線粒體膜電位下降相關的多核苷酸及其編碼多肽和用途的製作方法

2023-09-19 23:38:40

專利名稱：線粒體膜電位下降相關的多核苷酸及其編碼多肽和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及基因表達調控領域，具體地說，本發明涉及一類新 的編碼具有引起線粒體膜電位下降功能的人蛋白的多核苷酸，及其編碼的多肽，多肽的抗 體。本發明還涉及這類新的多核苷酸在宿主細胞中外源表達引起線粒體膜電位下降的應用。
背景技術：
細胞凋亡屬於細胞程序化死亡，是細胞內涉及到許多生化反應的複雜過程。凋亡 過程中的多種關鍵事件與線粒體有關，包括caspase激活物的釋放(如細胞色素C)、電子 轉移功能的喪失、線粒體跨膜電位的降低乃至消失及Bcl-2家族蛋白的參與。線粒體跨膜 電位的下降是細胞凋亡級聯反應過程中較早發生的事件。隨著線粒體跨膜電位的下降，線 粒體膜上的PT通道(Permeability transiton pore)開放。PT通道可以無選擇性地允許 (1. 5kD分子通過，造成線粒體基質內的高滲透壓，使線粒體內外H+梯度消失，呼吸鏈脫偶 聯，能量產生中斷；由於水和溶質的進入，基質腫脹並導致外膜破裂，釋放出包括細胞色素 C在內的各種活性蛋白。正因為線粒體在凋亡中的重要性，線粒體跨膜電位是常用的早期凋 亡的檢測指標之一。JC-I是一種陽離子染料，在線粒體中表現出膜電位依賴性聚集，能靈敏地反映細 胞線粒體跨膜電位改變情況。當線粒體跨膜電位未降低時，JC-I聚合而被檢測到紅色發射 光；當線粒體跨膜電位下降時，JC-I以單體形式存在，被檢測到綠色發射光。因此，JC-I作 為一種線粒體探針，應用於凋亡早期線粒體跨膜電位下降的檢測。基於JC-I染料對線粒體 膜電位下降的誘導劑和阻滯劑進行篩選的模型早在數年前就已被提出，近年來也有不少研 究者提出將JC-I與其它染料相結合進行篩選的方法，但尚未有真正應用JC-I進行大規模 篩選的報導。

發明內容
人基因組學研究目前是國際上的熱點，除大規模測序的方法外，還缺少從功能研 究開始的高通量篩選具有一定功能的基因的方法。針對這種現狀及現有藥物或試劑的不 足，本發明的目的是提供一類新的編碼具有引起線粒體膜電位下降的人蛋白的多核苷酸 MMraGl、2、3、4。本發明的另一目的是提供這類多核苷酸所編碼的多肽。本發明的另一目的是提供含有這類多核苷酸的載體，和這類多核苷酸及其載體轉 化或轉導的宿主細胞。本發明的另一目的是提供這類多核苷酸所編碼的多肽的抗體和用於檢測的核酸分子。本發明的另一目的是提供這類新的多核苷酸在宿主細胞中外源表達引起線粒體 膜電位下降的應用。本發明的另一目的是提供生產這些多核苷酸和其編碼的多肽的方法以及該多核 苷酸及其編碼的多肽的用途。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案在本發明的第一方面，提供新穎的分離的多核苷酸，它包含編碼具有引起線粒體 膜電位下降功能的蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列選自(a)與編碼含有SEQ ID NO :2、 SEQID N0:4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8的胺基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70%相似 性的多核苷酸；(b)編碼含有與 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 8 的 胺基酸序列有至少70%相似性的胺基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核 苷酸互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID N0:2、SEQ IDNO :4、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :8。較佳地，該多核苷酸的序列與選自下組的核苷酸序列有至少85%相似性(a) SEQ IDNO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7的編碼區序列或全長序列；(b)在遺傳 密碼簡併範圍內相應於(a)中提到的序列的至少一個序列；(c)與(a)或(b)中提到的序 列互補的序列雜交的至少一個序列。更佳地，該多核苷酸的序列選自SEQ ID NO =USEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5、SEQID NO 7的編碼區序列或全長序列。在本發明的第二方面，提供了上述核苷酸所編碼的多肽，它包含具有選自下組中 的胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 ；或與以上 任一胺基酸序列具有至少90%以上相似性的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或 其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有選自下組的胺基酸序列的多肽SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8。在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉 導的宿主細胞，還提供了被上述多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。在本發明的第四方面，提供了與上述多肽特異性結合的抗體，還提供了可用於檢 測的核酸分子，它含有上述任一多核苷酸中8-100個連續的核苷酸。在本發明的第五方面，提供了上述多核苷酸在宿主細胞中外源表達引起線粒體膜 電位下降的應用。在本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明中的 具有引起線粒體膜電位下降功能的多肽及藥學上可接受的載體。本發明的其他方面由於本文的技術的公開，對本領域技術人員而言是顯而易見 的。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質， 原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多核苷酸或多肽如果從天然狀態中與共同存在的其他物質分開，則為分離純化的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組 合物的一部分，既然載體或組合物不是它們的天然環境的成分，這些多核苷酸或多肽仍然 是分離的。如本文所用，「相似性」是指核苷酸或多肽序列比對過程中用來描述檢測序列和 目標序列之間相同DNA鹼基或胺基酸殘基順序所佔比例的高低，是一種直接的數量關係， 通過部分相同或相似的百分比來度量核苷酸序列或者多肽序列之間相似的程度，此相似 性百分比可以通過本領域已有的比對方法來計算，例子有兩兩序列間的比對方法FASTA 禾呈序(Pearson, W. R. and Lipman, D. J. 1988. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-2448) ， BLAST 禾呈)ψ (Altschul, S. F. ， et al. 1990 Basic local alignmentsearch tool. J. Mol. Biol. 215 403-410)等，或多序歹Ij 比對方法 CLUSTAL KCORPET, F. 1998Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res.，16 :10881-10890)等。同源序列是指從某一共同祖先經 趨異進化而形成的不同序列，根據相似性百分比可以判斷比對序列間的同源性。當基因或 蛋白質間相似程度很高時，表示它們具有一段共同的進化歷程，從而判斷它們會具有相似 的生物學功能。當具有至少50%的相似程度時，比較容易推測檢測序列和目標序列可能是 同源序列。較佳地，具有至少70%的相似程度；更佳地，具有至少85%的相似程度；最佳地， 具有至少90%的相似程度。而當相似性程度低於20%時，就難以確定或者根本無法確定其 是否具有同源性。本發明的多核苷酸包括其互補鏈可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、 基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編 碼鏈。如本文所用，「編碼具有引起線粒體膜電位下降功能的多肽的多核苷酸」可以是包括 編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。以 MMPRGl所編碼的多肽為例，編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ IDNO 1所示的編碼區 序列相同或者是遺傳密碼簡併的變異體。如本文所用，「遺傳密碼簡併」是指一個胺基酸有 幾個密碼子的現象。例如在本發明中MMPRGl所編碼的多肽的遺傳密碼簡併的變異體指編 碼具有SEQ ID NO 2的多肽的核苷酸，且此核苷酸與SEQ ID NO 1所示的編碼區序列有差 別。對於其他具有引起線粒體膜電位下降功能的多肽，可依此類推。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，它編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。該多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或 非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與本發明所述多核苷酸序列的互補序列雜交且兩個序列間具有至 少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條 件下與此多核苷酸序列的互補序列可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1) 在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC,0. 1% SDS, 600C ；或(2)雜交時 加有變性劑，如50% (ν/ν)甲醯胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll, 420C^ ；或(3)僅在兩 條序列之間的相同性至少在95%以上，更好的是在97%以上時才發生雜交。並且，可雜交 的多核苷酸編碼的多肽與本發明所述的多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明的多核苷酸序列能用本領域已有的方法獲得。這些技術包括但不局限於 (1)通過雜交技術分離DNA序列；(2)人工化學合成DNA序列；(3)通過構建cDNA文庫大規 模獲得所需的多核苷酸；(4) PCR擴增技術。第一種方法是先構建基因組文庫或者cDNA文庫，然後通過分子雜交等技術從基 因組文庫或cDNA文庫中篩選出目的基因或序列。當生物基因組比較小時，此方法較易成 功；當生物基因組很大時，構建其完整的基因組文庫較困難，再從龐大的文庫中去克隆目的 基因的工程量也很大。第二種方法是按設計好的序列一次合成100_200bp長的DNA片段，再用這些合成 的片段組合連接成完整的基因。這種合成長的基因序列的方法的價格十分昂貴。此方法主 要用於合成作為引物、接頭等的核酸片段。第三種方法是用本領域通常的方法構建cDNA文庫，多次測序後，結合生物信息學 分析技術(Ota et al.Nat Genet. 2004 Jan ；36(1) :40_5)，大規模獲得目的 cDNA 克隆。生 物信息學分析技術包括但不限於用BLAST或BLAT與已有的公共資料庫比對，如refseq數 據庫等；用Phred算法評估測序質量；用計算轉錄起始密碼子ATG的出現概率的ATGpr算法 篩選全長cDNA序列等。第四種方法用PCR 技術擴增 DNA/RNA 的方法(Saiki，et al. Science 1985 ；230 1350-1354)。用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用 常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。本發明優 選應用的方法是兩步法通量化RT-PCR技術在混合cDNA文庫中擴增得到大量的cDNA克隆。 混合cDNA文庫包括現有的cDNA文庫和腫瘤文庫。本發明的基因，或者各種DNA片段等核苷酸序列的測定可用常規方法，如雙脫氧 鏈終止法(Sanger et al. PNAS, 1977, 74 =5463-5467)；也可用商業測序試劑盒等。為了獲 得全長的cDNA序列，測序需要反覆進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成 全長的cDNA序列。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多 肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(如 細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。本發明的多肽可以是糖基化的，也可 以是非糖基化的。本發明的多肽可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括具有引起線粒體膜電位下降功能的多核苷酸編碼的人蛋白多肽的 片段、衍生物和類似物。術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持與本發明的天 然具有引起線粒體膜電位下降功能的人蛋白多肽相同的生物學功能或活性的多肽。本發明 的多肽片段、衍生物和類似物可以是(a)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優先 保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密 碼編碼的，或(b)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(c)成熟多肽與另一 個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(d)附加的胺基酸序列 融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋 白原序列)。本發明的多肽可以通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列來表達 或生產重組的具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白多肽(Science，1984 ；224 1431)。包
6括以下步驟(1)用本發明的多核苷酸(或其變異體)，或用含有此多核苷酸的表達載體轉化或 轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養步驟(1)得到的宿主細胞；(3)從培養基或細胞中分離、純化所需的蛋白多肽。本發明中的多核苷酸和多肽優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。本發明也涉及包含本發明所述多核苷酸的載體。本發明中，編碼具有引起線粒體 膜電位下降功能的人蛋白多肽的多核苷酸序列可以插入到重組表達載體中。術語「重組 表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病 毒，如腺病毒、逆轉錄病毒，或者其他載體。在本發明中適用的載體可以是原核表達載體， 也可以是真核表達載體，如在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al. Gene, 1987，56 125)，在哺乳動物細胞中高表達的真核表達載體pcDNA 3. 1/myc-hisB (-) (Invitrogen) ,pcDNA3. l/V5-His-T0P0 (Invitrogen,以下縮寫為 pcDT)。本發明優選 pcDT， 它可以直接與PCR產物連接來構建真核表達載體，大大提高了規模化生產的效率。只要能 在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以應用。表達載體的一個重要特徵是通常含 有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。用本領域的技術人員熟知的方法來構建含 有本發明所述多核苷酸序列和轉錄/翻譯控制信號的表達載體即可。這些方法包括體外重 組 DNA 技術、DNA 合成技術、體內重組 DNA 技術等(Sambrook，et al. Molecular Cloning, aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York,1989)。本發明的多核苷酸序列可有效地連接到表達載體中的適當的啟動子上來指導 mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動子；λ噬菌體的PL 啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動 子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達 的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。表達載體優選的 包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如用於大 腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性、或真核細胞培養用的綠色螢光蛋白(GFP)、新黴素抗性 及二氫葉酸還原酶。本發明還涉及用上述載體或者本發明的多核苷酸經基因工程產生的宿主細胞。本 發明的載體和多核苷酸可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達具有引起線粒體膜 電位下降功能的蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵 母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌；植物細胞；果蠅S2 或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞；293T、Hela細胞等。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將 會使轉錄增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常有10-300個鹼基對，作用於啟動子以 增強基因的轉錄。例子有在複製起始點下遊的100-270個鹼基對的SV40增強子、在複製 起始點下遊的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。本領域的普通技術人員都知道如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主細胞 為原核細胞如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收集，用CaCl2法處理，所用步驟是本領域眾所周知的。可供選擇的是MgCl2處理，也可用電穿孔的方法處理。 當宿主是真核細胞時，可選擇以下轉染方法磷酸鈣共沉澱法、常規機械方法如顯微注射、 電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，來表達本發明的多核苷酸所編 碼的多肽。根據所選的宿主細胞選擇合適的常規培養基，在適於宿主細胞生長的條件下培 養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用適當的方法如溫度轉化或化學誘導，來誘導選 擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。上述方法中的重組多肽可包被於細胞內、細胞外或在細胞膜上表達或分泌到細胞 外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其他特性通過各種分離方法分離和純化重組多 肽。這些方法是本領域技術人員所熟知的，如常規的復性處理，用蛋白沉澱劑處理(鹽析方 法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層 析、高效液相層析和其它各種液相層析技術或這些方法的結合。本發明還涉及與本發明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，「核 酸片段」的長度至少含有15個核苷酸，較好的是至少30個核苷酸，更好的是至少50個核 苷酸，最好的是至少100個核苷酸。此核酸片段通常是在本發明的核苷酸序列信息的基礎 上化學合成的DNA序列。上述核酸片段可以用於PCR擴增技術(如作為引物)以確定和/ 或分離編碼具有引起線粒體膜電位下降功能的多核苷酸；也可以作為雜交所用的探針。也 可以用於RNA幹擾技術。本發明的多核苷酸的一部分或全部也可作為探針固定在微陣列 (Microarray)或DNA晶片上，用於分析組織中基因的差異表達和基因診斷。探針的標記可 用放射性同位素，螢光素或酶(如鹼性磷酸酶)等。本發明的多肽可以直接作為藥物治療疾病；還可用於篩選促進或對抗具有引起線 粒體膜電位下降的功能的蛋白的抗體、多肽或其它配體，例如，篩選可用於促進或抑制本發 明的蛋白的功能的抗體。用表達的重組的本發明的蛋白來篩選多肽庫，用於尋找有治療價 值的能夠促進或抑制本發明的蛋白的功能的多肽分子。本發明的多肽可以單獨使用或者與合適的藥物載體組合後使用。組合物包含安全 有效量的多肽或拮抗劑及不影響藥物效果的載體和賦型劑。這些載體可以是水、葡萄糖、乙 醇、鹽類、緩衝液、甘油及它們的組合。藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜 脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。給藥於患者的用量取決於許多因素，如 給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。本發明的多肽也可以通過在活體表達這些多肽來使用。例如患者的細胞可以通過 在體外用編碼本發明多肽的基因進行基因工程操作，然後將工程細胞提供給患者，使工程 細胞在體內高表達這種多肽，從而達到治療的目的。具有引起線粒體膜電位下降功能的人蛋白的多核苷酸也可用於多種治療目的。可 用在基因治療技術中來治療由於具有引起線粒體膜電位下降的功能的人蛋白表達異常或 活性異常導致的疾病。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的具有引起 線粒體膜電位下降功能的人蛋白，來抑制內源性的具有引起線粒體膜電位下降功能的人蛋 白的活性。重組的具有引起線粒體膜電位下降功能的人蛋白基因也可包裝到脂質體中轉移 至細胞內。抑制本發明多肽mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酸也在本發明 的範圍之內。反義RNA和DNA以及核酸可用本領域已有的方法合成。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷間的連接用磷酸硫 酯鍵或肽鍵。本發明的多肽及其片段、衍生物、類似物或表達它們的細胞可以作為抗原來生 產抗體。這些抗體包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段 和Fab表達文庫產生的抗體。本發明的多肽的抗體可用本領域公知的抗體製備方法來生 產。例子有單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(Kohler and Milstein. Nature, 1975, 256 495-497)。多克隆抗體的生產可用本發明的多肽免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等。多種佐 劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌 合抗體可用已有的技術產生(Morrison et al. PNAS，1985，81 :6851)。單鏈抗體也可用已 有的技術生產(U.S.Pat No. 4946778)。本發明的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活體標本中的具有引起線粒體膜 電位下降功能的蛋白。還可以在臨床上用於與具有引起線粒體膜電位下降功能的人蛋白相 關的疾病的臨床診斷、治療、療效評價等。例如用放射性同位素標記與本發明的多肽結合的 單克隆抗體，然後注入體內跟蹤其位置和分布，可以作為一種非創傷性診斷方法來定位腫 瘤細胞，或判斷腫瘤細胞是否轉移。本發明中的抗體還可以用於治療或預防與具有引起線 粒體膜電位下降功能的人蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷具有引起 線粒體膜電位下降功能的人蛋白的產生或活性。本發明還涉及定量和定位檢測具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白水平的診 斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。實驗中檢測 的具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白水平，可以用作解釋具有引起線粒體膜電位下降 功能的蛋白在各種疾病中的重要性和用於診斷具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白起 作用的疾病。具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白的多核苷酸可用於具有引起線粒體膜電 位下降功能的蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，具有引起線粒體膜電位下降功能 的蛋白的多核苷酸可用於檢測具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白的表達與否，或在疾 病狀態下具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白的異常表達。如具有引起線粒體膜電位 下降功能的蛋白的DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷具有引起線粒體膜電位下降 功能的蛋白的表達異常。雜交技術是本領域已公開的成熟技術，包括Southern印跡法、 Northern印跡法、原位雜交等，相關的試劑盒可以從商業途徑獲得。本發明的多核苷酸的一 部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片上，用於分析組織中基因的 差異表達和基因診斷。用具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白特異的引物進行RNA-聚 合酶鏈式反應(RT-PCR)體外擴增也可以檢測具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白的轉 錄產物。檢測具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白基因的突變也可用於診斷具有引起 線粒體膜電位下降功能的蛋白相關的疾病。具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白基因 的突變形式包括與正常野生型的具有引起線粒體膜電位下降功能的蛋白的DNA序列相比 的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用本領域已有的技術如Southern印跡 法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用 Northern印跡法、Westen印跡法可間接判斷基因有無突變。
基因MMPRG1、2、3、4在實驗中所有用到的正常組織、胎兒組織、腫瘤組織中都有表 達，說明其為人體自身重要的線粒體膜電位相關調節基因；在不同的組織中表達量高低有 差別，說明其在不同的組織中發揮功能的程度不同。以下對本發明的實施方案進一步詳細說明。本發明通過對NCBI的refseq資料庫進行人功能未知預測基因檢索，獲得人未知 功能基因序列，進一步利用Humaruest資料庫通過BLASTn方法進行序列校正，根據校正後 得到的序列設計基因特異引物，從混合人組織cDNA文庫中通過兩步法通量化RT-PCR技術 擴增得到目的基因的編碼區cDNA片段。此編碼區cDNA片段與pcDT重組構建真核表達載 體。利用JC-I染料檢測本發明中的基因引起線粒體膜電位下降的功能。JC-I是一種陽離 子染料，在線粒體中表現出膜電位依賴性聚集，能靈敏地反映細胞線粒體跨膜電位改變情 況。當線粒體跨膜電位未降低時，JC-I聚合而被檢測到紅色發射光；當線粒體跨膜電位下 降時，JC-I以單體形式存在，被檢測到綠色發射光。因此，JC-I作為一種線粒體探針，應用 於凋亡早期線粒體跨膜電位下降的檢測。通過螢光顯微鏡觀察紅綠螢光的比例即可反映出 細胞線粒體跨膜電位的下降情況。進而通過流式細胞實驗檢測所選基因對細胞的影響，其 中MMPRGl和MMPRG2獲得陽性結果，對所轉染細胞有誘導凋亡的效果。實驗表明本發明的 多肽具有顯著、穩定的引起線粒體膜電位下降作用。由於採用了以上技術方案，本發明具有如下優點1、提供了規模化克隆和篩選新基因的技術平臺；2、提供了人類新功能基因MMPRG1、2、3、4的cDNA序列及其編碼多肽；3、首次發現人類新功能基因MMPRG1、2、3、4具有引起線粒體膜電位下降的作用；4、MMPRG1、2、3、4在機體多數正常細胞表達，說明其為自身重要的線粒體膜電位相 關調控分子。5、基於上述的4個優點，本發明為進一步研究凋亡機制，以及開發治療如愛滋病、 神經系統的退行性病變等自身免疫疾病和腫瘤等的新藥物，為開創新的臨床診斷、療效評 價及預後指標奠定必要的基礎。


圖1、真核表達載體pcDT-MMPRGx的構建示意圖(MMPRGx選自MMPRG1、2、3、4)；圖2、MMPRG2.4外源表達對細胞存活的影響(JC_1染色)；圖3、MMPRG1、2、3、4外源表達對線粒體跨膜電位影響的螢光檢測結果；圖4、MMPRG2.4外源表達對細胞存活的影響(流式細胞計數實驗)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用 於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如 《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等箸，科學出版社)中所述的條件， 或按照製造廠商所建議的條件。實施例1、兩步法通量化RT-PCR技術擴增目的基因(1)對NCBI的refseq資料庫進行人功能未知預測基因檢索，獲得人未知功能基因
10序列，並利用Humaruest資料庫通過BLASTn方法進行序列校正，最終得到的序列設定為下 組序歹丨J :SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO -J0根據此類序列設計基因 MMPRG1、2、3、4的特異引物
(2)用上述引物，按目的基因的表達譜在現有的cDNA文庫和腫瘤文庫中選擇模 板，進行初擴。現有的文庫包括12種人體正常組織(心、胰、睪丸、卵巢、前列腺、結腸、小腸、 骨骼肌、胸腺、淋巴結、扁桃體、白細胞)；6種人腫瘤組織(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 結腸癌、乳腺癌)；和8種胎兒組積(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎腎、胎腦、胎骨骼肌、胎胸腺) 的cDNA文庫(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初擴反應條件如下50 μ 1 PCR 反應 PCR延伸時間根據所擴目的基因的最長片段，按50seC/Kb的原則進行擴增940C 5 分鐘；94°C 30 秒，64°C 30 秒，72°C 50sec/Kb ；72°C 10 分鐘；4°C ⑴ 28 個循 環初擴產物純化到30 μ 1，以去除PCR反應體系中大量的引物及dNTPs等，並濃縮整 個體系，得到對應目的基因序列的二級擴增庫，作為二擴(大擴)的模板。(3)將(2)中的純化產物作為模板，分別對每個目的基因進行二擴，反應條件如 下50 μ 1 PCR (每個基因)反應
環
PCR延伸時間根據所擴目的基因的最長片段，按50seC/Kb的原則進行擴增 940C 5 分鐘；94°C 30 秒，64°C 30 秒，72°C 50sec/Kb ；72°C 10 分鐘；4°C ⑴ 30 個循
得到的PCR產物取10μ 1上樣電泳，挑選有擴增條帶的PCR產物，進行等體積純化(40μ1)。通過兩步PCR反應擴增出非單一條帶的基因用Qiagen膠回收試劑盒切膠回 收目的片段。擴增的結果表明，這些組織的細胞中都存在基因MMPRG1、2、3、4的cDNA，說明 MMPRG1、2、3、4在這些組織的細胞中都產生了基因MMPRG1、2、3、4的轉錄產物，有較廣的表 達圖譜。實施例2、目的基因真核表達載體的構建將二擴純化產物和真核表達載體pcDNA3. 1 /V5_His-TOPO (Invitrogen，縮寫為 pcDT)，按照試劑盒製造廠商建議的條件進行連接反應。連接產物電擊法轉化大腸桿菌 DH5 α，轉化物在含氨苄青黴素的固體LB平板培養基上生長，挑選生長的單一克隆菌落，提 取質粒，用EcoRI酶切，酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳鑑定，挑選有插入片段的陽性克隆，通 過測序(ABI PRISM 3700DNA分析儀)選出正確的正向插入克隆，各自命名為MMPRG1、2、3、 4。同時收集培養液，用SDS-PAGE分析沉澱蛋白，獲得MMPRG1、2、3、4多肽。MMPRG1、2、3、4蛋白分析結果顯示MMPRG1、2、3、4蛋白序列如下組序列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :8 所示。實施例3、利用JC-I染料測定目的基因引起線粒體膜電位下降的作用用目的基因轉染Hela細胞後，利用JC_1染料對細胞進行染色，按產品說明書所述 進行操作，於螢光顯微鏡下觀察細胞形態的變化。具體操作步驟如下本實驗用96孔細胞培養板操作，每個待檢基因設置3個平行重複孔，分別以pcDT 空質粒和Bax質粒做為空載體和陽性對照。下述步驟中的用量均為單孔用量。(1)細胞培養將 1. 2 X IO4 個 Hela 細胞(ATCC Number =CRL-11268)用含 10%胎 牛血清的 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)培養基(Hyclone，SH0022. 02) 鋪在96孔細胞培養板(Costar,3599)上(100 μ 1培養液/孔)，置37°C，5% CO2的細胞培 養箱(SANYO，MC0-15AC)中培養，取處於對數生長期的細胞進行所有實驗。(2)製備轉染工作液用2. 5 μ 1生理鹽水稀釋160ng待檢基因，輕輕混勻，室溫放 置；同樣用2. 5 μ 1生理鹽水稀釋0. 04 μ 1 VigoFect轉染試劑(威格拉斯生物技術(北京) 有限公司)，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋的VigoFect轉染試劑逐滴加入至稀釋的待 檢基因溶液中，輕輕混勻，是為轉染工作液，室溫放置15分鐘。(3)轉染將轉染工作液輕輕混勻，逐滴加入至(1)中鋪好細胞的96孔細胞培養 板中，輕輕混勻，置37°C，5% CO2細胞培養箱中培養24-28小時。(4)鏡檢將細胞置於螢光顯微鏡(Olympus IX 70)下觀察表型改變。結果如圖2 所示轉染了編碼MMPRG2和MMPRG4表達載體的細胞形態發生了明顯的改變。與陽性對照 BAX組相似，鏡下見典型的凋亡改變，如核皺縮、凋亡小體形成、貼壁細胞脫離培養瓶壁等， 而轉染了空載體的陰性對照沒有發生這些改變。表明這2個新基因與細胞凋亡相關。(5)染色用無血清培養基稀釋的JC-I染料(終濃度為10μ g/ml，Molecular Probes公司，M34152)對細胞進行染色，37°C孵育30分鐘後吸棄染料，PBS洗滌兩遍。(6)檢測將 96 孔板的細胞以 800 轉 / 分鐘(Eppendorf Centrifuge, 5810R)離 心5分鐘，棄上清。每孔加入40 μ 1細胞裂解液，混勻後將96孔板置於-80°c冰箱1小時以 上。將96孔板從-80°C解凍後恢復至室溫，每孔吸取10 μ 1細胞裂解液移至白色酶標板，用 微孔板酶標儀(Genios Pro, Tecan)檢測。紅色螢光強度值(RED)在590nm處檢測，激發波長535nm。綠色螢光強度值(GREEN)在535nm處檢測，激發波長484nm。以RED/GREEN表示 細胞線粒體跨膜電位下降情況。陽性對照為編碼BAX的表達載體。BAX是Bcl-2家族成員， 當細胞受到凋亡因子的誘導時，BAX可以轉位於線粒體並通過寡聚化形成跨膜通道，導致線 粒體膜電位下降，細胞色素C釋放，啟動細胞凋亡途徑。陰性對照為pcDT空載體。陽性基 因的標準為待篩基因RED/GREEN值低於陰性對照RED/GREEN值25%以上。結果如圖3所 示，MMPRG1、2、3、4在HeLa細胞中過表達能引起線粒體跨膜電位降低。實施例4、流式細胞實驗用目的基因單獨轉染Hela細胞後，利用流式細胞儀檢測待檢質粒的誘導細胞凋 亡的功能。具體操作步驟如下(1)細胞培養將Hela細胞(1X105)用含10%胎牛血清的DMEM培養基鋪在24孔 細胞培養板(Costar，3599)上，置37°C，5% CO2的細胞培養箱中培養16小時。(2)製備轉染工作液用8 μ 1生理鹽水稀釋500ng待檢質粒，輕輕混勻，室溫放 置；同樣用8 μ 1生理鹽水稀釋0. 16 μ 1 VigoFect轉染試劑，輕輕混勻，室溫放置5分鐘； 將稀釋的VigoFect轉染試劑逐滴加入至稀釋的待檢質粒溶液中，輕輕混勻，室溫放置15分 鍾。(3)轉染將轉染工作液輕輕混勻，逐滴加入至細胞培養板(500μ1培養液/孔) 中，輕輕混勻，置37°C，5% CO2培養箱中培養24-48小時。(4)製備單細胞懸液，流式細胞儀檢測轉染後24小時收穫細胞。吸出培養基，加入100 μ 1胰酶(Hyclone,SH30042.01), 37°C消化3分鐘，再加入200 μ 1含10%胎牛血清的DMEM培養基中和胰酶，吹吸數次使形 成單細胞，移入流式管(FALCON，352052)，1500 轉每分鐘(Eppendorf Centrifuge, 5810R) 室溫離心5分鐘，棄去上清。加入3ml PBS重懸細胞，1500轉每分鐘室溫離心5分鐘，棄去 上清。重複上述洗細胞一次，並重懸於200 μ 1 Binding buffer (IOmM Hepes, 140mM NaCl, ImM MgCl2, 5mM KC1,2. 5mM CaCl2)，加入終濃度為 1 μ g/mlFITC-Annexin-V (北京寶賽生物 技術有限公司，CX1001-2)，室溫避光反應30分鐘，再加入終濃度為lyg/ml PI (北京寶賽 生物技術有限公司，CX1001-2)。檢測使用流式細胞儀(FACSCalibur，BD，USA)。FITC標記 的Armexin-V發綠色螢光，可以特異性結合於凋亡細胞特有的外翻於細胞膜外的磷脂醯絲 氨酸，PI可以穿透死亡細胞的細胞膜，進而將細胞核染成紅色。Armexin-V與PI雙陰性的 細胞即為活細胞，其餘為死亡細胞。結果如圖4所示，MMPRG2、4與空載體比較均有陽性結果，與陽性對照Bax作用相 似，只是兩個基因作用程度不一，說明MMPRG2、4可以不同程度上誘導細胞凋亡。實施例5、抗體製備抗原選用原核細胞或真核細胞表達的MMPRG1、2、3、4蛋白全長或部分肽段，也可 以合成多肽作為抗原。多克隆抗體的製備免疫動物選用成年雄性紐西蘭兔或BALb/c小鼠，初次免疫用 200 μ g (紐西蘭兔)或20 μ g (BALb/c小鼠)抗原與等體積弗氏完全佐劑(FCA)充分乳化 後，於背部皮下多點注射。初次免疫後21、42、63天，用弗氏不完全佐劑(FIA)完全乳化的 抗原蛋白，各加強免疫1次，用量同前。每次免疫後7 10天，ELISA方法檢測血清效價， 達到IX 10_4時，放血分離血清。Western blot鑑定抗體特異性。
單克隆抗體製備免疫BALb/c小鼠同前，取脾臟製成B細胞懸液，與對數生長期的 骨髓瘤細胞SP2/0融合，通過HAT (H 次黃嘌呤；A 氨基喋呤；T 胸腺嘧啶核苷)選擇性培 養，獲得雜交細胞系，再通過ELISA方法檢測抗體效價，篩選出特定的雜交瘤細胞系，並得
到單克隆抗體。
序列表
北京諾賽基因組研究中心有限公司
線粒體膜電位下降相關的多核苷酸及其編碼多肽和用途
GAI09CN1924CZ-1
8
PatentIn version 3. 3
1
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DNA
人

CDS
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1414
DNA
人

CDS
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3
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28
權利要求
一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼具有引起線粒體膜電位下降功能的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(a)與編碼含有SEQ ID NO8所示的胺基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)編碼含有與SEQ ID NO8所示的胺基酸序列有至少70％相似性的胺基酸序列的多肽的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)的多核苷酸互補的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQID NO :8所示的胺基酸序列。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，該多核苷酸的序列與選自以下的核苷酸序列有至少 85%相似性(a)SEQ ID NO 7的編碼區序列或全長序列；(b)在遺傳密碼簡併範圍內相應於(a)中提到的序列的至少一個序列；或(c)與(a)或(b)中提到的序列互補的序列雜交的至少一個序列； 優選的，所述多核苷酸的序列選自SEQ ID NO 7的編碼區序列或全長序列。
4.權利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽，該多肽包含選自下組中的胺基酸序列的多 肽SEQ ID NO :8，或與SEQ ID NO :8的胺基酸序列具有至少90%相似性且具有引起線粒體 膜電位下降功能的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；優選的，該 多肽為SEQ ID NO :8所示胺基酸序列組成的多肽。
5.一種載體，該載體含有權利要求1所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程宿主細胞，該宿主細胞選自(a)用權利要求5所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；或(b)用權利要求1所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
7.一種抗體，該抗體是能與權利要求4所述的多肽特異性結合的抗體。
8.—種核酸片段，該核酸片段含有權利要求1所述的多核苷酸中8-100個連續的核苷酸。
9.權利要求1所述的多核苷酸或其編碼的多肽在引起線粒體膜電位下降中的應用； 優選的，所述多核苷酸在宿主細胞中外源表達會引起線粒體膜電位下降；更優選的，所述的宿主細胞選自權利要求8所述的宿主細胞；優選的，所述的應用是利用所述的多核苷酸來表達或生產重組的具有引起線粒體膜電 位下降功能的多肽；優選的，所述的應用是所述多核苷酸或其編碼的多肽在製備用於診斷和/或治療由於 具有引起線粒體膜電位下降的功能的人蛋白表達異常或活性異常導致的疾病的檢測劑或 藥物組合物中的應用。
10.含有權利要求4所述的多肽和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
全文摘要
本發明公開了一類新的編碼具有引起線粒體膜電位下降功能的人蛋白的多核苷酸，及其編碼的多肽，多肽的抗體。本發明還公開了這類新的多核苷酸在宿主細胞中外源表達引起線粒體膜電位下降的應用。
文檔編號A61P43/00GK101892237SQ20091025816
公開日2010年11月24日 申請日期2006年12月14日 優先權日2006年12月14日
發明者於鵬, 張晨穎, 王平章, 石太平, 程華玲, 袁勁松, 鄧唯唯, 陸陽, 馬大龍, 馬進京, 駱葉, 高霞, 高鵬 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司