一種萊茵衣藻外源基因表達系統及其構建生產phb轉基因藻的方法

2023-09-19 18:19:10 3

專利名稱：：一種萊茵衣藻外源基因表達系統及其構建生產phb轉基因藻的方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種萊茵衣藻外源基因表達系統，同時還涉及構建生產聚β-羥基丁酸(PHB)轉基因藻的方法。
背景技術：
：隨著社會的不斷發展，塑料製品已經成為人類社會生活的必需品。由於化學合成塑料在自然環境中的光降解和生物降解速度都較慢，用14C同位素跟蹤考察土壤中塑料的降解結果表明，塑料的分解速度隨環境條件(如降雨量、透氣性、溫度等)不同而有所差異，但總體看來，分解速度非常緩慢，通常認為需要200-400年，其塑料廢棄物造成的「白色汙染」問題已經成為日益嚴重的環境問題。開發出生物可降解的塑料是目前該領域研究的熱點。聚β-羥基丁酸(polyhydroxybutyricacid，PHB)是發現最早且研究最透徹的一種生物可降解塑料。它不僅具有與化學合成塑料相似的理化性質，還具有一些特殊性能，如生物可降解性、生物相容性、光學活性、無毒性、無刺激性和無免疫原性等。它的這些特殊性能在醫學、光電子化學、精細化工等高新技術行業具有極大的開發潛力。在醫學上，可以用作藥物釋控微球、外科醫用植入材料、藥劑載體、細胞培養的理想支架材料、骨修復材料和外科治療用品等；在光電子化學品方面可用作錄音材料介質、液晶顯示用材料、光學薄膜、光電攝影調色劑等；在精細化工方面，可用作精加工包裝、照相、攝像機、家電、電腦的緩衝包裝等。Lemoigne等於1925年在細菌Bacillusmegaterium中發現了聚β-羥基丁酸酯(PHB)。十九世紀二十年代至今已發現許多微生物包括光能和化能自養及異養菌等共65種均能產生PHB，如產鹼桿菌屬(Alcaligenes)，假單細胞菌屬(Pseudomonas)，甲基營養菌屬(Methylotrophs)，固氮菌屬(Azotobacter)和紅螺菌屬(Rhodospirillum)等。PHB的熔點低、可塑性強且易於加工，其分子量因菌種及合成條件而異，約從6×104至106道爾頓不等，相應的聚合度n約700至12,000。PHB的合成途徑如下在營養平衡條件下，微生物細胞中的乙醯輔酶A進入三羧酸循環，生成高濃度的游離輔酶，抑制了PHB合成的關鍵調控酶——乙醯輔酶A醯基轉移酶，最終抑制了PHB的合成；當營養失衡且碳源過剩時，NADH氧化酶活性降低，NADH逐漸增多會抑制檸檬酸合成酶及異檸檬酸脫氫酶，阻斷了三羧酸循環，沒有被利用的乙醯輔酶A積累到一定程度，輔酶A對乙醯輔酶A醯基轉移酶的抑制就被克服，乙醯輔酶A便縮合成乙醯乙醯輔酶A並啟動了PHB的合成(Steinbucheletal，MolecularMicrobiology，1991，5(3)535-542)。PHB能為土壤及海水中存在的許多微生物所降解，一般在厭氧汙水中降解最快，在海水中降解最慢(Luzier，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89839-842)。目前生產PHB較成熟的方法是用細菌發酵生產PHB。自然條件下產PHB的細菌中，PHB含量一般為1％～3％。在碳過量、氮限量的控制發酵條件下，PHB含量可達細胞乾重的70％～80％。1975年英國帝國化學公司(ICI)開始採用真養產鹼桿菌的一個突變體生產PHB。他們於1981年在限磷而其它鹽過量且含葡萄糖和丙酸的培養基上培養利用葡萄糖的真養產鹼桿菌突變體，使其產生P(3HB-3HV)，終產量可達菌體乾重的70％～80％(Leeetal，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，1995，5227-58)。1987年弗吉利亞JamesMadison大學的Dennis成功地從真氧產鹼桿菌中克隆到合成PHB的基因，並轉入大腸桿菌中。1989年ICI公司利用Dennis組建的工程菌生產的PHB佔菌體乾重80％以上。奧地利維也納大學在組建工程大腸桿菌的同時引入熱敏噬菌體溶解基因，可使細菌易裂解釋放PHB，降低了提取成本。但用細菌合成PHB生產效率低，熔點和降解起始溫差不大，結晶速度慢，加工困難，價格昂貴，實際應用受到限制。直到1992年Poirier等首次進行了植物生產PHB的嘗試，將CaMV35s啟動子控制的真氧產鹼桿菌PHB合成途徑中的phbB，phbC導入擬南芥菜中，並利用植物本身的酮硫裂解酶合成了一定量的PHB，顆粒大小形狀與細菌中相似。雖然PHB合成量很少，約100μg/gfwt，轉基因植株生長卻嚴重受阻，PHB顆粒在胞質、液泡，甚至核內出現，但質體內不存在(Poirieretal，FEMSMicrobiol.Rev.，1992，103237-246)。1994年，Nawrath等改進了策略，將PHB定位於質體。他們分別在phbB，phbA和phbC基因上連入一段編碼豌豆葉綠體Rubisco小亞基轉運肽的DNA片段，將表達產物定位於質體，通過雜交手段將三個基因在同一株擬南芥菜中表達。結果PHB累積量高達乾重的14％，而且轉基因植株發育正常(Nawrathetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，9112760-12764)。第一代含PHB基因的轉基因植物中，質體中沒有PHB產物，表明PHB顆粒不能穿過質體雙層膜。因此將PHB定位於質體的另一個優點就是不會造成PHB的洩漏而幹擾植物的正常生理功能，也不會阻礙一些內源機制的運轉。但是研究發現植株幼葉成長期PHB含量超過300～400μg/gfwt時，在後期(50～60天後)葉片有輕微的黃化現象。PHB顆粒積累太多可能對葉綠體的正常功能有不利的影響。孟山都公司的研究小組選擇油菜作為生產塑料(PHB)的植物，並期望在種子中表達相關目的基因，這是因為乙醯COA是PHB和脂肪酸生物合成的共用中間代謝產物，油菜種子又是油脂化合物有效合成積累的場所。孟山都公司的Houmiel等報導(Houmieletal，Planta，209547-550)，構建了一個包含4個目的基因(IlvA466、BktB/phbA、phbB和phbC)的植物表達載體，每個目的基因前融合有編碼擬南芥葉綠體轉送肽(ctp)和Lesguerella羧化酶啟動子(P-Lh)，目的基因尾部融合有豌豆RbcsSE9基因的E93』序列終止子，其中目的基因phbB使用的是豌豆Rubisco小亞基轉送肽。這樣構建的表達載體保證了多個目的基因在植物白色質體中正確表達。採用農桿菌介導法將該多基因表達載體導入油菜，轉基因植株成熟種子中含有7.7％鮮重的PHB。通過進一步改變脂肪酸和胺基酸生物合成的中間產物流向，研究小組獲得了能夠合成積累PHBV共聚物(3-羥基丁酸酯與3-羥基戊酸酯的共聚物)的轉基因油菜。研究還證明PHBV共聚物的積累並不影響油菜種子中油脂的合成和生產。本發明人之一宋豔茹等(植物學報，phbB、phbC基因在大腸桿菌中的表達及對馬鈴薯植株的轉化和檢測，1998，40(7)615-621)成功從真養產鹼桿菌染色體DNA中擴增出phbA、phbB和phbC基因，構建原核表達載體導入大腸桿菌，並對細菌中積累的PHB進行物化性質的鑑定，證明克隆的phbB、phbC基因產物具有活性。並已經完成了單基因(嵌合phbA)，雙基因(嵌合phbB、phbC)，三基因(嵌合phbA、phbB和phbC)植物表達載體的構建，轉化5個馬鈴薯品種，並在轉基因陽性株系中檢測到PHB的累積。儘管細菌發酵生產PHB的技術比較成熟，但由於細菌培養需要較昂貴的發酵底物和消耗能源使其價格難以下降，無法與現今價格低廉的化學合成塑料競爭。利用轉基因植物生產PHB也存在生長周期長，佔地空間大，轉基因植株不可育性等問題，這給實現工業化生產PHB帶來很大的困難。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)屬於綠藻門團藻目衣藻科，是一種單細胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(如光合作用、鞭毛組裝、趨光性和生理節律等)的模式生物，與酵母細胞有許多共同的特徵，素有「光合酵母」之稱。萊茵衣藻的細胞呈卵形，有細胞壁、細胞質和細胞核；細胞質裡有一個大型杯狀葉綠體，佔整個細胞體積的40-60％。細胞前部偏在一側的地方有一個紅色的眼點，眼點對光線的強弱很敏感。萊茵衣藻細胞的前端有兩根鞭毛，能夠擺動，因此可以在水中自由遊動。萊茵衣藻的全身都能夠吸收溶解在水中的二氧化碳和無機鹽，並且能夠依靠眼點的感光和鞭毛的擺動，遊到光照和其他條件都適宜的地方，進行光合作用，維持自己的生活。它具有無性生殖、有性生殖兩種方式，有光能自養、異養及光能異養3種不同的營養生長方式，其生長速度快且光合效率高。
發明內容本發明的目的在於提供一種萊茵衣藻外源基因表達系統，它包含強啟動子、外源目的基因、終止子、篩選標記和受體藻株(萊茵衣藻，Chlamydomonasreinhardtii)，該系統具有表達效率高、成本低、產物易分離、生態安全等優點。本發明的另一個目的是構建生產生物可降解塑料-聚β-羥基丁酸(polyhydroxybutyricacid，PHB)轉基因衣藻的方法，該方法具有易操作、生產成本低廉等優點。本發明包括以下幾方面的內容1.一種萊茵衣藻外源基因表達系統包括(1)轉基因受體藻的篩選與培養選擇細胞壁缺陷的萊茵衣藻CC-849作為受體藻，萊茵衣藻的培養採用Tris-acetate-phosphate(TAP)培養基，在光照～90μE/m2.s的條件下，通氣培養至對數生長後期，藻細胞濃度達到108-109cells/mL時，離心收集。藻細胞培養依生產規模採用不同規模的光合生物培養系統，大規模生產可採用跑道式藻類培養系統。(2)含有篩選標記基因表達盒的外源基因萊茵衣藻表達載體的構建A建立萊茵衣藻核表達載體含有RBCS2啟動子或Hsp70A-RBCS2合成啟動子、RBCS2終止子，通過「基因槍法」、珠磨法或電激法將外源基因導入萊茵衣藻核基因組中，再以ble基因為篩選標記，通過腐草黴素或Zeomycin篩選獲得轉基因衣藻。B建立菜茵衣藻葉綠體表達載體含有rbcL啟動子和rbcL終止子，以psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列為同源重組片段，通過「基因槍法」、珠磨法或電激法將外源基因定點整合到萊茵衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端基因序列之間，以突變的16SrRNA為篩選標記，通過壯觀黴素篩選獲得轉基因衣藻。2.構建生產PHB轉基因衣藻的方法(1)PHB生物合成關鍵酶基因的克隆先從GenBank裡獲得phbA(GenBank登錄號J04987)、phbB(GenBank登錄號J04987)和phbC(GenBank登錄號J05003)的基因序列，再通過PCR法從真養產鹼桿菌基因組中擴增出phbA、phbB和phbC基因，並克隆到合適的克隆載體上，分別獲得pSKA-1質粒、pUB8質粒和pUC13質粒。(2)PHB生物合成關鍵酶基因衣藻核表達載體的構建將phbA基因(1.2Kb)插入pH105載體的PmaCI位點，獲得pH105A，然後將phbA基因表達框架插入到pSP124的EcoRI位點，獲得phbA基因衣藻表達載體pH105A124(見圖1)；將phbB基因(780bp)連入pSP105的BamHI和PmaCI位點，獲得p105B；再將phbB基因表達框架插入到pSP124的EcoRV位點，獲得phbB基因衣藻表達載體p105B124(見圖2)；將phbC基因(1.8Kb)插入pH105載體的PmaCI位點，獲得pH105C，然後將phbC基因表達框架插入到pSP124的EcoRI位點，獲得phbC基因衣藻表達載體pH105C124(見圖3)。(3)PHB生物合成關鍵酶基因葉綠體表達載體的構建將phbB和phbC基因片段分別插入p53rGFPct質粒的NdeI與XbaI雙酶切位點，獲得p53rB和p53rC質粒。再將phbB基因表達框(rbcL5′-phbB-rbcL3′)插入p322的BamHI位點，獲得p322-53rB。再將phbC基因的表達框架(rbcL5′-phbC-rbcL3′)連接到p322-53rB的EcoRV酶切位點，獲得二價表達載體p322-53rBC(見圖4)。(4)PHB生物合成關鍵酶基因表達載體的遺傳轉化與篩選A通過「珠磨法」、基因槍法或電激法等遺傳轉化方法將PHB生物合成的關鍵酶基因phbA、phbB和phbC導入萊茵衣藻，通過抗性篩選平板培養基獲得轉基因衣藻。B通過共轉化的方法，同時進行phbB和phbC基因遺傳轉化，在篩選平板上培養7-15天，就可以長出陽性藻落，得到生產聚β-羥基丁酸二價轉基因衣藻，由於萊茵衣藻中含有β-酮硫裂解酶活性(phbA表達產物)，二價轉基因衣藻也能生產聚β-羥基丁酸。。C通過共轉化的方法，同時將phbA、phbB和phbC基因的表達載體混在一起，進行遺傳轉化，在篩選平板上培養7-15天，就可以長出陽性藻落，得到生產聚β-羥基丁酸的三價轉基因衣藻。(5)生產聚β-羥基丁酸的轉基因衣藻的鑑定A將在篩選平板培養基上長出的陽性藻落，經過連續繼代培養15-20代後，進行進一步的分子檢測。B分子鑑定包括PCR-Southernblot檢測、RT-PCR-Southernblot檢測和PHB產物檢測。獲得二價或三價轉基因衣藻後就可通過大規模培養轉基因衣藻來實現快速、廉價生產生物可降解塑料-聚β-羥基丁酸。本發明所述的利用萊茵衣藻外源基因表達系統及其構建生產PHB轉基因藻的方法，該方法的優勢主要表現在(1)萊茵衣藻繁殖速度快，生長周期短，能象細菌等微生物一樣進行集約化生產，同時它可以象高等植物那樣通過光合作用合成生產PHB的所需底物，不需要添加昂貴的底物，大大降低PHB生產成本；(2)該系統採用沒有細胞壁的突變株，表達產物容易分離提取；(3)萊茵衣藻遺傳背景清晰，易進行外源基因定點整合；(4)生長繁殖在受控光生物反應系統(photo-bioreactor)中進行，易於控制，無需顧慮轉基因生物的環境生態學問題。(5)本發明採用光誘導啟動子(RBCS2啟動子、rbcL啟動子)和光誘導的熱激啟動子(Hsp70A-RBCS2合成啟動子)，屬於萊茵衣藻強啟動子，易調控。Hsp70A-RBCS2合成啟動子經熱激後能使外源基因表達效率提高數十倍，這為通過誘導提高目的產物的產量提供調控基礎。圖1β-酮硫裂解酶基因衣藻表達載體pH105A124構建示意圖，其構建過程如下用SacI和HindIII雙酶切pSKA-1，得到phbA基因(1.2Kb)，兩端補平，插入pH105載體的PmaCI位點，獲得pH105A。經EcoRI酶切pH105A，將分離的phbA基因表達框架插入到衣藻轉化載體pSP124的EcoRI位點，獲得phbA基因衣藻表達載體pH105A124.圖2乙醯乙醯輔酶A還原酶基因衣藻表達載體p105B124構建示意圖，其構建過程如下通過EcoRI酶切pUB8，Klenow片段補平，再加入BamHI酶切1小時，分離的phbB基因插入pSP105的BamHI和PmaCI位點，獲得中間質粒p105B。再用EcoRI酶切p105B後用Klenow片段補平，將phbB基因表達框架插入到pSP124的EcoRV酶切位點，獲得phbB基因衣藻表達載體p105B124.圖3PHB合成酶基因衣藻表達載體pH105C124構建示意圖，其構建過程如下用EcoRI和BamHI酶切pUC13，兩端補平，獲得約1.18Kb的phbC基因；插入pH105的PmaCI位點，獲得pH105C。EcoRI酶切pH105C得到phbC基因的表達框架(大小約為2.8kb)；將phbC基因表達框架插入轉化載體pSP124的EcoRI位點，獲得phbC基因衣藻表達載體pH105C124.圖4衣藻葉綠體二價(phbB和phbC)表達載體p322-53rBC構建示意圖，其構建過程如下通過NdeI和XbaI雙酶切質粒T-phbB，將phbB基因片段插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位點，獲得p53rB質粒。再用BamHI酶切p53rB質粒，獲得phbB基因的表達框(rbcL5′-phbB-rbcL3′)，插入p322的BamHI位點，構建成一價表達載體p322-53rB。再通過NdeI和XbaI雙酶切質粒T-phbC，獲得phbC基因，插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位點，獲得p53rC質粒。通過BamHI酶切p53rC質粒，Klenow片段補平後獲得phbC基因的表達框架(rbcL5′-phbC-rbcL3′)，連接到p322-53rB的EcoRV酶切位點，獲得二價表達載體p322-53rBC。圖5-6轉phbB基因衣藻PCR-Southern雜交分析結果。圖5共有6條泳道，其中1為入DNA/HindImarker，2為陽性對照pUB8，3-5為轉基因衣藻基因組DNA中phbB的擴增產物，6為陰性對照(未轉基因衣藻基因組DNA的擴增產物)。圖6共有6條泳道，其中1為入DNA/HindIIImarker，2為陽性對照pUB8，3-5為轉phbB基因衣藻PCR產物與phbB基因探針雜交，6為陰性對照(未轉化衣藻基因組DNA擴增產物與探針雜)。只有陽性對照和轉基因藻出現雜交印跡，說明phbB基因已經整合到萊茵衣藻的基因組中。圖7-8轉phbB基因衣藻RT-PCR-Southern雜交分析結果。圖7為轉phbB基因衣藻的RT-PCR分析，共有8條泳道，其中1為入DNA/HindIIImarker，2為陽性對照陽性對照(pUB8/BamHI+EcoRI)，3為陰性對照(未轉化衣藻總RNART-PCR結果)，4-8為轉基因衣藻總RNA的RT-PCR產物；圖8為轉phbB基因衣藻RT-PCR-DNA雜交分析結果，共有8條泳道，其中1為入DNA/HindIII+EcoRI，2為陽性對照(pUB8/BamHI+EcoRI)，3為陰性對照，未轉化衣藻總RNART-PCR產物與探針雜交結果，4-8為轉基因衣藻RT-PCR產物與phbB探針雜交結果。只有陽性對照和轉基因藻出現雜交印跡，說明整合到基因組的phbB基因能在萊茵衣藻細胞中轉錄。具體實施例方式實施例1轉基因受體藻的選擇與培養本發明選用的轉基因受體為萊茵衣藻CC-849(Chlamydomonasreinhardtiicc-849)(購自美國Duke大學衣藻遺傳中心，Durham，NC27708USA)作為轉基因操作的受體，該藻株為細胞壁缺陷型的萊茵衣藻品系。萊茵衣藻培養時使用的培養基為TAP培養基，1L培養基的組份如下Tris2.42g，4倍Beijerincksalts(每升含16gNH4Cl，2gCaCl2·2H2O，4gMgSO4·7H2O)25mL，1M磷酸鉀緩衝液1mL，微量元素混合液(每升含11.4gH3BO3，22gZnSO4·7H2O，5.06gMnCl2·4H2O，4.99gFeSO4·7H2O，1.61gCoCl2·6H2O1.57gCuSO4·5H2O1.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O，50gNa2EDTA)1mL，冰醋酸1mL，H2O975mL，pH7.0。萊茵衣藻培養條件如下溫度22-25℃，光照90μE/m2/s的條件下連續光照培養，通氣量可調整(0.5L/分鐘)，藻細胞濃度達到108-109細胞/mL時離心收集。實施例2PHB生物合成關鍵酶基因的分離及表達載體的構建(1)PHB生物合成關鍵酶基因的克隆提取真養產鹼桿菌H16的染色體DNA(方法見葉梁，李樅等，科學通報，3-酮硫裂解酶基因phbA的克隆、序列分析及功能檢測，1999，44(4)398-402)，作為PCR擴增的模板。根據已發表的phbA基因序列(GenBank登錄號J04987)設計引物，PrA15-CACCATGACTTACGTTGTC-3′；PrA25GAAGAGCTCTTCCTTATTT-3′。PCR程序95℃變性1分鐘，53℃復性1分鐘，74℃延伸90秒，35個循環。實驗結果擴增出1.2kb的特異性片段，經SacI和EcoRV雙酶切後連入pBluescriptSK+的SacI和EcoRV位點，得到pSKA-1質粒。根據phbB基因序列(GenBank登錄號J04987)設計引物，PrB15-TGACCATGACTCAGCGCATTG-3′；PrB25-AGGCAAGCTTGTCAGCCCATATG-3′。PCR程序94℃變性1分鐘，55℃復性1分鐘，72℃延伸1分鐘，30個循環。實驗結果顯示得到780bp的特異性片段，經T4聚合酶處理，再連接到pUC18載體(Takara生物(大連)有限公司)的SmaI位點，得到pUB8質粒。根據phbC基因序列(GenBank登錄號J05003)設計引物，PrC15-ACCATGGCGACGCGGCAAAGGCG-3′；PrC25-GTCATGCCTTGGCTTTGACGTATCG-3′。PCR程序94℃變性2分鐘，62℃復性90秒，72.5℃延伸4分鐘，30個循環。實驗結果顯示得到1.78kb的特異性片段，經T4聚合酶處理，再連接到pUC18載體的SmaI位點，得到pUC13質粒。(2)PHB生物合成關鍵酶基因衣藻核表達載體的構建載體pSP105(Stevens，D.R.etal.ThebacterialphleomycinresistancegenebleasadominantselectablemarkerinChlamydomonas.1996，Mol.Gen.Genet.251，23-30.)上克隆有RBCS2的5′啟動子序列和它的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI等限制性內切酶位點，可以插入外源基因並在衣藻核基因組中表達外源基因。載體pCB740(SchrodaM.etal.SequenceelementswithinanHSP70promotercounteracttranscriptionaltransgenesilencinginChlamydomona.PlantJ，2002，31(4)445-455)上克隆有Hsp70A-RBCS2合成啟動子。載體pSP124(VictoriaLumbrerasetal.EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.PlantJ，1998，14(4)441-447)上含有ble基因的表達盒(RBCS2啟動子-b1e-RBCS2終止子)，編碼13.5KD的腐草黴素結合蛋白，它產生的抗體使衣藻具有腐草黴素和Zeomycin抗性，作為衣藻轉化時的篩選標記。構建pH105載體以pCB740為模板，設計兩條引物，擴增出HSP70A-RBCS2合成啟動子序列，並引入酶切位點上遊引物PrHp1(5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACAT3′)HindIIIEcoRI下遊引物PrHp2(5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′)PmaCI通過PCR(程序是94℃變性3min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30個循環；72℃延伸10min)從質粒pCB740上擴增出HSP70A-RBCS2啟動子片段(約498bp)，經瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒(Fermentas公司)回收DNA片段，將其克隆到不帶酶切位點的pUMD18-T載體(TaKaRa公司)上，得到HRT，通過PmaCI和HindIII從重組質粒HRT上分離出HSP70A-RBCS2啟動子片段(約498bp)，然後定向克隆於pSP105的PmaCI和HindIII位點上，獲得pH105載體。載體pH105上克隆有Hsp70A-RBCS2啟動子和RBCS2的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、NheI、XbaI和SalI等限制性內切酶位點，可以插入外源基因並在衣藻核基因組中高效表達外源基因。。用SacI和HindIII雙酶切pSKA-1，得到phbA基因(1.2Kb)，兩端補平，插入pH105載體的PmaCI位點，獲得pH105A。經EcoRI酶切pH105A，將分離的phbA基因表達框架插入到衣藻轉化載體pSP124的EcoRI位點，獲得phbA基因衣藻表達載體pH105A124(見圖1)；通過EcoRI酶切pUB8，Klenow片段補平，再加入BamHI酶切1小時，分離的phbB基因插入pSP105的BamHI和PmaCI位點，獲得中間質粒p105B。再用EcoRI酶切p105B後用Klenow片段補平，將phbB基因表達框架插入到pSP124的EcoRV酶切位點，獲得phbB基因衣藻表達載體p105B124(見圖2)；用EcoRI和BamHI酶切pUC13，兩端補平，獲得約1.18Kb的phbC基因；插入pH105的PmaCI位點，獲得pH105C。EcoRI酶切pH105C得到phbC基因的表達框架(大小約為2.8kb)；將phbC基因表達框架插入到轉化載體pSP124的EcoRI位點，獲得phbC基因衣藻表達載體pH105C124(見圖3)。在轉化實驗中，通過phbA、phbB和phbC基因衣藻表達載體的共轉化，可分別獲得二價(phbB和phbC基因)轉基因衣藻或三價(phbA、phbB和phbC基因)轉基因衣藻。(3)PHB生物合成關鍵酶基因葉綠體表達載體的構建質粒p53rGFPct(Franklin，S.E.etal.DevelopmentofaGFPreportergeneforChlamydomonasreinhardtiichloroplast.PlantJ2002，30733-744)上攜帶有衣藻葉綠體的rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列，通過NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，並插入外源目的基因，在rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列的作用下，可以在衣藻葉綠體中表達插入的外源基因。載體p322(美國Duke大學衣藻遺傳中心，Durham，NC27708USA)上攜帶有衣藻葉綠體psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列，方便外源基因表達盒插入葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA之間的位置；p228質粒(美國Duke大學衣藻遺傳中心，Durham，NC27708USA)上攜帶有突變的衣藻葉綠體16SrRNA和23SrRNA5′端序列，它的導入可使藻細胞具有壯觀黴素抗性，成為萊茵衣藻葉綠體遺傳轉化的篩選標記。設計引物為phbB基因和phbC基因引入NdeI和XbaI位點，並克隆到pUMD18-T載體上。擴增phbB基因的引物為5′-GCACATATGTGACCATGACTCAGCGCATTG-3′NdeI5′-AGGCAAGCTTGTCAGCCCATATGTCTAGATAC-3′，XbaIPCR程序94℃變性1分鐘，58℃復性1分鐘，72℃延伸1分鐘，30個循環，擴增產物克隆到pUMD18-T載體上，獲得T-phbB質粒。擴增phbC基因的引物為5′-GTCCATATGACCATGGCGACGCGGCAAAGGCG-3′；NdeI5′-GTCATGCCTTGGCTTTGACGTATCGTCTAGACTG-3′，XbaIPCR程序94℃變性2分鐘，62℃復性90秒，72.5℃延伸4分鐘，30個循環，產物克隆到pUMD18-T載體上，獲得T-phbC質粒。通過NdeI和XbaI雙酶切質粒T-phbB，將phbB基因片段插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位點，獲得p53rB質粒。再用BamHI酶切p53rB質粒，獲得phbB基因的表達框(rbcL5′-phbB-rbcL3′)，插入p322的BamHI位點，構建成一價表達載體p322-53rB。再通過NdeI和XbaI雙酶切質粒T-phbC，獲得phbC基因，插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位點，獲得p53rC質粒。通過BamHI酶切p53rC質粒，Klenow片段補平後獲得phbC基因的表達框架(rbcL5′-phbC-rbcL3′)，連接到p322-53rB的EcoRV酶切位點，獲得二價表達載體p322-53rBC(見圖4)。在轉化實驗中，通過p322-53rBC質粒和p228質粒的共轉化，可獲得二價(phbB和phbC基因)轉基因衣藻。實施例3萊茵衣藻的遺傳轉化(1)通過「珠磨法」轉化萊茵衣藻萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP溶液重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。吸取300μL懸浮液到5mL的試管裡(內含已滅菌的石英砂)，含外源基因的質粒經酶切成線狀(包括pH105A124，p105B124和pH105C124)，取1μg-2μg加入試管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振蕩15秒。把混合液轉移到25mL的帶螺旋帽的離心管中，加入10mL滅菌TAP培養液，在60轉/分鐘全溫振蕩搖床25℃光照過夜培奍(光照條件為90μE/m2/s)。室溫(20-25℃)離心收集細胞，去上清，用0.5mLTAP重懸，加入3.5mL0.5％TAP培養基，混勻後倒在含抗生素的篩選平板上，22℃光照培養箱裡培養7-15天(光照條件為90μE/m2/s)，平板上長出綠色的單克隆藻落。(2)通過「基因槍法」轉化萊茵衣藻萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP液體培養基重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。吸取300μL懸浮液塗布於TAP固體平板培養基，22℃光照培養箱(光照條件為90μE/m2/s)中培養1-2天以形成細胞層。在無菌條件下用基因槍(Bio-Rad)轟擊。具體步驟如下取50μL金粉懸浮液(60μg/mL)，加入6μg含有外源基因的環狀質粒(p322-53rBC)和50μL2MCaCl2和20μL0.1M亞精胺，通過渦輪振蕩器振蕩1-3分鐘以混合，8,000rpm離心10秒，棄上清，用無水乙醇清洗，振蕩，再8,000rpm離心10秒，棄上清，共5次，最後用60μL無水乙醇重懸沉澱。每次轟擊取10μL，轟擊參數如下真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養箱恢復培養12小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長出。(3)通過「電激法」轉化萊茵衣藻萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用電激緩衝液(10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。加入終濃度為10μg/mL的含外源基因的質粒(包括pH105A124，p105B124，pH105C124或p322-53rBC)及25μg/mL的鮭精DNA，混勻後置冰上，吸取0.4mL於電轉杯中待用。電轉儀(Eppendorf)電激時電壓為1KV/cm，持續時間2秒，然後冰上放置10分鐘，補充10mLTAP液體培養基22℃光照培養箱恢復培養12-18小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長出。實施例4轉基因萊茵衣藻的篩選與鑑定轉基因衣藻由於導入ble基因而具有Zeomycin抗性或是導入突變的衣藻葉綠體16SrRNA而具有壯觀黴素抗性，使轉基因衣藻可在含Zeomycin或壯觀黴素的篩選平板上生長，得到的轉化子經過連續性5-20代的繼代培養，並在抗性平板上進行保持培養(含10μg/mL的Zeomycin或100μg/mL的壯觀黴素)。轉基因藻的分子檢測包括PCR-southern雜交、RT-PCR-southern雜交和聚β-羥基丁酸產物分析。具體步驟如下(1)轉基因衣藻總DNA的提取萊茵衣藻總DNA提取參照文獻的方法(科學通報，phbB基因在萊茵衣藻中的表達與分子檢測，2004，49(15)1519-1522)取10mL處於對數生長後期的萊茵衣藻培養液，4℃離心收集，加350mL細胞裂解液(0.1mol/LNaCl，50mmol/LEDTA，20mmol/LTris-HCl，pH8.0)重懸沉澱，加入25μLProteinaseK(10mg/mL)、25μL20％SDS，混勻、55℃水浴2h；試管放在冰上降溫，加入200μL5mol/LKAc、冰上靜置後離心，上清加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，再用等體積的氯仿抽提1次，水相加入2倍體積的無水乙醇，混勻後置於-70℃放置15分鐘；離心收集沉澱，70％乙醇洗滌沉澱，乾燥後溶於30μLTE緩衝液中。(2)轉基因藻PCR-southern雜交分析以轉基因衣藻總DNA為模板，根據各目的基因片段設計特異性引物分別擴增phbA、phbB和phbC片段，然後各取10μLPCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後，採用「向上毛細管轉移法」轉膜，分別與由地高辛標記標記的完整的phbA、phbB和phbC基因(通過雙酶切分別從pSKA-1，pUB8和pUC13上獲得)探針雜交，雜交時採用高效地高辛DNA標記和檢測試劑盒(Roche生物公司)，結果顯示擴增片段可與探針雜交，轉基因衣藻出現和陽性對照一致的雜交印跡反應，而對照組沒有印跡(見圖5，圖6)。這表明phbA、phbB和phbC基因已經整合到萊茵衣藻的基因組中。(3)轉基因衣藻總RNA的提取用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取轉基因衣藻的總RNA，具體操作說明見產品說明書。(4)轉基因藻RT-PCR-southern雜交分析用Invitrogen生物公司的TRIzol試劑盒提取轉基因衣藻的總RNA。取1μg作為模板，採用Takara生物(大連)有限公司的RNA反轉錄試劑盒(AMV)進行反轉錄，以各基因片段的特異性引物進行RT-PCR擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離後轉膜，再分別與地高辛標記的完整的phbA、phbB和phbC基因探針雜交，結果顯示擴增片段可與探針雜交，轉基因衣藻出現和陽性對照一致的雜交印跡反應，而對照組沒有印跡(見圖7，圖8)。這表明導入萊茵衣藻基因組的phbA、phbB和phbC基因均具有轉錄活性。(5)轉基因藻產物分析-氣相色譜-質譜(GC-MS)光照條件下將二價或三價轉基因衣藻培養至對數中後期，離心收集藻細胞，冷凍乾燥後獲得藻粉。先通過甲醇65℃溫育5小時去除雜質，收集殘餘的藻細胞，熱氯法萃取PHB，再加入甲醇(含3％濃硫酸)93℃4小時酯化，待溶液溫度降到23℃後加入0.1％的NaCl溶液萃取，分離得到的有機相進行氣相色譜-質譜分析。這個氣相色譜-質譜(GC-MS)系統主要由GC-17A氣相色譜儀和QP-5000質譜儀組成。通過氦氣攜帶分離物，氣壓設定為100kPa，酯化的PHB首先通過DB-5MS毛細管(規格是30m×0.25mm)分離，氣相色譜的升溫程序是50℃保持2分鐘，以20℃/分鐘速率升溫至225℃，保持5分鐘。質譜採用電子轟擊(EI)模式，離子阱能量是70eV。結果顯示在二價或三價的轉基因衣藻中可以檢測到PHB，得到與PHB標準品(Sigma生物公司)相同的圖譜，而未轉基因衣藻中檢測不到。結果表明所得到的轉基因衣藻在光照培養條件下可以合成PHB。權利要求1.一種萊茵衣藻外源基因表達系統，它包括強啟動子、外源目的基因、終止子、篩選標記和萊茵衣藻受體藻株，首先是轉基因受體藻的篩選與培養，選擇萊茵衣藻作為受體藻，採用Tris-acetate-phosphate培養基，在光照～90μE/m2.s的條件下，通氣培養至對數生長後期，藻細胞濃度達到108-109cells/mL時，離心收集；其次是含有篩選標記基因表達盒的外源基因表達載體構建A、外源基因萊茵衣藻細胞核表達載體的構建，該載體含有RBCS2啟動子或Hsp70A-RBCS2合成啟動子、RBCS2終止子和ble基因篩選標記表達盒，通過基因槍法、珠磨法或電激法將外源基因導入萊茵衣藻核基因組中，通過腐草黴素或Zeomycin篩選獲得轉基因衣藻；B、萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建，該系統含有rbcL啟動子和rbcL終止子，以psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列為同源重組片段，通過基因槍法、珠磨法或電激法將外源基因定點整合到萊茵衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端基因序列之間，以16SrRNA為篩選標記，獲得轉基因衣藻。2.一種用於實現權利要求1所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，包括下列步驟A、轉基因受體藻的篩選與培養選用細胞壁缺陷的萊茵衣藻CC-849作為轉基因受體藻，在Tris-acetate-phosphate培養基，在光照～90μE/m2.s的條件下通氣培養；B、PHB生物合成關鍵酶基因的克隆先從GenBank裡獲得phbA、phbB和phbC的基因序列，再通過PCR法從真養產鹼桿菌基因組中擴增出phbA、phbB和phbC基因，並克隆到克隆載體上，分別獲得pSKA-1質粒、pUB8質粒和pUC13質粒；C、PHB生物合成關鍵酶基因衣藻核表達載體的構建將phbA基因1.2Kb插入pH105載體的PmaCI位點，獲得pH105A，然後將phbA基因表達框架插入到pSP124的EcoRI位點，獲得phbA基因衣藻表達載體pH105A124；將phbB基因780bp連入pSP105的BamHI和PmaCI位點，獲得p105B，再將phbB基因表達框架插入到pSP124的EcoRV位點，獲得phbB基因衣藻表達載體p105B124；將phbC基因1.8Kb插入pH105載體的PmaCI位點，獲得pH105C，然後將phbC基因表達框架插入到pSP124的EcoRI位點，獲得phbC基因衣藻表達載體pH105C124；D、PHB生物合成關鍵酶基因葉綠體表達載體的構建將phbB和phbC基因片段分別插入p53rGFPct質粒的NdeI與XbaI雙酶切位點，獲得p53rB和p53rC質粒，再將phbB基因表達框rbcL5′-phbB-rbcL3′插入p322的BamHI位點，獲得p322-53rB，再將phbC基因的表達框架rbcL5′-phbC-rbcL3′連接到p322-53rB的EcoRV酶切位點，獲得二價表達載體p322-53rBC；E、PHB生物合成關鍵酶基因表達載體的遺傳轉化與轉基因萊茵衣藻的篩選通過共轉化的方法，同時將phbB和phbC基因或同時將phbA、phbB和phbC基因的表達載體混在一起，利用珠磨法、基因槍法或電激法進行遺傳轉化，在篩選平板上培養7-15天，長出陽性藻落，進行分子檢測和產物分析確定生產聚β-羥基丁酸的二價或三價轉基因衣藻。3.按照權利要求2所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，其特徵是將外源基因/phbA、phbB和phbC導入萊茵衣藻的方法為珠磨法或者基因槍法或者電激法。4.根據權利要求3所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，其特徵是珠磨法選用細胞壁缺陷的受體萊茵衣藻，培養至對數期，用TAP培養液懸浮細胞濃度至2×108cells/mL，吸取300μL懸浮液到5mL的兩個試管裡，將目的DNA酶切成線狀，取1μg-2μg加入試管，受體藻/石英砂/DNA混合物振蕩時間為15秒。5.根據權利要求3所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，其特徵是基因槍法轟擊參數如下真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養箱恢復培養12小時。6.根據權利要求3所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，其特徵是電激法採用的電激緩衝液是10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇，調整受體細胞濃度至2×108細胞/mL，電轉儀電激時電壓為1KV/cm，持續時間2秒，然後冰上放置10分鐘，補充10mLTAP液體培養基22℃光照培養箱恢復培養12-18小時。7.根據權利要求2所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，其特徵在於所述的外源目的基因/phbA、phbB和phbC導入萊茵衣藻的整合位置為細胞核基因組或者葉綠體基因組中。8.根據權利要求2所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，其特徵在於(1)、phbB和phbC兩個基因同時導入萊茵得到的是二價轉基因藻；(2)、將PHB生物合成關鍵酶phbA、phbB和phbC基因同時導入萊茵衣藻得到的是三價轉基因藻，利用二價或三價的轉基因藻株均可生產聚β-羥基丁酸。9.根據權利要求2所述的一種構建生產PHB轉基因萊茵衣藻的方法，其特徵在於所述的轉基因藻篩選與鑑定包括(1)用含有篩選抗生素平板的篩選單克隆藻落，通過連續繼代培養15-20代後，進行分子檢測；(2)分子鑑定包括PCR-Southernblot檢測、RT-PCR-Southernblot檢測和PHB產物檢測。全文摘要本發明公開了一種萊茵衣藻外源基因表達系統及其構建生產PHB的轉基因藻的方法，由啟動子、外源目的基因、篩選標記和萊茵衣藻受體藻株組成。利用該系統構建生產PHB的轉基因的方法A.受體藻株的選擇與培養；B.PHB生物合成關鍵酶基因的克隆；C.PHB生物合成關鍵酶萊茵衣藻表達載體，D.通過珠磨法、基因槍法或電激法，從真養產鹼桿菌分離出的PHB生物合成關鍵酶基因導入萊茵衣藻中，經過篩選和分子檢測獲得生產PHB的二價或轉基因衣藻。利用光合作用產生的乙醯輔酶A為底物，在phbA、phbB和phbC基因編碼的PHB合成關鍵酶的共同作用下，合成聚β－羥基丁酸。方法易操作、成本低廉、產物易分離、安全，解決了白色汙染的問題。文檔編號C12P7/42GK1807649SQ20061001830公開日2006年7月26日申請日期2006年1月26日優先權日2006年1月26日發明者胡章立,王潮崗,宋豔茹申請人:深圳大學