一種at選擇性高頻率誘變的方法

2023-09-19 18:15:30

專利名稱：一種at選擇性高頻率誘變的方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及人工誘變基因技術，與體外基因定向進化有關。
背景技術：
分子生物學和基因工程的快速發展使人們能夠使基因在異源寄主中進行表達。然而，當富含AT基因在這些富含GC基因組的寄主中表達時，往往會遇到低表達或不表達的問題，其原因不是由於基因表達元件有問題，而是密碼識別系統的差異。為解決這個問題，人們不得不根據寄主使用密碼組合偏愛性(bias)人工合成能被寄主所識別的高GC含量基因，從而達到高表達這一目的。這一工作耗資大，勞動強度大。儘管如此，由於這一傳統做法是基於密碼子的簡併性，在合成過程中只改變核苷酸組成而並沒有改變胺基酸序列，故只能解決表達量的問題，並不能改變生物活性物質的自然屬性，如生物活性、溶解度、特異性以及作用pH、溫度等問題。另一方面，生物分子自然屬性來自於漫長的自然進化，這些自然屬性往往在實際應用中受到限制。人們為改變生物分子的自然屬性，相繼建立了體外分子進化技術，如體外DNA片段重組(DNA shuffling)，參見Stemmer，W.P.Ripid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.Nature，1994 370389-391，易錯PCR(Leung，D.W，Chen，E.and Goeddel，D.W，A method for random mutagenesis ofa defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction.Techniques，1989，1，11-15)等。這些技術可使DNA分子在體外產生分子間的重排或隨機突變。但是，都不能選擇性地將AT轉變為GC。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，利用dUTP作為媒介，通過PCR方法使AT鹼基轉換為GC從而富集基因的GC含量。利用這一技術，使富含AT的基因增加GC含量的同時，還可獲得改變自然屬性的體外改良分子。
本發明通過以下方案實施一種AT選擇性高頻率誘變的方法，以dUTP為媒介進行第一輪PCR，得到含dUMP的雜合DNA分子；以該DNA分子為模板，進行第二輪PCR；通過部分U與G配對，獲得AT鹼基分別被GC替換的突變DNA分子。
為了提高突變頻率，第二輪PCR是以含有dUMP的雜合DNA分子為模板，在Mn++存在下進行的，其中的Mn++是Mgcl2，其用量為0.5mM。
本發明的具體步驟包括1)使用dUTP部分取代dTTP進行PCR擴增；2)在dUTP存在下，降低dTTP濃度，使新合成鏈中dUMP取代dTMP；3)在dUTP存在下，降低dATP濃度，增加dGTP濃度，使新合成鏈中dUTP與dGTP配對，部分A和T通過dUMP介導被G和C取代。
在本發明中，可以向第一輪PCR反應系統增加一種極性溶劑(例如聚己二醇，最好是聚己二醇3500降低鹼基配對特異性，使新鏈合成過程中讓U與G配對，這樣有助於實現AT轉換為GC這一目的。
更詳細的技術方案如下所述1、利用dUTP介導使AT轉換為GC
在PCR過程中，通過限制dTTP濃度，讓Taq DNA聚合酶催化dUTP取代dTTP摻入到DNA分子形成雜合DNA分子。由於限制了dATP的濃度，使DNA合成過程中，降低了dATP與dUMP配對的機會，相反，增加了dGTP與dUTP配對的機率。同時，加入強極性化合物聚己二醇增加反應介質的極性，讓dGTP更易與模板鏈中的dUMP配對，使編碼鏈中的A被G取代，T被C所取代，最終達到部分AT被GC取代的目的。
2、dUTP介導AT轉換GC的誘變的具體方法該方法是通過以下兩輪PCR程序得以實現1)第一輪PCR10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，貨號Cat.No.201203) 5μlMgcl2(25mM) 7μlPEG3500(5mM) 5μldUTP(10mM) 2.5μldGTP(10mM) 2.5μldCTP(10mM) 1μldTTP(100μM) 2μldATP(100μM) 8μl模板DNA1μl正向引物(10μM，根據目標分子設計) 1μl反向引物(10μM，根據目標分子設計) 1μlTaq DNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl) 1μl加無離子水至 50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分鐘，25個循環。
PCR產物的純化上述PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行分離(ManiatisT，Fritsch，E.F，Sambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1982 150-160，coldSpring Harbor Laboratory)。DNA純化過程採用Qiagen公司試劑盒(QIAEX II Gel extraction kit，Cat.No.20021)進行。純化過程為用刀片在紫外燈下取出PCR產物譜帶，放入1.5ml離心管，加入3倍體積的3M NaI，置55℃保溫10分鐘使瓊脂糖凝膠完全溶解，上純化柱(購自Quagen公司，Cat.No.20021)，將柱放入2mL離心管，以8000轉/分鐘離心30秒，棄去流出液，加750ul緩衝液PE(購自Qiagen公司，Cat.No.20021)洗柱，以14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，加50uL去離子水，以14000轉/分鐘離心2分鐘，收集DNA流出液。
2)第二輪PCR10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，貨號Cat.No.201203)5μldNTP(10mM)1μl第一輪PCR產物 1μl正向引物(10μM，同第一輪PCR) 1μl反向引物(10μM，同第一輪PCR) 1μlTaq DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl加無離子水至 50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分鐘，25個循環。
酶解PCR產物用限制性內切酶NcoI/BglII(購自New England Bilabs公司)酶解，酶解反應(50μl)含有5μl 10X酶解緩衝液(購自New England Bilabs公司)，20μl PCR產物，1-2μl限制性內切酶NcoI/BglII，加水至終體積為50μl，在37℃下保溫2-5小時。
酶解產物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒(QIAquick PCR purification kit，Cat.No.28104)及操作程序進行.具體過程是取150μl PB緩衝液(購自Qiagen公司，與50μl酶解產物混合，上純化柱(購自Qiagen公司)，以14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，再加750μl PE緩衝液(購自Qiagen公司)，用14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，最後，加50μl無離子水，用14000轉/分鐘離心1分鐘，離心收集純化酶解DNA。
連接20μl連接反應含有2μl 10X連接緩衝(購自Qiagen公司)，2-4μl預先用NcoI/BglII酶解的pQE60載體(購自Qiagen公司)，2-4μl酶解PCR產物，1μl T4DNA連接酶(購自Qiagen公司)，加水至終體積20μl，放4℃保溫過夜。
轉化將20μl連接混合物與100μl大腸桿菌感受態細胞DH5α(購自New England Biolabs公司)混合，冰浴放置30分鐘，42℃處理90秒，加800ul液體LB培養基(其中含1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，37℃保溫1小時。鋪含100μg/ml氨苄青黴素固體LB培養基(1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)平皿，37℃保溫12小時，獲得含AT突變文庫(見圖1)。
2、高頻隨機突變方法以含有dUMP的雜合DNA分子為模板，在不同Mn++濃度進行PCR擴增，其過程如下1)第一輪PCR10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，貨號Cat.No.201203)5μlMgcl2(25mM) 7μldUTP(10mM)2.5μldGTP(10mM)2.5μldCTP(10mM)1μldTTP(100μM) 2μldATP(100μM) 6，8.10μl模板DNA 1μl正向引物(10μM，根據目標分子設計) 1μl反向引物(10μM，根據目標分子設計) 1μlTaq DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl加無離子水至 50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分鐘，25個循環。PCR產物的純化1)第二輪PCR以第一輪PCR產物作為模板，用Mn++離子取代Mg++離子作為Taq DNA聚合酶輔基進行PCR擴增。10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203) 5μlMncl(5mM)5μldNTP(10mM)1μl第一輪PCR產物 1μl正向引物(10μM，同第一輪PCR) 1μl反向引物(10μM，同第一輪PCR) 1μl
Taq DNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)1μl加無離子水至 50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分鐘，25個循環。
酶解PCR產物用限制性內切酶NcoI/BglII(購自New England Bilabs公司)酶解，酶解反應(50μl)含有5μl 10X酶解緩衝液(購自New England Bilabs公司)，20μl PCR產物，1-2μl限制性內切酶NcoI/BglII，加水至終體積為50μl，在37℃下保溫2-5小時。
酶解產物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒(QIAquick PCR purification kit，Cat.No.28104)及操作程序進行.具體過程是取150μl PB緩衝液(購自Qiagen公司，與50μl酶解產物混合，上純化柱(購自Qiagen公司)，以14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，再加750μl PE緩衝液(購自Qiagen公司)，用14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，最後，加50μl無離子水，用14000轉/分鐘離心1分鐘，離心收集純化酶解DNA。
連接20μl連接反應含有2μl 10X連接緩衝(購自Qiagen公司)，2-4μl預先用NcoI/BglII酶解的pQE60載體(購自Qiagen公司)，2-4μl酶解PCR產物，1μl T4DNA連接酶(購自Qiagen公司)，加水至終體積20μl，放4℃保溫過夜。
轉化將20μl連接混合物與100μl大腸桿菌感受態細胞DH5α(購自New England Biolabs公司)混合，冰浴放置30分鐘，42℃處理90秒，加800ul液體LB培養基(其中含1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，37℃保溫1小時。鋪含100μg/ml氨苄青黴素固體LB培養基(配方如下1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)平皿，37℃保溫12小時，獲得含高頻率突變文庫(見圖1)。
本發明的積極效果是AT選擇性誘變方法突變頻率為0.86％.其中AT轉換為其它鹼基數佔總突變鹼基數的96.5％；高頻率誘變方法的突變率為4.0％。其中AT轉換為其它鹼基數佔總突變鹼基的90.4％。是一種經濟、實用高頻率定向誘發基因突變的方法，該方法可用於體外分子的改良。


圖1是本發明方法的技術流程圖。
圖2是本發明的AT選擇性誘變方法對135031個鹼基進行誘變分析的結果圖。
圖3是本發明的高頻隨機誘變方法對綠色螢光蛋白誘變的結果圖。
圖4是本發明的AT選擇性誘變方法對AlbD酯酶基因進行體外改良的結果圖。
具體實施例方式
實施例1利用AT選擇性誘變方法對綠色螢光蛋白基因的誘變以含有綠色螢光蛋白基因的pEGFP載體(購自Clontech公司)作為模板，用本發明AT選擇性誘變方法進行PCR擴增具體操作如下第一輪PCR反應為10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司貨號Cat.No.201203)5μlMgcl2(25mM) 7μldUTP(10mM) 2.5μldGTP(10mM) 2.5μldCTP(10mM) 1μldTTP(100μM)2μl
dATP(100μM)8μlpEGFP質粒DNA1μl正向引物(10μM，5』-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT) 1μl反向引物(10μM，5』-TCGAGATCTTATTTGTATAGTTCATCCA) 1μlTaq DNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl) 1μl擴增條件為94℃2分鐘；94℃40秒；50℃30秒；72℃50秒；30個循環。
第二輪PCR反應為10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，貨號Cat.No.201203) 5μldNTP(10mM) 1μl第一輪PCR產物 1μl正向引物(10μM，5』-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT) 1μl反向引物(10μM，5』-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT) 1μlTaq DNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl) 1μl加無離子水至50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分鐘，25個循環。將擴增產物用限制性內切酶NcoI/BglII雙酶解。
酶解反應如下10X SuRE/cut緩衝液H(購自Roche公司)5μl第二輪PCR產物 30μl限制性內切酶NcoI(購自Roche公司) 1μl限制性內切酶BglII(購自Roche公司) 1μl加無離子水至 50μl37℃反應4小時，反應混合物進行純化，純化過程如下按Qiagen公司PCR純化試劑盒(QIAquick PCRpurification kit，Cat.No.28104)及操作程序進行.具體過程是取150μl PB緩衝液(購自Qiagen公司，Cat.No.28104)與50μl酶解產物混合，上純化柱(購自Qiagen公司，Cat.No.28104)，以14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，再加750μl PE緩衝液(購自Qiagen公司，Cat.No.28104)，用14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，最後，加50μl無離子水，用14000轉/分鐘離心1分鐘，離心收集純化酶解DNA。
純化後連接到預先用NcoI/BglII處理的大腸桿菌表達載體pQE60(購自Qiagen公司)，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α(購自New England Biolabs公司)獲得隨機突變文庫。
轉化子質粒製備從隨機突變文庫中挑取270個轉化子接種到3ml含有氨苄青黴素(100μg/ml)液體LB培養基(配方1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，在37℃培養過夜，用Qiagen公司質粒製備試劑盒(QIAprep Spin Miniprep Kit，貨號Cat.No.27106)並按照說明書操作程序抽提質粒。具體方法如下以6000轉/分鐘離心培養物，收集菌體。加250ml緩衝液A(購自Qiagen公司，Cat.No.27106)懸浮菌體；加250ml緩衝液B(購自Qiagen公司，貨號Cat.No.27106)混勻；再加300ul緩衝液C(購自Qiagen公司，貨號Cat.No.27106)，混勻。以14000轉/分鐘離心5分鐘。收集上清液上柱，加750μl PE緩衝液(購自Qiagen公司，貨號Cat.No.27106)，同上離心，棄去流出液，最後，用80μl無離子水洗脫質粒DNA。
綠色螢光蛋白基因的序列分析以來自隨機突變文庫的質粒為模扳進行測序，測序PCR引物為5』-CGGATAACAATTTCACACAG。
測序反應體系為8μl序列反應混合液(購自Qiagen公司)，2μl質粒DNA(200μg)，1μl引物(10pM)，9μl去離子水.PCR條件為95℃預變性5分鐘；94℃變性15秒，50℃退火15秒，60℃延伸4分鐘，30個循環.PCR產物用於序列測定。
測定結果表明，被測定的135031個鹼基中，有1169個鹼基發生了突變，突變頻率為0.86％.其中AT轉換為其它鹼基數為1127個，佔總突變鹼基數的96.5％.GC轉換其它鹼基數為42個.佔總突變鹼基數的3.5％(見圖2)。
實施例2用高頻隨機誘變方法對綠色螢光蛋白基因進行誘變按照上述方法，製備含有dUMP的DNA雜合分子(同實施例1中的第一輪PCR反應)作為模板進行PCR誘變。PCR具體程序如下10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203) 5μlMncl2(5mM)5μldNTP(10mM) 1μl含dUMP的GFP基因的第一輪PCR產物 1μl正向引物(10μM，5』-GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT)1μl反向引物(10μM，5』-TCGAGATCTTATTTGTATAGTTCATCCA) 1μlTaq DNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl) 1μl加無離子水至 50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃1分鐘，30個循環。
突變文庫的構建20μl連接體系含有10X連接緩衝液(購自New England Boilabs公司) 2μlNcoI/BglII酶解pQE602μlNcoI/BglII酶解PCR產物 6μlT4DNA連接酶(購自New England Boilabs公司) 1μl加無離子水至 20μl4℃保溫過夜。
轉化將連接混合物與100μl大腸桿菌感受態細胞DH5α混合，冰浴放置30分鐘，42℃處理90秒，加800μl LB培養基(配方1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉，pH7.5)，37℃保溫1小時.鋪含100μg/ml氨苄青黴素固體LB平皿，37℃保溫12小時，挑取轉化子抽提質粒。
質粒製備和序列測定方法同實施例1中「轉化子質粒製備」和「綠色螢光蛋白基因的序列分析」。結果表明在測定的6750個鹼基中，有271個鹼基發生突變，突變率為4.0％。其中245個AT轉換為其它鹼基，佔總突變鹼基的90.4％；26個GC轉換為其它鹼基，佔總突變鹼基的9.6％。(見圖3)。
實施例3利用AT選擇性誘變方法對AlbD酯酶基因進行體外改良(應用實施例)
黃假單胞菌(L.Zhang and R.G.Birch，Mechanisms of biocontrol by pantoea dispersa of sugarcane leaf scald disease caused by Xanthomonas albilineans Journal of Applied Microbiology1997，82，448-454)是一種病原菌。該菌產生一種分子量為842kDa的有機化合物，稱為Albicidin。Albicidin可引起甘蔗的白葉枯病(white leaf scald)，在許多國家導致大面積的甘蔗減產，造成巨大的經濟損失。Zhang等人從防止甘蔗白葉枯病出發，從Erwinia herbicola中分離到一種可失活albicidin的酶，稱之為AlbD，並發現該酶對脂肪酸鏈長C2-8的酯有水解活性(Zhang，L.H. R.G.Birch.1997.The genefor albicidin detoxification from Pantoea dispersa encodes an esterase and attenuatespathogenicity of Xanthomonas albilineans to sugarcane.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 949984-9989.)。繼後，Zhang等人將albD基因導入甘蔗，發現具有一定的抗病作用(Zhang，L. Birch，R.G.Engineereddetoxification confers resistance against a pathogenic bacterium.Nat.Biotechnol 1999，17，1021-1024)。鑑於這個酶的albicidin脫毒活性在抗甘蔗白葉枯病和酯酶活性的工業應用價值，本申請人用本發明的AT選擇性方法對野生型albD基因(基因序列參見GenBank Accession No.U96453，Zhang，L和Birch，R.G，Mechanisms of biocontrol by Pantoea dispersa of sugar cane leaf scald disease causedby Xanthomonas albilineans，1997)進行了體外誘變，具體誘變步驟如下1)第一輪PCR10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203) 5μlMgcl2(25mM) 7μlPEG3500(5mM) 5μldUTP(10mM)2.5μldGTP(10mM)2.5μldCTP(10mM)1μldTTP(100μM) 2μldATP(100μM) 8μlAlbD DNA 1μl正向引物(10μM，5』-cgcgtggatccgtttgatggaca-3』) 1μl反向引物(10μM，5』-gatgaattcccctggaaaagcttatccc-3』) 1μlTaq DNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)1μl加無離子水至 50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分鐘，25個循環。然後，將PCR產物用雙蒸水稀釋1000倍，用稀釋的PCR產物作為模板，同上進行PCR，重複6個循環。
2)第二輪PCR10×PCR緩衝液(購自Qiagen公司，Cat.No.201203) 5μldNTP(10mM)1μl
第6個循環PCR產物 1μl正向引物(10μM，5』-cgcgtggatccgtttgatggaca-3)1μl反向引物(10μM，5』-gatgaattcccctggaaaagcttatccc-3』) 1μlTaq DNA聚合酶(購自Qiagen公司，Cat.No.201203，2.5U/μl)1μl加無離子水至 50μlPCR條件94℃預熱3分鐘，94℃40秒，50℃30秒，72℃3分鐘，25個循環。
酶解PCR產物用限制性內切酶Bam HI/EcoRI(購自New England Bilabs公司)酶解，酶解反應(50μl)含有5μl 10X酶解緩衝液(購自New England Bilabs公司)，20μl PCR產物，1-2μl限制性內切酶BamHI/EcoRI，加水至終體積為50μl，在37℃下保溫2-5小時。
酶解產物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒及操作程序進行。具體過程是取150μl PB緩衝液(購自Qiagen公司)與50μl酶解產物混合，上純化柱(購自Qiagen公司)，以14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，再加750μl PE緩衝液(購自Qiagen公司)以14000轉/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，最後，加50μl無離子水，以14000轉/分鐘離心2分鐘，收集純化酶解DNA。
連接20μl連接體系含有2μl 10X連接緩衝(購自Qiagen公司)，2-4μl預先用Bam HI/EcoRI酶解的大腸桿菌載體pGXE-2T(購自Strategen公司)，2-4μl酶解PCR產物，1μl T4DNA連接酶(購自Qiagen公司)，加水至終體積20μl.放4℃保溫過夜。
轉化將連接混合物與100μl大腸桿菌感受態細胞DH5α(購自New England Biolabs公司)混合，冰浴放置30分鐘，42℃處理90秒，加800ul LB培養基(1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉pH7.5)，37℃保溫1小時。鋪含100μg/ml氨苄青黴素和Albicidin固體LB(配方1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉和1.5％瓊脂，pH7.5)平皿，37℃保溫12小時，獲得AlbD分子多樣性突變文庫高酯酶活性突變株篩選通過對不同AlbD突變株的酯酶活性測定篩選高酯酶活性突變體，具體操作如下1.測定原理用對—硝基苯戊酯作為底物在AlbD酯酶作用下，生成對—硝基苯酚和羧酸化合物。對—硝基苯酚呈黃色，在405nM波長下有最大光吸收，因此，通過分光光度計測定光吸收便可推算出酶活性。
2.測定方法從AlbD分子多樣性突變文庫中挑取轉化子接種到含有150μl液體LB培養基的96孔扳，以155轉/分鐘，37℃培養過夜；取20μl培養物加到含有145μl 3mM的對—硝基苯戊酯(用pH7.4磷酸緩衝液製備。磷酸緩衝液具體配方137mM Nacl-2.7mMKcl-10mM NaHPO4-2mMKH2PO4，pH7.4)，混合後，28℃保溫20分鐘；然後，在90℃保溫3分鐘使AlbD酯酶失活，在405nM波長下測定光吸收。用該方法篩選獲得了1株高活性突變株，命名為m-AlbD，其活性比野生型AlbD酯酶提高了4倍(見圖4)。
高活性突變株重組質粒製備將高活性突變株m-AlbD接種到3ml含有100μg/ml氨苄青黴素液體LB培養基(配方1％胰蛋白腖，0.5％Nacl，1％酵母粉，pH7.5)，在37℃培養過夜，用Qiagen公司質粒製備試劑盒(QIAprep Spin Miniprep Kit，貨號Cat.No.27106)並按照說明書操作程序抽提質粒。具體方法如下以6000轉/分鐘離心5分鐘，收集菌體。加250ml緩衝液A(購自Qiagen公司，Cat.No.27106)懸浮菌體；加250ml緩衝液B(購自Qiagen公司，Cat.No.27106)混勻；再加300ul緩衝液C(購自Qiagen公司，Cat.No.27106)，混勻。以14000轉/分鐘離心5分鐘。收集上清液上柱，加750μl PE緩衝液(購自Qiagen公司，Cat.No.27106)，同上離心，棄去流出液，最後，用80μl無離子水洗脫質粒DNA。序列分析表明GC含量提高了8.9％(如表1所示)。
表1 第6輪PCR誘變AlbD酶GC富集結果

權利要求
1.一種AT選擇性高頻率誘變的方法，其特徵在於，以dUTP為媒介進行第一輪PCR，得到含dUMP的雜合DNA分子；以該DNA分子為模板，進行第二輪PCR；通過部分U與G配對，獲得AT鹼基分別被GC替換的突變DNA分子。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於，第二輪PCR是以含有dUMP的雜合DNA分子為模板，在Mn++存在下進行的。
3.權利要求2所述的方法，其中的Mn++是Mgcl2，其用量為0.5mM。
4.權利要求1、2或3所述的方法，其步驟包括1)使用dUTP部分取代dTTP進行PCR擴增；2)在dUTP存在下，降低dTTP濃度，使新合成鏈中dUMP取代dTMP；3)在dUTP存在下，降低dATP濃度，增加dGTP濃度，使新合成鏈中dUTP與dGTP配對，部分A和T通過dUMP介導被G和C取代。
5.權利要求1所述的方法，其特徵在於，向第一輪PCR反應系統增加溶劑極性降低鹼基配對特異性，使新鏈合成過程中鹼基之間錯配。
6.權利要求5所述的方法，其中所述的溶劑是聚己二醇。
7.權利要求6所述的方法，其中所述的聚己二醇是3500。
全文摘要
本發明公開了一種AT選擇性高頻率誘變方法。其步驟包括以dUTP為媒介進行第一輪PCR擴增，得到含dUMP的雜合DNA分子；以該DNA分子為模板，進行第二輪PCR擴增；通過部分U與G配對，獲得AT鹼基分別被GC替換的突變DNA分子或者在第一輪PCR擴增後，以含有dUMP的雜合DNA分子為模板，在0.5mM Mgcl
文檔編號C12N15/11GK1807618SQ20061001825
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月19日 優先權日2006年1月19日
發明者劉子鐸, 張煉輝, 洪玉枝, 喻子牛 申請人:華中農業大學