C型肝炎病毒ns5b聚合酶抑制劑結合袋的製作方法

2023-09-19 22:23:40 2

專利名稱：C型肝炎病毒ns5b聚合酶抑制劑結合袋的製作方法
技術領域：
本發明涉及C型肝炎病毒NS5B聚合酶(HCV NS5B)，尤其是，新型HCVNS5B抑制劑結合袋(binding pocket)。提供的HCV NS5B的晶體結構包括定義該新型抑制劑結合袋的坐標和用於抑制劑篩選的三維模型。同時，提供了利用該晶體結構和抑制劑結合信息設計和篩選NS5B抑制劑的方法。
背景技術：
C型肝炎病毒(HCV)是輸血後和群體獲得性的全球性非甲非B肝炎的主要致病因子。已證實全球超過2億人感染有這種病毒。很高比例的攜帶者成為慢性感染者並且大多數發展為慢性肝病，即所謂的慢性C型肝炎。這些群體隨後有患嚴重肝病的危險，例如肝硬化、肝細胞癌和晚期肝病而導致死亡。
HCV形成病毒持久性和導致慢性肝病高發病率的機制還沒有完全得到闡明。還不知道HCV是如何與宿主免疫系統相互作用並逃避該系統的。另外，細胞免疫應答和體液免疫應答在防止HCV感染和疾病中的作用也還沒有得以確立。
HCV是黃病毒科的有包膜、正鏈RNA病毒。單鏈HCV RNA基因組是正極性的，包含一個約9600個核苷酸長的開放讀框(ORF)，編碼約3010個胺基酸的線性多蛋白。在被感染的細胞中，該多蛋白被細胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多個位點切割，產生結構和非結構(NS)蛋白。結構蛋白(C、E1、E2和E2-p7)包括構成病毒顆粒的多肽。非結構蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)編碼催化和調節HCV RNA基因組複製的酶或輔助因子。宿主細胞蛋白酶催化結構蛋白的加工。成熟非結構蛋白是由兩種被病毒編碼的蛋白酶催化產生的。第一種是NS2/3鋅依賴性金屬蛋白酶，該酶自動催化NS3蛋白從多蛋白中釋放。釋放的NS3蛋白包括N-末端絲氨酸蛋白酶結構域，並催化從多蛋白中的剩餘裂解。釋放的NS4A蛋白至少具有兩種作用。第一個作用是與NS3蛋白形成穩定的複合物，並輔助NS3/NS4複合物在膜中定位；第二個作用是作為NS3蛋白酶的輔因子。這種膜結合的複合物隨後催化多蛋白上剩餘位點的切割，從而影響NS4B、NS5A和NS5B的釋放。NS3蛋白的C-末端片段也具有核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。蛋白NS4B的功能還不清楚。NS5A是高度磷酸化蛋白，很可能負責各種HCV基因表型幹擾素抗性。NS5B是一種參與HCV複製的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。
HCV RNA基因組開放閱讀框5』端側翼是約340個核苷酸的非翻譯區(NTR)，它的作用是作為內部核糖體結合位點(IRES)，3』端側翼是約230個核苷酸的NTR。5』和3』NTR對於RNA基因組複製均非常重要。基因組中甚至存在不均衡的基因組序列變異，5』NTR和部分3』NTR都是最高度保守的部分。
對經過克隆並鑑定的HCV基因組部分和完整序列進行分析，確定預期抗病毒治療的適宜靶標。下面這4種病毒酶活性提供了可能的靶標(1)NS2/3蛋白酶；(2)NS3/4A蛋白酶複合物，(3)NS3解旋酶和(4)NS5B RNA-依賴性RNA聚合酶(NS5B RdRp)。另外還將NS5B RNA依賴性RNA聚合酶結晶，以揭示具有所附活性位點的其它核酸聚合酶的結構(Ago等1999；Bressanelli等1999；Lesburg等1999)。
複製所必需的病毒特異性功能是藥物開發中最具吸引力的靶。哺乳動物中不存在RNA依賴性RNA聚合酶，以及該酶是病毒複製所必需的事實，暗示HCV NS5B聚合酶是抗HCV療法的理想靶標。最近還證實破壞NS5B活性的突變可以消除黑猩猩(chimp)模型中的HCV RNA感染性(Kolykhalov，A.A.等，2000)。病毒RNA複製的起始步驟是NS5B(RdRp)識別RNA模板3』端，它可以直接或者間接在細胞蛋白的幫助下來實現(Lai，1998；Strauss等，1999)。然後，HCV聚合酶繼續延伸該模板，形成互補的RNA產物。
許多小組已經描述了HCV NS5B聚合酶的晶體結構(Ago等1999見上；Bressanelli等1999見上；Lesburg等1999見上)。它像一個扁平球，維數約為70_×60_×40_。多肽鏈圍繞活性位點在分子中心形成空穴，使其外形與其它U形聚合酶有很大不同。由於NS5B被細分為手指(finger)、手掌(palm)和拇指(thumb)域，其中手掌域(第188位至第225位和第287位至第370位殘基)是保守的，所以NS5B域的排列與其它聚合酶是相一致的。相比於其它聚合酶，拇指和手指域的廣泛接觸形成了球形HCV聚合酶。這些接觸部分地藉助手指延伸到手掌域的環作為媒介。NS5B晶體結構知識在以結構為基礎的藥物設計中是有用的，事實上，最近已經對NS5B聚合酶/抑制劑複合物的結構進行了報導(Wang等2003；Love等，2003；EP 1 256 628)。已發現，非核苷類似物抑制劑以楔形方式與位於聚合酶拇指域C末端區域附近的疏水結合袋結合。這項研究中，該酶在酶/抑制劑複合物中只能發生微小的構象變化。在NS5B上至少具有兩個NTP結合位點，一個在活性位點手掌內，第二個是拇指上的潛在變構位點(O′Farrell等2003；Bressanelli等2002)。
有意思地是，Labonté等2002年報導NS5B N-末端手指環(finger loop)內的Leu30突變會影響NS5B聚合酶活性，據推測是Leu30突變體結構的局部改變導致該活性降低。但是，作者並未對結合袋的存在發表任何看法，該結合袋在其自然狀態下被手指環掩蓋，由於Leu30殘基突變或取代使該結合袋暴露。發現這種奇特的結合袋是本發明的一個主題。
因此，深入認識酶結構對HCV複製的重要性，尤其是NS5B聚合酶，能促進開發有效治療HCV感染的方法。深入認識酶結構，特別是當它與特異性抑制劑複合時的結構，將會產生一種鑑定該酶中結合位點的方法，並獲得酶/抑制劑複合物以及該酶中敏感殘基的構象，這些知識對藥物設計和優化方法來講都是至關重要的。
發明概述已經發現，HCV聚合酶，當與某些抑制劑複合時，會採用取代手指環區而暴露結合袋的構象，其中所述手指環區由胺基酸殘基18至35定義，結合袋通常由胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義。這與現有技術發現的NS5B晶體結構相反，現有技術認為在自然狀態下，由胺基酸殘基18至35定義的手指環會遮蓋此結合袋。這種新的「暴露型」結合袋為尋找能結合HCV NS5B，並調節或優選抑制HCV NS5B聚合酶活性的其它化學實體定義了一種新的靶標。
因此，在一個方面，本發明提供了一種分離和純化的多肽，它包含由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的HCV NS5B抑制劑結合袋，其中所述結合袋由於由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環被取代而暴被露出來，並且該所述結合袋保持其天然功能構型。
在本發明的第二個方面，提供了一種分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，它包含由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋，其中所述結合袋保持其天然功能構型，並且所述結合袋是可暴露的。
在進一步的方面，提供了一種分離和純化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋組成，其中所述結合袋保持其天然功能構型。
在另一方面，提供了一種HCV NS5B多肽變體，其在由HCV NS5B的胺基酸殘基18至35定義的手指環內包含至少一個胺基酸突變，其中所述突變引起所述手指環發生取代，而使基本由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或者由其功能等同類似物定義的結合袋暴露，其中所述結合袋保持其天然功能構型。
本發明的另一個方面提供了一種HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其特徵是取代了胺基酸殘基18至35。
本發明的另一個方面提供了一種HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其中刪除了至少胺基酸殘基18至35。
在發明的另一個方面，提供了HCV NS5B晶體結構，包含由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結構坐標(structural coordinate)定義的，或由其功能等同類似物的結構坐標定義的結合袋，其中取代了由至少胺基酸18至35的結構坐標定義的天然手指環鏈，使所述結合袋暴露。
在本發明的另一個方面，提供了一種複合物，包含如上定義的HCVNS5B多肽、多肽變體或多肽類似物以及一種化合物，其中該化合物與NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物內的結合袋結合，所述結合袋由天然HCVNS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義。
在本發明的進一方面，提供了一種製備結晶的HCV NS5B複合物的方法，所述複合物包含如上定義的NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和與所述多肽、多肽變體或多肽類似物結合的化合物，其中所述化合物與由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結合袋結合。該方法包含下述步驟a)在結晶緩衝液中保溫純化的HCV NS5B多肽，獲得結晶的NS5B多肽；b)將所述化合物溶解；和c)在浸泡緩衝液中，將結晶的NS5B多肽與溶解的化合物一起浸泡適當的浸泡時間，獲得HCV NS5B複合物。
在製備如上定義的結晶HCV NS5B複合物的可選方法中，是將化合物加到含有結晶的HCV NS5B的結晶緩衝液中。
在製備如上定義的結晶HCV NS5B複合物的另一個可選方法中，包含下述步驟a)將純化的HCV NS5B與溶解的化合物混合，形成NS5B複合物；b)在結晶緩衝液中讓複合物結晶。
在本發明的另一方面，提供了複合物的X-射線晶體結構坐標，所述複合物包含如上定義的HCV NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和化合物，其中所述化合物與NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物內的結合袋結合，所述結合袋由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義。
在本發明的另一方面，提供了計算機可讀性存儲介質，在該介質上存儲有複合物的晶體結構模型，所述複合物包含如上定義的HCV NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和化合物，其中所述化合物與由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結構坐標定義的，或由其功能等同類似物的結構坐標定義的結合袋結合。
在本發明的進一方面，提供了一種鑑定結合HCV NS5B的化合物的方法，包括下述步驟a)將三維分子模型算法應用於由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結構坐標定義的，或由其功能等同類似物的結構坐標定義的HCV NS5B結合袋的結構坐標，確定HCV NS5B結合袋的空間坐標；和b)在HCV NS5B結合袋空間坐標的背景下對存儲的化合物的空間坐標進行電子篩選，測定該化合物是否結合在HCV NS5B結合袋內。
在本發明的另一方面，提供了一種鑑定潛在HCV抑制劑的虛擬篩選方法，包括下述步驟a)構建HCV NS5B結合袋的計算機模型，其中所述HCV NS5B結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的結構坐標定義，或由其功能等同類似物的結構坐標定義；b)利用計算機工具，在待評化合物和NS5B結合袋的計算機模型之間進行吻合度(fitting)程序操作，從而提供結合袋中化合物的能量最小化構型；和c)對該吻合度操作的結果進行評價，量化化合物和結合袋間的結合，其中與結合袋結合併獲得低能量、穩定複合物的化合物就是潛在的NS5B抑制劑。
還在本發明的另一方面，提供了一種篩選候選HCV NS5B抑制劑化合物的方法，包括下述步驟a)在適宜結合的條件下，保溫如上定義的HCV NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物和候選抑制劑化合物；和b)測定候選抑制劑化合物是否與多肽結合，其中與多肽結合的化合物是潛在的HCV NS5B抑制劑。
在發明的另一方面，提供了一種設計能結合如上定義的NS5B多肽、多肽變體或多肽類似物的化合物的方法，包括下述步驟評估互補性，即化合物和NS5B多肽中結合袋間的「吻合度」，其中所述結合袋由天然HCVNS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義。
在發明的另一方面，提供了一種產生抑制HCV NS5B的RNA複製活性的藥物的方法，包括鑑定或設計與NS5B結合袋吻合的化合物，所述NS5B結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義，或由其功能等同類似物定義，其中由於取代了由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈而使所述結合袋暴露。
下面，將會參考所附圖片對本發明的方面和實施例進行更詳細的描述，其中


圖1A描述沒有化合物時的NS5B apo酶結構；圖1B描述與NS5B結合的化合物A，其中取代了胺基酸18至35，因此該結構中看不到它們；圖1C描述結合到代表本發明結合袋的溶劑可及表面內的化合物A；圖2描述結合到代表本發明結合袋的溶劑可及表面內的化合物B；圖3描述結合到代表本發明結合袋的溶劑可及表面內的化合物C的NMR衍生的結合構象對接模型(docked model)；圖4顯示與化合物A複合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子結構坐標；圖5顯示與化合物B複合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子結構坐標圖6顯示與化合物C複合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子結構坐標發明詳述定義除非另外定義，本文所用的科學和技術術語以及名稱具有與本發明所屬領域普通技術人員常規理解相同的意思。通常，細胞培養、感染步驟、分子生物學方法等都是本領域技術人員所熟知的。這些常規技術可參閱參考手冊，如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1994)。
術語「HCV NS5B」指參與HCV複製的C型肝炎病毒(HCV)RNA-依賴性RNA聚合酶(RdRp)。如本領域技術人員所知，術語HCV包含含有許多不同菌株、分離體和亞型的病毒家族。另外，雖然此家族各成員的NS5B聚合酶功能等同且結構高度同源，它們在胺基酸序列上還是會有些區別。HCVNS5B聚合酶(來自HCV 1b基因型的NS5B)的胺基酸序列示於SEQ ID No.1中。其它分離的HCV NS5B聚合酶序列可獲自現有的公共序列資料庫。
本文所用術語「結合袋」指分子或分子複合物的區域，由於其構型所致，其有利於與相同分子或分子複合物實體或部分，或者不同分子、分子複合物、化學化合物或其它化合物實體或部分結合；或者被相同分子或分子複合物實體或部分，或者不同分子、分子複合物、化學化合物或其它化合物實體或部分佔據。根據本發明，本文所定義的NS5B結合袋會由於取代了殘基18至35的手指環域而暴露出來，從而使能影響NS5B活性，如抑制NS5B活性的化合物結合NS5B結合袋。通常，結合袋或其至少一部分包含一空穴，此空穴是可與相同或不同分子實體相互作用的部位。本領域技術人員可以理解，結合袋內的空穴特性會由於分子和分子的不同而有不同。
用於本發明多肽的術語「分離和純化的」是指基本與其它成分分離的多肽。
用於本發明結合袋的胺基酸序列的術語「天然HCV NS5B」是指給定HCV NS5B中的結合袋的天然胺基酸序列。
用於本發明結合袋的術語「天然功能構型」是指胺基酸天然重排，包括空間重排，形成可與某些化合物/實體結合或被某些化合物/實體佔據的結合袋。
本文所用術語「複合物」是指兩個或多個實體相混合，至少其中一個實體是蛋白或酶。具體地，本發明複合物是NS5B蛋白和另一化合物形成的複合物，其中NS5B蛋白包括可含胺基酸取代、截斷或插入的NS5B蛋白類似物。化合物或化學實體與蛋白混合或「複合」是指化合物或化學實體和蛋白結合(association/binding)的特性。複合物組分間的結合是各組分之間的接近狀態，這種結合可以是天然非共價鍵的，其中該接近能量上受氫鍵或範德華力或靜電相互作用支持，或者可以是共價鍵結合。
用於分子化合物的術語「類似物」表示自天然或自然胺基酸序列修飾過的胺基酸序列，並且該胺基酸序列保持著天然或自然胺基酸序列的生物活性(功能或結構的生物活性)。這種類似物可以獲自相同或不同種類，並且可以是天然類似物，或者是合成製備的。所述類似物包括取代、刪除或添加了一個或多個胺基酸的胺基酸序列，只要其保持了蛋白的生物活性。術語「保守性類似物」表示含有保持生物活性的胺基酸修飾的類似物。含胺基酸取代的類似物包括具有強或弱相似性的取代(參見，如Dayhoff，M.O.，(1978)，蛋白序列和結構圖譜，5，suppl.3，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)，根據下述「胺基酸相似性表」所定義
用於本發明結合袋多肽的術語「功能等同類似物」是指取代、刪除或插入了一個或多個胺基酸的結合袋。取代可以是根據如上所述進行的，例如用合適的保守性胺基酸或保守性合成胺基酸類似物來進行取代。本質上，術語「類似物」與前述定義相一致。短語「功能等同」說明類似物保持著天然分子的生物活性。
用於胺基酸或胺基酸殘基的術語「側鏈」意思是α-胺基酸的α碳原子上所附的基團。例如，例如，R-基側鏈對於甘氨酸是氫，對於丙氨酸是甲基，對於纈氨酸是異丙基。關於α-胺基酸的特定的R-基團或側鏈參考A.L.Lehninger’s text on Biochemistry(參見第四章)。
術語「截短」是指任何弄短或縮短的分子片段，且其為了本發明的目的保持其生物活性。截短可以指縮短天然蛋白分子或其類似物。
術語「均方根差(root mean square deviateon)」或「rms偏差」或「rmsd」是指平均值方差的算術平均值的平方根。在原子目標的上下文中，數字單位為埃(_)。它表示與趨勢(trend)或目標(object)的差異。
本文使用下述縮寫DLB差示譜線增寬(differential line broadening)；DMSO二甲亞碸；DTT二硫蘇糖醇；EDTA乙二胺四乙酸；FID自由感應衰變(free induction decay)；IPTG異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；HEPES4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸；MES2-(N-嗎啉)乙磺酸；MPD2-甲基-2，4戊二醇)；NMR核磁共振；NOESY核Overhauser效應譜；PEG聚乙二醇；PEG5k mme單甲醚聚乙二醇5000；Tris三(羥甲基)氨基甲烷；TSP3-三甲代甲矽烷基四氘丙酸鈉。
優選實施方式HCV NS5B聚合酶第一方面，本發明提供了包括功能HCV NS5B結合袋的分離和純化的多肽，所述結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個或多個)定義，其中由於取代了由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈，而使所述結合袋暴露，並且所述結合袋保持其天然功能構型。
在本發明的此方面，還提供了由暴露的HCV NS5B結合袋組成的分離和純化的HCV NS5B多肽，所述結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個或多個)定義，並且所述結合袋保持其天然功能構型。
在本發明的此方面，對本發明的多肽來說，引入呈現其天然構型(即在天然HCV NS5B聚合酶中所呈現的天然構型)的結合袋是很重要的，從而可以正確地模擬結合袋，成為有用的HCV NS5B抑制劑篩選工具。
另外，為了使多肽能有效地起到HCV NS5B抑制劑篩選工具的作用，使抑制劑結合袋暴露或者抑制劑結合袋至少是可暴露的也是很重要的，這樣才能讓抑制劑接近結合袋。在HCV NS5B中，發明人確定當NS5B手指環鏈的至少胺基酸殘基18至35被取代時，本文所定義的結合袋就會暴露。因此，在此方面，提供了包含有暴露構型的結合袋的多肽。
在本文中，由於一種HCV基因型或菌株與另一種HCV基因型或菌株的預期序列相似性，本發明的結合袋參考HCV NS5B蛋白中的胺基酸位置進行定義。取代的或可取代的手指環區也參考胺基酸位置進行定義，即胺基酸18至35。本領域技術人員很容易理解因為胺基酸插入或刪除，所有HCV NS5B中的胺基酸編號可能會與本文所示的HCV NS5B胺基酸編號略有不同。本文所示的胺基酸編號是以示於SEQ ID NO1的天然HCV 1bNS5B聚合酶序列為基礎的。而且，其它HCV NS5B中的相應胺基酸可以通過目測胺基酸序列或利用可商購的同源性軟體程序如Vector NTI來進行鑑定(由InfoMax Inc.提供)。從這方面來講，為了鑑定NS5B蛋白，應注意HCVNS5B序列的前4個胺基酸通常是-SMSY-(SEQ ID NO2)，這4個胺基酸在各變體之間是保守的。
在本發明的一個實施方式中，將結合袋定義為下述胺基酸序列(37)*392-393 395-396 399 424-425 428-429 492-495(496)*500 503
*(括號表示任意的胺基酸殘基)或，可選地(V37)，L392，A393，A395，A396，T399，I424，L425，H428，F429，L492，G493，V494，P495，(P496)，W500和R503。
本領域技術人員可以理解，多肽的功能等同類似物也包括在本發明的範圍之內。本發明多肽的一個或多個胺基酸殘基，不管它在結合袋內還是在結合袋域外，都可以用功能等同的胺基酸，通常是上述「胺基酸相似性表」中所列的保守性胺基酸替代，其合成胺基酸類似物或其它HCV基因型中發現的天然存在的胺基酸取代，並且它們仍然保持結合袋的功能形態或構型。也可以對多肽進行胺基酸刪除和/或插入。所述胺基酸取代、插入或刪除可以使多肽更利於在篩選試驗中使用，或使多肽更容易製備。不同HCV基因型中的結合袋內天然存在的胺基酸取代的粗略例子包括但不限於含有T499V取代的HCV基因型1b NS5B；含有M36L，I424V和T499A取代的HCV基因型1a NS5B；含有M36L，I424V，L425M和V494C取代的HCV基因型3a NS5B；含有M36K，L392I，A393S，I424V，L425I和V494A取代的HCV基因型2b NS5B；含有V494A取代的HCV基因型2a，2k，6b；含有V494I取代的HCV基因型3b；含有P495L取代的HCV基因型6a；和含有A396V取代的HCV基因型4a。
應該知道結合袋通常是由多肽的所有胺基酸原子來定義的，例如當抑制劑與多肽複合時，NS5B就在抑制劑所有原子5_內。可利用各種計算機分析來測定含有本文所定義結合袋的多肽是否與上述HCV NS5B結合袋充分相似，甚至於功能。可以在熟知的應用軟體中進行分析，如MolecularSimilarity applications of QUANTA[Molecular Simulations Inc，San Diego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]和MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]。
從本發明的這個方面衍生出了許多實施方式。例如，除了用上述胺基酸定義本發明的結合袋之外，結合袋可以額外包括一個或多個HCV NS5B的胺基酸殘基36，426，498或499。優選這些位置分別被M36，M426，R498和T/V499佔據。
在此方面的另一個實施方式中，多肽可以包括以天然構型存在的HCVNS5B的胺基酸殘基決定簇36和37。優選位置36和37被下述胺基酸佔據M36和V37，或者具有胺基酸序列M-V。
在另一個實施方式中，多肽可以包括以天然構型存在的HCV NS5B的胺基酸殘基決定簇392-399。優選位置392-399被下述胺基酸佔據L392，A393，R394，A395，A396，W397，E398和T399，或者具有胺基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T(SEQ ID NO4)。
在另一個實施方式中，多肽可以包括以天然構型存在的HCV NS5B的胺基酸殘基決定簇424-429。優選位置424-429被下述胺基酸佔據I424，L425，M426，T427，H428和F429，或者具有胺基酸序列I-L-M-T-H-F(SEQID NO5)。
在另一個實施方式中，多肽可以包括以天然NS5B構型存在的HCVNS5B的胺基酸殘基決定簇492-503。在此，優選位置492-503被下述胺基酸佔據L492，G493，V494，P495，P496，L497，R498，T499，W500，R501，H502和R503，或者具有胺基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R(SEQID NO6)。
HCV NS5B多肽類似物第二方面，本發明提供了分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋，其中所述結合袋保持其天然功能構型，且所述結合袋是可暴露的。
保持本文所公開的天然結合袋功能構型的上述NS5B多肽類似物，極方便地提供了天然NS5B多肽的模擬物，可將它設計成在抑制劑篩選試驗中使用時勝過天然NS5B多肽。例如，可將多肽類似物設計成更易製備和使用的，或者更加穩定的。還可以對它進行設計，從而能提供更易獲得的結合袋。
通過上面更詳細描述的定義中的，尤其是術語「類似物」定義中的胺基酸取代、刪除或插入來改變NS5B多肽，獲得NS5B多肽類似物。在此，優選對由胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈進行修飾，提供更易被取代而使本發明結合袋暴露的手指環鏈，或者提供取代或刪除的手指環鏈而暴露結合袋。
如上所述，取代NS5B手指環鏈的至少胺基酸殘基18至35時，就會使本發明的HCV NS5B結合袋暴露。現在已經確定某些化合物能夠取代手指環，而接近結合袋。因此，提供的多肽類似物中的結合袋是可暴露的，即天然NS5B構型被部分NS5B蛋白，如由胺基酸18至35定義的手指環掩蓋，通過用有結合袋傾向的化合物取代而使結合袋暴露。
從本發明的這個方面衍生出了許多實施方式。例如，除了用上述胺基酸定義本發明的結合袋之外，結合袋可以額外包括HCV NS5B的胺基酸殘基36，426或498或499中的一個或多個。優選，結合袋包括所有這些胺基酸殘基。同時，優選這些位置各自被M36，M426，R498和T/V499佔據。
在此方面的另一個實施方式中，多肽的結合袋可以包括以天然構型存在的HCV NS5B的胺基酸殘基36和37。優選位置36和37被下述胺基酸佔據M36和V37，或者具有胺基酸序列M-V。
在此方面的另一個實施方式中，多肽的結合袋可以包括以天然構型存在的HCV NS5B的胺基酸殘基392至399。優選位置392至399被下述胺基酸佔據L392，A393，R394，A395，A396，W397，E398和T399，或者具有胺基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T(SEQ ID NO4)。
在另一個實施方式中，多肽的結合袋可以包括以天然構型存在的HCVNS5B的胺基酸殘基424至429。優選位置424至429被下述胺基酸佔據I424，L425，M426，T427，H428和F429，或者具有胺基酸序列I-L-M-T-H-F(SEQ ID NO5)。
在另一個實施方式中，多肽的結合袋可以包括以天然NS5B構型存在的HCV NS5B的胺基酸殘基492至503。在此，優選位置492至503被下述胺基酸佔據L492，G493，V494，P495，P496，L497，R498，T499，W500，R501，H502和R503，或者具有胺基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R(SEQID NO6)。
在進一步的實施方式中，結合袋殘基的優選序列是與SEQ ID NO1所列序列一致的序列。
如上所述，由於HCV基因型之間存在高水平的序列同源性，在本文中，結合袋和可取代的/取代的手指環區是參考以SEQ ID NO1所列的HCV 1b基因型NS5B序列為基礎的胺基酸位置來進行定義的。但是，本領域的技術人員應該理解，結合袋或手指環的一個或多個胺基酸殘基位置上的微小變化，例如結合袋中一個胺基酸位置由1變為2(其可能由於插入或刪除一個或多個N-末端胺基酸而自然發生)，或者將單個胺基酸轉移到NS5B蛋白其它位置(如，不影響結合袋構型的區域)，仍然可以獲得與本發明相一致的結合袋和具有暴露結合袋功能的手指環。因此，這種位置差異在本發明的保護範圍之內。
HCV NS5B多肽變體在另一方面，本發明提供了HCV NS5B多肽變體，其在由胺基酸殘基18至35定義的手指環內包括至少一個胺基酸突變，其中所述突變能導致該手指環被取代，而使基本由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的結合袋暴露，其中所述結合袋保持其天然功能構型。
本發明此方面所述的NS5B變體可以包括任何能引起由胺基酸18至35定義的手指環發生取代的突變。例如，對與本文所述結合袋內的一個或多個殘基形成結合的胺基酸進行突變，可以阻止這種結合，從而引發取代或「打開」手指環而暴露結合袋。
在本發明的一個實施方式中，對HCV NS5B第30和31位胺基酸殘基中的至少一個進行突變，會使手指環發生取代。在優選的實施方式中，將胺基酸殘基30突變為除亮氨酸之外的胺基酸殘基。更優選，胺基酸殘基30選自P，F，W，M，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R和H。
如上所述的關於結合袋、包含結合袋的附加胺基酸殘基，以及結合袋殘基具體序列的實施方式是關於NS5B多肽和類似物的。
本發明的另一個方面提供了HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其特徵是取代了胺基酸殘基18至35。
本發明的另一個方面提供了HCV NS5B多肽，或其功能等同類似物，其中刪除了至少胺基酸殘基18至35。
如前所述，取代或刪除胺基酸殘基18至35會暴露本文所定義的新型結合袋，該結合袋在開發HCV治療劑中具有重要作用。
HCV NS5B晶體結構在發明的進一方面中，提供了HCV NS5B晶體結構，包括由天然HCVNS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)的結構坐標定義的，或由其功能等同類似物的結構坐標定義的結合袋，其中取代了由至少胺基酸18至35的結構坐標定義的天然手指環鏈而使所述結合袋暴露。優選地，結構坐標如圖4，5或6中任一所示。
暴露抑制劑結合袋的結構對於設計和開發候選NS5B抑制劑是很有價值的工具，因為該結構提供了更清楚理解結合袋構型和總體性質的手段和指導開發治療性NS5B抑制劑的重要知識。
在優選的實施方式中，提供的HCV NS5B晶體結構中的結合袋還額外由胺基酸殘基36，426，498和499來定義。在另一優選的實施方式中，提供的HCV NS5B晶體結構中的結合袋由胺基酸殘基36-37，392-399，424-429和492-503決定簇定義。
HCV NS5B複合物在本發明的另一個實施方式中，提供了包括HCV NS5B多肽和化合物的複合物，其中所述化合物與NS5B多肽內的結合袋結合，所述結合袋由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)來定義，或由其功能等同類似物來定義。
本發明的NS5B抑制劑-結合袋在由胺基酸殘基18至35定義的手指環區發生取代時而暴露。結合袋本身由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義。而且，它還可以進一步由附加的胺基酸殘基36，426，498和499中的一個或多個來定義，或甚至另外由下述胺基酸殘基決定簇36-37，392-399，424-429和492-503定義。
根據本發明的此方面，HCV NS5B多肽可以是天然NS5B多肽，或者是選自下組的HCV NS5B多肽、變體或類似物i)分離和純化的多肽，包括由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的功能HCV NS5B結合袋，其中所述結合袋由於取代了由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈而暴露出來，其中所述結合袋保持其天然功能構型；ii)分離和純化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋組成，其中所述結合袋保持其天然功能構型；iii)分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋，其中所述結合袋保持其天然功能構型且所述結合袋是可暴露的；iv)HCV NS5B多肽變體，其在由胺基酸殘基18至35定義的手指環內包括至少一個胺基酸突變，其中所述突變能導致該手指環被取代，而使基本由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的結合袋暴露，其中所述結合袋保持其天然功能構型；v)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其特徵是取代了胺基酸18至35；和vi)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其中刪除了至少胺基酸殘基18至35。
在此方面的優選實施方式中，複合物包含與選自下述專利文獻WO01/047883，WO 02/004425，WO 03/000254，WO 03/007945，WO 03/010140，WO 03/010141和WO 03/026587中的化合物家族的化合物結合的如上定義的HCV NS5B，類似物或變體。在此方面可選的優選實施方式中，複合物包含與選自描述於美國共同未決申請10/755,256，10/755,544和60/546,213(在此引入以供參考)中的化合物家族的化合物結合的上述HCVNS5B多肽、類似物或變體。以前，未顯示這些化合物會與本申請所要求保護的NS5B結合袋結合，形成本發明所述NS5B複合物。
在更優選的實施方式中，HCV NS5B複合物包含與下述化合物A，B或C中之一種化合物結合的NS5B多肽、類似物和變體化合物A 化合物B 化合物C 圖4，5和6顯示分別與化合物A，B和C結合的SEQ ID No1 HCV NS5B的結構坐標。獲得這些結構坐標的方法，對坐標進行解釋，並解釋該坐標在理解蛋白結構，尤其是本文所述結合袋的效用都是本領域技術人員可以理解的。也可以參考常規教科書，如《晶體結構分析》(Crystal StructureAnalysis)，Jenny Pickworth Glusker和Kenneth N.Trueblood，第二版，OxfordUniversity Press，1985，New York；和《蛋白結構原理》(Principles of ProteinStructure)，G.E.Schulz和R.H.Schirmer，Springer-Verlag，1985，New York，書中進行了深入的指導。
另外，本領域技術人員應懂得酶複合物的一組結構坐標，如圖4，5和6所示，是三維空間上確定形狀的相對的一組點。因此，很有可能完全不同的一組坐標可以定義出相似或相同的形狀，即天然NS5B結合袋的功能等同類似物，從而落在本發明的範圍之內。另外，各個坐標中的微小差別對整體形狀沒什麼影響。對結合袋來說，期望這些變化不會明顯改變可與這些結合袋結合的化合物的性質。
還應引起注意的是由於突變、添加、取代和/或刪除胺基酸而對晶體結構進行修飾，或者構成晶體的任何組分的其它改變都會引起結構坐標改變。如果這種改變在誤差可接受標準內，如與原始坐標相比，對於包含結合袋的α-碳來說rmsd＜1.0_，那麼就認為所得三維形狀相同。因此，例如，與本文所述NS5B結合袋活性位點結合的化合物也可以與其限定形狀的結構坐標在可接受的誤差範圍內的其它結合袋結合。
結晶方法在本發明的另一個方面，提供了製備包括HCV NS5B多肽和化合物的結晶的HCV NS5B複合物的方法，其中所述化合物結合到NS5B結合袋內，所述結合袋是由HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)的結構坐標定義，或由其功能等同類似物定義。
優選的結晶方法包括下述步驟a)在結晶緩衝液中保溫純化的HCV NS5B多肽，獲得結晶的NS5B多肽；b)將化合物溶解；和c)將晶體多肽與溶解的化合物一起在浸泡緩衝液(soaking buffer)中浸泡合適的時間，獲得結晶的Ns5B複合物。
在製備上述結晶的HCV NS5B複合物的可選方法中，直接將化合物加到含結晶的HCV NS5B的結晶緩衝液中。
在另一個可選方法中，通過使NS5B蛋白與化合物一起共結晶來製備上述的結晶的HCV NS5B複合物。該方法包括下述步驟
a)將純化的HCV NS5B多肽與溶解的化合物混合，形成NS5B複合物；和b)複合物在結晶緩衝液中結晶。
在此方面的優選實施方式中，將NS5B與選自上述化合物家族的化合物複合。更優選，化合物是選自上述化合物A、B或C中的一個，或其相關化合物。如上所述，結晶方法可以包括直接將化合物加到含有結晶的HCVNS5B的結晶緩衝液中，或者以溶解形式將純化的HCV NS5B多肽與化合物混合。當使用溶解形式的化合物時，優選將化合物溶解在濃度約25mM的100％DMSO中。
將濃度約5mg/mL-約15mg/mL的NS5B與純化緩衝液混合。優選，純化緩衝液中所用的NS5B濃度是約7-10mg/mL。純化緩衝液的性質通常在本領域中是已知的，其包括用於穩定HCV NS5B的鹽和/或甘油，使用的純化緩衝液pH在約6和約9之間。純化緩衝液的優選pH是約7.5。緩衝液如但不限制到Tris-，HEPES或bis-Tris，使用的濃度是約0mM-約50mM。優選緩衝液是濃度約20mM的Tris-。
為了穩定HCV NS5B，可將濃度約200mM-約800mM的鹽如，或加到緩衝液中。優選鹽是濃度約300mM的。
為了進一步穩定HCV NS5B，可加入濃度約0％-約30％的甘油。優選甘油濃度是約10％。
更優選，純化緩衝液約pH7.5，包括濃度約20mM的Tris-，濃度約10％的甘油，濃度約5mM的DTT，和濃度約300mM的。
可利用本領域已知的任何一種技術來讓NS5B多肽結晶，包括如油下分批結晶(batch crystallization under oil)、懸滴式蒸汽擴散(hanging drop vapordiffusion)和直滴式蒸汽擴散(sitting drop vapor diffusion)技術。實現本發明目的的優選結晶方法是如McPherson等(Preparation and Analysis of ProteinCrystals，Krieger Pub.1989)中所述的懸滴式蒸汽擴散技術。簡單的講，該結晶方法包括將含純化的NS5B的液滴置在儲存溶液(reserveoir solution)上方的結晶緩衝液中。液滴的蒸汽擴散使蛋白濃度增加，從而促進結晶。
使用的結晶緩衝液選自本領域技術人員已知的任一種適合本目的的緩衝液，包括但不限於濃度約50mM-約0.2M的MES，磷酸鈉，磷酸鉀，乙酸鈉或琥珀酸鈉。優選結晶緩衝液是濃度約0.1M的MES。
結晶緩衝液的pH通常在約4.5-約6.5之間，優選使用的結晶緩衝液pH是約5.4。
結晶緩衝液可以額外包括至少一種促NS5B結晶的沉澱劑。合適的沉澱劑的例子包括但不限於PEG，PEG5K mme(單甲醚聚乙二醇5000)，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇或叔丁醇。使用的沉澱劑濃度通常為約30％-約40％。在優選的實施方式中，沉澱劑是濃度約21％的PEG5K mme和濃度約0.4mM的硫酸銨。
在常規的結晶條件下誘導NS5B結晶。例如，在約0℃-約22℃的溫度下進行結晶。誘導結晶的優選溫度在約4℃-約11℃之間。
在優選的結晶方法中，在存在浸泡緩衝液的條件下，將溶劑的化合物浸入結晶的NS5B多肽中。浸泡緩衝液可包含任意一種常規緩衝液，包括但不限於濃度約50mM到約0.2M的MES，Tris，磷酸鈉，乙酸鈉和琥珀酸鈉。優選使用的浸泡緩衝液濃度是約0.1M。浸泡緩衝液的pH通常是約5-約8，優選使用的浸泡緩衝液pH是約7.0。
通過添加任何合適的蛋白，包括但不限於溶菌酶，BSA或甚至額外的NS5B，可將浸泡緩衝液的蛋白含量補充到濃度高至約10mg/mL。
浸泡緩衝液可以包括起NS5B穩定劑作用的補充劑。可將一種或多種濃度約100mM-約500mM的鹽，如，或加到緩衝液中去。優選加入的鹽濃度在約150mM到約300nM之間。更優選，加入濃度分別約210mM和約280mM的和。
為了進一步穩定HCV NS5B，可將濃度約10-20％的甘油加到浸泡緩衝液中去。優選加入的甘油濃度是約14％。
結晶緩衝液可以額外包括至少一種促結晶的沉澱劑。合適的沉澱劑的例子包括但不限於PEG，PEG5K mme(單甲醚聚乙二醇5000)，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇或叔丁醇。使用的沉澱劑濃度通常為約10％-約18％。在優選的實施方式中，沉澱劑是濃度約14％的PEG5K mme和濃度約0.4mM的硫酸銨。
將結晶的NS5B和溶解的化合物浸泡在浸泡緩衝液中約1到約12小時，優選約3到約8小時，更優選約5到約6小時的適宜浸泡時間。浸泡時的溫度是約5-約15℃，優選溫度是約11℃。
在可選的結晶方法中，將化合物加到含結晶的NS5B的結晶緩衝液中。在該方法中，將化合物簡單地噴灑到緩衝液上，隨後保溫合適的時間讓其溶解和結晶。
在另一個可選的結晶方法中，讓NS5B和化合物在如上所述僅用於NS5B的結晶緩衝液中共結晶。在該方法中，將NS5B和溶解的化合物在結晶緩衝液中混和，在如上所述的結晶條件下結晶。
按照本發明，結晶的NS5B複合物能按照X-射線晶體學進行處理是很重要的。利用X-射線晶體學分析，獲得的NS5B複合物晶體空間群(spacegroup)屬P2(1)2(1)2(1)，單位晶胞大小為a＝105.1，b＝106.6，c＝133.5，每個不對稱單位有兩個分子。利用配有R-axis IV++影像平板監視器(image platearea detector)的MicroMax007 home source X射線發生器(Rigaku，Japan)收集衍射數據。優選，對單個複合物晶體收集解析度為2.8_的數據。
X-射線坐標另一個方面，提供了上述NS5B複合物的X-射線晶體結構坐標。甚至更優選，NS5B複合物的結構坐標由圖4，圖5和圖6中之一來限定。
本發明的NS5B複合物的三維結構由圖4，圖5和圖6中任一所示的一組結構坐標來限定。術語「結構坐標(structure coordinate)」是由數學操作獲得的Cartesian坐標，所述操作與對晶體複合物的原子(散射中心)進行X-射線單色光束衍射所獲得的圖形相關。用衍射數據計算晶體重複單元的電子密度圖。然後用電子密度圖確定已知結構坐標的結合袋的各個原子的位置。
本領域技術人員應懂得一組蛋白或蛋白抑制劑複合物或其部分的結構坐標是在三維空間上確定形狀的的相對的一組點。因此，很有可能完全不同的一組坐標能定義出相似或相同的形狀。
通過對結構坐標進行數學操作可以使坐標改變。例如，通過對圖4，5或6所示的結構坐標進行結構坐標晶體學排列、分級或對所述多組結構坐標或其組合進行矩陣操作，即可對結構坐標進行操作。
必需測定分子或分子複合物或其部分是否與本文所述的全部或部分HCV NS5B蛋白或NS5B複合物足夠類似以致於可以認為兩者是等效的。利用目前所用的應用軟體，如QUANTA的分子相似性應用軟體[MolecularSimulations Inc，San Diego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]和MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]即可進行這種分析。
分子相似性應用能比較不同的結構，相同結構的不同構象以及相同結構的不同部分。在比較結構的分子相似性中使用的方法分為下述四步1)輸入待比較的結構；2)限定這些結構中的等效原子，3)進行吻合度(重疊)操作；和4)分析結果。
計算機-可讀性存儲介質另外，在本發明的另一方面，提供了一種計算機可讀性存儲介質，其上存儲有HCV NS5B複合物的晶體結構模型，所述HCV NS5B複合物包括HCV NS5B多肽和化合物，其中所述化合物與由圖4、5和6所示的天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)的結構坐標定義的，或由其功能等同類似物的結構坐標定義的NS5B結合袋結合。
計算機可讀性數據存儲介質是本領域技術人員所熟知的，包括如硬碟、CD-ROM、磁碟(軟盤)和DVD。
根據本發明的此方面，可將NS5B複合物和其部分的結構坐標存儲在機器可讀性存儲介質中。該數據可用於各種目的，如藥物開發和蛋白晶體的X-衍射晶體學分析。
在此方面的優選實施方式中，HCV NS5B複合物包括與上述確定的化合物家族中的化合物複合的NS5B。更優選，NS5B複合物包括與化合物A、B或C中的一種化合物結合的NS5B。
如前所述，結合袋可以額外由選自胺基酸殘基36，426，498和499中的一個或多個附加胺基酸殘基來定義，或甚至另外由胺基酸簇36-37，392-399，424-429和492-503定義。
NS5B複合物的坐標數據，如圖4、5和6所示，當與計算機聯合使用時，其中所述計算機裝有將這些坐標翻譯成三維結構的軟體程序，就可用於各種目的，尤其是有關藥物開發的目的。產生上述三維圖解圖像的軟體是已知且可以商購的。例子包括Quanta和WebLite Viewer。現用的坐標數據需要以計算機可讀格式存儲。因此，按照本發明，將能以三維結構顯示的數據存儲在計算機可讀介質上，當在裝有指示利用該數據程序的機器上使用時，該介質能顯示本文所述HCV NS5B複合物或HCV NS5B結合袋的圖解三維圖像。
HCV NS5B X-射線坐標數據對篩選潛在NS5B抑制活性的化合物是有用的。例如，可以利用計算機對由數據編碼的多肽NS5B結合袋結構結合指定化合物的能力來進行評價。同時，通過某種類型的結合而確定「適合」本文所述結合袋的化合物可能會阻止HCV NS5B聚合酶的生物活性，這樣，該化合物就代表一種潛在的藥物候選物。另外，可以在計算機屏幕上顯示數據的圖解三維圖像，從而可以目測HCV NS5B結合袋和化合物在NS5B複合物中的結合袋內的結合。
鑑定HCV NS5B結合化合物的虛擬方法在進一步的方面，本發明提供了一種評價化合物複合HCV NS5B潛力的虛擬方法。該方法描述為第一輪篩選搜索與本發明結合袋結合的化合物，並最終搜索到由於結合結合袋導致HCV抑制而具備治療效力的化合物。
因此，在本發明的進一步方面，提供了一種鑑定潛在HCV抑制劑的虛擬篩選方法，其包括下述步驟a)構建HCV NS5B結合袋的計算機模型，所述HCV NS5B結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)的結構坐標定義，或由其功能等同類似物定義；b)用計算工具對待測化合物和NS5B結合袋的計算機模型進行吻合度程序操作，從而提供所述化合物在該結合袋內的能量最小化構型；和c)對吻合度操作的結果進行評價，量化化合物和結合袋間的結合，其中與結合袋結合、產生低能量、穩定複合物的化合物是潛在的NS5B抑制劑。
另外，本發明提供了一種鑑定結合HCV NS5B的化合物的方法，包括步驟a)將三維分子模型算法應用於HCV NS5B結合袋的結構坐標，確定HCV NS5B結合袋的空間坐標，其中所述HCV NS5B結合袋由天然HCVNS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)來定義；和
b)在HCV NS5B結合袋空間坐標的背景下對存儲的候選化合物的空間坐標進行電子篩選，鑑定能結合到HCV NS5B結合袋內的化合物。
在本發明此方面的優選實施方式中，結合袋可以額外由胺基酸殘基36，426，498和499中的一個或多個來定義，或者由胺基酸殘基36-37，392-399，424-429和492-503定義的一個或多個胺基酸簇來定義。
在本發明的另一個優選實施方式中，結合袋的結構坐標是如圖4，5和6所示的結構坐標，或者是本領域技術人員能理解的功能等同的結構坐標。
根據本發明的此方面，任何給定化合物都可以在計算機上評價其與本文所述HCV NS5B結合袋的結合能力，以及其作為確定的NS5B抑制劑的潛力。如上暗示，利用已知軟體，如QUANTA[Molecular Simulations Inc，SanDiego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]，MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]可構建出由本文所述HCV NS5B結合袋構成的多肽的計算機模型。然後將要評價的待選化合物置於結合袋內的多個定位內，或者停靠在結合袋內。可利用軟體如GRID，DOCK，AUTODOCK，FlexX和GOLD實現停靠。當化合物停靠在結合袋內產生NS5B複合物「虛擬」圖像時，可進一步使用計算工具，利用軟體如QUANTA，Sybyl，InsightII和MOE獲得複合物的定量和定性圖，包括如，藥效團圖，表面性質圖(繪製Conolly，Gaussian and van der Waalssurfaces)和隨機受體潛力圖。
可通過計算機評估來檢測和優化所選化合物與本發明HCV NS5B結合袋結合的效力。例如通過目測定性確定的或者利用評分函數如LUDI，PLP，PMF，SCORE，GOLD和FlexX定性確定的形狀、大小和靜電互補來對給定化合物在NS5B結合袋內的配合等級進行評價。可單獨或組合，例如以一致評分法使用這些定性和定量評價法。
另外，可以在化合物與HCV NS5B結合形成複合物的相互作用能量基礎上對結合效力進行評價。例如，以本文所述方式與NS5B形成「低能量穩定複合物」的確定化合物，保證會進一步分析作為潛在的NS5B抑制劑。本文所用術語「低能量穩定複合物」解釋為NS5B複合物中的範德華(van derWaals)相互作用能量值，即化合物和NS5B相互作用的範德華能量小於約8000kcal/mol的NS5B複合物。可利用軟體MOE，並在MMFF94力場基礎上確定範德華相互作用能量值。因此，確定形成範德華相互作用能量值小於約8000kcal/mol的複合物的化合物是潛在的NS5B抑制劑。優選，本發明的低能量穩定複合物的範德華相互作用能量值小於約6000kcal/mol，更優選小於約4000kcal/mol。
利用本發明NS5B多肽變體/類似物的方法一旦利用虛擬方法，如上面描述的虛擬方法對許多化合物進行了篩選，就可以對已確定是潛在HCV抑制劑的化合物進行進一步的評價，來確定其與本發明結合袋相互作用和抑制HCV的實際傾向。
這樣，本發明的另一個方面，提供了一種篩選候選HCV NS5B抑制劑化合物的方法，包括下述步驟a)在適合與多肽結合的條件下，保溫候選抑制劑化合物，其中所述多肽選自下組i)分離和純化的多肽，包括由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的功能HCV NS5B結合袋，其中所述結合袋由於取代了由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈而暴露出來，其中所述結合袋保持其天然功能構型；ii)分離和純化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋組成，其中所述結合袋保持其天然功能構型；iii)分離和純化的HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋，其中所述結合袋保持其天然功能構型且所述結合袋是可暴露的；iv)HCV NS5B多肽變體，其在由胺基酸殘基18至35定義的手指環內包括至少一個胺基酸突變，其中所述突變能導致該手指環被取代，而使基本由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義的，或由其功能等同類似物定義的結合袋暴露，其中所述結合袋保持其天然功能構型；v)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其特徵是取代了胺基酸18至35；和vi)HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其中刪除了至少胺基酸殘基18至35；和b)測定候選抑制劑化合物是否與多肽結合，其中與多肽結合的化合物是潛在的HCV NS5B抑制劑。
可以利用本領域的固定方法對候選化合物在定義的HCV NS5B結合袋內的結合進行測定。例如，可以使用結合試驗，該試驗在適合發生結合的條件下，將候選化合物與含有本發明NS5B結合袋的多肽接觸。然後，例如利用NMR或其它已知的檢測技術對結合進行評估。
設計HCV NS5B抑制劑的方法在本發明的進一步方面，提供了設計與本文所述NS5B結合袋結合的化合物的方法。因此，本發明提供了以NS5B中的新結合袋結構為基礎，利用分子設計技術鑑定、選擇或設計潛在HCV NS5B抑制劑的機會。該預測模型對於高成本的製備和測定可能或不可能結合HCV NS5B蛋白的多種不同化合物來講是有價值的。
根據本發明，可以在實際合成和檢測前，對潛在NS5B抑制劑與本文所述NS5B結合袋的結合能力進行評價。如果推測擬用化合物不足以與結合袋相互作用或結合，那就排除製備和檢測該化合物。但如果計算機模型顯示相互作用很強，那就可以製備該化合物並完全測定其結合能力。可利用本領域技術人員範圍內的常規試驗來進行測定，從而確定結合。
在此，所提供的設計能與上述NS5B多肽結合的化合物的方法包括下述步驟評價化合物和NS5B多肽內結合袋的互補性，即「符合度」，其中所述結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義，或由其功能等同類似物定義。
類似地，提供的製備抑制HCV NS5B的RNA複製活性的藥物的方法包括鑑定或設計正好符合NS5B結合袋的化合物，所述NS5B結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任選胺基酸殘基37和496中的一個)定義，或由其功能等同類似物定義，其中所述結合袋由於取代了由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈而暴露出來。
作為第一次，本發明允許使用基於結構或合理的藥物設計技術來設計、選擇和合成化學個體，包括能放進和/或結合本文所定義的新型NS5B結合袋的抑制性化合物。
本發明可用的一具體有用的藥物設計技術是迭代藥物設計。迭代藥物設計是一種通過測定和評估蛋白質/化合物複合物的連續套三維結構，優化蛋白質和化合物之間結合的方法。
本領域技術人員將意識到天然配體或底物與其對應的受體或酶的結合袋的結合是多種生物作用機制的基礎。類似地，許多藥物通過與受體和酶的結合空穴結合發揮其生物效應。這種結合可發生在所有或任何部分的結合袋。理解這種結合有助於設計更易於與其靶受體或酶結合的性質的藥物，從而提高了生物效應。因此，該信息在設計本發明潛在受體或酶的配體或抑制劑，如HCV NS5B類多肽，尤其是HCV NS5B的抑制劑中非常有用。
在迭代藥物設計時，先獲得一系列蛋白質/化合物複合物的晶體。然後將各複合物的三維結構解析。這一途徑提供各複合物蛋白質和化合物之間的結合的深入了解。如下達到該目的選擇具有抑制活性的化合物、獲得該新蛋白質/化合物複合物的晶體、解析該複合物的三維結構以及比較新蛋白質/化合物複合物之間的結合和先前解析的蛋白質/化合物複合物之間的結合。通過觀察化合物變化如何影響蛋白質/化合物結合，可以優化結合。
下面將通過具體實施例對本發明的具體實施方式
進行描述，而不應將其理解為限制本發明。
實施例實施例1-表達和純化HCV NS5B通過將缺失了通常在成熟NS5B中發現的C末端21個胺基酸的變體表達，來製備溶解的重組HCV1b基因型(J4株)NS5B聚合酶(其胺基酸序列示於SEQ ID NO1中)。為了本發明的目的，表達的NS5BΔ21C末端具備6-His序列。在24℃，用0.4mM IPTG處理3小時，誘導大腸桿菌菌株JM109(DE3)中的pET載體表達NS5B。收穫細胞(在25mM Tris pH7.5，10％甘油，1mMEDTA，500mM ，2mM 2-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑混合物(購自RocheBiochemicals Inc.的標準混合物)，並在微流化器(microfluidizer)中裂解。將裂解物離心(30,000X)後，按照本領域技術人員所熟知的下述連續層析步驟來純化(i)利用Ni-NTA樹脂(Qiagen)進行金屬親和層析，用含遞增濃度(從10mM-500mM)的咪唑的緩衝液洗脫；(ii)DEAE-Sepharose層析，其中NS5B溶於含300mM 的緩衝液中過柱；(iii)肝素Sepharose層析，其中NS5B在含200mM 的緩衝液中，然後用含梯度高至1M 的緩衝液洗脫所結合的NS5B。在Resource S柱上濃縮富含NS5B蛋白的洗脫組分，然後用20mM Tris- pH7.5，10％甘油，5mM DTT，300mM 過Superdex200柱。將含高純度His-標記NS5B的峰值組分-80℃保存，直至使用。
實施例2-HCV NS5B的結晶用單甲醚聚乙二醇5000(PEG5Kmme)作沉澱劑，將如實施例1詳述獲得的HCV聚合酶NS5B株1b/J4(SEQ.ID NO1)結晶為其apo形式。利用懸滴式蒸氣擴散技術(McPherson，見上)獲得大的單晶體。具體地，將1μL NS5B(7.66mg/mL在含20mM Tris，pH7.3，300mM ，10％甘油的純化緩衝液中)加到由21％PEG5Kmme，0.1M MES，pH5.4，10％甘油和0.4M硫酸銨組成的1μL溶液中。將獲得的2μL液滴懸在由21％PEG5Kmme，0.1MMES，pH5.4，20％甘油和0.4M硫酸銨組成的1mL儲液之上。所得NS5B複合物晶體屬空間群P2(1)2(1)2(1)，單位晶胞大小為a＝105.1，b＝106.6，c＝133.5，每個不對稱單位包括兩個分子。利用由常規旋轉正極源(regularrotating anode source)發出的X射線，顯示晶體衍射(diffract)解析度高至2_。
實施例3-製備抑制劑化合物A，B和C根據2004年1月12日提交的共同未決申請US 10/755,256製備抑制劑化合物A。
根據2004年1月12日提交的共同未決申請US 10/755,256製備抑制劑化合物B。
根據2003年1月22日公開的WO 03/007945製備抑制劑化合物C。
實施例4 NS5B-抑制劑複合物的形成抑制劑浸泡將晶體移至由14％PEG5Kmme，14mM Tris，pH7.5，70mM MES，pH7.0，14％甘油，210mM ，10mg/mL溶菌酶和280mM硫酸銨組成的5μL浸泡液液滴中。抑制劑分子用DMSO溶解，濃縮至25mM。將抑制劑溶液(0.2μL)加到5μL NS5B晶體液滴中，11℃保溫5-6小時。保溫後，用cryoloop(Hampton Research，California，USA)將NS5B-抑制劑複合物晶體從溶液中移出，在液氮內低溫冷藏(cryo-cooled)。利用化合物A和B製備NS5B複合物。
數據收集在配有Raxis-IV++影像信號板監視器(Rigaku/MSC，Texas，USA)的MicroMax-007旋轉正極x-射線發生器上收集衍射數據。在用化合物A和化合物B製備的NS5B複合物於-180℃低溫冷藏的單晶體上採集解析度2.8_的數據。
定相(phasing)，構建模型和精加工利用HCV NS5B的公眾可得結構(pdb code1C2J)通過分子替換(MR)對衍射數據進行定相。利用程序CNX(Accelrys)進行旋轉和平移檢索(translation search)。用軟體O(Alwyn Jones，Upsala University，Sweden)進行模型構建，用CNX軟體(Accelrys)進行模型精加工。通過多輪模型構建和精加工來改善模型，直到獲得所需結果。所有情況下的最終模型包括兩分子NS5B，鑑定為NS5B A和NS5B B，(即殘基A1至A149，A154至A563，B1至B17，B36至B148和B153至B563)和一分子與NS5B分子B結合的化合物A或B。化合物A和化合物B NS5B複合物的最終原子結構坐標分別示於圖4和圖5中。NS5B-化合物A複合物的最終結晶(crystallographic)R因子是21.9％，R游離因子是28.0％，解析度2.8_。NS5B-化合物B複合物的最終結晶R因子是21.9％，R游離因子是25.7％，解析度2.7_。
實施例5 基於NMR結合構象的NS5B-化合物C複合物模型按照本文詳細描述的幾個步驟來確定化合物C在HCV聚合酶上的結合位點。開始，用NMR光譜法(轉移的NOESY)確定化合物C與HCV聚合酶結合時的結構。另一種NMR技術，差示譜線增寬(DLB)幫助辨認化合物C中與聚合酶結合的片段以及在結合狀態下暴露於溶劑的片段。然後將該結合結構對接(dock)在NS5B-化合物A複合物的X-射線衍生結構上。通過將化合物A和化合物C的吲哚和苯並咪唑所共有的5/6芳香環重疊，開始對接過程。然後，計算所有差示譜線增寬數據，利用MOE使複合物能量最小化。
按照下述方法獲得轉移的NOESY和DLB數據。將15μL的DMSO-d6濃縮液(含0.31mg化合物C)加入由20mM Tris-d11，2mM DTT-d10，1mMEDTA-d12，300mM 和摻有TSP-2，2，3，3-d4的10％(v/v)D2O組成的含水緩衝液中，製得含化合物C的樣品管(5mm)。將緩衝液終體積加到600μL，pH調為6.0。記錄游離化合物C的光譜。往NMR管中加兩次HCV聚合酶濃縮貯存液，測定光譜。在緩衝液中，濃縮貯存物包含21.7mg/mL HCV聚合酶(NS5BΔ21C-His6)，其中緩衝液組成為20mM Tris-d11，2mM DTT-d10，1mM EDTA-d12，300mM 和10％(v/v)甘油-d8。
於22和27℃，在Bruker AVANCE 600和800MHz NMR光譜儀上獲得NMR譜。溶劑信號的抑制是通過利用預飽和或通過在獲得數據前插入3-9-19WATERGATE模塊獲得的。採集兩個樣品管的一維光譜，用於DLB對比，採集各光譜的128輪掃描。不含聚合酶的樣品管的NOESY試驗結果沒有觀察到預期的明顯交叉峰。另外，含聚合酶的樣品管的NOESY光譜觀察到許多交叉峰，其包括抑制劑C與HCV聚合酶結合時有價值的內氫距離信息。記錄的一系列NOESY混合時間包括75，100，150，200和300秒(600和800MHz場)。通常獲得的二維數據組t2中是2048個點，t1中是512個點。取128輪掃描的均值用於NOESY FIDs。利用Bruker’s XWinNMR和WinNMR軟體(Bruker Canada，555 Steeles Ave.East，Milton，Ontario)加工和分析數據。在利用相移位sinebell窗口功能轉化後，對數據組進行零填充，產生2048×2048個真實數據點。
通過定製的模擬退火方法計算出化合物C結構，該方法在MOE分子建模程序(CCG，Montreal，Qc，Canada)中實現。利用mmff94力場在MOE的2202.03版本中實現全部計算。從系列NOESY數據獲得NMR-衍生的平底限制(flat-bottomed restraint)。將NOESY交叉峰的相對強度分為3級，然後作為限制，強(1.8-2.7_)，中(1.8-3.5_)或弱(1.8-5.0_)。冷卻階段，NMR-衍生的平底限制中的力常數逐漸增高。在1000K進行單獨的高溫無限制動力學測試(run)，以10psec間隔收集100個結構，獲得起始組構象。各結構利用下述模擬退火方法進行冷卻和最小化。在模擬過程中，溫度和限制權重(weight)分別是從1000K變到50K和從1/1000000變到20。使最終結構發生能量最小化，計算總能量，計算限制能，確定限制背離(restraint violation)。分離出NMR-一致結構，對兩個家族的結構進行鑑定。
然後，將NMR-衍生結構各家族的一個代表物對接在NS5B-化合物A複合物的X-射線衍生結構上。通過將化合物A和化合物C的吲哚和苯並咪唑所共有5/6芳香環重疊開始對接過程。化合物C只有一種結構同時與DLB數據和結合袋形狀匹配。在該複合物中，化合物C的右手側位於Pro 495和Pro 496上或與Pro 495和Pro 496鄰近。利用MOE分子建模程序，可以對第503，498和499位胺基酸的側鏈取向進行略微重調，從而提高抑制劑-聚合酶吻合度。將His 428和502質子化。利用最陡降幅、共軛梯度和刪簡的Newton算法的組合使複合物能量最小化，從而使該結構只發生較小變化。建立一種方法，從而可以讓抑制劑與位於抑制劑6_內的聚合酶殘基在最小化過程中移動，而其它所有殘基均固定，使用的遠程力閾值是9.5-10_。將在MOE分子建模程序2002.03版中運行的mmff94s力場用於計算，包括溶劑化。使用MOE分子建模程序進行複合物可視化。
NS5B-化合物C複合物的結構坐標獲自最終的最小化，並示於圖6中。
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US 10/755544.
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                             序列表110貝林格爾.英格海姆國際有限公司(BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH)120C型肝炎病毒NS5B聚合酶抑制劑結合袋13013/12314060/469,6041412003-05-091606170FastSEQ for Windows Version 4.02101211576212PRT213HCV4001Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala 1               5                  10                  15Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg            20                  25                  30His His Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Leu Arg        35                  40                  45Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Asp His Tyr    50                  55                  60Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala65                  70                  75                  80Lys Leu Leu Ser Ile Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser                85                  90                  95Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser            100                 105                 110Ser Arg Ala Val Asn His Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu        115                 120                 125Asp Thr Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Ser Glu Val    130                 135                 140Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile145                 150                 155                 160Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr                165                 170                 175Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly            180                 185                 190Phe Gln Tyr Ser Pro Lys Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Thr Trp        195                 200                 205Lys Ser Lys Lys Cys Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe    210                 215                 220Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr225                 230                 235                 240Gln Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gln Ala Ile Arg Ser Leu                245                 250                 255
Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln            260                 265                 270Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser        275                 280                 285Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Thr Ala Ala Cys Arg    290                 295                 300Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Leu305                 310                 315                 320Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ala Leu                325                 330                 335Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp            340                 345                 350Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser        355                 360                 365Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu    370                 375                 380Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala385                 390                 395                 400Arg His Thr Pro Ile Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala                405                 410                 415Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile            420                 425                 430Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr        435                 440                 445Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu    450                 455                 460Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly465                 470                 475                 480Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro                485                 490                 495Leu Arg Thr Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Lys Leu Leu            500                 505                 510Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp        515                 520                 525Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Gln    530                 535                 540Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile545                 550                 555                 560Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg His His His His His His                565                 570                 57521022114212PRT213HCV4002Ser Met Ser Tyr 121032114212PRT213HCV4003
Leu Gly Val Pro 121042118212PRT213HCV4004Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr 1               521052116212PRT213HCV4005Ile Leu Met Thr His Phe 1               5210621112212PRT213HCV4006Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Thr Trp Arg His Arg 1               5                  10
權利要求
1.選自下組的分離且純化的多肽i)多肽，包括由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B抑制劑結合袋，其中所述結合袋由於取代了由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈而暴露出來，且所述結合袋保持其天然功能構型；ii)HCV NS5B多肽類似物，包括由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋，其中所述結合袋保持其天然功能構型且所述結合袋是可暴露的；iii)HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的HCV NS5B結合袋組成，其中所述結合袋保持其天然功能構型；和iv)HCV NS5B多肽變體，其在由胺基酸殘基18至35定義的手指環內包括至少一個胺基酸突變，其中所述突變能導致該手指環被取代，而使基本由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定義的，或由其功能等同類似物定義的結合袋暴露，其中所述結合袋保持其天然功能構型。
2.權利要求1所述的多肽，其中結合袋由選自胺基酸殘基37和496的一個或多個附加胺基酸殘基來定義。
3.權利要求2所述的多肽，其中結合袋由選自胺基酸殘基36，426，498和499的一個或多個附加胺基酸殘基來定義
4.權利要求1所述的多肽，其中結合袋額外由選自36-37，392-399，424-429和492-503中的一個或多個胺基酸簇定義。
5.權利要求2所述的多肽，其中結合袋具有胺基酸序列V37，L392，A393，A395，A396，T399，I424，L425，H428，F429，L492，G493，V494，P495，P496，W500和R503。
6.權利要求3所述的多肽，其中所述附加的胺基酸具有胺基酸序列M36，M426，R498和T499。
7.權利要求4所述的多肽，其中胺基酸簇36-37具有胺基酸序列M-V，胺基酸簇392-399具有胺基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T，胺基酸簇424-429具有胺基酸序列I-L-M-T-H-F，且胺基酸簇492-503具有胺基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R。
8.權利要求1所述的多肽，其中HCV NS5B多肽變體的第30和31位中的至少一個胺基酸殘基是突變的。
9.權利要求8所述的多肽，其中第30位的胺基酸殘基是突變的。
10.權利要求9所述的多肽，其中將第30位的胺基酸殘基突變為選自P，F，W，M，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R和H的胺基酸。
11.HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，特徵是取代了胺基酸殘基18至35。
12.HCV NS5B多肽或其功能等同類似物，其中刪除了至少胺基酸殘基18至35。
13.HCV NS5B晶體結構，包含由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496的結構坐標定義的，或由其功能等同類似物的結構坐標定義的結合袋，其中取代了由至少胺基酸18至35的結構坐標定義的天然手指環鏈，使所述結合袋暴露。
14.NS5B複合物，包含由權利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中化合物在NS5B多肽內與結合袋結合，所述結合袋由天然HCV NS5B的胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496定義，或由其功能等同類似物定義。
15.權利要求14所述的複合物，其中所述化合物具有下述化學式(A)
16.權利要求14所述的複合物，其中所述化合物具有下述化學式(B)
17.權利要求14所述的複合物，其中所述化合物具有下述化學式(C)
18.一種製備結晶的HCV NS5B複合物的方法，所述複合物包含權利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中所述化合物與由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503並且任選胺基酸殘基37或496定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結合袋結合，所述方法包含下述步驟a)在結晶緩衝液中保溫純化的HCV NS5B多肽，獲得結晶的NS5B多肽；b)將化合物溶解；和c)在浸泡緩衝液中，將所述結晶的NS5B多肽與溶解的化合物一起浸泡適當的浸泡時間，獲得結晶的NS5B複合物。
19.權利要求18所述的方法，其中結晶緩衝液選自MES，磷酸鈉，磷酸鉀，乙酸鈉或琥珀酸鈉。
20.權利要求19所述的方法，其中使用的結晶緩衝液濃度在約50mM-0.2M之間。
21.權利要求20所述的方法，其中結晶緩衝液是濃度約0.1M的MES。
22.權利要求18所述的方法，其中所述結晶緩衝液額外包括至少一種沉澱劑。
23.權利要求22所述的方法，其中沉澱劑是選自由PEG，PEG5K mme，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇和叔丁醇組成的組中的沉澱劑。
24.權利要求23所述的方法，其中使用的沉澱劑濃度在約30％-約40％之間。
25.權利要求24所述的方法，其中沉澱劑是濃度約21％的PEG5K mme和濃度約0.4mM的硫酸銨。
26.權利要求18所述的方法，其中浸泡緩衝液是選自由MES，Tris，磷酸鈉，乙酸鈉和琥珀酸鈉組成的組中的浸泡緩衝液。
27.權利要求26所述的方法，其中使用的浸泡緩衝液濃度在約50mM-約0.2M之間。
28.權利要求18所述的方法，其中浸泡緩衝液包含最高約至10mg/mL的蛋白。
29.權利要求18所述的方法，其中浸泡緩衝液額外包括選自，和的一種或多種鹽。
30.權利要求29所述的方法，其中存在於浸泡緩衝液中的鹽濃度是約100mM-約500mM。
31.權利要求30所述的方法，其中浸泡緩衝液包含和。
32.權利要求31所述的方法，其中浸泡緩衝液包括濃度約210mM的和濃度約280mM的。
33.權利要求18所述的方法，其中浸泡緩衝液額外包括濃度約10-約20％的甘油。
34.權利要求18所述的方法，其中浸泡緩衝液額外包括至少一種沉澱劑。
35.權利要求34所述的方法，其中沉澱劑是選自由PEG，PEG5K mme，硫酸銨，MPD，異丙醇，乙醇和叔丁醇組成的組中的沉澱劑。
36.權利要求35所述的方法，其中沉澱劑的存在濃度是約10％-約18％。
37.權利要求36所述的方法，其中浸泡緩衝液包括濃度約14％的沉澱劑PEG5K mme(單甲醚聚乙二醇5000)和濃度約0.4mM的硫酸銨。
38.權利要求18所述的方法，其中浸泡時間是約3-約8小時。
39.權利要求38所述的方法，其中浸泡時間是約5-約6小時。
40.一種製備結晶的HCV NS5B複合物的方法，所述複合物包含權利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中所述化合物與由天然HCVNS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結合袋結合，其中該方法包含將所述化合物加到含結晶的HCV NS5B的結晶緩衝液中的步驟。
41.一種製備結晶的HCV NS5B複合物的方法，所述複合物包含權利要求1-12中任一項所述的多肽和化合物，其中所述化合物與由天然HCVNS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496定義的，或由其功能等同類似物定義的NS5B結合袋結合，所述方法包含下述步驟a)將純化的HCV NS5B與溶解的化合物混合，形成NS5B複合物；和b)在結晶緩衝液中讓複合物結晶。
42.權利要求14所述HCV NS5B複合物的一組X-射線晶體結構坐標。
43.權利要求15所述HCV NS5B複合物的一組X-射線晶體結構坐標。
44.權利要求43所述的坐標，如圖4所示。
45.權利要求16所述HCV NS5B複合物的一組X-射線晶體結構坐標。
46.權利要求45所述的坐標，如圖5所示。
47.權利要求17所述HCV NS5B複合物的一組X-射線晶體結構坐標。
48.權利要求47所述的坐標，如圖6所示。
49.一種計算機可讀性存儲介質，其上存儲有權利要求14所述HCVNS5B複合物的晶體結構的結構坐標。
50.一種計算機可讀性存儲介質，其上存儲有權利要求15所述HCVNS5B複合物的晶體結構的結構坐標。
51.權利要求50所述的存儲介質，其上存儲有圖4所示的結構坐標。
52.一種計算機可讀性存儲介質，其上存儲有權利要求16所述HCVNS5B複合物的晶體結構的結構坐標。
53.權利要求52所述的存儲介質，其上存儲有圖5所示的結構坐標。
54.一種計算機可讀性存儲介質，其上存儲有權利要求17所述HCVNS5B複合物的晶體結構的結構坐標。
55.權利要求54所述的存儲介質，其上存儲有圖6所示的結構坐標。
56.一種鑑定結合HCV NS5B的化合物的方法，包括下述步驟a)將三維分子模型算法應用於HCV NS5B結合袋的結構坐標，確定HCV NS5B結合袋的空間坐標，其中所述結合袋的結構坐標由天然HCVNS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496的結構坐標定義的，或由其功能等同類似物的結構坐標定義；和b)在HCV NS5B結合袋空間坐標的背景下對存儲所述化合物的空間坐標進行電子篩選，測定該化合物是否結合在HCV NS5B結合袋內。
57.一種鑑定潛在HCV抑制劑的虛擬篩選方法，包括下述步驟a)構建HCV NS5B結合袋的計算機模型，其中所述HCV NS5B結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496的結構坐標定義，或由其功能等同類似物的結構坐標定義；b)利用計算機工具，在待評化合物和NS5B結合袋的計算機模型之間進行吻合度程序操作，提供結合袋中化合物的能量最小化構型；和c)對該吻合度操作的結果進行評價，量化化合物和結合袋間的結合，其中與結合袋結合併獲得低能量、穩定複合物的化合物就是潛在的NS5B抑制劑。
58.權利要求57所述的方法，其中複合物的範德華相互作用能量值小於約8000kcal/mol。
59.權利要求58所述的方法，其中複合物的範德華相互作用能量值小於約6000kcal/mol。
60.權利要求59所述的方法，其中複合物的範德華相互作用能量值小於約4000kcal/mol。
61.一種篩選候選HCV NS5B抑制劑化合物的方法，包括下述步驟a)在適宜結合的條件下，保溫權利要求1-12中任一項所述多肽和候選抑制劑化合物；和b)測定候選抑制劑化合物是否與多肽結合，其中與多肽結合的化合物是潛在的HCV NS5B抑制劑。
62.一種設計與權利要求1-12中任一項所述多肽結合的化合物的方法，包括評估化合物和NS5B多肽中結合袋間的互補性，其中所述結合袋由天然HCV NS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496定義，或由其功能等同類似物定義。
63.一種產生抑制HCV NS5B的RNA複製活性的藥物的方法，包括鑑定或設計與NS5B結合袋吻合的化合物，所述NS5B結合袋由天然HCVNS5B的至少胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任選胺基酸殘基37或496定義，或由其功能等同類似物定義，其中所述結合袋由於由至少胺基酸殘基18至35定義的手指環鏈被取代而被暴露。
全文摘要
HCV聚合酶，當與某些抑制劑複合時，會採用取代手指環區而暴露結合袋的構象，其中所述手指環區由胺基酸殘基18至35定義，結合袋通常由胺基酸殘基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，496，500和503定義。這種新的暴露型結合袋為尋找能結合HCV NS5B，並調節或優選抑制HCV NS5B聚合酶活性的其它化學實體定義了一種新的靶標。
文檔編號C12N5/08GK1820022SQ200480019473
公開日2006年8月16日 申請日期2004年5月5日 優先權日2003年5月9日
發明者勒內·庫隆比, 皮埃爾·L·博利厄, 埃裡克·約裡庫爾, 喬治·庫科爾, 斯蒂文·萊普蘭特, 馬克-安德烈·波帕特 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司