修飾的抗－TNFα抗體的製作方法

2023-09-19 09:35:50 1

專利名稱：修飾的抗－TNFα抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及尤其是向人施用的且特別是用於治療用途的多肽。該多肽是修飾的多肽，所述修飾導致該多肽當給予人被試者時具有減少的引起免疫反應的傾向。本發明具體地涉及對人腫瘤壞死因子α(TNFα)反應性抗體進行修飾，從而導致當用於體內時與任何非修飾的對應物相比基本無免疫原性或具低的免疫原性的抗-TNFα抗體。
背景技術：
有許多關於治療性蛋白質的功效受對該治療性蛋白質有害的免疫反應限制的例子。幾種小鼠單克隆抗體已顯示出有希望用作許多人類疾病情形的治療劑，但在某些情況下由於引起顯著程度的人抗-鼠抗體(HAMA)反應而失敗[Schroff，R.W.等人(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等人(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對於單克隆抗體已發展了許多技術來試圖減少HAMA反應[WOA8909622；EPA0239400；EPA0438310；WOA9106667；EPA0699755]。這些重組DNA方法通常減少最終抗體構建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構建體中人的遺傳信息。但是，在幾種情況下，結果所得的「人源化」抗體仍然在患者中引起免疫反應[Issacs，J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等人(1999)Transplantation681417-1420]。
抗體不是唯一一類作為治療劑給藥而可產生免疫反應的多肽分子。即使人來源的且與人體內存在的蛋白質具有相同胺基酸序列的蛋白質也可誘導人體內免疫反應。顯著的例子包括粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等人(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和幹擾素α2[Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)New Engl.J.Med.3181409-1413]等的治療應用。
誘導免疫反應關鍵的是蛋白質中肽的存在，該肽可通過在II型MHC分子上呈遞而刺激T-細胞的活性，即所謂的「T-細胞抗原決定部位」。這種T-細胞抗原決定部位通常定義為具有與II型MHC分子結合的能力的任何胺基酸殘基序列。「T-細胞抗原決定部位」含蓄地指如下抗原決定部位，該抗原決定部位當與MHC分子結合時可由T細胞受體(TCR)識別，且至少在原則上可通過與TCR嚙合導致這些T-細胞活化以促進T-細胞反應。
II型MHC分子是一組在輔助T-細胞的選擇和活化中起重要作用的高度多態的蛋白質。人類DR類白細胞抗原(HLA-DR)是該組蛋白質的主要同種型，然而同種型HLA-DQ和HLA-DP也發揮相似的功能。本發明可應用於對呈遞在DR、DP或DQII型MHC環境中的T-細胞抗原決定部位的檢測。在人類群體中，每個個體攜帶2-4個DR等位基因、2個DQ和2個DP等位基因。許多DR分子的結構已得到了解析，這些結構顯示為具有許多疏水口袋的開放式(open-ended)肽結合溝，該疏水口袋與肽的疏水殘基(口袋殘基)結合[Brown等人Nature(1993)36433；Stern等人(1994)Nature368215]。確定不同II型MHC分子同種異型的多態性造成了肽結合溝中多種多樣的不同肽結合表面，且在群體水平上確保了能夠最大的靈活度地識別外源蛋白質及對病原體生物產生免疫反應。
對治療性蛋白質的免疫反應通過II型MHC肽呈遞途徑進行。在此，外源蛋白質被吞入並經加工以與DR、DQ或DP類的II型MHC分子結合進行呈遞。II型MHC分子是由專業的抗原呈遞細胞(APC)，如巨噬細胞和樹突細胞等表達的。II型MHC肽複合物與T-細胞表面上關連T-細胞受體的結合，加上某些其他共同受體如CD4分子的交互結合可誘導T-細胞內的活化狀態。該活化導致細胞因子的釋放，從而進一步活化其他淋巴細胞如B細胞以產生抗體，或者活化T殺傷細胞而形成完全的細胞免疫反應。
T-細胞抗原決定部位的鑑定是抗原決定部位消除的第一步，然而在本領域中幾乎沒有清楚的案例將鑑定抗原決定部位和去除抗原決定部位整合在單個方案中。WO98/52976和WO00/34317講授了鑑定多肽序列的計算穿線(computational threading approach)方法，該多肽序列具有與人II型MHC DR同種異型亞型結合的潛力。在這些講授中，預測的T-細胞抗原決定部位通過在目的蛋白質中應用合理的胺基酸替代而去除。然而利用該方案和其他鑑定抗原決定部位的基於計算的程序[Godkin，A.J.等人(1998)J.Immunol.161850-858；Sturniolo，T.等人(1999)Nat.Biotechnol.17555-561]，預測能夠與II型MHC分子結合的肽可能並不會在所有情況下，特別是在體內(由於加工途徑或其他現象)發揮T-細胞抗原決定部位的功能。此外，這些預測T-細胞抗原決定部位的計算方法通常不能夠預測具有DP或DQ限制性的抗原決定部位。
除計算技術之外，存在測量合成的肽與II型MHC分子結合能力的體外方法。一種示例性的方法應用具有限定的MHC同種異型的B-細胞系作為II型MHC結合表面的來源，且可應用於II型MHC配體的鑑定中[Marshall K.W.等人(1994)J.Immunol.1524946-4956；O』Sullivan等人(1990)J.Immunol.1451799-1808；Robadey C.等人(1997)J.Immunol.1593238-3246]。然而，這種技術不適用於篩選可針對廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在抗原決定部位，且它們也不能證實結合的肽能否發揮T-細胞抗原決定部位的功能。
最近採用重組MHC分子與合成的肽的可溶性複合物的技術已得到應用[Kern，F.等人(1998)Nature Medicine4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)TRENDS in Immunol.22583-588]。這些試劑和方法可用於鑑定來自人或實驗動物被試者的外周血液樣品中是否存在能夠結合特定的MHC-肽複合物的T-細胞克隆，但這些方法和試劑也不適用於篩選可針對廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在抗原決定部位。
T-細胞活化的生物學測定法可提供實際的選擇方案，通過該方案可讀出所檢測的肽/蛋白質序列引起免疫反應的能力。該類方法的例子包括Petra等人的工作，該工作對細菌蛋白質葡萄球菌激酶應用T-細胞增殖測定，隨後用合成的肽刺激T-細胞系以對抗原決定部位進行作圖[Petra，A.M.等人(2002)J.Immunol.168155-161]。類似地，應用合成的破傷風毒素蛋白質的肽進行的T-細胞增殖測定導致對毒素中免疫優勢抗原決定部位的確定[Reece J.C.等人(1993)J.Immunol.1516175-6184]。WO99/53038公開了所測試蛋白質的T-細胞抗原決定部位可用分離的人免疫細胞亞群進行確定的方法，其中細胞分離後，促進其在體外分化並在合成的目的肽存在時進行細胞培養，在培養的T-細胞中對任何誘導的增殖進行測量。相同技術也由Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)J.Immunotherapy23654-660]描述，其中在兩種情況下該方法應用於在細菌枯草桿菌蛋白酶中探測T-細胞抗原決定部位。這種技術需要仔細地應用細胞分離技術和利用多種細胞因子補充物進行細胞培養以便獲得想要的免疫細胞亞群(樹突細胞、CD4+和/或CD8+T-細胞)，且不利於應用多個供體樣品的快速通量篩選。
如上所述，由此期望從給定的原則上有治療價值但最初為免疫原性的肽、多肽或蛋白質中鑑定並去除或至少減少T-細胞抗原決定部位。這種治療上有價值的分子之一是對腫瘤壞死因子α(TNFα)具有結合特異性的單克隆抗體。本發明優選的單克隆抗體是描述於美國專利號6,284,471中的抗體cA2的修飾形式。在此處將抗體cA2稱為本發明的「親代」抗體。
本發明的一個目的是提供對人TNFα具有結合特異性的親代鼠源單克隆抗體的修飾形式，該修飾形式去除了一個或多個T細胞抗原決定部位。TNFα參與介導許多病理學狀況，如Crohn氏病、類風溼關節炎和內毒素性或心血管性休克。本發明修飾的抗體預期可在這些病症和TNFα作為病理生理學的顯著成分的其他疾病中具有治療用途。
cA2抗體不是對TNFα具有結合特異性的唯一抗體。各種具有類似特異性的多克隆和單克隆抗體製品是本領域中公知的。例子包括公開於EP0212489、EP0218868、EP0288088和WO91/02078中的抗-TNFα製品。對重組人TNFα特異的齧齒動物或鼠類單克隆抗體的其它例子已描述於文獻中[參見如Liang等人(1986)Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854；Meager等人(1987)，Hybridoma6305-311；Fendly等人(1987)，Hybridoma6359-369；Bringman等人(1987)，Hybridoma6489-507；Hirai等人(1987)J.Immunol.Meth.9657-62和Moller等人(1990)，Cytokine2162-169]。這些抗體的一些能夠在體外中和TNFα的作用並已用於發展對TNFα的免疫測定或用於重組TNFα的純化。通常，但與抗體cA2相反，這些抗體尚未被開發用於人體內實施診斷和治療。
然而已用鼠抗-TNFα抗體在人被試者中進行了臨床研究。在14個接受了單一劑量的鼠抗-TNFα抗體的嚴重膿毒性休克患者中，7個由於治療性鼠抗體的免疫原性而對治療物產生了人抗-鼠抗體反應。[Exley，A.R.等人(1990)，Lancet3351275-1277]。這種免疫原性可使得正在接受鼠抗-TNFα抗體的診斷或治療的患者中的治療無效。
在這點上，Adair等人[EP0927758]描述了重組抗體分子，該重組抗體分子包括具有人恆定區序列的抗體以及通過將互補決定區(CDR)移植在修飾的人抗體構架序列上形成的抗體。這種抗體和人源化抗體聲稱保持了對人TNFα□的特異性且可用於診斷和治療中。
抗體cA2的臨床應用由Le等人[US5,919,425]描述，Le等人詳細描述了用cA2治療TNFα介導的疾病的方法，該cA2事實上是命名為A2的最初鼠單克隆抗體的嵌合形式。類似地，Feldmen等人[US6,270,766]描述了相同抗體與重度骨髓抑制劑氨甲蝶呤的組合療法在治療關節炎和Crohn氏病中的應用。
目前用該抗體已進行了大量臨床試驗，該抗體得到了化合物名稱「infliximab」，且在一些地區以REMICADE作為商品名銷售。該抗體已被證明在類風溼關節炎和Crohn氏病的治療中具有一定程度的治療功效，並已在美國和歐洲得到用於Crohn氏病的管理批准。該抗體是用重組技術生產的，且如上文所提出的，該抗體是「嵌合的」，從而意味著抗體的恆定區由源自人恆定區基因的序列組成，因此減少了鼠源蛋白質序列的貢獻。儘管如此，Crohn氏病治療中高達13％的患者顯示出對治療性抗體的免疫反應[Mani R.N.等人(1998)Arthritis Rheum.411552-1563；Elliot M.J.等人(1994)Lancet3441105-1110；Targan S.R.等人(1997)N.Engl.J.Med.3371029-1035；Present D.H.等人(1999)N. Engl.J.Med.3401398-1405]。
因此需要具有增強性質，尤其在蛋白質的生物學性質中有改善的抗-TNFα抗體類似物。在這一點上，非常期望的是提供在人被試者中不具有或具有減少的誘導免疫反應潛力的抗-TNFα抗體。這種蛋白質預期在人被試者中將顯示增加的循環時間，且在慢性或復發性疾病情形中，如在許多抗-TNFα抗體適應症的情況中將是特別有利的。本發明提供了預期顯示增強的體內性質的抗-TNFα抗體修飾形式。
本發明的一個特定的目的是提供修飾的抗-TNFα抗體，其中免疫特徵通過減少潛在T-細胞抗原決定部位的數目而被修飾。
本發明公開了在抗-TNFα抗體重鏈和輕鏈可變區序列中鑑定的序列，該序列由於其II型MHC結合潛力而是潛在的T細胞抗原決定部位。
本發明進一步公開了在抗-TNFα抗體重鏈和輕鏈可變區中鑑定的序列，該序列由於在作為合成肽呈遞給體外培養的人外周血單核細胞(PBMC)群體時能夠誘導該PBMC細胞的增殖反應而是潛在的T細胞抗原決定部位。這些信息使得能夠構建存在於該抗體可變區中的T-細胞抗原決定部位的圖譜，且提供了從分子中去除T-細胞抗原決定部位所必需的關鍵信息。
儘管其他人已提供了包括嵌合[US，5,919,425]和人源化[EP0927758]形式的抗-TNFα抗體分子，但這些講授內容中無一認識到T細胞抗原決定部位對蛋白質免疫原性性質的重要性，也無一設想到根據本發明方案以特定且有控制的方式直接影響該性質。
發明概述和描述本發明提供了修飾的抗體，其中免疫特徵通過減少或去除潛在T-細胞抗原決定部位的數目而被修飾。
本發明優選的鼠源非修飾的「親代」單克隆抗體在此處指描述於美國專利No.6,284,471中的抗體cA2。
本發明公開了在cA2重鏈和輕鏈的可變區序列中鑑定的序列，該序列由於其II型MHC結合潛力而是潛在的T細胞抗原決定部位。
本發明進一步公開了在人體中具有免疫原性的抗體V-區序列的主要區域，從而提供了對該序列進行修飾以消除或減少這些位點的免疫原性效力所必需的關鍵信息。
在一方面，本發明提供了對單克隆抗體cA2所識別的抗原具有特異性的修飾的抗體分子，其中對該cA2抗體可變區中的一個或多個胺基酸進行替代以減少II型MHC對源自該區域的肽的識別。
在另一方面，本發明提供了在人體中具有減少的免疫原性潛力的變體單克隆抗體，該變體在cA2抗體V-區中包含一個或多個胺基酸替代以消除或減少該V-區域中可以作為II型MHC配體或能夠刺激T-細胞的肽片段。
在本發明另一方面提供了在人體中具有減少的免疫原性潛力的變體單克隆抗體，該變體包含重鏈和輕鏈V-區的組合，所述組合包含選自Vh1/Vk1、Vh1/Vk5、Vh1/Vk8、Vh5/Vk12和Vh8/Vk5的胺基酸序列。
最優選的是提供特徵在於具有V-區結構域Vh5/Vk12組合的抗體，但也可以考慮如上文所列的V-區成分的其他組合。
上文所列的Vh和Vk序列的序列完整地詳細描述於下面分項概述及圖8中，圖8也給出了如在此處所用的SEQ ID No分配號。
因此，本發明提供了在人體中具有減少的免疫原性的修飾的抗-TNFα抗體，其中該修飾的抗體包含重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列，所述序列選自SEQ ID No1/SEQ ID No5、SEQ ID No1/SEQ ID No7、SEQ IDNo1/SEQ ID No8、SEQ ID No3/SEQ ID No6和SEQ ID No4/SEQID No7，或者與上列每一個配對中的一個或兩個胺基酸序列具有至少70％相似性的胺基酸組合。
根據本發明命名為SEQ ID 1-8的序列為
SEQ ID No1(＝Vh1)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSSEQ ID No2(＝Vh3)EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSSSEQ ID No3(＝Vh5)EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSSSEQ ID No4(＝Vh8)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID No5(＝Vk1)DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNVEVKRSEQ ID No6(＝Vk12)DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRSEQ ID No7(＝Vk5)DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKRSEQ ID No8(＝Vk8)DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR概括而言，本發明涉及下面的要點●在此處稱為Vh1的單克隆抗體V-區重鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS；●在此處稱為Vh3的單克隆抗體V-區重鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS；●在此處稱為Vh5的單克隆抗體V-區重鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYAESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS；●在此處稱為Vh8的單克隆抗體V-區重鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTLVTVSS；●在此處稱為Vk1的單克隆抗體V-區輕鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNVEVKR；●在此處稱為Vk12的單克隆抗體V-區輕鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKR；●在此處稱為Vk5的單克隆抗體V-區輕鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR；●在此處稱為Vk8的單克隆抗體V-區輕鏈，以單字母代碼形式，其包含胺基酸序列DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR；●包含重鏈V-區序列Vh1和輕鏈序列Vk1的單克隆抗體；
●包含重鏈V-區序列Vh1和輕鏈序列Vk5的單克隆抗體；●包含重鏈V-區序列Vh1和輕鏈序列Vk8的單克隆抗體；●包含重鏈V-區序列Vh5和輕鏈序列Vk12的單克隆抗體；●包含重鏈V-區序列Vh8和輕鏈序列Vk5的單克隆抗體；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區重鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自下組中替代M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、L116V，其中胺基酸是以單字母代碼標識的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區重鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自下組中替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A，其中胺基酸是以單字母代碼標識的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區重鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自替代M18L、K19R、V23A、I28T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、L116V中的替代，其中胺基酸是以單字母代碼標識的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區重鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、E64D、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A、T115L、L116V中的替代，其中胺基酸是以單字母代碼標識的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區輕鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、V19A、Q38H、R39T、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T中的替代，其中胺基酸是以單字母代碼標識的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區輕鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、L104V中的替代，其中胺基酸是以單字母代碼標識的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區輕鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、S100G、N103K、L104V、V106I中的替代，其中胺基酸是以單字母代碼標識別的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●包含抗體cA2的胺基酸序列的單克隆抗體V-區輕鏈，該序列經修飾含有一個或多個選自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、Q38H、R39T、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、S100G、N103K、L104V、V106I中的替代，其中胺基酸是以單字母代碼標識的且編號指當N-末端殘基為第1位殘基時用數字表示的胺基酸位置；●據此修飾的額外包含人IgG1恆定區結構域和人κ恆定區結構域的抗體V-區；●據此修飾的能夠結合TNFα的抗體；●據此修飾的能夠對在體外致死濃度的TNFα中生長的WEHI164細胞提供保護作用的抗體；●據此修飾的能夠抑制體外人內皮細胞中TNFα刺激的ICAM-1產生的抗體；●據此修飾的能夠抑制體外人成纖維細胞中TNFα刺激的IL-6產生的抗體；●據此修飾的包含一個或多個V-區結構域的抗體，在所述V區結構域中免疫原性區域已用T-細胞試驗進行作圖並然後進行了修飾，從而當在T-細胞試驗中再次檢驗時，修飾的蛋白質比親代(非修飾的)分子引起較小的刺激指數；●具有單克隆抗體cA2的生物學活性且與非修飾的cA2相比基本無免疫原性或有低的免疫原性的修飾的抗體分子；●當體內應用時與抗體cA2具有相同生物學活性的修飾的抗體分子；●上文所述的抗體分子，其中該免疫原性的喪失是通過去除一個或多個源自最初非修飾分子的T-細胞抗原決定部位而實現的；●上文所述的抗體分子，其中該免疫原性的喪失是通過減少能夠結合源自該分子的肽的MHC同種異型的數目而實現的；●上文所述的抗體分子，其中去除了一個T-細胞抗原決定部位；●上文所述的抗體分子，其中所述最初存在的T-細胞抗原決定部位是II型MHC配體或肽序列，該配體或肽序列顯示出通過在II型MHC上呈遞而刺激或結合T-細胞的能力；●上文所述的分子，其中所述肽序列選自

圖1中描述的組；●上文所述的分子，其中在任何一個最初存在的T-細胞抗原決定部位中1-9個胺基酸殘基，優選一個胺基酸殘基被改變；●上文所述的分子，其中胺基酸殘基的改變是在特定位置上由其他胺基酸殘基對最初存在的胺基酸殘基的替代、添加或最初存在的胺基酸殘基的缺失；●上文所述的分子，其中如果必要，額外進行進一步改變——通常由特定胺基酸替代、添加或缺失來進行——以恢復該分子的生物學活性；●上文所述的分子，其中改變是在如下連續殘基鏈序列(A)-(H)之任何一個或全部的一個或多個殘基上進行的，其中所述序列源自該分子的cA2抗體V-區序列結構域並應用單字母代碼標識為；
A.＝GLVQPGGSMKLSCVAS；B.＝WVAEIRSKSINSA；C.＝SRDDSKSAVYLQMTDLRTD.＝RNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSE.＝DILLTQSPAILSVSPGERVSFF.＝HWYQQRTNGSPRG.＝LIKYASESMSGIPSH.＝DFTLSINTVESEDIADYYCQQ●包含來自上述序列(A)-(H)中任何一個的至少9個連續殘基的肽分子；●與源自(A)-(H)的任何一個肽序列有超過90％的胺基酸一致性的上述肽分子；●與源自(A)-(H)的任何一個肽序列有超過80％的胺基酸一致性的上述肽分子；●含有與上述序列(A)-(H)中一個或多個相同或基本同源的序列元件的肽分子；●能夠結合II型MHC的上述肽序列；●包含具有II型MHC結合活性的任一上述肽或修飾的肽的藥物組合物；●編碼在上文和下文中限定的任何一個特定的修飾分子的DNA序列或分子；●包含具有cA2的生物學活性的修飾分子的藥物組合物；●如上文和/或在權利要求中限定的藥物組合物，任選地還包含藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；●一種製備如上文或下文限定的具有抗體cA2生物學活性的修飾分子的方法，該方法包括下面的步驟(i)確定多肽或其部分的胺基酸序列；(ii)通過任何方法鑑定蛋白質胺基酸序列中的一個或多個潛在T-細胞抗原決定部位，該方法包括用體外或in silico技術或生物學測定法確定肽與MHC分子的結合；(iii)設計新的序列變體，該變體在鑑定的潛在T-細胞抗原決定部位中具有修飾的一個或多個胺基酸，從而如由體外或in silico技術或生物學測定法通過肽與MHC分子的結合所確定的，基本減少或消除這些T-細胞抗原決定部位的活性；(iv)用重組DNA技術構建這種序列變體並檢驗該變體以鑑定一個或多個具有期望性質的變體；和(v)可選擇地重複步驟(ii)-(iv)；●上文所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何一個最初存在的T-細胞抗原決定部位中替代、添加或缺失1-9個胺基酸殘基而實施的；●上文所述的方法，其中改變是參照同源蛋白質序列和/或in silico模建(modelling)技術而進行的；●由上述13聚體T-細胞抗原決定部位肽中的至少9個連續胺基酸殘基組成的肽序列及其在製備抗-TNFα抗體中的應用，該抗體當體內應用時與任何非修飾的分子相比基本無免疫原性或具有低的免疫原性，且具有抗-TNFα抗體的生物學活性。
提到「基本無免疫原性」或「減少的免疫原性潛力」包括與親代抗體即非修飾的鼠源或嵌合單克隆抗體相比減少的免疫原性。術語「免疫原性」包括在宿主動物中引起、誘導或否則促進體液和/或T-細胞介導的反應的能力，特別是當該「宿主動物」是人時。
本發明修飾抗體的一個重要且顯著的特徵是它們保持了非修飾的或「親代」抗體的功能活性。因此特別想要的是產生修飾的抗體，其顯示了與親代非修飾的抗體的治療功效相關的所有有利技術特徵。這與本發明的預期應用有關，即提供在許多人類重要疾病中具有治療功效的組合物，該疾病尤其包括類風溼關節炎和Crohn氏病及TNFα介導的許多其他臨床適應症。這種治療法是本發明優選的實施方案。
因此，本發明修飾的抗體對其目標抗原顯示出與單克隆抗體cA2所顯示的親和力相似的親和力。該抗體識別TNFα而不是TNFα，且能夠在一系列體外測定試驗中中和TNFα活性。這種測定試驗包括細胞毒性、細胞分裂發生、細胞因子誘導和粘著分子誘導。除中和TNFα的生物學活性之外，親代分子的治療功效被認為也由抗體誘導ADCC(依賴抗體的細胞介導的細胞毒性)的能力所介導，且可有效殺傷表達細胞表面結合形式的TNFα的細胞。ADCC現象是由完整抗體分子的恆定區結構域介導的，且本發明考慮到包含與ADCC誘導相容的恆定區結構域的完整抗體分子的生產。
關於證明TNFα中和活性的體外測定試驗，許多這樣的測定試驗在此處作為實驗例子描述，並提供了本發明優選抗體具有體外能力的證據。
「抗體」指能夠與抗原組合、相互作用或結合的免疫球蛋白家族的蛋白質。術語「抗原」在此處用於指能夠與抗體相互作用的物質，且在本發明的情況下指TNFα。本發明的TNFα是腫瘤壞死因子α(TNFα)，且最優選地為作為抗體cA2的抗原的人TNFα或任何TNFα。TNFα可為可溶性的TNFα或膜結合的TNFα。
術語「免疫球蛋白」在此處用於指由一種或多種基本上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、σ、ε和μ恆定區基因和實際上多個免疫球蛋白可變區基因。一個天然形式的免疫球蛋白是包含相同的兩個配對的四聚體，其中每一個配對具有一條輕鏈和一條重鏈。在每一個配對中，重鏈和輕鏈可變區一起提供了能夠與抗原相互作用的結合表面。術語Vh在此處用於指重鏈可變區，而術語Vk在此處用於指輕鏈可變區，且在本情況下與許多單克隆抗體共同的是該輕鏈是「kappa」(κ)類型的鏈。
如在此處所用的，Vh指長度約為110～125個胺基酸殘基的多肽，其序列相應於任何一個在此處所述的Vh鏈，該Vh鏈與Vk組合能夠結合人TNFα。類似地，Vk指長度約為95～130個胺基酸殘基的多肽，其序列相應於任何一個在此處所述的Vk鏈，該Vk鏈與Vh組合能夠結合人TNFα。全長的免疫球蛋白重鏈分子量為約50kDa，且在N-末端由Vh基因編碼，而在C-末端由恆定區基因之一(如γ)編碼。類似地，全長的免疫球蛋白輕鏈分子量為約25kDa，且在N-末端由V-區基因編碼，而在C-末端由κ或λ恆定區基因編碼。
除完整的抗體(四聚體)之外，免疫球蛋白可以以通過重組DNA技術或蛋白質生物化學衍生的許多其他形式存在。這些形式包括如Fv、Fab、Fab』和(Fab)2分子，且全部可含有本發明的Vh或Vk序列的任何一個。其它例子可包括「雙特異性的」抗體，即包含本發明的Vh/Vk組合和具有不同抗原特異性的第二Vh/Vk組合。
術語「T-細胞抗原決定部位」根據本發明的理解指能夠結合II型MHC、能夠刺激T-細胞和/或也能夠以和II型MHC複合的形式結合T-細胞(但不一定可測量地活化T細胞)的胺基酸序列。
如在此處和在所附權利要求中所用的，術語「肽」是包括兩個或多個胺基酸的化合物。胺基酸是通過肽鍵(在下文中定義)連接在一起的。有20種不同的天然存在的胺基酸參與肽的生物學生產，且可以將任何數目的胺基酸以任何順序連接而形成肽鏈或環。在肽的生物學生產中應用的天然存在的胺基酸均具有L-構型。合成的肽可採用常規的合成方法利用L-胺基酸、D-胺基酸或兩種不同構型胺基酸的各種組合來製備。一些肽僅含有少數的胺基酸單位。短肽，如少於10個胺基酸單位的肽有時稱為「寡肽」。其他肽含有大數目的胺基酸殘基，如多達100個或更多，並稱為「多肽」。按慣例，「多肽」可認為是含有3個或更多個胺基酸的肽鏈，而「寡肽」通常認為是特殊類型的「短」多肽。因而，如在此處所用的，可以理解的是只要提及到「多肽」也包括寡肽。進一步地，只要提及「肽」即包括多肽、寡肽和蛋白質。胺基酸的每一種不同排列形成了不同的多肽或蛋白質。可形成的多肽的數目及由此不同蛋白質的數目實際上是無限的。「α碳(Cα)」是肽鏈的碳-氫(CH)成分中的碳原子。「側鏈」是Cα的側基，該基團可包含簡單或複雜的基團或部分，且具有與肽的大小相比可顯著變化的物理大小。
本發明導致修飾的抗-TNFα抗體的一般方法包括以下步驟(a)確定多肽或其部分的胺基酸序列；(b)通過任何方法鑑定蛋白質胺基酸序列中一個或多個潛在的T-細胞抗原決定部位，該方法包括用體外或in silico技術或生物學測定法確定肽與MHC分子的結合；
(c)設計新的序列變體，該變體在鑑定的潛在T-細胞抗原決定部位中具有修飾的一個或多個胺基酸，如通過體外或in silico技術或生物學測定法由肽與MHC分子的結合而確定的，所述修飾導致基本上減少或消除T-細胞抗原決定部位的活性。這種序列變體是以一定的方式生成的，從而避免由序列改變生成新的潛在T-細胞抗原決定部位，否則這種新的潛在T-細胞抗原決定部位又進行修飾以基本減少或消除此T-細胞抗原決定部位的活性。
(d)用重組DNA技術構建這種序列變體並檢測該變體以鑑定一個或多個具有想要的性質的變體。
根據步驟(b)對潛在的T-細胞抗原決定部位的鑑定可根據本領域中以前描述的方法實施。適當的方法公開於WO98/59244；WO98/52976；WO00/34317中。
通過計算鑑定T-細胞抗原決定部位的其他非常有效的方法描述於實施例1中，該實施例是根據本發明的優選實施方案。已在抗-TNFα抗體的重鏈和輕鏈可變區序列上進行了該分析。
適合於探測T-細胞抗原決定部位的其它技術方法是生物學T-細胞測定法。這種分析方法描述於實施例2中並類似地是根據本發明的優選實施方案。因此，在此處具體化的優選生物學測定方法包括檢測源自抗-TNFα抗體重鏈和輕鏈可變區序列的重疊肽，或者作為替代方案檢測由V-區衍生的肽亞群，如根據實施例1所述方法通過計算衍生的全部或一些肽。對合成的肽檢驗其在體外培養的人T-細胞中引起增殖反應的能力。該增殖反應可通過任何方便的方法進行測量，但如在本發明實施方案中所利用的一種眾所周知的方法應用3H-胸腺嘧啶摻入。該方法可用從健康供體中獲取的幼稚人T-細胞來實施，且也可用於檢驗完整蛋白質分子以及合成的肽在體外的免疫原性。這種方案也已用於本發明的研究中(實施例11)來證明本發明優選的分子具有減少的免疫原性潛力。本發明人已確立在幼稚T-細胞測定試驗的操作中，等於或大於2.0的刺激指數是對所誘導的增殖作用的有用量度。刺激指數常規地通過用在有檢驗的肽時測量到的增殖分數(例如如果應用3H-胸腺嘧啶摻入則為每分鐘的計數)除以在不與檢驗的(多)肽接觸的細胞中測量到的增殖分數而獲得。
實際上，可產生許多抗-TNFα抗體變體並檢驗想要的免疫和功能特徵。特別重要的是當對蛋白質序列進行改變時，該預期的變化不引入新的免疫原性抗原決定部位。這在實踐中可以通過用任何適當的方法再次檢驗預期的序列是否存在抗原決定部位或II型MHC配體而避免。作為本發明進一步的實施方案的一種特定方法是應用體外免疫學回憶(recall)試驗，該試驗包括在致敏量的檢驗蛋白質(抗體)存在時培養PBMC製品並用相同的檢驗蛋白質或平行地用該蛋白質的修飾形式進行再次攻擊。這種方案提供了在不進行全面的臨床試驗的情況下對修飾的蛋白質減少的免疫原性潛力方便的實踐證明。對於大多數的目的，變體蛋白質可以通過重組DNA技術產生，但也可以考慮其他方法，包括化學合成。
在一個特別優選的實施方案中，本發明修飾的抗體是通過表達此處所述的Vh和Vk基因的不同組合而生成的。根據本發明最優選的組合包括組合Vh5/Vk12。也已產生了其他組合併檢驗了其在結合TNFα方面的功能活性，且這些組合包括Vh1/Vk1、Vh1/Vk5、Vh1/Vk8和Vh8/Vk5。重鏈和輕鏈的所有這種組合均包含於本發明中。
因此，本發明提供了在人體中具有減少的免疫原性的修飾的抗-TNFα抗體，其中該修飾的抗體包含選自SEQ ID No1/SEQ ID No5、SEQ IDNo1/SEQ ID No7、SEQ ID No1/SEQ ID No8、SEQ ID No3/SEQID No6和SEQ ID No4/SEQ ID No7，或者如下胺基酸的組合的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列，所述胺基酸組合與上列每一個配對中的一個或兩個胺基酸序列具有至少70％的相似性。
本發明涉及抗-TNFα單克隆抗體，其中在分子V-區的位置上已進行了至少一個胺基酸殘基的替代，結果導致一個或多個潛在的T-細胞抗原決定部位的活性被基本減小或一個或多個潛在的T-細胞抗原決定部位從蛋白質中被基本上消除。最優選地是提供修飾的抗體分子，在該分子中在親代分子的大多數免疫原性區域中進行了胺基酸修飾(如替代)。本發明主要的優選實施方案包括修飾的抗體分子，其中對II型MHC配體中的任一個進行改變，從而消除與MHC的結合或減少肽可結合的MHC同種異型的數目。本發明人已發現並在此處公開了在人體中抗體cA2分子的免疫原性區域。可以理解的是在某些情況下那些在此處公開的序列之外的額外區域可變為具有免疫原性的抗原決定部位，例如用表達與本發明的序列具有類似序列的蛋白質或肽的病原體感染的情況。無論如何，對於序列元件而言，充當II型MHC配體將是關鍵的，因此原則上在圖1中公開的任何序列均可認為是在本發明的範圍內的具有免疫原性的抗原決定部位。
為了消除T-細胞抗原決定部位，胺基酸替代是在肽序列中預期可實現T-細胞抗原決定部位活性的基本減少或消除的適當位點上進行的。在實踐中，適當的位點優選等同於可以在II型MHC結合溝所提供的一個口袋中結合的胺基酸殘基。
最優選地是改變肽在所謂的肽P1或P1錨定位置處與裂縫的第一個口袋的結合。在肽的P1錨定殘基和II型MHC結合溝的第一個口袋之間的結合相互作用質量被公認為是完整肽的總結合親和力的主要決定因素。在肽的該位置中的適當替代可為替代為較不易於容納於口袋中的殘基，如替代為更親水的殘基。肽中對應於與MHC結合裂縫其他口袋區域結合的位置的胺基酸殘基也可以加以考慮並且屬於本發明的範圍內。
可以理解的是在給定的潛在T細胞抗原決定部位中單個胺基酸替代是最優選的消除抗原決定部位的途徑。在單個抗原決定部位中也可以考慮進行組合替代，例如當單獨限定的抗原決定部位相互重疊時組合替代可能是特別適當的。此外，可以在就II型MHC結合溝而言非「口袋殘基」的位置，在肽序列中任何位點處進行胺基酸替代，該胺基酸替代可以是於給定的抗原決定部位中的單個替代或於單個抗原決定部位中的組合替代。所有這種替代均在本發明的範圍內。
在本發明涉及修飾的抗-TNFα抗體的情況下，應該認為含有這種修飾抗體或修飾抗體的片段的組合物和相關組合物也在本發明的範圍內。因此本發明考慮到應用和生成抗體片段，包括如Fv、Fab、Fab』和F(ab』)2片段。這種片段可用標準方法製備[如Coligan等人(Current Protocols inImmunology，John Wiley Sons 1991-1997)。本發明也考慮到本領域中眾所周知的各種抗體衍生分子的重組形式。這種抗體衍生分子包括穩定化的Fv片段，該片段包括包含連接Vh和Vl構域的肽連接體的單鏈Fv形式(如scFv)，或者通過鏈間二硫鍵穩定化的Fv(dsFv)(其含有經加工有利於Vh和V1結構域連接的額外半胱氨酸殘基)。同樣地，其他組合物亦是本領域中熟悉的，且可包括稱為「小體(minibodies)」的分子和單個可變結構域「dAb」。其他的分子還可以加入用於增加修飾抗體V-區結構域的效價的手段，即通過如對二聚化結構域(如「亮氨酸拉鏈」)進行加工或利用化學修飾策略得到的具有多個抗原結合位點的分子。
在另一方面，本發明涉及編碼修飾的抗-TNFα抗體實體的核酸。
在再一方面，本發明涉及用修飾的抗-TNFα抗體對人進行治療的方法。
本發明現在將由下面的實施例進行闡明，但不受其限制。該實施例涉及下面的附圖圖1提供了源自抗-TNFα抗體cA2的V-區結構域的肽序列表，所述序列具有潛在的人II型MHC結合活性。圖1A涉及重鏈來源的序列。圖1B涉及輕鏈來源的序列。
圖2提供了證明用本發明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)可以對TNFα誘導的體外WEHI細胞殺傷進行中和的圖。
圖3提供的圖證明了用本發明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)可以對TNFα刺激的體外人臍靜脈內皮細胞中ICAM-1的表達產生進行中和。
圖4提供了證明本發明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)能夠在體外測定中與陽性對照抗體(infliximab)競爭結合TNFα的圖。
圖5提供了一組柱形圖，這些圖所映了在體外幼稚T-細胞增殖測定中針對合成的肽的增殖反應。該數據涉及由來自單個供體#4的PBMC記錄的反應，並相應於肽CA1-CA75的每一個的1μM和5μM濃度給出。每一個圖用刺激指數(SI)相對於肽標識碼繪圖。SI＝CPM檢驗肽/CPM未處理的對照。肽序列和方法詳細描述於實施例2中。
圖6提供了體外幼稚T-細胞增殖測定中針對13-聚體肽P1-P15的每一個所記錄的增殖反應。A圖描述了來自供體#2的PBMC中的反應；B圖描述了來自供體#4的PBMC中的反應。結果相應於1μM和5μM濃度的給定肽來顯示。對於兩圖，SI＞2.0的反應表示為正的(+)而SI＜2.0的結果表示為負的(-)。
圖7顯示平板ELISA的結果，其中TNFα是由本發明修飾的抗體(Vh5/Vk12)探測的。結合曲線是抗體濃度相對492nm的光密度(OD492)所繪製的圖。
圖8提供了本發明抗-TNFα抗體的修飾的可變區結構域的胺基酸序列，序列以單字母代碼表示。
圖9提供了證明用本發明的抗-TNFα抗體(Vh5/Vk12)可以對TNFα刺激的體外人HS27成纖維細胞中IL-6的表達產生進行中和的圖。陰性對照(210G12)是非-TNFα結合抗體且陽性對照(infliximab)是TNFα中和抗體。
圖10提供的圖描述了應用幼稚人PBMC的免疫原性測定試驗的結果，該人PBMC是在不同濃度的修飾抗體(Vh5/Vk12)或免疫原性親代抗體(infliximab)存在時培養的。該圖顯示從反應性供體PBMC(A圖)和非反應性供體PBMC(B圖)獲得的結果。SI＝刺激指數。
實施例1用計算方法鑑定抗-TNFαVH和VL蛋白質序列中潛在的II型MHC配體。
分析具有充當II型MHC結合配體的潛力的肽序列的方案已在以前進行了詳細描述[WO02/069232]。已開發了應用該程序的軟體工具並將其應用於抗-TNFα抗體V-區結構域的分析中。簡言之，該軟體由多個元件建成，這些元件包括II型MHC分子模型文庫——該文庫形成以覆蓋在人類群體中現存的大量同種異型變體；肽主鏈結構文庫——該文庫形成以包含理論的和已知的主鏈構象。利用這些元件，基於使每一個主鏈構象停靠(docking)在每一個MHC同種異型模型結合溝中的結果而生成一個大的數據集。該數據集也包括在給定位置上所有可能胺基酸的最佳側鏈構象。肽側鏈(在最佳構象中)和MHC蛋白質之間的原子間距離貯存於該數據集中。來自目標蛋白質的待檢驗的肽是按如下進行分析的將其側鏈序列添加到所有主鏈上，然後檢索數據集得到最佳側鏈構象，由此計算針對每一個主鏈的「肽分數」。選擇最好的分數用於展示，並使該過程針對每一個可用的MHC模型結構進行重複。該算法已應用於分析抗-TNFα抗體cA2的V-區結構域。該分析鑑定了多個13聚體肽序列，這些序列經預測是一種或多種同種異型MHCII分子的配體，因而是潛在的T-細胞抗原決定部位。這些肽顯示於圖1A(重鏈來源的肽)和1B(輕鏈來源的肽)中。
實施例2體外增殖測定中用合成的肽和幼稚人PBMC對T-細胞抗原決定部位的鑑定。
MHC、肽和T-細胞受體(TCR)之間的相互作用為T-細胞識別的抗原特異性提供了結構基礎。T-細胞增殖試驗檢驗肽與MHC的結合和TCR對MHC/肽複合物的識別。本實施例的體外T-細胞增殖測定涉及對外周血單核細胞(PBMC)的刺激，該外周血單核細胞含有抗原呈遞細胞(APC)和T-細胞。刺激是在體外用合成的肽抗原進行的，且在一些實驗中是用完整的蛋白質抗原進行的。刺激的T-細胞增殖是用3H-胸腺嘧啶(3H-Thy)測量的，其中摻入的3H-Thy通過對洗滌後的固定細胞進行閃爍計數來估計。
表1合成的肽
來自貯存少於12小時的人血液的白細胞層從國家血液服務部門(National Blood Service)(Addenbrooks Hospital，Cambridge，英國)獲得。Ficoll-paque從Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，英國)獲得。無血清AIM V培養基從Gibco-BRL(Paisley，英國)獲得，該培養基用於原代人淋巴細胞的培養並含有L-穀氨醯胺、50μg/ml鏈黴素、10μg/ml gentomycin和0.1％的人血清清蛋白。合成的肽從Eurosequence(Groningen，荷蘭)和Babraham Technix(Cambridge，英國)獲得。紅細胞和白細胞是通過對白細胞層的輕輕離心而從血漿和血小板中分離的。移走並丟棄上層相(含有血漿和血小板)。使紅細胞和白細胞在磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中進行1∶1的稀釋，然後鋪在15ml ficoll-paque(Amersham Pharmacia，Amersham英國)上。根據製造商建議的條件進行離心，並從血清+PBS/ficoll paque界面收穫PBMC。使PBMC與PBS混合(1∶1)並通過離心收集。移走並丟棄上清液，且將PBMC沉澱重懸於50ml PBS中。再次通過離心使細胞沉澱，並丟棄PBS上清液。將細胞用50ml AIM V培養基重懸，並在此時進行細胞計數並用錐蟲藍染料排除法進行生存力的估計。再次通過離心收集細胞並丟棄上清液。將細胞重懸並以每ml 3×107的密度進行低溫貯存。貯存培養基是90％(v/v)熱失活的AB人血清(Sigma，Poole，英國)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，英國)。將細胞轉移到有調控的冷凍容器(Sigma)中並於-70℃放置過夜。當需要使用時，將細胞在轉移到10ml預熱的AIM V培養基中之前於37℃水浴中快速解凍。
PBMC是以每孔2×105個PBMC的密度在96孔的平底平板上用蛋白質和肽抗原刺激的。在用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham英國)進行脈衝之前，使PBMC於37℃溫育7日。對於本研究，製備了橫跨抗體cA2的重鏈和輕鏈的完整V-區結構域的合成的肽(15聚體)。每一個肽與鄰接的下一個肽在序列上重疊12個殘基，即每一個肽從相繼的下一個肽起增加3個殘基。肽序列和標識號顯示於表1中。每一個肽都單獨地針對從20個供體中分離的幼稚PBMC進行篩選。在每一個供體測定試驗中都應用兩個對照肽C32(PKYVKQNTLKLAT)和C49(KVVDQIKKISKPVQH)(該對照肽先前已證明具有免疫原性)和有效的非回憶性抗原KLH。將肽在DMSO中溶解至10mM的終濃度，然後將這些貯存液在AIM V培養基中1/500稀釋(終濃度20μM)。將肽添加到平底的96孔板上以得到100μl中2和10μM的終濃度。解凍的PBMC的生存力是通過錐蟲藍染料排除法進行估計的，然後將細胞以2×106個細胞/ml的密度進行重懸，並將100μl(2×105個PBMC/孔)轉移到含有肽的每一個孔中。在每一個肽濃度重複對三個孔的細胞培養物進行測定。將平板在5％CO2的潮溼空氣中於37℃溫育7日。在濾器墊上收穫細胞之前用每孔1μCi的3H-胸腺嘧啶對細胞脈衝18-21小時。CPM值是用Wallac小平板β頂部平板計數器(Wallac microplate beta top plate counter)(Perkin Elmer)測定的。結果表示為刺激指數(SI)，其中SI＝CPM檢驗的肽/CPM未處理的對照。
用幼稚T細胞增殖測定試驗對cA2V-區序列中的T細胞抗原決定部位作圖，導致對幾個免疫原性區域的鑑定。在各供體中具有顯著的刺激指數的肽包括如CA34(SI＝2.22)和CA52(SI＝2.09)等。
利用另一具有15個不同的13-聚體肽(P1-P15)的亞群對該圖譜在圍繞Vh和Vk序列的互補決定區(CDR)的序列區域中進行了精細化，該13-聚體肽具有如下序列
P1＝KGLEWVAEIRSKSP2＝EWVAEIRSKSINSP3＝AEIRSKSINSATHP4＝KSINSATHYAESVP5＝TGVYYCSRNYYGSP6＝STYDYWGQGTTLTP7＝SQFVGSSIHWYQQP8＝QFVGSSIHWYQQRP9＝SSIHWYQQRTNGSP10＝HWYQQRTNGSPRLP11＝PRLLIKYASESMSP12＝RLLIKYASESMSGP13＝LLIKYASESMSGIP14＝IKYASESMSGIPSP15＝ESMSGIPSRFSGS肽P1-P7源自Vh鏈序列，而肽P8-P15源自Vk鏈序列。在如前文一樣包括多種不同MHC同種異型的另一組10個幼稚PBMC製品中篩選肽P1-P15以獲得能體外引起增殖反應的肽。從合成肽和供體組這兩個集合得到的幼稚T-細胞增殖測定結果可以綜合在一起產生抗體Vh和Vk鏈的抗原決定部位圖譜。通常，在編緝這樣的圖譜時，將SI＞1.95認為是正反應。顯示所有15-聚體肽對一個反應性供體的SI的代表性柱形圖在附圖5中給出。13-聚體肽P1-P15的示例性結果在圖6中給出。
實施例3抗-TNFα抗體Vh和Vk基因的構建抗體的序列源自美國專利5,656,272。可變結構域重鏈(Vh)和可變結構域輕鏈(Vk)基因是通過基因合成製備的。簡言之，設計併合成了一組合成的寡核苷酸。基因是用連接酶鏈反應(LCR)組裝的，其中使具有互補末端特徵的寡核苷酸能夠退火，隨後用聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增和補平。該PCR是通過添加增加濃度的側翼寡核苷酸以充當引物而驅動的。通過進一步從載體進行PCR而將該PCR產物組裝為全長抗體基因，其中該載體含有免疫球蛋白基因的5』和3』側翼區域，並將該全長抗體基因亞克隆入表達載體中以表達完整的抗體。該組裝的Vh和Vk基因可充當模板來誘變和構建多個去除了T-細胞抗原決定部位的變體抗體序列。
為了組裝Vh基因，應用在表2中詳述的寡核苷酸OL373-OL391。為了組裝Vk基因，應用在表3中詳述的寡核苷酸OL392-OL410。對於該兩個基因，通過使20μl磷酸化的寡核苷酸與1μl Pfu DNA連接酶(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)、10μl 10×反應緩衝液(與酶一起提供)和69μl水混合而進行LCR。將反應混合物置於熱循環儀上，於95℃溫育2分鐘，隨後於95℃進行30秒、接著逐漸冷卻到60℃、然後於60℃溫育20分鐘、這3個步驟重複25個循環，最後於60℃溫育3小時。一般地，用2％瓊脂糖凝膠電泳對LCR樣品分析，得到成片的電泳條帶，其中具有剛剛可以看到的正確大小的模糊條帶。在所有情形中的寡核苷酸均購自MWG-Biotech(Ebersberg，德國)，並在體外用T4 DNA激酶(Roche，Lewes，英國)和廠商建議的規程進行磷酸化。在LCR後，將5μL反應物轉移到PCR混合物中以擴增組裝的片段。將寡核苷酸OL373和OL382用於驅動Vh反應，而將寡核苷酸OL392和OL401用於驅動Vk反應。PCR在50μl總體積中用Taq DNA聚合酶(Roche，Lewes，英國)進行15個循環。將反應物在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳，獲取想要的條帶並用Qiagen(Crawley，英國)DNA提取試劑盒進行純化。將產物直接克隆入pGemT-easy載體(Promega，Southampton，英國)中以進行序列分析。對7個克隆進行了測序直到獲得了正確的克隆。含有如上所述製備的可變區盒的全長免疫球蛋白基因用重疊PCR進行組裝。簡言之，將載體M13-VHPCR1和M13-VKPCR1的DNA[Orlandi等人(1989)，PNAS，893833-7]用作模板以分別針對Vh和Vk鏈產生另兩個重疊的PCR片段，該PCR片段包括具有鼠重鏈免疫球蛋白啟動子且編碼前導信號肽的5』側翼序列和包含剪接位點和內含子序列的3』側翼序列。將針對Vh和Vk分別由此產生的DNA片段用側翼引物在PCR中組合在一起，該側翼引物是獲得全長DNA序列所必需的。用於這些「連接」反應中的引物對對於Vh基因為寡核苷酸OL411/OL413和OL414/OL415，而對於Vk基因，應用了寡核苷酸OL411/OL412和OL411/OL401。
將末端具有5』和3』側翼序列的此重鏈基因克隆入表達載體pSVgpt[Reichmann等人(1988)Nature，332323]中，該載體包括人IgG1恆定區結構域[Takahashi等人(1982)Cell，29671]和用於在哺乳動物細胞中進行選擇的gpt基因。將末端具有5』和3』側翼序列的此輕鏈基因克隆入表達載體pSVhyg[Reichmann等人，見上引文]中，在該載體中gpt基因由潮黴素抗性基因(hyg)替代且包括人κ恆定區結構域[Heiter等人(1980)Cell，22197]。對於兩個載體，將完全組裝的Vh和Vk基因以通過凝膠電泳純化的HindIII/BamHI片段進行亞克隆，並用眾所周知的程序和試劑系統進行處理。
表2對於Vh的合成的寡核苷酸
表3對於Vk的合成的寡核苷酸
實施例4修飾的抗體Vh和Vk基因的構建稱為Vk1的修飾的Vk基因是通過基因合成構建的，該基因含有突變L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T和L104V。表4列出了用於組裝Vk1的寡核苷酸。這些寡核苷酸與OL393、OL394、OL395、OL400、OL401、OL403、OL405、OL407和OL408(參見上述實施例3)一起用於如前文所述的基因合成反應中。將該基因克隆入pGEM-T easy載體(Promega)中並將幾個克隆進行測序直到獲得了正確的克隆。全長免疫球蛋白基因的組裝和在表達載體中的亞克隆如同實施例3，只除了將寡核苷酸OL411和OL469用於Vk基因的連接反應中。
在此Vk基因中引入了額外的突變以製備其它變體Vk基因。這些突變包括V19A、Q38H、R39T、S100G、N103K、V106I。誘變是用表5中所列的寡核苷酸通過PCR進行的。將OL768和OL769、OL770和OL771與OL411和OL401(見上文)組合用於重疊PCR中。將OL648與OL411組合用於單個PCR中。將PCR產物克隆入pGEM-T Easy(Promega)中並通過測序鑑定正確的克隆。
變體Vh基因也是用誘變從野生型序列中構建的。構建了變體Vh基因，該變體Vh基因包含替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、E64D、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A、T115L和L116V。這些突變是用表6中所列的寡核苷酸引入的。簡言之，將每一套寡核苷酸與OL411和OL415組合用於重疊PCR中。將PCR產物克隆入pGEM-T Easy(Promega)中並通過測序鑑定正確的克隆。
將Vh和Vk結構域以如前文所述的HindIII BamHI片段亞克隆入表達載體中，並根據如在實施例5中詳述的方法表達變體抗體。
表4用於Vk1組裝的合成的寡核苷酸
表5用於Vk誘變的合成的寡核苷酸
表6用於Vh誘變的合成的寡核苷酸
實施例5抗-TNFα抗體的表達、純化和定量重鏈和輕鍊表達載體是用電穿孔共轉染入NS/0中的，該NS/0是從歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)獲得的非免疫球蛋白產生性小鼠骨髓瘤。表達gpt基因的集落是在Dulbecco氏改良的Eagle培養基(Dulbecco’sModified Eagle Medium)(DMEM)上進行選擇的，該培養基補充了10％(v/v)的胎牛血清和抗生素(均購自Gibco，Paisley，英國)及0.8μg/ml黴酚酸和250μg/ml黃嘌呤(Sigma，Poole，英國)。
轉染的細胞克隆產生的人抗體是通過對人IgG的ELISA分析進行測量的[Tempest等人(1991)BioTechnology9266]。將分泌抗體的細胞系進行擴大並通過蛋白質A親和層析對抗體進行純化[Harlow E.Lane D.；Antibodies，a Laboratory Manual，第309頁；Cold Spring HarborLaboratory Press(1988)，NY，美國]。
純化的抗體的濃度用探測目標抗體的人κ恆定區的ELISA確定。使用治療性抗體infliximab(Schering-Plough Ltd，英國)的商業製品確定了標準的濃度曲線，並將該標準用於計算所檢驗的抗體製品的濃度。該試驗是在96-孔板上進行的，且所有測定均重複進行兩次。
對於此試驗，將平板(Dynatech Immulon 2)用每孔100μl的綿羊抗-人κ抗體(The Binding Site，Birmingham，英國)進行包被，該抗體是以1∶250在pH9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩衝液(Sigma，Poole，英國)中稀釋的。包被在37℃進行1小時，且用PBST(具有0.05％Tween20的PBS)將孔洗滌3次。向孔中加入100μL PBST和所描述的對照和檢驗抗體的稀釋物。陰性對照僅應用PBST而不添加抗體。將標準製品(infliximab)1∶1000(v/v)稀釋，並在平板上橫向陳列二倍稀釋物系列。對於檢驗的抗體製品也給出二倍稀釋物系列。將該平板於室溫溫育1小時，並將平板孔如前文所述進行洗滌。結合的抗體用過氧化物酶綴合的綿羊抗-人IgGγ鏈特異性試劑(The Binding Site，Birmingham，英國)進行探測。將該第二抗體在PBST中1∶1000稀釋，並在平板的每一個孔中添加100μl。將平板於室溫再溫育1小時並如前文所述進行洗滌。探測是通過用每孔100μl「Sigmafast」過氧化物酶底物(Sigma，Poole，英國)實現的，顯色反應通過添加每孔40μl的1M硫酸而終止。光密度是用平板讀出器在492nm讀取的。相對於對照抗體繪製了抗體濃度對A492的標準曲線並通過與標準比較確定所檢驗抗體的濃度。
實施例6通過用修飾的抗體對TNFα進行中和而在體外保護TNFα敏感性細胞抗-TNFα抗體中和TNFα對體外生長的細胞系的致死作用的能力是用Galloway提供的方案檢驗的[Galloway等人，1991，J.Immunol.Meth.14037-43]。該試驗應用鼠纖維肉瘤細胞系WEHI164，該細胞系對TNFα的致死作用非常敏感。
對於此試驗，使細胞在固定的致死濃度的TNFα和一系列不同濃度的抗體存在時生長過夜。第二天，測量細胞的代謝活性以作為存活的指示。可中和TNFα的抗體可賦予細胞保護作用，因而在試驗中可測量到更大的代謝活性。
WEHI164從歐洲動物細胞保藏中心(ECACC#.8702250)獲得並生長於DMEM培養基中，該培養基具有Glutamax(Gibco，Paisley，英國)、10％胎牛血清(Perbio，Chester，英國)並含有antibiotic-mycotic(Gibco)。在測定前的一天，將細胞進行傳代培養以確保在隨後的試驗期間的活性增殖。該試驗在96孔平板上進行，對所有處理均重複進行兩次。製備含有對照抗體、檢驗抗體的稀釋物和無抗體的陰性對照的平板。一般地，平板上橫向排列抗體的二倍稀釋物系列，該系列起始於50μl體積中10μg/ml抗體的濃度。製備在含有4μg/ml放線黴素的培養基中的50μg/ml的TNFα貯存液(Pepro Tech EC Ltd，London，英國)並將其添加到處理孔中。通過輕輕敲打平板混合TNFα溶液，並在將製備的溶液轉移到含有細胞的測定平板之前將平板於室溫溫育至少2個小時。
測定平板是通過以每孔50μl接種2.5×104細胞並於37℃、5％CO2溫育至少1小時而製備的。隨後，將50μl TNFα/抗體混合物或對照製品從用於稀釋各種處理物的平板轉移出來。將細胞和處理物的混合物通過輕輕敲打平板進行混合，並將平板於37℃在含有5％CO2的潮溼空氣中溫育過夜。下一天，用「CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay」(Promega，Southampton，英國)估計每一孔中細胞的代謝活性。在添加試驗溶液之後，將平板再溫育90分鐘，並用平板讀出器在492nm讀取每一孔中溶液的吸收值。吸收數值相對抗體濃度作圖。在所有測定中，陽性對照製品是治療性抗體infliximab(Schering-Plough Ltd，英國)的樣品，該樣品在測定中一致地展示出在低於0.1μg/ml的濃度下對TNFα的顯著中和。類似地，本發明修飾的抗體在本試驗中一致地展示出與陽性對照製品等價的保護作用。圖2顯示從該試驗中獲得的示例性圖。
實施例7對TNFα刺激的體外人內皮細胞中ICAM-1的產生的中和。
在體外試驗中檢驗了抗-TNFα抗體對人臍靜脈內皮(HUVE)細胞中TNFα刺激的膜結合ICAM-1的產生進行中和的能力。簡言之，使HUVE細胞在TNFα和各種濃度的檢驗或對照抗體存在時生長於96孔平板中。隨後膜結合ICAM-1的定量相對表達應用商業上可購得的ICAM-1探測系統通過細胞裂解和酶聯免疫吸附測定(ELISA)估計。
對於此測定，製備了平行的兩套96孔平板。一套稱為「測定平板」，是用細胞接種的，而另一套稱為「製備平板」，用於製備TNFα和檢驗及對照抗體溶液的稀釋物。製備平板中的內含物最後將轉移到測定平板中。所有測定均重複進行兩次。
對於測定平板，將HUVE細胞(Cambrex Bio Science，Wokingham，英國)以50μl體積中每孔5×104個細胞的密度進行接種。通過於37℃、5％CO2溫育至少2小時而使細胞能夠附著到平板上。
對於製備平板，將檢驗抗體和陽性對照抗體的二倍稀釋系列在平板橫向上一式兩份地陳列。抗體的起始濃度為100μl/孔終體積中20μg/ml。陰性對照無抗體。製備培養基中40ng/ml的TNFα(Pepro Tech EC Ltd，London，英國)溶液，並以每孔100μl添加到製備平板上每一個處理孔中。將平板通過輕輕敲打進行混合，並於室溫溫育45分鐘。在該溫育後，將製備平板中每孔50μl添加到測定平板上其相應的孔中。將測定平板於37℃在含有5％CO2的潮溼空氣中溫育23小時。
下一天，去除所有孔的培養基並將細胞用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)洗滌1次。將細胞裂解，並測定裂解物中是否存在ICAM-1。裂解是通過在80μl裂解緩衝液中於4℃溫育45分鐘而實現的。裂解緩衝液包含8.7g/lNaCl、6.05g/l Tris、0.5％(v/v)NP40，pH8.0。裂解緩衝液也含有100mM濃度的蛋白酶抑制劑PMSF、碘乙醯胺和苯甲醯胺及各自為50mM和5mM濃度的胃蛋白酶抑制劑A和亮抑蛋白酶肽。這些抑制劑是在使用時新鮮添加入裂解緩衝液製備物中的。
在將裂解物轉移到新的圓底96孔平板中之前，將孔中的內含物用微量移液器混合。將平板離心以清除沉澱的細胞碎片，並將清澈的裂解物轉移到另一新的96孔平板中以進行保存(-20℃)或立即測定。
對於本測定試驗，用商業的ELISA系統(sICAM-1Module set；BenderMedsystems，Towcester，英國)和廠商建議的條件分析20μl清澈的裂解物中是否存在溶解的ICAM-1。每一孔中溶液的吸收值是用平板讀出器在492nm讀取的。吸收數值相對抗體濃度製圖。在所有測定中，陽性對照製品是治療性抗體infliximab(Schering-Plough ltd)的樣品，該樣品在測定中一致地展示出在低於1μg/ml的濃度下對TNFα的顯著中和。類似地，本發明修飾的抗體也一致地展示出與陽性對照製品等價的對ICAM-1表達的濃度依賴性抑制作用。圖3顯示從該測定中獲得的示例性圖。
實施例8修飾的抗體結合TNFα的競爭測定試驗本發明修飾的抗體與TNFα受體(RII，p75)競爭的能力是在競爭ELISA中測量的，該測量基於Siegel等人[Siegel等人(1995)Cytokine 7(1)15-25]所述的方法。將ELISA平板用受體(TNFαRII-Fc)包被，並與固定量的生物素化TNFα和抗體的二倍稀釋系列的混合物進行溫育。TNFα與受體的結合是通過應用鏈黴抗生物素蛋白-HRP綴合物的比色測定法進行測量的。該測定試驗用Immulon 2HB 96孔平板(Fisher，Loughborough，英國)進行，該平板通過在碳酸鹽包被緩衝液中於4℃用5μg/ml TNFαRII-Fc(RDsystems，Abingdon，英國)包被過夜而製備。將50μl體積應用於平板的每一個孔中。將包被的平板用PBS-0.05％(v/v)Tween20(PBS-T)洗滌至少5次，並通過添加PBS-T中的1％(v/v)BSA溶液，然後進一步於室溫溫育至少1小時來封閉。
在該溫育過程中，設立了稀釋物平板，在該平板中陳列了檢驗抗體和對照試劑。對於每一個檢驗抗體，一般使用起始於50μl/孔終體積中50μg/ml的濃度的二倍稀釋系列。對照包括非-TNFα結合抗體作為陰性對照，而臨床等級的Infliximab(Schering-Plough ltd，英國)作為陽性對照。對照抗體與檢驗抗體為相同的同種型。在添加抗體之後，添加每孔50μl的50ng/ml生物素-TNFα溶液，並將平板通過輕輕敲打而混合。該TNFα是如前文所述的商業來源產品(PeproTech，London，英國)並用EZ連接磺基-NHS-生物素(Perbio，Tattenhall，英國)按廠商建議的規程進行生物素化。
將封閉溶液從測定平板中去除並將平板如前文所述進行洗滌。將來自稀釋物平板的每一孔的50μl添加到測定平板的相關孔中，且在混合後，將測定平板於室溫溫育至少1小時。在溫育後，洗滌平板並將100μl稀釋的鏈黴抗生物素蛋白-HRP(Sigma，Poole，英國)試劑添加到平板的每一孔中。將平板進一步於室溫溫育至少1小時，並如前文所述進行洗滌。測定結果用100μl/孔的Sigma-fast OPD片劑(Sigma，Poole，英國)顯示，且顏色反應是通過添加每孔50μl的1M硫酸而終止的。將平板進行數據讀取，並將結果繪製為抗體濃度對492nm吸收值的圖。圖4顯示從該測定試驗中獲得的示例性圖。本發明的優選抗體顯示出與本測定中陽性對照抗體等價的對TNFα結合的濃度依賴性競爭曲線。
實施例9對Hs27細胞中TNFα誘導的IL-6增量調節的抑制人包皮成纖維細胞可通過暴露於TNFα而被誘導產生IL-6。本發明的修飾抗體阻斷該表達的增量調節的能力通過如下方式估計將細胞與TNFα及檢驗抗體共溫育，然後用商業上可購得的IL-6探測系統確定隨後分泌到培養基中的IL-6水平。
對於本測定試驗，製備了平行的兩套96孔平板。一套稱為「測定平板」，是用細胞接種的，而另一套稱為「製備平板」，用於製備TNFα及檢驗和對照抗體溶液的稀釋物。製備平板中的內含物最後將轉移到測定平板中。所有測定均重複進行兩次。
對於測定平板，將從歐洲動物細胞保藏中心(ECACC no.94041901)獲得的人包皮成纖維細胞Hs27以每孔2×104個細胞的密度進行接種，並通過於37℃在含有5％CO2的潮溼空氣中溫育過夜而使細胞能夠附著到平板上。貫穿始終的培養基為DMEM+Glutamax(Gibco，Paisley，英國)，含有10％胎牛血清(Perbio，Chester，英國)和常規的antibiotic/mycotic製品(Gibco)。
對於製備平板，將檢驗抗體和陽性對照抗體的二倍稀釋系列在平板橫向上一式兩份地陳列。抗體的起始濃度為100μl/孔終體積中1.25μg/ml。陰性對照無抗體。將3ng/ml的TNFα溶液(PeproTech EC Ltd.，London，英國)添加到含有抗體的所有孔中，而對於無抗體的對照孔，額外添加100μl/孔的培養基。將平板通過輕輕敲打進行混合，並於室溫溫育至少30分鐘。
從含有Hs27細胞的測定平板中除去培養基，並將來自製備平板每一孔的100μl轉移到測定平板的相關孔中。將平板通過輕輕敲打進行混合，並於37℃在含有5％CO2的潮溼空氣中溫育至少18小時。在溫育後，將培養基從每一孔中轉移到新的U-底96孔板中以在-20℃進行保存或立即測定。
用商業的ELISA系統(IL-6 Module set；Bender Medsystems，Towcester，英國)和廠商建議的條件分析培養基中是否存在IL-6。對於測定試驗，將50μl培養基進行1∶15(v/v)的稀釋。每一孔中溶液的吸收值用平板讀出器在492nm讀取。吸收數值對抗體濃度製圖。在所有測定中，陽性對照製品是治療性抗體infliximab(Schering-Plough ltd，英國)的樣品。本發明優選的修飾抗體一致地展示出對IL-6表達的濃度依賴性抑制。圖9顯示從該測定試驗中獲得的示例性圖。
實施例10TNFα的探測將簡單的平板ELISA用於證實本發明的修飾抗體與TNFα結合的能力。該測定是用治療性抗體Infliximab(Schering-Plough ltd，英國)製品作為正對照並用非-TNFα結合性人IgG製品(Sigma I2511)作為負對照進行比較而進行的。該測定用下面詳述的方法進行，並證明本發明優選的組合物(Vh5/Vk12)與本測定中的對照抗體具有相同的功效。典型的結合曲線如圖7所示。
將Immulon 2HB 96孔平板(Fisher，Loughborough，英國)在碳酸鹽包被緩衝液中於4℃用2.5μg/ml TNFα(Peprotech，London，英國)包被過夜。將50μl的體積應用於平板的每一個孔中。將包被的平板用PBS-0.05％(v/v)Tween20(PBS-T)洗滌3次。
製備了每一個抗體的二倍稀釋系列，並各自一式兩份地以每孔100μl體積應用。最高的抗體濃度為1μg/ml。將平板於室溫溫育1小時並如前文所述用PBST進行洗滌。為了探測結合的抗體，將平板與在PBST中1/1000稀釋的小鼠-抗人IgG-HRP綴合物(Sigma，Poole，英國)製品進行溫育。溫育為在室溫進行至少90分鐘。將平板再次如前文所述用PBST進行洗滌，且結合的抗體用100μl/孔的Sigma-Fast OPD顯示。顯色5分鐘，然後通過添加40μl/孔的1M H2SO4而終止反應。將平板在492nm進行數據讀取，並將數據繪製為抗體濃度對光密度的圖。圖7顯示代表性的結合曲線圖，該結合曲線圖表明了在該測定中修飾的抗體(Vh5/Vk12)和陽性對照之間的功能等價性。
實施例11
在體外增殖測定試驗中用人PBMC證明修飾的抗-TNFα抗體的減弱的免疫原性潛力。
修飾的抗體是根據實施例5的方法製備的。陽性對照(攻擊性抗體)是臨床等級的infliximab(Schering-Plough ltd，英國)。對於T細胞增殖測定，將來自健康供體的4×106個PBMC(每孔)與非修飾的和修飾的抗體在2ml大體積培養物(24孔平板中)中進行溫育。用5和50μg/ml的修飾的和非修飾的抗體對每一個供體進行處理。此外，維持未處理的大體積對照培養物以確定刺激指數。在5、6、7和8日，將每一大體積培養物中的細胞輕輕攪動，並取50μl樣品一式三份確定增殖指數。將50μl樣品等份試樣各自轉移到U-底96孔平板的3個孔中。將新鮮的AIM V培養基(130μl)添加到96孔中的每一個孔中。將細胞用每孔1μCi的[3H]胸腺嘧啶進行脈衝(18-21小時)，該[3H]胸腺嘧啶稀釋在20μl總體積的AIMV培養基中。對於每一個培養物，總體積為200μl。CPM值是用β-平板讀出器收集的，且每一個時間點的刺激指數根據上文實施例2所述確定。
相對於每一個時間點和抗體處理繪製SI圖。將顯著的SI取為＞2.0。在有反應的供體中，用infliximab處理導致在第7日具有峰值的顯著的增殖反應。在相同的供體中，用本發明修飾的抗體組合物(Vh5/Vk12)處理未導致顯著的增殖反應。該結果顯示與親代抗體相比，本發明優選的抗體組合物具有減小的免疫原性潛力。從該測定中獲得的代表性圖在圖10中提供。
權利要求
1.一種修飾的單克隆抗-TNFα抗體，該抗體當體內應用時與具有基本相同的生物學特異性的任何非修飾的抗體相比基本無免疫原性或有低的免疫原性，且與非修飾的親代抗體相比在重鏈和/或輕鏈V-區中包含特定胺基酸殘基的改變，其中該改變導致在所述V-區中可以在親代抗體中充當II型MHC結合配體並刺激T-細胞的肽序列的數目減少或消除。
2.根據權利要求1的修飾的抗體，其中所述親代抗體是嵌合的A2(cA2)。
3.根據權利要求1或2的修飾的抗體，其中還在抗體的CDR中進行V-區的改變，從而基本保持親代抗體的結合親和力。
4.根據權利要求2或3的修飾的抗體，其中在非修飾的抗體的所述V-區中進行改變的肽序列選自如圖1和表1所示的連續的T-細胞抗原決定部位序列。
5.根據權利要求4的修飾的抗體，其中對所述T-細胞抗原決定部位的任何一個中的1-9個胺基酸進行改變。
6.根據權利要求5的修飾的抗體，其中對1個胺基酸進行改變。
7.根據權利要求5或6的修飾的抗體，其中所述胺基酸殘基的改變是通過替代實現的。
8.根據權利要求4-7中任何一項的修飾的抗體，其中還進行其它胺基酸殘基改變以恢復該抗體的生物學活性。
9.根據權利要求3-8中任何一項的修飾的抗體，其中所述V-區中的胺基酸殘基改變是在親代抗體的至少一段選自如下的具有連續胺基酸殘基的肽序列中進行的(A) GLVQPGGSMKLSCVAS；(B) WVAEIRSKSINSA；(C) SRDDSKSAVYLQMTDLRT；(D) RNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS；(E) DILLTQSPAILSVSPGERVSF；(F) HWYQQRTNGSPR；(G) LIKYASESMSGIPS；(H) DFTLSINTVESEDIADYYCQQ.
10.根據權利要求2或3的修飾的抗體，其中V-區重鏈(「Vh」鏈)包含選自SEQ ID 1(Vh1)、SEQ ID 2(Vh3)、SEQ ID 3(Vh5)和SEQID 4(Vh8)的序列。
11.根據權利要求2或3的修飾的抗體，其中V-區輕鏈(「Vk」鏈)包含選自SEQ ID 5(Vk1)、SEQ ID 6(Vk12)、SEQ ID 7(Vk5)和SEQ ID 8(Vk8)的序列。
12.根據權利要求10或11的修飾的抗體，其包含權利要求10中的任一Vh鏈和權利要求11中的任一Vk鏈。
13.權利要求12的修飾的抗體，其包含Vh5鏈(SEQ ID 3)和Vk12鏈(SEQ ID 6)。
14.權利要求12的修飾的抗體，其包含Vh1鏈(SEQ ID 1)和Vk1鏈(SEQ ID 5)。
15.權利要求12的修飾的抗體，其包含Vh1鏈(SEQ ID 1)和Vk5鏈(SEQ ID 7)。
16.權利要求12的修飾的抗體，其包含Vh1鏈(SEQ ID 1)和Vk8鏈(SEQ ID 8)。
17.權利要求12的修飾的抗體，其包含Vh8鏈(SEQ ID 4)和Vk5鏈(SEQ ID 7)。
18.權利要求2或3的修飾的抗體，其具有改變的V-區重鏈，並與未改變的cA2抗體相比包含下列任一組的胺基酸殘基替代(a1) M18L，K19R，V23A，I28T，I51T，I56T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，L116V；(a2) K3Q，E5V，M18L，K19R，V23A，I28T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，G94A；(a3) M18L，K19R，V23A，I28T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，L116V；(a4) K3Q，E5V，M18L，K19R，V23A，I28T，I51T，I56T，E64D，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，G94A，T115L，L116V.
19.權利要求2或3的修飾的抗體，其具有改變的V-區輕鏈，並與未改變的cA2抗體相比包含下列任一組的胺基酸殘基替代(b1) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，V19A，Q38H，R39T，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T；(b2) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，L104V；(b3) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，S100G，N103K，L104V，V106I；(b4) L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，V19A，Q38H，R39T，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，S100G，N103K，L104V，V106I.
20.權利要求2或3的修飾的抗體，其具有改變的V-區重鏈和輕鏈，並同時包含如權利要求18所示的胺基酸替代組a1-a4中的任一組和如權利要求19所示的胺基酸替代組b1-b4中的任一組。
21.權利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區重鏈和輕鏈並同時包含替代組a1和b1。
22.權利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區重鏈和輕鏈並同時包含替代組a2和b2。
23.權利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區重鏈和輕鏈並同時包含替代組a2和b3。
24.權利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區重鏈和輕鏈並同時包含替代組a2和b4。
25.權利要求20的修飾的抗體，其具有改變的V-區重鏈和輕鏈並同時包含替代組a4和b3。
26.根據權利要求1-25中任何一項的修飾的抗體，其中恆定區結構域源自人IgG1和人κ。
27.根據權利要求1-26中任何一項的修飾的抗體，其中當該抗體以完整蛋白質形式在誘導的人T-細胞細胞增殖生物學測定試驗中檢測時，與使用來自相同供體的細胞平行檢測的親代抗體相比顯示出較小的刺激指數，其中該指數記為在蛋白質刺激後評定的細胞增殖值除以在未接受蛋白質的對照細胞中評定的細胞增殖值，且其中細胞增殖是由任何適當的方法測量的。
28.根據權利要求1-26中任何一項的修飾的抗體，其包含V-區序列，其中從該序列可以得到肽，該肽在誘導的人T-細胞細胞增殖生物學測定試驗中進行檢測時，顯示出比平行地進行檢測的源自非修飾的親代抗體的肽有低的刺激指數，其中該指數記為在肽刺激後評定的細胞增殖值除以在未接受肽的對照細胞中評定的細胞增殖值，且其中細胞增殖是由任何適當的方法測量的。
29.一種編碼根據權利要求1-28中任何一項的抗體的DNA分子。
30.一種包含如在上述權利要求的任何一項中限定的修飾的抗-TNFα抗體的藥物組合物，其任選地還包含藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
31.如在上述權利要求的任何一項中限定的修飾的抗-TNFα抗體在製備用於治療類風溼關節炎和Crohn氏病的藥物中的用途。
32.一種由9-15個連續的胺基酸殘基組成的肽分子，該肽分子具有潛在的II型MHC結合活性並從非修飾的抗-TNFα抗體A2的一級序列中生成，該肽分子在細胞增殖生物學測定試驗中具有至少1.8～2的刺激指數，其中該指數記為在肽刺激後評定的細胞增殖值除以在未接受肽的對照細胞中評定的細胞增殖值，且其中細胞增殖是由任何適當的方法測量的。
33.權利要求32的肽分子，其選自如在圖1或表1中描述的連續的T-細胞抗原決定部位序列。
34.一種通過胺基酸替代從權利要求32或33的肽分子形成的修飾的肽分子，該修飾的肽分子具有以小於2的刺激指數表示的減小的或不存在的潛在II型MHC結合活性，其中該指數記為在肽刺激後評定的細胞增殖值除以在未接受肽的對照細胞中評定的細胞增殖值，且其中細胞增殖是由任何適當的方法測量的。
35.根據權利要求34的修飾的肽分子，該肽分子具有小於1.8的刺激指數。
36.根據權利要求32-35之任一項的肽在製備抗-TNFα抗體中的用途，其中所述抗-TNFα抗體當體內應用時與任何非修飾的親代抗體相比基本無免疫原性或具有低的免疫原性。
全文摘要
本發明涉及對人腫瘤壞死因子α(TNFα)反應性抗體進行修飾，從而導致當用於體內時與任何非修飾的親代抗體相比基本無免疫原性或具低的免疫原性的抗－TNFα抗體。本發明也涉及包含親代抗體V－區域中的T－細胞抗原決定部位的肽分子，該肽分子通過胺基酸改變進行修飾以減少或消除該T－細胞抗原決定部位。
文檔編號A61P1/04GK1585778SQ02822357
公開日2005年2月23日 申請日期2002年11月11日 優先權日2001年11月12日
發明者K·海倫多爾恩, M·貝克爾, F·J·卡爾 申請人:默克專利有限公司