能夠表達外源gitr配體的細胞的製作方法

2023-09-19 23:39:30 2

專利名稱：能夠表達外源gitr配體的細胞的製作方法
技術領域：
本發明涉及用作治療劑或預防劑例如疫苗(用於治療腫瘤)的能夠表達糖皮質激 素誘導性腫瘤壞死因子受體(在下文中稱為「GITR」)的配體的遺傳修飾細胞和能夠表達所 述配體的衍生物的這類細胞。本發明還涉及增強的細胞介導的免疫應答和由調節性T細胞 介導的免疫抑制的控制，所述免疫應答由GITR-配體表達細胞或表達所述配體的衍生物的 細胞誘導。
背景技術：
活生物體主要由免疫應答提供對外源物質的防護。免疫系統由各種細胞和從由其 產生的可溶性因子組成。在那些細胞中，白細胞尤其是淋巴細胞在該系統中起主要作用。淋 巴細胞分為兩大類B淋巴細胞(在下文中可稱為「B細胞」)和T淋巴細胞(在下文中可 稱為「T細胞」)。兩類細胞都可以特異性方式識別抗原並與它們相互作用保護活生物體。作為繼手術、化學療法和放射療法之後的第4種用於治療腫瘤的方法，免疫療法 最近引人注意。由於免疫療法利用人類固有的免疫性，所以據認為接受免疫療法的患者的 身體負擔比其它療法中的輕。稱為免疫療法的治療方法包括細胞轉移療法，其中將以下細 胞轉移所述細胞例如為使用各種方法通過擴繁培養，獲得自例如外源誘導的細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)或外周血淋巴細胞的淋巴因子激活的細胞、自然殺傷T細胞或γ δ T細胞； 樹突細胞轉移療法或肽疫苗療法，預期通過所述療法在體內誘導抗原特異性CTL ；Thl細胞 療法；和免疫基因療法，其中將預期具有各種作用的基因離體引入上述細胞中以將其轉入 體內。在這些免疫療法中，傳統上已知⑶4陽性T細胞和⑶8陽性T細胞起關鍵作用。⑶8陽性T細胞為主要的效應細胞，其能夠直接在體內和體外破壞腫瘤細胞。這些 細胞對由MHC I類分子呈遞的抗原肽具有嚴格特異性。相比之下，NKT細胞的抗原特異性 沒有這麼嚴格，認為它們是顯示固有免疫應答的效應細胞。CD4陽性T細胞被認為具有通過多種機制調節抗腫瘤免疫應答的基礎性作用，但 它們並不直接破壞腫瘤。識別了由MHC II類分子呈遞的腫瘤抗原肽的CD4陽性T細胞通 過與抗原呈遞細胞(APC)相互作用促進CTL的活化和增殖。相比之下，⑶25陽性/⑶4陽性細胞(調節性T細胞Treg)已顯示抑制抗腫瘤的 免疫應答和各種自身免疫性疾病的進展(參見專利文獻1和非專利文獻1)。具體而言，由 於調節性T細胞通過經由靶向CD4陽性T細胞來控制輔助細胞功能而阻抑細胞毒性CD8陽 性T細胞的活性，所以認為某些腫瘤利用該系統用於其增殖，從而避免免疫系統的攻擊。已發現GITR為在調節性T細胞中表達的基因(參見非專利文獻1)，其為細胞表 面跨膜蛋白受體和腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的成員。已表明GITR組成地存在於非 活化T細胞上。GITR與另一種稱為GITR配體(在下文中稱為「GITRL」)的跨膜蛋白結合。 已表明針對GITR的拮抗性抗體能消除調節性T細胞的免疫抑制活性，這表明GITRL在通過 GITR調節調節性T細胞的活性中起功能性作用(參見非專利文獻2).現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1 =US 2003049696
非專利文獻
非專利文獻1 :S. Sakaguchi 等，Immunol. Rev. 182(2001)，第 18-32 頁
非專利文獻2 =McHugh 等，Immunity 16 (2002)，第 311-23 頁
發明簡述
待本發明解決的問題
鑑於所述現狀，本發明目的在於提供具有免疫系統增強作用和廣泛應用並可用作 治療劑或預防劑(疫苗)的物質，以及用於治療所述物質所施用的受試者的方法。
解決問題的手段
本發明人已發現通過將經修飾以表達GITRL或GITRL衍生物的細胞給予活生物 體，誘導了有效的抗腫瘤疫苗作用和局部抗腫瘤的細胞介導的免疫應答。本發明基於該發 現得以完成。
換言之，本發明涉及
[1]能夠表達外源GITRL(糖皮質激素誘導性腫瘤壞死因子受體的配體)或外源 GITRL衍生物的細胞；
[2] [1]的細胞，其中所述衍生物為GITRL或GITRL片段與免疫球蛋白Fc片段的融 合蛋白(GITRL-Fc)；
[3] [1]或[2]的細胞，其中所述細胞為腫瘤細胞或免疫細胞；
[4] [3]的細胞，其中所述細胞為失活的腫瘤細胞；
[5]用於製備[1]的細胞的方法，其包括用包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因 的載體轉化細胞；
[6] [5]的方法，其中所述衍生物為GITRL-Fc ；
[7] [5]或W]的方法，其中所述細胞為腫瘤細胞或免疫細胞；
[8] [7]的方法，其中所述細胞為失活的腫瘤細胞；
[9]包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因的病毒載體；
[10] [9]的病毒載體，其中所述載體選自逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病 毒載體和仙臺病毒載體，並包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因；
[11]包含[1]- ]的任一項中的細胞作為活性成分的治療劑或預防劑；
[12] [1]-[4]的任一項中的細胞在製備[11]的治療劑或預防劑中的用途；
[13]用於治療受試者的方法，其包括將[1]_[4]的任一項中的細胞給予所述受試 者；
[14]包含[9]或[10]的病毒載體作為活性成分的治療劑或預防劑；
[15] [9]或[10]的病毒載體在製備[14]的治療劑或預防劑中的用途；以及
[16]用於治療受試者的方法，其包括將[9]或[10]的病毒載體給予所述受試者。
發明效果
本發明提供能夠表現有效的抗腫瘤疫苗作用和誘導針對特定抗原的免疫應答的 作用的細胞；包含所述細胞作為活性成分的治療劑或預防劑；和用於治療所述細胞所施用 的受試者的方法。
附圖簡述

圖1顯示pMT-mGFc的示意圖。圖2顯示來自小鼠GITRL-Fc的測量結果。圖3顯示小鼠腫瘤大小隨時間的變化。圖4顯示四聚體測定的結果。圖5顯示小鼠腫瘤大小隨時間的變化。圖6顯示小鼠腫瘤大小隨時間的變化。圖7顯示四聚體測定的結果。圖8顯示小鼠腫瘤大小隨時間的變化。圖9顯示小鼠腫瘤大小隨時間的變化。圖10顯示小鼠腫瘤大小隨時間的變化。圖11顯示T細胞活化。圖12顯示調節性T細胞的比例。圖13顯示CD8陽性T細胞的比例。圖14顯示小鼠腫瘤大小隨時間的變化。圖15顯示多功能細胞的比例。實施本發明的方式本文所用術語「GITRL」是指與糖皮質激素誘導性腫瘤壞死因子受體(GITR)結合 的配體。GITRL也稱為TNFSF18(腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員18)。人GITRL的氨基 酸序列示於序列表的SEQ ID NO :6或Swiss Prot ID NO :Q9UNG2。人GITRL的核苷酸序列 示於序列表的SEQ ID NO 7或GenBank檢索號NM_005092。GITRL由177個胺基酸構成， 並由第1- 位的胞內域、第四-49位的跨膜域和第50-177位的胞外域組成。本文所用術語「GITRL衍生物」是指㈧具有GITRL的部分的片段或⑶包含GITRL 或GITRL片段的融合蛋白，所述片段或蛋白為能夠與GITR相互作用而將刺激傳導至GITR 表達細胞的分子。術語「GITRL-Fc」是指GITRL或GITRL片段與免疫球蛋白Fc片段(CH2 和CH3區)的融合蛋白.本文所用術語「外源GITRL」是指由已人工和外源地引入的編碼GITRL的核酸表達 的多肽。在引入上述核酸的細胞中，可存在與編碼外源GITRL的核酸序列具有相同序列的 內源核酸。術語「外源GITRL衍生物」是指由已人工和外源地引入的編碼GITRL衍生物的 核酸表達的多肽。本文所用術語「失活處理」是指進行使細胞不能增殖的處理。該處理允許得到以 下細胞其不能夠經歷隨後的有絲分裂但仍保留表達處理前已表達的蛋白(例如GITRL或 GITRL衍生物、細胞因子或腫瘤抗原)的能力。如下所述，失活處理可通過本領域技術人員 已知的各種方法進行。失活處理為抑制至少約90%、優選約95%或更優選基本上100%的 細胞增殖的處理。本發明所用術語「自體的」是指從相同個體(即自身)或遺傳相同的個體的衍生 (即自生(autogenicity))。術語「同種異體的」是指從相同種的不同個體的衍生(即異生 (allogenicity)) 0本文所用術語「腫瘤細胞」是指表現出異常生長表型或異常細胞狀態的細胞，所述細胞通過表現出自發增殖和由此難以控制的細胞增殖來表徵。「腫瘤細胞」包括「惡性腫瘤 細胞」和「良性腫瘤細胞」，還稱為「贅生物源細胞」。術語「腫瘤」是指大量腫瘤細胞或作為 整體的腫瘤細胞。本文所用術語「表達」是指細胞中內源基因或轉基因編碼區的轉錄和/或翻譯。本文所用術語「轉化」是指將外源核酸引入細胞中。例如，轉化包括使用病毒或非 病毒載體將外源核酸引入細胞中。用於轉化哺乳動物細胞的多種技術描述於例如Keown等 Methods of Enzymology 185:527-537(1990)。(1)本發明的細胞和載體以及用於製備本發明細胞的方法本發明涉及能夠表達外源GITRL或外源GITRL衍生物的細胞，用於治療或預防腫 瘤。對所表達的GITRL或所表達的GITRL衍生物沒有具體限制，只要其為通過與GITR的相 互作用而將刺激傳導至GITR表達細胞的分子即可。刺激傳導的結果由GITR表達細胞所保 持的免疫抑制作用減少來例示。對於本發明的製備方法而言，可使用編碼天然存在GITRL 或其衍生物的基因，所述GITRL具有例如SEQ ID NO :6所示的胺基酸序列。編碼GITRL或 GITRL衍生物的基因可表達為細胞膜蛋白(包括胞內或細胞表面呈遞的蛋白)，或由細胞待 釋放的分泌蛋白。能夠表達GITRL或GITRL衍生物的本發明細胞能夠將GITRL或GITRL衍 生物定位於細胞內、細胞膜上或細胞周圍，因此與將GITRL本身給予活生物體相比減少全 身效應。GITRL衍生物包括具有修飾胺基酸序列的GITRL變體和具有GITRL的部分的片段， 特別是，具有SEQ ID NO :6所示的人GITRL胺基酸序列的第50-177位胺基酸之間的胞外域 或第47-177位胺基酸之間的部分的GITRL片段。GITRL衍生物可為核酸編碼的多肽，所述核 酸在嚴格條件下與具有SEQ ID NO :7核苷酸序列的核酸的互補鏈雜交。本文所用術語「嚴 格條件」是指以下條件其中核酸與例如探針在含0. 5% SDS,5XDenhardt' s和100 μ g/ ml 變性鮭精 DNA 的 6X SSC(1XSSC 表示 0. 15M NaCl，0. 015M 檸檬酸鈉，pH 7.0)中於 68°C 下保溫12-20小時。與所述探針雜交的DNA可在例如用含0. 5% SDS的0. IXSSC在68°C 下洗滌後檢測。GITRL衍生物包括融合蛋白，其中GITRL或GITRL片段與另一種蛋白或其它蛋 白融合。融合蛋白可包含分泌信號、胞內定位信號或標籤序列，並且它們由與另一種蛋白 例如受體、配體或抗體或者其片段融合的融合蛋白例示。根據蛋白生產力和體內穩定性， GITRL-Fc (GITRL或其片段與免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白)可優選用作GITRL衍生物。 儘管得自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的任何片段都可用作免疫球蛋白的Fc片段，但是由於 低細胞毒性，可優選使用來自IgG同種型IgG2的片段。具有免疫球蛋白Fc片段的融合蛋 白可使用市售產品(例如來自hvivoGen的pFUSE-hlgG2-Fc2)製備。儘管GITRL-Fc的Fc 片段可位於融合蛋白的N端或C端，但可優選使用在C端具有Fc片段的GITRL衍生物。儘管對用於表達外源GITRL或外源GITRL衍生物的細胞沒有具體限制，但是可例 如優選使用腫瘤細胞或免疫細胞。所述腫瘤細胞可為獲得自相同個體的自身來源(自體 的)腫瘤細胞，可為獲得自與受試者不同的個體的同種異體腫瘤細胞，或者可為已確立的 腫瘤細胞系。對於所述腫瘤細胞系而言，優選使用來源於與需要治療或預防的腫瘤或惡性 腫瘤相同類型的來源的腫瘤細胞系。能夠表達GITRL或GITRL衍生物的本發明腫瘤細胞可 活化腫瘤細胞附近存在的免疫細胞，並阻抑調節性T細胞的活性，以有效地誘導針對腫瘤細胞表面存在的腫瘤抗原的免疫系統。在本發明的一個優選實施方案中，然後使其中已被誘導表達GITRL或GITRL衍生 物的腫瘤細胞失活。失活處理包括物理處理例如X射線或Y射線輻照，和使用化學劑例如 絲裂黴素C和環己醯胺的化學處理。可例如但不限於通過用約10-約IOOOcGy劑量和更優 選約50-約500cGy劑量的X射線輻照來進行失活處理，但對失活處理沒有具體限制，只要 其允許保持GITRL或GITRL衍生物的表達並阻抑表達細胞的增殖即可。在本發明的另一個實施方案中，將免疫細胞用作表達GITRL或GITRL衍生物的細 胞。所述可用的免疫細胞通過T細胞例如CD8陽性T細胞或CD4陽性T細胞或者抗原呈遞 細胞來例示。這些細胞可為自體的免疫細胞、同種異體的免疫細胞或已確立的免疫細胞系。 當考慮腫瘤治療時，優選表達識別腫瘤中表達的腫瘤抗原的T細胞受體(TCR)的T細胞。表 達特異性識別特定腫瘤抗原的T細胞受體和GITRL或GITRL衍生物兩者的T細胞，具有對 腫瘤細胞的親和力；因而能夠選擇性地將GITRL或GITRL衍生物轉運至腫瘤細胞或腫瘤細 胞的周圍。因此，調節性T細胞的活性被阻抑，因此免疫細胞在腫瘤附近活化，在所述腫瘤 附近處能夠表達GITRL或GITRL衍生物的本發明免疫細胞特異性地積聚。因此，可強烈誘 導針對表達特定腫瘤抗原的腫瘤細胞的免疫系統。本發明細胞可使用病毒或非病毒載體離體轉化細胞來製備，所述載體包含其中編 碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調控元件的核酸構建體。本文所用術語「可操作地連接」是指核酸序列與另一個或其它核酸序列以功能關 系連接。例如，如果編碼RNA分子或蛋白的DNA序列被置於啟動子或調控元件的控制之下， 或者將啟動子或調控元件放置以影響編碼或結構DNA序列的表達水平，則認為啟動子或調 控元件「可操作地連接」至編碼RNA分子或蛋白的DNA序列。術語「調控元件」是指涉及核苷酸序列表達的控制的序列。調控元件包括啟動子、 增強子和終止密碼子。調控元件通常還包括對正確翻譯核苷酸序列所需要的序列。術語「啟動子」是指通常位於編碼區上遊的非翻譯DNA序列，其包含RNA聚合酶的 結合位點並起始DNA至RNA的轉錄。啟動子區還可包含充當基因表達的調節子的其它元件。可用於製備本發明細胞的載體包括但不限於例如病毒載體和非病毒載體，例如逆 轉錄病毒(包括慢病毒)載體、腺病毒(Ad)載體(包括所述載體的複製型和複製缺陷型)、 腺伴隨病毒(AVV)載體、猿猴病毒40(SV-40)載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺病 毒載體和非病毒質粒載體。此外，用於改進基因轉移效率的物質例如RetroNectin (來自 Takara Bio Inc.)可用於基因轉移過程中。不使用病毒載體的基因轉移方法包括例如(在不限制本發明的情況下)使用諸如 脂質體或配體-聚賴氨酸等載體的方法、磷酸鈣法、電穿孔和粒子轟擊。當使用這些方法 時，將整合至質粒DNA、線狀DNA或RNA中的外源基因轉移。用於製備本發明細胞的、表達GITRL或GITRL衍生物的基因的載體可含有異源調 節序列，例如組成型啟動子、誘導型啟動子、腫瘤選擇性啟動子和增強子。這類啟動子包括 但不限於例如E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子、巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/ 兔β-珠蛋白啟動子、延伸因子1-α啟動子(EFl-α啟動子)、神經膠質特異性啟動子和神 經元特異性啟動子。本文所用術語「增強子」是指以下核苷酸序列當其可操作地連接至編 碼序列時，與僅由啟動子單獨實現的轉錄激活相比，增加可操作地連接至所述啟動子的編(即增強由啟動子的轉錄)。另外，在本發明中，可使用組成型啟動子(例如巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動 子、RSV LTR,MoMLV LTR,CAG啟動子、磷酸甘油酸激酶_1啟動子(PGK)和SV-40啟動子)。 表達GITRL或GITRL衍生物的基因的載體還可包含編碼信號肽或標籤肽的核酸。這類載體 可包含或不包含內含子。因此，所述載體可包含許多轉基因、轉基因的組合或轉基因/調控 元件的組合。用於轉化能夠表達外源GITRL或外源GITRL衍生物的本發明細胞的方法可包括培 養細胞的步驟，該步驟在用如上所述的載體轉化所述細胞之前進行；或者如果進行失活處 理，則在進行失活處理之前進行。或者，所述方法可包括培養細胞的步驟，該步驟在用如上 所述的載體轉化所述細胞之後進行；或者如果進行失活處理，則在進行失活處理之前進行。 如上所述的培養可使用已知培養基在根據待培養的細胞恰當地確定的培養條件下進行。此外，本發明還包括含有上述核酸構建體的載體，所述構建體含有可操作地連接 至調控元件的編碼GITRL或GITRL衍生物的基因。該載體在下文中稱為「本發明載體」。所 述載體可用於通過將所述載體本身給予受體細胞而賦予所述細胞表達GITRL或GITRL衍生 物的能力，以及用於製備如上所述的本發明細胞。對本發明載體的類型沒有具體限制；可使用多種如上所述的病毒或非病毒載體。 在優選的實施方案中，使用對細胞具有高基因轉移效率的病毒載體。更優選的是，使用可直 接給予活生物體(受試者)的病毒載體。可直接給予活生物體的病毒載體包括(在不具體 限制本發明情況下)逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和仙臺病毒載體。能夠表達外源GITRL或外源GITRL衍生物的本發明細胞誘導周圍免疫細胞的免 疫應答。所誘導的這類免疫應答可在受試者中通過如下來評價在開始給予表達GITRL或 GITRL衍生物的細胞之前或在開始治療後的各個時間點，測定腫瘤生長抑制能力(例如， 通過測量腫瘤大小)或使用抗原特異性細胞毒性測定、細胞增殖測定、溶細胞性細胞測定 (cytolytic cell assay)和體內遲髮型超敏反應測試，所述遲髮型超敏反應測試利用重組 的腫瘤相關抗原或免疫原性片段或者抗原衍生肽。這類免疫應答還可根據免疫細胞組分例 如⑶8陽性T細胞、⑶4陽性T細胞和調節性T細胞的比例來評價。此外，還可根據細胞因 子(例如幹擾素(IFN)-Y或腫瘤壞死因子(TNF)-Ci)的產生，或者細胞表面抗原(例如 CD107a)的存在來評價免疫應答。產生多種細胞因子或存在多種細胞表面抗原的細胞被稱 為多功能細胞並可用於免疫治療。用於測量免疫應答的增加的另外的方法包括通常用於測 量T細胞反應的測定，例如遲髮型超敏反應測試、使用肽-主要組織相容性複合體四聚體的 流式細胞術、淋巴細胞增殖測定、酶聯免疫吸附測定、酶聯免疫斑點測定、細胞因子流式細 胞術、直接細胞毒性測定、通過定量反轉錄酶-聚合酶鏈反應測定細胞因子mRNA和有限稀 釋分析。(2)本發明治療劑或預防劑以及細胞或載體在製備治療劑或預防劑中的用途兩者都在上文(1)中描述的、表達外源GITRL或外源GITRL衍生物的本發明細胞 和包含核酸構建體的載體，都可用於製備包含它們作為活性成分的本發明治療劑或預防 劑，所述核酸構建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調控元件。表達GITRL或GITRL衍生物的腫瘤細胞可用作治療劑或預防劑(細胞疫苗)。在 不受具體理論所束縛下，本發明細胞可充當有效的細胞疫苗，因為調節性T細胞的活性被
8表達GITRL或GITRL衍生物的腫瘤細胞附近中所表達的GITRL抑制，並且消除了對包括抗 原呈遞細胞、⑶8陽性T細胞和⑶4陽性T細胞在內的免疫細胞的抑制作用，即這些細胞被 活化，導致針對這些腫瘤細胞的免疫系統的增強。表達GITRL或GITRL衍生物的免疫細胞可用作治療劑或預防劑。在不受具體理論 所束縛下，有可能的是，例如表達特異性識別特定腫瘤抗原的TCR和GITRL或GITRL衍生物 兩者的T細胞，能夠將GITRL或GITRL衍生物特異地轉運至腫瘤細胞或腫瘤細胞的周圍。調 節性T細胞的活性由此受到阻抑，結果免疫細胞在腫瘤附近活化，在所述腫瘤附近處積聚 能夠表達GITRL或GITRL衍生物的本發明免疫細胞。因此，可強烈誘導針對表達特定腫瘤 抗原的腫瘤細胞的免疫系統。包含核酸構建體的載體能夠賦予體內受體細胞表達GITRL或GITRL衍生物的能 力，所述核酸構建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調控元件。因此， 引入載體的細胞顯示與上述腫瘤細胞或免疫細胞相同的功能。例如，將本發明載體給予至 腫瘤中與將表達GITRL或GITRL衍生物的腫瘤細胞給予至腫瘤中相比具有等價效果。本發明治療劑或預防劑旨在治療或預防以下疾病能夠表達GITRL或GITRL衍生 物的細胞對所述疾病有效。作為實例，這類疾病包括腫瘤疾病(例如白血病和實體瘤)和 由病毒、細菌和真菌引起的感染性疾病(例如流感、結核病或深部真菌病)。本發明治療劑 或預防劑可用於例如消除或減少腫瘤或感染細胞或者抑制這類細胞的生長。本發明治療劑或預防劑可經皮內、肌內、皮下、腹膜內、鼻內、動脈內、靜脈內(包 括留置導管插入(indwelling catheterization))、瘤內給予或者通過輸入性淋巴管內輸 注(intraafferent lymphatic infusion)給予。此外，本發明治療劑或預防劑適合用於免 疫療法中。在免疫療法中，將適於治療受試者的T細胞或失活的腫瘤細胞通過例如注射或 輸注靜脈內、動脈內、皮下或腹膜內給予受試者。本發明治療劑或預防劑對用於如上所述的 受試者非常有用，並可按照本領域熟知的方法，通過與例如適合用於胃腸外給予的有機或 無機載體、賦形劑或穩定劑一起混合，製備成注射劑或輸注劑。本發明治療劑或預防劑包含有效量的、能夠表達外源GITRL或外源GITRL衍生物 的細胞或者含有核酸構建體的載體，所述核酸構建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因 可操作地連接至調控元件。本文所用有效量是指與未治療的受試者相比，在給予如上所述 的治療劑或預防劑的受試者中表現出治療效果或預防效果的細胞量。具體量可變化，並可 適當地根據劑型、給藥途徑、預期用途以及受試者的年齡、體重和狀況來確定。例如，在包含 能夠表達GITRL或GITRL衍生物的本發明細胞作為活性成分的本發明治療劑或預防劑中， 所述細胞的量沒有具體限制。然而，例如優選1 X IO3至1 X IO11個細胞/mL，更優選1 X IO4 至IX IOltl個細胞/mL和甚至更優選IX IO5至IX IO9個細胞/mL。此外，本發明治療劑或 預防劑的劑量沒有具體限制。然而，例如對於成人而言，優選1 X IO6至1 X IO12個細胞/天， 更優選1 X IO7至5 X IO11個細胞/天和甚至更優選1 X IO8至2 X IO11個細胞/天。本發明治療劑或預防劑還可包含賦形劑。這類賦形劑包括含或不含生理相容性 緩衝劑(例如磷酸鹽或ifepes)、營養物(例如葡萄糖)、生理相容性離子或胺基酸(尤其是 無免疫原性組分的胺基酸)的各種細胞培養基；或等滲鹽水。可使用支持性試劑(例如白 蛋白或血漿成分)或惰性增稠劑。(3)本發明治療方法
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本發明涉及用於治療受試者的方法，其包括以下步驟通過將能夠表達GITRL或 GITRL衍生物的細胞或者包含核酸構建體的載體給予受試者，來誘導免疫應答，所述核酸構 建體中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調控元件。本發明方法中用於治療受試者的細胞，可通過上文(1)中所述用於製備能夠表達 GITRL或GITRL衍生物的本發明細胞的方法獲得。細胞可為使用從受試者或其他個體收集 的細胞作為材料，通過上文(1)中所述的方法製備的細胞。所述方法還包括在給予受試者 之前，培養所製備的細胞和/或使用合適的標記物分選所述細胞的步驟。在用於治療受試者的本發明方法中，將能夠表達GITRL或GITRL衍生物的細胞，或 者包含其中編碼GITRL或GITRL衍生物的基因可操作地連接至調控元件的核酸構建體的載 體，即上文O)中所述的本發明治療劑或預防劑，給予受試者。如本文所用，受試者沒有具 體限制；然而，優選的是，受試者表示患有對由本發明方法製備的細胞易感的疾病的活生物 體(即人類患者或非人類動物)，或需要針對所述疾病進行預防治療的活生物體。將細胞給予受試者可通過皮內、肌內、皮下、腹膜內、鼻內、動脈內、靜脈內(包括 留置導管插入)或瘤內給予或者通過輸入性淋巴管內輸注來進行。
實施例在下文中用實施例更詳細地描述本發明，但本發明並不限於這些實施例的範圍。實施例1 表達小鼠GITRL-Fc的逆轉錄病毒載體的構建通過從BALB/c小鼠(CLEA Japan, Inc.)的脾提取mRNA,並使用示於SEQ ID NO 1 的 mGITRL-FLF 引物和示於 SEQ ID NO 2 的 mGITRL-FLR 引物進行 RT-PCR，得到 EcoRV-小 鼠GITRL-Bgl II。將如此得到的PCR片段用內切核酸酶EcoRV和Bgl 11 (Takara Bio Inc.)切割，然後克隆至pFUSE-mFc2載體(InvivoGen)的EcoRV-BglII位點中，從而產生 pFuse-mFc/mGITRL。使用作為模板的 pFuse-mFc/mGITRL、示於 SEQ ID N0:3 的 mGF5 引物 和示於SEQ ID NO 4的mFc3引物進行PCR。將如此得到的擴增產物克隆至pCR-Blunt載 體(Invitrogen)中，從而產生pCRblunt-mGFc。將通過用內切核酸酶NotI和Sail (Takara Bio Inc.)消化pCRblunt-mGFc得到的小鼠GITRL-Fc部分切下，並克隆至pMIN載體的 NotI-SalI 位點[Gene Therapy，第 7 卷，第 797-804 Q000)頁]，從而產生 pMT-mGFc。圖 1 顯示pMT-mGFc的示意圖。該質粒編碼融合多肽，其包含跨越GenBank檢索號NP_899247下 所示小鼠GITRL的胺基酸44-173的區和得自小鼠IgG2的Fc片段。將如此製備的質粒 pMT-mGFc 與 Retorovirus Packaging Kit Eco (Takara Bio Inc.)中所含質粒pGP和pE-eco共轉染進HEK293T細胞，然後將轉染子培養2天以得到 細胞上清液，然後通過0.45 μ m濾器(Milex HV, Millipore)將細胞上清液過濾，從而得到 MT-mGFc/ECO逆轉錄病毒。實施例2 小鼠GITRL-Fc基因轉染細胞的製備按照製造商提供的方案使用Retronectin (Takara Bio Inc.)，以用實施例1製備 的MT-mGFc/ECO逆轉錄病毒感染甲基膽蒽(化學致癌物)誘導的小鼠纖維肉瘤細胞CMS 5 [Journal of Experimental Medicine，第 146 卷，第 720_7；34 頁(1977)]，從而產生轉染有 小鼠GITRL-Fc基因的CMS5細胞。隨後，通過有限稀釋進行克隆，並得到小鼠GITRL-Fc基 因轉染的CMS5細胞克隆1和7(在下文中分別稱為「克隆1」和「克隆7」)。
通過以下方法進行克隆細胞中小鼠GITRL-Fc表達的測量將轉染有小鼠 GITRL-Fc基因的CMS5細胞以2 X IO5個細胞/200 μ 1的密度鋪板至96孔板中，然後在10 小時後加入2μ1 10倍稀釋的Golgi Plug (BD Biosciences)。將細胞進一步培養9小時。 將Cytof ix/Cytoperm Kit (BD Biosciences)用於固定細胞和浸泡膜，然後將細胞用抗-小 鼠IgGmAb-FITC綴合物(Caltag)染色。通過流式細胞術測定細胞中的小鼠GITRL-Fc表達。 圖2顯示通過流式細胞術測量細胞中的小鼠GITRL-Fc的結果(a)非轉染細胞；(b)小鼠 GITRL-Fc基因轉染的主體細胞(bulk cell)；和(c)克隆1。如圖2(c)所示，小鼠GITRL-Fc 的產生在轉染有小鼠GITRL-Fc基因的細胞克隆中確證。實施例3:荷瘤實驗將克隆1和7各自以1 X IO6個細胞/0. ImL的濃度皮下注入8-10周齡BALB/c小 鼠(CLEA Japan, Inc.)和 8-10 周齡 C. B-17/lcr-scid/scidJcr 小鼠(CLEA Japan, Inc.) 的右背區，然後在皮下注射後每隔2-3天測定腫瘤大小。測量腫瘤的最大直徑和最小直徑， 並通過將最大直徑乘以最小直徑計算腫瘤大小。每一個組別使用5隻小鼠。圖3顯示各個小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時間依賴性變化。水平軸表示天數而縱 軸表示腫瘤大小的乘積(最大直徑X最小直徑mmXmm)。對於每個轉染有小鼠GITRL-Fc 基因的CMS5細胞克隆，儘管免疫缺陷C. B-17/lcr-scid/scidJcr小鼠顯示腫瘤大小持續增 加，但在具有正常免疫功能的BALB/c小鼠中腫瘤大小減小，並且在第17天之前幾乎觀察不 到腫瘤。該圖顯示移植至小鼠右背區的腫瘤直徑的乘積實心圓表示用克隆1移植的BALB/ c小鼠組；實心三角形表示用克隆7移植的BALB/c小鼠組；空心圓表示用克隆1移植的 C. B-17/lcr-scid/scidJcr小鼠組；和空心三角形表示用克隆7移植的C. B-17/lcr-scid/ scidjcr小鼠組。實施例4 在荷瘤小鼠中誘導腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的確證將CMS5或如實施例2製備的克隆1以IX IO6個細胞/0. ImL的濃度皮下注入 8-10周齡BALB/c小鼠的右背區。在皮下注射後第8和14天，收集脾細胞及其局部淋巴結 細胞，然後如下進行四聚體測定將來自CMS5腫瘤排斥抗原的表位肽9m(SEQ ID NO 5)以 1 μ M終濃度加至5X IO5個細胞的小鼠肥大細胞瘤細胞系PL HTR細胞[Somatic Cell and Molecular Genetics，第11卷，第467-475頁(198 ]，然後將細胞在37°C下培養2小時 (9m肽脈衝的PI. HTR細胞)。將這些細胞以1 40比例與脾細胞混合，然後將這些9m肽 脈衝的PI. HTR細胞也與局部淋巴結細胞和脾細胞以1 40 8的比例混合。將混合物共 培養1周，用9m與小鼠H2/Kd的四聚體(9m/Kd四聚體-PE綴合物)(The Ludwig Institute Core Factory, Lausanne, Switzerland)染色,然後通過流式細胞術分析。圖4顯示通過流式細胞術分析的結果。封閉區域表示與9m/Kd四聚體-PE綴合物 反應的細胞。如圖4(A)-(D)所示，在用CMS5皮下注射的小鼠中於第8和14天收集的所有 脾細胞和局部淋巴結細胞中，沒有檢測到與9m/Kd四聚體-PE綴合物反應的細胞。相反，如 圖4(E)-(H)所示，在用克隆1皮下注射的小鼠中於第14天收集的脾細胞和局部淋巴結細 胞中，都證實顯著出現與9m/Kd四聚體-PE綴合物反應的細胞。因此，確證了僅在負荷克隆 1的小鼠中誘導針對CMS5的腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞。實施例5 在接受各種抗體的負CMS5GITRL-FC小鼠中腫瘤生長的監測將如實施例2製備的克隆1以IX IO6個細胞/0. ImL的濃度皮下注入8-10周齡
11BALB/c小鼠的右背區。在該處理中，從皮下注射前1天開始每隔3天持續2周，將50 μ g 抗-小鼠CD4抗體(Clone GKl. 5)或25 μ 1抗-小鼠CD8抗體(Clone Lyt2. 2)通過眼窩靜 脈給予，或者在皮下注射前1天，將250yg抗-小鼠⑶25抗體(Clone PC61)通過眼窩靜 脈一次給予。在皮下注射後每隔2-3天，以與實施例3所述相同的方式測定腫瘤大小。每 一個組別使用三隻小鼠。圖5顯示各個小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時間依賴性變化。水平軸表示天數，而 縱軸表示腫瘤直徑的乘積(mmXmm)。空心圓表示三隻小鼠中每一隻的結果，而實心圓表示 所述結果的平均值。在圖5中，GITR-Fc顯示來自未給予抗體處理的小鼠的結果，抗-CD25 表示來自給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠的結果，抗-CD4表示來自給予抗-小鼠CD4抗體 的小鼠的結果，和抗-CD8表示來自給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠的結果。未給予抗體處理 的小鼠和給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠顯示腫瘤大小減小，並且腫瘤在第15天之前幾乎 消失。相反，給予抗-小鼠CD4抗體的小鼠和給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠顯示在各個組 別中3隻小鼠的2隻中腫瘤大小持續增加，這表明CD4陽性T細胞和CD8陽性T細胞兩者 都涉及抗腫瘤作用。實施例6 在給予輻射滅活的小鼠GITRL-Fc基因轉染的CMS5細胞的小鼠中，CMS5 腫瘤生長和腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的誘導的確證將通過用IOOcGy X射線輻照滅活的CMS5或通過用IOOcGy X射線輻照滅活的實施 例2製備的克隆1，以5X IO6個細胞/0. ImL的濃度皮下注入8_10周齡BALB/c小鼠的右背 區，然後在7天後，將CMS5以IX IO6個細胞/0. ImL的濃度皮下注入所述小鼠的右背區。在 皮下注射後每隔2-3天，以與實施例3所述相同的方式測定腫瘤大小。在皮下注射後第14 天收集脾細胞及其局部淋巴結細胞，然後以與實施例4所述相同的方式進行四聚體測定。圖6顯示各個小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時間依賴性變化；水平軸表示天數，而 縱軸表示腫瘤直徑的乘積(mmXmm)。圖7顯示四聚體測定的結果。給予X射線輻照滅活的 克隆1的小鼠，與給予X射線輻照滅活的CMS5的小鼠相比顯示腫瘤生長的抑制(圖6)，並 相對於CMS5顯示對腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的顯著誘導(圖7)。這些結果表明X 射線輻照滅活的CMS5GITRL-Fc保留作為疫苗的功能。實施例7 當將X射線輻照滅活的CMS5 GITRL-Fc給予用各種抗體阻斷的小鼠時， CMS5腫瘤生長的監測將通過用IOOcGy X射線輻照滅活的實施例2製備的克隆1，以5X IO6個細胞 /0. ImL的濃度皮下注入8-10周齡BALB/c小鼠的右背區。從第6天開始每隔3天持續2周， 將50 μ g抗-小鼠CD4抗體(Clone GKl.幻或25 μ 1抗-小鼠CD8抗體(Clone Lyt2. 2)通 過眼窩靜脈給予所述小鼠，或者在第6天，將250yg抗-小鼠⑶25抗體(Clone PC61)通 過眼窩靜脈一次性給予所述小鼠。在第7天，將CMS5以IX IO6個細胞/0. ImL的濃度皮下 注入所述小鼠的右背區。在皮下注射後每隔2-3天，以與實施例3所述相同的方式測定腫 瘤大小。圖8顯示各個小鼠組別中小鼠腫瘤大小的時間依賴性變化。在該圖中，水平軸表 示天數，而縱軸表示腫瘤直徑的乘積(mmXmm)。空心圓表示三隻小鼠中每一隻的結果，而 實心圓表示所述結果的平均值。在圖8中，GITR-Fc顯示未給予抗體處理的小鼠的結果， 抗-CD25表示來自給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠的結果，抗-CD4表示來自給予抗-小鼠CD4抗體的小鼠的結果，和抗-CD8表示來自給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠的結果。未給予 抗體處理的小鼠和給予抗-小鼠CD25抗體的小鼠顯示腫瘤大小增加的抑制，而給予抗-小 鼠CD4抗體的小鼠和給予抗-小鼠CD8抗體的小鼠顯示腫瘤大小以顯著性方式持續增加， 這表明⑶4陽性T細胞和⑶8陽性T細胞兩者都參與X射線輻照滅活的CMS5GITRL-Fc的
疫苗作用。實施例8 小鼠GITRL-Fc基因轉染細胞的產生按照實施例2所述的方法，將小鼠結腸癌細胞系CD6 (ATCC CRL-2638)用 MT-mGFc/ECO逆轉錄病毒感染，以產生小鼠GITRL-Fc基因轉染的CD6細胞。隨後，通過 有限稀釋進行克隆，並得到小鼠GITRL-Fc基因轉染的CD6細胞克隆21 (在下文中稱為 「CT26-21」)。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，將其中已整合 GITRL-Fc 基因的質粒載 體pcDNA3. 1 (Invitrogen)轉染入小鼠黑色素瘤細胞系B16(ATCC CRL-6475)，以產生小鼠 GITRL-Fc基因轉染的B16細胞。隨後，通過有限稀釋進行克隆，並得到小鼠GITRL-Fc基因 轉染的B16細胞克隆2和3(在下文中分別稱為「B16-2」和「B16-3」)。實施例9:荷瘤實驗將CI^6、CT26-21(各自 IX IO6 個細胞/0. ImL)、B16、B16_2 和 B16-3 (各自 5 X IO5 個細胞/0. ImL)皮下注入8-10周齡BALB/c小鼠(CLEA Japan, Inc.)的右背區，並在皮下 注射後每隔2-3天，以與實施例3所述相同的方式測定腫瘤大小。每一個組別中使用5隻 小鼠。圖9和10顯示各個小鼠組別中平均小鼠腫瘤大小的時間依賴性變化。水平軸表 示天數，而縱軸表示腫瘤大小的乘積(最大直徑X最小直徑mmXmm)。與對照(由圖中的 空心正方形表示)相比，小鼠GITRL-Fc基因轉染的CD6細胞克隆(CI^6_21，由圖9中的實 心正方形表示)和小鼠GITRL-Fc基因轉染的B16細胞克隆(B16-2和B16-3，分別由圖10 中的實心正方形和實心三角形表示)兩者都顯示在具有正常免疫功能的BALB/c小鼠中腫 瘤大小的減小。結果表明GITRL-Fc在各種癌細胞中的抗腫瘤效果。實施例10 =GITRL-Fc的T細胞活化能力的監測將對得自9m肽特異性TCR基因轉染DUC18小鼠的9m肽特異性的⑶8陽性T細胞 (3 X IO5個細胞)，與IX IO6個細胞的得自用100ng/ml、10ng/ml或lng/ml 9m肽脈衝的野 生型BALB/c小鼠的脾細胞混合，然後將混合物在37°C下於以下各種培養基中溫育15小時 含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養基(在圖11中用作對照，由空心正方形表示)； 含濃度為5 μ g/ml的DTA-I (抗-GITR激動劑抗體)的補充10% FCS的RPMI1640培養基 (在圖中表示為DAT-I，由實心正方形表示)；補充有50 μ 1培養小鼠GITRL-Fc基因轉染克 隆1細胞(實施例2中製備)上清液的、補充10% FCS的RPMI1640培養基(在圖中表示為 CMS5GITRL-Fc sup，由實心三角形表示)；和補充有50 μ 1培養小鼠GITRL-Fc基因轉染克隆 1細胞(實施例2中製備)上清液和濃度為5 μ g/ml的抗-GITRL抗體的、補充10% FCS的 RPMI1640培養基(在圖中表示為CMS5GITRL-Fc sup+GITRLmAb,由空心三角形表示)。將各 種DUC18小鼠來源的對9m肽特異的⑶8陽性T細胞的胞內IFN- γ，用抗-IFN- γ抗體(BD Biosciences)染色並通過流式細胞術分析。圖11顯示在各種肽濃度下，在各個樣品的⑶8陽性細胞中所含IFN-Y陽性細胞的比例。類似於DTA-I (其刺激GITR活化效應細胞)，小鼠GITRL-Fc基因轉染細胞的上清 液顯示通過活化CTL克隆誘導IFN- Y產生。抗-GITRL抗體抑制對在小鼠GITRL-Fc基因 轉染細胞的上清液中產生IFN-Y的誘導，該事實表明從小鼠GITRL-Fc基因轉染的細胞分 泌的GITRL-Fc具有與α GITR激動劑抗體等價的活性，並刺激和活化T細胞中的GITR。實施例11 =GITRL-Fc對調節性T細胞誘導的阻抑作用的監測將CMS5或如實施例2製備的小鼠GITRL-Fc基因轉染的細胞克隆1 (表示為圖 12和13中的CMS5GLFc)，以IX IO6個細胞/0. ImL的濃度皮下注入8_10周齡BALB/c小 鼠的右背區。在皮下注射後第9天，採集CMS5的脾細胞(脾)、局部淋巴結細胞(DLN)和 腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，並將它們用抗-⑶4抗體(BD Biosciences)、抗-Foxp3抗體(e Biosciences)、抗-CD8 抗體(BD Biosciences)和抗-CD25 抗體(BD Biosciences)染色， 並通過流式細胞術分析。圖12顯示各種組織中CD4陽性、Foxp3陽性細胞(調節性T細胞)對CD4陽性、 Foxp3陰性細胞的比。圖13顯示CD8陽性細胞對CD4陽性、Foxp3陽性細胞(調節性T細 胞)的比。如圖12所示，小鼠GITRL-Fc基因轉染的腫瘤細胞顯示在腫瘤浸潤淋巴細胞中比 CMS5中顯著較強對誘導調節性T細胞的阻抑，並且如圖13所示，其表明CD8細胞的比例相 對於調節性T細胞的比例增加。實施例12 通過GITRL-Fc表達監測T細胞獲得多功能性將CMS5以1父106個細胞/0. ImL的濃度皮下注入8_10周齡BALB/c小鼠的右背區。 7天後，將小鼠分組成通過尾靜脈注射注射了 IX IO6個細胞/0. ImL的9m肽特異性⑶8陽 性T細胞(獲得自DUC18小鼠)的組別(表示為圖14和15中的ACT)；通過尾靜脈注射注 射了 IX IO6個細胞/0. ImL的9m肽特異性⑶8陽性T細胞(獲得自DUC18小鼠)然後用 1 X IO7個細胞/0. ImL的輻射滅活的CMS5皮下注入左背區的組別(表示為圖14和15中的 ACT+CMS5 vac)；和通過尾靜脈注射注射了 1 X IO6個細胞/0. ImL的9m肽特異性⑶8陽性 T細胞(獲得自DUC18小鼠)然後用1 X IO7個細胞/0. ImL的輻射滅活小鼠GITRL-Fc基因 轉染的細胞克隆1(如實施例2所製備)皮下注入左背區的組別(表示為圖14和15中的 ACT+CMS5GLFc vac) 0以與實施例3所述相同的方式每隔3_5天，測定各個組別小鼠的腫瘤 大小。在第10天，採集局部淋巴結細胞，並將⑶8陽性細胞用抗-IFN-γ抗體、抗-TNF-a 抗體(BD Biosciences)和抗-CD 107a抗體(e Biosciences)染色，然後通過流式細胞術 分析。圖14顯示各個小鼠組別中平均小鼠腫瘤大小的時間依賴性變化。水平軸表示天 數，而縱軸表示腫瘤大小的乘積(最大直徑X最小直徑mmXmm)。在給予得自DUC18小鼠 的9m肽特異性⑶8陽性T細胞+小鼠GITRL-Fc基因轉染的細胞的組別中，腫瘤生長几乎 被抑制，這表明GITRL-Fc增強腫瘤抗原特異性T細胞的抗腫瘤作用。圖15顯示在轉移入淋巴結的9m肽特異性⑶8陽性細胞中存在的以下細胞類型 的比例顯示IFN-Y產生、TNF-α產生和⑶107a表達(細胞毒性粒細胞產生的能力的指 數)的所有三種功能的細胞(3型)；顯示兩種功能的細胞0型)；顯示單種功能的細胞(1 型)；和沒有任何功能的細胞(0型)。與其它組別相比，給予得自DUC18小鼠的9m肽特異 性⑶8陽性T細胞+小鼠GITRL-Fc基因轉染細胞的組別，具有較高的顯示三種或兩種功能的細胞比，這表明GITRL-Fc允許腫瘤抗原特異性效應T細胞以高效率獲得多功能性。實施例13 表達小鼠GITRL-Fc的腺病毒載體的製備將製備於實施例1的載體pMT-mGFc用內切核酸酶NotI和&ilI(Takara Bio Inc.) 切割，然後經過瓊脂糖凝膠電泳，並從凝膠中回收含小鼠GITRL-Fc序列的約1. 2kbp片 段。將所回收的片段用DNA Blunting Kit(Takara Bio Inc.)切成平端，然後連接至粘粒 載體 pAxCAwtit2 (Takara Bio Inc.)的 SwaI 位點中。使用 Gigapack III XL Packaging Extract (Agilent ^Technologies)，將如此獲得的重組DNA轉入大腸桿菌DH5 α (Takara Bio Inc.)中，然後在補充有氨苄西林的LB培養基中挑選轉化體。將該轉化體進一步培養以制 備粘粒 DNA，其命名為 「pAxCAwtit2-mGITRL-FcA」。然後，使用TransIT-293(Mirus Bio LLC)以將用內切核酸酶 BspT104I (Takara Bio Inc.)切割的PAxCAwtit2-mGITRL-Fc轉化HEK293細胞。將如此獲得的轉化體培養，然 後將培養物超聲破碎。將含表達GITRL-Fc的腺病毒載體AxCA-mGITRL-Fc的濃縮培養上清 液回收，並得到原代病毒溶液。將原代病毒溶液用於感染HEK293細胞，然後將所述細胞培養。將培養物超聲處理 並回收上清液，從而得到第二代病毒溶液。通過同樣的操作獲得第三代和第四代病毒溶液。以類似的方式，從粘粒載體pAXCAwtit2-AcGFP中製備第四代病毒溶液，所述載體 中AcGFP基因克隆自pAcGFPl載體(Clontech)。將該病毒溶液中包含的腺病毒載體命名為 AxCA-AcGFP0最後，將Adeno-X Rapid Titer Kit (Clontech)用於測定兩種不同的第四代病毒 溶液的病毒滴度。實施例14 用腺病毒載體感染小鼠腫瘤細胞將實施例13中製備的各種腺病毒載體的第四代病毒溶液用於以10和50的 MOI (感染複數每個細胞感染病毒的量)感染甲基膽蒽(化學致癌物)誘導的小鼠纖維 肉瘤細胞系CMS5和小鼠結腸癌細胞系CD6，然後將細胞培養2天。為確定感染效率，將用 AxCA-AcGFP的第四代病毒溶液感染的各個腫瘤細胞系都通過流式細胞術分析。結果，對於 以10M0I感染的CMS5和CI^6，分別證實72. 2%的CMS5細胞和57. 的細胞已被病 毒感染。對於以50M0I感染的CMS5和CT26，也分別證實99. 的CMS5細胞和94. 9%的 CT26細胞已被病毒感染。將用AxCA-mGITRL-Fc和AxCAwt2以50M0I感染的各個腫瘤細胞 系都用於後續實施例中。實施例15 在給予腺病毒載體感染的小鼠腫瘤細胞的小鼠中腫瘤生長的確認將實施例14中製備的AxCA-mGITRL-Fc感染的CMS5、非感染的CMS5、 AxCA-mGITRL-Fc感染的CD6和非感染的CT26，以1 X IO6個細胞/0. 2mL的濃度皮下注射至 8-10周齡BALB/c小鼠(CLEA Japan, Inc.)的右背區，然後在皮下注射後每隔2_3天，以與 實施例3所述相同的方式測定腫瘤大小。各個組別中使用5隻小鼠。在第15天，腫瘤直徑大小的平均值士標準差((最大直徑+最小直徑/2 :mm)為 11. 74 士 3. 49 (對於 AxCA-mGITRL-Fc 感染的 CMS5)、15. 59 士 1. 84 (對於非感染的 CMS5)、 5. 76士4. 65(對於 AxCA-mGITRL-Fc 感染的 CT26)和 13.洸士3. 45 (對於非感染的 CT26)。小鼠GITRL-Fc基因轉染的細胞顯示腫瘤大小減小，這表明在各種腫瘤細胞中表 達GITRL-Fc的腺病毒載體對腫瘤生長的抑制作用。
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工業實用性本發明的細胞、治療劑、預防劑和治療方法可用於治療或預防疾病，包括腫瘤和感 染。它們能夠有效地誘導免疫系統。SEQIDNO1:mGITRL-FLF 引物
SEQIDNO2:mGITRL-FLR 引物
SEQIDNO3:mGF5引物
SEQIDNO4:mFc3引物
SEQIDNO5表位肽9m
權利要求
1.一種能夠表達外源GITRL(糖皮質激素誘導性腫瘤壞死因子受體的配體)或外源 GITRL衍生物的細胞。
2.權利要求1的細胞，其中所述GITRL衍生物為GITRL或GITRL片段與免疫球蛋白Fc 片段的融合蛋白(GITRL-Fc)。
3.權利要求1或2的細胞，其中所述細胞為腫瘤細胞或免疫細胞。
4.權利要求3的細胞，其中所述細胞為失活的腫瘤細胞。
5.一種用於製備權利要求1的細胞的方法，其包括用包含編碼GITRL或GITRL衍生物 的基因的載體轉化細胞。
6.權利要求5的方法，其中所述GITRL衍生物為GITRL-Fc。
7.權利要求5或6的方法，其中所述細胞為腫瘤細胞或免疫細胞。
8.權利要求7的方法，其中所述細胞為失活的腫瘤細胞。
9.一種包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因的病毒載體。
10.權利要求9的病毒載體，其中所述載體選自逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨 病毒載體和仙臺病毒載體，並且包含編碼GITRL或GITRL衍生物的基因。
11.一種包含權利要求1-4中任一項的細胞作為活性成分的治療劑或預防劑。
12.權利要求1-4中任一項的細胞在製備權利要求11的治療劑或預防劑中的用途。
13.一種用於治療受試者的方法，其包括將權利要求1-4中任一項的細胞給予所述受 試者。
14.一種包含權利要求9或10的病毒載體作為活性成分的治療劑或預防劑。
15.權利要求9或10的病毒載體在製備權利要求14的治療劑或預防劑中的用途。
16.一種用於治療受試者的方法，其包括將權利要求9或10的病毒載體給予所述受試者ο
全文摘要
本文公開了能夠表達外源GITRL或外源GITRL衍生物的細胞；用於製備所述細胞的方法；包含所述細胞作為活性成分的治療劑或預防劑；所述細胞在製備治療劑或預防劑中的用途；包括將所述細胞給予受試者的步驟的方法；攜帶編碼GITRL或GITRL衍生物的基因的病毒載體；包含所述病毒載體作為活性成分的治療劑或預防劑；所述病毒載體在製備治療劑或預防劑中的用途；和包括將所述病毒載體給予受試者的步驟的方法。
文檔編號A61P31/10GK102149820SQ200980136139
公開日2011年8月10日 申請日期2009年9月11日 優先權日2008年9月12日
發明者三井潤, 加藤鬱之進, 峰野純一, 池田裕明, 珠玖洋, 竹中由貴 申請人:國立大學法人三重大學, 寶生物工程株式會社