一種農桿菌介導的油菜大田轉基因方法

2023-09-19 22:44:30

專利名稱：：一種農桿菌介導的油菜大田轉基因方法
技術領域：
：本發明屬於植物基因工程領域，涉及一種農桿菌介導的油菜大田轉基因方法。
背景技術：
：多年來，許多育種工作者試圖採用傳統的育種手段來獲得油菜良種，但進展十分緩慢。隨著基因工程技術的發展，人們愈來愈傾向於通過基因工程的手段改良油菜的產量、品質及抗逆性。目前應用於油菜的轉基因技術主要有農桿菌介導的轉化方法、基因槍方法、化學方法(如利用聚乙二醇)和物理方法(如利用電導入法)。其中農桿菌介導的轉化方法因其簡單、有效而得到廣泛應用。採用該方法在油菜中已經建立了基於組織培養的轉化體系，但該轉化過程比較複雜，涉及無菌苗的培養、外植體的切取、浸染、愈傷誘導、分化、生根、移栽等，因而油菜再生頻率受到外植體類型、基因型、激素、外植體生理狀態等多種因素的影響，使得油菜遺傳轉化效率較低。近年發展了一種農桿菌介導的floral-dip轉化方法，該方法省去了組織培養的繁瑣步驟，克服了植株再生的困難，可直接獲得轉化種子，因而具有不可替代的優勢。但是油菜的不同發育時期、農桿菌轉化液組成成分、浸染次數、浸染時間等都在不同程度上影響油菜的轉化效率。因此，優化floral-dip轉化方法的方案是進一步提高油菜遺傳轉化效率的關鍵。徐光碩等(見參考文獻)用inplanta法處理5個甘藍型油菜品種，獲得了轉基因油菜植株，平均轉化效率為O.1%左右，且各甘藍型油菜品種間的轉化率無明顯差異。其技術方案如下(1)農桿菌的培養吸取甘油冷凍保存的含有目的基因的農桿菌100iiL，接種於10mL新鮮的LB(1%蛋白腖，O.5%酵母提取物，1%NaCl，pH7.0)培養基中，在28。C左右150r/min振蕩培養過夜。吸取上述培養物10mL接種於1L含有合適濃度抗生素的5%蔗糖培養液中，在28t:左右150r/min振蕩培養24h以上，直至0D66。=5。(2)農桿菌轉化菌液配置①將上述0D66。=1-1.5的農桿菌懸浮液在8000Xg下離心8min，沉澱後的農桿菌用1L新鮮的LB培養基重新懸浮。②將培養好的農桿菌懸浮液離心後重新懸浮於浸染液(5%蔗糖，0.02%Silwet-77)中。(3)農桿菌轉化菌液浸染油菜花序①轉化時期及轉化前預處理在油菜大田中選擇花上沒有露水和泥土的植株，然後選擇那些有花即將開放的分枝，剪去分枝上已經開放的花。②浸染時間將枝條彎曲，使整個花序浸泡在盛有菌液的燒杯中，上下搖動lmin左右。③浸染次數及間隔時間整個過程自第一次浸染後每天或隔天進行一次，共1015次。④浸染後植株的管理在確保所有花都已被浸染後，用硫酸鈉紙袋將處理過的花序套住。於終花期將花序上的紙袋取下，管理好植株。待種子成熟時，將經過inplanta處理過的分枝剪下單獨收穫種子，曬乾後脫粒儲藏。(3)轉基因植株的篩選在經過inplanta處理的種子中選擇較飽滿者，用0.1%的升汞浸泡1215min，然後經無菌水清洗3次後，均勻播撒於含有卡那黴素(270mg丄—0的MS固體培養基上。將存活下來的幼苗移栽至營養缽，經DNA檢測確信外源基因的存在後移至土壤中。從上述技術方案來看，存在如下缺點(1)農桿菌的培養是採用液體培養，需要經過離心和重新懸浮菌體，操作麻煩。(2)配置農桿菌轉化菌液的轉化液為LB液體培養基或者為含5%蔗糖和0.02%Silwet-77的溶液，因對花有損害而降低外源基因進入植物基因組中的頻率。(3)用轉化菌液浸泡花序的時間為1分鐘，時間太長，對花損傷重。(4)浸染同一花序的次數太多，並且間隔時間短，對花損傷重。(5)於終花期將花序上的紙袋取下，可能因套袋時間太長，使果莢因缺乏光照而生長不良，影響種子的質量。總之，由於該方法存在上述缺點，導致轉化效率低，僅為0.1%(見表1)。表linplanta轉化方法在各油菜品種中的轉化效率TablelThefrequenceoftransformantsindifferentcultivarsofrapeseedbyinplantamethodtableseeoriginaldocumentpage4付紹紅等(見參考文獻)用floral-dip法處理甘藍型油菜，主要是研究表面活性劑Silwet-77對floral-dip轉化甘藍型油菜效果的影響，獲得了抗性植株，認為0.05%的表面活性劑Silwet-77對floral-dip轉化甘藍型油菜最為有利。其技術方案如下[OO32](1)農桿菌培養農桿菌培養基為LB培養基蛋白腖10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl5g/L。溶質完全溶解後用Na0H調節pH至7.O，定容至1L(固體培養基含1.5%瓊脂)，用接種環接觸穿剌的培養基畫線接種。放在2『C黑暗條件下培養3天。挖一塊穿剌物的瓊脂，接種於含合適濃度抗生素的YEP液體培養基上，於28振蕩培養1-2天，再取25ml放入500mlYEB(含合適濃度抗生素)中，搖菌24小時以上(0D6。。在1.8-2.0)。[OO34](2)轉化菌液配置4000rmp離心15min(室溫)，用2倍體積(1L)轉化液(MS基本培養基+6BAP(0.01ng/L)+蔗糖5%+0.05%Silwet-77;pH5.8)溶解，混勻後準備轉化。(3)農桿菌菌液浸染油菜花序①轉化時期及轉化前預處理選擇初花期的甘藍型油菜植株處理，前1天田間澆透水。去除主花序和每個分枝花序的頂端花蕾，同時除去已開放的花朵，只保留快要開放的花蕾。②浸染次數及間隔時間同一花序連續浸染3次，間隔時間為1天。③浸染後植株的管理浸染完後套上紙袋。最後一次浸染處理24小時後除去紙袋直至收穫種子。(4)轉基因植株的篩選對浸染處理後獲得的1\代種子經75%酒精表面消毒30秒，O.1%HgC12消毒10分鐘，鋪在預先倒好的篩選培養基(預先確定好最佳濃度培養基)平板上，經7-15天篩選培養，將正常生長的綠色苗進行第2次抗性篩選(7-15天)，將第2次篩選後的抗性植株進行第3次抗性篩選(7-15天)，第2次，第3次篩選培養基為Ms+Km(150mg/L)。從上述技術方案來看，存在如下缺點(1)農桿菌的培養是採用液體培養，需要經過離心和重新懸浮菌體，操作麻煩。(2)配置農桿菌轉化菌液的轉化液為MS基本培養基+6BAP(0.01ng/L)+蔗糖5%+0.05%Silwet-77;pH5.8，沒有添加促進外源基因進入植物基因組中的物質，因此在一定程度上影響轉化效率。(3)菌液浸泡花序的時間不明確，浸泡時間長短也會影響到轉化效率。(4)浸染同一花序的間隔時間太短，這對花有損害。(5)最後一次浸染處理24小時後就除去紙袋，套袋時間太短，不利於保持農桿菌轉化活性。總之，由於該方法存在上述缺點，導致轉化效率較低，僅為2.03%。參考文獻[1]徐光碩，饒勇強，陳雁，張椿雨，孟金陵.用inplanta方法轉化甘藍型油菜.作物學報，2004，1:1-5.[2]付紹紅，牛應澤，楊洪全，韋獻雅.表面活性劑silwetL-77對floral-dip轉化甘藍型油菜效果的影響.分子植物育種，2004，2(5):661-666.
發明內容本發明的目的是針對現有技術的缺點，提供一種操作簡便，轉化效率高的適用於構建油菜突變體庫的轉基因方法。本發明主要是從農桿菌培養、農桿菌轉化菌液配置、重複浸染間隔時間、浸染時間、及浸染後植株的管理入手，通過優化農桿菌介導的floral-dip轉化方法方案，提出一種高效的適用於油菜突變體庫構建的油菜大田轉基因方法。具體技術方案如下[OO57](1)農桿菌培養5將含有pSKI015質粒和pMP90RK輔助質粒或者含有pEGAD質粒的GV3101菌株進行活化和抗生素篩選培養。對陽性克隆的農桿菌菌液，按1:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液塗布新鮮的含抗生素的YEB固體平板上(100X20mm)，28。C下培養2-3天。[OOSO](2)農桿菌轉化液配置首先配置1/2MS液體培養基，然後在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙醯丁香酮和6-BAP，使其終濃度分別為5%、0.05%-0.1%、0.2%-0.4%和0.001%。-0.002%。，然後用NaOH調節pH值為5.7_5.8。農桿菌轉化液組成成分中乙醯丁香酮的作用原理，是其可誘導農桿菌Vir基因的活化，從而促進外源基因整合到植物基因組中。因此，在農桿菌轉化液中配置一定濃度的乙醯丁香酮有利於提高油菜遺傳轉化效率。(3)農桿菌轉化菌液配置用轉化液將培養在固體平板上的農桿菌洗脫下來，每個固體平板上(100X20mm)的農桿菌大概需要150ml轉化液洗脫，洗脫下來的農桿菌需要充分懸浮，然後用分光光度計測定轉化菌液的OD值，並用轉化液將轉化菌液0D6。。的值調至0.6-0.8。(4)農桿菌轉化菌液浸染油菜花序①最佳轉化時期及轉化前預處理將油菜播種在大田，當油菜的主枝和部分側枝現蕾並有幾朵小花開放時，去除主花序和每個分枝花序已開放的花朵，只剩下花蕾。處於最佳轉化時期的油菜見圖3。②浸染時間將轉化菌液(400-500ml)裝入塑膠袋(35X25cm)中，並將去掉已開放花的油菜花序抓成一束，輕輕伸入塑膠袋，讓轉化菌液充分浸泡花序，時間為30秒，浸泡後的花序立即用羊皮紙袋(40X18cm)包紮(圖4)。400-500ml的轉化菌液可浸染6_8株油菜。③浸染次數及間隔時間同一花序連續浸染3次，間隔時間為2-3天。花序頂端出現新的快開放花蕾的時間大約為2-3天，因而間隔2-3天時重複浸染可使受浸染的花蕾數增加。④浸染後植株的管理浸染完後套上羊皮紙袋(圖4)。在完成最後一次轉化的7-10天後，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾(圖4)。待種子成熟後，收穫曬乾，即得Tl代種子。(5)轉基因植株的篩選將獲得的T1代種子播種於大田，在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔2-3天噴施一次，連續噴4-5次，在完成最後一次噴施的10-15天後統計轉化率(圖5)。本發明的油菜轉化效率達2.5%-3.8%。本發明的優點(1)本發明農桿菌的培養採用固體平板培養，簡化了農桿菌菌體收集過程，因此也避免了液體培養的農桿菌因離心、懸浮等操作過程而降低農桿菌轉化活力。(2)與液體培養相比，農桿菌採用固體平板培養可以節約成本，尤其在大規模轉化時更加體現了該方法的優越性。例如配置500ml的轉化菌液，如果農桿菌採用液體培養，至少需要500ml液體培養基；如果採用固體培養，只需要液體培養基80ml和瓊脂1.2g，用於準備4個固體平板。由此可見，配置相同體積的轉化菌液，採用固體平板培養農桿菌所需的成本可降低約4倍。(3)本發明在農桿菌轉化液組成成分中加入乙醯丁香酮，並找到了加入的合適濃度，通過促進外源基因整合到植物基因組中，而提高油菜遺傳轉化效率。(4)本發明在完成最後一次轉化後，需套紙袋7-10天保溼，有利於保持農桿菌的轉化活力和浸染後花的復甦。(5)本發明在完成最後一次轉化的7-10天後，摘除花序上的羊皮紙袋有利於油菜果莢的生長，提高種子質量。(6)在完成最後一次轉化的7-10天後，摘除花序頂端的花及花蕾，可以減少篩選時的工作量，並進一步提高油菜轉化效率。這主要是由於油菜的花序為無限花序，7-10天後新長出的花蕾是沒有被轉化的，因此需要去除。(7)本發明的轉化效率達2.5%-3.8%，適用於建立油菜突變體庫。圖1為激活標記質粒pSKI015圖譜質粒T-DNA上帶有除草劑抗性標記基因BASTA和4個35S增強子(4X35Se);LB:T-DNA左邊界；RB:T-DNA右邊界。圖2為pEGAD質粒T-DNA表達框35S:CaMV35S啟動子；AtGA2ox8:目的基因AtGA2ox8;BastaR:除草劑抗性標記基因；EGFP:—種產生較強螢光的突變性綠色螢光蛋白。圖3為處於最佳轉化時期的油菜植株照片。圖4為轉化菌液浸染油菜花序過程；A:開花後5天的油菜花序；B:用轉化菌液浸泡花序；C:浸染後將花序用羊皮紙袋套上保溼；D:7-10天後取掉紙袋。圖5為轉基因植株的篩選A:沒有噴施除草劑Basta的1\代幼苗；B:噴施除草劑Basta後存活的1\代幼苗(抗Basta的轉基因植株)。具體實施方式以下實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例1:(1)油菜種植油菜品種1244怖為半冬性中熟甘藍型油菜(B.napus，染色體組AACC，2n=38)。其主要特點是分枝性強，枝葉繁茂，細根較發達；耐寒、耐溼、耐肥，抗霜黴病、菌核病和病毒病能力強；花瓣大，花黃色，角果較長，結莢多，籽粒飽滿；種子含油量較高，一般為35%50%。生長期約227天，產量約340-350斤/畝。將油菜種子於9月15日播種於苗床育苗，苗床的土壤應肥沃且溼潤。大約一個月以後，幼苗長出3-4片真葉，此時將幼苗移植到大田。大田的廂寬2米，行距0.4米，株距0.3米，廂與廂之間的溝距0.3米，溝深0.2米。種植5000株油菜，佔地面積大約為200平方米。油菜肥水管理按常規方法進行，次年春天(3月上旬)開花。此時，選擇最佳時期進行油菜農桿菌轉化。圖3為處於最佳轉化時期的油菜植株。(2)農桿菌培養pSKI015質粒圖譜見圖1，該質粒帶有除草劑抗性標記基因BASTA和4個35S增強子(4X35Se)。本發明用該質粒的目的有兩個一是解決目前限制油菜突變體庫建立的轉基因技術瓶頸問題；二是利用本發明建立油菜激活標記突變體庫。將保存於-80。C的含有pSKI015質粒的GV3101(含pMP90RK輔助質粒)菌株進行活化，劃線培養在含抗生素利福平、卡那黴素、羧苄青黴素和慶大黴素的YEB固體平板上(100X20mm)，抗生素終濃度分別為50mg.L—\50mg.L—\50mg.L-1和25mg.L—、28。C下培養2-3d，然後挑取單菌落於含抗生素的YEB液體培養基中培養，提取質粒，進行PCR檢測。這主要是由於含有pSKI015質粒的農桿菌如果於-S(TC儲存太久，會影響pSKI015質粒中的CaMV35S增強子重複序列的穩定性，因此在轉化前需檢測該重複序列是否存在於農桿菌中。檢測引物為T7，5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，或M13(-20)，5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3，與IK007，5，-CCCGCCAATATATCCTG-3，。對陽性克隆的農桿菌菌液，按1:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液塗布新鮮的含抗生素的YEB固體平板(100X20mm)上，28。C下培養2_3d。YEB固體培養基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白腖5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、瓊脂粉1.5%，pH7.2。YEB液體培養基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白腖5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、pH7.2。[cmo](3)農桿菌轉化液配置首先配置1/2MS液體培養基，然後在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙醯丁香酮和6-BAP，使其終濃度分別為5%、0.05%、0.4%和0.002%。，然後用NaOH調節pH值為5.8。農桿菌轉化液組成成分中乙醯丁香酮的作用原理，是其可誘導農桿菌Vir基因的活化，從而促進外源基因整合到植物基因組中。因此，在農桿菌轉化液中配置一定濃度的乙醯丁香酮有利於提高油菜遺傳轉化效率。[O112](4)農桿菌轉化菌液配置用農桿菌轉化液將培養在固體平板上的農桿菌洗脫下來，每個固體平板上(100X20mm)的農桿菌大概需要150ml轉化液洗脫，洗脫下來的農桿菌需要充分懸浮，然後用分光光度計測定轉化菌液的OD值，並用轉化液將轉化菌液0D6。。的值調至0.8。(5)農桿菌轉化菌液浸染油菜花序①最佳轉化時期的選擇及轉化前預處理次年春天(3月上旬)，油菜進入初花期。此時，選擇主枝和部分側枝現蕾並有幾朵小花開放的油菜植株，去除主花序和每個分枝花序已開放的花朵，剩下快開放的花蕾和花序頂端花蕾。圖3為處於最佳轉化時期的油菜植株。②確定浸染時間於上午8時開始進行浸染，避免在中午紫外線較強時進行浸染。浸染時，將轉化菌液(400-500ml)裝入塑膠袋(35X25cm)中，並將去掉已開放花的油菜花序抓成一束，輕輕伸入塑膠袋，讓轉化菌液充分浸泡花序，時間為30秒，浸泡後的花序立即用羊皮紙袋(40X18cm)包紮(圖4)。400_500ml的轉化菌液可浸染6-8株油菜。③浸染次數及間隔時間同一花序連續浸染3次，間隔時間為2-3天。花序頂端出現新的快開放花蕾的時間大約為2-3天，因而間隔2-3天時重複浸染可使受浸染的花蕾數增加。④浸染後植株的管理浸染完後套上羊皮紙袋(圖4)。在完成最後一次轉化的7天後，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾(圖4)。待種子成熟後，收穫曬乾，即得1\代種子。(6)轉基因植株的篩選將獲得的1\代種子播種於大田，在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔2-3天噴施一次，連續噴4-5次，在完成最後噴施的10-15天後統計轉化率(圖5)。本發明的油菜轉化效率達3.8%。實施例2:(1)油菜種植油菜品種N529為半冬性中熟甘藍型油菜(B.n即us，染色體組AACC，2n=38)。將油菜種子於9月15日播種於苗床育苗，苗床的土壤應肥沃且溼潤。大約一個月以後，幼苗長出3-4片真葉，此時將幼苗移植到大田。大田的廂寬2米，行距0.4米，株距0.3米，廂與廂之間的溝距0.3米，溝深0.2米。種植5000株油菜，佔地面積大約為200平方米。油菜肥水管理按常規方法進行，次年春天(3月上旬)開花。此時，選擇最佳時期進行油菜農桿菌轉化。(2)農桿菌培養pEGAD質粒的T-DNA圖譜見圖2。該T-DNA序列中帶有目的基因、除草劑抗性標記基因BASTA和突變性綠色螢光蛋白(EGFP)報告基因，這些基因都由CaMV35S啟動子(35S)驅動表達。將保存於-S(TC的含有pEGAD質粒的GV3101菌株進行活化，劃線培養在含抗生素利福平、卡那黴素和慶大黴素的YEB固體平板上(100X20mm)，抗生素終濃度分別為50mg.L入50mg.L—1和25mg.L—、28。C下培養2_3d，然後挑取單菌落於含抗生素的YEB液體培養基中培養24小時。將農桿菌菌液按l:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液塗布新鮮的含抗生素的YEB固體平板(100X20mm)上，28。C下培養2_3d。YEB固體培養基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白腖5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、瓊脂粉1.5%，pH7.2。YEB液體培養基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白腖5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、pH7.2。(3)農桿菌轉化液配置首先配置1/2MS液體培養基，然後在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙醯丁香酮和6-BAP，使其終濃度分別為5%、0.05%、0.4%和0.002%。，然後用NaOH調節pH值為5.8。農桿菌轉化液組成成分中乙醯丁香酮的作用原理，是其可誘導農桿菌Vir基因的活化，從而促進外源基因整合到植物基因組中。因此，在農桿菌轉化液中配置一定濃度的乙醯丁香酮有利於提高油菜遺傳轉化效率。(4)農桿菌轉化菌液配置用農桿菌轉化液將培養在固體平板上的農桿菌洗脫下來，每個固體平板上(100X20mm)的農桿菌大概需要150ml轉化液洗脫，洗脫下來的農桿菌需要充分懸浮，然後用分光光度計測定轉化菌液的OD值，並用轉化液將轉化菌液0D6。。的值調至0.8。(5)農桿菌轉化菌液浸染油菜花序①最佳轉化時期的選擇及轉化前預處理次年春天(3月上旬)，油菜進入初花期。此時，選擇主枝和部分側枝現蕾並有幾朵小花開放的油菜植株，去除主花序和每個分枝花序已開放的花朵，剩下快開放的花蕾和花序頂端花蕾。②確定浸染時間於上午8時開始進行浸染，避免在中午紫外線較強時進行浸染。浸染時，將轉化菌液(400-500ml)裝入塑膠袋(35X25cm)中，並將去掉已開放花的油菜花序抓成一束，輕輕伸入塑膠袋，讓轉化菌液充分浸泡花序，時間為30秒，浸泡後的花序立即用羊皮紙袋(40X18cm)包紮。400-500ml的轉化菌液可浸染6_8株油菜。③浸染次數及間隔時間同一花序連續浸染3次，間隔時間為2-3天。花序頂端出現新的快開放花蕾的時間大約為2-3天，因而間隔2-3天時重複浸染可使受浸染的花蕾數增加。④浸染後植株的管理浸染完後套上羊皮紙袋。在完成最後一次浸染的IO天后，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾。待種子成熟後，收穫曬乾，即得1\代種子。(6)轉基因植株的篩選將獲得的1\代種子播種於大田，在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔2-3天噴施一次，連續噴4-5次，在完成最後噴施的10-15天後統計轉化率。本發明的油菜轉化效率達2.5%。權利要求一種農桿菌介導的油菜大田轉基因方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)農桿菌轉化菌液配置將活化的陽性克隆農桿菌菌液，稀釋塗布在YEB固體平板上培養；在1/2MS液體培養基中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙醯丁香酮和6-BAP，使其質量終濃度分別為5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰，最後用NaOH調節pH值為5.7-5.8；配置成轉化液；用配置的轉化液將固體平板上的農桿菌洗脫下來，並繼續用轉化液將洗脫的轉化菌液OD500的值調至0.6-0.8；(2)農桿菌轉化菌液浸染油菜花序①轉化前預處理當油菜的主枝和部分側枝出現花蕾並有幾朵小花開放時，去除主花序和每個分枝花序已開放的花朵，只剩下花蕾；②浸染將①步中經過預處理的油菜花序抓成一束，輕輕伸入轉化菌液中充分浸泡花序，時間為30秒，浸泡後的花序立即用羊皮紙袋包紮；400-500ml的轉化菌液浸染6-8株油菜；同一花序連續浸染3次，間隔時間為2-3天；(3)浸染後植株的管理在完成最後一次轉化的7-10天後，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾；待種子成熟後，收穫曬乾，即得T1代種子；(4)轉基因植株的篩選將獲得的T1代種子播種，通過噴施除草劑抗性選擇標記篩選。2.根據權利要求l所述的農桿菌介導的油菜大田轉基因方法，其特徵在於，步驟(1)所述的農桿菌菌株是含有pSKI015質粒和pMP90RK輔助質粒或含有pEGAD質粒的GV3101菌株。3.根據權利要求l所述的農桿菌介導的油菜大田轉基因方法，其特徵在於，步驟(1)所述的YEB固體平板培養是將陽性克隆的農桿菌菌液按1:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液塗布含抗生素的100X20mmYEB固體平板上，28。C下培養23天。4.根據權利要求l所述的農桿菌介導的油菜大田轉基因方法，其特徵在於，步驟(1)所述的洗脫過程中每個100X20mm固體平板上的農桿菌用150ml轉化液洗脫，洗脫下來的農桿菌充分懸浮。5.根據權利要求1所述的農桿菌介導的油菜大田轉基因方法，其特徵在於，步驟(2)中浸染時，轉化菌液裝在規格為35X25cm塑膠袋中。6.根據權利要求1所述的農桿菌介導的油菜大田轉基因方法，其特徵在於，步驟(3)中羊皮紙袋規格為40X18cm。7.根據權利要求1所述的農桿菌介導的油菜大田轉基因方法，其特徵在於，步驟(4)中所述的抗性篩選具體是在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔23天噴施一次，連續噴4-5次。全文摘要本發明公開了一種農桿菌介導的油菜大田轉基因方法。用蔗糖、Silwet-77、乙醯丁香酮和6-BAP濃度分別為5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰的1/2MS液體培養基洗脫YEB固體平板上的農桿菌；轉化前當油菜的主枝和部分側枝出現花蕾並有幾朵小花開放時，去除主花序和每個分枝花序已開放的花朵，只剩下花蕾；將花序在洗脫的轉化菌液中浸泡30秒後立即包紮；同一花序連續浸染3次，間隔2-3天；轉化後的7-10天，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾。該方法操作簡單，所需成本降低，轉基因效率高，無基因型依賴性，在利用基因工程手段培育油菜新品種和油菜突變體庫建立方面都具有很好的應用前景。文檔編號C12N15/84GK101748148SQ20101030090公開日2010年6月23日申請日期2010年1月28日優先權日2010年1月28日發明者劉選明,唐冬英,廖紅東,林建中,林辰濤,趙小英申請人:湖南大學