系中引發的抗重複和抗子孢子抗體的數量級反應了326-345表位的遺傳限制性模式。對單表位(T*)4MAP的高反應物(C57B1、BALB/c、A/J)和低反應物(C3H)在用雙表位MAP免疫後的抗子孢子抗體產生中也是高反應物和低反應物。疫苗本發明的組合物也可在敏感宿主中用作引發免疫的免疫原，包括保護性免疫。免疫可包括在宿主(或在另一宿主或體外，作為被動免疫)中引發抗體的產生，其將識別且結合到瘧原蟲細胞。免疫也可包括瘧疾特異性T細胞的活化。因此，包括通用T細胞表位的致免疫組合物可用於疫苗製劑，以通過防止(總體上或部分上)在宿主中的疾病傳播賦予預防或治療性免疫，如通過抑制生物的前血紅細胞期的發育。
應當指出，對這些有用的材料，不必由致免疫組合物(或由含有它的疫苗，或由一種抗體)在瘧疾感染或增殖的任何階段達到100％抑制。在感染的程度(如通過寄生物血症的程度測得)中任何實質性下降均能實際上減弱臨床症狀和實際上增加宿主存活和恢復的可能性。
本領域已知多種用於疫苗製劑的多種方法。一般，疫苗製成可注射的液體溶液或懸浮液。也可製成適於注射前溶解或者懸浮的固體形式。也可為乳化製劑，或是包被於脂質體中的蛋白質形式。活性免疫原性成分可與賦形劑混合，如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如需要，疫苗可以含有小量輔助物，如保溫或乳化劑、pH緩衝劑和/或增強疫苗效力的佐劑。致免疫組合物也可在摻入脂質體或其它微載體中後施用。
也可需要重複免疫以使宿主累積產生免疫反應。免疫原的量和免疫接種方案均可由實驗決定，如本領域周知，利用動物(如靈長類)模型，隨後在人中臨床測試。關於疫苗組合物和免疫接種的信息描述於如美國專利No.4,767,622(Ristic，1988年8月30日)；美國專利No.4,735,799(Patarroyo，1988年4月5日)和Pataroyo，M.E.等人，自然，332158，1988；以及Wellcome基金會公開的歐洲申請A.250,261(1987年12月23日公開)。
疫苗可通過皮下、肌肉內、口腔內、皮內或鼻內路徑施用。劑量範圍可從約5μg至約5mg每劑，可應用單次或多次劑量方案。施用的量、次數和施用方案可由經驗決定，如通過建立劑量和頻率矩陣，並將一組實驗單元或主體與矩陣中的各點相比較。
本發明也提供在敏感哺乳動物中抑制瘧疾生物增殖的方法，其包括向哺乳動物施用含有一種或多種下列成分的致免疫有效量的致免疫組合物(i)至少一種瘧疾衍生的含有B細胞表位的肽，其中的B細胞表位能刺激針對生物子孢子期的抗瘧疾抗體(如中和)的產生；和(ii)至少一種瘧疾衍生的肽，其包含能在不同遺傳背景的接種者中引發抗瘧疾T細胞反應的通用T細胞表位。致免疫有效量是如上述測得的能有效引發針對瘧疾生物的保護性免疫的量。在另一方面，該組合物可施用於已接觸過瘧疾生物的哺乳動物。在另一方面，多肽可在該哺乳動物接觸瘧疾生物之前施用於哺乳動物。
下列實施例意在用作本發明的非限定性闡述。實施例1含有MAP的抗瘧疾疫苗在不同遺傳背景的小鼠中的研究顯示含有T*表位(見上)的肽基疫苗在無佐劑時(即當在磷酸鹽緩衝液中單獨施用)為免疫原性的。
通過添加佐劑(如明礬(Rehydragel，ReheisNJ)或QS21(CambridgeBiotech，Cambridge MA))獲得增強的抗體反應。
典型的包含MAP的抗瘧疾疫苗帶有1mg與100μgQS21混合的(T*T1B)4MAP。此疫苗由皮下注射施用。實施例2在人中引發CS特異性抗體進行下列研究以檢查對多種不同遺傳背景的人用含通用T細胞表位的疫苗的免疫效果。
方法合成了一種稱為(T1BT*)4-P3C的多肟(polyoxime)合成瘧疾疫苗。疫苗含有如上述的通用T細胞表位(T*)且與衍生自惡性瘧原蟲CS重複的28個殘基重複序列(DPNANPNV)3(NANP)3(稱為T1B)相結合。疫苗也含有一種連接到賴氨酸核的共價連接的合成佐劑三棕櫚醯半胱氨酸(Pam 3CyS)。用於致免疫多肟組合物合成的方法公開於國際專利申請WO 94/25071。用於含T*多肟合成的方法公開於共同未決申請號＿＿＿＿，其於1996年12月24日提交，基於臨時申請No.60/034,506。
向表達寬範圍II類單元型的10個人類志願者皮下施用疫苗(無額外的佐劑或乳化劑)。在第0天和第28天接種。在免疫接種前於第14天和第42天獲得血清。
用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定抗體效價，採用的板由三表位多肟免疫原(T1BT*)4或僅含有CS重複(T1B)4的雙表位MAP包被。將板與2倍系列稀釋的血清(自180稀釋度開始)溫育，然後洗板，且與過氧化物酶標記的抗人IgG反應。由加入過氧化物酶底物(ABTS)且測量410nm處光密度(OD)顯示結合的抗體存在。終點效價代表免疫血清的最終稀釋度，其中血清的O.D值大於獲自免疫接種前十名志願者血清的平均O.D值+3標準偏差。
結果如表4所示，單劑量免疫接種14天後，在50％的接種者中可檢出特異於多肟免疫原的抗體。於第28天施用第二次多肟疫苗，在多數接種者血清中可檢出增加的抗肽抗體應答和陽性反應。此外，如利用(T1B)4MAP進行的ELISA所示，可檢出特異性地與CS重複反應的抗體。惡性瘧原蟲CS蛋白質的重複區是可中和子孢子感染的保護性抗體的目標，方法是通過在哺乳動物宿主中阻斷宿主肝細胞的入侵且阻止瘧疾生活周期的開始。最後，在第二劑疫苗施用後，所有個體均有陽性IgM反應。
表4不同HLA單元型志願者中含有T*惡性瘧原蟲通用T細胞表位的多肟疫苗的免疫原性
a.在皮下注射1mg(T1BT*)4多肟疫苗後+14天收集的血清中測量初級IgG抗體反應。次級IgG抗體反應則在第28天第二次注射疫苗後的+14天收集的血清中測量。
這些結果表明，在所有接種者中，含有通用T細胞表位的疫苗能引發特異於惡性瘧原蟲CS蛋白質的IgG或IgM抗重複抗體。因此，含有這種通用表位克服了針對CS重複的免疫反應的遺傳限制性，且提供了一種在不同遺傳背景的個體中有免疫原性的合成肽疫苗。
權利要求
1.一種致免疫組合物，其包含第一種含有通用T細胞表位的瘧疾衍生肽，其中該組合物在不同遺傳背景的哺乳動物中引發抗瘧疾T細胞反應。
2.如權利要求1所定義的致免疫組合物，其還包含第二種含有B細胞表位的瘧疾衍生肽，其中B細胞表位在哺乳動物中刺激抗瘧疾抗體的產生。
3.如權利要求1所定義的致免疫組合物，其中所述第一種肽摻入到多抗原肽中。
4.如權利要求2所定義的致免疫組合物，其中所述第一種和第二種肽摻入到多抗原肽中。
5.如權利要求1所定義的致免疫組合物，其中所述第一種肽含有EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT的序列。
6.如權利要求1所定義的致免疫組合物，其中所述第一種肽基本上由EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列組成。
7.一種含有如權利要求1所定義的致免疫組合物及藥學可接受的載體或稀釋劑的疫苗。
8.如權利要求7的疫苗，其還包含藥學可接受的佐劑。
9.一種在敏感哺乳動物中抑制瘧疾生物增殖的方法，其包括向該哺乳動物施用致免疫有效量的如權利要求7所定義的疫苗。
10.一種在哺乳動物中引發針對瘧疾的保護性免疫的方法，其包括向該哺乳動物施用致免疫有效量的如權利要求7所定義的疫苗。
11.一種致免疫組合物，其包含帶有EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列的第一種瘧疾衍生肽，其中所述組合物在不同遺傳背景的哺乳動物中引發一種抗瘧疾T細胞反應。
12.如權利要求11所定義的致免疫組合物，其還包含帶有B細胞表位的第二種瘧疾衍生肽，其中B細胞表位在哺乳動物中刺激抗瘧疾抗體的產生。
13.一種包含如權利要求11所定義的致免疫組合物和藥學可接受的載體或稀釋劑的疫苗。
14.如權利要求13所定義的疫苗，其還包含藥學可接受的佐劑。
15.一種在敏感哺乳動物中抑制瘧疾生物增殖的方法，其包括向所述哺乳動物施用致免疫有效量的如權利要求13所定義的疫苗。
16.一種在哺乳動物中引發針對瘧疾的保護性免疫的方法，其包括向所述哺乳動物施用致免疫有效量的如權利要求13所定義的疫苗。
全文摘要
本發明提供了引發針對瘧疾的保護性免疫的方法和組合物。特別地,本發明涉及在不同遺傳背景的個體中引發T細胞反應的通用T細胞表位。也公開了包含瘧疾特異性通用T細胞表位的致免疫組合物和疫苗。
文檔編號C07K7/08GK1244126SQ98801959
公開日2000年2月9日 申請日期1998年1月21日 優先權日1997年1月21日
發明者E·納丁, A·莫萊諾 申請人:紐約大學