包含hpv－16病毒的突變e7蛋白的非免疫抑制免疫原性組合物或疫苗組合物的製作方法

2023-08-22 22:27:31 1

專利名稱：包含hpv－16病毒的突變e7蛋白的非免疫抑制免疫原性組合物或疫苗組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及與通過HPV-16型乳頭瘤病毒感染相關的一些癌症的預防或治療的領域。
現有技術現今認為一些人乳頭瘤病毒或者HPV是癌症的致病原。具體地，16、18、31、33和51型HPV經常與肛門和生殖器癌症，包括婦女宮頸癌相關。
宮頸中50％以上的鱗狀癌與HPV-16型乳頭瘤病毒相關。
HPV E6和E7病毒癌蛋白強烈參與這些病毒導致發生此類癌症的分子機理。這兩種癌蛋白使p53蛋白和成視網膜細胞瘤蛋白形成的細胞周期調節子失活，由此導致啟動癌症的多步發展事件。
通常，惡性腫瘤存在於具有相關抗原(TAA)或特異抗原(TSA)的癌細胞和特定基質微環境，其特徵是過度血管形成，或者新血管生成，其通常與免疫細胞的麻痺，即處於免疫抑制狀態相關聯。最初，免疫抑制的存在僅限於腫瘤水平，因為個體仍然能夠保護自身抵抗其他侵入如感染。
然而，隨著轉移性擴散，免疫抑制可擴散並全身化，這可通過患有終末期癌的癌症患者易受感染來證明。這種免疫抑制包括癌性細胞或來自它們所在環境的細胞產生的麻痺因子。免疫系統細胞的局部麻痺，或者免疫抑制，因此代表使得癌性細胞逃避宿主免疫系統的一種主要武器。
在由HPV-16感染導致的癌中也觀察到這種免疫抑制狀況。這種免疫抑制是現今抗HPV-16感染導致的癌症的預防性或治療性疫苗組合物的開發中一個主要的技術障礙。實際上，當今抗HPV-16疫苗策略支持當HPV-16產生的一些抗原，尤其是E6和E7蛋白與受感染癌性細胞膜表面的主要組織相容性複合物(MHC)I類抗原結合時，誘導特異識別HPV-16產生的這些抗原的細胞毒性T細胞的增殖。
一些作者將在HPV-16導致的癌中觀察到的免疫抑制與宮頸的癌性細胞表面MHC I類分子的表達水平降低(Cruz等，1999)，或者與表現出前腫瘤發育異常的患者中T細胞受體(TCR)δ鏈的表達減少聯繫起來(Muderspach等，2000)。其他作者將免疫抑制狀況與T細胞對由腫瘤細胞產生並被傳送到免疫細胞的可能信號的應答缺乏，由此導致它們的凋亡(例如，因為Fas/Fas配體相互作用)聯繫起來(Schoell等，1999)。
其他作者觀察到與HPV感染導致的癌症相關的免疫抑制伴隨著IL-10增加(EI Sherif等，2001；Giannini等1998；Giannini等2002)和TGF-β-1增加(Giannini等1998)，以及上皮下IFN-γ的減少(EI Sherif等，2001)。
在國際申請WO 00/03732中公開的發明人的已有工作表明對於HPV導致的宮頸癌，乳頭瘤病毒E7蛋白參與腫瘤或被感染的細胞水平上的局部免疫抑制。
E7蛋白誘導的免疫抑制的特徵在於抑制PPD或破傷風類毒素刺激的T細胞增殖、抑制同種異體細胞刺激的T細胞增殖、抗原呈遞細胞(APC)的α-IFN(免疫抑制細胞因子)過量產生。為了減小或阻斷HPV的可溶E7蛋白誘導的免疫抑制，已經建議使用E7蛋白的非毒性衍生物作為抗原以誘導特異抗胞外E7蛋白的抗體。為了產生沒有天然蛋白毒性作用的E7衍生的免疫原性化合物，已經建議通過化學修飾或者遺傳修飾，包括通過產生胺基酸殘基的插入、缺失或替換以減小或抑制天然蛋白的毒性功能位點來修飾天然E7蛋白。在這種背景下，已經公開了通過戊二醛處理天然E7蛋白得到的經化學修飾E7蛋白，其缺少免疫抑制活性。
如在文獻陳述中公開的被建議降低或阻斷天然E7蛋白的免疫抑制性質的化學修飾的目標是通過用醛、氨甲醯或馬來醯亞胺官能團偶聯這種蛋白的胺基酸之一的反應性官能團將化學基團加入到天然E7蛋白的碳骨架，而不改變這種天然蛋白的胺基酸序列，即不對E7蛋白的一級結構帶來任何明顯的修飾。
實際上，如在文獻的陳述中公開的各種抗E7免疫原性組合物，為了產生抗由HPV-16感染引起的癌症的預防或治療性疫苗製劑，主要旨在通過產生針對受感染的細胞表面表達的E7蛋白的特異細胞毒性淋巴細胞(CTL)來誘導免疫應答，這些組合物含有作為抗原的完整E7蛋白，任選地為經化學修飾的(Gerard等，2001)，或含有衍生自E7蛋白的肽(Muderspach等，2000；Schoell，1999-見上面)。在所有情況下，包括當使用衍生自天然E7蛋白的肽時，在天然蛋白的胺基酸序列中沒有導入修飾，因此，對胺基酸的最初一級結構沒有修飾。這可簡單地解釋為希望保持天然E7蛋白中目標表位的完整以便有利於誘導免疫應答，尤其是產生能夠特異並有效地識別受感染細胞產生的天然E7蛋白的CTL細胞。
甚至當考慮重排E7蛋白的一級胺基酸結構，以期產生具有減小的致癌性或轉化性質的免疫原性蛋白時，所關注的是在重排的免疫原性化合物中保持E7蛋白序列的至少一份完整拷貝，以便在所述免疫原性化合物中存在所有天然E7蛋白的潛在表位。
從而，Osen等(2001)已經公開了產生編碼免疫原性化合物的DNA，該免疫原性化合物易於誘導特異識別在HPV-16感染的癌性細胞表面表達的天然E7蛋白的細胞毒性淋巴細胞(CTL)的產生，該方法使用DNA的抗HPV疫苗策略，而不是直接使用肽免疫原性化合物。為了避免可導致天然E7蛋白被過表達的重組事件，或者至少具有天然E7蛋白的致癌性質的重組蛋白，這些作者構建了編碼這樣的免疫原性蛋白的DNA，其中天然E7蛋白的所有表位都被表現，儘管分別為(i)結構域1-10，(ii)結構域11-40，(iii)結構域41-70和(iv)結構域71-98的肽結構域的每一個都已經被顛倒到最終的免疫原性肽化合物中。所述作者堅持認為需要產生保持天然E7蛋白的所有潛在CTL表位而同時喪失其細胞癌性轉化性質的免疫原性肽化合物。最後這些作者進一步建議鑑於其致癌能力，應增加重排的免疫原性肽化合物的無毒性，從而抑制天然E7蛋白與成視網膜細胞瘤pRB蛋白的結合結構域，該結構域從E7的21號胺基酸到26號胺基酸，負責天然E7蛋白的致癌活性。然而，非致癌性免疫原性肽化合物的這種實施方案還沒有被具體地實現。
發明描述令人驚奇地，現在根據本發明表明可通過對編碼天然E7蛋白的DNA的定向誘變得到具有誘導對天然E7蛋白的特異免疫應答的相同能力，甚至更高的能力的突變蛋白，並且其中天然E7蛋白的免疫抑制性質已經被阻斷。
從而第一次根據本發明表明，令人驚奇地，位於HPV-16乳頭瘤病毒的天然E7蛋白的胺基酸位置20(Thr或T)至胺基酸位置29(Asn或N)的區域中的肽片段負責所述蛋白的免疫抑制活性。
為了本發明公開的目的，當胺基酸中一個或幾個胺基酸的不同之處位於序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白的相應20-29肽區域中時，與具有SEQID No.3的HPV-16天然E7蛋白相比至少一個胺基酸不同的蛋白被稱為根據本發明的「突變的」E7蛋白。
具體地，根據本發明已經表明與天然E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比含有至少一個胺基酸，優選至少2個胺基酸替代的突變E7蛋白已經喪失了誘導以前關於天然E7蛋白所報導的免疫抑制的性質。從而已經表明與天然的E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比24位半胱氨酸殘基被甘氨酸殘基替代(CYS24GLY)和26位穀氨酸殘基被穀氨醯胺殘基替代(GLU26GLN)的突變E7蛋白已經喪失了天然E7蛋白的免疫抑制性質。同樣，已經表明與天然的E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比24位半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代(CYS24SER)和26位穀氨酸殘基被穀氨醯胺殘基替代(GLU26GLN)的突變E7蛋白已經喪失了天然E7蛋白免疫抑制性質。
根據本發明已經表明含有與天然E7蛋白的SEQ ID No.3胺基酸序列相比，根據序列SEQ ID No.3的編號，在序列SEQ ID No.3胺基酸位置20到胺基酸位置29的相應多肽區域中至少4個，優選4、5、6、7、8、9或10個連續胺基酸缺失的突變E7蛋白已經喪失了對天然E7蛋白所觀察到的免疫抑制性質。
具體地，已經表明含有根據序列SEQ ID No.3的編號，肽片段21(Asp或D)到26(Glu或E)缺失的突變E7蛋白已經喪失了為天然E7蛋白觀察到的免疫抑制性質。其相應於天然E7蛋白的21號胺基酸到26號胺基酸缺失的突變E7蛋白為了本說明書的目的被稱為E7Δ21-26。
同樣，D』Anna等(2001，J.Natl.Cancer Inst.卷93(24)1843-1851)公開了通過遺傳重組產生的E7Δ21-26蛋白。
類似地，已表明根據序列SEQ ID No.3的編號，含有肽片段21(Asp或D)到25(Tyr或Y)缺失的突變E7蛋白已經喪失了為天然E7蛋白觀察到的免疫抑制性質。其相應於天然E7蛋白的21到25號胺基酸區域缺失的突變E7蛋白為了本說明書的目的被稱為E7Δ21-25。
從而根據本發明表明天然E7蛋白的20-29肽區域中胺基酸的簡單替代使得可能阻斷為該天然蛋白觀察到的免疫抑制活性。從而，天然E7蛋白一級結構的小改變(20-29號肽區域)破壞了天然E7蛋白的典型的免疫抑制性質。
根據本發明，當蛋白對來自接種了抗破傷風(破傷風類毒素抗原)和/或白喉(「結核菌素純化的蛋白衍生物」或「PPD」型)疫苗的個體的人外周血單核細胞體外增殖抑制至少60％，優選至少70％時，該蛋白是「免疫抑制的」，所述單核細胞增殖通過將所述細胞與(I)PPD抗原，(ii)類毒素破傷風抗原，(iii)PPD抗原和類毒素破傷風抗原的結合或者以及(iv)與相對於所述單核細胞為同種異體的細胞孵育進行誘導。在這種試驗中，潛在免疫抑制蛋白使用的濃度為根據效果-劑量曲線誘導最大增殖抑制值的濃度。實施例6給出了這種試驗的闡述。
而且，當這種蛋白誘導免疫抑制細胞因子的異常體外產生水平時是「免疫抑制的」，這些免疫抑制細胞因子分別是外周血單核細胞產生的IL-10和具有抗原的細胞(APC)產生的α-IFN或IL-10。
此外，如將在該公開的下文中進一步詳述的和如在實施例中闡明的，上面的突變E7蛋白除了它們的非抑制性質之外還共有刺激產生針對天然E7蛋白的「中和」抗體，即產生識別天然E7蛋白並阻斷對免疫系統的細胞有害的天然E7蛋白的免疫抑制活性的能力。根據本發明，包括根據實施例1中進一步描述的試驗，當抗-E7抗體阻斷天然E7蛋白刺激通過γ-IFN預處理的人巨噬細胞產生α-TNF時，該抗-E7抗體稱為「中和的」抗體。
這些結果使得可定義突變E7蛋白家族，這些蛋白與天然E7蛋白的胺基酸序列相比都具有胺基酸突變、替代或缺失。
一般來說，根據本發明的非免疫抑制的「突變E7」蛋白含有以下胺基酸序列(從N末端到C末端)i.序列SEQ ID No.3的1-19位胺基酸序列；ii.具有(a)與SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比至少一個，優選至少2個胺基酸替代的胺基酸序列或者(b)與SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比至少4個連續胺基酸缺失的胺基酸序列；和iii.SEQ ID No.3的30-98位胺基酸序列。
根據本發明，「含有」如上定義的胺基酸序列的突變E7蛋白為這樣的蛋白，其胺基酸序列「基本在於」上面提到的胺基酸序列。換句話說，根據本發明的突變E7蛋白可除了上面提到的胺基酸序列，還含有至多20個，優選至多15個，優選至多10個，最優選至多6個胺基酸的一段或兩段額外的胺基酸序列，該額外的胺基酸序列分別位於區域(i)的N-末端或區域(ii)的C末端，並且在一些情況下位於區域(i)的N-末端和區域(ii)的C-末端。對於後一情況，位於區域(i)N末端的額外序列可以與位於C末端的額外序列不同，或者為相反情況，即兩個額外的序列可以是相同的。通常，根據本發明的突變E7蛋白含有與對其定義的上面的胺基酸序列相比，單個額外的胺基酸序列，如多(組氨酸)胺基酸序列，例如含有6個組氨酸殘基聚合物的序列。
從上面提到的定義得到根據本發明的突變E7蛋白具有與序列SEQ IDNo.3的相應肽區域相同的2個胺基酸區域，它們分別是與序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白中1到19號肽區域相同的胺基酸區域(i)和與序列SEQ IDNo.3的天然E7蛋白中30到98號肽區域相同的胺基酸區域(iii)。突變E7蛋白的中心胺基酸區(ii)與序列SEQ ID No.3的相應20-29號肽區域相比，含有胺基酸的一處或多處替代，或另外地含有一個至少4個胺基酸的缺失。
根據第一個可變方案，突變E7蛋白的胺基酸區域(ii)與天然蛋白序列SEQ ID No.3的相應20-29號肽區域相比，優選含有至少2個胺基酸替代，並且可含有3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸替代。在其中突變E7蛋白的胺基酸區域(ii)含有10個胺基酸替代的實施方案中，突變E7蛋白的胺基酸區域(ii)與序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白中20到29號肽區域完全不同。
為了得到根據本發明的突變E7蛋白，優選進行天然E7蛋白中20到29號肽區域中胺基酸的每個替代，從而突變E7蛋白中被替代的胺基酸屬於與相應於天然E7蛋白的胺基酸不同的「類別」，其中分別為芳香族、疏水的、極性的、鹼性的、酸性胺基酸類別或者小胺基酸，優選如下-20位的Thr殘基被非Ala、Ser、Met和Gly的殘基替代；-21位的Asp殘基被非Glu的殘基替代；-22位的Leu殘基被非Ile和Val殘基替代；-23位的Tyr殘基被非Phe和Trp殘基替代；-24位的Cys殘基被任何不同的胺基酸殘基替代；-25位的Tyr殘基被非Phe和Trp的殘基替代；-26位的Glu殘基被非Asp的殘基替代；-27位的Gln殘基被非Asn殘基替代；-28位的Leu殘基被非Ile和Val的殘基替代；和-29位的Asn殘基被非Gln的殘基替代。
該胺基酸組由下面的胺基酸形成Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val，以及對它們一個或多個如下化學基團進行化學修飾的衍生物，所述化學基團不參與結合本發明的突變E7蛋白序列中的另一個胺基酸。
優選的突變E7蛋白質家族包括在它們的24位Cys殘基和26位Glu被取代的蛋白質家族。
第一個尤其優選的含有兩個單核苷酸替代的突變E7蛋白是這樣的E7蛋白(CYS24GLY，GLU26GLN)。
第二個尤其優選的含有兩個單核苷酸替代的突變E7蛋白是這樣的E7蛋白(CYS24SER，GLU26GLN)。
根據第二個可變方案，胺基酸區(ii)與序列SEQ ID No.3的相應20-29號胺基酸序列相比含有5、6、7、8、9或10個連續胺基酸缺失。當胺基酸區(ii)含有10個胺基酸缺失時，所述區域(ii)不含有任何胺基酸並且所得突變E7蛋白從N末端到C末端含有序列SEQ ID No.3的1-19區(i)，其通過肽結合直接與序列SEQ ID No.3的30-98區(iii)相連。
根據上面提到的第二個可變方案第一優選的突變E7蛋白質家族為與序列SEQ ID No.3的20-29號胺基酸相應的序列相比含有區域(ii)中6個連續胺基酸缺失的蛋白質家族。
根據本發明第三個優選的突變E7蛋白在於在蛋白中其胺基酸序列含有天然E7蛋白中序列SEQ ID No.3的21到26號胺基酸缺失。這種突變E7蛋白，也稱作E7Δ21-26，具有胺基酸序列SEQ ID No.1並被序列SEQID No.2的核酸所編碼。E7Δ21-26蛋白的區域(ii)與序列SEQ ID No.3的20-29號胺基酸相應的序列相比含有區域(ii)中6個連續胺基酸缺失。
根據上面提到的第二個可變方案第二優選的突變E7蛋白質家族為與序列SEQ ID No.3的20-29號胺基酸相應的序列相比含有區域(ii)中5個連續胺基酸缺失的蛋白質家族。
根據本發明第四個優選的突變E7蛋白在於該蛋白具有其中胺基酸序列含有天然E7蛋白中序列SEQ ID No.3的相應21-25號胺基酸缺失。這種突變的E7蛋白在本公開中也被稱作E7Δ21-25。E7Δ21-25蛋白的區域(ii)與序列SEQ ID No.3的20-29號胺基酸相應的序列相比具有5個連續胺基酸缺失。
根據本發明已經表明編碼HPV-16突變E7蛋白(如上面定義的)的DNA的表達產物，當與合適的免疫佐劑組合時，能夠在小鼠中產生特異體液和細胞應答，由此允許誘導可與通過天然E7蛋白誘導的相當的(如果不是更高的話)保護性抗腫瘤免疫。
如此處所用的，編碼突變E7蛋白的DNA的「表達產物」指宿主細胞中從編碼如此處上面定義的突變E7蛋白的DNA翻譯(或者相應的RNA信使的翻譯)導致的蛋白。
此外，還表明編碼本發明HPV-16的突變E7蛋白的表達產物具有等於或高於天然E7蛋白的抗腫瘤治療活性。
而且，編碼本發明突變E7蛋白的DNA的表達產物一方面在於缺乏其直接的免疫抑制活性，另一方面在於誘導對癌性細胞分泌的天然E7蛋白所誘導的免疫抑制阻斷。
本發明的一個目的是提供誘導抗HPV-16乳頭瘤病毒的天然E7蛋白的免疫應答而同時不誘導免疫抑制的免疫原性組合物，該組合物含有作為活性成分的如在本公開的上文中定義的非免疫抑制性突變E7蛋白，如果需要，與一種或多種賦形劑或佐劑組合在一起以得到生理可相容的免疫。
本發明還涉及對乳頭瘤病毒感染導致的癌症沒有任何預防性或治療性免疫抑制性質的疫苗組合物，其特徵是該組合物含有與一種或多種生理可相容的免疫佐劑結合的如在本公開的上文中定義的作為活性成分的非免疫抑制性突變E7蛋白。
本發明還涉及如上文定義的非免疫抑制性突變E7蛋白的用途，用於製備免疫原性組合物或非免疫抑制的疫苗組合物和誘導產生中和天然E7蛋白的免疫抑制活性的抗體。
如在實施例中所闡明的，根據本發明的免疫原性組合物或疫苗組合物誘導針對表達天然E7蛋白的細胞，或者表達衍生自天然E7蛋白的肽的細胞產生細胞毒性細胞免疫應答。具體地，在實施例中表明根據本發明的免疫原性組合物或疫苗組合物誘導針對表達天然E7蛋白或者衍生自天然E7蛋白的肽的腫瘤細胞產生細胞毒性細胞免疫應答。
HPV-16天然E7蛋白的參考胺基酸序列為例如，Seedorf等(1985)公開的序列，其在Swissprot資料庫中的登錄號為P03129，並且其在本公開中被複製為序列SEQ ID No.3。編碼HPV-16天然E7蛋白的核酸含有核苷酸序列SEQ ID No.4。
突變E7蛋白(如在本公開中定義的)可通過本領域技術人員熟知的蛋白質合成常規技術製備。
例如，可通過重組DNA技術，例如，通過在重組細菌細胞系統，如重組大腸桿菌(E.coli)細胞中過表達編碼突變E7蛋白的核酸來製備該突變E7蛋白，如Kieder等(1996)和Tucker等(1996)所述。
也可通過化學合成，在均勻溶液中或者在固相中製備突變的E7蛋白。合適的化學合成技術的第一個例證是例如Houben Weyl所公開的(1974)。
而且，可通過化學合成技術在溶液或固相中通過連續偶聯將要被摻入的不同胺基酸殘基(在液相中從N末端到C末端，或者在固相中從C末端到N末端)來製備突變的E7蛋白，一種合成技術在於其中胺基酸殘基N末端和側鏈被事先通過合適的保護性化學基團封閉。可用於合成突變E7蛋白的這種技術的一個例證是如Merrifield(1965a；1965b)所公開的。
本發明所使用的核酸根據本發明，可通過翻譯編碼所述突變E7蛋白的核酸，例如，編碼SEQ ID No.1的突變E7蛋白的核酸來產生突變E7蛋白。
優選地，根據本發明的任何核酸和任何多肽都是分離的或純化的形式。
術語「純化的」不需要物質以絕對純的形式，排除任何其他化合物的存在而存在。其是相對定義。當起始材料或者天然材料被純化至少1個數量級，優選2或3個，優選4或5個數量級時，那麼多核苷酸或多肽處於純化的狀態。
表述「核酸」、「多核苷酸」、「寡核苷酸」以及「核苷酸序列」包括處於單鏈形式或雙鏈體形式的RNA、DNA、cDNA序列以及至少兩種核苷酸的RNA/DNA雜交序列。
術語「核苷酸」指天然核苷酸(A、T、G、C)以及含有至少一種修飾，如(i)嘌呤類似物，(ii)嘧啶類似物或(iii)糖類似物的經修飾核苷酸，這種經修飾核苷酸在例如PCT申請WO 95/04064中公開。
為了本發明的目的，當第一核苷酸的每一鹼基與方向相反的第二多核苷酸的互補鹼基偶聯時，認為第一核苷酸與第二多核苷酸是「互補的」。互補鹼基為A和T(或A和U)，C和G。
根據一個優選的實施方案，編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的核酸含有核苷酸序列SEQ ID No.2。
如上定義的核酸主要用於實現產生相應的表達產物。
因此，編碼突變E7蛋白的核酸優選地含有控制原核或真核宿主細胞中突變E7蛋白表達的調節性多核苷酸。
該調節性多核苷酸含有至少一個能夠啟動編碼突變E7蛋白的DNA在所選擇的宿主細胞中轉錄的啟動子序列。這種調節性多核苷酸也可以含有支持編碼突變E7蛋白的DNA表達的其他核苷酸序列，例如，本領域技術人員熟知的轉錄活化序列。
優選地，選擇所謂的「可誘導的」啟動子，即對誘導劑存在應答的啟動子，僅在存在誘導化合物時所述啟動子管理處於其控制下的DNA的轉錄。
LacZ啟動子是這種可誘導的啟動子的一個例證性實例。
根據本發明，可使用本領域技術人員熟知的任何分子生物學、微生物學和重組DNA常規技術以製備如下文定義的核酸。這種技術由例如Sambrook等(1989)，Glover(1985)、Gait(1984)和Ausubel等(1989)公開。
置於如上定義的調節性多核苷酸控制下的含有編碼本發明突變E7蛋白的DNA的核酸包括在表達盒中。
表達盒這種表達盒除了含有調節編碼突變E7蛋白的DNA的多核苷酸外，還可含有能夠增加表達產物翻譯的位於可讀框5』側的非翻譯序列，即所謂的「前導」序列，或者本領域技術人員熟知的所謂「終止子」序列。
最優選地，如上文定義的表達盒還含有編碼信號肽的序列，為了產生包含所述信號肽和突變E7蛋白的融合蛋白，例如，為了所述信號肽和E7Δ21-26蛋白的融合蛋白的產生，以便有利於編碼突變E7蛋白的DNA表達產物的分泌和發現突變E7蛋白主要在細胞外，例如在細胞培養上清液中。優選地，編碼信號肽的核苷酸序列位於緊挨編碼突變E7蛋白的核苷酸序列的5』側。
通常，如下文定義的表達盒還含有選擇性標記多核苷酸，例如，his基因，以便確實地選擇被該多核苷酸轉化的宿主細胞。
重組載體編碼突變E7蛋白的核酸(如在本公開中所定義的)如果需要，在被插入表達盒後，優選被導入克隆和/或表達重組載體，該載體含有所述核酸或所述表達盒，如上面定義的表達盒。
如此處所用的，術語「載體」指處於單鏈形式或雙鏈形式的環狀或線性DNA或RNA分子。
重組載體可以為克隆載體或表達載體。
其可以是來自細菌或病毒的載體。
本發明優選的細菌載體為例如pBR322載體(ATCC37017)或者如PAA233-3(Pharmacia，Uppsala，瑞典)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)的載體。
已上市的載體的其他實例包括pQE70、pQE60、pWE9(Qiagen)、psiX174、pBluescript SA、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI、pSG(Stratagene)載體。
根據第一個實施方案，使用如上文定義的重組載體在轉化或者轉染目的細胞宿主後用於擴增被插入其中的核酸或表達盒。
根據第二個實施方案，其可以是含有如上面定義的核酸或表達盒的表達載體，目的是轉化所選擇的宿主細胞以產生編碼本發明突變E7蛋白的DNA的表達產物。
如上面定義的重組載體還有利地含有具有適宜轉錄的啟動和中止序列。
如上面定義的表達盒是本發明重組載體的一個特定實施方案。
為了允許編碼本發明突變E7蛋白的核酸表達，如上面定義的核酸、表達盒或重組載體應該被導入宿主細胞。
重組宿主細胞為了實現如在本公開中定義的突變E7蛋白的一些產生模式，優選使用被如上面定義的核酸、表達盒或重組載體轉化的宿主細胞。
被轉化的宿主細胞有利地為細菌細胞，如大腸桿菌細胞，或者酵母細胞，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞。
被轉化的宿主細胞有利地為真核細胞。
一類優選的重組宿主細胞為被根據本發明的核酸、表達盒以及重組載體轉化的哺乳動物細胞如小鼠細胞。
得到編碼E7Δ21-26蛋白的核酸的方法本發明公開了產生如在本公開中定義的編碼突變E7蛋白的核酸的方法，所示方法包括下面的步驟(a)對編碼天然E7蛋白的核酸進行定向誘變，這通過分別將第一核苷酸引物和第二核苷酸引物與編碼天然E7蛋白的DNA的3』末端雜交而擴增所述核酸實現；和(b)回收所擴增的DNA。
第一核苷酸引物在其序列中含有編碼將要被插入起始天然E7蛋白胺基酸序列中的突變的密碼子序列。
從而，如果考慮製備其區域(ii)含有一個或多個單胺基酸替代的突變E7蛋白，那麼第一引物的序列含有編碼將要被替代的一個或多個胺基酸的適宜密碼子。
根據另一個備選方案，如果考慮製備與序列SEQ ID No.3的20-29號胺基酸相應序列相比，其區域(ii)含有4、5、6、8、9或10個連續胺基酸缺失的突變E7蛋白，那麼第一引物在其序列中含有編碼緊挨將要被缺失的肽片段的N-末端胺基酸的第一個密碼子，所述第一個密碼子緊靠第二個密碼子前，所述第二個密碼子編碼緊挨將要被缺失的肽片段N末端胺基酸。
第一引物的使用使得可以擴增將要被產生的最終產物，其中期望的密碼子已經被修飾，所述擴增終產物編碼目的突變E7蛋白。
擴增步驟(a)中使用的第二核苷酸引物除了含有與編碼天然E7蛋白的DNA的3』端雜交的序列外，還含有一個或多個內切酶識別位點。
在例如通過限制性內切酶，優選在多克隆位點處進行核苷酸切割事先打開宿主載體後，將編碼突變E7蛋白的核酸在預定的插入位點插入到克隆載體或者表達載體，例如通過將所述核酸與載體的核酸連接。
本發明的一個目標是提供含有突變E7蛋白(如在本公開中所定義的)的組合物，優選含有所述突變E7蛋白的免疫原性組合物或者疫苗組合物。
含有本發明非免疫抑制性突變E7蛋白的組合物本發明的一個目的是提供含有本發明非免疫抑制性突變E7蛋白的組合物，如含有序列SEQ ID No.1的胺基酸序列的突變E7蛋白的組合物。
本發明的另一個目的是含有編碼本發明突變E7蛋白的DNA的表達產物，如SEQ ID No.2的E7Δ21-26蛋白的組合物。
根據本發明已經表明如在本公開中定義的突變E7蛋白缺乏免疫抑制性質，如在實施例中所闡明的。
具體地，已經表明E7Δ21-26蛋白當與適宜的免疫佐劑結合被施用於哺乳動物時不誘導任何免疫抑制。
已經表明突變的E7蛋白—分別為E7蛋白(CYS24GLY，GLU26GLN)和E7蛋白(CYS24SER，GLU26GLN)當與適宜的免疫佐劑結合被施用於哺乳動物時不誘導免疫抑制。
如前面已經簡略解釋的，編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的DNA的表達產物誘導與天然E7蛋白自身誘導的免疫應答至少相同數量級的針對天然E7蛋白的免疫應答，並且本發明的突變E7蛋白對人免疫細胞缺乏天然E7蛋白的免疫抑制性質。
因此本發明的另一個目的是提供HPV-16感染更特別是提供HPV-16誘導的癌症的預防性或治療性藥物組合物，其特徵在於其包含作為主要活性成分的編碼如上面定義的突變E7蛋白的DNA的表達產物，如果需要，其與一種或多種生理可相容的賦形劑結合。
優選地，所述藥物組合物以適於每周施用用量為10到1000μg突變E7蛋白，或者編碼該突變E7蛋白的DNA的表達產物的形式存在。
根據本發明表明編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的表達產物當與適宜的免疫佐劑組合施用時，能夠產生針對天然E7蛋白的體液和細胞免疫應答，從而允許誘導針對腫瘤的預防性免疫性。此外，通過施用編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物而導致的誘導抗腫瘤抗性狀況的保護性免疫等於或高於以前施用天然E7蛋白後得到的保護性免疫。
還表明編碼序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白的DNA的表達產物在這種蛋白與適宜的免疫佐劑結合施用於已經患有腫瘤的個體時能夠誘導治療性抗腫瘤免疫。由編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物誘導的治療性抗腫瘤免疫應答明顯高於施用天然E7蛋白後可以得到的治療性抗腫瘤免疫應答。
這些結果在實施例3中闡明，其中在鼠模型中表明，與施用天然E7蛋白動物的平均壽命相比較，通過編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物誘導的抗腫瘤治療性免疫使得可以延長動物的平均壽命1.5倍。
還表明通過編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物誘導的治療性抗腫瘤免疫是由於對特異體液和細胞免疫應答的同時誘導。
從而，實施例的結果表明如在本公開中定義的突變E7蛋白能夠誘導針對天然E7蛋白的全身性體液應答。更具體地還表明產生了高水平的IgG同種型抗E7抗體，主要是IgG2b和IgG1同種型抗體。
此外，在適宜的條件下，將本發明的突變E7蛋白施用於個體也使得可能誘導黏膜免疫性，如通過在實施例3中給出的IgA同種型抗體應答的高水平所證明的。
此外，根據突變E7蛋白的基本特徵，這種本身缺乏天然E7蛋白的任何直接免疫抑制活性的蛋白也允許通過用所述突變E7蛋白免疫後所產生抗體的中和特性阻斷癌細胞分泌的可溶E7蛋白的免疫抑制活性，如通過實施例2中的結果所證明的。
實施例的結果還表明本發明的突變E7蛋白允許特異識別天然E7蛋白的CD4+和CD8+T細胞的增殖，這種細胞增殖伴隨著γ-IFN細胞因子的過量產生。
本發明還涉及誘導針對HPV-16乳頭瘤病毒天然E7蛋白的免疫應答，而不同時誘導免疫抑制的免疫原性組合物，所述組合物含有與一種或多種生理可相容的免疫賦形劑或佐劑結合的作為活性成分的非免疫抑制的突變E7蛋白，其胺基酸序列從N末端到C末端含有i.序列SEQ ID No.3的1-19號胺基酸序列；ii.(a)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應胺基酸相比具有至少一個胺基酸替代或者(b)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應胺基酸相比具有至少4個連續胺基酸缺失的胺基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30-98號胺基酸序列。
這種免疫原性組合物可以預防性使用，其目的是誘導針對HPV-16感染的保護性抗腫瘤免疫。
這種免疫原性組合物也可以用於治療或者治癒HPV-16感染，尤其是HPV-16感染導致的癌症。
本發明還涉及如在本公開中定義的突變E7蛋白的用途，用於製備藥物組合物，或者用於製備如上文描述的免疫原性組合物。
本發明的另一個目的是旨在誘導抗HPV-16感染導致的癌症的預防性保護性免疫或者治療性免疫，而阻斷天然E7蛋白誘導的免疫抑制狀況的藥物組合物或者免疫原性組合物的製備方法，其特徵是其包括其中如上文定義的突變E7蛋白與一種或多種生理可相容的免疫佐劑組合的步驟。
本發明還涉及乳頭瘤病毒感染導致的癌症的預防性或治療性疫苗組合物，其特徵在於其包含與一種或多種生理可相容的免疫佐劑結合的作為活性成分的非免疫抑制性突變E7蛋白，其胺基酸序列從N末端到C末端含有i.序列SEQ ID No.3的1-19號胺基酸序列；ii.(a)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應胺基酸相比具有至少一個胺基酸替代或者(b)與序列SEQ ID No.3的20-29號相應胺基酸相比具有至少4個連續胺基酸缺失的胺基酸序列；和
iii.序列SEQ ID No.3的30-98號胺基酸序列。
為了抵抗胞外E7蛋白誘導的對HPV-16感染的癌性細胞水平上局部免疫抑制，然後刺激針對這些癌性細胞的有效免疫應答(這些癌性細胞的膜表面具有與MHC I類抗原結合的天然E7蛋白，或者胞內成熟後衍生自天然E7蛋白的肽)，重要的是誘導能夠中和HPV-16病毒感染的癌性細胞所分泌的可溶E7蛋白產生的免疫抑制作用的抗體，特別是IgG同種型抗體的產生。此外，必須同時誘導能夠特異識別暴露於癌性細胞膜表面的天然E7蛋白或者由其衍生的的肽的細胞毒性淋巴細胞(CTL)保護，以便破壞這些細胞。為了實現這些目的，需要誘導全身性免疫應答。
此外，由於人乳頭瘤病毒主要在黏膜癌，尤其是在肛門與生殖器癌，包括婦女的宮頸癌中被檢測到，因此重要的是通過在黏膜上誘導黏膜型免疫應答，更特別地在局部水平刺激IgA同種型抗體的產生以實現全身性免疫應答誘導的預防性或治療性效果。
根據所要達到的目的，使用能夠使應答指向全身免疫或黏膜免疫的免疫佐劑。
在全身免疫性佐劑中，優選使用IFA型佐劑(不完全弗氏佐劑)、磷酸鈣或氫氧化鋁。也可使用丹麥Brenntay Biosector上市的QuilA佐劑。在黏膜免疫佐劑中，優選使用本領域技術人員熟知的如霍亂毒素B(CTB)以及LT毒素突變體(LTμ)佐劑。
誘導全身型和/或黏膜型免疫應答也受到本發明疫苗組合物的施用途徑影響。
從而，通過腸胃外、皮下或皮內施用疫苗組合物將有助於誘導全身性免疫途徑，如果需要也伴隨著黏膜免疫反應。
從而，局部水平上的本發明疫苗組合物的施用(例如通過鼻灌注，以及通過在黏膜表面的局部應用)將有助於黏膜型免疫應答的誘導。
本發明的另一個目的是HPV-16感染導致的癌症的預防性或治療性治療的方法，其特徵在於包括其中患者被施用免疫有效量的如在本說明書中定義的疫苗組合物的步驟。
優選地，患者被施用適於全身性和/或黏膜施用形式的針對需要該治療的受試者的預防或治療有效量的本發明疫苗組合物。突變E7蛋白或編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物的施用劑量可以是10到1000μg，通過腸胃外途徑，每周一次，持續2個月，然後根據誘導的細胞或體液應答的水平周期性地施用，例如每2到6個月施用。
根據第一個方面，本發明的疫苗組合物的特徵在於其包含至少一種能夠優選將免疫應答導向產生中和野生型E7蛋白的免疫抑制活性的抗體的佐劑。
根據第一個特定實施方案，所述疫苗組合物的特徵在於其包含至少一種能夠優選將免疫應答導向產生IgA同種型抗體的佐劑。
根據第二個優選的實施方案，所述疫苗組合物的特徵在於其包含至少一種能夠優選將免疫應答導向產生IgG同種型抗體的佐劑。
根據另一個優選的實施方案，所述疫苗組合物的特徵在於其包含(i)能夠優選將免疫應答導向產生IgA同種型抗體的佐劑和(ii)能夠優選將免疫應答導向產生IgG同種型抗體的佐劑的組合。
優選地，根據本發明的疫苗組合物的特徵在於其包含至少一種能夠誘導體液和細胞免疫應答這兩者的免疫佐劑。
優選地，將尋找細胞應答的誘導，其特徵尤其在於表達CD8抗原並特異識別野生E7蛋白，如在癌性細胞表明與MHC I類抗原結合的野生E7蛋白的T淋巴細胞的增殖。
根據本發明疫苗組合物的另一個特定實施方案，這種疫苗組合物可含有一種或多種其他HPV抗原性或免疫原性化合物。例如，在本發明的疫苗組合物中，編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物可以與一種或多種HPV-16衣殼蛋白或者從此類衣殼蛋白得到的肽，尤其是本領域技術人員熟知的HPV-16的L1和L2蛋白結合。
根據另一個特定實施方案，本發明的疫苗組合物可以含有能夠誘導針對與HPV-16不同的HPV型，優選針對導致癌症的HPV型，如HPV-18、31、33和51的細胞免疫應答或體液免疫應答的一種或多種抗原性或免疫原性化合物。
在本發明疫苗製劑的另一個特定實施方案中，編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物可以與能夠誘導針對具有免疫抑制或血管生成性質的可溶因子，如αIFN、βTGF、αTNF或甚至VEGF產生抗體的一種或多種抗原性或免疫原性化合物組合。優選地，此類抗原性或免疫原性化合物分別為經化學修飾的αIFN、βTGF、αTNF或VEGF以便誘導它們的免疫抑制性質和/或穩定它們。這種化學修飾(例如通過羧甲基化)是本領域技術人員熟知的。這些化學修飾由Frankel等(1988)更具體地描述。
根據本發明疫苗組合物的這種特定實施方案的一個優選方面，編碼突變E7蛋白的DNA的表達產物和至少一種抗原性或免疫原性化合物被化學相連以形成超級免疫原性化合物，如在以NEOVACS公司的名義在2001年8月10日提交的法國專利申請No.01/10751中所公開的。
複合超免疫原這種複合超免疫原含有物理上相互連接的兩個不同的免疫原性多肽，兩個多肽分別在於(a)第一免疫原性多肽，其誘導抗HPV-16細胞病原性抗原結構的細胞免疫反應或細胞和體液免疫反應；(b)第二免疫原性多肽，其誘導產生抗基質局部循環蛋白的中和或阻斷抗體，所述基質局部循環蛋白為細胞因子或者具有免疫毒性或血管生成性質的細胞調節因子，此類因子由癌性細胞或基質細胞，包括T淋巴細胞和具有抗原的細胞(APC)產生。
根據本發明使用的複合超免疫原被稱為「雙功能的」，因為兩種多肽(a)和(b)(它們是構造該超免疫原的兩個基本部分)使得可以同時誘導針對兩種不同靶標—病原性抗原性結構和基質的局部循環蛋白—的免疫反應。然而，本發明的雙功能複合超免疫原在其結構中可分別地含有多肽(a)和/或多肽(b)的許多拷貝。
構成本發明複合超免疫原性化合物的多肽(a)和多肽(b)之所以被稱為相互「物理連接的」是因為它們在所有情況下均包括在相同物理結構、分子或顆粒(微粒或納粒)中，其中它們在一定程度上相互分開。由於它們在複合超免疫原中被物理相互連接，多肽(a)和多肽(b)被一起呈遞給相同的具有免疫能力的細胞以及巨噬細胞、T或B淋巴細胞。
根據複合超免疫原的第一個優選的實施方案，多肽(a)和(b)分別選自-多肽(a)HPV-16乳頭瘤病毒的L1和L2蛋白，如果需要被脫毒或穩定化，這些蛋白的免疫原性片段，或者從中衍生的免疫原性蛋白(LeBuanec等，1999)。
-多肽(b)本發明的突變E7蛋白，例如，序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白。
根據複合超免疫原的第二個優選的實施方案，多肽(a)和(b)分別選自-多肽(a)本發明的突變E7蛋白，例如，序列SEQ ID No.1的突變E7蛋白。
-多肽(b)IFNα、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要被脫毒或穩定化，這些蛋白的免疫原性片段，或者從中衍生的免疫原性蛋白。
根據一個有利的實施方案，本發明還涉及含有通過突變E7蛋白的身份區別的幾種複合超免疫原(多肽(a)或多肽(b)，依賴於複合超免疫原的類型)的組合物。
為了製備根據本發明的複合超免疫原，通過化學途徑或者通過遺傳重組在多肽(a)和多肽(b)之間產生偶聯。
在本發明的免疫原性肽偶聯物的一個特定實施方案中，多肽(a)和(b)相互之間直接共價相連，例如通過肽-CO-NH連接相連。
然而，為了在免疫原性肽偶聯物的結構中產生一些彈性，更尤其為了允許免疫原性肽偶聯物中關於相互的多肽(a)和(b)的空間具有一定的可動性，優選其中多肽(a)和(b)在所述偶聯物中通過間隔鏈相互分開的肽偶聯物。
根據免疫原性肽偶聯物的第一個優選的實施方案，多肽(a)和(b)在所述偶聯物中通過選自SMCC或SIAB(兩種都是雙功能化合物)的間隔鏈相互分開。
SIAB化合物由HermansonG.T.(1996，Bioconjugate techniques，SanDiegoAcademic Press，239-242頁)描述，其是具有下式(I)的化合物 SIAB化合物含有兩個反應基團，分別是碘代乙酸基團和硫代-NHS酯基團，這些基團分別與氨基和巰基反應。
SMCC化合物由Samoszuk M.K.等(1989，Antibody，Immunoconjugates Radiopharm.，2(1)37-46)描述，是具有下式(II)的化合物 SMCC化合物含有兩個反應基團，分別是硫代-NHS酯基團和馬來醯亞胺基團，分別與氨基和巰基基團反應。
根據第二個優選的實施方案，複合超免疫原含有包含線性間隔肽的間隔鏈。優選地所選的線性間隔肽長3到30個胺基酸，優選5到20個胺基酸，最優選7到15個胺基酸。
優選地，線性間隔肽基本上甚至唯一地由帶正電或負電的胺基酸組成，pH等於7以增加所述複合超免疫原的總親水性。應該理解應避免施用含有疏水胺基酸的間隔肽。優選地，間隔肽的特徵是其由3到30個賴氨酸殘基，優選5到20，最優選7到15個賴氨酸殘基長的聚(賴氨酸)鏈組成。
根據本發明複合超免疫原的另一個實施方案，在所述肽偶聯物中，多肽(a)和(b)通過由一個分枝的間隔肽，優選聚(賴氨酸)寡樹枝狀結構(如Basak等(1995)所描述的)組成的間隔鏈相互分開。
在本發明複合超免疫原的後一個實施方案中，所述肽偶聯物中每個偶聯物分子可含有多肽(a)和(b)的幾份拷貝，有利地，多肽(a)和(b)的2到8份拷貝，優選地，每個偶聯物分子中的每個多肽(a)和(b)具有不超過4份的拷貝。
多肽(a)和(b)也可以被包括在單個物理結構中，例如直徑10到500納米，優選10到200納米，最優選10到100納米的納顆粒上，例如如Aucouturier等(2001)描述的IMS的納顆粒，如Skaugrud等(1999)描述的脫乙醯殼多糖的納顆粒，脂質體或生物可降解顆粒(如Baras等(1999)描述的酸性聚交酯(PLA)、聚-ε-己內酯(PLC)或聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯))的納顆粒。
根據本發明的另一個實施方案，多肽(a)和(b)在單個載體結構中被物理相連，使得它們可同時被呈遞到免疫系統的細胞上。在這個特定實施方案中，多肽(a)和(b)被固定在納顆粒，例如脫乙醯殼多糖、由直徑100到300納米的脂質納顆粒組成的IMS(可從法國的Seppic公司得到的免疫調節劑)或脂質體上。
優選地，這種納顆粒具有小的尺寸，從而同時將多肽(a)和(b)呈遞到細胞，就像這些多肽在相同的分子中被共價連接一樣。有利地，納顆粒的直徑為10到1000nm，優選10到500nm，更優選10到300nm，最優選10到200nm。
含有編碼本發明突變E7蛋白的核酸的疫苗組合物本發明的另一個目的是提供沒有預防性或治療性免疫抑制性質的用於乳頭瘤病毒感染導致癌症的免疫原性組合物或者疫苗組合物，其特徵是該組合物含有免疫有效量的編碼如在本公開中定義的突變E7蛋白的核酸、如在本公開中定義的表達盒或者重組載體。
為了實現上面提到的疫苗組合物，逆轉錄病毒載體或者腺伴隨病毒載體(AAV)被優選作為表達載體。這種腺伴隨病毒載體為例如Flotte等(1992)，Samulski等(1989)或者McLaughlin等(1996)描述的腺伴隨病毒載體。為了將核酸、表達盒或載體導入宿主細胞，本領域技術人員可以有利地利用各種技術，如磷酸鈣沉澱技術(Graham等，1973，Chen等，1987)、葡聚糖DEAE(Gopal，1985)、電穿孔(Turkaspa，1986，Potter等1984)、直接微注射(Harland等，1985)或者裝載DNA的脂質體(Nicolau等，1987；Fraley等，1980)。
根據一個特定實施方案，將本發明的核酸或表達盒體內導入宿主細胞，尤其是來自哺乳動物的宿主細胞的方法包括將含有在藥學可接受載體中的核酸或表達盒的製劑通過對所選組織，例如平滑肌組織或黏膜組織進行局部注射導入，核酸和表達盒被這種組織的細胞吸收。
體外或體內使用含有「裸」核酸或表達盒的組合物為，例如，在PCT申請WO 95/11307以及Tacson等(1996)和Huygen等(1996)的文章中公開的組合物。
其也可以是腺病毒載體，如2或5型人腺病毒載體。
注射到所選宿主生物體的載體量依賴於注射部位。作為說明，在患者身體中可注射約10μg到1000μg編碼本發明突變E7蛋白的核酸或表達盒。
適用於抗腫瘤被動接種的組合物如在本公開中清除地闡明的，為了阻斷HPV-16感染的癌性細胞分泌的E7蛋白的免疫抑制性質，全身性抗體或黏膜抗體的產生是必需的。
對於含有本發明突變E7蛋白的疫苗組合物或者含有編碼突變E7蛋白的核酸、表達盒或重組載體的疫苗組合物被治療性地使用，即HPV-16感染之後使用這一情況，有利地是快速阻斷癌性細胞產生並分泌的E7蛋白的免疫抑制作用以便有助於通過所述疫苗組合物快速誘導體液和細胞免疫應答，其目的是進一步增加其效率。
通過使用與一種或多種免疫佐劑結合的作為抗原性或免疫原性化合物的本發明突變E7蛋白對人或動物免疫後得到的有效量針對天然E7蛋白的中和抗體施用於患者可以實現對受感染細胞所產生的E7蛋白的免疫抑制作用進行早期阻斷。
本發明還涉及分離可中和HPV-16天然E7蛋白的免疫抑制作用的抗體的方法，特徵在於其包括使用本發明的突變E7蛋白免疫哺乳動物(包括人)，然後回收所得抗體的步驟。
本發明還涉及抗本發明的突變E7蛋白的抗體。這種抗體更具體的特徵在於它們是中和性的，即它們中和天然E7蛋白的免疫抑制作用。
本發明的另一個目的是含有中和HPV-16天然E7蛋白尤其是中和受HPV-16感染的細胞分泌的E7蛋白的免疫抑制作用的抗體的藥物組合物，所述抗體抗本發明的突變E7蛋白。
還涉及用於抗HPV-16感染，包括抗HPV-16感染導致的癌症的被動接種組合物，其為含有如上定義的抗體的組合物。
為了檢查本發明抗體的中和能力，本領域技術人員可有利地參考實施例1中描述的試驗，其包括定量暴露於天然E7蛋白的人巨噬細胞產生的α-IFN或α-TNF的抑制百分數。
本發明的另一個目的是阻斷HPV-16病毒感染的細胞所產生E7蛋白的免疫抑制作用的方法，其特徵是患者被施用中和量的用如在本公開中定義的突變E7蛋白免疫人或動物後得到的抗體。
待施用於患者的抗體的「中和量」依賴於HPV感染程度。通常，在實施例1中描述的免疫抑制試驗中，患者被施用的中和抗體的量對應於需要阻斷免疫抑制量的天然E7蛋白的中和抗體的量，為從100ng到1mg。
抗體可以是IgA同種型或IgG同種型抗體。它們可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
根據本發明的抗體也包括F(ab』)2或F(ab)片段。
含有用本發明的突變E7蛋白處理的樹突狀細胞的疫苗組合物樹突狀細胞是在T細胞免疫啟動中特化的抗原呈遞細胞(APC)。T細胞免疫應答的誘導需要樹突狀細胞和T細胞的物理接觸。樹突狀細胞通過兩個信號步驟活化給定抗原的特異免疫應答。第一個信號步驟涉及抗原性肽-MHC/T細胞受體(TCR)相互作用。第二個信號步驟涉及共-刺激分子，如細胞表面標記或細胞因子。
樹突狀細胞當呈遞抗原到T細胞時產生各種細胞因子，影響細胞因子微環境，然後導致免疫應答。
更特別地，公知用樹突狀細胞接種使得可以打破針對腫瘤細胞的免疫系統耐受性和通過Th1型T細胞免疫應答的刺激在宿主生物體中誘導腫瘤的裂解，至少隨著腫瘤發展沒有相伴的免疫抑制情況。
根據本發明已經表明個體的樹突狀細胞群體與適量的突變E7蛋白(如在本公開中定義的)的體外孵育使樹突狀細胞能夠隨後將所述的突變E7蛋白呈遞到從同一個體得到的自體單核細胞群體中的T細胞，並且誘導E7蛋白的特異T細胞的活化，這可通過這種T細胞的增殖來顯現。可通過例如在實施例中闡明的[3H]胸苷的胞內摻入量來測定T細胞的活化。
在類似的但是其中樹突狀細胞事先與天然E7蛋白體外孵育的實驗中，沒有觀察到T細胞活化，如在缺乏外來抗原時孵育的對照樹突狀細胞的群體中一樣。在這種系統中，可再一次觀察到天然E7蛋白的免疫抑制活性。
相反，本發明的突變E7蛋白缺乏任何免疫抑制活性並允許誘導抗天然E7蛋白的有效特異T細胞免疫應答。
本發明的另一個目的是提供缺乏對乳頭瘤病毒導致的癌症產生預防性或治療性免疫抑制性質的疫苗組合物，其特徵在於其包含適宜量的作為活性成分的針對所要治療個體的自體或同種異體的樹突狀細胞，所述自體樹突狀細胞已經被與如在本發明中定義的突變E7蛋白孵育，從而使得能夠將該所述突變E7蛋白呈遞給特異識別該蛋白的T細胞。
本發明的另一個目的是預防或治療乳頭瘤病毒感染導致的癌症的方法，其特徵是其包括以下步驟個體被施用合適量針對所要治療的個體的自體(等基因的)或同種異體的樹突狀細胞，所述自體(等基因的)或同種異體的樹突狀細胞在被施用於個體前已經與如在本公開中定義的突變E7蛋白孵育，從而使得能夠將該所述突變的E7蛋白呈遞給特異識別該蛋白的T細胞。
優選地，通過對從人外周血淘洗製備的單核細胞進行分化得到樹突狀細胞，該人外周血是患者的血液或者來自與患者共有主要組織相容性複合體的單倍型，如HLA-A2單倍型的個體的血液。
優選地，樹突狀細胞一旦從患者得到，就被培養在用於培養哺乳動物細胞的適宜培養基，如HL1培養基(Bio Whittaker)中，如果需要培養基被加入穀氨醯胺，任選一種或多種抗生素如鏈黴素，並在37℃培養箱的溼潤空氣中以5％(V/V)CO2進行培養。
然後將培養物中樹突狀細胞與選擇量的，優選5到50μg/ml突變E7蛋白一起孵育。
優選地，樹突狀細胞與突變的E7蛋白孵育，與每106個樹突狀細胞孵育的突變E7蛋白的量為1到50μg。
優選地，將要被治療的患者被施用101到500×106個用本發明的突變E7蛋白處理的樹突狀細胞。
有利地，通過經過腸胃外途徑的注射將用突變E7蛋白處理的樹突狀細胞單次施用於患者。如果需要，根據導致的抗E7免疫應答的強度，可以對患者施用多次注射，例如，每月、每兩個月、每季度或每年兩次施用被處理的樹突狀細胞。
還通過下面的附圖和實施例進一步闡明本發明而對本發明沒有限制。


圖1是E7Δ21-26製劑免疫之前和之後小鼠血清抗E7 IgG抗體滴度圖；圖2是E7Δ21-26製劑免疫之前和之後小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖；圖3是未免疫小鼠脾細胞和用E7Δ21-26製劑免疫後的小鼠脾細胞在存在天然E7蛋白培養時的Ip增殖指數圖；圖4是未免疫小鼠脾細胞和用E7Δ21-26製劑免疫後的小鼠脾細胞在存在天然E7蛋白培養時的γ-IFN圖；圖5到8顯示了E7Δ21-26製劑免疫之前和之後小鼠血清抗E7 IgG抗體的滴度圖和小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖9到10顯示了E7Δ21-26製劑免疫之前和之後小鼠血清抗E7 IgG抗體的滴度圖和小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖；圖11是顯示E7Δ21-26製劑免疫之前和之後小鼠陰道分泌物中存在的IgA圖。
圖12和13顯示了E7Δ21-26製劑免疫之前和之後小鼠血清抗E7 IgG抗體的滴度圖和小鼠血清抗E7 IgG抗體的中和百分率圖；圖14是顯示E7Δ21-26製劑免疫之前和之後小鼠陰道分泌物中存在的IgA圖。
圖15是顯示將C3細胞注射到用或不用E7Δ21-26製劑免疫的小鼠中的腫瘤生長圖。
圖16闡明了顯示在接受7×103個表達HPV-16 E7的C3細胞的小鼠中C3腫瘤的發育圖；圖16A代表對照小鼠，而圖B代表用E7Δ21-26處理的小鼠；橫坐標代表注射C3細胞後的天數；縱坐標代表腫瘤表面；圖17闡明了顯示在接受「9×103」個表達HPV-16 E7的C3細胞的小鼠中C3腫瘤的發育的圖；圖18是顯示了混合淋巴反應水平的圖，該反應水平通過用對照樹突狀細胞(空菱形)、用天然E7蛋白預處理(滿圓形)或用E7Δ21-26蛋白預處理(陰影線的正方形)的樹突狀細胞刺激效應者單核細胞的增殖水平來測量。縱坐標給出了通過[3H]胸苷的摻入顯現的效應者單核細胞的增殖，而橫坐標給出了刺激細胞數(樹突狀細胞)與效應細胞數(T細胞)之間的比。
實施例1全身性(體液和細胞)免疫應答實施例1.1存在弗氏完全(ACF)和不完全(AIF)佐劑時E7Δ21-26蛋白的免疫原活性存在ACF和AIF時對購自Charles River的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26製劑的免疫原性(體液和細胞)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6隻小鼠通過肌內途徑接受0.2ml(50μg)ACF乳液注射。在第21天和60天進行AIF 5μg加強注射。
在第一次注射前2天和在最後一次免疫後12天從每隻小鼠眼球後採集血樣。
8隻對照小鼠接受相同的無免疫原製劑。
3隻小鼠接受100μg製劑並在注射後的7天期間研究疾病症狀的缺乏。
將小鼠在最後一次免疫12天後用C3細胞刺激。C3細胞是來自C57BL/6，用完整HPV16基因組和ras癌基因轉化的胚胎細胞(Feltkamp，M.C.，H.L.Smits，M.P.Vierboom，R.P.Minnaar，B.M.de Jongh，J.W.Drijhout，J.terSchegget，C.J.Melief和W.M.Kast.1993.用含有細胞毒性T淋巴細胞表位的肽接種保護免受人乳頭瘤病毒16型轉化的細胞誘導的腫瘤，Eur.J.Immunol.232242-2249)。它們在含有7％CO2的溼潤空氣中於37℃下在加入10％FCS、50U/ml青黴素、50μg/ml鏈黴素和250ng/ml兩性黴素B的DMEM培養基(Bio-Whittaker)中培養。將欲注射到小鼠的細胞在從使用胰蛋白酶的塑料製品移走後用無血清的培養基洗滌。
製劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭髮、體重)和通過屍檢後的解剖學研究來測量。
B.結果在存在ACF和AIF時通過E7Δ21-26製劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象並且無解剖學損傷。
用100μg製劑免疫的三隻小鼠中沒有一隻在注射7天後顯示出任何疾病症狀。
通過體液應答和細胞應答測量免疫應答1.體液應答血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定並以滴度(給出高於0.3的光密度的稀釋度的倒數)表達。
圖1在存在ACF和AIF時通過E7Δ21-26製劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天採集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然後將這些稀釋液應用於用γ-IFN預處理16小時的人巨噬細胞。培養24小時後，回收培養上清液並通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(RD)測量產生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導α-TNF的表達，而非中和血清允許該細胞因子的合成。
結果以中和％給出。
圖2存在ACF然後是AIF時通過E7Δ21-26製劑誘導的抗體具有非常高的中和能力。
2.細胞應答2.1細胞增殖將來自免疫小鼠和對照小鼠的脾細胞分離然後以100,000個細胞/孔培養於存在天然E7的微培養板的圓底孔中。細胞培養在37℃裝有5％CO2的溼潤空氣中繼續6小時。孵育結束前18小時，加入0.5μCi氚化的胸苷/孔。免疫應答的強度與Ip增殖指數成比例。
Ip＝給定抗原的spm(脈衝(strokes)/分鐘)/對照smp圖3從存在ACF和AIF時用E7Δ21-26製劑免疫的小鼠得到的脾細胞當體外用天然E7蛋白活化時增殖。
2.2.γ-IFN的產生使用ELISA試驗(LO-IMEX，比利時)，在培養72小時後確定存在10μg/ml天然E7時培養的脾細胞的培養上清液中γIFN的存在，如以前描述的進行(De Smedt，T.，B.Pajak，E.Muraille，L.Lespagnard，E.Heinen，P.De Baetselier，J.Urbain，O.Leo和M.Moser.1996.通過脂多糖體內調節樹突狀細胞數及成熟.J.Ex.Med.1841413-1424)。這些結果以IU/ml表達。
圖4從存在ACF然後是AIF時用E7Δ21-26製劑免疫的小鼠得到的脾細胞當體外用天然E7蛋白活化時產生大量γIFN。
實施例1.2存在弗氏不完全佐劑(AIF)時E7Δ21-26蛋白的免疫原性活性存在AIF時對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26製劑的免疫原性(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6隻小鼠通過肌內途徑接受存在1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml(50μg)AIF乳液注射。在第21天和60天進行AIF5μg加強注射。
在第一次注射前2天和在最後一次免疫後12天從每隻小鼠眼球後採集血樣。
6隻對照小鼠接受相同的無免疫原製劑。
3隻小鼠接受100μg製劑並在注射後的7天期間研究疾病症狀的缺乏。
製劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭髮、體重)和通過屍檢後的解剖學研究來測量。
B.結果在存在AIF時通過E7Δ21-26製劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象並且無解剖學損傷。
用100μg製劑免疫的三隻小鼠中沒有一隻在注射後7天期間顯示出任何疾病症狀。
通過體液應答和細胞應答測量免疫應答1.體液應答血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定並以滴度(給出高於0.3的光密度的稀釋度的倒數)表示。
圖5在存在AIF時通過E7Δ21-26製劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天採集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然後將這些稀釋液應用於用γ-IFN預處理16小時的人巨噬細胞。培養24小時後，回收培養上清液並通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(RD)測量產生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導α-TNF的表達，而非中和血清允許該細胞因子的合成。
結果以中和％給出。
圖6存在AIF時通過E7Δ21-26製劑誘導的抗體具有非常高的中和能力。
實施例1.3存在弗氏不完全佐劑(AIF)時包埋於脫乙醯殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26的免疫原活性存在AIF時對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究包埋於脫乙醯殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26製劑的免疫原(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6隻小鼠通過肌內途徑接受存在1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml(50μg)AIF乳液注射。在第21天和60天進行AIF5μg加強注射。
在第一次注射前2天和在最後一次免疫後12天從每隻小鼠眼球後採集血樣。
6隻對照小鼠接受相同的無免疫原製劑。
3隻小鼠接受100μg製劑並在注射後的7天期間研究疾病症狀的缺乏。
製劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭髮、體重)和通過屍檢後的解剖學研究來測量。
B.結果存在AIF時通過包埋於脫乙醯殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26製劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象並且無解剖學損傷。
用100μg製劑免疫的三隻小鼠中沒有一隻在注射後7天顯示出任何疾病症狀。
通過體液應答和細胞應答測量免疫應答1.體液應答血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定並以滴度(給出高於0.3的光密度的稀釋度的倒數)表示。
圖7存在AIF時通過包埋於脫乙醯殼多糖納顆粒中E7Δ21-26製劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天採集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然後將這些稀釋液應用於用γ-IFN預處理16小時的人巨噬細胞。培養24小時後，回收培養上清液並通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(RD)測量產生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導α-TNF的表達，而非中和血清允許該細胞因子的合成。
結果以中和％給出。
圖8存在AIF時通過包埋於脫乙醯殼多糖納顆粒中的E7Δ21-26製劑誘導的抗體具有非常高的中和能力。
實施例2全身性和黏膜免疫應答實施例2.1存在IMS 1113(SEPPIC)時E7Δ21-26蛋白的免疫原活性存在IMS 1113(SEPPIC)時對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26製劑的免疫原(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6隻小鼠通過肌內途徑注射存在IMS 1113和1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml含有50μg E7Δ21-26，以及通過鼻內途徑給予的20μg相同製劑。
在第7、14和21天，這些小鼠通過鼻內途徑接受20μl，即20μg IMS1113製劑。
在第60天，這些小鼠接受0.2ml含有5μg IMS 1113製劑的注射和通過鼻內途徑的20μl含有20μg的相同製劑。
在第一次注射前2天和在最後一次免疫後12天從每隻小鼠眼球後採集血樣。
6隻對照小鼠接受相同的無免疫原製劑。
3隻小鼠接受100μg製劑並在注射後的7天中研究疾病症狀的缺乏。
製劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭髮、體重)和通過屍檢後的解剖學研究來測量。
B.結果存在IMS 1113時用E7Δ21-26製劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象並且無解剖學損傷。
用100μg製劑免疫的三隻小鼠中沒有一隻在注射後7天顯示出任何疾病症狀。
通過體液應答和細胞應答測定免疫應答1.體液應答1.1.血清中IgG同種型抗體的產生血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測定並以滴度(給出高於0.3的光密度的稀釋度的倒數)表示。
圖9存在IMS 1113時用E7Δ21-26製劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天採集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然後將這些稀釋液應用於用γ-IFN預處理16小時的人巨噬細胞。培養24小時後，回收培養上清液並通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(RD)測量產生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導α-TNF的表達，而非中和血清允許該細胞因子的合成。
結果以中和％給出。
圖101.2.陰道分泌物中同種型IgA抗體的產生血清中抗天然E7重組蛋白的IgA型抗體的存在通過ELISA測量並以滴度(給出高於0.3的光密度的稀釋度的倒數)表示。
圖11存在IMS 1113時用E7Δ21-26製劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7IgA型抗體滴度。
實施例2.2存在AIF(全身途徑)或者存在PBS(鼻途徑)時包埋於脫乙醯殼多糖中的E7Δ21-26製劑的免疫原活性對從Charles River購買的6周齡C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究包埋於脫乙醯殼多糖中的E7Δ21-26製劑的免疫原(體液)活性。
A.材料與方法在第0天，一組6隻小鼠通過肌內途徑接受存在AIF和1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml含有50μg E7Δ21-26的注射，以及通過鼻內途徑的存在PBS加入1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的20μg相同製劑。
在第7、14和21天，這些小鼠通過鼻內途徑接受20μl，即20μg存在PBS時包埋於脫乙醯殼多糖中的E7Δ21-26。
在第60天，這些小鼠接受0.2ml含有5μg AIF製劑的注射和通過鼻內途徑接受存在PBS的20μl含有20μg的相同製劑。
在第一次注射前2天和在最後一次免疫後12天從每隻小鼠眼球後採集血樣以及陰道分泌物樣品。
6隻對照小鼠接受相同的無免疫原製劑。
3隻小鼠接受100μg製劑並在注射後的7天期間研究疾病症狀的缺乏。
製劑毒性的缺乏通過缺乏臨床跡象(行為、頭髮、體重)和通過屍檢後的解剖學研究來測量。
B.結果通過包埋於脫乙醯殼多糖中的E7Δ21-26製劑免疫的小鼠沒有顯示出任何臨床跡象並且無解剖學損傷。
用100μg製劑免疫的三隻小鼠中沒有一隻在注射後7天顯示出任何疾病症狀。
通過體液應答和細胞應答測量免疫應答1.體液應答1.1.血清中G同種型抗體的產生血清中抗天然E7重組蛋白的IgG型抗體的存在通過ELISA測量並以滴度(給出高於0.3的光密度的稀釋度的倒數)表示。
圖12用包埋於脫乙醯殼多糖中的E7Δ21-26製劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗體滴度。
使用下面的免疫抑制試驗測量這種抗體的中和活性。在-2天和72天採集的血清的1/50稀釋液與50ng/ml天然E7孵育2小時。然後將這些稀釋液應用於用γ-IFN預處理16小時的人巨噬細胞。培養24小時後，回收培養上清液並通過ELISA試驗、DTA50 DuoSet(RD)測量產生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白誘導α-TNF的表達，而非中和血清允許該細胞因子的合成。
結果以中和％給出。
圖131.2.陰道分泌物中同種型A抗體的產生血清中抗天然E7重組蛋白的IgA型抗體的存在通過ELISA測量並以滴度(給出高於0.3的光密度的稀釋度的倒數)表示。
圖14用包埋於脫乙醯殼多糖中的E7Δ21-26製劑免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgA型抗體滴度。
實施例3保護性抗腫瘤應答實施例3.1存在ACF然後存在AIF時E7Δ21-26蛋白的注射產生抗腫瘤抗性如下測試了存在ACF然後存在AIF時用E7Δ21-26製劑免疫的小鼠(實施例1.1)保護性抗腫瘤應答。
最後一次免疫後12天，通過皮下途徑(s-c)在側腹中用500,000個C3細胞注射小鼠。C3細胞是源自C57BL/6、用完整HPV16基因組和ras癌基因轉化的胚胎細胞。
圖15腫瘤在所有僅用佐劑治療的對照小鼠中生長。在存在ACF然後AIF時用E7Δ21-26製劑免疫的6隻小鼠中4隻小鼠不長腫瘤，在1隻小鼠中，腫瘤生長，然後穩定，在1隻小鼠中，腫瘤生長。
存在ACF和AIF時，E7Δ21-26在小鼠中產生特異抗16型人乳頭瘤病毒誘導的腫瘤的特異性免疫應答。
實施例4治療性抗腫瘤應答存在AIF時E7Δ21-26誘導對預先植入的C3腫瘤的排斥已經如下在C57BL/6(H-2b)小鼠中檢驗。
實施例4.1治療模型的製備A.材料與方法小鼠(8隻一組)被用數量增加0；5×102；5×103；5×104和5×105的C3細胞皮下注射入側腹。通過測量腫瘤表面每周一次評價腫瘤生長。
B.結果表I通過測量腫瘤表面評價腫瘤生長*
*以mm2表示的表面代表從測量8個腫瘤的表面得到的平均值。
已經接受5×105個細胞的小鼠在細胞注射後12天都生長腫瘤(8/8)。
在接受5×104個細胞的小鼠中，8隻中的4隻小鼠在細胞注射後21天長腫瘤，8隻中的4隻在注射後28天後長腫瘤。
在接受5×103個細胞的小鼠中，8隻中的1隻小鼠在細胞注射後35天長出腫瘤，8隻中的3隻在注射後42-60天後長腫瘤，並且另外4隻仍然沒有顯示任何腫瘤。
在接受5×102個細胞的小鼠中，8隻中的1隻小鼠在細胞注射後35天長腫瘤，其他7隻仍然沒有長腫瘤。
實施例4.2在接受7×103和9×103劑量的表達E7蛋白的C3細胞的小鼠中抗腫瘤應答A.材料與方法將小鼠首先從側腹皮下注射7,000或9,000個C3細胞(第0天)。在第2、9、16和23天，小鼠接受AIF和1μg GM-CSF和鼠IL2中的10μg E7Δ21-26製劑的肌內注射。在第9、16、23和60天，小鼠接受AIF中的10μgE7Δ21-26製劑的肌內注射。
如上面實施例4.1中所描述的每周兩次測量腫瘤的大小。
B.結果圖16和17顯示了所得結果。
對照小鼠在注射C3細胞後10到20天都長腫瘤(8/8)而80％(注射7,000個細胞-圖16)和75％(注射9,000個細胞-圖17)免疫的小鼠不長腫瘤。
實施例5用E7Δ21-26突變的E7蛋白預處理的樹突狀細胞刺激混合淋巴細胞反應單向自體混合淋巴細胞反應包括在攜帶抗原的樹突狀細胞(刺激細胞)上共培養個體的單核細胞(效應細胞或應答細胞)。具有對刺激細胞攜帶的抗原特異的受體的效應細胞增殖。通過氚化的胸苷摻入試驗測量增殖。
樹突狀細胞來自通過從供體的外周血PBMCs淘析的單核細胞的分化(Sallusto等，Journal of Experimental Medicine，1994，179，1109-18)。單核細胞(2.5×106個細胞/ml)被培養於富含SAB(10％)、GMC-SF(50ng/ml)和IL4(1,000單位/ml)的RPMI 1640中的特氟隆小瓶中。培養6天後，那些細胞顯示出分化的樹突狀細胞的表型。
從而將這些所得的樹突狀細胞用3μg/ml劑量的天然E7、或E7Δ21-26和/或培養基處理，然後在圓底96孔板中與同一供體的PBMCs共培養，PBMCs的比例為1/10；3/10和10/10。反應結束前18小時，加入0.5μCi氚化的胸苷/孔。結果(以每分鐘的脈衝給出)在圖18中給出。
當樹突狀細胞與天然E7蛋白預孵育，然後與應答細胞培養時，沒有觀察到增殖(因為天然E7蛋白的免疫抑制活性)。當樹突狀細胞與突變的E7蛋白(缺少天然蛋白的免疫抑制活性)預孵育時，觀察到刺激細胞的增殖。
實施例6突變的E7蛋白缺乏免疫抑制活性使用細胞增殖試驗測定體外免疫抑制活性的缺乏。將人外周血單核細胞分離，然後在存在3μg/ml不同天然E7蛋白和它們的各自突變體或者存在E7 HPV 16(Δ21-25)疫苗培養物(MP Kieny，Transgene贈送)的培養上清液(SN)時和存在加強抗原(PPD+TT)時將這些單核細胞以150,000個細胞/孔培養於圓底孔中。細胞培養在37℃下裝有5％CO2的溼潤空氣中持續6天。通過氚化的胸苷摻入試驗測量細胞增殖。結果(以每分鐘脈衝給出)總結於後面的表II中。
表II
所得結果表明突變體被脫毒(喪失天然蛋白的免疫抑制活性)。
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2102211276212DNA213人工序列220
223人工序列描述E7Δ21-264002catggagata cacctacatt gcatgaatat atgttagatt tgcaaccaga gacaactcaa 60ttaaatgaca gctcagagga ggaggatgaa atagatggtc cagctggaca agcagaaccg 120gacagagccc attacaatat tgtaaccttt tgttgcaagt gtgactctac gcttcggttg 180tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt actttggaag acctgttaat gggcacacta 240ggaattgtgt gccccatctg ttctcagaaa ccataa 276210321198212PRT213人乳頭瘤病毒16型4003Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser20 25 30Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr50 55 60Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Cys Thr Leu Glu65 70 75 80Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Arg85 90 95Lys Pro
2104211294212DNA213人乳頭瘤病毒16型4004catggagata cacctacatt gcatgaatat atgttagat ttgcaaccaga gacaactgat 60ctctactgtt atgagcaatt aaatgacagc tcagaggagg aggatgaaat agatggtcca 120gctggacaag cagaaccgga cagagcccat tacaatattg taaccttttg ttgcaagtgt 180gactctacgc ttcggttgtg cgtacaaagc acacacgtag acattcgtac tttggaagac 240ctgttaatgg gcacactagg aattgtgtgc cccatctgtt ctcagaaacc ataa 29權利要求
1.缺乏針對乳頭瘤病毒感染所致癌症的預防性或治療性免疫抑制特性的疫苗組合物，其特徵在於其包含與一種或多種生理可相容的免疫佐劑結合的作為活性成分的非免疫抑制性突變E7蛋白，該突變E7蛋白從N-末端到C-末端含有下列胺基酸序列i.序列SEQ ID No.3的1-19位胺基酸序列；ii.具有(a)與序列SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比至少一個胺基酸替代的胺基酸序列或者(b)與序列SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比至少4個連續胺基酸缺失的胺基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30-98位胺基酸序列。
2.根據權利要求1的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特徵在於所述突變的E7蛋白的胺基酸區域(ii)與天然蛋白的序列SEQ ID No.3的胺基酸對應的20-29位肽區域相比包含至少2個胺基酸替代。
3.根據權利要求2的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特徵在於所述突變的E7蛋白的胺基酸區域(ii)與天然蛋白的序列SEQ ID No.3的胺基酸對應的20-29位肽區域相比包含3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸替代。
4.根據權利要求2的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特徵在於24位的Cys殘基和26位的Glu已經用不同的胺基酸殘基替代。
5.根據權利要求4的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白是(CYS24GLY，GLU26GLN)E7蛋白。
6.根據權利要求4的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白是(CYS24SER，GLU26GLN)E7蛋白。
7.根據權利要求1的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特徵在於所述突變的E7蛋白的胺基酸區域(ii)與SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比包含5、6、7、8、9或10個連續胺基酸的缺失。
8.根據權利要求7的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特徵在於所述突變的E7蛋白的胺基酸區域(ii)與SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比包含6個連續胺基酸的缺失。
9.根據權利要求8的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白在於該突變的E7蛋白具有包含對天然E7蛋白的SEQ ID No.3序列的相應胺基酸21-26位缺失的胺基酸序列。
10.根據權利要求7的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白的特徵在於所述突變的E7蛋白的胺基酸區域(ii)與SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比包含5個連續胺基酸的缺失。
11.根據權利要求10的疫苗組合物，其中突變的E7蛋白在於該突變的E7蛋白具有包含對天然E7蛋白的SEQ ID No.3序列的相應胺基酸21-25位缺失的胺基酸序列。
12.根據權利要求1到11中任意一項所述的疫苗組合物，其特徵在於其包含至少一種能夠優選地將免疫應答定向到產生中和天然E7蛋白免疫抑制活性的抗體的佐劑。
13.根據權利要求12的疫苗組合物，其特徵在於其包含至少一種能夠優選地將免疫應答定向到產生IgA同種型抗體的佐劑。
14.根據權利要求12的疫苗組合物，其特徵在於其包含至少一種能夠優選地將免疫應答定向到產生IgG同種型抗體的佐劑。
15.根據權利要求12的疫苗組合物，其特徵在於其包含(i)能夠優選地將免疫應答定向到產生IgA同種型抗體的佐劑和(ii)能夠優選地將免疫應答定向到產生IgG同種型抗體的佐劑的組合。
16.根據權利要求15的疫苗組合物，其特徵在於其包含至少一種能夠誘導體液和細胞免疫應答的免疫佐劑。
17.根據權利要求7的疫苗組合物，其特徵在於細胞應答更特別地通過表達CD8抗原並特異識別野生型E7蛋白的淋巴細胞的增殖而表徵。
18.誘導針對HPV-16乳頭瘤病毒天然E7蛋白的免疫應答而不同時誘導免疫抑制的免疫原性組合物，所述組合物包含與一種或多種生理學上可相容的賦形劑或免疫佐劑結合的作為活性成分的非免疫抑制的突變E7蛋白，該突變蛋白從N-末端到C-末端包含以下胺基酸序列i.序列SEQ ID No.3的1-19位胺基酸序列；ii.具有(a)與序列SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比至少一個胺基酸替代的胺基酸序列或者(b)與序列SEQ ID No.3的相應20-29位胺基酸序列相比至少4個連續胺基酸缺失的胺基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30-98位胺基酸序列。
19.用於HPV-16感染所致癌症的預防性或治療性疫苗組合物，其特徵在於其包含免疫有效量的編碼如在權利要求1到11之一中定義的突變E7蛋白的核酸、含有所述核酸的表達盒或含有所述表達盒的重組載體。
20.如在權利要求1到11中任意一項所定義的非免疫抑制性突變E7蛋白的用途，用於製備非免疫抑制的免疫原性組合物或疫苗組合物，其中所述組合物誘導產生中和天然E7蛋白免疫抑制活性的抗體。
21.中和抗體，其抗編碼如根據權利要求1到11之一中定義的突變E7蛋白的DNA的表達產物。
22.用於針對HPV-16感染的被動接種的組合物，其包含根據權利要求21的抗體。
23.缺乏針對乳頭瘤病毒感染所致癌症的任何預防性或治療性免疫抑制特性的疫苗組合物，其特徵在於其包含適宜量的對待治療個體而言為自體或同種異體樹突狀細胞作為活性成分，所述自體樹突狀細胞已經與如在權利要求1到11之一定義的突變E7蛋白孵育，從而使得能夠將所述突變的E7蛋白呈遞給T細胞。
全文摘要
本發明涉及誘導針對HPV－16乳頭瘤病毒天然E7蛋白的免疫應答而同時不誘導免疫抑制的免疫原性組合物或疫苗組合物，所述組合物包含作為活性成分的非免疫抑制的突變E7蛋白，該突變蛋白從N－末端到C－末端包含的胺基酸序列如下i.序列SEQ ID No.3的1－19位胺基酸序列；ii.具有(a)與序列SEQ ID No.3的相應20－29位氫基酸序列相比至少一個胺基酸替代的胺基酸序列或者(b)與序列SEQ ID No.3的相應20－29位胺基酸序列相比至少4個連續胺基酸缺失的胺基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30－98位胺基酸序列。
文檔編號C07K14/16GK1656116SQ03811786
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月4日 優先權日2002年4月24日
發明者D·扎古裡, H·勒布阿內克, B·比其尼, P·科昂 申請人:尼奧瓦克斯公司