使用菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的新檢測方法

2023-09-20 02:34:15 2

專利名稱：：使用菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的新檢測方法
技術領域：
：本發明得到了國立衛生研究院5-U01-AI053873號的資助。因此，政府可享有本發明的某些權利。目前本發明應用於識別和鑑定新的殺蟲的靶位，特別是與宿主細胞相關的新的殺蟲的耙位、檢測和其抗體。
背景技術：
：由昆蟲對農作物造成的全球經濟損失是令人震驚的。在美國每年由於鱗翅類害蟲造成的經濟損失估計高達600,000,000美元。因此，在現代農業中殺蟲劑是殺滅害蟲的重要物質。一種被稱為多殺菌素的殺蟲劑是兩種天然代謝物spinosynA和spinosynD的混合物，其是由放線菌saccharapolysporaspinosa中產生的。多殺菌素可以有效地依次殺滅昆蟲中鱗翅目、雙翅目和纓翅目害蟲，還可以有效地抗鞘翅目和直翅目的害蟲。殺蟲劑多殺菌素通常是針對生物體特定的靶點，例如關鍵蛋白質。迄今為止，僅僅鑑定了為數不多的殺蟲劑作用的靶位。也可能由于田間的昆蟲種群增加了對殺蟲劑的抗藥性，這些靶位點作用失效。由於多殺菌素是天然的殺蟲劑，因此有望發現其他作用於多殺菌素靶位的具有殺蟲效果的化學化合物。
發明內容儘管不斷的改進技術，目前知道的具有殺蟲效果的耙位還是有限的，因此需要發現和研製新的、有效的、安全的殺蟲劑。本發明根據這個需要，尋找到了以類似於多殺菌素的作用方式和化學組成的新的可以有效的識別和鑑定靶位點，即多殺菌素靶位點。此外，來自於脊椎動物的菸鹼乙醯膽鹼受體是幹涉多種疾病狀態的藥學和動物健康化合物重要靶位。因此，本發明也提供了一個研究菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位相互作用和藥物學的模式系統。SEQUENCEIDNO:1是位於果蠅2L染色體34E位點上的編碼菸鹼乙醯膽鹼受體a-5亞單位的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:2是果蠅X染色體上18C位點的編碼菸鹼乙醯膽鹼受體a-7亞單位的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:3是位於30D位點編碼果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-6受體亞單位的正向PCR引物的寡核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:4是位於30D位點編碼果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-6受體亞單位的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:5是位於34E編碼果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-5受體亞單位的正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:6是位於34E編碼果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-5受體亞單位的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:7是位於18C編碼果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-7受體亞單位的正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:8是位於18C編碼果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-7受體亞單位的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:9是編碼線蟲ric-3正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:10是編碼線蟲ric-3反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:11是對應於果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-6受體亞單位第367-380位胺基酸的胺基酸序列。SEQUENCEIDNO:12是加入Kozak翻譯起始信號編碼30DnAChRa6正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:13是編碼30DnAChRa6反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:14是加入Kozak翻譯起始信號編碼線蟲ric3正向PCR引物的核苷酸序列。上面列出來的序列是與參考文獻NucleicAcidsRes.l3:3021-3030(1985)和BiochemicalJ.219(No.2):345-373(1984)列出來的標準一致的核酸序列字母的單字母密碼和胺基酸單字母密碼，所述文獻通過參考併入本申請。核酸和胺基酸序列數據所用的符號和格式遵守37C.RR.§1.822的要求。本發明一方面涉及宿主細胞，其包括(i)與編碼受體亞單位的NCBI接收號No.NM205953基因編碼區第79-1485位核酸有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼離子通道亞單位的核酸，其中宿主細胞能對spinosyn響應。本發明的另一方面涉及宿主細胞，其包括(i)與編碼的受體亞單位NCBI接收號No.NM205953基因編碼區第79-1485位核酸有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼前體蛋白質的核酸，其中宿主細胞中能對spinosyn口向應。本發明的另外一個方面涉及檢測影響受體亞單位能力的化學化合物的方法，包括以下步驟(a)將(i)NCBI接收號為No.NM205953的編碼受體亞單位的編碼區第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸；和(ii)編碼離子通道亞單位的核酸分子體外導入宿主細胞，以表達受體亞單位和離子通道亞單位，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評估暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發明的另一方面涉及用於評估化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟(a)將(i)與編碼受體亞單位NCBI接收號為No.NM205953的基因第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸體外導入宿主細胞，以表達受體亞單位；其中離子通道亞單位由宿主細胞內源性產生和表達，其中宿主細胞能對syinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發明的另一方面涉及檢測化學化合物對受體亞單位影響能力的方法，包括以下步驟(a)將(i)與編碼受體亞單位NCBI接收號為NO.NM205953的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸在宿主細胞體外表達受體亞單位，(ii)編碼輔助蛋白的分離的核酸分子體外導入宿主細胞以表達受體亞單位好輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評估暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發明的另外一個方面涉及評估化學化合物影響受體亞單位的能力的方法，包括以下步驟(a)與編碼受體亞單位NCBI接收號No.NM205953基因編碼區第79-1485位核酸有50%同一性的核酸體外導入宿主細胞，以表達受體亞單位，其中宿主細胞內源性產生和表達輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發明的另一方面涉及可以特異性的與NCBI接受號為No.NM205953編碼區第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸序列編碼的多肽抗原表位結合的抗體，其中功能性表達由核酸編碼的的多肽的宿主細胞能對spinosyn響應。本發明的另外一方面涉及包括了基因突變的生物體，其中基因編碼區具有與NCBI接收號No.NM205953編碼區第79-1485位核酸序列有至少50%同一性，其中包括突變的生物體顯示比其來源的母系的生物體對spinosyn降低的響應性。本發明另一方面涉及載體，包括(a)與(1)與NCBI接收號No.NM205953編碼區的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的DNA分子的一條鏈的對應部分基本上互補的反義核酸序列；(b)與反義核酸序列可操作性連接的調節序列，以在轉化細胞中表達反義核酸序列，其中轉化細胞比未轉化細胞對spinosyn的響應性減少。本發明的再一個方面涉及用於篩選對spinosyn抗性的生物體，包括下面步驟(a)從生物體中獲得核酸；(b)檢測與NCBI接受號為NO.NM205953基因編碼區第79-1485位核酸有至少50%同一性的核酸序列；(c)比較被檢測的序列與來自於對spinosyn易感的生物體的相同基因的序列，其中被篩選的生物體與spinosyn易感的生物體來源於同一個物種的。在進一步的實施範例中，本發明涉及檢測影響受體亞單位的化學化合物的能力的方法，包括下面步驟(a)將包括(i)與NCBI接收號No.NM205953基因編碼區的第79-1485位有至少50%同一性的核酸序列；(ii)與核酸序列可操作性連接的調節序列的載體導入生物體的一個或多個細胞中，以使得核酸序列的在至少一個或者多個轉化細胞中表達，其中轉化細胞顯示了比未轉化細胞對spinosyn響應的增強；(b)將表達受體亞單位的轉化細胞暴露於化學化合物；(c)評估暴露的受體亞單位來檢測化學化合物是否影響受體亞單位。本發明的其他特性和優點將在下面的說明書中進行解釋，其中一部分在說明書中是清楚的，或者在本項發明的應用中學到。在本文中可以從本發明的說明書和其權利要求中了解和知道其優點。將被理解，對本發明的總的描述和後面更為的詳細的描述是示例性和說明性的，並用於對進一步解釋要求保護的本發明。為更方便的了解本發明下面是部分定義。單位、前綴和符號以其SI的接收格式表示。除非有其他的說明，核酸都是按照從左側5'端起始到右側3'端的順序；胺基酸是從左到右從氨基端到羧基端。說明書中列出的數值範圍是包括在限定的一定範圍內的，且包括該範圍內的每一個整數。本申請提到的胺基酸是按照IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦使用的眾所周知的三個字母的密碼子或者是一個字母的密碼子。同樣，核酸也是用該委員會命名的單字母代碼。除非另作說明，本文所涉及的軟體術語和電工、電子術語是按照新的正EE標準的電工和電子術語詞典進行使用(第五版本，1993年)。下述定義的術語被參考文獻更詳細的定義，並作為整體併入本申請。"輔助蛋白"指包括但不限於是昆蟲和無脊椎動物的輔助蛋白，例如伴侶蛋白質，其參與膜運輸、離子通道亞單位的成熟、摺疊和多肽如受體亞單位的轉運和/或裝配。"編碼輔助蛋白的核酸"或者"多核酸的輔助蛋白"指的是編碼輔助蛋白的多聚核酸。這個術語也包括任何輔助蛋白的片段、變異體、同系物、等位基因或者前體(如前導蛋白(preproteins)或前蛋白)。"抗體"指的是能夠特異結合抗原決定簇的完整分子和其片段。可以用完整的多肽或片段作為免疫抗原來製備特異性結合該多肽的抗體(如，本發明中提到的核酸編碼的多肽)。如有需要，可以使這些蛋白質與載體蛋白連接。"反義RNA"指的是可以阻斷耙基因(美國專利號No.5，107,065通過參考併入本申請)表達的，且與該基因的初級轉錄本或mRNA的全部或部分互補的RNA轉錄本。它可以與耙基因的轉錄本的任何一段互補，如5'非編碼序列、3'非編碼序列、內含子或者編碼序列，等等。"具有轉錄活性的RNA(功能RNA)"指的是正義RNA、反義RNA、核酶RNA、或者是那些參與細胞過程但並不能被翻譯的RNA。"結合親合力"指的是配體與受體或者其他蛋白質相互作用的傾向(propensity)。"離子轉運"指的是在生物系統中鹽離子和其他電解質以離子的形式從一個地方運動到另一個地方。"抗原表位(抗原決定簇)"指的是大分子的任何一個區域能夠或者具有識別並結合一個或者更多特異性抗體的潛能，也包括結合特異性抗體的區域。"表達"指的是來源於本發明中的核酸片段的正義(mRNA)或反義RNA的轉錄本和穩定累積。表達也指的是mRNA翻譯形成的多肽。"反義抑制"指的是能夠抑制靶標蛋白質表達的反義RNA轉錄本的產物。"過表達"指的是的轉基因生物體中的某一個基因的表達產物明顯高於正常或者非轉基因生物體。"共抑制"指的是能夠抑制相同或基本相似的外源性或內源性基因(美國專利號No.5,231，020通過參考併入本申請)表達的正義RNA轉錄本的產物。"功能表達"指的是宿主細胞離子通道分子的合成和任何必需的翻譯後的過程，使得在對細胞膜電位的實驗性增加改變的響應中或一旦暴露於適當的藥理化合物的情況下離子通道能夠正確的插入到細胞膜上並能夠進行離子轉運。"基因"指的是表達特異蛋白質的核酸片段，包括前面的調節序列(5'非編碼區)和編碼區後面的序列(3'非編碼區)。"天然基因，，指的是在自然界中發現的本身具有調節序列的基因。"嵌合基因"指的是除天然基因之外的任何基因，包括未在自然界中一起存在的調節和編碼序列。因此，嵌合基因包括不同來源的調節序列和編碼序列或者是相同來源的但與自然界中的天然基因不同的方式排列的調節序列和編碼序列。"內源基因"指的是在生物體的基因組中位於原來位置的天然基因。"外源基因"指的是未在宿主生物體中發現的基因，可通過基因轉移將其轉入到宿主生物體中。外源基因包括能夠嵌入到非其天然生物體中的天然基因或嵌合基因。"轉基因"指的是能夠通過轉化的方法進入基因組中的基因。"基因組DNA"指的是染色體DNA並且可能包括內含子。"內含子"是間插序列，是一個基因中的DNA非編碼序列，該基因可以被轉錄成不均一核RNA(hnRNA)，但在核內通過RNA剪切的形式去除內含子，留下一個成熟的mRNA，然後在細胞質內翻譯。內含子末端的區域是自身互補的，在hnRNA中形成天然的髮夾結構。"宿主細胞"指的是將分離得到的核酸片段穩定的或瞬間轉入的任何細胞或生物體。宿主細胞可以是一個大生物體的一部分、組織培養的個體或自由生活的生物體。這些包括但不限於脊椎動物和無脊椎動物宿主、真核宿主如哺乳動物細胞(例如SH-SY5Y細胞、COS細胞、HEK-293細胞和PC12細胞)、大鼠和小鼠、眾所周知的模式生物如斑馬魚、爪蟾卵、昆蟲細胞(昆蟲細胞系如果蠅schneider、果蠅Kc、Sf9和HighFive系)，原核宿主如細菌(包括但不限於大腸桿菌、芽胞桿菌屬、鏈黴菌屬和假單胞細菌屬)以及真菌(包括但不限於來源於克魯維酵母屬和酵母菌物種的細胞)和植物。"昆蟲"包括昆蟲綱中的任何空氣呼吸的節肢動物，包括但不限於家蠅、果蠅或醋蠅(黑腹果蠅)，也包括其他農業昆蟲、醫學昆蟲、重要的獸醫昆蟲等如桃財(綠色桃岈)、綠棉鈴蟲(菸草螃蟲)、馬鈴薯甲蟲(科羅拉多馬鈴薯甲蟲)、德國小蠊(德國蟑螂)、蘋果蠹蛾、小菜蛾、埃及伊蚊和甘比亞按蛟。"離子通道亞單位"指的是能夠形成部分離子通道的任何蛋白質分子，包括那些在形成離子通道的過程中能夠與其他分子結合的亞單位。"編碼離子通道亞單位的核酸"或"離子通道亞單位多聚核酸"指的是編碼離子通道亞單位的多聚核酸。這個術語也包括任何離子通道亞單位的片段、變異體、同系物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。"編碼離子通道亞單位的核酸"這個術語也包括由宿主細胞如PC12細胞內源性產生的核酸的實施方案。"分離"指的是如核酸或蛋白質的物質，其為(1)基本上或完全沒有在天然存在的環境中發現的通常與該物質相伴或相互作用的組分；(2)如果這個物質在其自然環境中，但被人類的故意介入而改變形成組合物和/或被放到不是該物質的原來位置上的細胞中。"損傷"指的是核酸與來源於母系或野生型種群的核酸相比發生的任何分子變化。例如，損傷可以是核酸序列的缺失、倒置、插入、複製、轉換、顛換或重排。"配體門控離子通道亞單位"指的是形成受配體調節的任何離子通道的部分的亞單位，包括但不限於菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位、GABA受體亞單位、5-羥色胺受體亞單位和穀氨酸受體亞單位。已知並可以從公用資料庫和網際網路可以獲得核酸序列、蛋白質序列，以及多序列對比和系統進化的研究。"編碼配體門控離子通道亞單位的核酸"或"配體門控離子通道亞單位多聚核酸"指的是編碼配體門控離子通道亞單位的多聚核酸。這個術語也包括任何配體門控離子通道亞單位的片段、變異體、同系物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。"核酸"指的是任何核酸，包括單鏈或多鏈脫氧核糖核酸或核糖核酸鹼基的聚合物。核酸也包括片段、修飾的核酸和變異體。因此，本申請使用的術語"多聚核酸"和"核酸"是可以替換使用的。典型的"啟動子"指的是指導結構基因轉錄產生RNA的DNA序列。典型的啟動子位於基因上遊500bp(鹼基對)接近轉錄起始位點的區域。如果是一個可誘導型啟動子，在外源性或內源性誘導因素作用下，轉錄會增加或減少。相反，對於組成型啟動子誘導因素不能調控其轉錄。"受體亞單位"指的是構成完整受體的任何蛋白質。"菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位"指的是構成完整的菸鹼乙醯膽鹼受體組成的任何蛋白質，如菸鹼乙醯膽鹼a-5、a-6和a-7受體亞單位。前面提到的所有引用的編碼受體亞單位的核酸指的是編碼受體亞單位的多聚核酸。這個術語也包括任何受體亞單位的片段、變異體、同系物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。"抗性"指的是遺傳確定的昆蟲種群對spinosyn作用的相對響應。一般，昆蟲品系或種群在殺蟲劑試驗中(以可以殺死一個屬或種群中50%的用藥劑量作為評判標準)顯示了比適當的參考耐受劑量或者比易感種群至少高於2倍，優選4-8倍，更優選至少10倍以上的抗性則被認為其具有"抗性"。"對spinosyn的響應"指的是暴露spinosyn產生的可以檢測到包括但不限於行為、存活力、配體結合或離子轉運的改變的效應。"Spinosyn"指的是包括由放線菌多刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)產生的由U.S.專利號No.5,362,634鑑定命名的A83543等發酵產物。這些化合物指的是因子或A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W和Y組分等等(可參見公布的國際專利申請書WO93/09126和W094/20518)以及下文中會被提到的SpinosynA、B、C等等。天然產生的spinosyn化合物由融合到12-元大環內酯的5,6,5-三環系統、中性糖(鼠李糖)和氨基糖(forosamine)糹且成(見Kirstetat,1991)。包括由Saccharopolysporapagona產生的21-正丁巴比妥spinosyn這些及其他的天然spinosyn化合物是由位於1815北方大學街道，皮奧裡亞(Peoria,)III.61604的中西部北方區域研究中心、農業研究服務處和美國農業部存貯培養的命名為NRRL18719、18537、18538、18539、18743、18395和18823保藏培養物發酵產生的。在U.S.Pat.Nos.5,496,931、5,670,364、5,591,606、5,571,卯1、5,202,242、5,767,253、5,840,861、5,670,486和5，631，155專利中也公開了Spinosyn化合物。SpinosynA和D是spinosyn的兩個組分，其是具有特別活性殺蟲劑。由稱為多殺菌素的DowAgroSciences(Indianapolis,Ind.)生產的主要包含這兩種spinosyn組分(大約85%的spinosynA和15%的spinosynD)。此處使用的此術語也包括由spinosyn合成或半合成的"spinosyn衍生物"。"實質類似"指的是核酸片段，其中一個或多個核酸鹼基變化導致一個或多個胺基酸的替換，但並不影響由DNA序列編碼蛋白質的功能特性。"實質類似"也指的是核酸片段，其中一個或多個核酸鹼基發生改變不能影響由反義或共抑制方法導致的核酸片段介導的基因表達發生改變。"實質類似"也指的是發生缺失或插入一個或多個核酸核酸片段的修飾，沒有從實質上影響合成的轉錄本與由反義或共抑制介導基因表達發生改變的功能特性或者獲得的蛋白質分子的功能特性相比發生改變。因此可以理解為本發明包括更多的特定的例舉的序列。例如，本領域所熟知的用小於耙基因整個編碼區的核酸片段和與靶基因不是100%同一性的核酸片段可以反義抑制和共抑制基因的表達。此外，本領域所熟知的靶基因的改變可以導致在特定位點上化學等值的胺基酸的產生，但並不影響編碼蛋白質的功能特性。因此，疏水性胺基酸丙氨酸的密碼子可以被其他具有較少疏水殘基如甘氨酸和具有較多疏水殘基如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸編碼的密碼子所替換。類似的，發生陰離子電荷殘基替換，如穀氨酸替換天冬氨酸，或陽離子電荷殘基發生替換，如精氨酸替換賴氨酸，可以產生一樣的功能產物。造成蛋白質分子的N端和C端部分的發生改變的核酸變化並不能改變蛋白質的活性。可以用本領域常規方法預測編碼產物的保留生物學活性的每一個修飾。此外，實質類似的核酸片段具有在嚴謹條件下(O.IXSSC、0.1%SDS，65。C)與本申請公開的核酸片段雜交的能力。本發明中的實質類似的核酸片段也可以由其編碼的胺基酸序列與在本申請公開的用本領域技術人員通常使用的計算方法得到的胺基酸序列的百分比類似性進行比對。優先選擇那些編碼的胺基酸與本申請報導的核酸序列編碼的胺基酸序列有80%以上相似性的核酸片段。更優選那些核酸序列編碼的胺基酸與本申請報導的核酸序列編碼的胺基酸序列有90%以上相似性的核酸片段。最優選那些核酸序列編碼的胺基酸與本申請報導的核酸序列編碼的胺基酸序列有95%以上相似性的核酸片段。用VactorNTiSuite(InforMax,NorthBethesda,MD)程序對序列對比和百分比近似計算。用Clustalmethodofalignment(HigginsandSharp,1989)的預設參數(GAPPENALTY-IO，GAPextensionPENALTY:O.l)(此後稱為Clustalalgorithm)對序列多重對比。用Clustalmethod進行配對對比的預設參數是KTUPLE1、GAPPENALTY=3、WINDOW:5和DIAGONALSSAVED=5。胺基酸或核酸序列的"實質部分"指的是用本領域技術人員評估的方法或應用自動化的計算機算法如BLAST(基本的局部比對搜索工具，參見Altschuletal,1993，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列比較的時需要的足以推定多肽或基因的胺基酸或核酸序列。大體上，與胺基酸相鄰十個或更多或者三十個或更多的核酸的序列可以用來推定與已知蛋白質或基因的同源的多肽或核酸序列。此外，就核酸序列而論，可以應用依賴序列的方法，利用包括20-30個相鄰的核酸的基因特異寡核苷酸探針鑑定(如Souther雜交)和分離(如細菌克隆或噬菌體的原位雜交)基因。另外，12-15個鹼基的短寡核苷酸可用來作為進行PCR擴增的引物來獲得包括引物的特異的核酸片段。相應地，核酸序列的"實質部分"指的是需要特異性鑑定和域分離包括該序列的核酸片段的足夠序列。本說明書說明了一個或更多個編碼特異的植物蛋白質的部分或全部胺基酸和核酸序列。本領域的技術人員利用本申請報導的序列，可以將本申請公開的全部或實質部分序列用於本領域技術人員已知的目的。"轉錄調節區"和"調節區"指的是調節基因轉錄的DNA區域。調節區包括許多順式作用元件，這些順式作用元件包括但不限於啟動子、增強子和激素反應元件。由於內含子和5'非翻譯區可以影響轉錄，因此轉錄調節區還包括這些序列。調節區可操作地連接於核酸，以保證宿主細胞中核酸的表達。"轉基因動物"指的是通過將DNA人為插入和穩定整合到基因組上的修飾動物。DNA可以隨機或定向插入到染色體、附加體或染色體外元件的特定位點。"轉基因細胞"指的是將DNA人為插入到染色體或附加體或染色體外元件的細胞。"變異體"指的是實質類似的序列。一般，本發明的核酸序列變異體與天然核酸序列有至少46%、48%、50%、52%、53%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其中百分比序列同一性是基於全部序列的，用預設參數進行GAP10分析得到的。一般來說，本發明中的多肽序列變異體與天然蛋白質有至少60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其中百分比序列同一性是基於全部序列的，用預設參數進行GAP10分析得到的。GAP用的是NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.48:443-453,1970)算法來尋找兩個完整序列的最大匹配數和最小缺口數的比對。"變異體"也指的是與本發明包含的和生物學功能必需的基序高度相似的胺基酸序列的實質類似序列。通常，本發明的多肽序列的變異體與定義的基序的保守胺基酸殘基有至少85%、90%或95%的序列同一性。本發明使用的本領域所熟知的標準重組DNA和分子克隆技術，在SambrookandRussell(2000)中有詳細描述。本發明包括的變異體包括核酸的個別替換、缺失或加入，或改變、添加或缺失單個胺基酸，或在編碼的序列中的小部分胺基酸的多肽序列。"保守修飾變異體"通過化學類似的胺基酸替換原來的胺基酸導致改變。可以利用假定宿主的偏好的密碼子參數製備或合成改變的核酸。本發明的核酸片段可被用來分離來源於同一個或不同物種的編碼同源性蛋白質的cDNAs和基因。用本領域所熟知的依賴於序列的方法分離同源基因。依賴於序列的方法的實施例包括但不限於核酸雜交方法和DNA、RNA擴增方法，例如各種使用核酸擴增技術的方法(如多聚酶鏈延伸反應、連接酶鏈反應)。例如可以本領域所熟知的以全部或部分核酸片段作為雜交探針篩選目標生物體，從而直接分離編碼其他菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位的cDNAs或基因組DNAs。用本領域所熟知的方法根據核酸序列設計併合成特異的寡核苷酸探針(SambrookandRussell,2000)。此外，本領域技術人員也可以用全部序列來指導合成DNA探針，如隨機弓I物DNA標記、缺口平移或末端標記，或用體外轉錄系統合成RNA探針。另外，設計可以用來擴增全部或部分序列的特異性引物。在擴增反應中或在擴增反應後，直接標記得到的擴增產物，將標記得到的擴增產物作為探針在適當的嚴謹條件下來分離全長cDNA或基因組片段。另外，核酸片段的兩個小片段可被用到多聚酶鏈反應中來擴增更長的編碼DNA或RNA的同源基因的核酸片段。多聚酶鏈反應可用來擴增核酸片段克隆形成的文庫，其中一個引物的序列來源於核酸片段，另外一個引物的序列是利用編碼基因的mRNA前體3'末端的多聚腺苷酸尾巴的序列。第二條引物的序列也可以來源於克隆載體序列。例如，本領域熟練的技術人員可遵循RACE技術(Frohmanetal,1988)使用PCR方法擴增轉錄本中某一個點到3'或5'末端產生cDNAs。根據序列設計3，和5，方向的引物。使用商業上通用的3'RACE或5'RACE系統(Invitrogen,Madison，WI)分離特異性的3'或5'cDNA片段(Oharaetal.,1989;Lohetal，1989)。將3，和5'RACE得到的產物相連可以得到全長的cDNAs產物(FrohmanandMartin,1989)。得到的核酸和推測得到的胺基酸序列可用於cDNA表達文庫的免疫篩選。可以合成胺基酸序列代表性部分的多肽。可用這些肽免疫動物製備特異性的針對組成胺基酸序列的多肽或蛋白質的單克隆或多克隆抗體。用得到的抗體篩選cDNA文庫分離感興趣的全長cDNA克隆(Lerner,1984;SambrookandRussell,2000)。本發明包括的編碼相同胺基酸序列的許多多聚核酸。遺傳密碼子的簡併性使得"沉寂變異體"的出現，其例如可用於選擇性雜交、檢測本發明的多聚核酸的等位變異體。另外，本發明包括了由等位變異體組成的分離的核酸。本申請用的術語"等位基因"指的是相同基因相關的核酸。也可將變異體描述成，如，剪切、物種或多態變異體。剪切變異體是與參考分子有高度同一性，但由於它在mRNA過程中改變剪切外顯子產生了比參考分子多或少一定數量的多聚核酸。因此，相應的多肽會比參考分子增加或減少功能結構域。物種變異體指的是在不同物種中不同的多聚核酸。獲得的多肽通常互相具有很高的胺基酸同一性。多態變異體是特定物種的個體的某一個特定基因的多聚核酸序列，也包括一個核酸鹼基的多聚核酸序列變異產生的"單核酸多態性(SNP)，，。本項發明中提到的核酸變異體可以通過如下方法如寡核苷酸定點誘變、接頭分區誘變、PCR產生的誘變等等獲得，也可參見McPherson(1991)。因此，本發明也包括那些核酸序列與發明中的序列具有實質相似性的序列組成的DNA分子。就某一個特定核酸序列而言，"保守修飾變異體"指的是那些編碼一致或保守修飾胺基酸序列變異體的核酸序列。由於遺傳密碼子的簡併性，大量功能上相同的核酸編碼特定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，丙氨酸的指定密碼子中的一個發生上面描述的相應的變化都不會改變其編碼的多肽。這樣的核酸變異體叫做"沉寂變異體"，它屬於一種保守修飾的變異體。本申請的每一個核酸序列都依據遺傳密碼子編碼一個多肽，都可能描述核酸的每一個可能的沉寂變異體。本領域技術人員可以識別被修飾核酸產生的功能一致分子的密碼子(除了AUG是蛋氨酸的唯一密碼子，UGG是色氨酸的唯一密碼子外)。相應地，在本發明描述的多肽序列以及本發明要求保護的權利要求範圍中，本發明描述的多肽序列，包含了編碼這個多肽的核酸的每一個沉寂變異體。"保守修飾變異體"是由於個體替換、缺失或加入核酸、肽、多肽或蛋白質序列的改變、增加或缺失編碼序列的一個胺基酸或一小部分胺基酸序列的胺基酸序列，這個改變導致用化學類似胺基酸替代原來的胺基酸。因此，從整體中可以選擇從1到50任何數目的胺基酸殘基。例如，1、2、3、14、25、37、45或50個胺基酸殘基都可以。典型的保守修飾變異體與同一個來源的未修飾的多肽序列具有相似的生物學活性。如一般天然蛋白質對其天然的底物有至少20%、30%、40%、50°/。、60%、70%、80%或90%的底物特異性、酶活性或配體/受體結合。保守置換表格提供了本領域所熟知的功能上相似的胺基酸。例如，下面六組包括的胺基酸是每一個組內的是可以相互保守置換的l)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E);3)天冬醯胺(N)、谷胺醯胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。也可以用其他本領域所熟知的保守置換模式(參見Creighton,1984)，如用比較軟體GCG包、BLAST或CLUSTAL對序列進行評分。"載體"指的是能夠運送另外一個與其相連的核酸的核酸分子。一種類型的載體就是"質粒"，指的是連接了一個DNA片段的環狀雙鏈DNA環。另外一種類型的載體是病毒載體，其中加入的DNA片段可以插入到病毒基因組中。某些載體在進入宿主細胞後可以自身複製(如具有細菌來源複製子的細菌載體和附加哺乳動物載體)。其他載體(如非附加體哺乳動物載體)當轉入宿主細胞後，可以整合到宿主細胞的基因組中，因此和宿主的基因組一起複製。此外，某些載體具有能夠指導與它相連接基因表達的能力。這樣的載體指的是本申請說的"表達載體"。總的來說，重組DNA技術使用的表達載體通常都是質粒的形式。在本說明書中，由於質粒是最常使用的載體形式，因此"質粒"和"載體"這兩個術語可以交互使用。然而，本項發明也包括具有相同的功能的其它形式的表達載體，如病毒載體(複製缺陷的逆病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。"電壓門控性離子通道亞單位"指的是形成任何受電壓的變化調節離子通道的部分的亞單位，包括但不限於鈣、鈉、鉀和氯化物電壓門控性離子通道亞單位。可以從NCBI資料庫上找到已經公布的編碼這些電壓門控性離子通道的核酸序列。"編碼電壓門控性離子通道亞單位的核酸"或"電壓門控性離子通道亞單位多聚核酸"指的是編碼電壓門控性離子通道亞單位的多聚核酸，該術語也包括任何電壓門控性離子通道亞單位的片段、變異體、同源物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。2.詳細描述本發明的實施方案涉及包括特定的核酸，並在合適條件下，能夠表達某個胺基酸的宿主細胞。本發明的宿主細胞包括與NCBI接收號No.NM205953編碼的受體亞單位的基因編碼區在79-1485位有至少50%、優選至少60%、尤其至少70%、更優選至少80%或特別是90°%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的核酸，優選其長度超過至少100、特別是超過至少500個緊鄰的核酸，和特別是完全覆蓋全序列。NCBI接收號No.NM205953基因在黑腹果蠅基因組中位於染色體2L的30D。示例性的核酸序列包括但不限於果蠅或其它無脊椎動物的核酸序列，如秀麗隱杆線蟲(NCBI接收號No.NM072806)、甘比亞按蚊(NCBI接收號No.AY705401)、產蜜蛭蟲(NCBI接收號No.AY500239)和煙芽夜蛾(綠棉鈴蟲)(NCBI接收號No.AF143847)。可以獲得這些已經公布了的示例性的核酸序列相對應的胺基酸序列。在一些實施方案中，這個核酸序列編碼菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位。在其它實施方案中，編碼受體亞單位的核酸序列是包括選自下面序列的核酸(a)NCBI接收號No.NM205953的核酸序列；(b)編碼黑腹果蠅接收號No.NM205953受體亞單位的剪切變異體的序列，如公共資料庫公布的(NCBI接收號Nos.NM164874,NM205951,NM135472,麗205952,畫205953AF321445,AF321446,AF321447,AF321448和AF321449);(c)由於遺傳密碼子簡併性，編碼與在(a)和(b)中定義的相同的胺基酸的序列。在本發明的另外一個實施方案中，宿主細胞還包括編碼離子通道亞單位的核酸。本領域技術人員可以明白編碼離子通道亞單位的核酸是宿主細胞內源性產生或非內源性產生的。在可以內源性產生的離子通道亞單位的情況下，因此沒有必要將核酸轉入宿主細胞中。示例性的離子通道亞單位包括配體門控性離子通道亞單位，如菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位、Y-氨基丁酸(GABA)受體亞單位、5-羥色胺受體亞單位、穀氨酸受體亞單位和它們的功能片段，以及電壓門控性離子通道亞單位如鈣、鈉、鉀、氯化物門控性離子通道亞單位和它們的功能片段。在一些實施方案中，宿主細胞包括編碼菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的離子通道亞單位的核酸。在其它實施方案，編碼菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的核酸包括選自下面的序列(a)具有SEQIDNo:1的核酸序列；(b)與SEQIDNo:1編碼菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位基因編碼區925-2424位序列有至少50%、優選至少60%、尤其優選至少70%、更優選至少80%和特別優選90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的核酸序列，序列的長度優選超過至少100、特別優選至少超過500個緊鄰的核酸、並特別優選覆蓋序列的全長；(c)包括已知和公共資料庫得到的(NCBI接收號Nos.NM176035，NM205986，NM205985,AF272778)編碼菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位剪切變異體的核酸序列；(d)由於遺傳密碼子簡併性編碼在(a)-(c)中定義的序列，編碼相同胺基酸的序列。上面提到的SEQIDNo:1位於黑腹果蠅基因組的染色體2L的34E。在本發明的實施方案中，宿主細胞能夠對spinosyn響應。本領域的技術人員可以用本申請描述的容易有效的方法進行檢測，如電壓鉗制術、離子流測定膠遷移、WesternBlots、放射標記競爭試驗、噬菌體表達克隆和色譜聯合分段分離技術。此外除了含有上面提及序列的宿主細胞，本發明的實施方案涉及還包括編碼輔助蛋白核酸的宿主細胞。在特定的實施方案是，編碼輔助蛋白的核酸是編碼無脊椎動物輔助蛋白的核酸。在進一步的實施方案中，編碼輔助蛋白的核酸選自(a)具有NCBI接收號NaNM068898的核酸；(b)與NCBI接收號No.NM068898基因編碼區的第1-1137位序列有至少36%的同一性、優選至少40%，特別優選至少50%、優選至少60%、特別優選至少70%、更優選80%和特別優選90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性，序列的長度優選超過至少100、特別超過至少500個緊密相連的核酸，和特別覆蓋整個序列的編碼輔助蛋白的序列；(c)NCBI接收號No.NM068898編碼秀麗隱杆線蟲ric-3輔助蛋白的剪切變異體的序列；(d)由於密碼子的簡併性，編碼與(a)-(c)定義的的胺基酸相同的胺基酸的序列。此外，本發明的實施方案涉及還包括編碼離子通道亞單位的第二個核酸的宿主細胞。特定的編碼離子通道亞單位的第二個核酸是編碼配體門控性離子通道的第二個亞單位。在一些實施方案中，宿主細胞包括編碼配體門控性離子通道亞單位的第二個核酸，這個核酸也是菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位。甚至在其它一些實施方案中，編碼菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的核酸是編碼菸鹼乙醯膽鹼a-7受體亞單位的核酸。在進一步的實施方案是，編碼菸鹼乙醯膽鹼a-7受體亞單位的核酸恐怖選自下述的序列(a)與編碼菸鹼乙醯膽鹼a-7受體亞單位的SEQIDNo:2基因編碼區第106-1617序列有至少50%、優選至少60%、特別優選至少70%、更優選至少80%和特別優選90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99°/。和100%同一性的序列，這個序列的長度優選超過至少100、特別超過至少500個緊密連接的核苷酸，和基本覆蓋全長核酸的序列。(b)與編碼菸鹼乙醯膽鹼a-7受體亞單位的SEQIDNo:2序列有至少50%同一性；(c)來源於黑腹果蠅的編碼菸鹼乙醯膽鹼a-7受體亞單位的剪切變異體的序列，包括可以從公共資料庫中査到的序列(NCBI接收號Nos.NM206791、NM167645、麗206790、畫080340、AJ554210和AY036614);(d)由於密碼子的簡併性，編碼與(a)-(c)中定義的的胺基酸相同的胺基酸的序列。需要提到的是，包含SEQIDNo:2的基因位於黑腹果蠅基因組的X染色體的18C位置。本發明的實施方案還涉及包括與NCBI接收號No.NM205953編碼受體亞單位的基因的79-1485核酸序列有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼輔助蛋白的核酸，其中宿主細胞能對spinosyn響應的宿主細胞。在這些特別的實施方案中，編碼離子通道亞單位的核酸不需要被轉入到宿主細胞中。本發明的另外一個方面涉及，包括前面提到的核酸序列的載體，優選表達載體的宿主細胞。在本發明的實施方案中，提供了前面提到的載體形式，其中的核苷酸序列與在載體中存在的並且被安排在該核苷酸序列中的調控序列操作性連接，且受其調控。這些調控核酸序列與本發明中的核酸序列可以是異源的，即它們來源於不同的基因或生物體，或同源的，即與本發明的核苷酸在調控單位中是天然共同存在的。本發明的重組表達載體包括適於在宿主細胞中表達的核酸，也就是說重組表達載體包括一個或更多個基於被用來表達的宿主細胞中篩選得到的與表達核酸序列操作性連接的調節序列。在重組表達載體中，"可操作連接"指的是感興趣的核酸以表達核酸序列的方式與調控序列相連(如體外轉錄/翻譯系統或轉入載體的宿主細胞)。調節序列包括那些在許多類型的宿主細胞中直接組成型表達的核酸序列和那些僅僅在部分宿主細胞中直接表達的核酸序列(如組織特異性調節序列)。本領域技術人員可以理解根據要轉入的宿主細胞和想要表達的蛋白質的表達水平等等來設計要用的表達載體。在真核或原核細胞中根據蛋白質的表達來設計重組表達載體。例如，可以在細菌大腸桿菌細胞、昆蟲細胞(杆狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳細胞中表達蛋白質。Goeddel，1990中詳細說明了如何選擇合適的宿主細胞。本發明中證實的宿主細胞，提供了檢測化學化合物中化學試劑與受體亞單位相互作用或影響受體亞單位的能力，如作用於spinosyn類似物。因此，本發明的另外一個方面涉及檢測化學化合物影響受體亞單位的能力的方法包括下述步驟(a)將(i)與包含NCBI接收號No.NM205953編碼受體亞單位的基因的編碼區的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼離子通道亞基的核酸分子轉入宿主細胞中，體外表達受體亞單位和離子通道亞基，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位與化學化合物暴露；(c)評估被表達和被暴露的受體亞基來檢測是否化學化合物可以影響受體亞基。本領域所熟知的誘導核酸進入宿主細胞的方法很多。其中之一就是微注射，也就是直接用細的玻璃注射針將DNA注射到細胞核中(或者直接將RNA注射到細胞的細胞質中)。也可以將DNA和惰性碳水化合物聚合物(葡聚糖)共同孵育，其中該聚合物與帶正電荷的化學基團(DEAE、溴化甲基)耦合。DNA通過其帶負電荷的磷酸基團依附到DEAE-葡聚糖)上。這些大的包含DNA的顆粒依次依附到細胞表面，通過己知的內吞作用進入細胞。逃避被破壞的細胞質中的一些DNA進入到細胞核，象其他基因一樣轉錄形成RNA。另外一個方法是，用磷酸鈣沉澱的方法使細胞攝入DNA。電穿孔的方法是將細胞放到含有DNA的溶液中，用電脈衝使細胞膜瞬間打開，DNA通過這些打開的孔直接進入細胞質中，或用DEAE-葡聚糖和磷酸鈣方法形成內吞小囊泡旁路進入細胞(這個途徑有時可以破壞囊泡或DNA)。也可以通過人工脂囊泡、脂質體與細胞膜融合，直接將其與DNA的內容物運送到細胞質，從而將DNA轉入細胞。更直接的方法是，用原代培養的植物細胞和組織，將DNA吸入到鉤微粒的表面，鳥槍注射入細胞。這些方法中的微注射，電穿孔和脂質體融合很適合誘導蛋白質進入細胞。還可以參考ManninoandGould-Fogerite,1988;ShigekawaandDower,1988;Capecchi;1980禾口Kleinetal，1987。誘導核酸進入細胞的方法也包括使用病毒載體。由於病毒的生長依賴於進入細胞的病毒基因組能力，因此運用病毒載體誘導核酸進入細胞是一個很精明和有效的方法。被廣泛使用的產生蛋白質的一種這樣的病毒是昆蟲病毒杆狀病毒。由於杆狀病毒在複製的過程中能夠產生令人矚目的水平的結構蛋白質(病毒外殼蛋白質)而被許多學者關注。如果外源基因置換病毒的基因，該外源基因的表達明顯增加。像牛痘苗一樣，杆狀病毒很大，因此必需將外源基因重組到病毒基因組上。為了在杆狀病毒中表達外源基因，要將感興趣的基因克隆到帶有小部分病毒基因組的載體的病毒外殼蛋白基因上。將重組質粒和野生型的杆狀病毒DNA共同轉染昆蟲細胞。以較低的效率質粒和病毒DNA通過同源序列重組，因此可以將外源基因插入病毒基因組中。由於缺乏外殼蛋白包含重組病毒的斑看上去與病毒的斑不同。挑選重組病毒的斑擴大培養。病毒原種然後用於感染新鮮培養的昆蟲細胞，使外源蛋白質高效表達。可以參考Miller(1989)的杆狀病毒載體。多種病毒載體如噬菌體、痘苗病毒、腺病毒和逆轉錄病毒可被用來轉化哺乳動物細胞。需要指出的是，轉化細胞的一些方法需要使用中間質粒載體。Cohen和Boyer的專利U.S.Pat.No.4，237,224描述了用限制性內切酶和DNA連接酶的方法構建重組質粒表達系統。利用轉化的方法將重組質粒導入細胞，在單細胞的原核細胞生物體中複製，在組織培養的真核細胞中生長。用本領域熟知的SambrookandRussell(2000)所述標準的克隆方法將DNA序列克隆到質粒載體上。在本發明的一些實施方案中，所用的宿主細胞能夠內源性產生編碼離子通道亞單位的核酸，所以，沒有必要將編碼離子通道亞單位的核酸誘導進入宿主細胞。因此，檢測化學化合物影響受體亞單位的方法包括下述步驟(a)將(i)誘導編碼受體亞單位的核苷酸序列導入宿主細胞，體外表達受體亞單位，其中宿主細胞可以內源性產生和表達離子通道亞單位，其中宿主細胞能對spinosyn響應；以及因此(b)使受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評估受處理的受體亞單位來檢測化學化合物是否可以影響受體亞單位。本發明的另外一個實施方案涉及檢測化學化合物影響受體亞單位的相關方法包括下述步驟(a)將(i)與編碼受體亞單位的NCBI接收號No.NM205953基因編碼區第79-1485位核苷酸序列至少50%同一性的核酸；(ii)編碼輔助蛋白的核酸分子導入宿主細胞，體外表達受體亞單位和輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)使受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評價被表達的和被暴露的的受體亞單位來檢測化學化合物是否能夠影響受體亞單位。在本發明的一些實施方案是，所用的宿主細胞能夠內源性表達輔助蛋白，所以，沒有必要將編碼輔助蛋白的核酸誘導進入宿主細胞。因此，檢測化學化合物影響受體亞基的方法包括下述步驟(a)將(i)編碼受體亞單位的核酸序列進入宿主細胞，並使其體外表達受體亞單位，其中宿主細胞能夠產生和表達內源性的輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；以及因此(b)使受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位來檢測化學化合物是否可以影響受體亞基。無論如何，本發明所用的宿主細胞是可以暴露於各種化學化合物如可能的殺蟲劑和殺蟲劑(pesticides),並通過評估細胞和化合物的相互作用，發現和鑑定新的控制昆蟲的化合物。本發明的實施方案中，所用的化學化合物是化學化合物的混合物。篩選化學化合物的示例方法在Eldefrawi改al.(1987)和Rauhetal.(1990)中公開。本領域熟知的有許多種通過評估被暴露的宿主細胞來檢測化學化合物是否可以影響受體亞單位的方法。在一個實施方案中，評估包括監測離子轉運，例如通過離子通道，如對非洲爪蟾的卵母細胞功能性表達的通道用電壓鉗制術進行分析(參見Taglialatelaetal,1992和Stuhmer,1992總體討論的用電壓鉗制術分析在爪蟾表達的受體和離子通道)。用包含一種或多種化合物的培養基預培養細胞，向培養基中加入含放射性指示劑如發射性鈣("Ca2,或放射性鈉("Na+)的培養基，繼續培養細胞，過濾分離細胞來監測離子轉運。用液體閃爍計數或其它放射性技術(BloomquistandSoderlund，1988)測量細胞中的放射性指示劑來監測離子轉運。在另外一個實施方案中，用鈣或鈉選擇性螢光螯合劑平衡預處理細胞，洗漆細胞，用化學試劑處理細胞，通過測量螢光來監測細胞內鈣或鈉的增加，來評估化學化合物對受體的影響(DeriandAdam-Vizi，1993;Lin，etal，1999;PCTIntAppl.WO2004033647;PCTApplication:WO20031009;Wilcox,1999)。在進一步的實施方案中，通過測量化合物對受體亞單位的結合親和力來評估化學化合物對受體亞單位的影響。檢測結合的結合試驗使是本領域技術人員已知的，包括但不限於凝膠遷移檢測、westernblots、放射標記的競爭檢測、基於噬菌體的表達克隆、色譜分段分離、共沉澱、交聯、相互作用捕獲或雙雜交試驗、Southwestern分析、ELISA等等，其在例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(1999,JohnWiley&80113,:^)中描述，通過參考全文併入本申請。篩選的化合物包括任何化合物，但不限於細胞外、細胞內、生物或化學起源的化合物。本發明的方法也包含配體，特別是帶有指示劑如放射標記、螢光標記、化學螢光標記、酶標記和免疫原標記的可能的殺蟲劑。試驗中用的核酸包括在溶液中游離的、附著到固體支持物上的、細胞表面的或位於細胞內或與細胞部分結合的核酸。例如，本領域技術人員可以測量受體亞單位和被試驗的化合物形成的複合物。也可以檢測被試驗的化合物減少受體亞單位和其底物形成的複合物。另外，這項試驗特別適用於使用CCD照相機、發光計或其它合適的光亮檢測系統進行高通量篩選的檢測。通過這種方式，向培養在多孔盤中的細胞加入試驗必需的試驗底物和試劑，來檢測進入細胞內的鈣。此外，可以使用商業儀器如"FLIPR-fluorimetricimagingbasedplatereader"(MolecularDevicesCorp,Sunnyvale,Calif"USA;Woodetal,2000)禾口"VIPR"voltageionprobereader(Aurora,BioscienceCorp.CA,USA)。"FLIPR"可以高通量精確測量整個細胞內的螢光。電壓敏感的螢光染料FLIPR技術被大量的用來測量哺乳動物細胞的膜電位和細胞的螢光現象。這個設備使用的是低角度雷射掃描光照，從而在接近標準的96孔板的孔底部大約200微米的處的掩膜(mask)以選擇性激發螢光。低角度雷射通過選擇性將光只想單層細胞而減少產生的背景，也消除了周圍培養基產生的螢光背景。然後使用CCD照相機對平板底部的所有視野照相，來測量每一個孔的底部產生的螢光。根據孔的面積均化測量得到的信號，然後測量所有細胞的平均響應。這個系統具有同時測量每一個孔螢光的優點，也避免了通過一個孔接一個孔的測量方法中連續測量的不精確性。這個系統可以以每秒兩次的速度讀出96孔或384孔板每一個孔的螢光信號。這個特性使得FLIPR系統可以平行的快速測量螢光，該特性可以檢測細胞的許多生理性能變化。細胞的這些生理性能變化可以作為藥物發現功能試驗的代理標誌物。FLIPR也被設計為具有本領域的已有的靈敏度。此靈敏度使得它可以精確測量非常小的變化。被稱為"chamdeons"的不編碼輔助因子的新的鈣螢光指示劑在細胞內有明確的定位。這些所謂的"chameleons"包括綠色螢光蛋白(GFP)的藍或青紫發射突變、鈣調節蛋白、鈣調節蛋白結合多肽M13和增強綠色或黃色發射的GFP的銜接融合。結合鈣的鈣調節蛋白包裹M13功能區，增力口(Miyawakietal,1997)或減少(Romoseretal,1997)GFP蛋白兩側的螢光共振能的轉移。本發明鑑定了不同宿主細胞以及方法，也提供了產生的抗體，即與NCBI接收號No.NM205953基因編碼區第79-1485位核酸序列有至少50%、優選至少60%、特別優選至少70%的同一性、更優選至少80%的同一性、特別是90%、91%、92°/。、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的核酸序列編碼的多肽的抗原表位特異性結合的抗體，其中這個多肽在宿主細胞表達、優選功能表達由能對spinosyn響應的核酸編碼的多肽。優選與NCBI接收號No.NM205953核酸序列以及才第367-380位胺基酸的多肽特異性結合的抗體。本發明的抗體包括能夠與已經鑑定的抗原表位結合的多克隆和單克隆抗體、抗體的片段和人源化的抗體。本發明的人源化的抗體可以用本領域技術人員已知的嵌合體的方法產生。本發明的抗體片段包括但不限於Fab、Fab2和Fd片段。本發明也提供了能夠產生上面描述抗體的雜交瘤。雜交瘤是能夠分泌特異性單克隆抗體的永生化細胞系。一般而言，本領域所熟知的製備多克隆、單克隆抗體以及能夠產生理想抗體的雜交瘤技術參見Campbell,1984和St.Grothetal，1980。用菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位蛋白質(或其抗原片段)作為抗原免疫任何已知能夠產生抗體的動物(小鼠、兔子等等)可以產生抗體。免疫方法是本領域技術人員已知的。這些方法包括皮下或腹腔注射蛋白質。本領域技術人員可以根據免疫不同的動物、蛋白質抗原性和免疫注射的位置知道用於免疫接種的菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位蛋白質的量是不同的。對作為免疫原的蛋白質修飾或給予佐劑給藥來增加蛋白質抗原性。增加蛋白質抗原性的方法是本領域已知的，包括但不限於將抗原與異種蛋白質偶聯(如球蛋白或P-半乳糖苷酶)或在免疫過程中加入佐劑。對於單克隆抗體，將從被免疫動物中分離的脾細胞與骨髓瘤細胞融合(如SP2/OAg15骨髓瘤細胞)形成產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。可以使用本領域所熟知的鑑定產生具有理想特徵的抗體雜交瘤細胞的任何方法之一。這些方法包括ELISA試驗篩選雜交瘤、Westernblot分析或放射性免疫法(Lutzetal,1988)。克隆培養分泌理想抗體的雜交瘤，而後用本領域所熟知的方法(Campbell,1984)測定抗體的類和亞類。從被免疫的動物分離含抗體的抗血清的多克隆抗體，而後用上面描述的一個方法篩選得到具有理想特異性的抗體。本申請進一步提供了上面描述的以可檢測標記形式存在的抗體。抗體可以通過使用放射性同位素、親和標記(如生物素、卵白素等)、酶標記(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等)、螢光標記(如FITC或若丹明等)、順磁原子、納米顆粒而被可檢測地標記。用本來領域所熟知的方法對抗體進行標記，例如參見Sternbergeretal,1970、Bayeretal,1979、Engvaletal,1972、Godingl976和Yeetal，2005。本發明標記的抗體或其片段可用於進行體外、體內和原位檢測鑑定表達具有該被鑑定的抗原表位的受體亞單位的細胞或組織、鑑定包含具有該被鑑定的抗原表位的受體亞單位的樣品或鑑定樣品中的存在的具有該被鑑定的抗原表位的受體亞單位。更特別地，抗體或其片段通過與樣品孵育可用於檢測樣品中的具有該被鑑定的抗原表位的受體亞單位。與樣品中具有理想抗原表位的任何受體亞單位結合的抗體或其片段形成複合物。然後檢測複合物，籍此檢測樣品中的受體亞單位。本發明的另外一個方面涉及包含基因的生物體，其中基因的編碼區與包含NCBI接收號No.NM205953基因編碼區的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性，其中包含了突變的生物體顯示相對母系來源的生物體對spinosyn的響應的降低。感興趣基因的突變可導致生物體中的受體亞單位蛋白質不表達，或可以表達受體亞單位蛋白質但包含改變的配體結合位點。本領域所熟知的任何遺傳誘變的方法都可以產生基因的突變(Ashbumer,1989和Wood,1988)。在基因或基因組中產生突變的技術包括輻射(如X射線、紫外或y射線)、化學試齊W如EMS、MMS、ENU、甲醛等)和由轉位子插入誘導的包括發育不全的可動因子導致的插入誘變或轉位子介導的缺失，如前面所述的男性重組。改變基因表達的其它方法包括使用轉位子(如P元件、EP-類型"過表達阱"元件、水手元件、piggyBac轉位子、hermes、minos、sleepingbeauty等)反義雙鏈RNA幹擾、肽和RNA適體、直接缺失、同源重組、顯性負性等位基因和細胞內抗體使基因不表達。許多誘變劑可以造成遺傳突變。誘變劑的示例是本領域技術人員已知的，包括但不限於化學誘變劑(如影響(增加或減少)活性的DNA嵌入或DNA結合化學試劑、化學試劑與DNA分子結合編碼可能或表達基因的蛋白質)、物理誘變劑(如紫外光、電離輻射(Y、P、a輻射、X射線))、生物化學誘變劑(如限制性內切酶、DNA修復誘變劑、DNA修復抑制劑、易錯DNA多聚酶和複製蛋白質)等等。誘變劑和DNA相互作用造成DNA序列的誘變改變。在損傷作用下加入誘變劑造成突變可啟動替代的DNA修復機制可以參與完成突變。在某一個實施方案中，化學誘變可誘導靶細胞或生物體一個或多個基因的突變。化學誘變劑通常的實施例是N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)突變細胞和生物體。在本發明中使用的化學誘變劑的其它實施例包括但不限於ethylmethanesulphonate(EMS)和ICR191。許多其他的化學誘變劑是本領域技術人員所熟悉的，也可以用於本發明，參見Friedbergetal,1995，通過參考，其指導化學誘變劑和在不同細胞和生物體中誘導基因突變的突變，而併入本發明。本領域技術人員可以明白突變包括缺失突變、插入突變、移碼突變、無義突變、錯義突變或剪切突變。本申請示範了本領域所熟知的破裂和失活基因的轉位子插入突變技術。許多技術應用P元件轉位子誘導果蠅的插入誘變，產生誘導隱性致死突變的P元件轉位子的技術(P-致死)特別適用於快速鑑定新的果蠅的必需基因(Cooleyetal,1988;Spraldingetal,1995;Ohetal，2003)。由於P元件和果蠅基因組的序列是已知的，所以快速鑑定轉錄單位是可能的，即由插入到插入序列的兩側的P元件一端或兩端序列造成的斷裂P元件。本發明中，斷裂感興趣的果蠅基因如果是同源的則不能導致致死效應，但可以對抗spinosyn或其衍生物的致死效應。這個基因的突變顯示影響編碼蛋白質的化合物是有效的殺蟲劑化合物，這類蛋白質是篩選和發現的有效殺蟲劑的極好的靶標。此外，影響這類蛋白質的化合物具有治療的效果。用共抑制的方法(Bingham,1997;Smyth，1997;QueandJorgensen,1998)可產生spinosyn抗性表型(包括apinosyn衍生物抗性表型)。共抑制是由於表達或注射與感興趣基因的部分片段一致的反義RNA鏈造成的基因表達降低的表型。共抑制效應被有效延伸到植物和線蟲以產生功能缺失表型。在果蠅中只有一篇關於共抑制的報導，即用共抑制方法從白色Adh轉基因誘導Adh基因降低的表達(Pal-Bhadraetal，1997)。用雙鏈RNA幹擾技術(dsRNAi)可以產生spinosyn抗性表型。這個方法是根據來源於基因編碼區的雙鏈RNA的幹擾特性，在線蟲的遺傳研究中廣泛使用(Fireetal,1998)，在果蠅中可產生功能缺失的表型(KennerdellandCarthew,1998;MisquittaandPatterson,1999)。這個方法的一個實施例是，在體外合成來源於感興趣基因(例如主題基因)的重要部分的互補的正義和反義RNAs。在注射緩衝液中退火正義和反義RNAs，將雙鏈RNA注射或其他方法誘導進入動物(如在它們的食物中或浸漬在包含RNA的緩衝液中)。然後檢査注射動物的後代的感興趣表型(PCT公布no.W099/32619)。產生功能丟失如spinosyn抗性表型的其它方法包括使用肽適配體作為蛋白質功能的顯性抑制子(KoloninandFinley,1998;Xuetal,1997;Hoogenboometal，1998)、RNA適配體(Goodeta/.,1997;Ellingtonetat1995;Belletal，1998;Shietal,1999)和細胞內抗體(Chenetal，1994;Hassanzadehetal,1998aand1998b)。細胞內表達的抗體或細胞內抗體都是單鏈抗體分子，與細胞內的靶分子特異性結合併使其失活。細胞內抗體可用於細胞試驗和整個生物體如果蠅(Chenetal，1994;Hassanzadehetal，1998aand1998b)。用與主題(subject)蛋白質特異性反應的細胞內抗體構建誘導表達載體，這些載體被誘導進入模式生物體，用上面描述的研究適配體的相同方式迸行研究。突變的生物體可用於篩選理想表型如spinosyn抗性，選擇、鑑定和分類產生理想表型的基因如克隆、測序、序列圖等，鑑定生物體如根據本發明的這一方面的突變生物體。本研究的另一個方面是載體包括(a)反義核苷酸序列基本上與(1)與包含NCBI接收號No.NM205953編碼受體亞單位的編碼區的第79-1458位置的核酸序列有至少50%的同一性、優選至少60%的同一性、特別優選至少70%的同一性、更優選至少80%的同一性、特別是90%、91%、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的DNA分子一條鏈的相應部分區域互補；(b)與反義核酸連接的調節序列，以至於反義核酸序列在轉入的細胞中表達，其中轉化細胞公開了比未轉化細胞對spinosyn的響應降低。反義分子與編碼受體亞單位的整個DNA互補，如與整個分子的核酸長度相同。然而，較理想的是更短的分子。在一些範例中，可以用整個反義分子的片段。合適的片段優選含有至少20個核酸，可以與編碼整個分子的mRNA雜交。導入與受體亞單位基因產物mRNA(如導入反義分子)互補的RNA或單鏈DNA分子進入細胞可減少黑腹果蠅的受體亞單位基因產物的表達水平。反義分子與受體亞單位基因產物mRNA配對，阻滯mRNA翻譯成蛋白質。因此，黑腹果蠅的受體亞單位反義分子能夠阻斷編碼受體亞單位的mRNA翻譯成功能受體。與編碼受體亞單位或其片段的mRNA互補的反義分子可用來顯著降低黑腹果蠅功能受體亞單位的表達。先選擇表達功能受體亞單位第一水平的細胞，然後導入反義分子(或其片段)進入細胞。反義分子(或其片段)阻斷黑腹果蠅受體亞單位的表達導致細胞中黑腹果蠅功能受體亞單位的第二水平表達。第二表達水平少於起始的第一次表達水平。傳統地，目標基因編碼區(來自於基因組DNA或cDNA)或編碼反義RNAs的基因、共抑制RNAs、幹擾dsRNA、RNA適配體、肽適配體或細胞內抗體與特異啟動子和具有已經很好了解其調節功能的轉錄增強子、優選異源啟動子/增強子(啟動子/增強子對基因表達的主要途徑是非天然的)結合產生轉基因動物。用本領域所熟知的方法將外源性核酸序列轉入動物或培養細胞的基因組中可產生轉基因動物或重組細胞系。對於無脊椎動物模型，最常見的方法是使用轉位因子。有幾個合適的轉位因子可用來導入核酸序列進入模式生物體的基因組中。轉位因子特別適合向感興趣的基因中插入序列，以至於不能正確表達編碼蛋白質，產生功能缺失表型的基因敲除動物。在果蠅中用P元件(RubinandSpmdling，1982;U.S.Pat.No.4，670,388)、在線蟲用Tel(Zwaaletal，1993;EpsteinandShakes,1995)可以很好的建立這項技術。也可以使用其它Tel樣轉位因子如minos、mariner和sleepingbeauty。此外，已經鑑定了在不同物種中發揮作用的轉位因子，如PiggyBac(Thibaultetal"1999)、hobo和hermes。除了產生功能缺失表型外，轉位因子也可用來將感興趣的基因或其突變或變異體作為附加基因插入到動物基因組的任何功能區，導致基因的錯誤表達(包括過表達)。優化的從pGMR衍生的載體可以特異性的使轉基因果蠅的基因錯誤表達的(Hayetal.，1994)，載體長度為9Kb，包含大腸桿菌的複製起始區、氨苄青黴素耐藥基因、活動插入序列的P元件轉位子的3'和5'末端、White標誌基因、包括hsp70增強子的TATA區表達單位和a-tubulin基因3'非翻譯區的。表達亞單位包括插入增強子的第一個多克隆位點和位於500個鹼基下遊的插入感興趣基因的第二個多克隆位點。作為轉位因子的替代，利用同源重組或基因打耙技術置換動物同源基因中感興趣基因的一個或兩個拷貝。外源或內源啟動子元件可以調節轉基因，轉基因可以是一個小的基因或是一個大的基因組片段。在一個應用中，例如使用果蠅(Brandetal,1994)或線蟲(MeUoandFire,1995)中異位表達基因分析基因的功能。己經很好表徵的可以用於產生轉基因動物的異源啟動子的實施例是包括熱休克啟動子/增強子，即在溫度誘導下錯誤表達。在果蠅中，包括hsp70和hsp83基因，在線蟲中包括hsp16-2和hsp16-41基因。也使用果蠅中組織特異性啟動子/增強子包括在眼睛中表達的eyeless(MozerandBenzer,1994)、sevenless(Bowtelletal，1991)禾口glass-responsive啟動子/增強子(Quiringetal.,1994)和在翅膀中表達的dpp或vestigal基因起源的啟動子/增強子(Stachling-Hamptonetal,1994;Kimetal，1996)。最後，用內源性啟動子如主要蛋白質通路基因限制顯性激活或顯性負性轉基因的正常激活通路是必需的。在線蟲中，有用的組織特異性啟動子/增強子的示例包括咽肌肉特異性表達的myo-2基因啟動子、用於身體-肌肉特異性表達的hlh-1基因啟動子、神經元接觸特異性基因表達的mec-7基因啟動子。優選的實施方案中，將基因插入轉化載體，然後和包含顯性可選標記如，rol-6的質粒注射入線蟲，由於基因融合直接造成主要通路基因的錯誤表達。通過表型和主要通路基因錯誤表達造成的表型來鑑定轉基因動物。在果蠅中，用外源DNA的二元控制系統檢測發育特異性階段和組織特異性模式的錯誤表達(mis-expression)基因。二元外源調節系統的兩個實施例包括源自酵母的UAS/GAL4系統(Hayetal，1997;Ellisetal，1993;BrandandPerrimon，1993)和源自大腸桿菌的Tet系統(Belloetal，1998)。用已知的方法可以產生顯性負性突變，該突變引起蛋白質幹擾野生型蛋白質拷貝的正常功能，並且其導致在正常基因拷貝存在下的功能丟失或降低功能的表型(Hershkowitz，1987)。本發明的一個方面，提供了穩定轉化的轉基因魚。在一個實施方案中，轉基因魚的基因組中含有被導入與啟動子操作性連接的受體亞單位基因，其被穩定整合或插入到基因組中。優選的啟動子包括器官或組織特異性啟動子(包括細胞特異性的啟動子)或可以被特異性組織調節的啟動子。典型的，來自於除魚之外的動物的受體亞單位基因有利於構建到在本申請詳細描述的重組載體上。優選的受體亞單位基因是無脊椎動物受體亞單位。這樣的魚可以形成穩定魚系，其能夠複製，並把與受體亞單位相關的遺傳信息傳遞給它們後代的。本發明中用了許多種的魚。魚的實施例包括硬骨魚如斑馬魚。與其它動物模型相比，與其他動物相比較，選用斑馬魚有特別的好處。如，斑馬魚適於遺傳篩選、修飾篩選和化學篩選，可快速的發育成ex-utero，有明顯的生活周期，每周可產生非常多的後代。用相對很小的設施(在9升的池子中可以生存54個成年斑馬魚)可以餵養斑馬魚，且很容易產生為數眾多的後代，每一個成熟的雌性一般每周可以產100-300個卵。這些卵是體外受精產生的，胚胎是透明的，因此可以用解剖顯微鏡觀察早期的造血組織和其它器官和組織系統的發育。胚胎的大部分器官的發育是非常快的，在受精後5天血細胞可以完全發育成熟，3個月時達到生殖成熟。載體包括編碼受體亞單位的基因操作性與啟動子相連接。優選器官或組織特異性的啟動子。由於大部分哺乳動物的啟動子在魚中不能很好的發揮作用，因此本領域的技術人員用所熟知的方法將斑馬魚、fogu或其它物種的魚的基因組調節序列特異性的克隆到感興趣的編碼序列的上遊、中間和下遊。類似的程序也可以用來構建其其如斑馬魚的器官或組織特異性啟動子，這也是本領域技術人員己知的。轉運載體中包括轉基因。本申請用的本領域所熟知的載體指的是包括設計用來直接轉化(如通過將外源性的DNA插入到其基因組可以改變細胞遺傳物質的過程)目標細胞遺傳物質的核酸序列構建。載體可能包括多個位置和序列定向的(oriented)遺傳性元件，即與其它必需或理想元件操作性連接，以便在盒(cassette)中核酸的可以被轉錄，並且如果需要在微注射的單細胞受精胚胎中翻譯核酸。通過本領域技術人員所熟知的和許多文獻中描述的方法將上面引用的核酸序列插入載體從而構建重組表達載體。本發明用了許多已知的載體。合適的載體包括質粒載體、病毒載體包括逆病毒載體(參見Milleretal，1993)、腺病毒載體(參見Erzurum,etal，1993;Zabner,etal，1994;andDavidson,etal,1993)、腺相關病毒載體(參見Flotte，etal，1993)、皰疹病毒載體(參見Anderson,etal，1993)和慢病毒載體(參見Lever,2000)。這些載體包括其它已知的在特異宿主細胞中有效表達的必需或理想的遺傳元件，包括調節元件，如本申請描述的轉基因魚宿主細胞。例如，載體包括啟動子，例如本申請描述的具有器官或組織特異性的啟動子，和與啟動子共同作用以達到轉錄基因的任何必需的增強子序列。"增強子"指能夠在細胞中刺激啟動子活性的核酸序列元件，如本申請描述的轉基因魚宿主細胞。載體也可以例如是線性的。核酸序列與編碼報告基因產物的核酸序列融合，以便形成融合蛋白質，能夠可視化觀察或其他方式鑑定存在的融合蛋白質或其位置。術語"編碼"指的是通過轉錄和翻譯的機制，轉錄和翻譯核酸序列的過程，這使細胞具有將一系列的胺基酸聚集到胺基酸序列上產生多肽的信息的特性。這樣的核苷酸序列的一個示例是，本發明用的編碼GFP的核苷酸序列，以便在發育的胚胎的區域和/或hatched或者成熟魚融合蛋白一旦表達時產生螢光。作為替代，可以使用其它報告基因產物包括螢光素酶、(3-半乳糖苷酶、氯黴素醯基轉移酶、P-葡萄糖苷酶和鹼性磷酸酶。檢測本申請描述的報告基因產物存在，包括檢測其活性或量的試驗是本領域技術人員熟知的，以及也在定期更新的CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubeletal，eds.，JohnWiley&Sons)中有描述。本申請可以發現對報告基因試驗的更詳細的描述，例如下面的文章螢光素酶參見Nguyen,V.T.etal.(1988)、|3-半乳糖苷酶參見Martin,C.S.，etal，1997;JainandMagrath,1991);卩-葡萄糖苷酶，卩-葡萄糖苷酶和鹼性磷酸酶參見Bronstein,etal(1994);氯黴素醯基轉移酶參見Cullen(1987);Go腿n,C.etal,(1982);Mineretal.(1988);Sleigh(1986);小時ubyandWilsonC1992)。本發明的另外一個方面，基因位於報告基因之前，所述報告基因如螢光蛋白質基因(例如GFP、RFP、BFP、YFP或dsRED2)或螢光素酶蛋白質基因，包含位於特異性重組酶識別位點(如Flox、Lox或FRT位點)兩側的一個強的轉錄終止位點。一個普遍存在的啟動子(如EFI-a或(3-actin)可以啟動"Loxed"、"Floxed"或"FRPed"報告基因的表達。由於位於報告基因內的強轉錄終止位點，在重組蛋白質不存在的情況下，報告基因的鄰近的第二個基因產物(如受體亞單位基因)不表達。然而，當在細胞中激活重組蛋白質表達時，就會切斷Loxed,Floxed，orFRPed的報告基因產物，第二個基因與普遍表達的基因啟動子並排排列。此外，組織特異性重組通過使用雷射激活熱休克可導入位點特異性重組酶轉基因。在胚胎發育過程中雷射可激活單個細胞。這些發明的另外一個方面是本申請提供了製備轉基因魚的方法。在一個實施方案中，方法包括導入受精魚卵(包含魚的胚胎)或沒有受精的魚卵的核酸，該核酸包括無脊椎動物受體亞單位與啟動子操作性連接。本申請描述的核酸可以是載體的一部分。當用受精的魚卵時方法包括從魚的胚胎發育成轉基因魚。當編碼菸鹼受體亞單位的基因導入沒有受精的卵時的方法包括受精魚卵和從魚的胚胎發育成轉基因魚。有許多本領域技術人員熟知的方法可將核酸導入到卵中，包括機械的方法、化學方法、親脂的方法、逆病毒感染的方法和電穿孔。例如，示例性的機械方法包括例如微注射。示例性的化學方法包括例如磷酸鈣法或DEAE-葡聚糖法。示例性的親脂的方法包括使用脂質體和其它脂質介導轉染的陽離子試劑。這些方法都是本領域技術人員已知的，伊J鄉口也在GeneTransferMethods:IntroducingDNAintoLivingCellsandOrganisms,(NortonandSteel，2000)和定期更新的CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubeletal.,)中有描述。例如，涉及魚的微注射的方法在例如ChenandPowers(1990)和FletcherandDavis(1991)有更進一步的詳細描述。涉及魚的電穿孔的方法在例如Powersetal.(1992)和Luetal.(1992)中有更進一步的詳細描述。用逆病毒載體，如泛嗜性逆病毒載體感染的方法導入DNA進入魚卵或胚胎的技術在Bums，J.C,etal(1993)中有描述。包括轉基因的載體或其它核酸可以在發育的理想階段導入沒有受精的卵或受精的卵中。本申請描述了可以使用的多個編碼不同轉基因的載體。當使用受體卵或胚胎時，優選將核酸導入胚胎(即在發育的一個細胞階段)。然而，在發育的後期包括兩細胞期、四細胞期等等的階段可以通過給藥的方式把核酸導入。因此核酸可以被導入桑椹胚、囊胚等等中。用上面描述的轉基因的方法可以將分離的至少一個核酸分子導入進入受精卵。此外，在發育的後期當核酸進入受精卵，用上面描述的轉基因的方法，分離的至少一個核酸分子整合到上述轉基因構建中，並進入至少一個細胞中如桑椹胚、囊胚中。用標準的方法可以從合適的魚得到其卵。許多魚可以通過商業購買的方式得到，如寵物商店。用本領域已知的方法可得到受精卵。例如，將相應年齡的魚，如3-12個月的魚，按照雌性和雄性的理想比率如(2:1)放到一個相應大小的容器如池子中。在交配後的一定時間如10-60分鐘，將魚放在池子中的交配室中，收集受精卵。例如在Gulpetal.(1991)中描述了這個方法。或者，本領域技術人員所熟知的方法是用人工授精的方法得到魚的受精卵。還可以用本領域技術人員所熟知的其它方法得到受精的魚卵。在把構建的核酸導入進入魚卵或胚胎後，形成的魚卵或胚胎在具有一個適宜的環境中發育成成年的魚。例如，這個適宜的環境包括在28.5°C的E3卵水中生活15天，而後在16天注入循環系統的水(Westerfield，2000)。可以通過包括基因組DNA的點雜交和Southernblot雜交的本領域技術人員熟知的方法鑑定本申請描述的產生的轉基因魚。簡言之，這個方法包括從魚的組織中分離基因組DNA、用限制性內切酶消化DNA和Southernblot雜交消化的DNA產物，如在Chen，T.T.etal(1996)中有描述。通過從鰭組織中分離基因組DNA、聚合酶鏈反應擴增轉基因序列和Southernblot分析擴增的產物進行初步篩選，這個方法在Luetal.(1992)和Chenetal(1993)有描述。此外，如果被導入的核酸編碼包括受體亞單位GFP融合蛋白質的菸鹼受體亞單位螢光融合蛋白質，可以用可見的螢光進行初步篩選。優選的產生轉基因魚的轉基因可以穩定整合到其基因組中。這意味著轉基因被整合到魚的基因組中而不是染色體外。在轉基因魚孵化後的一個合適的時間，加入試驗的藥物或試劑。在本發明的其它形式中，在魚的胚胎和魚卵中加入試驗試劑。用標準的本領域技術人員已知的方法可以將編碼受體亞單位的DNA片段整合到轉基因小鼠的基因組中。本領域已知的多種方法可以用於將轉基因導入動物以生成建立起來的轉基因動物系，例如可參見Hoganetal.1986and1994;U.S.Pat.Nos.5,602,299;5,175,384;6,066,778和6,037,521。這些技術包括但不限於原核微注射(U.S.Pat.No.4,873,191)、逆病毒介導基因轉入生殖種系(VanderPuttenetal.1985)、胚胎幹細胞基因打靶(Thompsonetal,1989)、胚胎電穿孔(Lo,1983);和精子介導的基因轉移(Lavitranoetal.1989))。例如，用在不同發育階段的胚胎細胞導入轉基因生成轉基因動物。根據胚胎細胞的發育不同的階段用不同的方法。受精卵是微注射一個很好的靶標，微注射受精卵的方法是本領域已知的，參見U.S.Pat.No.4,873,191中的描述。在小鼠中，如果雄性前核的直徑大小達到大約20微米時，可以重複注射l-2皮升(pi)的DNA溶液。用受精卵作為靶標進行基因轉移具有主要的優點，即在大多數情況下，注射的DNA可以在第一次分裂前整合到宿主基因組中(Brinster,etal.1985)，作為結果，非人類的轉基因動物的所有細胞都帶有了轉基因。由於50%的生殖細胞都帶有轉基因，這通常也可以反映轉基因從建立者(founder)傳給後代的傳遞效率。將受體亞單位核酸片段微注射到前核可以生成轉基因小鼠。導入目標載體進入胚胎幹細胞(ES)可以生成本發明的轉基因動物。在適合的條件下體外培養植入前胚胎可以獲得胚胎幹細胞(Evansetal.1981;Bradleyetal.1984;Gossleretal1986;andRobertsonetal.1986)。使用本領域技術人員熟知的包括電穿孔、磷酸鈣共沉澱、原生質體或原生質球融合、脂質體和DEAE-葡聚糖介導的DNA轉染的方法可以將DNA有效轉入到胚胎幹細胞生成轉基因。通過逆病毒介導的導入或微注射技術可以將轉基因導入進入胚胎幹細胞。轉染的胚胎幹細胞在進入胚泡期胚胎的囊胚腔後，可以擴增胚胎，生成嵌合體動物(reviewedinJaenisch,1988)。轉染的胚胎千細胞進入囊胚腔前，如果轉基因帶有篩選標記，可用各種篩選的方法富集整合了轉基因的胚胎幹細胞。也可以用PCR的方法篩選整合到轉基因中的胚胎幹細胞。在胚胎幹細胞進入囊胚腔前，這個方法不需要在合適的篩選條件培養轉染的胚胎幹細胞。此外，可以用逆病毒感染的方法將轉基因導入非人的動物中。發育的非人的胚胎可以在體外培養到胚泡期。期間，卵裂球可作為逆病毒感染的靶標(Janenich,1976)。酶切消化透明帶可以有效感染卵裂球(Hoganetal，1986)。典型的導入轉基因的病毒載體系統是帶有轉基因的複製缺陷逆病毒(Jahneretal.，1985);VanderPutten,etal，1985)。在單層病毒包裝細胞中培養卵裂球可以非常容易和有效的轉染(VanderPuttenetal,1985;Stewartetal,1987)，或者，可以在後面的階段進行病毒感染，將病毒和病毒包裝細胞注射入囊胚腔(Jahneretal，1982)。大部分的第一代是轉基因的嵌入體，因為整合僅僅發生在一部分的細胞，其之後形成轉基因動物。另外，逆病毒載體介導的第一代轉基因動物的轉基因插入到基因組的不同位置，一般其後代就會分離。此外，小型的胚胎可通過子宮內的逆病毒感染導入轉基因進入種系(Jahneretal.，1982)。其它本領域技術人員已知的利用逆病毒或逆病毒載體生成轉基因動物的方法包括逆病毒顆粒或產生逆病毒的絲裂黴素C處理的細胞微注射到受精卵或早期胚胎的卵黃周隙(WO90/08832;HaskellandBowen,1995)。將編碼受體亞單位多肽的cDNA的DNA片段微注射到非人哺乳動物如小鼠的單細胞胚胎前核，將注射的胚胎移植到假孕雌性動物的輸卵管或子宮，生成轉基因動物。培養生成的第一代動物可以交配、近親交配、遠親交配或交叉交配生成特定動物的後代。這些交配策略的示例包括但不限於多於一個整合位點的遠親交配可產生不同的種系，不同種系的近親交配產生高表達轉基因的化合物轉基因(由於每一個轉基因的加成表達效應)，異源轉基因小鼠的交配產生DNA分析中增加表達而不需要篩選的在某一個整合位點的純合子小鼠，不同的純合子種系的交配可產生化合物雜合子或純合子的種系，培養不同近親交配遺傳背景的動物來檢査表達修飾轉基因動物和表達的生理效應。本發明得到了在所有細胞均攜帶轉基因的非人的轉基因哺乳動物，和部分細胞中帶有轉基因的非人的轉基因哺乳動物，即嵌合體動物。轉基因可以以單轉基因或串聯體如頭頭串聯或頭尾串聯整合。篩選轉基因動物，檢測以篩選表達受體亞單位表型的動物。可以先用如Southernblot分析或PCR技術進行第一步篩選分析動物細胞來證實轉基因的整合。可以用但不限於來自動物組織樣品的Northernblot分析、原位雜交和逆轉錄酶PCR(rt-PCR)的方法評估轉基因動物細胞中的轉基因mRNA的表達。可以進一步表徵非人轉基因哺乳動物的特性，以鑑定具有本發明的方法中有用的表型的那些動物。本發明的篩選方法中，對有機體如果蠅給予大量的候選試劑。給藥後，通過與對照(如沒有給予候選試劑的轉基因或野生型的果蠅)比對檢測生物體，確定對有機體例如果蠅有效的候選試劑。一般，通過將候選試劑混合到果蠅的營養培養基中，並放在有果蠅(幼蟲或成蟲，一般是成蟲)的培養基中，以便該果蠅以此培養基為食而口服給藥，所述的培養基例如水和含有添加的營養試劑。用本領域所熟知的方法對其它生物體給藥。一般分析多數混合物的試驗是平行進行的，不同濃度的試劑試驗來得到對候選試劑不同濃度的不同反應。一般，濃度試驗中要有一個不加複合物的陰性對照。優選的實施方案是，用高通量篩選的方法對大量的生物體平行的篩選大量候選化合物。"大量"也是多數的意思，也就是指至少10-50，通常至少100和更通常至少IOOO，其中數目可以是10，000或50,000或更多，但是在許多試驗中將不超過5000。本發明的方法用於篩選大量不同的可能殺蟲劑的候選化合物。候選的複合物包括許多化學類型，儘管通常是有機分子，優選分子量大於50並小於2,500Da的小分子有機化合物。候選的化合物包括與蛋白質結構相互作用所必須的功能集團，特別是氫鍵結合，以及特別包括至少氨基、羧基、羥基或羧基基團，優選至少兩個功能基團。候選的化合物通常包括含有上面提到的一個或更多個功能基團取代的環狀的碳或雜環結構和/或芳香或多芳香結構。候選化合物也發現於活性分子中，包括但不限於肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶和其衍生物、結構類似物或其組合。候選化合物的來源很豐富包括合成的文庫或天然的化合物。例如，有許多方法可以隨機和直接合成大量的有機化合物和活性分子包括隨機表達寡聚核苷酸和寡肽的方法。在細菌、真菌、植物和動物抽提物中可產生天然化合物文庫。此外，天然或合成的文庫和化合物可以通過傳統化學、物理和生物化學方法修飾，可用於生成組合文庫。直接或隨機化學修飾，如醯化、烷化、酯化、醯化(amidification)等等可以被產生結構類似物。用藥物設計或計算機模式的方法可以創造新的可能殺蟲劑或治療化合物。上述篩選的方法是評估用作殺蟲劑的候選化合物效果和安全性的多步篩選過程的部分。本發明的多步篩選過程候選化合物或化合物文庫可用於在本發明的轉基因生物體中篩選。此外，在篩選候選化合物作為殺蟲劑的體外篩選試驗前要先做一個體內篩選。可以使用任何常規的體外篩選的試驗，其中許多合適的體外篩選試驗是本領域技術人員所熟知的。本發明也提供了用於本發明的篩選方法的試劑盒。本發明的試劑盒包括本發明生物體或生成這樣生物體的方式，例如本發明的雄性和雌性有機體，攜帶需要的基因，例如轉基因、轉座酶基因、GAL4等等的載體。把果蠅放在相應的容器中如管形瓶中培養。本發明的試劑盒也包括動物的營養培養基，如果蠅的培養基。用本領域技術人員所熟知的基於PCR檢測的直接對比的方法，篩選果蠅種群中具有抗性殺蟲劑的生物活性。如Aronstein，K.etal.(1993)。具體實施例方式實施例克隆果蠅菸鹼乙醯膽鹼a-6亞單位使用FasrTack2.0mRNA分離試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)從冰凍的果蠅頭部分離PolyA+mRNA。將果蠅頭(0.326g)和15ml裂解液加入到Dounce勻漿器中，從10倍的儲存液中得到裂解液。然後，按照說明書操作，用25pl的洗脫緩衝液懸浮最後得到的mRNA沉澱。用溶解在200jxl的洗脫緩衝液中的5|ilmRNA測定A260/A280的讀數。mRNA的濃度是0.139pg/W，總量是3.475jig。使用InvitrogencDNAcycle試劑盒(Invitrogen,Carlsbad，CA)合成第一條鏈cDNA，2(Vl反應體系中，加入3.5ji1mRNA(0.4865嗎mRNA)，按照說明書進行操作。然後用FailSafePCR試劑盒(Epicentre,Madison，WI)進行PCR，25^1反應體系依次加入1^1cDNA、2.5^1的lOpM/pl的SEQUENCEIDNOS.3和4引物、0.5^1FailSafe酶、12.5^12xFailSafePCR混合物(A-L)和5|alH20。在PerkinElmerCetusDNAthermalcycler儀器上進行PCR反應，條件如下95。C30秒，55。C30秒，72°C2分鐘，共30個循環。取5)al反應產物P/。的瓊脂糖/TBE凝膠電泳。用預混合物A、D和G可以分別產生預期的1497bp長度的反應產物。將剩下的20^1PCR反應產物上樣到1%的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，用QiaexII(Qiagen，Valencia,CA)純化回收條帶。將純化回收得到的PCR產物連接到pCR2.1-TOPO載體上，然後按照Invitrogen,Carlsbad，CA的說明書操作將其轉化到TOP10細胞。用WizardPlusSV小量抽提試劑盒(Promega，Madison,WI)提取從每一個PCR產物中得到的18個克隆的質粒DNA。用EcoRI酶切分析質粒DNA，可以產生三種形式的片段包括932bp和565bp的兩個片段、只有一個的H97bp片段或者是稍微大一些的單一條帶。對這些克隆測序結果公開來源於外顯子3和8(Grausoetal，2002)的不同剪切可以產生剪切變異體。由於RNAi編輯(Grausoetal.2002)導致內部EcoRI酶切位點消失，因此EcoRI酶切消化只能產生單一的酶切片段。用標準的分子技術從pCR2.1-TOPO載體上切下果蠅30D基因作為BamHI片段，並亞克隆到pAcP(+)IEl-3(Novagen,Madison,WI)和pGH19(Limanet.al，1992)載體上。克隆果蠅菸鹼乙醯膽鹼(X-5亞單位以果蠅的胚胎mRNA作為模板(Clontech,PaloAlto，CA)，用SuperscriptIIfirststrandsynthesisi式齊廿盒(Invitrogen，Carlsbad,CA)合成第一條鏈cDNA。以序列ID號5和6為引物，用FailSafePCRkit(Epicntre,Madison,WI)試劑盒的2X反應混合物A-F迸行PCR反應，條件如下95°C3分鐘變性，而後進行30個循環的95。C30秒、55°C30秒、72。C2.5分鐘，最後72。C延伸10min。反應A和D可以擴增得到預期片段為2440bp的PCR產物，將其連接到pCRBluntll-TOPO載體上，對得到的一些克隆測序。其中得到的一個克隆與NCBI接收號No.AF272778僅僅有3個鹼基的改變。這些核苷酸的變化導致2個胺基酸的置換，在603位置處I-V的變化(相對於M起始)和795處I-M的變化，這兩個置換都是保守胺基酸。用標準的分子技術從pCRBluntll-TOPO載體中酶切該基因，命名為XbaI片段，將其亞克隆到pAcP(+)IEl-3和pGH19載體上。克隆果蠅菸鹼乙醯膽鹼ot-7亞單位以果蠅的幼蟲mRNA作為模板(Clontech,PaloAlto，CA)，用SuperscriptIIfirststrandsynthesis試齊U盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)合成第一條鏈cDNA。以序列ID號7和8為引物，用ThermalAcePCRkit(Invitrogen,Carlsbad,CA)試劑盒進行PCR，使用梯度段(gradientblock)的循環條件，如下95。C預變性3分鐘，而後95。C30秒，45°C、53.3°C或者60。C30秒，74。C2分鐘，共30個循環，最後74°C延伸10分鐘。每個反應產生預期大小的產物1633bp。將60。C退火得到的產物連接到pCRBluntll-TOPO載體上，然後測序和鑑定得到的大小正確的克隆。結果得到了從ATG起始密碼子開始1378處單個鹼基C到T的變化，這個改變導致形成了翻譯提前終止密碼子。用QuickChangeIIsitedirectedmutagenesiskit(Stratagene，LaJolla，CA)試劑盒將T還原成C。最後得到的序列與NCBI接收號No.AJ554210匹配發現，除了在311位的賴氨酸為蘇氨酸和C端的FP胺基酸序列替代了VSGVRG。用標準的分子技術從pCRBluntll-TOPO酶切片段，命名為XbaI耙基因，亞克隆到pAcP(+)IEl-3和pGH19載體上。克隆線蟲ric-3將得到的線蟲ric3基因PCR產物連接到pCR2.1-TOPO載體上，證實包含1137bp大小插入片段的正確的克隆。以加入了BamHI酶切位點的序列ID號9禾n10為引物，用FailSafePCRkit試劑盒進行PCR擴增。將得到的PCR產物克隆到pCR2.1-TOPO載體上，對大小正確的克隆進行測序。得到的克隆與NCBI接收號NM068898序列完全一致。用標準的分子技術，從p2.1-TOPO重組載體中將基因切下，作為Bamffl片段，並亞克隆到pAcP(+)正l-3和pGH19載體上。功能分析製備宿主細胞通過水浴(bathing)用2g/l的三卡因甲基磺酸鹽麻醉非洲爪蟾(Xenopus1，AnnArbor,ML;Nasco，FortAtkinson,WI)，外禾鬥手術取出卵母細胞，將其放到包含96mMNaCl、2mMKCl、1.8mMCaCl2、1mMMgCl2、5mMHEPES5、2.5mM丙酮酸鈉、100units/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素pH7.6的培養溶液中。卵母細胞在通常不含(^2+的蛋白酶溶液中分散，以defoUiculate卵母細胞，該蛋白酶溶液包含88mMNaCl、2.5mMKCl、lmMMgCl2、5mMHEPES、2.5mM丙酮酸鈉、100units/ml青黴素和0.1mg/ml鏈黴素pH7.6和1.5mg/ml膠原酶IA(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)。分離之後，徹底衝洗卵母細胞，然後將其放回到含有C^+的培養溶液中，18。C保存。合成用於爪蟾卵母細胞注射的cRNA按照下面的方法合成cRNA:用NotI、XhoI或NheI其中的一個限制性內切酶酶切線性化質粒DNA。用T7mMessagemMachinekit(Ambion，Austin,TX)試劑盒按照說明書操作，以線性化的DNA為模板合成cRNA。導入核酸分子用於將cRNA注射入爪蟾卵母細胞的，微量移液器在DMZ-UniversalPuller(Zeitz-Instruments,Mlinchen，Germany)上做成。用負壓將注射用的cRNA吸入到微量移液器中。用NanojectII卵母細胞注射器(DrummondScientificCo"Broomall,PA)，以正壓將接近10-50ng的cRNA注射到卵母細胞中。下面這些核酸被注射到卵母細胞(1)菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位亞單位(30D);(2)菸鹼a-7受體亞單位(34E);(3)菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位和線蟲ric-3(30D和ric-3);(4)菸鹼a-7受體亞單位和線蟲(34E和ric-3);(5)菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位和菸鹼a-7受體亞單位(30D和34E);(6)菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位、菸鹼a-7受體亞單位和線蟲ric-3(30D、34E和ric-3)。電壓鉗制術分析電壓鉗制術記錄的對照外部溶液包括88mMNaC1、1mMKCl、0.41mMCaCl2、2.4mMNaHC03、0.3mMCa(N03)2、0.82mMMgS04.7H20和15mMHEPESpH7.6。用重力灌注系統連續灌註記錄室。向外部溶液中加入lmM的菸鹼，然後將其加入到灌注液，持續30秒。而後，以不少於10分鐘從外部溶液中洗脫菸鹼。此後，用DMSO(二甲基亞碸)溶解spinosynA，以終濃度10將其溶解到外部溶液中，然後將其加入到灌注液中，持續60秒。而後從外部溶液中洗脫spinosynA，使得DMSO的終濃度不超過0.1%(v/v)。注射後用電壓鉗制術記錄1-5天，用OC-725C卵母細胞夾子(WarnerInstruments,Hamden，CT)進行手工記錄，大部分的結果要用Roboocyte自動卵母細胞記錄系統(RoboocyteAutomatedOocyteRecordingSystem)(MultichannelSystems,Reutlingen，Germany)記錄。對於手工記錄，裝酉己至ljDMZ-UniversalPuller(Zeitz-Instruments,Mi3nchen,Germany)上的記錄的微電極填充了3mMKC1，具有1-5的電阻。標準的電壓鉗制術的兩個電極是用來記錄加入菸鹼或spinosynA後電流的變化的。加入菸鹼或spinosynA後卵母細胞的電壓鉗位到-60mV，電流在峰值檢測。用上面描述的放大器放大得到的數據，用AcqKnowledge硬體/軟體(BIOPACSystems,Inc.,SantaBarbara,CA)或Roboocyte自動卵母細胞記錄系統軟體(MultichannelSystems,Reutlingen,Germany)在計算機上記錄數據。結果和討論下面的表格l公開了結果。表1.tableseeoriginaldocumentpage50"-"表示的是誘導的可以忽略不計的電流。"+"表示電流幅度小。"++"表示中等幅度電流。"++++"表示高幅度電流。本申請所出現的對數據的"可忽略不計"、"小"、"中等"和"高"描述性的術語都是相對的。從上面的表1可以看到，用30D(位於染色體2L的30D位置的菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位)的cRNA單獨注射卵母細胞，卵母細胞顯示對菸鹼和spinosynA都沒有反應。用34E(位於染色體2L的34E位置的菸鹼乙醯膽鹼受體a-5亞單位)的cRNA單獨或是34E和ric-3cRNAs聯合注射卵母細胞顯示對菸鹼小幅度的反應，但對spinosynA沒有可檢測到的反應。將30D和ric-3cRNAs聯合注射卵母細胞，顯示細胞對菸鹼和spinosynA的小幅度的反應。這個結果顯示菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位亞單位與伴隨蛋白質共同表達，即輔助蛋白能檢測具有影響a-6受體能力的化學試劑。將34E和30DcRNAs聯合注射卵母細胞顯示了對菸鹼和spinosynA中等幅度的響應。這更進一步證明菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位與伴隨蛋白質共同表達，即離子通道亞單位能夠檢測具有影響a-6受體能力的化學試劑。將34E、30D和ric-3cRNAs共同注射入卵母細胞顯示了對菸鹼或spinosynA的高幅度響應。這更證明菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位與多個伴隨蛋白質共同表達，能檢測具有影響a-6受體能力的化學試劑。結合試驗在昆蟲細胞中表達菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位用標準的分子克隆技術將位於染色體2L30D的菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位的基因克隆到杆狀病毒載體pAcP(+)IEl-3(Novagen,Madison,WI)，用杆狀病毒介導其表達，產生重組病毒，將Sf9細胞稀釋到2mlSf90011SFM(Invitrogen,Carlsbad,CA)培養基中，按照8x105細胞/孔的密度，接種到6孔板上，27°C貼壁培養l小時。在12x75mm的聚苯乙烯的管中混合DNA/lipid的混合物，包括86pl無菌水、5^1濃度為0.1嗎4d載體、5^1BacPAK6Bsu361線性DNA(Clontech,PaloAlto,CA)禾卩4(ilBacfectin(Clontech,PaloAlto，CA)，室溫培養混合物15分鐘。在培養DNA/lipid混合物的過程中，棄掉貼壁培養細胞的培養基，加入新鮮的1.5ml培養基。然後將DNA/lipid混合物逐滴滴入到細胞上，同時要不斷的搖晃，27。C培養5小時。然後，再加入1.5ml的Sf900HSFM，27°C培養4-5days。用臺式離心機1000rpm5分鐘離心細胞混合物，棄去細胞碎片。將包含重組病毒(轉染培養基)的上清收集到一個乾淨的tube管中，4。C儲存。為了擴增重組病毒，以1x106細胞/ml的密度將50ml的SfP細胞加入到125ml的一次性錐形瓶中。向細胞中加入1ml的轉染培養基，27。C140rpm培養48hours。48小時後，收集轉染混合物1000rpm離心5分鐘。將上清轉移到千淨的指定存放Pi病毒儲存的燒瓶中。為表達菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位，50ml的SfP細胞按照2x106細胞/ml的密度接種到125ml的錐形瓶中。向細胞中加入lml的PiVh-US儲存液，27°C140rpm培養24hours。取100^1的樣品做Westernblot證明菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的表達，剩下的樣品用來作結合試驗。在D.Mel-2細胞中表達克隆的30DnAC小時a-6前面克隆得到的果蠅nAC小時a-6基因是用PCR方法，以在seqID.12和13引物的5'和3'末端加入Spel位點的擴增得到的。在s叫ID.12的5'端加入了Kozak翻譯起始序列增加30DnAC小時a-6在D.Mel-2細胞中的表達。將得到的PCR產物連接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad,CA)載體上並測序。除了引物處的引入的變化，與前面確定得到的nAC小時30D—致。用SpeI酶從pCR2.1-TOPO載體上切下目標基因，然後分別連接到Spel酶切和鹼性磷酸酶處理的線性化pMT/V5-HisA和pIB/V5-HisA載體上。用限制性酶切和測序鑑定正確的克隆。用QiagenEndoFreeMaxikit(Qiagen，Valencia,CA)試劑盒大量提取質粒。在D.Mel-2細胞中表達克隆的線蟲ric3用加入了Kozak翻譯起始信號的SeqID14和SeqID10引物PCR擴增前面得到了克隆的線蟲ric3基因。將得到的PCR產物連接到pCR2.1-TOPO載體上，並測序。此序列除了加入的Kozak序列與前述的序列一致。作為BamHI片段分離這個基因，將其分別連接到己經用Bamffl酶切和鹼性磷酸酶處理的pIB/V5-HisA和pMT/V5-HisA載體上。用限制性酶切和測序鑑定正確的克隆。用QiagenEndoFreeMaxikit試劑盒大量提取質粒。在D.Mel-2細胞中瞬間表達果蠅nAC小時a-6基因將在含抗生素/抗微生物劑的果蠅SFM中培養的D.Md-2細胞按照1.9x107細胞/燒瓶密度接種到75cm2燒瓶s上，27。C過夜培養。用12x75mm的聚苯乙烯管混合轉染混合物，包括1630pl無菌水、40嗎pIB/V5-HisA/ric3、40jigpIB/V5-HisA/30D和250^1CellFectin。輕微混合試劑，然後室溫培養15分鐘。在培養混合物的過程中，用10ml的新鮮的不含抗生素的果蠅SFM培養基洗滌細胞，然後棄掉這個培養基，加入不含抗生素的6ml新鮮的果蠅SFM培養基。向轉染混合物中加入4ml不含抗生素的果蠅SFM培養基，然後將這個混合物轉移到燒瓶中。上下吹打輕微混勻，27。C過夜培養。在D.Mel-2細胞中穩定表達果蠅nAC小時a-6基因D.Mel-2細胞購於Invitrogen(Carlsbad,CA)，在125ml搖瓶中培養，需要50ml的體積。在包含5ml/L抗生素-抗維生物劑(100X)(Gibco,Carlsbad，CA)的果蠅SFM培養基，按照3x105細胞/ml的密度每周兩次傳代。將D.Md-2細胞按照5x105細胞/孔的密度接種到12孔板中，27°C過夜培養。在12x75mm的聚苯乙烯管中加入6嗎pIB/V5-HisA/ric3、82|_d無菌H20和12(ilCellFectin(Invitrogen，Carlsbad,CA)。輕微混合混合物，室溫培養15分鐘。在培養轉染混合物的過程中，棄掉細胞中的培養基，加入不含抗生素的lml新鮮的培養基。15分鐘後，棄去細胞培養基。向轉染混合物中加入0.5ml不含抗生素的培養基，然後將這個溶液加入到細胞中。混合物27。C培養48小時。48小時後，用細胞刮從盤上刮下細胞，分到包含抗生素的2ml果蠅SFM培養基的6孔板的四個孔中。27°C貼壁培養1小時，棄去培養基，加入包含25(ig/ml殺稻瘟菌素S(BlasticidinS)(Invitrogen，Carisbad，CA)的新鮮培養基。27°C培養5天。5天後，刮掉細胞集中轉移到一個管中，臺式離心機中600rpm離心，棄去上清，用含25pg/ml殺稻瘟菌素S的50ml新鮮的果蠅SFM懸浮細胞，27。C/140rpm震蕩培養。細胞以3xlO、dls/ml的密度每周傳代兩次。篩選4周後，降低殺稻瘟菌素S的濃度到10|ig/ml。在篩選劑量下培養3個月，接種5x105細胞/孔到12孔板中，27。C過夜培養。三個12x75mm的聚苯乙烯管中都加入下面的試劑2嗎pMT/V5-HisA/30D、0.15嗎pCoHygro(Invitrogen,Carlsbad,CA)(表達質粒和篩選質粒的比例是40:1)、89pl無菌H20和12|ilCellFectin。輕微混合樣品，室溫培養15分鐘，然後按照上面所描述的方法轉染細胞。24小時後，棄去包含轉染混合物的培養基，加入包含抗生素的1ml新鮮培養基，27°C培養另外24小時。從12孔板的三個孔中刮散細胞，平均分到兩個6孔板中。貼壁培養6小時後，向培養基中分別加入含有200、150、100或5(Hig/mlhygromycinB(潮黴素B)的2ml/孔的新鮮培養基。27°C繼續培養，每4-5天換含潮黴素B的新鮮培養基。篩選培養兩周後，刮散200ng/ml潮黴素B篩選的細胞，輕微沉澱，用包含20(Hig/ml潮黴素B的25ml新鮮培養基懸浮，然後轉到125ml的搖瓶中。27。C140rpm繼續培養，在篩選劑量下擴增細胞。為了誘導30DnAChR的表達，臺式離心機630rptn5分鐘離心收集細胞。用不含潮黴素B，終濃度為600nM硫酸銅的新鮮培養基按照2x106細胞/ml密度懸浮細胞，27。C/140rpm培養24小時。製備轉化細胞為進行結合試驗，如下方法製備昆蟲細胞和cRNA注射的爪蟾卵母細胞在室溫下輕微離心昆蟲細胞。棄去上清，用冰冷的包含200mM蔗糖、10mM磷酸鹽緩衝液、1mMEDTA和1mMPMSF在pH7.2-7.4條件下洗滌兩次。用冰冷的儲存緩衝液稀釋最後得到的細胞沉澱，然後分裝，這些分裝的樣品在-8(TC儲存，準備做結合試驗。按照前面描述的用電生理學的方法注射爪蟾卵母細胞，完整細胞用於結合試驗。放射性配體置換結合試驗在結合試驗中用兩個主要的放射性配體傳統的(X7放射性配體、[3H]methyllycaconitine(MLA，甲基牛扁亭鹼)和[3H]dihydrospinosynA(DHSA)。針對這兩個放射性配體要用包含10mM磷酸鈉(7.2-7.4)的結合緩衝液。用D.Mel-2細胞，所有試驗需要50nl細胞懸浮液。用爪蟾卵母細胞進行結合試驗，集合卵母細胞(2-5卵母細胞)，轉入lml的結合緩衝液中，輕微吹打結合緩衝液，換兩次新的結合緩衝液，洗去殘存的卵母細胞培養基。向每一個卵母細胞聚集中加入終體積為50-100^緩衝液。沒有標記的菸鹼和spinosynA分別用100%的DMSO和100。/。的乙醇配製成終濃度為40mM，如果有需要可以室溫下超聲，而後可以用結合緩衝液再稀釋。溶劑的終濃度要維持在每孔小於0.1%。25^沒有標記的競爭性化合物加入到細胞懸浮液或卵母細胞中。用化合物對細胞或細胞抽提物在平的搖床輕微搖晃預處理15-30分鐘，如果是pH]DHSA則l(TC處理，如果是["H]MLA則室溫處理。在總體積為100ul的結合緩衝液中，向混合物中加入25^的l-10nM[3H]MLA或[3H]DHSA。分別在三個反應96孔微孔滴定板中重複進行試驗，用平的搖床輕微搖晃30-90分鐘，如果是[SH]DHSA則l(TC進行，如果是[3H]MLA則室溫下進行。用TomTec(CT)96-孑L細胞收集器，通過GF/C玻璃纖維濾器色片(fiberfiltermats)輕微真空分離結合放射性和游離放射性的細胞抽提物。對於用pH]DHSA進行的試驗，用0.5%的PEI(w/v，用去離子水稀釋)預浸濾器色片1-2小時，以減少非特異性結合。然而，對於用卩H]MLA進行的試驗，只要簡單的用包含2mg/mlBSA(pH7.2-7.4)的10mM的磷酸鈉緩衝液預浸濾器色片就可以了。用冰冷的結合緩衝液快速洗滌樣品三次，用60。C烤箱烘乾濾器色片，用Meltilexsolid國scintillant(PerkinElmer，Finland)的WallacMicroBeta計數器(Counter)(Wallac，CT)計算三分鐘的樣品放射活性。在檢測整個卵母細胞的結合試驗的情況下，加入冰冷的結合緩衝液終止反應，然後兩次抽吸步驟，中間用結合緩衝液洗滌。將卵母細胞轉到包含7ml閃爍液雞尾酒溶液(scintillationcocktail)(UlitmaGoldMV，PackardBiosciences,CT)的閃爍瓶中漩渦，用液體閃爍計數器(liquidscintillationcounter)(Tri-carb2900TR,PackardBiosciences,CT)計數3分鐘0結果和討論表2用Dma6注射完整爪蟾卵母細胞後三天進行的^H]MLA結合tableseeoriginaldocumentpage55表2的結果顯示在菸鹼存在下，[3H]MLA能夠置換(72°/。)Da6-菸鹼受體的菸鹼。與卵母細胞的功能相關的數據(如誘導)提供了spinosyn對爪蟾卵母細胞表達Da6菸鹼受體的效果。此外，這些數據第一次公開了，spinosynA可以與在爪蟾卵母細胞表達的Da6菸鹼受體中的卩H]MLA結合。在瞬間表達Da6菸鹼受體的Sf9和S2細胞中觀察到[SH]MLA劑量依賴的置換試驗，表明這個試驗可以被用來進行高通量篩選和證實與Da6菸鹼受體相互作用的化學試劑。如下面的Figure3所看到的，與D.Mel-2細胞中表達的Da6和線蟲的ric3的fH]DHSA結合可以促進卩H]MLA的整個結合(improvedovertheoverallbindingseenwith[3H]MLA)。Figure3.[3H]DHSA置換formulaseeoriginaldocumentpage56此外，使用^H]DHSA對D.Mel-2細胞進行藥理學觀察發現，天然的菸鹼(nicotinicinnature)可被菸鹼置換(nicotinicinnatureasdemonstratedbydisplacementbynicotine),而不旨g被毒蕈鹼的試齊U如毒蕈鹼和阿託品置換。儘管置換^H]DHSA結合，通過使用傳統的如MLA和ot-金環蛇毒的菸鹼對抗物，可以在較高濃度表明，且這些配體和受體化合物的親和力相對很低。其它菸鹼配體如吡蟲啉、地棘蛙素、噻蟲嗪、甲醯膽鹼和山梗菜礆不能明顯置換卩H]DHSA的結合。這個結合的進一步表徵通過評估在^H]DHSA結合試驗中許多已知spinosym類似物的效果而進行。鼠李糖或呋塞米中沒有觀察到顯著的置換。spinosynA的pseudoagylcone也不能顯著置換。SpinosynA、dihydrospinosynA和spinosynA的許多生物學活性衍生物在I^H]DHSA結合試驗中可以顯著置換卩H]DHSA。這些數據進一步支持[SH]DHSA結合試驗可以用來預測配體和spinosynA的結合位點之間的相互作用，因此可以用於檢測結構活性關係。此外，這些數據表明這個試驗/受體結合可以被用來發現新的與spinosyn靶點相互作用的試劑。製備果蠅30D-特異性(菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位)多克隆抗邇對所有已經公布的昆蟲菸鹼乙醯膽鹼受體a亞單位序列利用VectorNTi程序的比對特性進行比對。證實了一個與30D編碼區367-380位胺基酸相符的15個胺基酸肽，其對於30D是唯一的。將SEQENCEIDNO:11的肽序列提交到ZymedLaboratoriesInc.(SanFrancisco,CA)可以獲得肽特定的多克隆抗體。用30D特異的抗體作為一抗，westernblot檢測確認宿主細胞中表達的菸鹼乙醯膽鹼a-6受體亞單位。這個30D特異抗體不能與表達的菸鹼乙醯膽鹼a-5受體亞單位或雞的(x-7受體亞單位的宿主細胞中分離的蛋白發生反應。發明的有機體用兩種方法對抗spinosynA的黑腹果蠅進行篩選。其中一個方法是，收集純合子遺傳型enbwdp的雄性果蠅，並在沒有雌性的情況下培養到2-5天(aged2-5)。雄性果蠅飢餓2-3小時，然後給予在1%蔗糖(w/v)中的40-50mM誘變劑的甲基磺酸乙酯(mutagenethyhnethanesulfonate)(EMS)溶液接近16小時。EMS處理後存活下來的雄性分別與能夠對抗spinosynA的有無效等位基因菸鹼乙醯膽鹼ot-6受體亞單位(其賦予spinosynA抗性)的純合子雌性交配或者與基因型為C>(9//wG/"(CX)賦予spinosynA抗性)的雌性交配。交配後產的卵發育成成蟲。2-5天後，通過給果蠅餵食spinosynA，和同時在管形瓶中，其事先用溶解在5%蔗糖溶液中的lOOppmspinosynA溶液浸漬的濾紙覆蓋標準黑腹果蠅的培養液培養。在化合物處理36-96小時後，如果spinosynA對成蟲沒有顯示或者有很小的毒性，則對spinosynA有抗性的成蟲個體打分。被認定對spinosynA有抗藥性的成蟲與CyO/InGla遺傳型的果蠅雜交(cross),以用於同源第二個染色體。這些雜交的第二個染色體的後代如果還是純合子則繼續用spinosynA抗性進行篩選。第二種方法是，攜帶賦予spinosynA抗性的無效等位基因(foranullallelethatconfersspinosynAresistance)、禾口在Y染色體上帶有(熱休克頭(heat-shock-head)進化缺陷)轉基因的純合子的雄性黑腹果蠅(D.melanogaster)與攜帶賦予spinosynA抗性的無效等位基因純合子雌性交配。收集交配後產生的卵，使其發育，在5-6天後，將發育的幼蟲放到37t:培養2小時。這個熱休克處理使得產生的/2^基因異位和致死性表達。由於fe-W"結構位於Y染色體上，所以只在雄性幼蟲發生熱休克後的死亡。因此，只有雌性幼蟲可以發育為成蟲。用這個方式收集的接近13,000未經改變(virgin)雌性果蠅成蟲，其與大約4,000cmZw4純合子雄性交配，如前面所描述的這些雄性成蟲用EMS發生突變。收集交配後產生的篩選後的具有抗性的幼蟲，並把它們放到含有O.lppmspinosynA的培養基中。3天後對具有抗spinosynA的發育幼蟲打分，將這些打分的具有抗性的幼蟲移到新鮮培養基的管形瓶中，在無spinosynA處理下繼續培養。新出現的成蟲與CyO//"G/a遺傳型的果蠅雜交以同源產生(isogenizing)第二個染色體。這些雜交的第二個染色體的純合子後代繼續用spinosynA抗性進行篩選。用上面描述的兩種方法分離的編碼黑腹果蠅菸鹼乙醯膽鹼(x-6受體亞單位的大約10個突變的等位基因具有spinosynA抗性。分析這些等位基因揭示了幾種不同類型的突變。這些突變包括引入了一個提前終止密碼子、在基因序列編碼的多肽發生單個胺基酸的置換導致的突變，和影響mRNA剪切的突變。導入提前終止密碼子的例子是NCBI接收號No.NM205953的菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位，其編碼26位的谷胺醯胺CAA密碼子突變為終止密碼子TAA，引入了一個提前終止密碼子，從而對抗spinosynA。胺基酸置換的示例是NCBI接收號No.NM205953的菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位的168位半胱氮酸TGC密碼子變為絲氨酸TCC密碼子，從而對抗spinosynA。mRNA剪切位點突變的示例是NCBI接收號No.NM205953的菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位在第四個內含子的末端剪切受體位點發生突變，從TAGCGC變為TAACGC，從而對抗spinosynA。用突變的果蠅進行21-正巴比妥-spinosvn篩選分別預處理10個俄勒岡野生種的成年黑腹果蠅(5個雄性和5個雌性)和10個spinosyn抗性株的兩組成年果蠅。建立兩組(每組10個果蠅)進行預處理。用2:1的丙酮和水配製spinosynA和21-正巴比妥-spinosyn類似物的儲存液，濃度1000ppm，而後用10%蔗糖稀釋到所需要的濃度。從棉花心(接近1/4英寸)加入500ul的處理物處理管行瓶(或對照用溶劑)，然後把果蠅放到每一個管形瓶中，用棉花心蓋上。處理後72小時監測果蠅，期間在室溫下培養，要求12:12的白天和黑夜循環。結果處理後72小時所有的果蠅都死亡了。100ppm的spinosynA或21-正巴比妥spinosyn都足夠致死所有野生型的果蠅。在相同濃度下，卻沒有顯著致死具有spinosyn抗性的果蠅。劑量響應數據(即LD^)表明具有spinosynA抗性的果蠅對spinosynA的抗性比野生型果蠅至少高100倍。此外，spinosynA抗性果蠅比新分類的spinosyns如21-正巴比妥spinosyns的抗性大於100倍(基於LDs。)。這些數據顯示可以將spinosynA抗性的果蠅(即靶位點突變)用於篩選發現新的與spinosynAa-6菸鹼性受體亞單位相互作用的新的化合物。儘管優選的實施方案已經解釋和描述的非常具體，對於相關領域的技術人員可以清楚的發現各種修飾、加入、減少等等的變化將不超出本發明的精神，並且這些也被認為是在本發明的權利要求範圍內。LISTOFREFERENCESCITEDAltschuletal，JMolBiol215:403-410(1993).Andersonetal,CelMolNeurobiol13:503-515(1993).Aronsteinetal,PesticBiochem.Physiol48(3):229-233(1993).Ashburner，InFlyPushing:TheTheoryandPracticeofDrosophilamelanogastergenetics(1997)ColdSpringHarborPress,Plainview，N.Y.Ashburner,InDrosophilamelanogaster.ALaboratoryManual(1989),ColdSpringHarbor,N.Y"ColdSpringHarborLaboratoryPress:pp.299-418Ausubleet.al，InShortProtocolsinMolecularBiology,ThirdEdition's),Bayeretal,MethEnzym62:308(1979).Belletal,JBiolChem273:14309-14314(1998).Belloetal,Development125:2193-2202(1998).Bingham,Cell90(3):385國387(1997).BloomquistandSoderlund，MolPharmacol33:543-550(1988).Bowtelletal,PNASUSA88(15):6853-6857(1991).Bradleyetal，Nature309:255-258(1984).BrandandPerrimon,Development118:401-415(1993).Brandetal，MethodsCellBiol44:635-654(1994).Brinsteretal，PNAS82:4438-4442(1985).Bronsteinetal,inBioluminescenceandChemiluminescence:FundamentalsandAppliedAspects,pp.20-23,(A.K.Campbell,etal,eds.,JohnWiley&Sons,1994)Bumsetal，PNAS90:8033-8037(1993).Campbell,MonoclonalAntibodyTechnology:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,(1984).Capecchi，Cell22:479-488(1980).ChenandPowers,TrendsBiotechnol8:209-215(1990).Chenetal，MolecBiolBiotechnol2:88-95(1993).Chenetal,HumGenTher5:595-601(1994).Chenetal,BiotechAnnRev2:205-236(1996).Cooleyeta/.，Science239(4844):1121-1128(1988).Creighton,Proteins.StructureandMolecularPrinciples.(1984).Cullen，MethodsEnzymol152:684-704(1987).Gulpetal,PNASUSA88:7953-7957(1991).Davidsonetal，NatureGenetics3:219-223(1993).DeriandAdam-Vizi,JNeurochem61:818-825(1993).Eldefrawietal，FASEBJ1:262-271(1987).Ellingtonetal，BiotechnolAnnRev1:185-214(1995).Ellisetal,Development119(3):855-865(1993).Engvaletal，Immunol109:129(1972).EpsteinandShakes,Caenorohabditiselegans:ModernBiologicalAnalysisofanOrganism(1995).Erzurametal,NucleicAcidsRes21:1607-1612(1993).Evanetal,Nature292:154-156(1981).Fireetal,Nature391:806-811(1998).FletcherandDavis，InGeneticEngineering(1991).Flotteetal,PNASUSA90:10613-10617(1993).Friedburgetal，DNARepairandMutagenesis(1995).Frohmanetal,PNASUSA85:8998(1988).FrohmanandMartin,Technique1:165-170(1989).Goding，JImmunolMeth13:215(1976).Goeddel,GeneExpressionTechnologyInMethodsinEnzymology(1990).Goodetal，GeneTherapy4:45-54(1997).Gormanetal,MolCellBiol2:1044-1051(1982).Gossleretal,PNAS83:卯65-9069(1986).Grausoetal,Genetics160:1519-1533(2002).HaskellandBowen,MolReproducDev40:386(1995).Hassanzadehetal,FEBSLetters16:75-80(1998a).Hassanzadehetal,FEBSLetters16:81-86(1998b).Hayetal，Development1202121-2129(1994).Hayetal,PNASUSA94(10):5195-5200(1997).Hershkowitz,Nature329:219-222(1987).HigginsandSharp,ComputerApplicationsBioSci5(2):151-153(1989).Hoganetal，ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual(1994).Hoganetal,ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual(1986).Hoogeboometal,Immunotechnology4:1-20(1998).HrubyandWilson,MethodsEnzymol216:369-372(1992).Jaenisch,Science240:1468-1474(1988).Jahnereta/.,PNAS82:6927-6931.Jahneretal，Nature298:623-628(1982).JainandMagrath，AnalBiochem199:119-124(1991).Janenich,PNAS73:1260-1264(1976).KenderdellandCarthew，Cell95:1017-1026(1998).Kimetal，Nature382:133-138(1996).Kirstetal，TetrahedronLett32(37):4839-4842(1991).Kleinetal,Nature327:70-73(1987).KoloninandFinley,PNASUSA95:14266-14291(1998).Lavitranoetal，Cell57:717-723(1989).Lemer，Adv.Immunol36:1-44(1984)Lever,CurrOpinionMolTher2:488-496(2000).Limanet.al，Neuro9(5):861-871(1992).Linetal,Biotechniques26(2):318-326(1999).Lo,Mol.CellBiol.3:1803-1814(1983).Lohetal，Science243:217-22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atggcctgggacttttaattatgataccggcttgtgcggctggaccccatgagaag121cggctactccacgcccttctggacaactacaacagcctggagcgtccggtggtcaatgaa181tccgatccattgcaactgagcttcggactaacactcatgcagattatcgatgtggacgaa241aagaatcaactgcttataacgaatatttggctcaaattggaatggaacgatatgaatctt301cgatggaattcgagtgagttcggtggtgtgcgggatctgcgaattccgccacatcgccta361tggaaaccggatgtactgatgtacaacagtgccgacgagggcttcgatggaacgtacgcc42lacaaatgtggtggttcgcaataatgggagctgtctgtacgtaccgccaggtatattcaag481tcaacgtgtaaaatcgacattacgtggtttccattcgacgatcagagatgtgaaatgaaa541tttggttcgtggacctacgatgggttteagttggacctgcagttgc鄉acgaagctggt601ggcgacatttctagctttataaccaatggcgaatgggacttgttaggtgtgcccggtaaa661cgaaatgaaatctactataattgctgcccagaaccttatattgacataacattcgccatt721ttgataaggcgcaaaacgttgtactattttttcaatctgattgtgccgtgcgtactgatc781gcctccatggcactgctagggtttacactgccaccagattctggtgaaaagctttcgctt841ggagttacaattctattatcgcttacagtcttcctcaacatggtggccgaaacaatgccg901gcgacctccgatgcggtaccgctgctcggaacttatttcaattgcattatgtttatggtg961gcctcatcagttgtgtcaaccatacttgtcctcaattatcatcatagaaatccagatacg1021catgaaatgagtgaatggataagagtaatattcctttattggttaccttgcatattgcgc1081atgcaaagacccggacaggttggctacgaatgtccgccgccgccctcttcttcgagttcc1141tccgcatccggcgagaagaagcaacagatccaaaacgttgagctaaaggagagatcctcc120laagtctctgctggccaatgtgctcgatatagacgatgatttccgatgcaatcatcgatgt1261gccagcgcgactttgccccaccagcccacatattacaggacgatgtacaggcaaggggat1321gacggcagcgtgggacccgtgggaccagctggtccagttgtggacgggcgtttgcacgag1381gccatttcccacacctgtctgacatcctctgcggagtacgaactggcgctgatactcaag1441gagctgcgttggataacagaacagctcaaaaaagaggacgaaacaagcgacattacgcga1501gattggaaatttgctgccatggtcgtcgatcgtttgtgccttattattttcaccttgttt1561actattatagcaaccctcgctgtactcttctcagcgccgcatttcattttcccgtaSEQUENCEIDNO:3ggatccatggactccccgctgccagcgtcgctSEQUENCEIDNO:4ggatccttattgcacgattatgtgcggagcggaSEQUENCEIDNO:5tctagacaccatgaaaaatgcacaactgaaactgactSEQUENCEIDNO:6tctagactacgagacaataatatgtggtgctgaSEQUENCEIDNO:7tctagacaccatgagcttcccacaaccgcactcaSEQUENCEIDNO:8tctagattacgggaaaatgaaatgcggcgctgaSEQUENCEIDNO:9ggatccatgccaaaaactgaacggcgtSEQUENCEIDNO:10ggatcctcaagtctttttaggtctccgcctSEQUENCEIDNO.:11SNRMKELELKERSSSEQUENCEIDNO.:12actagtcaccatggactccccgctgccagcgtcgSEQUENCEIDNO.:13actagtttattgcacgattatgtgcggagcSEQUENCEIDNO.:14ggatccaccatgccaaaaactgaacggcgt權利要求1.宿主細胞包括(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50％同一性；(ii)核酸，其編碼離子通道亞單位，其中該宿主細胞能夠對spinosyn響應。2.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中該受體亞單位是菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位。3.根據權利要求1所述的宿主細胞，其是無脊椎動物細胞。4.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該受體亞單位的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM205953的序列；(b)具有接收號No.NM205953的編碼來自於黑腹果蠅受體亞單位的剪切變異體的序列；(c)序列，由於遺傳密碼的簡併性，其編碼與(a)-(b)中定義的所述序列相同的胺基酸序列。5.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸是由該宿主細胞內源性產生的。6.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸是編碼配體門控性離子通道亞單位的核酸。7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其中編碼該配體門控性離子通道亞單位的該核酸選自編碼菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的核酸、編碼GABA受體亞單位的核酸、編碼5-羥色胺受體亞單位的核酸或編碼穀氨酸受體亞單位的核酸。8.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸是編碼電壓門控性離子通道亞單位的核酸。9.根據權利要求8所述的宿主細胞，其中編碼該電壓門控性離子通道亞單位的該核酸選自編碼鈣、鈉、鉀或氯化物的電壓門控性離子通道亞單位的核酸。10.根據權利要求7所述的宿主細胞，其中編碼該菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有SEQIDNO:l的核酸序列；(b)核酸，其具有與具有SEQIDNO:l的基因的編碼區的第925-2424位之間的核酸序列至少50%同一性；(c)編碼菸鹼乙醯膽鹼受體亞單位的剪切變異體的核苷酸序列；(d)序列，由於遺傳密碼的簡併性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的胺基酸序列。11.根據權利要求1所述的宿主細胞，進一步包括(Hi)編碼輔助蛋白的核酸。12.根據權利要求11所述的宿主細胞，其中編碼該輔助蛋白的該核酸是編碼無脊椎動物的輔助蛋白的核酸。13.根據權利要求12所述的宿主細胞，其中編碼該無脊椎動物的輔助蛋白的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM068898的核酸；(b)序列，其具有與具有NCBI接收號No.NM068898的基因的編碼區的第1-1137位之間的核酸序列有至少36%的同一性；(c)編碼新杆狀線蟲(Caem^/2(3^/z'fee/egara)ric-3輔助蛋白剪切變異體的序列；(d)序列，由於遺傳密碼的簡併性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的胺基酸序列。14.根據權利要求1所述的宿主細胞，進一步包括編碼離子通道亞單位的第二個核酸。15.根據權利要求14所述的宿主細胞，其中該第二個核酸是編碼菸鹼a-7受體亞單位的核酸。16.根據權利要求15所述的宿主細胞，其中編碼該菸鹼a-7受體亞單位的該第二個核酸是包括選自下面序列的核酸(a)核酸，其與具有SEQIDNO:2的基因的編碼區的第106-1617位之間的核酸序列有至少50%的同一性；(b)核酸，其編碼菸鹼a-7受體亞單位，具有SEQIDNO:2;(c)編碼黑腹果蠅的菸鹼a-7受體亞單位的該序列的剪切變異體;(d)序列，由於遺傳密碼的簡併性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的胺基酸序列。17.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該受體亞單位的核酸包括載體。18.根據權利要求17所述的宿主細胞，其中該核酸可操作地連接於調節序列，該調節序列確保該核酸在宿主細胞中表達。19.根據權利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸包括載體。20.根據權利要求19所述的宿主細胞，其中該核酸可操作地連接於調節序列，其中所述調節序列確保該核酸在該宿主細胞中表達。21.宿主細胞包括(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號NO.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%的同一性；(ii)核酸，其編碼輔助蛋白，其中該宿主細胞能夠對spinosyn響應。22.根據權利要求21所述的宿主細胞，其中該受體亞單位是菸鹼乙醯膽鹼受體a-6亞單位。23.根據權利要求21所述的宿主細胞，其是無脊椎動物細胞。24.根據權利要求21所述的宿主細胞，其中編碼受體亞單位的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM205953的序列；(b)序列，其編碼黑腹果蠅的受體亞單位的剪切變異體，具有NCBI接收號No.NM205953;(c)序列，由於遺傳密碼的簡併性，其編碼與(a)-(b)中定義的所述序列相同的胺基酸序列。25.根據權利要求21所述的宿主細胞，其中編碼輔助蛋白的該核酸是編碼無脊椎動物輔助蛋白的核酸。26.根據權利要求25所述的宿主細胞，其中編碼無脊椎動物輔助蛋白的核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM068898的核酸；(b)序列，其具有與具有NCBI接收號No.NM068898的基因的編碼區的第1-1137位之間的核酸序列有至少36%的同一性；(c)編碼新杆狀線蟲ric-3輔助蛋白剪切變異體的序列；(d)序列，由於遺傳密碼的簡併性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的胺基酸序列。27.檢測化學化合物影響受體亞單位的能力的方法，包括下述步(a)將(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性；(ii)核酸，其編碼離子通道亞單位，體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位和該離子通道亞單位，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將該受體亞單位暴露於化學化合物；(C)評估被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。28.根據權利要求27所述的方法，其中該評估步驟包括監測離子轉運。29.根據權利要求27所述的方法，其中該評估步驟包括檢測該化合物與該受體亞單位結合的親和力。30.根據權利要求27所述的方法，其中該化學化合物是化學化合物的混合物。31.根據權利要求27所述的方法，其中該宿主細胞是非洲爪蟾(Xewopw/aev^)的卵母細胞。32.根據權利要求27所述的方法，其中該宿主細胞是昆蟲細胞系。33.根據權利要求32所述的方法，其中所述的昆蟲細胞系選自果蠅Schneider細胞系、果蠅Kc細胞系、Sf9細胞系或HighFive細胞系。34.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟:(a)將(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位，其中離子通道亞單位由該宿主細胞內源性產生和表達，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將該受體亞單位暴露於化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。35.根據權利要求34所述的方法，其中該評估步驟包括監測離子轉運。36.根據權利要求34所述的方法，其中該評估步驟包括監測該化合物與該受體的結合親和力。37.根據權利要求34所述的方法，其中該化學化合物是化學化合物的混合物。38.根據權利要求34所述的方法，其中該宿主細胞是非洲爪蟾卵母細胞。39.根據權利要求34所述的方法，其中該宿主細胞是昆蟲細胞系。40.根據權利要求39所述的方法，其中所述的昆蟲細胞系選自果蠅Schneider細胞系、果蠅Kc細胞系、Sf9細胞系或HighFive細胞系。41.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟(a)將(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性；(ii)分離的核酸分子，其編碼輔助蛋白，體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位和該輔助蛋白，其中該宿主細胞能對spinosyn響應5(b)將該表達受體亞單位暴露於化學化合物；(C)評估該被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。42.根據權利要求41所述的方法，其中該評估步驟包括監測離子轉運。43.根據權利要求41所述的方法，其中該評估步驟包括檢測該化合物與該受體的結合親和力。44.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟:(a)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號NO.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性；(ii)分離的核酸分子，其編碼輔助蛋白，體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位，其中該宿主細胞內源性產生和表達輔助蛋白，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將該被表達受體亞單位暴露於化學化合物；(C)評估該被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。45.根據權利要求44所述的方法，其中該化學化合物是化學化合物的混合物。46.根據權利要求44所述的方法，其中該宿主細胞是非洲爪蟾卵母細胞。47.根據權利要求44所述的方法，其中該宿主細胞是昆蟲細胞系。48.特異結合多肽抗原表位的抗體，其中該多肽由與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性的核酸編碼，其中表達由該核酸編碼的該多肽的該宿主細胞能對spinosyn響應。49.根據權利要求48所述的抗體，其中該抗原決定簇來源於367-380位胺基酸，並且該核酸序列是具有NCBI接收號No.NM205953的核酸序列。50.根據權利要求48所述的抗體，其中該抗體是單克隆抗體。51.包括基因突變的生物體，其中該基因的編碼區具有與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列至少50%的同一性，並且其中該生物體包括顯示出比其來源的親本生物體對spinosyn降低的反應性的突變。52.根據權利要求51所述的生物體，其中該生物體是無脊椎動物。53.根據權利要求52所述的生物體，其中該無脊椎動物是果蠅。54.根據權利要求51所述的生物體，其中該生物體的基因組的該基因是純合子。55.根據權利要求51所述的生物體是無脊椎動物。56.根據權利要求51所述的生物體是昆蟲。57.載體，包括(a)反義核苷酸序列，其實質上互補於(1)具有NCBI接收號NO.NM205953的基因的編碼區的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性的DNA分子的相應部分；(b)調節序列，其與該反義核苷酸序列操作性連接，以便該反義核酸序列在其轉化的細胞中表達，並且其中該轉化細胞展現了比未轉化細胞對spinosyn降低的響應。58.轉化有根據權利要求57所述的載體的細胞。59.根據權利要求58所述的細胞，其中該細胞是無脊椎動物細胞。60.根據權利要求59所述的細胞，其中該無脊椎動物細胞是黑腹果蠅細胞或新杆狀線蟲細胞。61.篩選化合物的方法，包括下述步驟(a)把化合物給藥於轉基因生物體，該轉基因生物體包括由根據權利要求57所述的載體轉化的細胞，(b)觀察該化合物對該生物體的效應。62.用於篩選化合物活性的試劑盒，該試劑盒包括包括由根據權利要求57所述的載體轉化的細胞的轉基因生物體。63.篩選抗spinosyn的生物體的方法，包括步驟(a)從該生物體獲得核酸；(b)檢測核酸的序列，該核酸與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區的第79-1485核酸序列有至少50%的同一性；(c)比較該檢測的序列和來自於對spinosyn易感的生物體的相同基因的序列，其中該被篩選的生物體和該對spinosyn易感的生物體是來源於同一個物種。64.篩選化合物的方法，包括下述步驟(a)把該化合物給藥於轉基因生物體，該轉基因生物體包括由根據權利要求57所述的載體轉化的細胞；和(c)觀測該化合物對該生物體的效果。65.根據權利要求64所述的方法，其中該生物體是脊椎動物。66.根據權利要求65所述的方法，其中該脊椎動物是魚。67.根據權利要求66所述的方法，其中該魚是斑馬魚。68.根據權利要求64所述的方法，其中該脊椎動物是小鼠。69.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟:(a)將載體，其包括(i)核苷酸序列，其與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區第79-1485位的核酸序列有至少50%同一性的核苷酸序列；(ii)與該核苷酸序列操作性連接的調節序列，導入生物體的一個或多個細胞中，以至於該核苷酸序列在其轉化的至少一個或多個細胞中表達，並且其中該轉化細胞展現了比未轉化細胞對spinosyn增強的響應。(b)將該被轉化細胞表達的該受體亞單位暴露於化學化合物；(C)評估該被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。70.根據權利要求69所述的方法，其中該轉化細胞包括組織培養物。71.根據權利要求69所述的方法，其中該轉化細胞包括完整的生物體。全文摘要本申請屬於鑑定和表徵新的殺蟲靶位的領域，特別是涉及宿主細胞，檢測和其抗體。文檔編號G01N33/94GK101180543SQ200680005904公開日2008年5月14日申請日期2006年2月23日優先權日2005年2月23日發明者G·B·沃森,G·D·古斯塔夫松,J·M·哈斯勒,K·R·庫克,N·奧爾,S·舒安德,V·L·薩爾加多,耿超賢申請人:美國陶氏益農公司