使發射體的光譜發射特性產生改變的發射體結合肽的製作方法

2023-09-19 16:52:35

專利名稱：使發射體的光譜發射特性產生改變的發射體結合肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及發射體結合肽(Emitter-bindende Peptide)，在其抗原結合口袋與發射體相互作用時其使發射體的光譜發射特性產生改變。本發明的發射體結合肽特別是抗體或抗體片段的組分。
背景技術：
為診斷檢測某些物質及確定其濃度，現在很多情況下使用的是體外診斷測量方法，其基於對於要測定的物質具有高親和力的生物分子，如例如肽、蛋白質、抗體或寡核苷酸。為此，優選使用蛋白質和肽，特別優選使用抗體和抗體片段。
某些體外診斷方法，如例如電化學發光是基於針對要測定物質的不同抗體的組合，其中一種抗體用於從所研究的樣品中分離要測定的物質，而另一種抗體攜帶診斷用的檢測信號分子。在電化學發光的診斷方法中，標記的抗體被光學檢測Grayeski，M.L.，Anal.Chem.1987，59，1243。
除了電化學發光，光誘導的磷光和螢光也可以作為分子的光學特性用於診斷測量方法。與電化學發光和磷光相比，特別是將螢光作為分子的光學特性在大的動態範圍內具有測量信號的高檢測靈敏性和高線性的優點。
為檢測螢光團的螢光，發展了在螢光方法中應用不同原理的多種測量方法。已有的測量方法應用例如偏振光弱化(螢光偏振＝FP)，測量光子使用壽命(螢光使用壽命測量-FLM)，漂白特性(螢光光漂白恢復-FRR)和不同螢光團之間的能量轉移(螢光-共振-能量轉移-FRET)Williams，A.T.，et al，Methods Immunol.Anal.1993，1，446；Youn，H.J.et al，Anal.Biochem.1995 Oswald，B.et al，Anal.Biochem.2000，280，272；Szollosi，J.et al，Cytometry 1998，34，159。
其它檢測方法基於偏振面或檢測磷光的改變。
上述方法中，使用的抗物質抗體實現了不同的目的。一方面，它們用於從所述樣品中分離要測定的物質，而另一方面，它們也可實現對應用於待檢測物質上的不同信號遞質進行定位的目的。為檢測例如樣品中的抗體，主要的光學和放射性測量方法已被建立，而且也已知聲學(見例如Cooper，M.A.et al，Direct and Sensitive Detection of aHuman Virus By Rupture Event Scanning.Nat Biotechnol.2001 Sep；19(9)833-7)和磁學測量方法。光學測量方法獲得了最廣泛的應用Nakamura，R.M.，Dito，W.R.，Tucker，E.S.(Eds.).ImmunoassaysClinical Laboratory Techniques for the 1980s.A.R.Liss，NewYork.Edwards，R.(ed.).ImmunoassaysEssential Data，1996，WileyEurope。
在多數已有的測量方法中，抗物質抗體用一種螢光團標記。這個標記通過特異的和非特異的化學偶聯完成。標記的抗體過量加入要研究的樣品中。為了結合所有測定的物質分子，這是必需的。另外，這個方法通常基於一種抗物質抗體用於分離要測定的物質而在另一個結合位點檢測要研究物質的另一種抗物質抗體用信號分子標記。這樣，可以避免由於未結合的、但是產生信號的抗體造成的測量結果的歪曲。然而，由於存在分離步驟，這個方法需要較複雜的方法學和技術要求以及較高的花費。較複雜的技術要求阻止了這個方法用於高速診斷，被證明是特別不利的。
針對低分子量分子的抗體和肽是已知的。這些也包括針對染料分子的抗體和肽。Simeonov，A.et al.，Science 2000，290，307-313描述了針對芪的抗體(「藍色螢光抗體」)。這些抗體催化特異的光化學異構化過程並導致UV-VIS光譜範圍內的紅移吸收和螢光最大值(吸收移動最大12nm，螢光移動22nm)。然而，對於在600-1200nm波長範圍內保持花青染料的螢光量子產額時的紅移，Simeonov，A.et al.沒有提供任何有關的提示。
Watt，R.M.et al.(Immunochemistry 1977，14，533-541)描述了已知的抗螢光素抗體構建體的光譜特性。結合螢光素後，在可見光譜範圍內抗體發生了吸收和螢光最大值的移動，但是只有12nm或5nm。另外，螢光量子產額急劇減少(大約90％)。
Rozinov，M.N.et al.(Chem.Biol.1998，5，713-728)描述了從噬菌體文庫中選擇12聚體(12-mer)肽，其結合染料德克薩斯紅(TexasRed)、羅丹明紅(Rhodamine Red)、Oregon Green 514和螢光素。對於德克薩斯紅，觀察到了吸收和螢光的紅移，但只有2.8nm或1.4nm。
另外，針對不同染料的抗體已經可以商業獲得，例如針對螢光素、四甲基羅丹明、德克薩斯紅、Alexa fluorine 488、BODIPY FL、螢光黃(Lucifer Yellow)和Cascade Blue、Oregon Green的抗體(MolecularProbes Company，Inc.，USA)。然而，這些是用於生物分析目的的多克隆IgG抗體，其具有某種不可控程度的交叉反應性且其不是從嚴格的選擇過程中生產的。
還需要適用於上述測量方法的改良的發射體結合肽，特別是特異性的抗體。此時，特別是那些在600-1200nm波長範圍內，在保持花青染料的螢光量子產額時產生紅移的發射體結合肽是有利的。
這個目標本發明是通過如下實現的，一種發射體結合肽，其特徵在於所述肽在其抗原結合口袋與發射體相互作用時改變發射體的光譜發射特性，一種生產本發明的發射體結合肽的方法，包括用一種發射體免疫適當的生物體，包括一種選自選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁(indotricarbocyanine)、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料的染料以及相應應用本發明的發射體結合肽、核酸、宿主細胞或抗體或綴合物作為診斷試劑用於體外診斷。在從屬權利要求中引用了適當的實施方案。
因此，本發明的第一方面涉及一種發射體結合肽，其特徵在於所述肽在其抗原結合口袋與發射體相互作用時改變發射體的光譜發射特性。
優選的是本發明的發射體結合肽，其中發射體包含一種在700至1000nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和/或螢光最大值、優選在750至900nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和螢光最大值的染料。
更優選的是本發明的發射體結合肽，其中發射體部分的發射特性的改變選自偏振面改變、螢光強度改變、磷光強度改變、螢光使用壽命改變和吸收最大值和/或螢光最大值的紅移。本發明不限於這些光譜現象，然而術語「發生特性改變」在本發明的範圍內包括所有的物理現象或作用，其中發射體發生的高能輻射在其特性上改變並且此時這種改變定量性的依賴於物質-發射體綴合物或物質-檢測試劑-發射體-綴合物與其發射體結合配偶體和物質的結合/非結合。在一個實施方案中，所述物質例如是肽、蛋白質、寡核苷酸以及特別是抗體或抗體片段。在本發明的範圍內，所述抗體片段是那些包括至少含有所謂「互補性決定區」(CDR)的抗原結合區域的片段。此時，抗原結合區域最優選包括完整的可變鏈VL和VH。
在本發明發射體結合肽的一個特別優選的方面中，抗體或抗體片段選自多克隆或單克隆抗體、人源化抗體、Fab片段，特別是單體Fab片段、scFv片段、合成和重組抗體、scTCR鏈及其混合物。
在合成和重組抗體或抗體片段時特別優選的是來自HuCAL文庫的那些(WO 97/08320；Knappik，(2000)，J.Mol.Biol.296，57-86；Krebs et al.J Immunol Methods.2001 August 1；254(1-2)67-84)。這些可以是天然形式之一的完整的免疫球蛋白或抗體(IgA，IgD，IgE，IgG，IgM)或者是抗體片段，其中抗體片段包括至少VL胺基酸位置4至103和VH的5至109，優選VL的胺基酸位置3至107和VH的4至111及特別優選完整的可變鏈VL和VH(VL的胺基酸位置1至109和VH的1至113)(編號根據WO 97/08320)。
在一個優選的實施方案中，抗體或抗體片段包括至少一個CDR區域，其包含在序列SEQ-ID No.1、2、5、6、9、10、13、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中(VLCDR1位置24-34，CDR2位置50-56，CDR3位置89-96；VHCDR1位置26-35，CDR2位置50-65，CDR3位置95-102)，特別是VL CDR3或VH CDR3。此時特別優選的是包括一個可變鏈VL的抗體，所述可變鏈包含在序列SEQ-ID No.2、6、10、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中或者包含在序列SEQ-ID No.1、5、9和13之一之中(或這種抗體的片段)。最優選的是包括包含在以下序列對中的一個VH/VL對的抗體，所述序列對為SEQ-ID No.1+2；SEQ-ID No.5+6；SEQ-ID No.9+10；SEQ-ID No.13+14；SEQ-ID No.5+17；SEQ-ID No.5+19；SEQ-ID No.5+37；SEQ-ID No.9+21；SEQ-ID No.9+23；SEQ-ID No.9+25；SEQ-ID No.9+27；SEQ-ID No.9+29；SEQ-ID No.9+31；SEQ-ID No.9+33；SEQ-ID No.9+39；SEQ-ID No.13+35(或這種抗體的片段)。此時特別優選的是Fab片段MOR02628、MOR02965、MOR02977、MOR02969、MOR03263、MOR03325、MOR03285、MOR03201、MOR03267、MOR03268、MOR03292、MOR03294、MOR03295、MOR03309、MOR03293和MOR03291。從本發明所述的抗體開始，獲得示出本發明特性的新的修飾的抗體的多種可能性對於本領域技術人員是顯而易見的。
本領域技術人員已知特別是重鏈和輕鏈的CDR區域負責親和力以及選擇性和特異性。此時，特別是VH的CDR3區域和VL的CDR3區域起作用，然後是VH的CDR2和VL的CDR1，而大多數情況下VH的CDR1和VL的CDR2起次要作用。因此，為最佳化抗體的親和力以及選擇性和特異性，特別提示了CDR區域(也參見例如Schieret al.，J.Mol.Biol.(1996)263，551)。此時，例如一或多個CDR區域可以被特異性地交換為例如其它已經示出本發明特性的其它抗體的CDR區域或者被相應的CDR序列的文庫交換(為此見實施例1的優化)，所述文庫產生了完全隨機的變化或含有或多或少對特異胺基酸或其組合的強偏愛(趨勢(Tendenz))。而且，本領域技術人員也能夠將完整的可變鏈以相同方式交換為其它明確的抗體的相應鏈或這種鏈的多樣性文庫。另外，通過誘變特異性交換CDR中的一或多個胺基酸基的方法是本領域技術人員已知的。這種改變胺基酸殘基的鑑定在此例如是基於對比不同抗體的序列和鑑定保守的或至少在相應位置高度同源的殘基來進行的。在改變CDR時，此時本領域技術人員已知所謂的「規範結構(kanonischen Strukturen)」(Al-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.(2000)295，979)；Knappik et al.J.Mol.Biol.(2000)296，57)，其影響CDR區域的三維排列，因此可以考慮設計的最佳策略。
而且，改變抗體或抗體片段的骨架區以獲得更穩定或更可表達的分子的技術也是本領域技術人員熟知的(WO 92/01787；Nieba et al.(1997)Protein Eng.10，435；Ewert et al.(2003)Biochemistry 42，1517)。
除了用於修飾抗體或抗體片段的已經描述的策略，根據本發明抗體的知識和本申請描述的測量方法，本領域技術人員也能夠對胺基酸序列或所述抗體的組合物進行額外的改變並且通過使用所述分析和測量方法確定是否產生了其特性符合本發明抗體的特性的修飾抗體。
本發明的另一方面涉及編碼本發明的抗體或抗體片段之一的核酸分子。在一個優選實施方案中，此時這些是編碼可變鏈VL之一或可變鏈VH的核酸分子，所述可變鏈VL之一包含在序列SEQ-IDNo.2、6、10、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中，所述可變鏈VH包含在序列SEQ-ID No.1、5、9和13中。此時特別優選的是SEQ-ID No.3、4、7、8、11、12、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的序列。
本發明的發射體結合肽最理想展示小於50nm及優選小於10nm的結合親和力。
另一個方面是本發明的發射體結合肽，其中所述發射體包含一種在700-1000nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和/或螢光最大值、優選在750-900nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和螢光最大值的染料。選擇染料的紅移，以便在與檢測發射體的試劑相互作用後所述吸收最大值和/或螢光最大值移向較高的波長，移動值大於15nm，優選大於25nm及最優選大約30nm。此時，移動是染料的特性，沒有必要以這種方式對移動加以考慮。通常，移動被測量為染料發射值的改變，即在某個單波長。為此，提供了本領域技術人員已知的用於測量的適當的光學試劑。這也應用於測量偏振面的改變、螢光強度的改變、磷光強度的改變、螢光使用壽命的改變和吸收最大值和/或螢光最大值的紅移。
對於本發明的發射體結合肽，優選使用的發射體包含選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料的一種染料。通常，本發明的物質-發射體-綴合物的發射體可以包含通式(I)的一種花青染料 其中D表示基團(II)或(III)
其中標有星號的位置表示與基團B連接的位點以及可以表示基團(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII) 其中R1和R2，分別獨立地代表C1-C4-磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50-烷基鏈，其任選被0至15個氧原子和/或被0至3個羰基間隔和/或被0至5個羥基取代；R3和R4，分別獨立地代表基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2分別獨立地代表氫原子，C1-C4-磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50-烷基鏈，其任選被0至15個氧原子和/或被0至3個羰基間隔和/或被0至5個羥基取代，R5代表氫原子、甲基、乙基或丙基或氟、氯、溴或碘原子，b表示數字2或3，及X和Y獨立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及這些化合物的鹽和溶劑合物。
可能令人驚奇地發現，在抗體與在近紅外光譜範圍內(＞750nm)具有吸收和螢光的花青染料高度親和性結合後，吸收最大值和螢光最大值向較高波長移動了大約30nm(紅移)。因此應用這個原理，可能例如在一個大的濃度範圍內直接檢測並且從全血樣品中光譜分離信號，其中關於要被測定的物質的濃度的信號是線性的。
發射體可以和物質形成綴合物。在本發明的範圍內，具有通式S-E的是物質-發射體綴合物，其中S代表要被檢測的物質及E代表發射體，其包含一個與檢測發射體的試劑相互作用時出現發射特性改變的部分。作為本發明的綴合物的組分，i.a.，在600-1200nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和螢光最大值的染料是適當的。此時，優選在700-1000nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和螢光最大值的染料。符合這些條件的染料例如是如下的那些聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、部花青和氧雜菁染料、羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料、四吡咯染料(tetrapyrrolfarbstoffe)，尤其是苯卟啉、氯、細菌氯(bacteriochlorine)、脫鎂葉綠甲酯一酸、細菌脫鎂葉綠甲酯一酸(bacteriopheophorbides)、紅紫素(purpurines)和酞菁。
優選的染料是在750和900nm之間具有吸收最大值的花青染料，且靛三羰菁具有特別的優勢。本發明綴合物的結構組分也是通過本發明的方法確定濃度的物質。
這些選自例如抗原，如蛋白質、肽、核酸、寡核苷酸、血液組分、血清組分、脂質、藥物製劑和低分子量的化合物，特別是糖、染料或其它分子量低於500道爾頓的化合物。
優選的染料是在750和900nm之間具有吸收最大值的花青染料，且靛三羰菁具有特別的優勢。
染料含有結構元件，通過其與物質結構進行共價偶聯。這些是例如具有羧基、氨基和羥基的接頭。
在光學測量時，這可以以不同方式進行，且取決於發射體(例如螢光團)光譜特性的特徵性改變的類型。通常優選的是檢測吸收波長和發射波長的移動或在大部分檢測與抗體結合的螢光團的部分的波長下測量吸收和/或螢光強度。根據抗體結合螢光團的光譜特性的改變，其它特性，如例如光子使用壽命、偏振和漂白特性也可以用於光學測量。
螢光團在近紅外光的光譜範圍內的特別益處在於由血液組分產生的少的重疊(geringen berdeckung)。由此，可以進行深穿透(Tiefeneindringung ermglicht)，而不會使待檢測的信號太強烈的改變。
而且，本領域技術人員已知在結合螢光團後能夠改變其UV範圍內光譜特性的針對螢光團的抗體。通過將螢光團結合在抗體的抗原結合口袋中，可以主要改變螢光強度、吸收最大值、發射最大值和光子使用壽命[Simeonov，A.，et al.，Science(2000)307-313]。這些已知的抗體針對發射體(螢光團)，然而其在光的可見光和UV範圍內具有吸收和螢光發射。
本發明的另一方面涉及將本發明的發射體結合肽用於體外診斷的應用。
為此，本發明的發射體結合肽也可以存在於一個診斷試劑盒中，任選和其它佐劑一起。另外，所有本發明的這些試劑盒都可以含有特別的指導和文件(例如標準曲線、定量指導等)。
本發明現在基於實施例和所附附圖和序列更詳細地被描述，但是本發明不限與此。這裡

圖1CysDisplay-Screening載體pMORPH23(載體圖和序列)，圖2表達載體pMORPHX9MS(載體圖和序列)，及圖3實施例2的染料在PBS中在存在和不存在抗體MOR02965時的吸收光譜(左)和螢光光譜。
實施例
實施例1選擇、生產和定性發射體結合抗體選擇針對花青染料Fuji 6-4(ZK203468)[三鈉-3，3-二甲基-2-{4-甲基-7-[3，3-二甲基-5-磺醯基-1-(2-磺醯乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]七-2，4，6-三烯-1-基亞基}-1-(2-磺醯乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸鹽，內鹽]([Trisodium-3，3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3，3-dimethyl-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2，4，6-trien-1-ylidene}-1-(2-sulfonatoethyl)-2，3-dihydro-1H-indole-5-sulfonate，Inner Salt])的HuCAL GOLD Fab抗體片段HuCAL GOLD抗體文庫抗體文庫HuCAL GOLDHuCAL GOLD是完全合成的、Fab抗體片段形式的模塊化人抗體文庫。HuCAL GOLD基於HuCAL-scFv1文庫描述的HuCAL-共有序列-抗體基因(WO 97/08320；Knappik，(2000)，J.Mol.Biol.296，57-86；Krebs et al.J Immunol Methods.2001 Aug 1；254(1-2)67-84).在HuCAL GOLD中，所有相應於人抗體中這些區域組成的6個CDR區域通過使用所謂的三核苷酸誘變(trinukleotidmutagenese)被多樣化(Virneks et al.(1994)NucleicAcids Res.1994Dec 25；22(25)5600-7)，而在較早的HuCAL文庫中(HuCAL-scFv1和HuCAL-Fab1)，只有VH和VL中相應於天然組成的CDR3-區域被多樣化(見Knappik et al.，2000)。而且，稱為CysDisplay一種修飾的篩選方法(WO 01/05950)也發現於HuCALGOLD中。用於篩選方法的載體pMORPH23見於圖1。
Vλ的1位and 2位.原始的HuCAL主基因用其可信的(authentischen)N-末端構建VLλ1QS(CAGAGC)，VLλ2QS(CAGAGC)和VLλ3SY(AGCTAT).這些序列見於WO 97/08320。生產HuCAL-scFv1-文庫時，這兩個胺基酸殘基被改變為″DI″以促進克隆(EcoRI位點)。這些殘基在生產HuCAL-Fab1和HuCAL GOLD時被保留了。因此，所有HuCAL文庫都含有在5』-端具有EcoRV切割位點GATATC(DI)的VLλ基因。所有HuCAL kappa基因(主基因和文庫中的所有基因)在任何情況下在5』-端都含有DI，因為這些代表了可信的N-末端(WO 97/08320)。
VH的1位.原始的HuCAL-主基因用其可信的N-末端生產VH1A、VH1B、VH2、VH4和VH6具有Q(＝CAG)作為第一個胺基酸基，VH3以及VH5具有E(＝GAA)。相應的序列見於WO 97/08320。在克隆HuCAL-Fab1以及HuCAL GOLD文庫時，胺基酸Q(CAG)被摻入所有VH基因的這個1位中。
噬菌粒的生產大量的噬菌粒通過輔助噬菌體感染來自HuCAL GOLD抗體文庫或來自成熟文庫的大腸桿菌(E.coli)TOP10F′細胞生產和濃縮。最後，HuCAL GOLD或成熟文庫(TOP10F′細胞中)在具有34μg/ml的氯黴素/10μg/ml的四環素/1％葡萄糖的2×YT培養基中在37℃培養至OD600為0.5。然後，用VCSM13輔助噬菌體在37℃進行感染。沉澱感染的細胞並重懸於2×YT/34μg/ml氯黴素/10μg/ml四環素/50μg/ml卡那黴素/0.25mmol IPTG中並且22℃培養過夜。用PEG從上清中沉澱噬菌體2x並通過離心收集(Ausubel(1998)Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley Sons，Inc.，New York，USA)。將噬菌體重懸於PBS/20％甘油並儲存於-80℃。
每個選擇循環中噬菌粒的擴增如下進行對數期大腸桿菌TG1細胞用選擇的噬菌體感染並鋪板於具有1％葡萄糖/34μg/ml的氯黴素的LB-瓊脂平板上。溫育過夜後，刮下細菌菌落，重新培養並用VCSM13輔助噬菌體感染。
初步選擇針對染料Fuji 6-4(ZK203468)的抗體HuCAL GOLD抗體文庫純化濃縮的噬菌粒用於標準選擇方法。作為抗原，BSA-或運鐵蛋白-偶聯的ZK203468交替使用。將抗原加入PBS中並以50μg/ml的濃度加入MaxisorpTM微量滴定板F96(Nunc)中。Maxisorp平板在4℃溫育過夜(″包被″)。在Maxisorp平板用含有5％奶粉的PBS封閉後，將大約2E+13個HuCAL GOLD噬菌體加入到抗原荷載的(antigen-beladenen)、封閉的孔中並且在室溫溫育過夜或2小時。幾個洗滌步驟之後(洗滌步驟隨著漸進的選擇循環而變得更嚴格)，結合的噬菌體用20mmol DTT或100μmol未綴合的ZK203468洗脫。總之，進行三次連續的選擇循環，其中在選擇循環之間進行噬菌體擴增，如上述。
亞克隆選擇的Fab片段用於表達包含3個循環的抗體選擇之後，分離的HuCAL克隆的Fab-編碼插入物亞克隆至表達載體pMORPHX9_MS(見圖2)以促進Fab片段隨後的表達。最後，選擇的HuCAL Fab克隆的純化的質粒-DNA用限制性酶XbaI和EcoRI消化。純化Fab-編碼插入物並連接到相應消化的載體pMORPHX9_MS中。這個克隆步驟產生了Fab-表達載體pMORPHX9_Fab_MS。這個載體表達的Fab片段攜帶2個C-末端標記(Myc標記和Strep標記II)用於純化和檢測。
篩選和定性ZK203468-結合Fab片段選擇後分離了幾千個克隆並亞克隆及通過ELISA在384孔板中對於淘選中使用的抗原ZK203468-BSA和-運鐵蛋白的特異性檢測進行了測試。在此鑑定的克隆在抑制性-ELISA(inhibitions-ELISA)中研究了其對未綴合染料的有效結合。
這產生了腸胃外Fab片段MOR02628(蛋白質序列SEQ-ID NO1(VH-CH)和SEQ-ID NO2(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO3(VH-CH)和SEQ-ID NO4(VL-CL))、MOR02965(蛋白質序列SEQ-ID NO5(VH-CH)和SEQ-ID NO6(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO7(VH-CH)和SEQ-ID NO8(VL-CL))和MOR02977(蛋白質序列SEQ-IDNO9(VH-CH)和SEQ-ID NO10(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO11(VH-CH)和SEQ-ID NO12(VL-CL))和MOR02969(蛋白質序列SEQ-ID NO13(VH-CH)和SEQ-ID NO14(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO15(VH-CH)和SEQ-ID NO16(VL-CL))，其有效地結合未綴合的染料ZK203468。
實施例2通過交換LCDR3區域最佳化腸胃外抗體片段克隆LCDR3文庫4個腸胃外(parenteralen)克隆MOR02628、MOR02965、MOR02969和MOR02977的質粒-DNA用限制性酶EcoRI和XbaI消化，並將產生的來自表達載體pMORPHX9_MS的完整的Fab-插入物亞克隆至相應酶切的展示載體(display vektor)pMORPH23中。這個步驟對於製備用於在噬菌體表面呈遞Fab片段的基因III(GenIII)是必需的。在另一步驟中，4個胃腸外克隆(現pMORPH23中)用BpiI和SphI消化。在此，LCDR3區和Clambda恆定區從載體骨架中去除。分離純化相應的載體-DNA片段。同時，從HuCAL-Fab 2文庫分離互補BpiI/SphI片段，其含有多樣化的LCDR3區域(具有大約3E+8的可變性)和Clambda恆定區(＝插入物-DNA)。幾μg的載體-DNA和相容的插入物-DNA以1∶2的摩爾比用T4-DNA-連接酶連接並在純化後轉化進電感受態(elektrokompetente)TOP10F′細胞中。此時，每個胃腸外抗體獲得了5E+8至大約1E+9個克隆大小的文庫。
組合克隆MOR02628、MOR02969和MOR02977基於的文庫(″Pool″)。個別處理MOR02965文庫(″Lead″)。如所述，通過這些TOP10F′-成熟文庫用VCSM13輔助噬菌體感染生產相應的噬菌粒。
MaxisorpTM微量滴定板的抗體選擇「lead」和「pool」文庫的純化和濃縮的噬菌粒用於在嚴格條件下的成熟選擇方法(長洗滌時間、被純化的、胃腸外的Fab蛋白置換)。作為抗原，BSA-或運鐵蛋白-偶聯的ZK203468交替使用。這些抗原加入PBS中並以100-250ng/ml的低濃度加入MaxisorpTM微量滴定板F96(Nunc)中。Maxisorp平板在4℃溫育過夜(″包被″)。在Maxisorp平板用含有5％奶粉的PBS封閉後，將大約2E+13個HuCAL GOLD噬菌體加入到抗原荷載的、封閉的孔中並且在室溫溫育過夜或2小時。為提高嚴格性，在溫育過程中加入額外的100nm或500nm的、胃腸外克隆的純化Fab片段。幾次充分(ausgedehnten)洗滌步驟之後，結合的噬菌體用20mmol的DTT洗脫。總之，進行兩個連續的選擇循環，其中在選擇循環之間進行噬菌體擴增，如上述。
在Neutavidin Strip上的抗體選擇「lead」和「pool」文庫的純化的和濃縮的噬菌粒另外用於嚴格條件下的第二種成熟選擇方法(長洗滌時間，被純化的、胃腸外的Fab蛋白或游離染料置換)。作為抗原，使用生物素綴合的ZK203468(或者具有烷基或醚接頭)。這些抗原加入PBS中並以60或12ng/ml的低濃度和大約2E+11個噬菌體混合。抗原-噬菌體溶液在室溫溫育過夜或2小時。為提高嚴格性，在溫育過程中加入額外的0.5μg/ml胃腸外克隆的純化Fab片段或40nm/ml的ZK203468。然後將含有抗原-結合噬菌體的溶液加入封閉的neutravidin strip上並溫育30分鐘以使得通過抗原的生物素基結合可能固相。幾次洗滌步驟後，結合的噬菌體用20mmol的DTT洗脫。總之，進行兩個連續的選擇循環，其中在選擇循環之間進行噬菌體擴增，如上述。
亞克隆選擇的Fab片段用於表達選擇(「成熟」)之後，分離的HuCAL克隆的Fab-編碼插入物亞克隆進表達載體pMORPHX9_MS以促進隨後的表達。最後，選擇的HuCAL Fab克隆的純化治療-DNA用限制性酶XbaI和EcoRI消化。純化Fab-編碼插入物並連接入被相應消化的載體pMORPHX9_MS中。這個克隆步驟產生了Fab-表達載體pMORPHX9_Fab_MS。這個載體表達的Fab片段攜帶2個C-末端標記(Myc標記和Strep標記II)用於純化和檢測。
鑑定最佳化的抗體片段為鑑定對染料Fuji 6-4具有改良的親和力的抗體，從選擇中分離克隆並在384-孔板中通過ELISA篩選。最後，將ZK203468-BSA加入ELISA-微量滴定板中。要被檢測的Fab片段作為未純化的細菌裂解物加入。為研究除了與抗原綴合物的結合之外的與游離染料的結合，將具有細菌裂解物和額外的游離染料的相同的篩選平板以兩種不同濃度進行混合。由於未綴合的染料導致的Fab結合固相的抑制表明抗體不特異性檢測染料綴合物，而是游離染料。在此，在溶液抑制測試和ELISA形式以及Luminex裝置中精確定性了分離的克隆，而且測定了其對Fuji 6-4的親和力。
如下克隆相比於胃腸外抗體示出了改良的親和力
總之，胃腸外MOR02977的親和力相比於MOR03267可能提高了140倍。所有其它鑑定的克隆相比於分別的胃腸外Fab示出了提高2-70倍。
實施例3光物理學定性染料-抗體複合物和測定光譜移動/螢光量子產額檢測了基於與靛三羰菁染料三鈉-3，3-二甲基-2-{4-甲基-7-[3，3-二甲基-5-磺醯基-1-(2-磺醯乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]七-2，4，6-三烯-1-基亞基}-1-(2-磺醯乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸鹽，內鹽結合的抗體的染料-抗體複合物(見實施例1和2)。製備於PBS中濃度為1μmol/l的上述染料和2.4μmol/l的各自抗體的溶液並在室溫溫育2小時。用分光測光儀(Perkin-Elmer，Lambda2)測定吸收最大值。用SPEX fluorolog(通過燈和探測器對依賴波長的靈敏性進行校準，wellenlngenabhngigeEmpfindlichkeit von Lampe und Detektor kalibriert)測定相對於靛青綠(DMSO中Q＝0.13，J Chem Eng Data 1977，22，379，Bioconjugate Chem2001，12，44)的螢光最大值和螢光量子產額。根據吸收和螢光最大值，計算在沒有於PBS中的抗體(1μmol/l)時相對於上述染料溶液的光譜移動(吸收最大值754nm，螢光最大值783nm，螢光量子產額10％)。
結果總結在下表中
實施例4構建用於表達HuCAL免疫球蛋白的表達載體克隆重鏈去除載體pCDNA3.1+(Invitrogen)的″多克隆位點″(NheI/ApaI)，並且與HuCAL設計的限制性切割位點相容的platzhalter用於連接前導序列(NheI/EcoRI)、Fab片段的VH結構域(MunI/)和免疫球蛋白恆定區(BlpI/ApaI)。前導序列(EMBL 83133)具有一個Kozak序列(Kozak，1987)。人IgG(PIR J00228)、IgG4(EMBL K01316)和血清-IgA1(EMBL J00220)的恆定區被分為具有長度為例如70個鹼基的重疊寡核苷酸。將″沉默突變″導入以去除與HuCAL設計不相容的限制性切割位點。寡核苷酸通過″重疊延伸-PCR″連接。
在亞克隆Fab片段到IgG分子的過程中，Fab片段的重鏈通過MfeI/BlpI切割並連接到用EcoRI/BlpI開口的載體中。EcoRI(g/aattc)和MfeI(c/aattg)具有兩個相容的粘性末端(aatt)，而且Fab片段中的原始MfeI切割位點的序列在連接到IgG表達載體中時從c/aattg改變為g/aattg，由此，一方面MfeI切割位點和EcoRI切割位點都被破壞，而另一方面，發生了胺基酸從Q(密碼子caa)到E(密碼子gaa)的改變。
克隆輕鏈.通過兩個不同的platzhalter取代pCDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的″多克隆位點″。k-platzhalter含有用於摻入k-前導序列(NheI/EcoRV)、HuCAL Fab Vk結構域(EcoRV/BsiWI)和k-鏈的恆定區(BsiWI/ApaI)的限制性切割位點。1-platzhalter中相應的切割位點是NheI/EcoRV(1-前導序列)、EcoRV/HpaI(V1-結構域)和HpaI/ApaI(恆定區1-鏈)。k-前導序列(EMBL Z00022)以及1-前導序列(EMBL J00241)都由Kozak序列提供。人k-(EMBL L00241)和1-鏈(EMBL M18645)的恆定區都通過″重疊延伸(overlap extension)-PCR″組裝，如上述。
產生IgG-表達CHO細胞.CHO-K1細胞用重和輕IgG鍊表達載體的等摩爾混合物共轉染。用600mg/ml的G418和300mg/ml的Zeocin(Invitrogen)選擇雙重抗性轉染子。通過「捕獲ELISA(capture-ELISA)」檢測各個克隆上清中的IgG表達。陽性克隆在具有10％″ultra-low IgG-FCS″(Life Technologies)的RPMI-1640培養基中培養。在上清的pH為8.0之後及無菌過濾之後，對溶液進行標準的A蛋白-柱層析(Standard-Protein A-Sulenchromatographie)(Poros 20A，PEBiosystems)。
序列表110舍林股份公司莫弗西斯股份公司120使發射體的光譜發射特性產生改變的發射體結合肽130
150DE 103 31 054.11512003-07-09150US 60/487,2341512003-07-1616040170PatentIn version 3.22101211252212PRT213Artificial220
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ctggtgacgg ttagctcagc gtcgaccaaa ggtccaagcg tgtttccgct ggctccgagc420agcaaaagca ccagcggcgg cacggctgcc ctgggctgcc tggttaaaga ttatttcccg480gaaccagtca ccgtgagctg gaacagcggg gcgctgacca gcggcgtgca tacctttccg540gcggtgctgc aaagcagcgg cctgtatagc ctgagcagcg ttgtgaccgt gccgagcagc600agcttaggca ctcagaccta tatttgcaac gtgaaccata aaccgagcaa caccaaagtg660gataaaaaag tggaaccgaa aagcgaattc gagcagaagc tgatctctga ggaggatctg720aacggcgcgc cgtggagcca cccgcagttt gaaaaatgat aa 7622104211654212DNA213Artificial220
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1.發射體結合肽，其特徵在於所述肽在其抗原結合口袋和發射體相互作用時改變所述發射體的光譜發射特性。
2.權利要求1的發射體結合肽，其中所述發射體包含一種染料，該染料在700至1000nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和/或螢光最大值，優選在750至900nm的光譜範圍內具有至少一個吸收最大值和/或螢光最大值。
3.權利要求1或2的發射體結合肽，其選自抗體或抗體片段，如Fab抗體、scFv片段、scTCR鏈、單鏈抗體或其混合物。
4.權利要求3的發射體結合肽，其包括一種VH/VL對，其包含在如下序列對之一之中SEQ ID No1+2、SEQ ID No5+6、SEQID No9+10、SEQ ID No13+14、SEQ ID No5+17、SEQ ID No5+19、SEQ ID No5+37、SEQ ID No9+21、SEQ ID No9+23、SEQ ID No9+25、SEQ ID No9+27、SEQ ID No9+29、SEQ IDNo9+31、SEQ ID No9+33、SEQ ID No9+39和SEQ ID No13+35。
5.權利要求1-4任一項的發射體結合肽，其對所述發射體的結合親和力小於50nm並優選小於10nm。
6.權利要求1-5任一項的發射體結合肽，其中所述發射體的發射特性的改變選自偏振面改變、螢光強度改變、磷光改變，特別是磷光強度的改變、螢光使用壽命改變和吸收最大值和/或螢光最大值的紅移。
7.權利要求1-6任一項的發射體結合肽，其中在與檢測發射體的試劑相互作用之後吸收和/或螢光最大值向較高波長移動值大於15nm，優選大於25nm，及最優選大約30nm。
8.權利要求2-7任一項的發射體結合肽，其中染料選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料。
9.權利要求2-8任一項的發射體結合肽，其中染料包括通式(I)的花青染料 其中D代表基團(II)或(III) 其中星號標明的位置是和基團B連接的位點，其表示基團(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII) 其中R1和R2，各自獨立地代表C1-C4磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0至15個氧原子和/或被0至3個羰基間隔和/或被0至5個羥基取代；R3和R4，各自獨立地代表基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2分別獨立地代表氫原子，C1-C4磺烷基鏈，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0至15個氧原子和/或被0至3個羰基間隔和/或被0至5個羥基取代，R5代表氫原子或氟、氯、溴或碘原子、Me、Et或Prop，b表示數字2或3，及X和Y獨立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及這些化合物的鹽和溶劑合物。
10.多核苷酸，特別是DNA、RNA或PNA，其包括編碼權利要求1-9任一項的發射體結合肽或其功能性變體的序列。
11.DNA-或RNA-載體分子，其含有至少一種或多種權利要求10的多核苷酸且其可以在細胞中表達。
12.含有權利要求10的多核苷酸或權利要求11的載體分子的宿主細胞。
13.包含權利要求1-9任一項的至少一種發射體結合肽的抗體，特別是多克隆或單克隆抗體、人抗體或人源化抗體、合成或重組抗體。
14.生產權利要求1-9任一項的發射體結合肽的方法，包括用一種發射體免疫適當的生物體，所述發射體包含一種染料，其選自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧雜菁染料及羅丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料。
15.生產權利要求1-9任一項的發射體結合肽的方法，包括所述肽的重組和/或合成生產。
16.權利要求1-9任一項的發射體結合肽、權利要求10或11的核酸、權利要求12的宿主細胞或權利要求13的抗體作為用於體外診斷的診斷試劑的應用。
17.用於體外診斷的診斷試劑盒，包括選自權利要求1-9任一項的發射體結合肽、權利要求10或11的核酸、權利要求12的宿主細胞或權利要求13的抗體的至少一種試劑，任選在共同的或另一個容器中還具有其它佐劑和/或指導。
18.體外定量測定在樣品中含有的一種物質的方法，包括如下步驟a)將權利要求1-9任一項的發射體結合肽與一種發射體接觸，從而所述綴合物的發射體與發射體結合肽的相互作用在發射體的光譜發射特性中產生了一個改變，及b)測量發射體的光譜發射特性的改變。
19.權利要求18的直接體外定量測定樣品中含有的物質或樣品中存在的抗原檢測試劑的方法，其還額外包括如下步驟，d)通過測量發射體的發射特性的改變定量樣品中含有的物質。
20.權利要求18或19的方法，其中發射體部分的光譜發射特性的改變選自偏振面改變、磷光改變，特別是磷光強度的改變、螢光使用壽命改變和吸收最大值和/或螢光最大值的紅移。
21.權利要求18-20任一項的方法，其中發射體結合肽、抗體片段，如Fab片段、scFv片段、scTCR鏈、單鏈抗體或其混合物與樣品接觸。
22.權利要求18-21任一項的方法，其中發射體結合肽包含權利要求1-9任一項的序列。
23.權利要求19-22任一項的方法，其中發射體結合肽對發射體具有小於50nm及優選小於10nm的結合親和力。
全文摘要
本發明涉及發射體結合肽，在其抗原結合口袋與發射體相互作用時其能夠改變發射體的光譜發射特性。本發明的發射體結合肽特別是抗體和抗體片段的組分。
文檔編號C12N15/13GK1820027SQ200480019621
公開日2006年8月16日 申請日期2004年7月9日 優先權日2003年7月9日
發明者米夏爾多·席爾納, 凱·利哈, 安德烈亞斯·門拉德, 斯特凡尼·烏爾林格, 科尼莉亞·哈內爾, 博多·布羅克斯 申請人:舍林股份公司, 莫弗西斯股份公司