催化切割β－胡蘿蔔素的新型雙加氧酶的製作方法

2023-09-19 21:54:45

專利名稱：催化切割β－胡蘿蔔素的新型雙加氧酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及轉化細菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細胞、種子、組織、和完整生物體的領域。更具體的說，本發明涉及將編碼類胡蘿蔔素/類視黃質(retinoid)生物合成途徑的一種或多種特定酶的重組核酸序列整合到合適宿主細胞或生物體中，它們在轉化之後展示期望表型，而且可用於例如商業生產。另外，本發明提供了通過生物技術來實現氧化切割C40類胡蘿蔔素而產生類胡蘿蔔素/類視黃質途徑的不同特徵性代謝物的手段和方法。
背景技術：
維生素A(視黃醇)及其衍生物(視黃醛、視黃酸)(在說明書全文中使用術語「類視黃質」)代表在動物中涉及廣泛基礎生理過程的一組化學類化合物。它們在例如視覺、生殖、代謝、細胞分化、骨骼發育、和胚胎形成過程中的圖式形成中是必不可少的。為了研究類視黃質(諸如維生素A)的作用，已經使用了幾種物種(如小鼠、大鼠、雞、和豬)作為脊椎動物模型生物體，而在無脊椎動物中大多數研究是用黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)進行的。蠅視覺系統數十年來一直作為使用電生理學、光化學、遺傳學、和分子生物學研究受體多樣性和維生素A利用的模型。
維生素A及其最重要的衍生物視黃醛和視黃酸(RA)由20個碳原子組成(C20)且屬於化學類的類異戊二烯。動物通常不能從頭合成類視黃質。動物的類視黃質生物合成依賴於由食物攝取具有維生素A原活性的類胡蘿蔔素。在那些能夠由類胡蘿蔔素合成類視黃質的動物中，必須酶促切割維生素原。例如在哺乳動物中，已經在衍生自小腸和肝的粗提物中描述了這種酶活性。該酶催化對稱氧化切割β-胡蘿蔔素而形成兩個分子視黃醛，在生化上表徵為15，15』-β-胡蘿蔔素雙加氧酶(β-diox I)。這些酶在整個動物界中參與類胡蘿蔔素代謝/類視黃質形成。例如，

圖1和圖9圖解了在哺乳動物中描述的類視黃質形成的生物合成途徑。除了β-胡蘿蔔素，還可以切割葉黃素(含氧類胡蘿蔔素)，只要它們具有未取代β-芷香酮環(如β-隱黃素)即可；而且在不同的動物物種中，已經報導了對不同於β-胡蘿蔔素的類胡蘿蔔素進行代謝而形成羥化類視黃質的能力(如昆蟲綱中的玉米黃質和黃體素)。為了進一步代謝，必須酶促修飾產生的視黃醛而形成視黃醇(維生素A)或視黃酸。
在細菌和植物中也發現了對類胡蘿蔔素的酶促氧化切割。在高等植物中發現了偏心切割類胡蘿蔔素的許多範例。這些範例包括番紅花(crocus)中saffron的形成、柑橘水果中檸烏素和其它阿樸類胡蘿蔔素的形成，最有趣的是植物激素脫落酸(ABA，參與例如秋季落葉和種子休眠的一種生長調節劑)。ABA衍生自在11-12碳雙鍵處氧化切割9-順式-環氧-類胡蘿蔔素。最近，對ABA生物合成缺陷的玉米突變體vp14的研究提供了對這種切割反應更好的分子理解，並克隆和分子表徵了動物來源的第一種類胡蘿蔔素切割酶(β-diox I)。由該發現提出了問題，即相似的酶是如何參與動物的類胡蘿蔔素代謝/類視黃質代謝，催化氧化切割具有維生素A原活性的類胡蘿蔔素。在隨後的實驗中，的確鑑定並表徵了相似的酶(β-diox II)，它們也參與類胡蘿蔔素/類視黃質途徑並特異切割β-胡蘿蔔素而形成β-阿樸胡蘿蔔素醛(β-apocarotenal，視黃酸的前體)。因而，除了β-diox I是一類新型β-胡蘿蔔素特異酶以外，依照本發明能夠鑑定的另一類新型酶(β-diox II)也進行對相同底物即β-胡蘿蔔素的氧化切割。
在動物中，已經在體外對這些重要類型的酶在類胡蘿蔔素代謝/類視黃質形成中的功能研究了近40年。然而，試圖分離並純化這樣的蛋白質和鑑定它們的分子結構的所有嘗試都失敗了。這些酶的分子結構的公開(包括它們的核苷酸序列(cDNA)和它們的胺基酸序列)對於研究維生素A/類視黃質在動物和在醫學中的作用的多個領域而言將是重要的。另外，該遺傳物質可用於轉化完整的存活生物體，從而得以在例如植物和微生物中生成類視黃質(諸如維生素A和視黃酸)以增加它們的營養價值。
在脊椎動物中，已經有爭議的討論了在維生素A及其衍生物的生物合成中對β-胡蘿蔔素的對稱/不對稱切割。除了β-diox I，本發明還提供了對來自小鼠、人、和斑馬魚的cDNA的鑑定，它們編碼稱為β-dioxII的第二類胡蘿蔔素雙加氧酶，該酶專一催化不對稱氧化切割β-胡蘿蔔素而形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮(已知是來自例如玫瑰的花香物質)。除了β-胡蘿蔔素，該酶還氧化切割番茄紅素。它的推導胺基酸序列與β，β-胡蘿蔔素-15，15』-雙加氧酶享有顯著的序列同一性，而且兩類酶即β-diox I與β-diox II具有幾個保守基元。至於它們的功能，由該酶形成的阿樸胡蘿蔔素醛擔當視黃酸生物合成的前體(以及其它可能的生理學作用)。因而，與果蠅相反，在脊椎動物中對胡蘿蔔素的兩種(對稱和不對稱)切割途徑都存在，在這裡揭示了胡蘿蔔素代謝的更高複雜性。
在人中，正如普遍知道的，視黃醛(即β-diox I的切割產物)是視覺的決定性因素。同樣清楚的是，決定完整生物體或單個細胞中視黃酸直接前體可利用性的酶對視黃酸信號途徑及由此介導的細胞應答將具有廣泛影響。
類視黃質具有幾種醫學應用，如癌症治療。作為(預防性或治療性)藥物製劑中的活性成份，類視黃質可用於預防和/或治療不同類型的癌症。例如，動物模型顯示類視黃質可調控細胞生長、分化、和凋亡，並在幾種組織(諸如肺、皮膚、乳腺、前列腺、和膀胱)中遏制癌發生。後者還應用於對展示口腔、子宮頸、支氣管上皮、皮膚、及其它組織和器官惡變前或惡性損傷的患者的臨床研究。有些類視黃質在體外甚至對高度惡性細胞顯示抗腫瘤活性，正如通過抑制增殖和誘導分化或凋亡所證明的。治療效果的突出範例是全-反式視黃酸引起前髓細胞白血病細胞分化成粒細胞，全-反式視黃酸目前成功的用於治療這類癌症(Nason-Burchenal和Dmitroysky，在《Retinoids》(類視黃質)中，第301頁，1990；Xu和Lotan，在《Retinoids》(類視黃質)中，第323頁，1999)。
本發明首次提供了參與動物類胡蘿蔔素/類視黃質代謝、催化氧化切割具有維生素A原活性的類胡蘿蔔素的酶的完整分子表徵。本發明的成就，包括編碼這些基因類型的完整核苷酸序列的發現，能夠通過提供依照本發明轉化的植物或其部分來改進營養狀況，尤其是在不發達國家。依照本發明，提供了稱為β-diox II的一類新型酶，它也進行對β-胡蘿蔔素的氧化切割。但是與β-diox I相反，它產生β-阿樸胡蘿蔔素醛即視黃酸的第二種已知前體。因此，本發明提供了特異氧化切割β-胡蘿蔔素並積累視黃酸前體的兩類新型酶。
例如，維生素A缺乏是以穀物為生(諸如以稻米作為主要或幾乎唯一主食)的世界人口部分中導致嚴重臨床症狀的很嚴重健康問題。僅在東南亞，估計每年有500萬兒童形成眼疾乾眼病，其中25萬最終失明。另外，雖然維生素A缺乏不是死亡的終極決定因素，但是它與潛在致命的苦惱諸如腹瀉、呼吸道疾病、和兒童疾病(諸如麻疹)的易感性升高有關聯。依照UNICEF彙編的統計結果，改進維生素原營養每年能夠在1-4歲兒童中防止100-200萬人的死亡，還能防止稍後的孩童時期中25-50萬人的死亡。出於這些原因，非常希望提高主食中的維生素A水平。
在發達國家，維生素缺乏不再形成普遍問題，因為植物食品提供了足夠的維生素A原，而且可以由動物產品直接獲得維生素A。然而，出於預防原因或者在困擾例如再吸收或將維生素原正確切割成維生素A的某些臨床和/或遺傳紊亂或功能失常時，可能希望提供類視黃質作為例如所謂「功能食品」的功能成份。
儘管涉及視黃醇及其類似物的完全化學合成有許多發表物和專利，但仍強烈需要在營養、診斷和藥物/治療應用中具有高度價值的這些物質的生物技術生產。
發明概述本發明提供了轉化細菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細胞、種子、組織、和完整生物體以產生能夠表達不對稱切割β-胡蘿蔔素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段並積累β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮以及阿樸番茄紅素醛(apo1ycopenal)的轉化體的手段和方法。本發明還提供了通過生物技術使用天然或轉化後積累β-胡蘿蔔素或者由培養基攝取β-胡蘿蔔素的細胞、組織、器官、或完整生物體生產類視黃質的手段和方法。本發明還提供了編碼衍生自不同來源和分類群的存活生物體的所述新型β-胡蘿蔔素雙加氧酶且設計適用於進行本發明方法的DNA分子，及包含所述分子的質粒或載體系統。另外，本發明提供了展示改良的營養品質或生理狀況且包含上述DNA分子和/或使用本發明方法生成的轉基因細菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細胞、種子、組織、和完整生物體。另外，本發明提供了展示針對β-diox II多肽的特異免疫反應性且適用於診斷、治療、和篩選目的以及分離並純化所述多肽的抗體。最後，本發明提供了在基因療法領域使用依照本發明的DNA分子的手段和方法。
因而，本發明提供了切割β-胡蘿蔔素的酶在本身不含類視黃質的生物體(諸如植物材料、真菌、和細菌)中的從頭導入和表達，以及修飾現有的類視黃質生物合成以調控某些目的類視黃質的積累。另外，本發明提供了DNA探針和序列信息，使得本領域技術人員能夠由其它來源(諸如本說明書全文中未公開的動物物種)克隆相應基因和/或cDNA。
另外，本發明提供了包含基因產物或其功能活性片段作為活性成份的藥物製劑，以及簡單且合適的診斷測試系統以進一步證明這些分子的功能性。
圖的簡述圖1顯示了動物中類視黃質形成的主要步驟。以粗箭頭強調維生素A形成中的關鍵步驟；只顯示了類視黃質的全-反式異構體。
圖2顯示了生成並積累β-胡蘿蔔素的大腸桿菌(大腸桿菌(+)菌株)中因表達黑腹果蠅β-胡蘿蔔素雙加氧酶而引起的相對於對照(大腸桿菌(-)菌株)由黃色(β-胡蘿蔔素)至幾乎白色(類視黃質)的顏色變化。
圖3給出了在用表達果蠅β-胡蘿蔔素雙加氧酶cDNA的質粒轉化的生成β-胡蘿蔔素的大腸桿菌(大腸桿菌(+)菌株)中形成的類視黃質相對於用載體對照(pBAD-TOPO)轉化的大腸桿菌(-)菌株的HPLC分析和光譜鑑定。刻度條指示360nm吸光度0.01。A.大腸桿菌(+)菌株(上線)和大腸杆茵(-)菌株(下線)的甲醛/氯仿提取物。B.由相應視黃醛異構體產生相應肟(順式和反式)的羥胺/甲醇提取物。在上線中，真實標準物是分開的。在中線中顯示了大腸桿菌(+)菌株提取物的異構組成。在下線中顯示了大腸桿菌(-)菌株提取物的HPLC圖譜。
圖4圖解了由大腸桿菌(+)菌株提取的主要物質相對於真實標準物(點線)的吸收光譜(正己烷)。
圖5展示了β-diox-gex融合蛋白在不同條件下的酶活性。將融合蛋白β-diox-gex在不同條件下在含50mM Tricine/NaOH(pH7.6)和100mM NaCl的緩衝液中保溫。加入5μl β-胡蘿蔔素(80μM，溶於乙醇)開始反應。於30℃保溫2小、時後終止反應並抽提。進行HPLC分析並顯示360nm的HPLC圖譜。刻度條指示360nm吸光度0.005。A.在存在5μMFeSO4和10mM L-抗壞血酸時保溫；B.在不存在FeSO4/抗壞血酸時保溫；C.在存在10mM EDTA時保溫；D.在保溫前將融合蛋白於95℃保溫10分鐘。
圖6描述了來自黑腹果蠅的β-diox II的cDNA序列和推導胺基酸序列。
圖7是vp14(玉米)、RPE65(視網膜色素上皮，牛)、和β-dioxI(果蠅)的推導胺基酸序列的線性比對。以黑色指示同一性，以灰色指示依照PAM250矩陣的保守胺基酸。我們使用目視比對和程序比對。可以在例如β-diox I序列的第549-570位找到高度保守區。迄今為止鑑定的所有β-diox同系物均享有這一共有基元，它是依照本發明的酶的特徵。
圖8圖解了身體不同部分中β-diox I的mRNA水平。通過RT-PCR研究了β-diox mRNA的表達模式。只在頭部可檢測到β-diox mRNA。由衍生自成年果蠅(雌性和雄性)頭、胸、和腹部的總RNA製劑合成cDNA。使用一組跨越內含子的引物研究相同RNA樣品中核糖體蛋白質rp49(FLYBASE編號FBgn0002626)的mRNA水平作為對照。
圖9是哺乳動物β-胡蘿蔔素/類視黃質代謝的示意圖。實心箭頭指示通過對稱切割途徑形成維生素A。可以將形成的視黃醛進一步代謝成視黃醇和視黃酯(貯存物)或者氧化成視黃酸。斷線箭頭指示通過不對稱切割β-胡蘿蔔素而形成β-(8』，10』，12』)-阿樸胡蘿蔔素醛。為了形成視黃酸，必需通過與脂肪酸β-氧化相似的機制縮短β-阿樸胡蘿蔔素醛。
圖10是小鼠中兩類胡蘿蔔素雙加氧酶的推導胺基酸序列的比較。小鼠β-diox I(小鼠-1)與小鼠β-diox II(小鼠-2)的推導胺基酸序列的線性比對。以黑色指示同一性，以灰色指示依照PAM250矩陣的保守胺基酸。以星號標記可能涉及結合輔因子Fe2+的6個保守組氨酸殘基。
圖11顯示了對在β-diox II酶活性體外測試中形成的產物的分析。將表達β-diox II的大腸桿菌粗提物在存在β-胡蘿蔔素時保溫2小時。然後提取形成的化合物並進行HPLC分析。A.甲醛/氯仿提取物；B.羥胺/甲醇提取物。在存在甲醛/氯仿時提取之後，可以檢測到停留4.6分鐘的化合物；而在存在羥胺/氯仿時，它的停留時間變成了16分鐘。C.峰1的UV/VIS光譜；D.峰2的UV/VIS光譜。
圖12顯示了合成並積累β-胡蘿蔔素和番茄紅素的大腸桿菌菌株在分別表達β-diox I或β-diox II之後的顏色。A.積累β-胡蘿蔔素的大腸杆茵對照菌株；B.表達β-diox的積累β-胡蘿蔔素的大腸杆茵菌株；C.表達β-diox II的積累β-胡蘿蔔素的大腸桿菌菌株；D.表達β-diox II的積累番茄紅素的大腸桿菌菌株；E.積累番茄紅素的對照菌株。
圖13顯示了通過HPLC分析對大腸桿菌提取物檢測胡蘿蔔素切割產物。生成β-胡蘿蔔素的大腸桿菌菌株中形成的胡蘿蔔素切割產物的HPLC分析。用羥胺/甲醇法(von Lintig J和Vogt K，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)抽提細茵。A.表達β-diox I的大腸桿菌菌株提取物(上線)相對於對照菌株(下線)。圖中指示了所發現的類視黃質的組成。B.表達β-diox II的大腸桿菌菌株提取物(上線)相對於對照菌株(下線)。能夠檢測到6種物質，並根據它們的UV/VIS光譜分成兩種不同類型的化合物(第1類峰2、5、和6；第2類峰1、3、和4)。C.峰2的UV/VIS光譜作為第1類化合物的代表；D.峰4的UV/VIS光譜作為第2類化合物的代表。
圖14是果蠅(果蠅β-diox I，SEQ ID NO2)、小鼠-2(小家鼠(Mus musculus)，SEQ ID NO17)、人-2(人，SEQ ID NO21)、和斑馬魚-2(Danio rerio，SEQ ID NO19)的推導胺基酸序列的線性比對。以黑色指示同一性。箭頭指示與果蠅β-diox具有假設同源性的區域。可以在例如β-diox序列的第549-570位找到高度保守區。迄今為止鑑定的所有β-diox同系物均享有這一共有基元，它是依照本發明的酶的特徵。
圖15是後生動物多烯鏈雙加氧酶和植物VP14的系統樹計算。系統樹計算基於序列距離法並利用所有後生動物多烯鏈雙加氧酶和植物VP14推導胺基酸序列的鄰接(NJ)算法(Saito N和Nei M，Mol.Biol.Evol.，4406-425，1987)。通過生物體名稱後面的編號1和2來指示兩種不同類型的脊椎動物胡蘿蔔素雙加氧酶。除了本文報導的序列，還使用了如下序列人-1(AAG15380)、小鼠-1(Redmond TM、GentlemanS、Duncan T、Yu S、Wiggert B、Gantt E、和Cunningham FX Jr.，J.Biol.Chem.，在線，2000)、RPE65人(XP001366)、RPE65牛(A47143)、果蠅(von Lintig J和Vogt K，J.Biol.Chem，27511915-11920，2000)、VP14(AAB62181)。
圖16展示了對小鼠不同組織中兩類胡蘿蔔素雙加氧酶穩定狀態mRNA水平的評估。通過RT-PCR分析小鼠多種組織中β-diox I、β-dioxII、和β-肌動蛋白的mRNA水平。將反應產物上樣至TBE-瓊脂糖(1.2％)凝膠以進行分析。用溴化乙啶將凝膠染色並顯示照片。對每份樣品在存在(+)和不存在(-)逆轉錄酶時進行分析以證明PCR產物衍生自mRNA。
發明詳述本發明提供了具有特異切割β-胡蘿蔔素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學活性的分離新型β-胡蘿蔔素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段。依照本發明的一個優選實施方案，根據得自小鼠的序列信息，所述β-dioxII多肽或其功能片段包含選自下組的一種或多種胺基酸序列SEQ IDNO17的第29-47位、第96-118位、第361-368位、和第466-487位胺基酸序列，其中優選第二項和第四項。對這些區域特別是SEQ IDNO17第96-118位和第466-487位所列區域特別感興趣是因為已經證明它們在性質上是高度保守的。因此，本領域技術人員可以容易的設計、合成、並使用衍生自SEQ ID NO16所列DNA序列且包含選自下組的一種或多種核酸序列的相應核酸探針SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位核酸序列，其中優選第二項和第四項，作為合適篩選工具進行表達分析或用於揭示具有上文所述酶活性因而為本發明所涵蓋的這種新型酶的其它成員。顯然，如圖14所述，這同樣適用於本文提供的同源β-diox II序列。例如，所述β-diox II多肽或其功能片段包含例如SEQ ID NO19(斑馬魚)的第55-63位、第112-134位、第378-385位、和第482-503位及SEQ ID NO21(人)的第59-67位、第116-138位、第385-392位、和第490-511位的一種或多種胺基酸序列，其中優選相應的第二項和第四項。因此，如上所述，可以容易的設計、合成、並使用衍生自SEQ ID NO18和/或20所列DNA序列且包含選自下組的一種或多種核酸序列的相應核酸探針SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第378-385位和第482-503位及SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位核酸序列，其中優選相應的第二項和第四項。依照本發明的原理，可以容易的鑑定並使用所有這些β-diox II同系物以及來自還有一些不同來源的其它同系物。
本發明部分基於基本上所有植物、真菌、和細菌本身不含類視黃質的事實。雖然所有植物、有些真菌、和許多細菌能夠合成β-胡蘿蔔素，但是它們通常不具有能夠將β-胡蘿蔔素切割成類視黃質的酶。這些生物體因而可依照本發明用作β-胡蘿蔔素的來源，從而在導入例如編碼II型β-胡蘿蔔素雙加氧酶的cDNA後合成類視黃質。另外，積累香葉基-香葉基-二磷酸(GGPP)但天然或因其它原因缺乏下遊酶而基本上不生成β-胡蘿蔔素的這些生物體也可用於本發明的內容。β-胡蘿蔔素的合成需要八氫番茄紅素合酶(psy)，它參與包含兩步反應的第一個類胡蘿蔔素特異反應，導致兩分子GGPP頭頭縮合而形成第一種尚無顏色的胡蘿蔔素產物八氫番茄紅素。另外，進一步的酶促途徑必需另外三種植物酶的互補各自催化導入兩個雙鍵的八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)和ζ-胡蘿蔔素去飽和酶(ZDS)，以及番茄紅素β-環化酶。為了減少轉化工作，可以在本發明的-個優選實施方案中使用能夠導入完全去飽和序列所需要的所有四個雙鍵並將八氫番茄紅素直接轉變成番茄紅素的細菌胡蘿蔔素去飽和酶，諸如衍生自歐文氏茵的CrtI(參閱Xudong Ye等人，「Engineering the Proyitamin A(β-Carotene)Biosynthetic Pathway into(Carotenoid-Free)RiceEndosperm」(將維生素A原(β-胡蘿蔔素)生物合成途徑導入(不含類胡蘿蔔素的)稻胚乳)，Science，287303-305，2000)。例如，可以將能夠優選表達植物八氫番茄紅素合酶(psy)(GenBank編號X78814)和細菌八氫番茄紅素去飽和酶(crtI)(GenBank編號D90087)二者的載體用於指導在例如通常基本上不含類胡蘿蔔素的質體中形成番茄紅素。另外，可以容易的設計能夠表達番茄紅素β-環化酶(GenBank編號X98796)的第二種載體並用於共轉化。然而，正如轉化實驗可以證明的，導入編碼所述番茄紅素β-環化酶的核酸序列可能並不是必不可少的，因為使用包含psy和crtI聯合表達盒的一次轉化產生的轉化體顯示積累β-胡蘿蔔素以及黃體素和玉米黃質。為了使該途徑進行至形成類視黃質諸如視黃酸或維生素A及其衍生物，可以單獨導入編碼依照本發明的多肽或其功能片段的核酸序列，或者聯合任何上述其它酶一起導入。因而，本發明能夠在依照本發明適當選擇的指定宿主中完全導入或補足類胡蘿蔔素/類視黃質途徑。
說明書全文中用於區分某些靶細胞或組織的術語「包含類胡蘿蔔素」或「基本上不含類胡蘿蔔素」指未依照本發明轉化的相應植物或其它材料已知通常基本上不含類胡蘿蔔素，如貯存器官(諸如稻胚乳等)也是如此。不合類胡蘿蔔素並不排除那些以幾乎檢測不到的量積累類胡蘿蔔素的細胞或組織。優選的是，該術語應當定義為具有類胡蘿蔔素含量0.001％w/w或更低的質體包含物質。
關於選擇合適來源用於生成切割類胡蘿蔔素的酶，應當理解，除了本文公開的來自果蠅的β-diox I及來自人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、和斑馬魚(Danio rerio)的β-diox II序列，本領域技術人員通過例如常規篩選可以容易的找到、分離、並使用所有功能等同DNA分子及其片段，諸如關於SEQ ID NO1、16、18、和/或20所列序列的等位基因變體、同系、或合成修飾(人為的)的序列，來自現有生物體、編碼展示相同期望活性即將β-胡蘿蔔素不對稱切割成類視黃質的酶或其功能片段的序列，和與黑腹果蠅(SEQ ID NO1)、小家鼠(SEQ ID NO16)、Danio rerio(SEQ ID NO18)、和/或人(SEQ ID NO20)的部分或完整序列基本上同源的序列，例如用於保證具有期望生物學或酶活性即特異切割β-胡蘿蔔素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的β-diox II多肽或其功能片段的表達，或用於測定所述多肽或其功能片段的特徵性核酸的存在。例如，通過使用黑腹果蠅(SEQ ID NO1)的序列信息，可以通過本領域知道的且下文進一步詳細描述的常規篩選流程鑑定來自人(SEQ ID NO20)、Danio rerio(SEQ ID NO18)、和小家鼠(SEQ ID NO16)的脊椎動物β-diox II同系物，它們也為本發明所涵蓋。
因而，這些DNA序列優選選自下組(1)SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18和/或SEQ ID NO20中所列DNA序列或其互補鏈；和(2)SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位DNA序列或其互補鏈；和(3)SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第1160-1183位、和第1472-1537位DNA序列或其互補鏈；和(4)SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位DNA序列或其互補鏈；和(5)在高嚴謹度條件下與(1)、(2)、(3)、和(4)中所定義的DNA序列或其互補鏈發生雜交的DNA序列或其功能片段；和(6)若非遺傳密碼的簡併性將與(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定義的DNA序列發生雜交的DNA序列。
雜交嚴謹度指核酸雜合體表現穩定的條件。這些條件對於本領域普通技術人員而言是顯然的。正如本領域技術人員所知道的，雜合體的穩定性由雜合體的解鏈溫度(Tm)反映，序列同源性每降低1％，解鏈溫度降低大約1-1.5℃。雜合體的穩定性通常是鈉離子濃度和溫度的函數。通常在較高嚴謹條件下進行雜交反應，隨後是不同嚴謹度的清洗。
在用於本文時，高嚴謹度指只允許在1M Na+中、於65-68℃形成穩定雜合體的那些核酸序列發生雜交的條件。可以通過例如含6x SSC、5x Denhardt氏液、1％SDS(十二烷基磺酸鈉)、0.1M焦磷酸鈉、和0.1mg/ml變性鮭魚精DNA(作為非特異競爭劑)的水溶液中的雜交來提供高嚴謹條件。雜交後，可以在幾個步驟中進行高嚴謹度的清洗，最後一次清洗(大約30分鐘)是於雜交溫度下、在0.2-0.1x SSC、0.1％SDS中進行的。
中嚴謹度指相當於在上述溶液中、但於大約60-62℃雜交的條件。在這種情況中，最後一次清洗是於雜交溫度下、在1x SSC、0.1％SDS中進行的。
低嚴謹度指相當於在上述溶液中、但於大約50-52℃雜交的條件。在這種情況中，最後一次清洗是於雜交溫度、在2x SSC、0.1％SDS中進行的。
應當理解，可以使用多種緩衝液(如基於甲醛的緩衝液)和溫度來修改和重複這些條件。Denhardt氏液和SSC對於本領域技術人員而言是眾所周知的，其它合適雜交緩衝液也如此(參閱例如Sambrook等人，《Molecular Cloning》(分子克隆)，冷泉港實驗室出版社，1989；或Ausubel等人編的《Current Protocols in Molecular Biology》(分子生物學通用方案)，John Wiley ＆ Sons公司，1990)。必須憑經驗確定最佳雜交條件，因為探針的長度和GC含量也有一定影響。
在本文中應當提到，術語與β-diox II編碼DNA序列「基本上同源的DNA序列」指編碼與SEQ ID NO17、19、和21中分別所列的小家鼠、Danio rerio、和/或人β-diox II胺基酸序列至少45％、優選至少60％、更優選至少75％、最優選至少90％同一的胺基酸序列的DNA序列，和代表具有特異切割β-胡蘿蔔素而形成β-阿樸胡蘿蔔素醛的生物學活性和/或具有特異結合針對本發明多肽或其功能片段所製備的抗體的能力的多肽或其功能片段的DNA序列。
依照一個優選實施方案，這些DNA序列是cDNA、基因組、或人造(合成)DNA序列的形式，而且可以如本領域所知道的(參閱例如Sambrook等人，同上)或下文具體所述進行製備。
通過本文提供的指導，可以依照本領域眾所周知的方法獲得本發明的核酸。例如，可以通過化學合成、使用聚合酶鏈式反應(PCR)、或者通過篩選由認定具有β-diox II或以可檢測水平表達β-diox II的來源構建的基因組文庫或合適cDNA文庫而獲得本發明的DNA。
用於合成目的核酸的化學法在本領域是知道的，包括三酯、亞磷酸酯、亞磷醯胺、和H-磷酸酯方法，PCR和其它自身引物法，以及固相支持物上的寡核苷酸合成。若知道核酸的完整序列，或者可以獲得與編碼鏈互補的核酸序列，則可以使用這些方法。或者，若知道目標胺基酸序列，則可以使用每種胺基酸殘基的已知和優選編碼殘基來推斷可能的核酸序列。
用於分離β-diox II編碼基因的其它方法是如(Sambrook等人，第14章，1989)所述使用PCR技術。該方法需要使用能夠與β-diox II核酸發生雜交的寡核苷酸探針。下文描述了選擇寡核苷酸的策略。
用設計用於鑑定目的基因或其編碼的蛋白質的探針或分析工具篩選文庫。對於cDNA表達文庫，合適方法包括識別並特異結合β-diox II的單克隆或多克隆抗體；長度為大約20-80個鹼基、編碼來自相同或不同物種的已知或可疑β-diox II cDNA的寡核苷酸；和/或編碼相同或雜交基因的互補或同源cDNA或其片段。適用於篩選基因組DNA文庫的探針包括但不限於寡核苷酸、編碼相同或雜交DNA的cDNA或其片段、和/或同源基因組DNA或其片段。
可以通過在合適雜交條件下用探針即本文公開或提及的核酸(包括可衍生自SEQ ID NO1、16、18、和/或20中所列序列的寡核苷酸)篩選合適cDNA或基因組文庫來分離編碼β-diox II的核酸。合適文庫可以由商業途徑獲得，或者可以由例如細胞系、組織樣品、等等製備。
在用於本文時，探針指例如所具有的核苷酸序列所包含的10-50、優選15-30、最優選至少20個連續鹼基與例如SEQ ID NO1、16、18、和/或20中所列的等同或更多數目的連續鹼基相同(或互補)的單鏈DNA或RNA。選擇作為探針的核酸序列的長度和確定性應足以將假陽性結果降至最小。核苷酸序列可以基於上文所述β-diox II中保守或高度同源的核苷酸序列或區域。用作探針的核酸在一個或多個位置可以是簡併的。在不知道所篩選文庫的來源物種的偏愛密碼子用法時，簡併寡核苷酸的使用可能是特別重要的。
用於構建探針的優選區域包括5』和/或3』編碼序列、預測編碼配體結合位點的序列、等等。例如，本文公開的全長cDNA克隆或其片段可用作探針。優選的是，用雜交後易於檢測的合適標記物手段標記本發明的核酸探針。例如合適標記物手段是放射性標記物。標記DNA片段的優選方法是在隨機引發反應中用DNA聚合酶的Klenow片段摻入α32PdATP，正如本領域眾所周知的。通常用γ32P標記的ATP和多核苷酸激酶末端標記寡核苷酸。然而，也可以使用其它方法(如非放射性)來標記寡核苷酸或片段，包括例如酶標記、合適螢光團的螢光標記、和生物素化。
例如用包含基本上完整β-diox II編碼序列的DNA一部分或基於所述或等同DNA一部分的合適寡核苷酸篩選文庫之後，通過檢測雜交信號來鑑定陽性克隆；通過限制酶作圖和/或DNA序列分析來表徵所鑑定的克隆；然後通過例如與本文所列序列的比較來進行檢驗，以確定它們是否包含編碼完整β-diox II的DNA序列(即它們是否包含轉錄起始和終止密碼子)。若所選擇克隆是不完整的，則可將它們用於再次篩選相同或不同文庫以獲得交疊克隆。若文庫是基因組文庫，則交疊克隆可能包含外顯子和內含子。若文庫是cDNA文庫，則交疊克隆將包含開放讀碼框。在這兩種情況中，可以通過與本文提供的DNA和推導胺基酸序列的比較來鑑定完整克隆。
為了檢測內源β-diox II的任何異常，可以使用本發明的核苷酸序列作為雜交探針進行遺傳篩選。同樣，根據本文提供的核酸序列，可以設計反義或核酶型治療劑。
設想可以通過核苷酸替代、核苷酸刪除、核苷酸插入、或核苷酸片段的倒置及其任意聯合而容易的修飾本發明的核酸。這些突變體可用於例如生成具有與自然界中發現的β-diox II序列不同的胺基酸序列的β-diox II突變體。誘變可以是預先確定的(位點特異的)或隨機的。非沉默突變的突變不應改變序列的讀碼框，而且優選不產生可發生雜交而形成二級mRNA結構(諸如環或髮夾)的互補區。
另外，本發明設想並能夠使用本文提供的序列數據進行親緣和功能基因組研究。親緣研究被作為測序和作圖的輔助活動進行，並設計用於提供關於生物學功能(包括例如同源性搜索、二級結構關聯、差異cDNA篩選、表達克隆、遺傳連鎖分析、定位克隆、和誘變分析)的有趣且可能重要的線索。與親緣研究相反，功能研究通常使用細胞或動物來試圖了解序列與生物學功能的更直接關聯，包括例如篩選諸如酵母、果蠅、線粒體、人組織、小鼠、和蛙等系統中的表型變化，使用旨在控制基因表達或蛋白質作用的基因「敲除」或其它方法以提供將序列與功能相聯繫的有用信息。這些技術在本領域是眾所周知的。
上述方法的使用應當優選達到一條或多條如下標準(1)對基因序列的抑制應當具有序列特異性，從而基本上消除假陽性結果；(2)應當具有廣泛的應用性，即它應當有可能對高豐度和低豐度兩類基因，以及產物是胞內、膜結合、或胞外的序列有效；(3)應當可應用於預測目的(人)狀況的模型；(4)應當能夠進行劑量-應答研究以測定目標最受影響的劑量；(5)目標確認研究所需要的信息量應當優選最小的，即該技術能夠直接研究EST，而無需獲得全長基因序列、啟動子和其它調控信息、或蛋白質序列/結構的前提條件；(6)應當可用於高通量模式。
因此，本發明提供了應用上述所有方法和技術(包括「敲除」、胞內抗體、aptamer、反義寡核苷酸、和核酶)的足夠指導。在本發明的一個優選實施方案中，衍生自任何上述β-diox II序列(諸如SEQ IDNO1、16、18和/或20中所列序列)的β-diox II特異反義寡核苷酸可用於生物體發育任何階段的類視黃質/維生素A缺陷相關模型中的劑量-應答研究。在另-個優選實施方案中，使用特別設計的核酶，以通過操作其作用機制固有的元件來進行優化後的序列特異抑制。例如，可以設計只結合它們的靶的核酶，並且通過選擇15個核苷酸(完全屬於典型ESR的信息限制之內)的靶序列，在統計學上確保靶序列在基因組中將只出現一次。因此，本發明一般性地提供了特別設計的核酶，只與它的靶(預計在基因組中只出現一次)相互作用，高度確保只抑制特定靶。更具體的說，本發明提供了獨特裝備的核酶，以進行能夠證實特定mRNA靶的抑制是由β-diox II介導的狀況或表型的改變的真實起因的幾類重要控制。例如，已知將核酶的催化核心突變使之不能夠進行切割但就高度特異結合它的靶而言仍發揮功能。這些「滅活」的核酶相對於有活性的核酶不產生或只產生基本上降低的靶向抑制-使之成為很有效的陰性對照。或者，可以使催化核心維持活性形式，但是修飾靶向臂，使得它們不再結合靶序列。若發生非特異切割，則這種構建物應當顯示活性。既然核酶包含不連續的結合臂，那麼核酶兩個結合臂將分開結合，並在維持特異性的同時為核酶增加選擇性。由於這種不連續結合臂的結合強度相對低於例如連續反義結合，所以核酶與靶序列之間的任何錯配預計不能有效結合，從而使靶在切割前就脫落。
對於上文例示的方法和技術，可以使用完整序列及其(功能性)片段，特別是上文所述片段。
如果需要，可以依照確立流程使用衍生自β-diox II的探針由細胞或組織克隆編碼β-diox相關蛋白質或多肽的核酸。具體而言，可以如下製備這些DNA1)由合適細胞或組織分離mRNA，例如通過DNA探針的雜交或者通過在合適表達系統中的表達和期望多肽表達的篩選來選擇期望mRNA，製備與mRNA互補的單鏈cDNA並由此製備雙鏈cDNA，或2)例如使用DNA探針或者使用合適表達系統並篩選期望多肽的表達，由cDNA文庫分離cDNA並篩選期望cDNA，或3)將步驟1)或2)的雙鏈DNA摻入合適表達載體，4)用載體轉化合適宿主細胞並分離期望DNA。
通過已知方法分離聚腺苷酸化mRNA(步驟1)。分離方法包括例如在存在去汙劑和核糖核酸酶抑制劑(例如肝素、異硫氰酸胍、或巰基乙醇)時將細胞勻漿，用氯仿/酚混合液抽提mRNA(任選存在鹽和緩衝液、去汙劑、和/或陽離子螯合劑)，並用乙醇、異丙醇、等由剩餘含鹽水相沉澱mRNA。通過氯化銫梯度離心及隨後的乙醇沉澱和/或層析法(例如親和層析，例如寡(dT)纖維素或寡(U)sepharose層析)，將分離的mRNA進一步純化。優選的是，通過梯度(例如線性蔗糖梯度)離心或合適大小分級分離柱(例如瓊脂糖凝膠)的層析將這些純化的mRNA依照大小分開。
通過用DNA探針直接篩選mRNA或者通過在合適細胞或無細胞系統中翻譯並篩選獲得的多肽來選擇期望mRNA。優選使用DNA雜交探針來實現期望mRNA的選擇，由此避免翻譯的額外步驟。合適DNA探針是核苷酸序列已知、由編碼β-diox II或相關蛋白質的DNA衍生的至少17個核苷酸組成的DNA。或者，可以使用EST序列信息來生成合適DNA探針。
合成DNA探針是依照下文詳述的已知方法合成的，優選使用固相磷酸三酯、亞磷酸三酯、或亞磷醯胺方法的逐步縮合，例如通過磷酸三酯法縮合二核苷酸偶聯單位。如(Ike Y等人，Nucleic Acids Research，11477，1983)所述，通過在適當縮合步驟中使用受保護形式的兩種、三種、或四種核苷酸dA、dC、dG、和/或dT的混合物或相應二核苷酸偶聯單位，使這些方法適用於合成期望寡核苷酸的混合物。
為了雜交，標記DNA探針，例如通過眾所周知的激酶反應進行放射性標記。依照已知流程進行大小分離後的mRNA與含標記物的DNA探針的雜交，即在含添加劑(例如鈣螯合劑、粘度調節化合物、蛋白質、無關DNA、等)的緩衝液和鹽溶液中、於有利於選擇性雜交的溫度(例如0-80℃，例如25-50℃或65℃左右，優選比雜交雙鏈DNA解鏈溫度低20℃左右)進行雜交。
可以在細胞(例如蛙卵母細胞)或無細胞系統(例如網織紅細胞裂解物或麥胚提取物)中翻譯分級分離後的mRNA。對獲得的多肽篩選β-diox II活性或與針對β-diox II或其相關蛋白質製備的抗體的反應(例如在免疫測定法中，例如放射性免疫測定法、酶免疫測定法、或螢光標記物免疫測定法)。這些免疫測定法及多克隆和單克隆抗體的製備在本領域是眾所周知的並相應應用。依照本發明，提供了多克隆抗體。
由選擇的mRNA模板製備單鏈cDNA在本領域是眾所周知的，由單鏈DNA製備雙鏈DNA也一樣。將mRNA模板與脫氧核苷三磷酸(任選放射性標記的脫氧核苷三磷酸，從而能夠篩選反應結果)、引物序列(諸如能夠與mRNA的聚(A)尾發生雜交的寡dT殘基)、和合適酶(諸如逆轉錄酶，例如來自鳥類成髓細胞性白血病病毒(AMV))的混合液一起保溫。例如通過鹼性水解降解模板mRNA之後，將cDNA與脫氧核苷三磷酸和合適酶的混合液一起保溫，以產生雙鏈DNA。合適的酶是例如逆轉錄酶、大腸杆茵DNA聚合酶I的Klenow片段、或T4 DNA聚合酶。通常，由單鏈cDNA自發形成的髮夾環結構作為合成第二條鏈的引物。通過S1核酸酶的消化除去該髮夾結構。或者，在水解mRNA模板之前首先通過均聚脫氧核苷酸尾延伸單鏈DNA的3』端，隨後合成第二條cDNA鏈。
或者，由cDNA文庫分離雙鏈DNA並篩選期望cDNA(步驟2)。cDNA文庫是如下構建的如上所述由合適細胞(例如雞胚細胞、人單核白細胞、或人胚肺上皮細胞)分離mRNA並由此製備單鏈和雙鏈cDNA。遵循確立流程用合適限制性內切核酸酶消化該cDNA並摻入λ噬茵體(例如λcharon4A或λgt11)。如上所述使用DNA探針篩選複製在硝酸纖維素膜上的cDNA文庫，或者在合適表達系統中進行表達並對獲得的多肽篩選與針對期望β-diox II的特異抗體的反應。
本領域知道多種方法可以將雙鏈DNA摻入適當載體(步驟3)。例如，可以通過在存在相應脫氧核苷三磷酸和酶(諸如末端脫氧核苷酸轉移酶)時的保溫而向雙鏈DNA和載體DNA添加互補均聚物。然後通過互補均聚尾之間的鹼基配對將載體和雙鏈DNA連接到一起，最後通過特定連接酶(諸如連接酶)進行連接。其它可能性是向雙鏈DNA的末端添加合成接頭，或者通過平端或粘端連接將雙鏈DNA摻入載體。
用獲得的雜合載體轉化適當宿主細胞(步驟4)和選擇轉化的宿主細胞(步驟5)在本領域是眾所周知的。雜合載體和宿主細胞可能特別適用於生成DNA或生成期望的β-diox II。
除了可用於生成重組β-diox II蛋白質，這些核酸還可用作探針，從而使本領域技術人員易於鑑定和/或分離編碼β-diox II的核酸。核酸可以是未標記的，或者已用可檢測模塊標記。另外，依照本發明的核酸可用於例如測定β-diox II特異核酸的存在甚至數量的方法，所述方法包括將β-diox II的編碼(或互補)DNA(或RNA)與待測樣品核酸進行雜交，並測定β-diox II的存在和(任選的)數量。另一方面，本發明提供了與編碼β-diox II的核酸序列互補或在嚴謹條件下發生雜交的核酸序列。這些寡核苷酸可有效用於反義和/或核酶方法，包括基因療法。
本發明還提供了用於擴增核酸待測樣品的方法，包括用β-dioxII的編碼(或互補)核酸(DNA或RNA)引發核酸聚合酶(鏈式)反應。
因此，本發明的DNA序列可作為標準，確定用於由其它來源克隆基本上同源的DNA序列的新PCR引物。另外，可以通過本領域知道的、例如Sambrook等人(同上)描述的方法將它們和這些同源DNA序列整合到載體中，從而在適當宿主系統中表達或過度表達編碼的多肽。然而，本領域技術人員知道，DNA序列自身也可用於轉化本發明的合適宿主系統以獲得所編碼多肽的過度表達。
如上所述，本發明由此提供了特異DNA分子，以及包含所述DNA分子的質粒或載體系統，它們在可操作表達盒內包含能夠指導在功能上有活性(即指導由β-胡蘿蔔素生成類視黃質)的β-胡蘿蔔素雙加氧酶II生成的DNA序列。優選的是，所述DNA分子還包含至少一種選擇標記基因或cDNA，它可操作連接允許其在細菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、或植物細胞、種子、組織、或完整生物體中表達的組成性、誘導性、或組織特異性啟動子序列。若選擇含質體材料進行轉化，則優選將編碼核苷酸序列融合合適質體運輸肽編碼序列，二者都優選在組織特異性或組成性啟動子的控制下表達。
依照本發明的多肽包括β-diox II及其衍生物，所述衍生物保留了β-diox II的至少一種共有結構決定簇。
「共有結構決定簇」指研究的衍生物具有β-diox II的至少一種結構特徵。結構特徵包括具有能夠與針對天然發生的或變性的β-dioxII多肽或其片段製備的抗體發生交叉反應的表位或抗原性位點、具有與β-diox II的胺基酸序列同一性、和具有共有的結構/功能關聯。因而，由本發明提供的β-diox II包括由初級轉錄本的其它剪接產生的mRNA編碼的剪接變體、胺基酸突變體、糖基化變體、和保留了β-dioxII的生理學和/或物理學特性的其它β-diox II共價衍生物。例示性衍生物包括通過替代、化學、酶促、或其它適當手段用非天然發生胺基酸的模塊共價修飾本發明蛋白質獲得的分子。這種模塊可以是可檢測模塊，諸如酶或放射性同位素。還包括由特定物種(優選哺乳動物)發現的β-diox II天然發生變體或同系物。這種變體或同系物可能是由相同基因家族的相關基因、特定基因的等位基因變體編碼的，或者代表β-diox II基因的其它方式剪接的變體。
保留共有結構特徵的衍生物可以是β-diox II的片段。β-diox II的片段包括它的單個結構域，以及衍生自結構域的更小多肽。優選的是，衍生自依照本發明的β-diox II的更小多肽確定了β-diox II的一個特徵性特徵即可。在理論上，片段可以是幾乎任何大小，只要它們保留β-diox II的一個特徵即可。優選的是，片段的長度是5-200個胺基酸。將較長的片段看作全長β-diox II的截短型，通常為術語「β-diox II」所涵蓋。β-diox II多肽的例示性片段分別是SEQ ID NO17的第39-47位、第96-118位、第361-368位、和第466-487位，SEQID NO19的第55-63位、第112-134位、第378-385位、和第482-503位，SEQ ID NO21的第59-67位、第116-138位、第385-392位、和第490-511位胺基酸序列。
β-diox II的衍生物還包括它們的突變體，可以包含胺基酸刪除、添加、或替代，只要滿足維持β-diox II的至少一個特徵性特徵的要求即可。因而，可以進行保守胺基酸替代而基本上不改變β-diox II的本性，5』或3』端截短的形式也一樣。此外，可以對本發明所包括的β-diox II片段進行刪除和替代。可以由編碼β-diox II的DNA生成β-diox II突變體，即對所述DNA進行體外誘變，導致例如一個或多個胺基酸的添加、交換、和/或刪除。例如，可以通過重組方法製備β-dioxII的替代、刪除、或插入變體，並篩選與天然形式β-diox II的免疫交叉反應性。
本發明還提供了β-diox II多肽及其衍生物，所述衍生物保留了β-diox II的至少一種共有抗原決定簇。
「共有抗原性決定簇」指研究的衍生物具有β-diox II的至少一種抗原性功能。抗原性功能包括具有能夠與針對天然發生的或變性的β-diox II多肽或其片段製備的抗體發生交叉反應的表位或抗原性位點。
保留共有抗原性決定簇的衍生物可以是β-diox II的片段。β-diox II的片段包括它的單個結構域，以及衍生自結構域的更小多肽。優選的是，衍生自依照本發明的β-diox II的更小多肽確定了β-dioxII的一個特徵性表位。在理論上，片段可以是幾乎任何大小，只要它們保留β-diox II的一個特徵即可。優選的是，片段的長度是5-500個胺基酸。將較長的片段看作全長β-diox II的截短型，通常為術語「β-diox II」所涵蓋。
本發明提供了用於生產β-diox II多肽的方法，包括(1)在合適宿主中表達由上文所述DNA編碼的多肽，並(2)依照本領域眾所周知的常規技術分離所述β-diox II多肽。另外，提供了通過上述過程獲得或可獲得的蛋白質。
優選的是，本發明的蛋白質或其衍生物是以分離形式提供的。「分離的」指蛋白質或其衍生物經鑑定不含其天然環境中的一種或多種成份。分離的β-diox II包括重組細胞培養物中的β-diox II。表達重組β-diox II基因的生物體中存在的β-diox II，無論β-diox II蛋白質是分離的」或其它形式的，都包括於本發明的範圍之內。
如果需要，在任何所述系統(細菌、真菌、植物、動物、等)中形成的類視黃質(諸如β-阿樸胡蘿蔔素醛、β-芷香酮、和阿樸番茄紅素醛)可以進一步代謝成視黃醇、視黃酯、視黃酸、及其相應立體異構體。那些修飾可用於改進切割反應的效率和/或積累期望的類視黃質。特定類視黃質的積累可能是有用的，因為類視黃質根據其氧化狀態(醇、醛、和酸)和立體異構形式而發揮不同生物學功能，例如視黃醛/視黃醇在視覺中的功能，視黃酸在發育過程和分化中的功能，而視黃酯是動物體內維生素A的正常貯存物。可以通過類視黃質修飾酶與β-diox II的共表達來實現期望類視黃質衍生物的積累。通過那些功能聯合，例如可以在作為飼料、食品、和/或飼料和食品添加劑的植物和/或細菌中實現視黃酯的積累，或者可以實現特定類視黃質(例如9-順式視黃酸，即RXR轉錄因子的配體)的生物合成。另外，動物起源的類視黃質結合蛋白的共表達可以改進期望類視黃質的產量。
依照本發明的一個優選實施方案，將下列酶或酶組合與β-dioxII一起共表達。例如，若希望將視黃醛轉變成視黃醇，可以使用醇脫氫酶(如AF059256)和/或視黃醛脫氫酶/還原酶(如AW211228)。在意欲由視黃醇生成視黃酯的情況中，可以使用視黃醇醯基轉移酶(如AF071510)。若應當由視黃醛生成視黃酸，則將選擇視黃醛氧化酶(如AB017482)。另外，若希望共表達類視黃質結合蛋白，則可設想選擇視黃醇結合蛋白(如AJ236884)。最後，可以共表達將上述化合物的全-反式結構轉變成13-順式、11-順式、9-順式、或-順式異構體的不同異構酶。
依照本發明，提供了轉化植物細胞、種子、組織、或完整植株以及用於轉化微生物(諸如酵母、真菌、和細菌)以生成能夠介導類視黃質合成的轉化體的手段和方法。依照本發明的另一方面，所述方法還可用於修飾動物中的類視黃質代謝。
選擇用於轉化的宿主材料應當表達導入的基因，而且它們的表達優選是純合的。通常，基因將可操作連接在特定植物、昆蟲、動物、或微生物(諸如包括酵母在內的真菌和細菌)的靶向宿主細胞中在功能上有活性的啟動子。其表達水平應當足以獲得期望來自該基因的特徵。例如，選擇標記基因的表達應當提供對依照本發明方法產生的轉化體的適當選擇。相似的，展示將β-胡蘿蔔素切割成類胡蘿蔔素/類視黃質的期望活性、用於增強營養品質的酶的編碼基因的表達應當導致轉化體相對於未進行本發明轉化方法的相同物種具有相對較高含量的所編碼基因產物。另一方面，通常希望限制目的基因的過度表達以避免顯著不利的影響植物、昆蟲、真菌、動物、或微生物的正常生理，即其表達程度不至於使得它們的培養變得困難。
可以在用於在轉化的原核或真核宿主細胞、種子、組織、或完整生物體中表達的表達盒中使用編碼β-胡蘿蔔素雙加氧酶的基因。為了實現本發明的目的，即在目的靶宿主中導入切割β-胡蘿蔔素而形成類視黃質的能力，優選使用包含轉錄起始區(與編碼β-胡蘿蔔素雙加氧酶II的基因相連)的可操作表達盒進行轉化。
轉錄起始區對宿主而言可以是天然或類似的，或者是外源或異源的。外源指在轉錄起始區所導入的野生型宿主中未曾發現有該轉錄起始區。
在植物材料中，對與貯存蛋白(諸如谷蛋白、patatin、napin、cruciferin、β-conglycinin、菜豆蛋白、等)有關的那些轉錄起始區特別感興趣。
轉錄盒將包含(以轉錄的5』-3』方向)轉錄和翻譯起始區、編碼β-胡蘿蔔素雙加氧酶II或其功能片段(保留其特異的酶促、免疫原性、或生物學活性)的DNA序列、及在靶向宿主材料(諸如植物或微生物)中有功能的轉錄和翻譯終止區。終止區可以是相對於轉錄起始區是天然的，可以是相對於目的DNA序列是天然的，或者可以衍生自其它來源。可以由根癌土壤桿菌的Ti質粒獲得適用於植物材料的合適終止區，諸如章魚鹼合酶和胭脂鹼合酶終止區(參閱Guerineau等人，Mol.Gen.Genet.，262141-144，1991；Proudfeot，Cell，64671-674，1991；Sanfacon等人，Genes Dev.，5141-149，1991；Mogen等人，Plant Cell，21261-1272，1990；Munroe等人，Gene，91151-158，1990；Ballas等人，Nucl.Acids Res.，177891-7903，1989；Joshi等人，Nucl.Acids Res.，159627-9639，1987)。
為了在植物或含質體材料中表達β-胡蘿蔔素雙加氧酶II，優選將編碼序列融合編碼運輸肽的序列，它在表達和翻譯後指導將切除運輸肽的蛋白質轉運至發生類胡蘿蔔素生物合成的(植物)質體，諸如葉綠體。例如，可以在翻譯水平將β-diox II cDNA融合編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(核糖體二磷酸羧化酶-加氧酶)小亞基運輸肽的序列或編碼其它質體蛋白運輸肽的序列。這些運輸肽在本領域是知道的(參閱例如Von Heijne等人，Plant Mol.Biol.Rep.，9104-126，1991；Clark等人，J.Biol.Chem.，26417544-17550，1989；Della-Cioppa等人，Plant Physiol.，84965-968，1987；Romer等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.，1961414-1421，1993；和Shah等人，Science，233478-481，1986)。可用於進行本發明的任何基因可以利用天然或異源運輸肽。
構建物還可包含任何其它必需調節基因，諸如植物翻譯共有序列(Joshi，1987，同上)、內含子(Luehrsen和Walbot，Mol.Gen.Genet.，22581-93，1991)、等，它們可操作連接編碼β-胡蘿蔔素雙加氧酶II的核苷酸序列。希望導入的編碼基因內的內含子序列可以通過穩定轉錄本並使之有效轉運至細胞核外而提高表達水平。在已知的這些內含子序列中包括植物遍在蛋白基因的內含子(Cornejo，Plant Mol.Biol.，23567-581，1993)。另外，已經觀察到將相同構建物插入基因組的不同基因座可以改變植物中的表達水平。據認為這種影響部分由於基因在染色體上的位置所致，即不同隔離群將具有不同的表達水平(參閱例如Hoever等人，Transgenic Res.，3159-166，1994)。可用於構建表達盒的其它調控DNA序列包括例如能夠調控(誘導或遏制)相連DNA序列在植物組織中的轉錄的序列。
已知例如某些植物基因受到多種內部或外部因素的誘導，諸如植物激素、熱休克、化學藥品、病原體、缺氧、光、應激、等。
另一組可被調控的DNA序列包括存在於菸草PR(發病相關)蛋白基因中且由化學調節劑(諸如EP-A 0 332 104中所述)方式誘導的化學驅動序列。
在植物、動物、昆蟲、真菌、或微生物中表達外源基因的另一個考慮事項是轉基因基因組的穩定水平，即外源基因由群體分離的趨向。若將選擇標記與目的基因或表達盒連接，則可以施加選擇以維持轉基因宿主生物體或其部分。
在表達盒構建物中包含5』前導序列可能是有利的。這些前導序列可以增強翻譯。翻譯前導序列在本領域是知道的，包括微小RNA病毒前導序列，例如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5』非編碼區；Elroy-Stein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866126-6130，1989)；馬鈴薯Y病毒組，例如TEV前導序列(菸草蝕刻病毒；Allisson等人，Virology，1549-20，1986)；人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP；Macejak和Sarnow，Nature，35390-94，1991)；來自苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMV RNA 4；Jobling和Gehrke，Nature，325622-625，1987)；菸草花葉病毒前導序列(TMV；Gallie等人，Molecular Biology of RNA，237-256，1989)；和玉米褪綠斑駁病毒前導序列(MCMV；Lommel等人，Virology，81382-385，1991；Della-Cioppa等人，1987，同上)。
根據在哪裡表達編碼β-胡蘿蔔素雙加氧酶II的DNA序列，可能希望合成具有宿主偏愛密碼子或者葉綠體或質體偏愛密碼子的序列。可以由具體目的植物物種中最大表達量的蛋白質中的最高頻率密碼子確定植物偏愛密碼子(參閱EP-A 0 359 472；EP-A 0 386 962；W0 91/16432；Perlak等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88324-3328，1991；和Murray等人，Nucl.Acids Res.，17477-498，1989)。這樣，可以優化核苷酸序列用於在任何靶向宿主中表達。應當認識到，可以優化或合成基因序列的所有或任何部分。即也可以使用合成或部分優化的序列。關於葉綠體偏愛基因的構建，參閱USPN 5,545,817。
編碼β-diox II的表達系統可用於研究β-diox II活性，特別是在轉基因細胞、組織、或動物中。優選已經削弱了β-diox II表達的系統，特別是通過轉座子插入手段來實現這種削弱的系統。依照本發明的突變細胞、組織、或動物其β-diox II表達受損。尤其是那些表達嚴重削弱但不受限制的表達突變體可用於研究β-diox II活性。它們顯示對推定上遊信號劑與β-diox II特定靶結構域的受調相互作用以及對預測介導其生物學應答的下遊靶的修飾的敏感性增加。因此，本發明還提供了用於評估試劑靶向β-diox II活性的能力的方法，包括將本文所述β-diox II突變體暴露於該試劑，並判斷對β-diox II生物學活性的影響。
在製備轉錄盒時，可以操作多種DNA片段以提供處於正確取向和正確讀碼框的DNA序列。為此目的，可以採用銜接頭或接頭來連接DNA片段，或者可以包括其它操作以提供方便的限制性位點、除去多餘DNA、除去限制性位點、等。為此目的，可以採用體外誘變、引物修復、限制性消化、退火、切除、連接、等，其中可能涉及插入、刪除、或替代(如轉換和顛換)。
可以通過標準方法將攜帶編碼天然或突變β-胡蘿蔔素雙加氧酶的cDNA或基因組DNA的表達盒置於表達載體中。在用於本文時，載體(或質粒)指用於將異源DNA導入細胞以進行表達或複製的離散元件。這些載體的選擇和使用完全屬於本領域技術範圍之內。可以獲得許多載體，而且適當載體的選擇將依賴於載體的意欲用途(即它是用於DNA擴增還是用於DNA表達)、將插入載體的DNA的大小、將用載體轉化的宿主的類型(植物、動物、昆蟲、真菌、或微生物)、和將表達載體導入宿主細胞的方法。根據其功能(DNA擴增或DNA表達)和相容宿主細胞，每種載體都包含多種元件。典型表達載體通常包含但不限於編碼細菌複製起點和抗生素抗性基因的原核DNA元件，提供表達載體在細菌宿主中的生長和選擇；克隆位點，用於插入外源DNA序列，在本文中是編碼能夠切割β-胡蘿蔔素而形成類胡蘿蔔素/類視黃質的酶的DNA序列；控制外源基因轉錄起始的真核DNA元件，諸如啟動子；和控制轉錄本加工的DNA元件，諸如轉錄終止/聚腺苷酸化序列。它還可包含最終將載體整合到靶向宿主染色體中所需要的序列。
在一個優選的實施方案中，表達載體還包含編碼選擇標記的基因(在功能上連接啟動子)，諸如潮黴素磷酸轉移酶(van den Elzen等人，Plant Mol.Biol.，5299-392，1985)。賦予抗生素抗性因而適合於作為選擇標記的基因的其它範例包括新黴素磷酸轉移酶基因(Velten等人，EMBO.J.，32723-2730，1984)；衍生自Tn5的卡那黴素抗性(NPT II)基因(Bevan等人，Nature，304184-187，1983)；PAT基因(Thompson等人，EMBO J.，62519-2523，1987)；和氯黴素乙醯基轉移酶基因。關於適用於本發明的植物表達載體和選擇標記基因的一般描述參閱Gruber等人，《Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology》(植物分子生物學和生物技術的方法)，第89-119頁，CRC出版社，1993。至於適用於酵母的選擇標記，可以使用因標記基因的表型表達而便於選擇轉化體的任何標記基因。適用於酵母的標記是例如賦予抗生素G418、潮黴素、或博來黴素抗性的基因，或者在營養缺陷型酵母突變體中提供原養型的基因(例如URA3、LEU2、LYS2、TRP1、或HIS3基因)。
適用於哺乳動物細胞的選擇標記是能夠鑑定有能力攝取β-diox核酸的細胞的基因，諸如二氫葉酸還原酶(DHFR，氨甲蝶呤抗性)、胸苷激酶，或者賦予G418或潮黴素抗性的基因。將哺乳動物細胞轉化體置於只有已經攝取並表達標記的轉化體唯一適合於存活的選擇壓力下。在以DHFR或穀氨醯胺合酶(GS)作為標記的情況中，可以通過在逐漸提高壓力的條件下培養轉化體來施加選擇壓力，由此導致選擇基因和編碼β-diox II的相連DNA二者的擴增(在其染色體整合位點)。擴增指生成生長所必需的蛋白質更加需要的基因與編碼期望蛋白質的密切相連基因在重組細胞染色體內重複串聯的過程。期望蛋白質的增量通常是由因此擴增的DNA合成的。
用於分別控制目的基因和標記基因的表達的啟動子元件可以是任何植物相容啟動子。它們可以是植物基因啟動子，諸如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(核糖體二磷酸羧化酶-加氧酶)小亞基的啟動子或來自根癌土壤桿菌腫瘤誘導質粒的啟動子，像胭脂鹼合酶和章魚鹼合酶啟動子；或者是病毒啟動子，諸如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子。關於適用於本發明的已知植物啟動子的回顧，參閱例如國際申請WO 91/19806。
「組織特異性」啟動子提供期望基因產物在表達類胡蘿蔔素或葉黃素生物合成途徑產物的組織中特別高的積累；儘管在植物的其它部分也可以發生一些表達。已知的組織特異性啟動子的範例包括谷蛋白1啟動子(Kim等人，Plant Cell Physiol.，34595-603，1993；Okita等人，J.Biol.Chem.，26412573-12581，1989；Zheng等人，PlantH.，4357-366，1993)、針對塊莖的I型patatin啟動子(Bevan等人，Nucl.Acids Res.，144625-4638，1986)；與馬鈴著塊莖ADPGPP基因相連的啟動子(Muller等人，Mol.Gen.Genet.，224136-146，1990)；β-conglycinin(也稱為7S蛋白質，驅動種子定向轉錄)的大豆啟動子(Bray，Planta，172364-370，1987)；和來自玉米胚乳玉米蛋白基因的種子定向啟動子(Pedersen等人，Cell，291015-1026，1982)。可用於本發明的另一類啟動子是植物遍在蛋白啟動子。植物遍在蛋白啟動子在本領域是眾所周知的，正如Kay等人，Science，2361299，1987和EP-A 0 342 926所證明的。同樣適用於本發明的是肌動蛋白啟動子、組蛋白啟動子、和微管蛋白啟動子。EP-A0 332 104描述了優選的化學誘導啟動子的範例，諸如菸草PR-1a啟動子。另一類優選啟動子是創傷誘導型啟動子。這一類的優選啟動子包括下列所述Stanford等人，Mol.Gen.Genet.，215200-208，1989；Xu等人，Plant Mol.Biol.，22573-588，1993；Logemann等人，Plant Cell，1151-158，1989；Rohrmeier和Lehle，PlantMol.Biol.，22783-792，1993；Firek等人，Plant Mol.Biol.，22192-142，1993；和Warner等人，Plant J.，3191-201，1993。
依照一個優選實施方案，用於表達β-胡蘿蔔素雙加氧酶II的盒包含β-diox II cDNA，並在翻譯水平融合了編碼用於質體輸入的運輸肽的序列、聚腺苷酸化信號、和轉錄終止子，它們都可操作連接允許期望蛋白質在植物細胞、種子、組織、或完整植株中表達的合適組成性、誘導性、或組織特異性啟動子。
此外，依照本發明的β-diox II基因優選包含分泌序列以便於由細菌宿主分泌多肽，使之以可溶性天然肽而非包涵體的形式生成。根據情況，可以由細菌周質間隙或培養基回收肽。
適用於酵母宿主的啟動序列可以是受控或組成性的，而且優選衍生自高度表達的酵母基因，尤其是釀酒酵母基因。因而可以使用TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酶(PHO5)基因的啟動子；編碼α或a因子的酵母交配信息素基因的啟動子；衍生自編碼糖酵解酶的基因的啟動子，諸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶、或葡萄糖激酶基因的啟動子；或來自TATA結合蛋白(TBP)基因的啟動子。另外，有可能使用包含一種酵母基因的上遊激活序列(UAS)和另一種酵母基因的下遊啟動子元件(包括功能性TATA盒)的雜合啟動子，例如包含PHO5基因的UAS和酵母GAP基因包含功能性TATA盒的雜合啟動子(PHO5-GAP雜合啟動子)。合適組成性PHO5啟動子是例如缺乏上遊調控元件(UAS)、諸如PHO5(-173)啟動子元件(由PHO5基因的第-173位核苷酸開始，至第9位核苷酸結束)的縮短型酸性磷酸酶PHO5啟動子。
可以通過衍生自病毒(諸如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒(CMV)、逆轉錄病毒、和猿猴毒40(SV40))基因組、衍生自異源哺乳動物啟動子(諸如肌動蛋白啟動子或很強的啟動子如核糖體蛋白質啟動子)、或者衍生自通常與β-diox序列相連的啟動子的啟動子來控制哺乳動物宿主中由載體轉錄β-diox II基因，條件是這些啟動子與宿主細胞系統是相容的。
可以通過將增強子序列插入載體來提高編碼β-diox II的DNA在高等真核生物中的轉錄。增強子相對不依賴於取向和定位。已知來自哺乳動物基因(如彈性蛋白酶和珠蛋白)的許多增強子序列。然而，通常採用來自真核細胞病毒的增強子。範例包括位於複製起點(第100-270位bp)晚期一側的SV40增強子和CMV早期啟動子增強子。可以將增強子剪接到載體中，位於β-diox II DNA的5』或3』，但是優選位於啟動子的5』位點。
有利的是，編碼β-diox II的真核表達載體可以包含基因座控制區(LCR)。LCR能夠指導整合到宿主細胞染色質中的轉基因的高水平整合位點獨立性表達，這尤其對在永久轉染的真核細胞系(其中載體發生了染色體整合)中表達β-diox II基因時、在設計用於基因療法應用的載體時、或者在本文公開的或本領域已知的轉基因動物或其它宿主中是重要的。
依照本發明的一個優選實施方案，本文公開的表達盒和質粒或載體系統額外包含編碼特異性類視黃質修飾酶和/或類視黃質結合蛋白的核酸序列，優選與依照本發明的多肽共表達，正如上文所述。
適用於表達β-diox II的真核宿主細胞，包括真菌(包括酵母)、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞，還將包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。通常可以由真核或病毒DNA或cDNA的5』和3』非翻譯區獲得這些序列。這些區域包括轉錄成編碼β-diox II的mRNA非翻譯部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。
可以通過幾種方法獲得本發明涵蓋的原核或真核宿主細胞、種子、組織、和完整生物體。本領域技術人員將領會，可以根據轉化所靶向的宿主的類型(諸如植物，即單子葉或雙子葉)來選擇方法。這些方法通常包括直接基因轉移、化學誘導基因轉移、電穿孔、顯微注射(Crossway等人，BioTechniques，4320-334，1986；Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.，7530-36，1987)、由土壤桿菌介導的基因轉移、使用例如可以由Agracetus公司(麥迪遜，威斯康星)和Dupont公司(威爾明頓，德拉瓦)獲得的裝置的微彈加速法(參閱例如Sanford等人，美國專利號4,945,050；和Mc Cabe等人，Biotechnology，6923-926，1988)、等。
用於獲得本發明轉化植物或其部分的一種方法是直接基因轉移，其中在存在包含希望導入植物或其部分的核苷酸序列的DNA寡核苷酸時在合適條件下培養植物細胞或以其它方式生長。供體DNA來源通常是包含期望基因的質粒或其它合適載體。為了方便，這裡參考了質粒，應當理解，也涵蓋了包含期望基因的其它合適載體。
可以通過直接基因轉移處理攝取質粒的任何合適植物組織。這些植物組織包括例如處於發育早期，特別是減數分裂前，尤其是減數分裂前1-2周的生殖結構。通常，將減數分裂前的生殖器官浸泡在質粒溶液中，諸如通過將質粒溶液直接注射到植物中生殖器官處或附近。然後將植物自花授粉或與來自以相同方式處理的另一株植物的花粉交叉授粉。質粒溶液通常在用於每個花結構的大約0.1-10ml中包含大約10-50μg DNA，但是根據具體花結構的大小可以高於或低於這個範圍。溶劑通常是無茵的水、鹽水、或緩衝液，或者是常規的植物培養基。如果需要，質粒溶液還可以包含試劑，以化學誘導或增強質粒攝取，諸如PEG、Ca2+、等。
在將生殖器官暴露於質粒後，使花結構生長至成熟並收穫種子。根據質粒標記，通過植物在標記敏感或優選標記抗性培養基中的發芽或生長來選擇具有標記基因的轉化植物。例如，由用具有卡那黴素抗性基因的質粒處理的植物獲得的種子將保持綠色，而不具有這種標記基因的植物是白化體。可以通過常規的Southern、Northern、和Western印跡技術進一步證明期望基因的mRNA轉錄和肽表達的存在。
在適用於進行本發明的另一種方法中，處理植物原生質體以誘導依照本發明的質粒或載體系統的攝取。原生質體的製備在本領域是眾所周知的，通常包括用纖維素酶和其它酶消化植物細胞足夠時間以除去細胞壁。通常通過過篩和清洗由消化混合物分離原生質體。然後將原生質體懸浮於適當培養基，諸如F培養基、CC培養基、等，濃度通常是104-107個細胞/ml。然後向此懸浮液中加入上文所述質粒溶液和誘導劑(諸如聚乙二醇、Ca2+、仙臺病毒、等)。或者，可以將質粒包裹到脂質體中。然後將質粒與原生質體的溶液於大約25℃保溫適當時間，通常是大約1小時。在有些情況中，可能希望通過短時加熱至大約45℃例如2-5分鐘並迅速冷卻至保溫溫度而對混合物進行熱休克。然後克隆處理後的原生質體，並通過例如標記基因的表達和常規的印跡技術來選擇期望基因的表達。然後以常規方式由克隆再生完整植株。
電穿孔技術是相似的，只是通常在電穿孔槽中在不存在或存在聚乙二醇、Ca2+、等時對裸露質粒和原生質體的混合物應用電流。典型電穿孔包括1-10個脈衝的40-10,000DC伏特，持續時間1-2000微秒，各脈衝之間的間隔通常是0.2秒。也可以使用相似強度的交流脈衝。更具體的說，將帶電電容器在含質粒和原生質體懸浮液的電穿孔槽中放電。這種處理導致生物膜通透性的可逆升高，從而能夠插入依照本發明的DNA。電穿孔後的植物原生質體再生它們的細胞壁，分裂，並形成愈傷組織(參閱例如Riggs等人，1986)。
適用於轉化靶細胞的另一種方法涉及土壤桿菌的使用。在這種方法中，將包含具有期望基因或基因盒的質粒的土壤桿菌用於感染植物細胞並將質粒插入靶細胞基因組。然後如上所述選擇並克隆表達期望基因的細胞。例如，通過質粒(如Ri質粒)和土壤桿菌(如髮根土壤桿菌或根癌土壤桿菌)的手段將目的基因導入靶組織(如塊莖、根、穀粒、或豆莢)的一種方法是利用適用於在大腸桿菌中克隆的小型重組質粒，其中已經經剪接了T-DNA片段。在T-DNA內的一個位點處切開這種重組質粒，並在開口處剪接一段「過客」DNA。過客DNA由將要導入植物DNA的本發明基因和選擇標記(如抗生素抗性的基因)組成。然後將這種質粒再次克隆到大型質粒中，並導入攜帶未修飾Ri質粒的土壤桿菌菌株。在細菌的生長過程中，有時會發生罕見的雙重重組，導致細菌中的T-DNA包含插入片段即過客DNA。通過在含抗生素的培養基上的存活來鑑定並選擇這些細菌。將這些細菌用於將它們的T-DNA(經過客DNA修飾)插入植物基因組。利用髮根土壤桿菌或根癌土壤桿菌的這種流程產生了可再生成健康、有活力植株的轉化植物細胞(參閱例如Hinchee等人，1988)。
另一種合適方法是用微彈轟擊細胞，所述微彈包被了轉化DNA(Wang等人，Plant Mol.Biol.，11433-439，1988)，或者通過壓力衝擊在含DNA的溶液中以待轉化細胞的方向加速，由此因壓力衝擊而與溶液細微散布成霧狀(EP-A 0 434 616)。
微彈轟擊已經發展成用於細胞(包括植物細胞)的有效轉化技術。Sanford等人(Particulate Science and Technology，527-37，1987)報導了利用微彈轟擊將核酸有效投遞至洋蔥(Allium cepa)植物細胞的細胞質。Christou等人(Platn Physiol.，87671-674，1988)報導了通過微彈轟擊用卡那黴素抗性基因穩定轉化大豆愈傷組織。相同作者報導了大約0.1-5％細胞被穿透，並發現可觀測水平的NPTII酶活性和轉化愈傷組織中高達400mg/L的卡那黴素抗性。McCabe等人(1988，同上)報導了使用微彈轟擊穩定轉化大豆(Glycine max)。McCabe等人還報導了由R0嵌合植物回復轉化R1植物的發現(還可參閱Weissinger等人，Annual Rev.Genet.，22421-477，1988；Datta等人，Biotechnology，8736-740，1990(稻)；Klein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854305-4309，1988(玉米)；Klein等人，Plant Physiol.，91440-444，1988(玉米)；Fromm等人，Biotechnology，8833-839，1990；和Gordon-Kamm等人，Plant Cell，2603-618，1990(玉米))。
或者，可以直接轉化植物質體。已經在高等植物中報導了葉綠體的穩定轉化(參閱例如Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90913-917，1993；Staub和Maliga，EMBO J.，12601-606，1993)。該方法依賴於包含選擇標記的DNA的微粒槍投遞和通過同源重組將DNA打靶至質體基因組。在這些方法中，可以通過質體基因啟動子的使用或通過所處位置便於由選擇性啟動子序列(諸如由T7 RNA聚合酶識別的啟動子序列)的沉默的質體傳播轉基因的轉錄激活來實現質體基因表達。沉默質體基因是通過由細胞核表達構建物表達的特定RNA聚合酶激活的，並通過運輸肽的使用將聚合酶靶向質體。可以這種方法通過由合適植物組織特異性啟動子表達的細胞核編碼、質體定向的特異性RNA聚合酶來獲得組織特異性表達。McBride等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，977301-7305，1994)已經報導了這種系統。
所有植物轉化系統都產生轉基因和非轉基因植物的混合物。可以通過導入抗生素或除草劑基因使之能夠在含相應有毒化合物的培養基上選擇來實現轉基因植物細胞的選擇。除了那些用於選擇轉基因植物的標記系統，新的所謂「陽性選擇系統」已經成功用於植物轉化(PCT/EP94/00575、WO 94/20627)。與抗生素或除草劑抗性選擇系統(其中轉基因細胞獲得在選擇培養基上存活的能力，而殺死非轉基因細胞)相反，這種方法有利於轉基因植物細胞的再生和生長，並餓死而非殺死非轉基因植物細胞。因此，將這種選擇策略稱為「陽性選擇」。已經構建了用於由土壤桿菌介導的轉化的載體系統，並成功用於例如轉化馬鈴薯、菸草、和番茄(Haldrup A、Petersen SG、和Ollels FT，Platn Mol.Biol.，37287-296，1998)。基於這種陽性選擇系統的轉化系統依照本發明可用於導入包含β-diox II的構建物以獲得表達β-diox II多肽的植物並由此能夠酶促切割β-胡蘿蔔素而形成β-阿樸胡蘿蔔素醛。另外，那些選擇系統的使用將具有優點，即克服了在選擇系統中使用抗生素或除草劑基因的缺點，諸如基因產物的毒性或變應原性和抗生素處理的幹涉，正如本領域普遍知道的。
上文以例示方式列出的可能轉化方法並沒有宣稱是完全的，而且並非意欲以任何方式限制本發明的主題。
因此，本發明還包括以適當方式用上文所列依照本發明的DNA分子或者用質粒或載體系統轉化或轉染的原核或真核宿主細胞、種子、組織、或完整生物體，所述方式使得所述宿主細胞、種子、組織、或完整生物體能夠表達具有特異切割β-胡蘿蔔素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學活性和/或具有特異結合針對所述多肽或其功能片段所製備的抗體的能力的多肽或其功能片段。
依照本發明，原核或真核宿主細胞、種子、組織、或完整生物體選自下組細菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細胞、種子、組織、或完整生物體。關於原核分類群，宿主可以選自下組原細菌(proteobacteria)，包括α、β、γ、δ、和ε亞門的成員；革蘭氏陽性細菌，包括放線茵綱(Actinomycetes)、硬壁茵門(Firmicutes)、梭菌屬(Clostridium)及其親緣、黃細菌(flavobacteria)、藍細菌(cyanobacteria)、綠色硫細菌(greensulfur bacteria)、綠色非硫細菌(green non-sulfur bacteria)、和古細菌(archaea)。屬於α亞門的合適原細菌可以選自下組土壤桿菌屬(Agrobacterium)、紅螺茵屬(Rhodospirillum)、紅假單胞茵屬(Rhodopseudomonas)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅微茵屬(Rhodomicrobium)、紅球形茵屬(Rhodopiia)、根瘤茵屬(Rhizobium)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、水螺茵屬(Aquaspirillum)、生絲微茵屬(Hyphomicrobium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、拜葉林克氏茵屬(Beijerinckia)、副球菌屬(Paracoccus)、和假單胞茵屬(Pseudomonas)，優選土壤桿菌屬和紅細菌屬，分別最優選金黃色土壤桿菌(Agrobacterium aureus)和莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)。屬於β亞門的合適原細菌可以選自下組紅環茵屬(Rhodocyclus)、紅育茵屬(Rhodopherax)、Rhodovivax、螺茵屬(Spirillum)、亞硝化單胞茵屬(Nitrosomonas)、球衣茵屬(Spherotilus)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、產鹼茵屬(Alcaligenes)、假單胞茵屬(Pseudomonas)、博德特氏茵屬(Bordetella)、和奈瑟氏球菌屬(Neisseria)，優選氧化氨的細菌諸如亞硝化單胞茵屬，最優選亞硝化單胞菌ENI-11。屬於γ亞門的合適原細菌可以選自下組著色茵屬(Chromatium)、硫螺旋茵屬(Thiospirillum)、貝日阿託氏菌屬(Beggiatoa)、亮發茵屬(Leucothrix)、埃希氏茵屬(Escherichia)、和固氮菌屬(Azotobacter)，優選腸桿菌科(Enterobacteriaceae)諸如大腸埃希氏茵(Escherichia coli)，最優選大腸桿菌K12茵株諸如M15(描述為DZ 291，Villarejo等人，J.Bacteriol.，120466-474，1974)、HB101(ATCC編號33649)、和大腸埃希氏茵SG13009(Gottesman等人，J.Bacteriol.，148265-273，1981)。屬於δ亞門的合適原細菌可以選自下組蛭弧茵屬(Bdellovibrio)、脫硫弧茵屬(Desulfovibrio)、脫硫單胞茵屬(Desulfuromonas)、和粘細菌(Myxobacteria)諸如粘球菌屬(Myxococcus)，優選黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)。屬於ε亞門的合適原細菌可以選自下組卵硫菌屬(Thiorulum)、沃林氏茵屬(Wolinella)、和彎曲桿菌屬(Campylobacter)。合適的革蘭氏陽性細菌可以選自下組放線茵(Actinomycetes)諸如放線茵屬(Actinomyces)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、諾卡氏茵屬(Nocardia)、遊動放線菌屬(Actinoplanes)、節桿菌屬(Arthrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、小單孢菌屬(Micromonospora)、弗蘭克氏茵屬(Frankia)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、和短桿菌屬(Brevibacterium)，硬壁茵門(Firmicutes)包括梭茵屬及其親緣諸如梭茵屬、芽孢桿菌屬(Bacillus)、脫硫腸狀茵屬(Desulfotomaculum)、高溫放線茵屬(Thermoactinomyces)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、醋酸桿菌屬(Acetobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、瘤胃球茵屬(Rominococcus)、動性球菌屬(Planococcus)、枝原體屬(Mycoplasma)、無膽甾原體屬(Acheoleplasma)、和螺原體屬(Spiroplasma)，優選枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。合適的黃細茵類可以選自下組擬桿菌屬(Bacteroides)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、和黃桿菌屬(Flavobacterium)，優選黃桿菌屬諸如黃桿菌ATCC 21588。合適的藍細菌類可以選自下組Chlorococcales，包括集胞藍細菌屬(Synechocystis)和聚球藍細菌屬(Synechococcus)，優選集胞藍細菌之種(Synechocystis sp.)和聚球藍細菌之種(Synechococcus sp.)PS717。合適的綠色硫細菌可以選自下組綠菌屬(Chlorobium)，優選泥生綠茵嗜硫代硫酸鹽小種(Chlorobium limicola f.thiosulfatophilum)。合適的綠色非硫細菌可以選自下組綠屈撓茵科(Chloroflexaceae)諸如綠屈撓菌屬(Chloroflexus)，優選橙色綠屈撓茵(Chloroflexusaurantiacus)。合適的古細菌類可以選自下組鹽杆茵科(Halobacteriaceae)包括鹽桿菌屬(Halobacterium)，優選鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarum)。
關於真菌(包括酵母)的真核分類群，宿主可以選自下組子囊茵門(Ascomycota)包括酵母綱(Saccharomycetes)諸如畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬(Saccharomyces)，和變形子囊茵門(anamorphicAscomycota)包括麴黴屬(Aspergillus)，優選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑麴黴(Aspergillus niger)(如ATCC 9142)。
真核宿主系統包括優選選自下組的昆蟲細胞SF9、SF21、Trychplusiani、和MB21。例如，可以在昆蟲細胞系統中有利的表達依照本發明的多肽。適用於本發明方法的昆蟲細胞原則上包括能夠用表達載體轉化並表達由其編碼的異源蛋白的任何鱗翅目(lepidopteran)細胞。具體而言，優選使用Sf細胞系諸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞系IPBL-SF-21 AE(Vaughn等人，In Vitro，13213-217，1977)。特別優選衍生細胞系Sf9。然而，也可以採用其它細胞系，諸如粉紋(粉)夜蛾(Trichoplusia ni)368(Kutstack和Marmorosch，《Invertebrate Tissue Culture Applications inMedicine，Biology and Agriculture》(無脊椎動物組織培養在醫學、生物學、和農業中的應用)，Academic出版社，紐約，美國，1976)。這些細胞系以及適用於本發明的其它昆蟲細胞系可以由商業途徑獲得(如Stratagene，拉霍亞，加利福尼亞，美國)。與在培養的昆蟲細胞中表達一樣，本發明還包括在完整昆蟲生物體中表達異源蛋白諸如β-diox II。病毒載體諸如杆狀病毒的使用能夠感染完整昆蟲，這在某些方面比培養細胞易於生長，因為它們對特殊生長條件的要求較少。大型昆蟲諸如蠶蛾能夠提供高產量的異源蛋白。可以依照常規提取技術由昆蟲提取蛋白質。適用於本發明的表達載體包括能夠在昆蟲細胞系中表達外源蛋白的所有載體。一般而言，可用於哺乳動物和其它真核細胞的載體同樣可應用於昆蟲細胞培養物。尤其優選明確意欲用於昆蟲細胞培養物的杆狀病毒載體，而且可以通過商業途徑廣泛獲得(如Invitrogen和Clontech)。還知道能夠感染昆蟲細胞的其它病毒載體，諸如Sindbis病毒(Hahn等人，PNAS USA，892679-2683，1992)。選擇的杆狀病毒載體(回顧見Miller，Ann.Rev.Microbiol.，42177-179，1988)是苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多核型多角體病毒(AcMNPV)。通常用異源基因取代AcMNPV的多角體蛋白基因的至少部分，因為多角體蛋白不是病毒繁殖所必需的。為了插入異源基因，使用轉移載體比較有利。優選在大腸桿菌宿主中製備轉移栽體，然後通過同源重組過程將DNA插入片段轉移至AcMNPV。
真核宿主系統還包括動物細胞，優選選自下組幼倉鼠腎(BHK)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎(HEK)細胞、和COS細胞，最優選3T3和293細胞。
在本公開書中提到的宿主細胞包括體外培養的細胞和宿主生物體內的細胞。
本發明還提供了選自下組的轉基因植物材料原生質體、細胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚、胚珠、合子、等，尤其是通過依照本發明方法進行了轉化並包含可表達形式的本發明重組DNA的完整植株，以及用於生成所述轉基因植物材料的方法。
在用於本文時，術語「植物」通常包括真核藻類、有胚植物包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)、和種子植物門(Spermatophyta)諸如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)，後者包括Magnoliopsida、Rosopsida(真-「雙子葉植物」)、和百合綱(Liliopsida)(「單子葉植物」)。代表性和優選範例包括穀物種子，如稻、小麥、大麥、燕麥、莧屬植物、亞麻、黑小麥、黑麥、玉米、和其它草類；油料種子，諸如芸苔種子、棉花種子、大豆、紅花、向日葵、椰子、棕櫚、等；其它可食用種子或含可食用部分的種子，包括西葫蘆、南瓜、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿蔔、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹生堅果，諸如胡桃、巴旦杏、山核桃、鷹嘴豆、等。其它範例包括馬鈴薯、胡蘿蔔、甘薯、製糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、櫟、榆、槭、蘋果、和香蕉。通常，本發明可應用於栽培用於食品、藥物、飲料、等的物種。優選的是，選擇用於轉化的靶植物栽培用於食品，諸如穀物、根、豆類、堅果、蔬菜、塊莖、水果、調味品、等。
可以遵循本領域眾所周知的如下流程將依照本發明生成的陽性轉化體再生成植株(參閱例如McCormick等人，Plant Cell Reports，581-84，1986)。然後栽培這些植株，在用相同轉化種或不同種授粉後可以對後代評估期望特性的存在和/或期望特性的表達程度，並鑑定具有期望表型特徵的所得雜合體。第一項評估可以包括例如轉化植物的細菌/真菌抗性水平。可以栽培兩代或更多代以確保目的表型特徵得到穩定維持和遺傳，然後收穫種子以確保已經實現了期望表型或其它特性。
本發明的範圍還包括轉基因植物，特別是通過本發明方法轉化的轉基因可育植物及其無性繁殖和/或有性繁殖後代，它們仍然展示因母本植物的轉化而引起的新的和期望的特性。
術語「後代」理解為包括「無性繁殖」和「有性繁殖」產生的轉基因植物的後代。該定義還意欲包括可通過已知方法(諸如細胞融合體或突變體選擇)獲得的所有突變體和變體，以及轉化植物材料的所有雜交和融合產物，所述突變體和變體仍然展示最初轉化植物的特徵性特性。
由先前通過本發明方法轉化的轉基因植物或其後代起源、因而至少部分由轉基因細胞組成的植物部分，諸如花、莖、果實、葉、根，也是本發明的對象。本發明的另一方面涉及用於測量、分析、和評估依照本發明的核酸和/或胺基酸分子固有的定性和定量性質的診斷手段和方法。例如，適當設計的寡核苷酸(本文公開的序列的代表性例子)使之能夠進行例如組織分型、表達作圖、和等位基因測定(SNP分析)，優選在高通量裝置(諸-如DNA和蛋白質微陣)中進行，諸如此類。其它應用領域包括生成特定構建物作為基因治療工具，和生成抗體用於例如純化、治療、或診斷目的。
依照本發明的還有一個實施方案，提供了特異識別並結合β-dioxII的抗體。例如，可以生成針對具有SEQ ID NO17、19、或21中所列胺基酸序列的β-diox II蛋白質的這些抗體。或者，將β-diox II或諸如上文所述β-diox II片段(也可以通過體外方法合成)融合(通過重組表達或體外肽鍵)免疫原性多肽，繼而將這種融合多肽用於製備針對β-diox II表位的抗體。
可以由免疫動物的血清回收抗β-diox II多肽。可以常規方式由來自免疫動物的細胞製備單克隆抗體。
本發明的抗體可用於研究β-diox II的定位、篩選表達文庫以鑑定編碼β-diox II或功能性結構域的核酸、以及純化β-diox II等。
依照本發明的抗體可以是天然類型的完整抗體，諸如IgE和IgM抗體，但是優選IgG抗體。另外，本發明包括抗體片段，諸如Fab、F(ab』)2、Fv、和scFv。由於尺寸小即因此組織分布優越，小片段(諸如Fv和scFv)具有用於診斷和治療應用的有利特性。
尤其指出依照本發明的抗體的診斷和治療應用。因此，它們可以是改變後包含效應蛋白諸如毒素或標記物的抗體。尤其優選能夠在體內將腫瘤中的抗體分布成像的標記物。這些標記物可以是易於在患者體內顯影的放射性標記物或不透射線標記物，諸如金屬微粒。另外，它們可以是能夠在取自患者的組織樣品上顯影的螢光標記物或其它標記物。
重組DNA技術可用於改進本發明的抗體。因而，可以構建嵌合抗體以降低它們在診斷或治療應用中的免疫原性。另外，可以通過CDR移植(參閱EP-A-239 400，Winter)和任選的框架修飾(參閱WO 90/07861，Protein Design Lab)將抗體人源化而將免疫原性最小化。
可以由動物血清獲得依照本發明的抗體，或者在單克隆抗體或其片段的情況下，可以在細胞培養物中生成。依照已確立流程，重組DNA技術可用於在細菌或優選哺乳動物細胞培養物中生成抗體。選擇的細胞培養物系統優選分泌抗體產物。
因此，本發明包括用於生成依照本發明的抗體的方法，包括培養已經用包含表達盒的雜合載體轉化的宿主(如大腸桿菌或哺乳動物細胞)，所述表達盒包含啟動子，以及與之可操作連接的編碼信號肽的第一種DNA序列，並正確讀碼框中連接編碼抗體的第二種DNA序列，以及分離所述抗體。
雜交瘤細胞或哺乳動物宿主細胞的體外增殖是在合適培養基中進行，它們是常規的標準培養基，例如Dulbecco氏修改的Eagle氏培養基(DMEM)或RPMI 1640培養基，任選補充哺乳動物血清(如胎牛血清)或痕量元素和生長維持補充物(如飼養細胞，諸如正常小鼠腹膜滲出細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞、2-氨基乙醇、胰島素、轉鐵蛋白、低密度脂蛋白、油酸、等)。作為宿主細胞的細菌細胞或酵母細胞的增殖同樣是在本領域知道的合適培養基中進行的，例如對於細菌而言使用培養基LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific肉湯、SOB、SOC、2xYT、或M9基本培養基，對於酵母而言使用培養基YPD、YEPD、基本培養基、或完全基本Dropout培養基。
體外生產可提供相對較純的抗體製劑，並能夠擴大規模以產生大量的期望抗體。用於細菌細胞、酵母、或哺乳動物細胞培養的技術在本領域是知道的，包括均相懸浮培養(如氣升式反應器或連續攪拌反應器)、固定化或截留細胞培養(如中空纖維、微囊、瓊脂糖微珠、或陶柱)。
還可通過哺乳動物細胞的體內增殖來獲得大量的期望抗體。為此目的，將生成期望抗體的雜交瘤細胞注射到組織相容哺乳動物中，引起抗體生成腫瘤的生長。任選的是，在注射前用烴尤其是礦物油諸如降植烷(四甲基十五烷)對動物進行引發。1-3周後，由那些哺乳動物的體液分離抗體。例如，將通過合適骨髓瘤細胞與來自Balb/c小鼠的抗體生成脾細胞的融合獲得的雜交瘤細胞、或衍生自雜交瘤細胞系Sp2/O且生成期望抗體的轉染細胞腹膜內注射到Balb/c小鼠體內(該小鼠任選用降植烷預處理)，1-3周後，由動物採集腹水。
對細胞培養物上清液篩選期望抗體，優選通過表達β-diox II的細胞的免疫螢光染色、通過免疫印跡、通過酶免疫測定法(如三明治測定法或斑點測定法)、或放射性免疫測定法進行。
為了分離抗體，可以濃縮培養物上清液或腹水中的免疫球蛋白，例如通過硫酸銨沉澱、在吸溼材料諸如聚乙二醇中的透析、通過選擇性膜過濾、等。如果必需和/或希望，可通過常規的層析法純化抗體，例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素層析、和/或免疫親和層析，如使用β-diox II蛋白質或A蛋白進行親和層析。
本發明還涉及分泌本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞。本發明的優選雜交瘤細胞在遺傳上是穩定的，分泌具有期望特異性的本發明單克隆抗體，並能夠通過解凍和再次克隆由深層冷凍培養物活化。
本發明還涉及用於製備分泌針對β-diox II的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法，其特徵是用純化的β-diox II蛋白質、含純化的β-diox II的抗原載體、或攜有β-diox II的細胞免疫合適哺乳動物(例如Balb/c小鼠)，將免疫動物的抗體生成細胞融合合適骨髓瘤細胞系的細胞，克隆在融合中獲得的雜合體細胞，並選擇分泌期望抗體的細胞克隆。例如，將用攜有β-diox II的細胞免疫的Balb/c小鼠的脾細胞融合骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/O-Agl4的細胞，對獲得的雜合體細胞篩選期望抗體的分泌，並克隆陽性雜交瘤細胞。
優選用於製備雜交瘤細胞系的方法，其特徵是通過在幾個月(如2-4個月)裡幾次(如4-6次)皮下和/或腹膜內注射107-108個人腫瘤起源且表達含合適佐劑的β-diox II的細胞來免疫Balb/c小鼠，最後一次注射後2-4天由免疫小鼠採集脾細胞，並在存在融合促進劑(優選聚乙二醇)時融合骨髓瘤細胞系PAI的細胞。優選的是，骨髓瘤細胞在含大約30-50％分子量4000左右的聚乙二醇的溶液中融合3-20倍過量的來自免疫小鼠的脾細胞。融合後，在上文所述合適培養基中擴增細胞，以規則時間間隔添加選擇性培養基(例如HAT培養基)以防止正常骨髓瘤細胞相對於期望雜交瘤細胞的過度生長。
本發明還涉及包含編碼針對β-diox II蛋白質的抗體的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的插入片段的重組DNA。根據定義，這些DNA包括編碼單鏈DNA、由所述編碼DNA及其互補DNA組成的雙鏈DNA、或這些互補(單鏈)DNA自身。
另外，編碼針對β-diox II的抗體的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的DNA可以是具有編碼重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的真實DNA序列或其突變體的酶促或化學合成DNA。真實DNA的突變體是編碼上述抗體的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的DNA，其中一個或多個胺基酸被刪除或用一個或多個其它胺基酸替代。優選的是，所述修飾位於抗體的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的CDR以外。這種突變DNA還可以是沉默突變體，其中一個或多個核苷酸被其它核苷酸替代，而新的密碼子編碼相同的胺基酸。這種突變體序列也是簡併序列。簡併序列在遺傳密碼的含義內是簡併的，即其中有不限數目的核苷酸被其它核苷酸替代，而不改變最初編碼的胺基酸序列。這些簡併序列是有用的，因為它們具有不同的限制性位點和/或特定宿主(特別是大腸桿菌)優選的特定密碼子頻率，從而獲得重鏈鼠可變結構域和/或輕鏈鼠可變結構域的最佳表達。
術語「突變體」意欲包括通過依照本領域已知方法由真實DNA的體外誘變獲得的DNA突變體。
為了裝配完整的四聚體免疫球蛋白分子和表達嵌合抗體，將編碼重鏈和輕鏈可變結構域的重組DNA插入片段融合編碼重鏈和輕鏈恆定結構域的相應DNA，然後轉移到適當宿主細胞中，例如在摻入雜合體載體後進行這種轉移。
在診斷組合物的情況中，優選抗體與用於檢測抗體的手段一起提供，它可以是酶促、螢光、放射性同位素、或其它手段。可以在意欲用於診斷的診斷試劑盒中提供同時、同時但分開、或順序使用的抗體和檢測手段。
例如，本發明提供了特徵為指定受試者或個體中β-diox II水平的升高或降低的病理學的診斷方法。例如，獲取測試樣品，並在合適條件下接觸能夠特異結合β-diox II的試劑或能夠結合編碼β-dioxII的核酸分子的核苷酸序列，所述條件允許所述試劑或所述核苷酸序列與所述β-diox II靶胺基酸或核酸序列之間的特異結合。隨後，可以將所述測試樣品中所述特異結合的量與對照樣品中特異結合的量進行比較，其中由所述測試樣品中所述特異結合量相對於所述對照樣品的升高或降低即可診斷與由β-diox II誘導的途徑有關的病理學。
本發明還提供了升高或降低細胞或組織中β-diox II的量的方法，這可以調控維生素A或其它類視黃質的水平。例如，可以通過將包含編碼β-diox II或其功能性片段的核酸序列的核酸分子導入細胞或組織來升高指定靶細胞或組織中β-diox II的量。細胞或組織中β-diox II的量的升高可以誘導或促進維生素A積累，這不僅將有利於人類，還將有利於頻繁給予維生素製劑以改進營養品質的動物和飼料。
生物學材料的保藏攜帶衍生自黑腹果蠅的β-胡蘿蔔素雙加氧酶編碼基因的大腸桿菌細胞已經根據布達佩斯條約保藏於德國不倫瑞克的DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，鑑定參考號為「β-diox」，編號DSM 13304。
如下實施例是例示性的，而非限制本發明。
實施例質粒構建物積累β-胡蘿蔔素的大腸桿菌菌株的構建使用載體pFDY297構建攜帶來自草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)的β-胡蘿蔔素生物合成基因的質粒。pFDY297是導入了pBluescriptSK的第1-485位bp的pACYC177(第486-3130位bp)衍生物。為了克隆來自草生歐文氏菌的β-胡蘿蔔素生物合成基因，在PCR產物的兩端導入合適的內切核酸酶限制性位點。首先將crtE基因插入pFDY297。使用引物5』-GCGTCGACCGCGGTCTACGGTTAACTG-3』(SEQ IDNO3)和5』-GGGGTACCCTTGAACCCAAAAGGGCGG-3』(SEQ ID NO4)及Expand PCR System即擴增PCR系統(Boehringer，曼海姆，德國)，通過PCR由pBL376(Hundle BS等人，Mol.Gen.Genet.，245406-416，1994)擴增CrtE，該質粒編碼來自草生歐文氏茵的整個類胡蘿蔔素生物合成基因簇。用KpnI和SalI消化PCR產物，並連接到pFDY297的適當位點中，產生質粒pCRTE。使用引物5』-GCTCTAGACGTCTGGCGACGGCCCGCCA-3』(SEQ ID NO5)和5』-GCGTCGACACCTACAGGCGATCCTGCG-3』(SEQ ID NO6)及Expand PCRSystem即擴增PCR系統(Boehringer，曼海姆，德國)，通過PCR由pBL376擴增基因crtB、crtI、和crtY。用XbaI和SalI消化PCR產物，並連接到pCRTE的適當位點中，產生質粒pORANGE。將質粒轉化到大腸桿菌JM109中之後，得到的菌株能夠合成β-胡蘿蔔素。由黑腹果蠅克隆β-diox我們由通過手工解剖得到的成年果蠅的頭部分離總RNA。使用寡(T)-銜接頭引物5』-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTT TTTTTT-3』(SEQ ID NO7)及Superscript逆轉錄酶(Gibco，德國)進行逆轉錄。為了克隆全長cDNA，使用衍生自已發表EST片段(編號AI063857)的特異上遊引物5』-GCAGCCGGTGTCTTCAAGA G-3』(SEQ ID NO8)和3』端的錨定引物5』-GACCACGCGTATCGATGTCG A-3』(SEQ ID NO9)及ExpandPCR System即擴增PCR系統(Boehringer，曼海姆，德國)進行PCR。0.8％瓊脂糖凝膠電泳之後，分離得到的PCR產物，直接連接到載體pBAD-TOPO(Invitrogen，荷蘭)中，並轉化到積累β-胡蘿蔔素的大腸桿菌菌株中。使用這種克隆策略，將果蠅cDNA在翻譯水平上融合載體的短開放讀碼框，並受到可由L-阿拉伯糖誘導的正調控啟動子的控制。將細菌塗布在含氨苄青黴素(100μg/ml)、卡那黴素(50μg/ml)、和L-阿拉伯糖(0.2％)的LB瓊脂上。通過由黃色褪至幾乎白色來鑑定陽性菌落。為了分析得到的質粒pβdiox並確認其結構，將兩條鏈完整測序。β-diox-gex的表達、純化、和酶活性為了表達β-diox，使用Gex上遊引物5』-GGAATTCGCAGCCGGTGTCTTCAAGAG-3』(SEQ ID NO10)和Gex下遊引物5』-CCTCGAGGTAGTCTTCCCATATAAGG-3』(SEQ ID NO11)及Expand PCR System即擴增PCR系統(Boehringer，曼海姆，德國)擴增cDNA。通過寡核苷酸引物在PCR產物的兩端導入了合適的限制性位點。EcoRI和NcoI的限制性消化之後，將PCR產物克隆到表達載體pGEX-4T-1(Pharmacia，弗賴堡，德國)的合適位點中。將得到的質粒pβdiox-gex轉化到大腸桿菌菌株JM109中。如製造商的方案所述，進行融合蛋白β-diox-gex在大腸桿菌中的表達和隨後在穀胱甘肽sepharose 4B(Pharmacia，弗賴堡，德國)上的純化。β-diox酶活性的測定將純化的蛋白質在300μl含50mM Tricine/NaOH(pH7.6)和100mMNaCl及0.05％屈立通X100的緩衝液中保溫。加入5μlβ-胡蘿蔔素(80μM，溶於乙醇)開始反應。分別加入FeSO4和L-抗壞血酸至終濃度5μM和10mM。於30℃保溫2小、時後，加入100μl 2M NH2OH(pH6.8)和200μl甲醇終止反應。如上所述進行抽提和HPLC分析。通過RT-PCR測定身體不同部分的mRNA水平由成年果蠅(雄性和雌性)分離總RNA。通過手工解剖獲得頭、胸、和腹部(事先已經除去腿和翅)。為了測量β-diox的穩定狀態mRNA的量，如(von Lintig J等人，Plant J.，12625-634，1997)所述進行RT-PCR。使用寡(dT17)引物及Superscript逆轉錄酶(Gibco，德國)進行逆轉錄。使用β-diox II的上遊引物5』-CTGCAAACGGACCGACCACGT-3』(SEQ ID NO12)和下遊引物5』-GCAAATCTATCGAAGATCGAG-3(SEQ ID NO13)及Taq聚合酶(Pharmacia，弗賴堡，德國)進行PCR。使用跨越內含子的上遊引物5』-GACTTCATCCGCCACCAGTC-3』(SEQ ID NO14)和下遊引物5』-CACCAGGAACTTCTTGAATCCG-3』(SEQ ID NO15)研究組成性表達的核糖體蛋白質rp49的mRNA水平作為內部對照。作為β-diox和rp49的兩個單獨引物測定法進行PCR，並在一個測定法中聯合所有四種引物。由大腸桿菌提取β-胡蘿蔔素和類視黃質及HPLC分析在安全紅光下在50ml燒瓶中在LB培養基中培養大腸桿菌菌株直至培養物的OD600達到1。加入L-阿拉伯糖(0.2％w/v)誘導β-diox的表達達6小時或16小時。然後離心收穫細菌。通過如下方案抽提沉澱A.將沉澱重懸於200μl 6M甲醛，並於30℃保溫2分鐘，然後加入2ml二氯甲烷。用4ml正己烷萃取胡蘿蔔素和類視黃質3次。將收集的有機相蒸發，並溶於HPLC溶劑。B.將沉澱重懸於2ml 1M NH2OH(溶於50％甲醇)，並於30℃保溫10分鐘。用石油醚萃取3次。將收集的有機相在N2流下乾燥，並溶於HPLC溶劑。在配備multi-diode-array即多重二極體陣列(166型，Beckman)和System Gold Nouveau軟體(Beckman，美國)的System Gold(Beckman)上的Hypersil 3μm(Knaur，德國)上進行HPLC分析。HPLC溶劑A(正己烷/乙醇99.75∶0.25)用於視黃醛，溶劑B(正己烷/乙醇99.5∶0.5)用於視黃醛肟。參照物全-反式、13-順式、和9-順式視黃醛購自Sigma(德國)；11-順式視黃醛由適應黑暗的牛眼分離。分別通過NaBH4的還原或與NH2OH的反應來獲得相應的視黃醇和肟。為了將摩爾量量化，用確定量的參照物衡量峰積分。由小鼠不同組織製備總RNA為了實驗，處死7周齡的BALB/c小鼠(雄性和雌性)，手工解剖不同組織(結腸、小腸、胃、脾、腦、肝、心、腎、肺、和睪丸)，並立即在液氮中冷凍。每種組織取50-100mg，用杵在研缽中用液氮勻漿，並使用RNeasy Kit即RNA簡易試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)分離總RNA。通過分光光度法測定分離的總RNA的濃度。由小鼠克隆編碼β-diox同源蛋白的cDNA為了克隆編碼推定小鼠β-胡蘿蔔素雙加氧酶的全長cDNA，使用5』/3』RACE試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，曼海姆，德國)進行RACE-PCR。使用500ng由肝分離的總RNA、寡dT錨定引物、及Superscript逆轉錄酶(Life Technologies公司)進行逆轉錄。使用錨定引物和用於β，β-胡蘿蔔素-15，15』雙加氧酶(β-diox I)的特異上遊引物5』-ATGGAGATAATATTTGGCCAG-3』(SEQ ID NO22)或用於β-diox II的特異上遊引物5』-ATGTTGGGACCGAAGCAAAGC-3(SEQ ID NO24)及Expand PCR System即擴增PCR系統(Roche MolecularBiochemicals)進行PCR。將PCR產物連接到載體pBAD-TOPO(Invitrogen，荷蘭)中，產生質粒pDiox I和pDiox II。小鼠中β-胡蘿蔔素雙加氧酶的組織特異性表達如(von Lintig J、Welsch R、Bonk M、Giuliano G、BatschauerA、和Kleinig H，Plant J.，12625-634，1997)所述，使用由不同組織分離的總RNA(100ng)進行RT-PCR。使用如下引物組。β-dioxI上遊引物5』-ATGGAGATAATATTTGGCCAG-3』(SEQ ID NO22)和下遊引物5』-AACTCAGACACCACGATTC-3』(SEQ ID NO23)；β-diox II上遊引物5』-ATGTTGGGACCGAAGCAAAGC-3』(SEQ ID NO24)和下遊引物5』-TGTGCTCATGTAGTAATCACC-3』(SEQ ID NO25)。使用上遊引物5』-CCAACCGTGAAAAGATGACCC-3』(SEQ ID NO26)和下遊引物5』-CAGCAATGCCTGGGTACATGG-3』(SEQ ID NO27)分析β-肌動蛋白的mRNA作為各RNA樣品完整性的對照。酶活性的體外測定將質粒pDiox II轉化到大腸桿菌菌株XL1-blue(Stratagene公司)中以異源表達β-diox II多肽。於28℃培養細菌直至A600達到1.0。然後加入L-(+)-阿拉伯糖至終濃度0.8％(w/v)，並將細菌繼續培養3小時。收穫細菌之後，用弗氏壓碎器將它們在含50mM Tricine/KOH(pH7.6)、100mM NaCl、和1mM二硫蘇糖醇的緩衝液中破碎。將粗提物以20,000xg離心20分鐘。於4℃將上清液對相同緩衝液透析1小時。如(Nagao A、During A、Hoshino C、Terao J、Olson JA，Arch.Biochem.Biophys.，32857-63，1996)所述，加入吐溫40微團中的β-胡蘿蔔素(測定法中的終濃度是300μM β-胡蘿蔔素和0.2％吐溫40)來測定粗提物(100μg總蛋白)中的酶活性。然後如(von Lintig J和Vogt K，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)提取親脂性化合物並進行HPLC分析。表達來自小鼠的兩類不同β-胡蘿蔔素雙加氧酶、積累β-胡蘿蔔素和番茄紅素的大腸杆茵菌株的HPLC分析將質粒pDiox I和pDiox II轉化到適當的大腸桿菌菌株中。培養條件和胡蘿蔔素及其切割產物的分析如先前所述(von Lintig J和VogtK，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)。切割產物的LC-MS和GC-MS質譜將大腸桿菌菌株培養過夜，並離心收穫細菌。對於固相提取，將SPME注射器(100μm PDMS，Supelco，Deisenhofen，德國)在上清液中保溫15分鐘。然後將吸附至固相的化合物直接進行GC-MS(GCHewlett-Packard 6890；MSHewlett-Packard 5973(70eV)，Waldbronn，德國)，溫度程序為由起始100℃以6℃/分鐘升至300℃。使用DB-1(30m x 0.25mm x 0.25μm薄膜厚度，JW，Folsom，加拿大)作為柱，氦作為運載氣體。對於LC-MS分析，如先前所述(von LintigJ和Vogt K，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)，在存在羥胺時抽提細菌沉澱。在HP1100 HPLC模塊系統(Hewlett Parckard。Waldbronn，德國)上進行LC/MS，該系統偶聯配備APcI界面(常壓化學離子化)的Micromass(曼徹斯特，英國)VG平臺II四極質譜儀。使用二極體陣列檢測儀(DAD)監測uV吸收。MS參數(APcI+型)如下來源溫度120℃；APcI探針溫度350℃；冠3.2kV；高壓透鏡0.5kV；錐電壓30V。以完全掃描模式(m/z 250-1000)作業系統。使用MassLynx 3.2軟體獲取並處理數據。對於峰分離，採用Bischoff(Leonberg，德國)Nucleosil RP-C18柱(5μm，250x4.6mm)並保持於25℃。流動相由乙腈/甲醇85∶15(v/v)混合物(A)和異丙醇(B)組成；梯度％A(分鐘)100(8)-70(10)-70(25)-100(28)-100(32)；流速1ml/分鐘；注射體積20μl。序列比較和系統發生樹分析使用載體NTI Suite 6.0(InforMax公司，牛津，英國)，產生的結果顯示於圖15。
使用化學藥品β-芷香酮(Roth，卡爾斯魯厄，德國)、12』-β-阿樸胡蘿蔔素醛(BASF，路德維希港，德國)、和8』-β-阿樸胡蘿蔔素醛(Sigma，Deisenhofen，德國)。結果搜索昆蟲EST庫以尋找vp14即植物類胡蘿蔔素切割酶的同源物，發現了來自黑腹果蠅的已發表EST片段(編號AI063857)。為了克隆全長cDNA和直接測試β-胡蘿蔔素雙加氧酶I活性，通過導入來自細菌草生歐文氏茵的一套β-胡蘿蔔素生物合成基因(Hundle BS等人，S.a.)來構建能夠合成並積累β-胡蘿蔔素的大腸桿菌。該方法能夠通過茵落由黃色(β-胡蘿蔔素)褪至幾乎白色(類視黃質)來檢測類視黃質的形成，並提供了一種用於鑑定β-胡蘿蔔素雙加氧酶I活性的快速且有效的體外測試系統。為此目的，由果蠅頭部分離總RNA併合成cDNA。使用衍生自EST片段的特異寡核苷酸和dT17錨定寡核苷酸進行RACE-PCR。將得到的PCR產物直接克隆到表達載體pBAD-TOPO中，並轉化到所述大腸桿菌菌株中。將細胞塗布在含0.2％L-阿拉伯糖的LB培養基上以誘導推定β-胡蘿蔔素雙加氧酶I的表達之後，找到幾個幾乎白色的菌落並進行進一步分析(圖2)。在安全紅光下進行過夜培養，以使光氧化作用引起的β-胡蘿蔔素的異構化作用和非特異切割最小化。提取β-胡蘿蔔素和類視黃質並進行HPLC分析。僅用載體轉化的對照菌株缺乏切割β-胡蘿蔔素的能力，而且連痕量的類視黃質都檢測不到。但是表達果蠅cDNA的細菌除了β-胡蘿蔔素以外還包含顯著量的類視黃質(圖3a)。通過停留時間(retention time)以及與真實標準物的共層析和通過它們的吸收光譜來鑑定類視黃質(圖4)。佔優勢的視黃醛異構體是全-反式形式，只有大約20％的13-順式形式。根據誘導後細菌的培養時間，還可能檢測到顯著量的全-反式視黃醇和13-順式視黃醇以及這些視黃醇異構體的酯。所發現的類視黃質異構體與它們的β-胡蘿蔔素前體的異構組成是一致的，後者是通過分開的HPLC系統來鑑定的。為了確認視黃醛的形成和改進類視黃質的產量以及分離它們的異構體，還在存在羥胺時進行抽提。圖3b顯示，這種處理導致全-反式和13-順式視黃醛肟的形成，伴隨其吸收光譜的相應藍移。分析證明，除了視黃醛以外，大腸桿菌中還形成顯著量的視黃醇和視黃基酯(表1)。問題是，大腸桿菌是否還能夠由視黃醛生成視黃酸。為了分析視黃酸的形成，裂解細胞並使用已確立方案(Thaller C和Eichele G，Nature，327625-62814，1987)在HPLC系統上分析提取物。結果揭示，在這些條件下，在大腸桿菌中能夠檢測到顯著量的視黃醛和視黃醇，但是沒有形成視黃酸。
表1大腸桿菌(-)菌株 大腸桿菌(+)菌株全-反式視黃醛n.d. 4.713-順式視黃醛n.d. 1.5全-反式視黃醇n.d. 8.013-順式視黃醇n.d. 2.4n.d. 1.8∑類視黃質 -18.4β-胡蘿蔔素 56.0 21.4n.d.檢測不到來自細菌培養物(於28℃培養16小時)的大腸桿菌(+)菌株和大腸桿菌(-)茵株中β-胡蘿蔔素和類視黃質的摩爾量(pmol/mg乾重)。
總之，這些結果證明克隆的cDNA編碼β-胡蘿蔔素雙加氧酶，相應的，將其命名為β-diox I。既然在大腸桿菌測試系統中唯獨發現類視黃質即C20化合物，因而可以推測對β-胡蘿蔔素的中央切割得到催化，導致兩個分子視黃醛的形成。
為了進一步分析β-diox I的酶特性，將cDNA克隆到表達載體pGEX-4T-1中並表達成融合蛋白。為了排除與穀胱甘肽-S-轉移酶的N端融合會消除酶活性的可能性，將構建物(β-diox-gex)轉化到合成β-胡蘿蔔素的大腸杆茵菌株中。使用上文所述測試法，可以顯示類視黃質的形成程度與未融合β-diox I相同(未顯示數據)。在大腸桿菌中表達β-diox-gex之後，通過親和層析純化蛋白質。無需加入去汙劑就可實現純化，說明融合蛋白是可溶的，而且與膜不是緊密相連的。為了測試體外酶活性，將1μg純化蛋白質在含0.05％屈立通X100的測定法中在存在β-胡蘿蔔素時保溫2小時。為了分析形成的產物，加入羥胺/甲醇終止反應，並在抽提後通過HPLC分析產物。分析揭示了視黃醛的形成(圖5)。在測定法中加入FeSO4/抗壞血酸導致切割產物的形成增加(圖5A)，而加人EDTA可以抑制β-胡蘿蔔素向視黃醛的轉變(圖5C)。這些結果指示，雙加氧酶的酶促活性依賴鐵，正如在動物來源的幾種體外系統中所報導的。總之，迄今為止在大腸桿菌中鑑定的β-diox II酶活性同樣可以在體外用純化蛋白質進行測量，並導致相同產物的形成。
序列分析揭示，該cDNA編碼620個胺基酸的蛋白質(SEQ ID NO2)，計算分子量69.9kDa(圖6)。推導胺基酸序列與植物類視黃質雙加氧酶vpl4、來自少動假單胞茵(Pseudomonas paucimobilis)的木質素芪合酶、和藍細菌集胞藍細菌屬(Synechocystis)中功能未知的幾種蛋白質享有序列同源性。然而，發現與RPE65(來自脊椎動物視網膜色素上皮的一種蛋白質，首次描述於牛眼)有最高序列同源性。RPE65與β-diox I展示36.7％的整體序列同一性。使用程序Map進行的β-diox I推導胺基酸序列、RPE65、與vp14的比對顯示獨特樣式的保守區(圖7)。與RPE65和vp14相比，昆蟲蛋白質接近C端具有長延伸。植物蛋白質vp14相對於其動物同源物的N端延伸很有可能歸因於用於質體輸入的靶序列。β-diox II與細菌和植物雙加氧酶的序列同源性說明，我們正在研究存在於細菌、植物、和動物中的一種新型雙加氧酶。
通過RT-PCR研究β-diox I mRNA的表達模式。如圖8所示，mRNA唯獨限於頭部，而通過這種方法在胸部和腹部檢測不到β-diox ImRNA。雖然果蠅將3-羥基視黃醛用於視覺，但據顯示除了3-羥基類視黃質(玉米黃質和黃體素)以外，β-胡蘿蔔素也可作為合適前體。另外，已經證明果蠅能夠在β-芷香酮環第3位羥化視黃醛並形成非常見對映體(3S)-3-羥基視黃醛，它是環裂cyclorrhaph果蠅的獨特發色團。這些結果證明，在果蠅中，β-胡蘿蔔素切割和類視黃質的進一步代謝以及視覺循環都位於身體的相同部分。編碼新型胡蘿蔔素雙加氧酶(β-diox II)的cDNA的克隆為了克隆編碼推定β-胡蘿蔔素雙加氧酶的cDNA，我們搜索了小鼠EST資料庫並找到了與迄今為止由果蠅鑑定的β-diox I具有顯著肽序列相似性的兩個EST片段。一個EST片段(AWO44715)編碼小鼠β-dioxI(Redmond TM、Gentleman S、Duncan T、Yu S、Wiggert B、GanttE、和Cunningham FX Jr.，J.Biol.Chem.，在線，2000)，另一個(AW611061)與果蠅、雞、和小鼠β-diox I及小鼠RPE65具有顯著相似性。然而，它不是同一的，因而成為這類雙加氧酶的一種迄今未知的新代表。為了獲得全長cDNA，我們設計了由EST片段推導的上遊引物。然後我們在衍生自7周齡BALB/c雄性小鼠肝臟的總RNA製劑上進行了RACE-PCR。將PCR產物克隆到載體pBAD-TOPO中，並進行序列分析。cDNA(SEQ ID NO16)編碼532個胺基酸的蛋白質。序列比較揭示，推導胺基酸序列(SEQ ID NO17)與小鼠β，β-15，15』-雙加氧酶(β-dioxI)享有39％的序列同-性(圖10)。找到了幾個高度保守的胺基酸序列和可能涉及結合輔因子Fe2+的六個保守組氨酸，表明所編碼的蛋白質屬於相同類型的酶。因而，除了β-diox I和RPE65以外，在小鼠中還存在第3種多烯鏈雙加氧酶即β-diox II。新型胡蘿蔔素雙加氧酶催化β-胡蘿蔔素的不對稱切割而導致β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮的形成為了在功能上鑑定β-diox II，我們將它在大腸桿菌中表達成重組蛋白，並在關於β-diox I所述條件下(Nagao A、During A、HoshinoC、Terao J、Olson JA，Arch.Biochem.Biophys.，32857-63，1996)進行酶活性的體外測試。HPLC分析揭示未能由β-胡蘿蔔素形成類視黃質。但是可以檢測到停留時間為4.6分鐘的一種化合物(圖11A)。當抽提過程中存在羥胺時，該化合物的停留時間由4.6分鐘變成16分鐘，指示該化合物具有醛基，由此可以形成相應的肟(圖11B)。由新型β-胡蘿蔔素雙加氧酶催化的推定β-胡蘿蔔素切割產物在長達2小時的保溫時間裡線性增加。化合物的UV/VIS吸收光譜與β-阿樸胡蘿蔔素醛或β-阿樸胡蘿蔔素醛肟類似(圖11C)。但是根據我們實驗室參照物原液的光譜比較，它們與8』-阿樸胡蘿蔔素醛/肟和12』-β-阿樸胡蘿蔔素醛/肟不相同。這些化合物的UV/VIS光譜與在文獻(Barua AB、和Olson JA，J.Nutr.，1301996-2001，2000)中找到的β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛(424nm)和β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛肟(435nm)的光譜類似。轉換率及由此形成的切割產物的量在體外相當低，正如早就在β-diox中所觀察到的。為了獲得大量的這種物質用於進一步的化學分析，我們決定利用早已成功用於鑑定果蠅β-diox I的大腸桿菌測試系統。表達小鼠β-diox I作為對照。在由β-胡蘿蔔素形成類視黃質的情況下，該測試系統提供了能夠通過細菌由黃色變成幾乎白色的顏色變化而使β-胡蘿蔔素切割可視化的優點。表達小鼠β-diox I的大腸桿菌變成白色，而在表達β-diox II的大腸桿菌中，看不到這種顯著的顏色變化，指示該酶催化在大腸桿菌中形成β-阿樸胡蘿蔔素醛(圖12)。在表達小鼠β-diox II的大腸桿菌菌株中，β-胡蘿蔔素含量顯著降低(22.8pmol/mg乾重，而對照菌株為60.9pmol/mg乾重)。為了鑑定這些化合物，如上所述提取這些化合物並進行HPLC分析。可以鑑定到兩類物質，吸收最大值分別位於424nm和386nm(圖13B和C)。具有相同光譜但停留時間不同的化合物的存在可能是由於所形成產物的立體異構組成和/或由於所形成肟的順式和反式構型。這一結果早在分析果蠅的β-diox I後就獲得了。根據誘導時間不同，首先可以檢測到推定的β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛，然後可檢測到推定的β-10』-阿樸胡蘿蔔素醇，表明在大腸桿菌中醛轉變成相應的醇(未顯示數據)。大腸桿菌中視黃醛向視黃醇的轉變早已通過表達來自果蠅或小鼠的β-diox I就發現了，正如本文所述(圖13A)。為了肯定的鑑定形成的推定β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛，我們將它轉變成相應的β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛肟並對其進行LC-MS分析。因為是在APcI+模式中操作該系統，準分子離子通常表現為[M+H]+信號。通過在m/z 392[M+H]+這是光譜的基峰的準分子離子來鑑定10』-β-阿樸胡蘿蔔素醛肟。偶數號[M+H]+質譜信號清楚證明該化合物中氮的存在，由此可確定羥基轉化成相應的肟。沒有觀察到多烯鏈的片段化(產生特徵性子離子)。另外，在405nm(肩)、424nm、和446nm顯示最大值的特徵性UV光譜符合10』-β-阿樸胡蘿蔔素醛肟的發色團系統，而且與先前報導的光譜數據(Barua AB和0lson JA，J.Nutr.，1301996-2001，2000)是一致的。
由此，由β-胡蘿蔔素形成了β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛。但是通過HPLc未能檢測到應當由對β-胡蘿蔔素9』、10』雙鍵的氧化切割產生的第二種化合物即β-芷香酮。這可以是由於它的揮發性和/或由於它分配到培養基中。因此，我們在固相提取親脂性化合物後通過GC-MS分析了細菌生長培養基。在這種大腸桿菌菌株的培養基中，除了大量的吲哚以外，還可以檢測到顯著量的β-芷香酮，而在大腸桿菌對照菌株中未能發現。總之，這些分析證明β-diox II催化對β-胡蘿蔔素在9』、10』碳雙鍵的不對稱切割，導致β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮的形成。因此，我們將該酶稱為β-β-胡蘿蔔素-9』，10』-雙加氧酶(β-diox II)。但是應當注意的是，來自本文未鑑定的其它來源的β-dioxII可能攻擊其它雙鍵。因此，β-diox II的活性即不對稱切割β-胡蘿蔔素不限於上文公開的9』、10』碳雙鍵。
為了測試該酶是否催化對不同於β-胡蘿蔔素的胡蘿蔔素的氧化切割，我們將它轉化到能夠合成並積累番茄紅素的大腸桿菌菌株中(圖12)。如上所述進行實驗。在該菌株中，能夠檢測到顯著量的推定阿樸番茄紅素醛。這可以通過將醛轉變成相應的肟來顯示(未顯示數據)。因此，這種新型胡蘿蔔素雙加氧酶在大腸桿菌測試系統中同樣催化對番茄紅素的氧化切割，導致阿樸番茄紅素醛(暫時通過它們的UV/VIS光譜來鑑定)的形成。由人和斑馬魚克隆編碼新型胡蘿蔔素雙加氧酶的cDNA為了確認其它後生動物中存在這第二類雙加氧酶，我們在資料庫中搜索具有序列同一性的EST片段。我們找到了來自人和斑馬魚的EST片段。然後我們克隆了全長cDNA並測序。由衍生自人肝的總RNA克隆的cDNA(SEQ ID NO20)編碼556個胺基酸的蛋白質(SEQID NO21)。而由斑馬魚分離的cDNA(SEQ ID NO18)編碼549個胺基酸的蛋白質(SEQ ID NO19)。推導胺基酸序列與小鼠β-diox II享有72和49％的序列同一性。我們進行了基於序列距離法的系統樹計算並利用與後生動物多烯鏈雙加氧酶和植物VP14推導胺基酸序列的鄰接算法。如圖15所示，在脊椎動物中發現了三組多烯鏈雙加氧酶-兩類不同的β-胡蘿蔔素雙加氧酶(I和II)和RPE65。在果蠅和Caenorhabditiselegans中，在整個基因組中只找到了一類雙加氧酶(I)。根據大腸桿菌測試系統的判斷，C.elegans雙加氧酶催化對β-胡蘿蔔素的對稱切割而形成視黃醛。序列分析揭示，三種脊椎動物多烯鏈雙加氧酶很有可能來自共同祖先。因此，編碼這類酶的其它基因即β-diox和RPE65的存在顯然與脊椎動物胡蘿蔔素/類視黃質代謝有關。新型胡蘿蔔素雙加氧酶的組織特異性表達我們分析了來自7周齡BALB/c小鼠(雄性和雌性)的幾種組織的總RNA，並通過RT-PCR評估了兩類胡蘿蔔素雙加氧酶的穩定狀態mRNA水平。在小腸、肝、腎、和睪丸中能夠檢測到兩類胡蘿蔔素雙加氧酶mRNA的RT-PCR產物。在脾和腦中還存在該新型胡蘿蔔素雙加氧酶的mRNA，在肺和心中能夠檢測到兩類胡蘿蔔素雙加氧酶的低豐度穩態mRNA水平(圖16)。通過分析β-肌動蛋白mRNA確認了RNA製劑的完整性。通過在測定法中省略逆轉錄酶，可以顯示RT-PCR產物衍生自mRNA而非DNA汙染。通過用人cDNA riboprobe分析的多組織mRNA印跡，我們可以在心和肝中發現新型胡蘿蔔素雙加氧酶的2.2kb信使，而主要在腎中觀察到β-diox II的2.4kb轉錄本(未顯示數據)。反映上述結果的討論依照本發明，果蠅β-diox I是在分子水平上鑑定的第一種β-胡蘿蔔素雙加氧酶。在研究本發明原理的實驗過程中，可以證明有兩種由β-胡蘿蔔素作為底物開始的可替換途徑，其特徵為具有同源β-diox I和II基因類型的不同酶活性。本文公開的信息提供了打開進一步研究動物中類胡蘿蔔素/類視黃質代謝的廣闊領域的鑰匙。
β-diox I編碼620個胺基酸的蛋白質，計算分子量69.9kDa。序列比較揭示β-diox I屬於迄今為止只在細菌和植物中發現的新型雙加氧酶。可以在關於植物類胡蘿蔔素切割酶vp14所報導的相同條件下測量β-diox I的酶活性，前者在ABA生物合成途徑中負責切割9-順式-新黃素。在動物中，已經報導了β-胡蘿蔔素雙加氧酶活性依賴鐵。向測定法中加入FeSO4/抗壞血酸導致酶活性升高，而加入EDTA顯著減少視黃醛的形成。可以不加入輔因子諸如硫醇試劑或電子受體而測量酶活性。這指示β-diox II依賴Fe2+，而且酶活性不需要其它輔因子，正如關於植物vp14所報導的。既然β-胡蘿蔔素在水性環境下是不溶的，就在存在0.05％屈立通X100時進行酶活性的測試。在體內，β-胡蘿蔔素是不能自由擴散的，而是必須結合親脂性結構諸如膜或結合蛋白。因此，問題是β-diox是否結合膜而與其親脂性底物發生相互作用。可以無需加入去汙劑而純化β-diox融合蛋白，這針對的是它的可溶狀態而非膜結合拓撲學。但是融合蛋白的穀胱甘肽-S-轉移酶部分也可能有助於它的可溶性。既然果蠅的視覺發色團是3-羥基視黃醛，我們測試了β-diox I是否能夠使用玉米黃質作為底物而直接形成這種羥化類視黃質，但是在我們所應用的條件下，該酶未能催化這種反應。另外，我們在積累玉米黃質的大腸桿菌菌株中表達β-diox I，但是只能夠檢測到未羥化類視黃質的形成。在這種大腸桿菌菌株中，發現了顯著量的β-胡蘿蔔素即玉米黃質的直接前體，它可以作為β-diox I的底物。這一結果的解釋可能在於果蠅能夠在β-芷香酮環第3位羥化視黃醛的事實。總之，我們能夠顯示β-diox I催化對β-胡蘿蔔素的對稱切割。
β-diox I基因位於果蠅基因組中3號染色體的87F。已經通過細胞學方法將果蠅突變體ninaB正好定位在這一區域(FlyBase Mapseotion 87)。在所有類型的光受體中，突變體表型具有降低的視紫質含量。但是可以通過飲食添加視黃醛來挽救突變體表型，而甚至更高劑量的β-胡蘿蔔素卻不能。視覺色素髮色團的有效性和視黃酸對視覺色素蛋白質模塊(視蛋白)的轉錄調控二者都依賴β-diox II酶活性。因此，似乎有可能ninaB表型是由β-diox I中的突變引起的。
發現β-diox I與RPE65(首次描述於牛眼的一種多邊合作)有最高序列同源性。因此，問題是RPE65是否是β-diox I的脊椎動物相應物。雖然尚不知道RPE65的準確功能，已經有人提出它在維生素A代謝中發揮作用，最近發現該基因中的突變對人早期發作視黃醛營養不良的嚴重形式負有責任。在破壞了RPE65基因的小鼠眼中，全-反式維生素A發生積累。由此得出結論，RPE65參與哺乳動物視覺循環中維生素A全-反式向11-順式的異構化。但是由RPE-膜級分除去RPE65之後，全-反式視黃醇向11-順式視黃醇的異構化不受影響。根據我們的知識，在RPE中從未報導過β-胡蘿蔔素雙加氧酶活性，在脊椎動物的眼中也從未測量到顯著量的它的底物β-胡蘿蔔素。我們在所述測試系統中表達了通過RT-PCR由牛RPE克隆的RPE65，但是未能檢測到類視黃質的形成或偏心切割產物諸如阿樸胡蘿蔔素醛的形成。因此，RPE65的準確功能仍需進一步研究，我們推測其它尚未發現的具有不同組織特異性(小腸、肝)的該家族成員負責脊椎動物β-胡蘿蔔素雙加氧酶活性。β-diox I與RPE65以及植物和細菌雙加氧酶的序列同源性說明我們正在研究催化切割共軛碳雙鍵的新型雙加氧酶。這種反應類型涉及對類胡蘿蔔素的切割以及多種其它化合物。所述大腸杆茵測試系統提供了鑑定涉及類視黃質形成的新基因和篩選本發明酶的潛在激動劑或拮抗劑的有力工具。另外，生成類視黃質的大腸杆茵菌株可成功的用於鑑定胡蘿蔔素/類視黃質代謝的其它步驟。
依照本發明的另一方面，我們報導了來自小鼠、人、和斑馬魚且催化對β-胡蘿蔔素的不對稱切割的第二種新型胡蘿蔔素雙加氧酶的克隆、鑑定、和組織特異性表達。通過在合成β-胡蘿蔔素的大腸杆茵茵株中表達該酶，顯示了由β-胡蘿蔔素形成β-阿樸胡蘿蔔素醛。可以通過吸收光譜、醛向相應肟的轉變、和通過LC-MS或GC-MS來鑑定所形成的切割產物是β-10』-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮。在體外，酶催化與大腸桿菌測試系統中相同的反應。因此，所鑑定的酶催化對其底物β-胡蘿蔔素的多烯主鏈中9』、10』雙鍵的氧化切割。
除了上文討論的與β-diox I的整體序列同一性以外，還存在獨特保守樣式的組氨酸殘基，它們可能涉及輔因子Fe2+的結合。因而，包括RPE65在內，在脊椎動物中發現了多烯鏈雙加氧酶家族的三種不同代表。RPE65蛋白質的生化功能仍待闡明，我們顯示除了對β-胡蘿蔔素的對稱切割以外還發生不對稱切割，斷然解決了關於這種反應的意義的爭論。關於組織特異性表達的分析顯示，在幾種組織(如小腸和肝)中-起發現了兩類酶的mRNA。這些發現在分子水平上確認了在相同組織中存在對β-胡蘿蔔素的對稱和不對稱切割二者這一生化結果。小鼠與人中的表達模式是不一致的。這可能是由於胡蘿蔔素代謝的物種間差異，或是反映所研究個體的年齡和營養狀況的差異，因而有可能存在另一種因素可用於解釋在幾次研究中獲得的相互矛盾的結果。在用組織勻漿物進行的早期研究中，可以發現由不對稱切割β-胡蘿蔔素產生的不同鏈長的多種β-阿樸胡蘿蔔素醛。因此，幾位作者將術語隨機切割用於這種反應。在這裡，我們顯示了酶β-diox II不催化這種副反應，而是對9』、10』雙鍵特異的。在體外發現的不同於10』-β-阿樸胡蘿蔔素醛的β-阿樸胡蘿蔔素醛的形成可能是由初級切割產物的進一步代謝或其它尚不知道的胡蘿蔔素雙加氧酶引起的。但是難以獲得後生動物多烯鏈雙加氧酶的體外活性，而且已經報導了在水性環境中通過非酶促降解而由β-胡蘿蔔素形成β-阿樸胡蘿蔔素醛(Henry LK、Puspitasari-Nienaber NL、Jaren-Galan M、van Breemen RB、Catignani GL、和Schwartz SJ，J.Agric.Food Chem.，485008-5013，2000)在對編碼這種新型胡蘿蔔素雙加氧酶(β-diox II)的cDNA進行分子鑑定之後，即產生了其在脊椎動物胡蘿蔔素代謝中的生理學相關性的問題。已經在大鼠和雞中顯示β-阿樸胡蘿蔔素醛可以是RA形成的生物學活潑前體。在吸收這些化合物之後，首先形成相應的酸，然後變短產生視黃酸。相同研究還顯示只有小部分的β-阿樸胡蘿蔔素醛受到β-diox的攻擊而產生視黃醛。這種可能性對於考慮如本文所述在幾種組織中共表達兩類雙加氧酶而言可能是重要的。還發現幾種組織能夠合成RA，而且發現視黃醛即對稱切割β-胡蘿蔔素的初級產物並不是中間物。通過分析由β-阿樸胡蘿蔔素醛形成RA，提出了與脂肪酸β-氧化相似的機制。在這些研究中，通過給予檸檬醛-視黃醛脫氫酶(催化將視黃醛氧化成RA)的有效抑制劑，可以確保了由β-阿樸胡蘿蔔素醛形成RA。因此，不對稱切割反應很有可能代表RA形成另外途徑的第一步，而且可能有助於身體、某些組織、或細胞中的RA穩態。由不對稱切割β-芷香酮產生的第二種產物已知是植物香氣化合物。這種短鏈化合物是揮發性的，而在動物中的推定生理學作用仍待研究。
在果蠅中，維生素A是專一地通過對稱切割反應而形成的。在脊椎動物中，發現有兩類不同的胡蘿蔔素雙加氧酶β-diox I和β-diox II以及RPE65蛋白質。序列比較顯示，脊椎動物雙加氧酶來自共同祖先。與果蠅相反，在脊椎動物中，RA在發育和細胞分化中發揮重要作用。因而，不同β-胡蘿蔔素雙加氧酶的存在可能與RA作用的出現有關。通過斑馬魚胚胎的原位雜交，在原腸胚形成之前發現了β-diox的斑馬魚同源物的高穩態mRNA水平。只在器官形成之後可檢測到β-胡蘿蔔素-9』，10』-雙加氧酶的斑馬魚同源物。關於小鼠已經報導了在發育早期發現有β-diox I的高穩態mRNA水平(Redmond TM、Gentleman S、DuncanT、Yu S、Wiggert B、Gantt E、和Cunningham FX Jr.，J.Biol.Chem.，在線，2000)。這表明，由對稱氧化切割反應催化的由β-胡蘿蔔素形成類視黃質可能有助於胚胎中的類視黃質穩態。因此，除了母源預先形成的維生素A，由維生素原開始的從頭生物合成似乎是發育過程中類視黃質的重要來源。但是不對稱切割反應在發育晚期在某些組織中可能有助於RA形成。關於這一點，β-diox II在腦和肺中的表達可能是有關聯的。在神經系統的細胞分化過程中，RA發揮重要作用。在雪貂模型中，在某些條件下，諸如暴露於香菸的煙霧，報導了β-胡蘿蔔素對肺的毒性。關於這一點，有人爭論對β-胡蘿蔔素的不對稱切割可能涉及這些毒性作用(回顧參閱Russell RM，Am.J.Clin.Nutr.，71878-884，2000)。另外，已經在體外在睪丸、小腸、肝、腎、和肺中發現了可由β-胡蘿蔔素形成RA。在這裡我們顯示，在所有這些組織中發現了編碼兩種不同類型胡蘿蔔素雙加氧酶的mRNA。這說明，除了小腸和肝以外，還有幾種組織可能通過由β-胡蘿蔔素內源形成類視黃質而促進它們自身的RA穩態，這是類視黃質穩態中至今仍被低估、未受賞識的特徵。
正如在大腸桿菌測試系統中所判斷的，該酶能夠催化對番茄紅素的氧化切割。這表明胡蘿蔔素的多烯鏈主鏈在底物特異性方面發揮重要作用，而β-胡蘿蔔素的芷香酮環結構似乎關聯微小。在分析了小鼠β-diox I之後也獲得了這一結果。已經報導了番茄紅素對人健康的有利影響。番茄紅素主要在肝中積累，但也在腸、前列腺、和睪丸(即表達β-diox I和β-diox II二者的mRNA的組織)中積累。對番茄紅素的切割和阿樸番茄紅素醛的形成是脊椎動物生理學中推定作用的指示。在脊椎動物中，存在配體未知的幾種核受體，如孤兒受體。除了在β-胡蘿蔔素切割的情況下可能是RA形成的推定前體之外，可以推測，通過β-胡蘿蔔素和/或番茄紅素的不對稱切割反應形成的化合物還可能代表這些受體的推定配體。
總之，本文呈現的數據對催化β-胡蘿蔔素的不對稱切割的酶即β-胡蘿蔔素-9』，10』-雙加氧酶進行了分子鑑定。因而，除了β-胡蘿蔔素的對稱切割之外，在脊椎動物中還存在第二種酶活性。涉及切割β-胡蘿蔔素的酶的分子鑑定將為研究衍生自胡蘿蔔素的代謝物對動物生理和人類健康的影響開闢了新的道路。
最近幾年，對類視黃質受體及其配體以及它們在發育和細胞分化中的各種作用的了解有了極大進步。憑藉本發明的發現，切割反應對組織分布的影響、類視黃質的異構特異性、和維生素A攝取的調控不久可能得到進一步闡明。
另外，編碼β-胡蘿蔔素雙加氧酶I和II的cDNA的鑑定對醫學、製藥學、和生物技術的應用具有極大影響。在醫學中，由人或哺乳動物克隆相應基因能夠更詳細的在生理學上表徵哺乳動物胡蘿蔔素/類視黃質代謝，並將影響由維生素A及其衍生物引起的多種作用，由此可提供幾種治療性應用。
已知維生素A缺乏是-個嚴重問題。配備必需調控序列的cDNA可用於在不含類視黃質的生物體諸如大多數植物、大多數細菌、和真菌中進行表達。因此，依照本發明可以在用於食品工藝的農作物和微生物中實現維生素A生產，或更常說的，在至今不含類視黃質但能夠合成維生素A原(β-胡蘿蔔素)的生物體中生產維生素A。
顯然，根據上文傳授，本發明的許多修改和變異是可能的。因此，應當理解，在所附權利要求的範圍內，可以不同於本文具體所述而實踐本發明。
序列表110greenovation Pflanzenbiotechnoloaie GmbH120催化切割β-胡蘿蔔素的雙加氧酶130催化切割β-胡蘿蔔素的雙加氧酶14014115000105822.11512000-03-2015099125895.51511999-12-2416027170PatentIn 2.1版21012112037212DNA213黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)220221CDS222(1)..(1860)4001atg gca gcc ggt gtc ttc aag agt ttt atg cgc gac ttc ttt gcg gtg48Met Ala Ala Gly Val Phe Lys Ser Phe Met Arg Asp Phe Phe Ala Val1 5 10 15aaa tac gat gag cag cga aat gat ccg caa gcg gaa cga ctg gat ggc96Lys Tyr Asp Glu Gln Arg Asn Asp Pro Gln Ala Glu Arg Leu Asp Gly20 25 30aac gga cga ctg tat ccc aac tgc tcg tcg gat gtg tgg ctg cga tcc144Asn Gly Arg Leu Tyr Pro Asn Cys Ser Ser Asp Val Trp Leu Arg Ser35 40 45tgc gag cgg gag ata gtt gat ccc att gag ggc cat cac agc ggg cac192Cys Glu Arg Glu Ile Val Asp Pro Ile Glu Gly His His Ser Gly His50 55 60att ccc aaa tgg ata tgc ggt agt ctg ttg cgc aat gga ccc ggc agc240Ile Pro Lys Trp Ile Cys Gly Ser Leu Leu Arg Asn Gly Pro Gly Ser65 70 75 80tgg aag gtg ggc gac atg acc ttc ggc cat ctg ttc gac tgc tcc gcc288Trp Lys Val Gly Asp Met Thr phe Gly His Leu Phe Asp Cys Ser Ala85 90 95ctg ctg cac cga ttt gcc att cgg aat gga cgc gtc acc tac cag aat336Leu Leu His Arg Phe Ala Ile Arg Asn Gly Arg Val Thr Tyr Gln Asn100 105 110cgc ttc gtg gac acg gaa aca ctg cga aag aat cgc tct gcc cag cgg384Arg phe Val Asp Thr Glu Thr Leu Arg Lys Asn Arg Ser Ala Gln Arg115 120 125att gtg gtc acg gag ttt ggc aca gct gct gtt ccg gat ccc tgt cac432Ile Val Val Thr Glu Phe Gly Thr Ala Ala Val Pro Asp Pro Cys His130 135 140tcg atc ttc gat aga ttt gcg gcc att ttt cga ccg gat agt gga acg480Ser Ile Phe Asp Arg Phe Ala Ala Ile Phe Arg Pro Asp Ser Gly Thr145 150 155 160gat aac tcg atg att tcc ara tat cct ttc ggg gat cag tat tac aca528Asp Ash Ser Met Ile Ser Ile Tyr Pro Phe Gly Asp Gln Tyr Tyr Thr165 170 175ttt acg gag acg cct ttt atg cat aga ata aat ccc tgc act ttg gcc576Phe Thr Glu Thr Pro Phe Met His Arg Ile Ash Pro Cys Thr Leu Ala180 185 190acc gaa gca cga atc tgc acc acc gac ttc gtg ggc gtg gtg aac cac624Thr Glu Ala Arg Ile Cys Thr Thr Asp Phe Val Gly Val Val Asn His195 200 205aca tcg cat ccg cat gtt ctt ccc agt ggc act gtc tac aac ctg ggc672Thr Ser His Pro His Val Leu Pro Ser Gly Thr Val Tyr Asn Leu Gly210 215 220acc aca atg acc aga tct gga ccg gca tac act ata crc agt ttc ccg720Thr Thr Met Thr Arg Ser Giy Pro Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Phe Pro225 230 235 240cac ggc gag cag atg ttc gag gat gct cat gtg gtg gcc aca ctg ccg768His Gly Glu Gln Met Phe Glu Asp Ala His Val Val Ala Thr Leu Pro245 250 255tgc cgc tgg aaa ctg cat ccc ggt tat atg cac acc ttc ggc tta acg816Cys Arg Trp Lys Leu His Pro Gly Tyr Met His Thr Phe Gly Leu Thr260 265 270gat cac tac ttt gtg att gtg gag cag ccg ttg tcc gtt tcg ctt acg864Asp His Tyr Phe Val Ile Val Glu Gln Pro Leu Ser Val Ser Leu Thr275 280 285gag tat atc aaa gcc cag cra ggt gga cag aat tta tcg gcg tgt crc912Glu Tyr Ile Lys Ala Gln Leu Gly Gly Gln Asn Leu Ser Ala Cys Leu290 295 300aag tgg ttc gag gat cga ccg aca cra ttt cac ctt ata gat cgg gtt960Lys Trp Phe Glu Asp Arg Pro Thr Leu Phe His Leu Ile Asp Arg Val305 310 315 320tcc ggc aaa ctg gtg cag acc tac gaa tcg gaa gcc ttc ttc tac ctg1008Ser Gly Lys Leu Val Gln Thr Tyr Glu Ser Glu Ala Phe Phe Tyr Leu325 330 335cac arc atc aac tgc ttt gaa cgg gat ggc cac gtg gtg gtg gac att1056His Ile Ile Asn Cys Phe Glu Arg Asp Gly His Val Val Val Asp Ile340 345 350tgc agc tac agg aat ccc gag atg atc aac tgc atg tat ctg gag gcc1104Cys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Met Ile Asn Cys Met Tyr Leu Glu Ala355 360 365att gcc aat atg caa acg aat ccc aat tat gct acc crc ttt cgt gga1152Ile Ala Asn Met Gln Thr Asn Pro Asn Tyr Ala Thr Leu Phe Arg Gly
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RT-PcR下遊引物40013gcaaatctat cgaagatcga g 212101421120212DNA213人工序列220223人工序列的描述衍生自核糖體蛋白質rp49的rp49 RT-PCR上遊引物40014gacttcatcc gccaccagtc 202101521122212DNA213人工序列220223人工序列的描述衍生自核糖體蛋白質rp49的rp49 RT-PCR下遊引物40015caccaggaac ttcttgaatc cg 22210162111855212DNA213小家鼠(Mus musculus)220221CDS222(1)..(1596)40016atg ttg gga ccg aag caa agc ctg cca tgc att gcc cca ctg ctg acc 48Met Leu Gly Pro Lys Gln Ser Leu Pro Cys Ile Ala Pro Leu Leu Thr1 5 10 15acg gcg gag gag act ctg agt gct gtc tct gct cgg gtc cga gga cat 96Thr Ala Glu Glu Thr Leu Ser Ala Val Ser Ala Arg Val Arg Gly His20 25 30att cct gaa tgg ctt aat ggt tat cta crt cga gtt gga cct ggg aag 144Ile Pro Glu Trp Leu Asn Gly Tyr Leu Leu Arg Val Gly Pro Gly Lys35 40 45ttt gaa ttt ggg aag gat aga tac aat cat tgg ttt gat gga atg gcg 192Phe Glu Phe Gly Lys Asp Arg Tyr Asn His Trp Phe Asp Gly Met Ala50 55 60ttg ctt cac cag ttc cga atg gag agg ggc aca gtg aca tac aag agc 240Leu Leu His Gln Phe Arg Met Glu Arg Gly Thr Val Thr Tyr Lys Ser65 70 75 80aag ttt 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370 375 380Tyr Ser Ser Ala Ser Ala Val Lys Gln Gly Asp Gly Glu Ile Trp Cys385 390 395 400Ser Pro Glu Asn Leu His His Glu Asp Leu Glu Glu Glu Gly Gly Ile405 410 415Glu Phe Pro Gln Ile Asn Tyr Gly Arg Phe Asn Gly Lys Lys Tyr Ser420 425 430Phe Phe Tyr Gly Cys Gly Phe Arg His Leu Val Gly Asp Ser Leu Ile435 440 445Lys Val Asp Val Thr Asn Lys Thr Leu Arg Val Trp Arg Glu Glu Gly450 455 460Phe Tyr Pro Ser Glu Pro Val Phe Val Pro Val Pro Gly Ala Asp Glu465 470 475 480Glu Asp Ser Gly Val Ile Leu Ser Val Val Ile Thr Pro Asn Gln Ser485 490 495Glu Ser Asn Phe Leu Leu Val Leu Asp Ala Lys Ser Phe Thr Glu Leu500 505 510Gly Arg Ala Glu Val Pro Val Gln Met Pro Tyr Gly Phe His Gly Thr515 520 525Phe Val Pro Ile530210182112134212DNA213Danio rerio220221CDS222(29)..(1675)40018aagatagcaa tccataacac ctaaagtc atg tct aca tct gca aat gat caa52Met Ser Thr Ser Ala Asn Asp Gln1 5atg tat aaa gtg cca gct aac aaa aaa cgt cca tct gcc agc ggc ctg 100Met Tyr Lys Val Pro Ala Asn Lys Lys Arg Pro Ser Ala Ser Gly Leu10 15 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45gtc tgg gga cat ttt cct aag tgg ctc aat ggc tct cra ctt cga att192Val Trp Gly His Phe Pro Lys Trp Leu Asn Gly Ser Leu Leu Arg Ile50 55 60gga cct ggg aaa ttc gag ttt ggg aag gat aag tac aat cat tgg ttt240Gly Pro Gly Lys Phe Glu Phe Gly Lys Asp Lys Tyr Asn His Trp Phe65 70 75 80gat ggg atg gcg ctg crt cac cag ttc aga atg gca aag ggc aca gtg288Asp Gly Met Ala Leu Leu His Gln Phe Arg Met Ala Lys Gly Thr Val85 90 95aca tac agg agc aag ttt cta cag agt gat aca tat aag gcc aac agt336Thr Tyr Arg Ser Lys Phe Leu Gln Ser Asp Thr Tyr Lys Ala Asn Ser100 105 110gct aaa aac cga att gtg atc rca gaa ttt ggc aca ctg gct crc ccg384Ala Lys Asn Arg Ile Val Ile Ser Glu Phe Gly Thr Leu Ala Leu Pro115 120 125gat cca tgc aag aat gtt ttt gaa cgt ttc atg tcc agg ttt gag ctg432Asp Pro Cys Lys Asn Val Phe Glu Arg Phe Met Ser Arg Phe Glu Leu130 135 140cct ggt aaa gct gca gcc atg act gac gat act aat gtc aac tat gtg480Pro Gly Lys Ala Ala Ala Met Thr Asp Asp Thr Asn Val Asn Tyr Val145 150 155 160cgg tac aag ggt gat tac tac crc tgc acc gag acc aac ttt atg aat528Arg Tyr Lys Gly Asp Tyr Tyr Leu Cys Thr Glu Thr Asn Phe Met Asn165 170 175aaa gtg gac att gaa act ctg gaa aaa aca gaa aag gta gat tgg agc576Lys Val Asp Ile Glu Thr Leu Glu Lys Thr Glu Lys Val Asp Trp Ser180 185 190aaa ttt att gct gtg aat gga gca act gca cat cct cat tat gac ccg624Lys Phe Ile Ala Val Asn Gly Ala Thr Ala His Pro His Tyr Asp Pro195 200 205gat gga aca gca tac aat atg ggg aac tcc ttt ggg cca tat ggt ttc672Asp Gly Thr Ala Tyr Asn Met Gly Asn Ser Phe Gly Pro Tyr Gly Phe210 215 220tcc tat aag gtt att cgg gtt cct cca gag gag gtg gac ctt ggg gag720Ser Tyr Lys Val Ile Arg Val Pro Pro Glu Glu Val Asp Leu Gly Glu225 230 235 240aca arc cat gga gtc cag gtg ata tgt tct att gct tct aca gag aaa768Thr Ile His Gly Val Gln Val Ile Cys Ser Ile Ala Ser Thr Glu Lys245 250 255ggg aaa cct tct tac tac cat agc ttt gga atg aca agg aac tat ata816Gly Lys Pro Ser Tyr Tyr His Ser Phe Gly Met Thr Arg Asn Tyr Ile260 265 270att ttc att gaa caa cct cra aag atg 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gtt att ctt tct 1536Val Pro Ala Pro Gly Thr Asn Glu Glu Asp Gly Gly Val Ile Leu Ser500 505 510gtg gtg arc act ccc aac cag aat gaa agc aat ttt ctc cta gtt ttg 1584Val Val Ile Thr Pro Asn Gln Asn Glu Ser Asn Phe Leu Leu Val Leu515 520 525gat gcc aag aac ttt gaa gag ctg ggc cga gca gag gta cct gtg cag 1632Asp Ala Lys Asn Phe Glu Glu Leu Gly Arg Ala Glu Val Pro Val Gln530 535 540atg cct tat ggg ttc cat ggt acc ttc ata ccc atc tgatgggaca1678Met Pro Tyr Gly Phe His Gly Thr Phe Ile Pro Ile545 550 555accacaaggt ctggaaacta ggtttaaaat aagtgtgcac ttggacataa agactggaga 1738aataaacact gaggactcca aaaggggggc aaggaggaag aggggcaggg gttaaaaagc 1798tacctattga atactatgtt ccctatttgg gtgatgggtt cgttagaagt ccaaacctca 1858gcagcacaca atatactcat gtaacaagcc tgcacatgta ccccagaatt taaaataaaa 1918tttttttttt tttttt 19342l02l211556212PRT213人40021Met Val Tyr Arg Leu Pro Val Phe Lys Arg Tyr Met Gly Asn Thr Pro1 5 10 15Gln Lys Lys Ala Val Phe Gly Gln Cys Arg Gly Leu Pro Cys Val Ala20 25 30Pro Leu Leu Thr Thr Val Glu Glu Ala Pro Arg Gly Ile Ser Ala Arg35 40 45Val Trp Gly His Phe pro Lys Trp Leu Asn Gly Ser Leu Leu Arg Ile50 55 60Gly Pro Gly Lys Phe Glu Phe Gly Lys Asp Lys Tyr Asn His Trp Phe65 70 75 80Asp Gly Met Ala Leu Leu His Gln Phe Arg Met Ala Lys Gly Thr Val85 90 95Thr Tyr Arg Ser Lys Phe Leu Gln Ser Asp Thr Tyr Lys Ala Asn Ser100 105 110Ala Lys Asn Arg Ile Val Ile Ser Glu Phe Gly Thr Leu Ala Leu Pro115 120 125Asp Pro Cys Lys Asn Val Phe Glu Arg Phe Met Ser Arg Phe Glu Leu130 135 140Pro Gly Lys Ala Ala Ala Met Thr Asp Asp Thr Asn Val Asn Tyr Val145 150 155 160Arg Tyr Lys Gly Asp Tyr Tyr Leu Cys Thr Glu Thr Asn Phe Met Asn165 170 175Lys Val Asp Ile Glu Thr Leu Glu Lys Thr Glu Lys Val Asp Trp Ser180 185 190Lys Phe Ile Ala Val Asn Gly Ala Thr Ala His Pro His Tyr Asp Pro195 200 205Asp Gly Thr Ala Tyr Asn Met Gly Asn Ser Phe Gly Pro Tyr Gly Phe210 215 220Ser Tyr Lys Val Ile Arg Val Pro Pro Glu Glu Val Asp Leu Gly Glu225 230 235 240Thr Ile His Gly Val Gln Val Ile Cys Ser Ile Ala Ser Thr Glu Lys245 250 255Gly Lys Pro Ser Tyr Tyr His Ser Phe Gly Met Thr Arg Asn Tyr Ile260 265 270Ile Phe Ile Glu Gln Pro Leu Lys Met Asn Leu Trp Lys Ile Ala Thr275 280 285Ser Lys Ile Arg Gly Lys Ala Phe Ser Asp Gly Ile Ser Trp Glu Pro290 295 300Gln Cys Asn Thr Arg Phe His Val Val Glu Lys Arg Thr Gly Gln Leu305 310 315 320Leu Pro Gly Arg Tyr Tyr Ser Lys Pro Phe Val Thr Phe His Gln Ile325 330 335Asn Ala Phe Glu Asp Gln Gly Cys Val Ile Ile Asp Leu Cys Cys Gln340 345 350Asp Asn Gly Arg Thr Leu Glu Val Tyr Gln Leu Gln Asn Leu Arg Lys355 360 365Ala Gly Glu Gly Leu Asp Gln Val His Asn Ser Ala Ala Lys Ser Phe370 375 380Pro Arg Arg Phe Val Leu Pro Leu Asn Val Ser Leu Asn Ala Pro Glu385 390 395 400Gly Asp Asn Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Thr Ser Ala Ser Ala Val Lys405 410 415Gln Ala Asp Gly Thr Ile Cys Cys Ser His Glu Asn Leu His Gln Glu420 425 430Asp Leu Glu Lys Glu Gly Gly Ile Glu Phe Pro Gln Ile Tyr Tyr Asp435 440 445Arg Phe Ser Gly Lys Lys Tyr His Phe Phe Tyr Gly Cys Gly Phe Arg450 455 460His Leu Val Gly Asp Ser Leu 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1.具有特異切割β-胡蘿蔔素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學活性的分離β-胡蘿蔔素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段。
2.依照權利要求1的β-diox II多肽或其功能片段，其包含選自下組的一種或多種胺基酸序列SEQ ID NO17的第39-47位、第96-118位、第361-368位、和第466-487位，SEQ ID NO19的第55-63位、第112-134位、第378-385位、和第482-503位，SEQ ID NO21的第59-67位、第116-138位、第385-392位、和第490-511位胺基酸序列。
3.依照權利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列胺基酸序列至少45％同一的胺基酸序列。
4.依照權利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列胺基酸序列至少60％同一的胺基酸序列。
5.依照權利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列胺基酸序列至少75％同一的胺基酸序列。
6.依照權利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列胺基酸序列至少90％同一的胺基酸序列。
7.依照權利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有SEQ ID NO17、19、或21中所列胺基酸序列或其部分。
8.依照權利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有由選自下組的DNA序列編碼的胺基酸序列(1)SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18和/或SEQ ID NO20中所列DNA序列或其互補鏈；和(2)SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位DNA序列或其互補鏈；和(3)SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第1160-1183位、和第1472-1537位DNA序列或其互補鏈；和(4)SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位DNA序列或其互補鏈；和(5)在高嚴謹度條件下與(1)、(2)、(3)、和(4)中所定義的DNA序列或其互補鏈發生雜交的DNA序列或其功能片段；和(6)若非遺傳密碼的簡併性將與(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定義的DNA序列發生雜交的DNA序列。
9.包含編碼依照權利要求1-8任一項的β-diox II多肽或其功能片段的DNA序列的DNA分子。
10.包含用於保證β-diox II多肽或其功能片段的表達或者用於測定所述多肽或其功能片段的特徵性核酸的存在的DNA序列的DNA分子，所述多肽或其功能片段具有特異切割β-胡蘿蔔素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學活性，所述核酸選自下組(1)SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18和/或SEQ ID NO20中所列DNA序列或其互補鏈；和(2)SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位DNA序列或其互補鏈；和(3)SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第1160-1183位、和第1472-1537位DNA序列或其互補鏈；和(4)SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位DNA序列或其互補鏈；和(5)在高嚴謹度條件下與(1)、(2)、(3)、和(4)中所定義的DNA序列或其互補鏈發生雜交的DNA序列或其功能片段；和(6)若非遺傳密碼的簡併性將與(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定義的DNA序列發生雜交的DNA序列。
11.依照權利要求9或10的DNA分子，其所包含的DNA序列是cDNA、基因組、或人造DNA序列。
12.依照權利要求9-11任一項的DNA分子，其包含至少一種選擇標記基因或cDNA，它可操作連接允許其在細茵、真菌包括酵母、昆蟲、動物、或植物細胞、種子、組織、或完整生物體中表達的組成性、誘導性、或組織特異性啟動子序列。
13.依照權利要求9-12任一項的DNA分子，其中編碼核苷酸序列與合適質體運輸肽編碼序列相融合，二者都優選在組織特異性或組成性啟動子的控制下表達。
14.包含依照權利要求9-13任一項的一種或多種DNA分子的質粒或載體系統。
15.用於生成β-diox II多肽的方法，包括下列步驟(1)在合適宿主中表達由依照權利要求9-14中任一項的DNA編碼的多肽，並(2)分離所述β-diox II多肽。
16.由權利要求15的方法獲得的蛋白質產品。
17.以適當方式用依照權利要求9-13任一項的DNA分子或者用依照權利要求14的質粒或載體系統轉化或轉染的原核或真核宿主細胞、種子、組織、或完整生物體，所述方式使得所述宿主細胞、種子、組織、或完整生物體能夠表達具有特異切割β-胡蘿蔔素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學活性和/或具有特異結合針對所述多肽或其功能片段所製備的抗體的能力的多肽或其功能片段。
18.依照權利要求17的原核或真核宿主細胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組細菌、真菌包括酵母、昆蟲、動物、和植物細胞、種子、組織、或完整生物體。
19.依照權利要求18的原核宿主細胞或完整生物體，其是選自下組的細菌原細菌，包括α、β、γ、δ、和ε亞門的成員；革蘭氏陽性細菌，包括放線茵綱(Actinomycetes)、硬壁茵門(Firmicutes)、梭茵屬(Clostridium)及其親緣、黃細菌、藍細菌、綠色硫細菌、綠色非硫細菌、和古細菌。
20.依照權利要求19的原核宿主細胞或完整生物體，其屬於選自下組的原細菌類土壤桿菌屬(Agrobacterium)、紅細菌屬(Rhodobacter)、氧化氨的細菌諸如亞硝化單胞茵屬(Nitrosomonas)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、粘細菌(Myxobacteria)諸如粘球菌屬(Myxococcus)，優選金黃色土壤杆茵(Agrobacterium aureus)、莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)、亞硝化單胞茵屬之種(Nitrosomonas sp.)ENI-11、大腸埃希氏茵(Escherichia coli)、和黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)。
21.依照權利要求19的原核宿主細胞或完整生物體，其屬於選自下組的革蘭氏陽性細菌放線茵綱(Actinomycetes)和厚壁茵門(Firmicutes)包括梭茵屬(Clostridium)及其親緣，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)，優選枯草芽孢杆茵(Bacillus subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
22.依照權利要求19的原核宿主細胞或完整生物體，其屬於選自下組的黃細菌擬杆茵屬(Bacteroides)、噬纖維茵屬(Cytophaga)、和黃桿菌屬(Flavobacterium)，優選黃桿菌諸如黃桿菌ATCC 21588。
23.依照權利要求19的原核宿主細胞或完整生物體，其屬於選自下組的藍細菌Chlorococcales，包括集胞藍細菌屬(Synechocystis)和聚球藍細菌屬(Synechococcus)，優選集胞藍細菌屬之種和聚球藍細菌屬之種PS717。
24.依照權利要求19的原核宿主細胞或完整生物體，其屬於選自下組的綠色硫細菌或綠色非硫細菌分別是綠茵屬(Chlorobium)或綠屈撓茵科(Chloroflexaceae)諸如綠屈撓茵屬(Chloroflexus)，分別優選泥生綠茵嗜硫代硫酸鹽小種(Chlorobium limicolaf.thiosulfatophilum)和橙色綠屈撓茵(Chloroflexusaurantiacus)。
25.依照權利要求19的原核宿主細胞或完整生物體，其屬於選自下組的古細菌鹽桿菌科(Halobacteriaceae)諸如鹽桿菌屬(Halobacterium)，優選鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarum)。
26.依照權利要求18的真核宿主細胞或完整生物體，其是選自下組的真菌包括酵母子囊茵門(Ascomycota)包括酵母綱(Saccharomycetes)諸如畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬(Saccharomyces)，和變形子囊茵門(anamorphic Ascomycota)包括麴黴屬(Aspergillus)，優選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑麴黴(Aspergillusniger)。
27.依照權利要求18的真核宿主細胞，其是選自下組的昆蟲細胞SF9、SF21、Trychplusiani、和MB21。
28.依照權利要求18的真核宿主細胞，其是選自下組的動物細胞幼倉鼠腎(BHK)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎(HEK)細胞、和COS細胞，最優選NIH 3T3和293細胞。
29.依照權利要求18的真核宿主細胞、種子、組織、或完整生物體，其是選自下組的植物細胞、種子、組織、或完整生物體真核藻類、有胚植物包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)、和被子植物門(Spermatophyta)諸如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)，後者包括Magnoliopsida、Rosopsida、和百合綱(Liliopsida)(「單子葉植物」)。
30.依照權利要求29的真核宿主細胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組穀物種子，優選稻、小麥、大麥、燕麥、莧屬植物、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油料種子，優選芸苔種子、棉花種子、大豆、紅花、向日葵、椰子、和棕櫚；選自下組的其它可食用種子或含可食用部分的種子西葫蘆、南瓜、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿蔔、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹生堅果，優選胡桃、巴旦杏、山核桃、和鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿蔔、甘薯、製糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、櫟、榆、槭、蘋果、和香蕉。
31.轉化細菌、真菌、酵母、昆蟲、動物、或植物細胞、種子、組織、或完整生物體以產生能夠表達β-胡蘿蔔素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段的轉化體的方法，所述多肽或其功能片段具有特異切割β-胡蘿蔔素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿蔔素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學活性和/或具有特異結合針對所述多肽或其功能片段所產生的抗體的能力，該方法包括用依照權利要求9-13任一項的DNA分子或者用依照權利要求14的質粒或載體系統轉化所述細菌、真菌包括酵母、昆蟲、動物、或植物細胞、種子、組織、或完整生物體。
32.由依照權利要求31產生的轉化體提供或再生的轉化細菌、真菌包括酵母、昆蟲、動物、或植物細胞、種子、組織或完整生物體。
33.依照權利要求32的轉化植物細胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組真核藻類、有胚植物包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)、和種子植物門(Spermatophyta)諸如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)，後者包括Magnoliopsida、Rosopsida、和百合綱(Liliopsida)(「單子葉植物」)。
34.依照權利要求33的轉化植物細胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組穀物種子，優選稻、小麥、大麥、燕麥、莧屬植物、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油料種子，優選芸苔種子、棉花種子、大豆、紅花、向日葵、椰子、和棕櫚；選自下組的其它可食用種子或含可食用部分的種子西葫蘆、南瓜、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿蔔、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹生堅果，優選胡桃、巴旦杏、山核桃、和鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿蔔、甘薯、製糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、櫟、榆、槭、蘋果、和香蕉。
35.能夠與權利要求1-8和16任一項的多肽發生特異免疫反應的抗體。
36.依照權利要求9-13任一項的DNA分子用於診斷和/或治療目的的用途。
37.依照權利要求1-8和16任一項的多肽用於治療目的的用途。
38.依照權利要求35的抗體用於權利要求1-8和16任一項的多肽的分離和/或量化和用於診斷和/或治療目的的用途。
全文摘要
本發明提供了轉化細菌、真菌(包括酵母)、動物、和植物細胞、種子、組織、和完整植株以產生能夠表達新型β－胡蘿蔔素雙加氧酶並積累胡蘿蔔素/類視黃質途徑重要代謝物(諸如維生素A醛和視黃酸)的轉化體的手段和方法。本發明還提供了通過生物技術使用天然或轉化後積累β－胡蘿蔔素或者由培養基攝取β－胡蘿蔔素的細胞、組織、器官、或完整植株生產類視黃質的手段和方法。本發明還提供了編碼衍生自不同來源和分類群的存活生物體、對稱和不對稱切割β－胡蘿蔔素的雙加氧酶且設計適用於進行本發明方法的DNA分子，及包含所述分子的質粒或載體系統。另外，本發明提供了展示改良的營養品質或生理狀況且包含這些DNA分子和/或使用本發明方法生成的轉基因細菌、真菌(包括酵母)、動物、和植物細胞、種子、組織、和完整植株。
文檔編號A61K48/00GK1425062SQ00818539
公開日2003年6月18日 申請日期2000年12月27日 優先權日1999年12月24日
發明者J·馮林提格, K·沃格特 申請人:辛根塔參與股份公司