免疫球蛋白變體及其用途的製作方法

2023-09-15 09:40:25

專利名稱：免疫球蛋白變體及其用途的製作方法
技術領域：
一般地，本發明涉及分子生物學領域。更具體地，本發明涉及具有改變的生物學特性的IgG免疫球蛋白變體及使用它們的方法。
背景技術：
多年來，免疫球蛋白作為治療劑的使用顯著增多。人們對構成免疫系統的一個重要部分的免疫球蛋白(Ig)分子極感興趣，因為它們(1)與一個多種多樣的配體家族反應， (2)擁有不同效應器功能及(3)具有極大的生物學重要性。今天，基於抗體的藥物的用途包括治療癌症、自身免疫性疾病以及多種系統性和傳染性疾病。還有，免疫球蛋白作為體內診斷工具，例如在診斷成像規程中是有用的。IgG是人類和其它哺乳類中最普遍的免疫球蛋白類別，而且在多種類型的免疫療法和診斷規程中使用。人IgGl是為了治療最常用的抗體。當前，臨床試驗中的許多抗體針對腫瘤相關抗原。特別地，抗VEGF中和性抗體顯示出遏制裸鼠中多種人腫瘤細胞系的生長(Kim et al. Nature 362:841-844(1993) ；Warren et al. J. Clin. Invest. 95 1789-1797(1995) ； Borgstrom et al. Cancer Res. 56 :4032-4039 (1996) ；Melnyk et al. Cancer Res. 56 :921-9 (1996))，及還抑制缺血性視網膜病症模型中的眼內血管發生 (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114 :66-71 (1996))。確實，一種人源化抗 VEGF 抗體， 貝伐單抗(AVASTIN ,Genentech,South San Francisco,CA)是第一種被美國 FDA批准的，設計用於抑制血管發生的療法。儘管有潛力，免疫球蛋白免疫療法的問題之一是免疫球蛋白在循環中的持久性。 免疫球蛋白清除速率直接影響免疫球蛋白的量和給藥頻率(frequency of dosage) 0升高的劑量和給藥頻率可在患者中引起不良作用，而且還提高醫療費用。經由嚙齒類中涉及被動免疫經胎盤或卵黃囊或經初乳自母親轉移至胎兒/新生兒(IgG經胞轉的母體胎兒轉移)的研究，闡明了循環中IgG異化的機制(Brambell， Lancet, ii :1087-1093,1966；Rodewald, J.Cell Biol. ,71 :666-670,1976 ；Morris et al. , In Antigen Absorption by the Gut, pp.3-22,1978, University Park Press, B altimore Jones et al.，J. Clin. Invest. ,51 :2916-2927,1972)。新生JL Fc 受體(FcRn) 在哺乳類中IgG的胞轉和穩態中發揮重要作用。Fcfoi在結構上與主要組織相容性複合物 (MHC)I類分子同源，而且由跨膜α鏈和β2_微球蛋白(β2πι)組成。先前敲除小鼠中的研究例示了 IgG在Fcfoi或β an缺陷小鼠中的血清半衰期大大縮短(Roopenian et al., J Immunol 170 (7),3528-3533, 2003 ；Israel et al. , Immunology 89 (4),573-578,1996),證明了 Fcfoi在調節循環IgG水平中的保護性作用。小鼠IgG的Fc區中的多項位點特異性誘變實驗導致了涉及IgG和Fcfoi之間相互作用的某些關鍵胺基酸殘基的鑑定(Kim et al.，Eur. J. Immunol. ,24 :2429-2434,1994 ；Medesan et al.，Eur. J. Immunol. ,26 :2533, 1996 ；Medesan et al.，J. Immunol.，158 :2211_2217，1997)。另外，多份出版物記載了通過引入或修飾IgG的Fcfoi結合區來獲得半衰期改變的生理學活性分子的方法(W0 97/43316 ； 美國專禾U No. 5，869，046 ；美國專利 No. 5，747，035 ；W096/32478 ；W02006053301 ；美國專利 No. 7，083，784 ；美國專利 No. 7，371，826)。在分子水平，FcRn在CH2-CH3域區中結合IgG的Fc部分。Fc-Fcfoi相互作用是高度PH依賴性的；IgG在pH 6以高親和力結合Fcfoi，但是隨著pH上升至7. 4，結合親和力大大下降。此PH依賴性相互作用負責保護IgG免於降解。具體地，被胞飲的IgG在酸性內體中被Fcfoi捕捉，再循環回到細胞表面，然後釋放回到處於生理血清pH 7. 4的循環中(Ober et al. Proc Natl Acad Sci U S AlOl (30), 11076-11081,2004 ；Ober et al. J Immunol 172(4),2021-2029, 2004 ；Prabhat et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104(14)， 5889-5894, 2007) 0未被Fcfoi結合的IgG被靶定至溶酶體並被降解。因為Fcfoi在調節 IgG穩態中是重要的，所以經由蛋白質工程來調控Fc與Fcfoi之間的相互作用是用於改進治療性抗體的藥動學的一種方法(Shields et al. J Biol Chem 276 (9)，6591-6604， 2001 ；Dall' Acqua et al. Nat Biotechnol 15(7),637-640,1997 ；Dall' Acqua et al., JImmunol 169 (9),5171-5180, 2002 ；Hinton et al. J Biol Chem 279 (8)，6213-6216， 2004 ；Hinton et al. J Immunol 176(1), 346-356, 2006 ；Datta-Mannan et al. Drug Metab Dispos 35 (1),86-94,2007 ；Datta-Mannan et al. J Biol Chem 282(3),1709-1717, 2007)。多項小鼠、恆河猴和獼猴中的研究證明了提高IgGWpH 6結合親和力可延長半衰期(Dall' Acqua et al. Nat Biotechnol 15(7),637-640,1997 ；Dall' Acqua et al.，J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002 ；Hinton et al.J Biol Chem 279 (8)，6213-6216，2004 ； Hinton et al. J Immunol 176 (1)，346-356，2006)。此外，其它研究還證明了在 pH 7. 4 的 Fcfoi結合親和力是IgG藥動學的另一項決定子。具體地，在pH 7. 4對小鼠Fcfoi的結合親和力升高的某些變體在小鼠中展現升高的清除(即縮短的半衰期)(Dall' Acqua et al.， J Immunol 169 (9)，5171-5180，2002)。不過，尚未闡明Fcfoi親和力與半衰期之間的詳細相關性，因為先前的研究都涉及少數變體，在Fcfoi親和力的有限範圍內。不清楚經由改造 Fc = Fcfoi相互作用可實現的最大程度的半衰期延長。儘管堅持(順從)藥物治療是重要的，估計得到處方藥物的患者一半沒有以推薦方式服用藥物。例如，一項最新的研究顯示多達三分之一服用在過去10年中開發的乳腺癌藥物的女性沒有完成她們的五年推薦療程。順從性差的一些原因包括健忘、順從的物理困難(例如旅行至或搬離治療場所)、不便、不良副作用、方案複雜和藥物費用。藥物治療堅持得差可導致所實現的健康福祉不及藥物可提供給患者的全部。例如，不完成推薦的癌症療程可導致疾病復發和存活機會降低。改善藥物順從性的策略包括使它更加方便患者完成推薦的療程。使免疫療法處理下的患者可實現這一點的方式之一是通過延長免疫球蛋白在循環中的持續時間。免疫球蛋白清除速率直接影響免疫球蛋白的量和給藥頻率。因此，開發賦予延長的體內半衰期的免疫球蛋白可降低量和/或給藥頻率，如此將不便以及任何別的醫療費用降至最低。
因而，為了治療，具有賦予延長的體內半衰期的經修飾免疫球蛋白會是高度有益的。本發明解決這些和其它需要，正如閱讀下述公開後會顯而易見的。發明概述本發明提供了新型IgG變體及其用途。在本發明中提供了多種IgG變體。例如， 本發明公開了新型IgG變體，其包含如下的人IgG Fc區，相對於野生型人IgG Fc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基251、252、307、308、378、428、430、434、和436中兩處或更多處的兩個或更多個胺基酸替代，其中所述變體IgG與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比，具有延長的半衰期，且其中至少兩處所述胺基酸替代是胺基酸殘基 251、252、307、308、378、428、430、434、或436處的，而且胺基酸殘基251處的胺基酸替代是用天冬氨酸或穀氨酸進行的替代，胺基酸殘基252處的胺基酸替代是用酪氨酸進行的替代，胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，胺基酸殘基308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代，胺基酸殘基378處的胺基酸替代是用纈氨酸進行的替代，胺基酸殘基4 處的胺基酸替代是用亮氨酸進行的替代，胺基酸殘基430處的胺基酸替代是用丙氨酸或賴氨酸進行的替代，胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸，絲氨酸或酪氨酸進行的替代，而胺基酸殘基436處的胺基酸替代是用異亮氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸251處的胺基酸替代，其中所述胺基酸251處的胺基酸替代是用天冬氨酸或穀氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸307處的胺基酸替代，其中所述胺基酸307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸308處的胺基酸替代， 其中所述胺基酸308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人 IgG Fc區包含胺基酸378處的胺基酸替代，其中所述胺基酸378處的胺基酸替代是用纈氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸436處的胺基酸替代，其中所述胺基酸436處的胺基酸替代是用異亮氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述變體IgG具有比具有野生型人IgG Fc區的IgG更高的對Fcfoi的結合親和力。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸307處用穀氨醯胺進行的胺基酸替代和胺基酸434處用丙氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸307處用穀氨醯胺進行的胺基酸替代和胺基酸434處用絲氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸308處用脯氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434處用丙氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸252處用酪氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434處用丙氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸378處用纈氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434 處用丙氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸4 處用亮氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434處用丙氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸434處用丙氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸436處用異亮氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸308處用脯氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434處用酪氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸307處用穀氨醯胺進行的胺基酸替代和胺基酸436處用異亮氨酸進行的胺基酸替代。本發明還公開了新型IgG變體，其包含如下的人IgG Fc區，相對於野生型人IgG
6Fc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基251、252、307、308、378、380、428、430、 434、和436中三處或更多處的三個或更多個胺基酸替代，其中所述變體IgG與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比，具有延長的半衰期，且其中至少三處所述胺基酸替代是胺基酸殘基251、252、307、308、378、380、428、430、434、或436處的，而且胺基酸殘基251處的胺基酸替代是用天冬氨酸或穀氨酸進行的替代，胺基酸殘基252處的胺基酸替代是用酪氨酸進行的替代，胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，胺基酸殘基 308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代，胺基酸殘基378處的胺基酸替代是用纈氨酸進行的替代，胺基酸殘基380處的胺基酸替代是用丙氨酸進行的替代，胺基酸殘基4 處的胺基酸替代是用亮氨酸進行的替代，胺基酸殘基430處的胺基酸替代是用丙氨酸或賴氨酸進行的替代，胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸、絲氨酸、酪氨酸或組氨酸進行的替代，而胺基酸殘基436處的胺基酸替代是用異亮氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸251處的胺基酸替代，其中所述胺基酸251處的胺基酸替代是用天冬氨酸或穀氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸307處的胺基酸替代，其中所述胺基酸307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸308處的胺基酸替代， 其中所述胺基酸308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人 IgG Fc區包含胺基酸378處的胺基酸替代，其中所述胺基酸378處的胺基酸替代是用纈氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸436處的胺基酸替代，其中所述胺基酸436處的胺基酸替代是用異亮氨酸進行的替代。在某些實施方案中，所述變體IgG與具有野生型人IgG Fc區的IgG相比，具有更高的對Fcfoi的結合親和力。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸307處用穀氨醯胺進行的胺基酸替代、胺基酸380處用丙氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434處用絲氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸307處用穀氨醯胺進行的胺基酸替代、 胺基酸380處用丙氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434處用丙氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸252處用酪氨酸進行的胺基酸替代、胺基酸 308處用脯氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸434處用酪氨酸進行的胺基酸替代。在一個實施方案中，所述人IgG Fc區包含胺基酸251處用天冬氨酸進行的胺基酸替代、胺基酸307 處用穀氨醯胺進行的胺基酸替代和胺基酸434處用組氨酸進行的胺基酸替代。在某些實施方案中，本發明提供了進一步包含位置297處用丙氨酸進行的胺基酸替代的變體IgG或其片段。在某些實施方案中，本發明的變體IgG與具有野生型人IgG Fc區的IgG相比，具有更高的對Fcfoi的結合親和力。在某些實施方案中，所述變體IgG在pH 6.0具有比在pH 7. 4更高的對Fcfoi的結合親和力。在某些實施方案中，所述變體IgG是人的或人源化的 IgG。在某些實施方案中，所述變體IgG是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在某些實施方案中， 所述變體IgG的IgG Fc區是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區。在某些實施方案中，所述變體 IgG 的 IgG Fc 區是 IgGl Fc 區。在某些實施方案中，所述變體IgG是抗VEGF抗體。在某些實施方案中，所述變體 IgG是貝伐單抗(bevacizumab)的變體。在某些實施方案中，所述具有野生型人IgG Fc區的IgG是貝伐單抗。在某些實施方案中，所述野生型人IgG Fc區是貝伐單抗的Fc區。在某些實施方案中，所述變體IgG包含重鏈可變域(SEQ ID NO :1)和輕鏈可變域(SEQ ID NO: 2)。在某些實施方案中，所述變體IgG包含重鏈可變域(SEQ ID NO 3)和輕鏈可變域(SEQ ID NO :4)。在某些實施方案中，所述變體IgG包含重鏈可變域(SEQ ID NO 7)和輕鏈可變域(SEQ ID NO 8)。本發明進一步公開了藥物組合物，其包含任何本文所述變體IgG和藥學可接受載體。在本文中還提供了試劑盒，其包含容器中的任何本文所述變體IgG和使用說明。在某些實施方案中，所述變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG相比延長了至少50%、100%、150%、200%、300%或更多。在某些實施方案中，所述變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG相比延長了至少2倍。在某些實施方案中，所述變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG相比延長了至少3倍。在某些實施方案中，所述變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG相比延長了至少4倍。在某些實施方案中，所述具有野生型人IgG Fc區的IgG是貝伐單抗。在某些實施方案中，所述變體IgG的半衰期是貝伐單抗的均值半衰期。在某些實施方案中，所述貝伐單抗的均值半衰期是約10至12天(如在獼猴中測量的)或約3周(如在人中測量的)。在某些實施方案中，提供了包含人IgG Fc區的變體IgG，其中所述人IgG Fc區相對於野生型人IgG Fc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基307和434處的胺基酸替代，其中所述變體IgG具有與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長的半衰期，且其中所述胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，而所述胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸進行的替代。在一個實施方案中，所述變體IgG是變體IgGl，其包含重鏈可變域(SEQ ID NO 1)和輕鏈可變域(SEQ ID NO :2)，且包含如下的人IgGl Fc區，相對於野生型人IgGlFc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基 307和434處的胺基酸替代，其中所述變體IgGl具有與具有野生型人IgGl Fc區的IgGl的半衰期相比延長的半衰期，且其中所述胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，而所述胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸進行的替代。在另一個實施方案中，提供了包含人IgG Fc區的變體IgG，其中所述人IgG Fc區相對於野生型人IgG Fc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基307和434處的胺基酸替代，其中所述變體IgG具有與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長的半衰期，且其中所述胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，而所述胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用絲氨酸進行的替代。在另一個實施方案中，提供了包含人IgG Fc區的變體IgG，其中所述人IgG Fc區相對於野生型人IgG Fc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基308和434處的胺基酸替代，其中所述變體IgGl具有與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長的半衰期，且其中所述胺基酸殘基308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代，而所述胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸進行的替代。在另一個實施方案中，提供了包含人IgG Fc區的變體IgG，其中所述人IgG Fc區相對於野生型人IgG Fc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基307、380和434 處的胺基酸替代，其中所述變體IgG具有與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長的半衰期，且其中所述胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，所述胺基酸殘基380處的胺基酸替代是用丙氨酸進行的替代，而所述胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用絲氨酸進行的替代。在某些實施方案中，上文所述包含人IgG Fc區的變體IgG具有比具有野生型人 IgG Fc區的IgG更高的對Fcfoi的結合親和力。在某些實施方案中，所述變體IgG在pH 6. 0 具有比在PH 7. 4更高的對Fcfoi的結合親和力。在某些實施方案中，所述變體IgG是人的或人源化的IgG。在某些實施方案中，所述變體IgG是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在某些實施方案中，所述變體IgG的IgG Fc區是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區。在某些實施方案中，所述變體IgG的IgG Fc區是IgGl Fc區。在某些實施方案中，所述變體IgG是抗VEGF 抗體。在某些實施方案中，所述變體IgG是貝伐單抗的變體。在某些實施方案中，所述具有野生型人IgG Fc區的IgG是貝伐單抗。在某些實施方案中，所述野生型人IgG Fc區是貝伐單抗的Fc區。在某些實施方案中，所述變體IgG包含重鏈可變域(SEQ ID NO 1)和輕鏈可變域(SEQ ID NO :2)。在某些實施方案中，在本文中提供了藥物組合物，其包含任何包含人IgG Fc區的變體IgG和藥學可接受載體。在本文中還提供了試劑盒，其包含容器中的任何包含人IgG Fc區的變體IgG和使用說明。在某些實施方案中，提供了包含人IgGl Fc區的變體IgG，其中所述變體IgG包含重鏈可變域(SEQ ID NO 1)和輕鏈可變域(SEQ ID NO :2)，且其中所述人IgGl Fc區相對於野生型人IgGl Fc區包含依照Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基434處的胺基酸替代，其中所述變體IgG具有與具有野生型人IgGl Fc區的IgG的半衰期相比延長的半衰期， 且所述變體IgG具有與具有野生型人IgGl Fc區的IgG對Fcfoi的結合親和力相比更高的對Fcfoi的結合親和力，且其中所述胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用組氨酸的替代。在某些實施方案中，所述變體IgG是變體IgGl。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG 的半衰期相比延長了至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100%。在一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長了至少 50%。在另一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG 的半衰期相比延長了至少75%。在又一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長了至少100%。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約15、20、25、30、35、或40 天。在一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約15天。在另一個實施方案中， 本發明的變體IgG的半衰期是至少約20天。在另一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約25天。在另一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約30天。在另一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約35天。在另一個實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約40天。在某些實施方案中，所述變體IgG是變體IgGl。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是在人中測量的半衰期。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是在獼猴(cynomolgus monkey)中測量的半衰期。 在某些實施方案中，所述野生型IgG或所述具有野生型人IgG !^c區的IgG是貝伐單抗。在某些實施方案中，貝伐單抗的半衰期是約10至12天(如在獼猴中測量的)或約20天(如在人中測量的)。在本發明中提供了多種使用IgG變體的方法。提供了治療受試者中的腫瘤的方法。例如，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何上文和本文所述變體IgG。在某些實施方案中，所述變體IgG是抗VEGF抗體。在某些實施方案中，所述變體IgG是貝伐單抗的變體。在某些實施方案中，所述方法進一步包括對所述受試者施用有效量的化療劑。在本發明中提供了抑制受試者中的VEGF活性的方法。例如，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何上文和本文所述變體IgG。在某些實施方案中，所述VEGF活性是血管發生。在本發明中提供了調控受試者中的血管通透性的方法。例如，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何上文和本文所述變體IgG。在本發明中提供了治療受試者中的非新生物病症(non-neoplastic disorder)的方法。例如，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何上文和本文所述變體IgG。在某些實施方案中，所述非新生物病症是自身免疫性疾病。在某些實施方案中，所述非新生物病症是阿爾茨海默氏病。在某些實施方案中，所述受試者診斷有老年性黃斑變性。在本發明中提供了治療受試者中的表達HER的腫瘤的方法。例如，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何上文和本文所述變體IgG。在某些實施方案中，所述變體 IgG包含重鏈可變域(SEQ ID NO 7)和輕鏈可變域(SEQ ID NO 8)。在本發明中提供了抑制或預防受試者中的癌細胞生長的方法。例如，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何上文和本文所述變體IgG。在本發明中提供了對受試者施用有效量的變體IgG的方法。這些施用方法可以與本文所述其它方法(例如治療方法)組合使用。在某些實施方案中，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何上文和本文所述變體IgG，且其中每4周或更長間隔對所述受試者施用所述變體IgG。在某些實施方案中，每5周或更長時間間隔施用所述變體IgG。在某些實施方案中，每6周或更長時間間隔施用所述變體IgG。在某些實施方案中，每7周或更長時間間隔施用所述變體IgG。在某些實施方案中，每8周或更長時間間隔施用所述變體 IgG。在某些實施方案中，每9周或更長時間間隔施用所述變體IgG。在某些實施方案中，每 10周或更長時間間隔施用所述變體IgG。在某些實施方案中，每11周或更長時間間隔施用所述變體IgG。在某些實施方案中，每12周或更長時間間隔施用所述變體IgG。在某些實施方案中，所述方法包括對所述受試者施用有效量的任何變體IgG，其中以比具有野生型人 IgG Fc區的IgG的推薦或規定劑量頻率(prescribed dosage frequency)要低的頻率施用所述變體IgG。在某些實施方案中，所述具有野生型人IgG Fc區的IgG是貝伐單抗。在某些實施方案中，以比貝伐單抗的規定劑量頻率要低的頻率施用所述變體IgG，例如貝伐單抗的變體。在某些實施方案中，變體IgG首先每2周施用，稍後每4周或更長時間間隔施用。 在某些實施方案中，變體IgG首先每3周施用，稍後每6周或更長時間間隔施用。在某些實施方案中，變體IgG首先每4周施用，稍後每8周或更長時間間隔施用。在某些實施方案中，變體IgG首先每5周施用，稍後每10周或更長時間間隔施用。在某些實施方案中，變體 IgG首先每6周施用，稍後每12周或更長時間間隔施用。在某些實施方案中，變體IgG (例如貝伐單抗的變體)首先以貝伐單抗的規定劑量頻率施用，之後以比貝伐單抗的規定劑量低的頻率施用。在本文所述方法的某些實施方案中，變體IgG是抗VEGF抗體。在一個實施方案中， 抗VEGF抗體包含重鏈可變域(SEQ ID NO 1)和輕鏈可變域(SEQ ID NO :2)。在另一個實施方案中，抗VEGF抗體是貝伐單抗的變體。在某些實施方案中，本發明的變體IgG靜脈內施用於受試者。在某些實施方案中， 本發明的變體IgG皮下施用於受試者。在本文所述方法的某些實施方案中，受試者是人。在某些實施方案中，受試者診斷有癌症。在某些實施方案中，所述癌症選自下組非小細胞肺癌、腎細胞癌、卵巢癌、成膠質細胞瘤、乳腺癌、和結腸直腸癌。在本文中還提供了治療受試者中的良性、癌前或非轉移性癌症的方法，其包括對該受試者施用有效量的變體IgG。在某些實施方案中，變體IgG的施用預防良性、癌前、或非轉移性癌症變成攻擊性(invasive)或轉移性癌症。例如，良性、癌前或非轉移性癌症可以是0期、I期、或II期癌症，而在某些實施方案中，變體IgG的施用預防良性、癌前或非轉移性癌症進展到下一期，例如I期、II期、III期或IV期癌症。在某些實施方案中，施用所述變體IgG的時間和量足以治療受試者中的良性、癌前、或非轉移性腫瘤或者預防良性、癌前、或非轉移性腫瘤變成攻擊性或轉移性癌症。在某些實施方案中，施用變體IgG降低良性、癌前、或非轉移性腫瘤的腫瘤尺寸、腫瘤負荷、或腫瘤數目。變體IgG還可以一定的量和時間施用以降低良性、癌前、或非轉移性腫瘤中的血管密度。如本文所述，本發明的方法可用於治療例如0期(例如原位癌)、I期、或II期癌症。新輔助療法和輔助療法可用於治療任何類型的癌症，例如良性或惡性。在本發明的某些實施方案中，所述癌症是實體瘤，包括但不限於結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃腸癌、頭頸癌、肝癌和軟組織癌(例如B細胞淋巴瘤諸如NHL和多發性骨髓瘤和白血病諸如慢性淋巴細胞性白血病)。在另一個實施方案中，良性、癌前、或非轉移性腫瘤是息肉、腺瘤、纖維瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、胰島素瘤、軟骨瘤、骨瘤、血管瘤、淋巴管瘤、腦脊膜瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、鱗狀細胞乳頭狀瘤、聽神經瘤、 神經纖維瘤、膽管囊瘤(cystanoma)、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、沙眼、肉芽腫、錯構瘤、移行細胞乳頭狀瘤、唾液腺的多形(pleiomorphic)腺瘤、硬纖維瘤(desmoid tumor)、 皮樣囊乳頭狀瘤(cystpapilloma)、囊腺瘤、灶性結節性增生、或結節再生性增生。在另一個實施方案中，該方法希望用於治療腺瘤。腺瘤的非限制性例子包括肝細胞(liver cell) 腺瘤、腎腺瘤、後腎腺瘤、支氣管腺瘤、肺泡(alveolar)腺瘤、腎上腺腺瘤、垂體腺瘤、甲狀旁腺腺瘤、胰腺腺瘤、唾液腺腺瘤、肝細胞(h印atocellular)腺瘤、胃腸腺瘤、管狀腺瘤 (tubular adenoma)、禾口膽管腺瘤。本發明的特徵還有如下的方法，其包括對受試者施用有效量的變體IgG以預防該受試者中良性、癌前、或非轉移性癌症的發生或復發。在本發明的某些實施方案中，受試者處於癌症、息肉、或癌症症候群的風險。在一個例子中，受試者具有癌症、息肉、或遺傳性癌症症候群的家族史。在本發明的某些方面，受試者處於形成良性、癌前、或非轉移性腫瘤的風險。在某些實施方案中，該方法預防從未具有腫瘤的受試者、從未具有臨床可檢測癌症的受試者、或只具有良性腫瘤的受試者中所述良性、癌前或非轉移性癌症的發生或復發。另一方面，提供了在受試者中預防癌症復發或降低癌症復發可能性的方法，其包括對該受試者施用變體IgG，其時間和量足以在該受試者中預防癌症復發或降低癌症復發可能性。本發明包括一種在具有腫瘤的受試者中預防癌症復發的方法，其包括除去該腫瘤 (例如使用確定性手術(definitive surgery))及然後對該受試者施用變體IgG的步驟。本
11發明包括在受試者中預防腫瘤再生長的方法，其包括除去該腫瘤(例如使用確定性手術) 及然後對該受試者施用變體IgG的步驟。在一個相關方面，本發明包括一種在受試者中預防癌症復發或在受試者中降低癌症復發可能性的方法，其任選包括對該受試者在手術前施用有效量的變體IgG，施用確定性手術，及在手術後施用有效量的變體IgG，其中所述在手術後施用變體IgG預防癌症復發或降低癌症復發可能性。在另一個相關方面，本發明包括一種在受試者中預防癌症復發或在受試者中降低癌症復發可能性的方法，其包括在任何別的抗癌治療劑缺失下對該受試者施用有效量的變體IgG，其中所述施用在受試者預防癌症復發或在受試者中降低癌症復發可能性。對於每一個上述方面，腫瘤可以是任何類型的腫瘤，包括但不限於實體瘤，特別是腫瘤和腺瘤，本文所述的。受試者可具有休眠腫瘤或微轉移，其可以是或不是臨床可檢測的。在此方面的一個實施方案中，施用所述變體IgG，其時間和量足以降低休眠腫瘤或微轉移的新血管形成。在另一個實施方案中，施用所述變體IgG，其時間和量足以預防臨床可檢測腫瘤或其轉移的發生，或延長受試者的存活持續時間。在一個實施方案中，變體IgG是單一療法。在另一個實施方案中，受試者先前經歷過對腫瘤的處理，例如使用抗癌療法。在一個例子中，抗癌療法是手術。在另一個實施方案中，受試者可在施用變體IgG之前、期間(例如同時)、或之後進一步用別的抗癌療法處理。 抗癌療法的例子包括但不限於手術、放射療法(放療)、生物療法、免疫療法、化療、或這些療法的組合。在受試者經歷過確定性手術的實施方案中，變體IgG—般在受試者自手術恢復一段時間之後施用。此時間段可包括傷口癒合或手術切口癒合所需要的時段、降低傷口開裂的風險所需要的時間段、或受試者回到與手術前的健康水平相比本質上相似或更好的健康水平所需要的時間段。確定性手術完成和第一次施用變體IgG之間的時段還可包括藥物假期所需要的時段，其中受試者在各治療方案間需要或要求一段時間。一般地，確定性手術完成和變體IgG療法開始之間的時間段可包括小於1周、1周、2周、3周、4周( 天)、5周、6 周、7周、8周、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、 2年、3年、或更長。在一個實施方案中，確定性手術和施用變體IgG之間的時段大於2周且小於1年。在一個實施方案中，確定性手術和施用變體IgG之間的時段大於4周( 天)。在某些實施方案中，每一個上述方面可進一步包括對受試者監測癌症復發。本發明還提供了手術切除受試者例如人患者中可手術癌症之前新輔助療法的方法，包括對患者施用有效量的變體IgG，其中該患者已經診斷有腫瘤或癌症。變體IgG可以單獨地或與至少一種化療劑組合地施用。本發明還包括一種治療有可手術癌症的受試者的方法，其包括在手術之前對該受試者施用有效量的變體IgG，然後實施手術，由此切除癌症。在一個實施方案中，該方法進一步包括在手術之後對該受試者施用有效量的變體IgG以預防癌症復發。在另一個方面，本發明關注一種新輔助療法的方法，包括在確定性手術之前對有可手術癌症的受試者施用有效量的變體IgG和至少一種化療劑。在另一個方面，本發明包括一種在具有不可切除腫瘤的受試者中縮小腫瘤尺寸的方法，包括對該受試者施用有效量的變體IgG，其中該施用縮小腫瘤尺寸，由此容許完全切除腫瘤。在一個實施方案中，該方法進一步包括在完全切除腫瘤之後對該受試者施用有效量的變體IgG。在另一個方面，本發明關注一種在受試者中治療癌症的方法，包括下述步驟a) 包含多個處理周期的第一階段，其中每個周期包含以預定間隔對受試者施用有效量的變體 IgG和至少一種化療劑；b)確定性手術，由此除去癌症；和C)包含多個維持周期的第二階段，其中每個周期包含以預定間隔在沒有任何化療劑的情況下對受試者施用有效量的變體 IgG。在一個實施方案中，第一階段包含第一多個處理周期(first plurality of treatment cycle)，其中施用變體IgG和第一化療方案，接著是第二多個處理周期(second plurality of treatment cycle)，其中施用變體IgG和第二化療方案。本發明提供了方法，包括在確定性手術後對有轉移性或非轉移性癌症的受試者施用有效量的變體IgG。在某些實施方案中，該方法進一步包括使用至少一種化療劑。在一個方面，該方法包括下述步驟a)包含多個處理周期的第一階段，其中每個周期包括以預定間隔對受試者施用有效量的變體IgG和至少一種化療劑；和b)包含多個維持周期的第二階段，其中每個周期包括以預定間隔在沒有任何化療劑的情況下對受試者施用有效量的變體IgG。在一個實施方案中，第一階段包括第一多個處理周期，其中施用變體 IgG和第一化療方案，接著是第二多個處理周期，其中施用變體IgG和第二化療方案。在某些實施方案中，變體IgG是結合VEGF或降低VEGF表達或生物學活性的抗 VEGF抗體。抗VEGF抗體或其抗原結合片段可以是單克隆抗體、嵌合抗體、完全人的抗體、 或人源化抗體。在某些實施方案中，在本發明的方法中有用的例示性抗體包括貝伐單抗 (AVASTIN )、G6-31、B20-4. 1、B20_4. 1. 1、及其片段。在某些實施方案中，變體IgG是人源化抗HER2單克隆抗體HERCEPTIN 。在某些實施方案中，變體I gG是嵌合抗CD20抗體Rituxan 、抗I gE抗體X0LAIR 、抗 CD20 抗體、抗 CDlla 抗體Raptiva 、抗 Her2 抗體Omnitarg 、抗 oxLDL 抗體、抗 CD4 抗體MTRX1011A、抗HCV抗體、抗IL-17A/F抗體、抗A-β抗體、抗DR6抗體、抗人巨細胞病毒 (HCMV)抗體、抗HER受體家族抗體、抗組織因子抗體、MLN-02抗體、人源化抗⑶18F(ab' )2 抗體、或人源化抗IgE IgGl抗體rhuMab-E25。在某些實施方案中，變體IgG是雙特異性抗體，其中靶抗原是IL-4和IL-13。在某些實施方案中，變體IgG是靶向金黃色葡萄球菌表位的抗體。雖然可以在施用變體IgG之前、期間、或之後以多種不同方式處理受試者，但是在某些實施方案中，在沒有手術或化療的情況下處理受試者。在其它實施方案中，用變體IgG 進行的處理是單一療法或對於變體IgG治療期間的時間段是單一療法，如臨床醫生所評估的或本文所述的。在其它實施方案中，用變體IgG進行的處理與別的抗癌療法組合，包括但不限於手術、放射療法、化療、區別療法(differentiating therapy)、生物療法、免疫療法、血管發生抑制劑、和抗增殖化合物。用變體IgG進行的治療還可包括上述類型的治療方案的任何組合。在某些實施方案中，細胞毒劑、抗血管發生劑和抗增殖劑可以與變體IgG組合使用。 在一個實施方案中，抗癌療法是化療。在某些實施方案中，所述化療劑和變體IgG並行施用。在某些實施方案中，本發明的方法在治療和預防早期腫瘤，由此預防進展成更晚期，導致與晚期癌症有關的發病率和死亡率降低中是有利的。本發明的方法在預防腫瘤復發或腫瘤再生長，例如切除原發性腫瘤後持續存在的休眠腫瘤中，或者在降低或預防微轉移的發生或增殖中也是有利的。對於本發明的方法，所述癌症可以是實體瘤，例如諸如乳腺癌、結腸直腸癌、直腸癌、肺癌、腎細胞癌、膠質瘤(例如間變性(anaplastic)星形細胞瘤、間變性少突星形細胞瘤(oligoastrocytoma)、間變性少突神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤)、腎癌、前列腺癌、 肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、類癌、頭頸癌、黑素瘤、和卵巢癌。本發明的方法還可包括對受試者監測癌症或腫瘤復發。根據詳述、附圖、和權利要求，本發明的其它特徵和優點會是顯而易見的。本文所述任何實施方案或任何其組合適用於本文所述發明的任何和所有變體IgG 和方法。附圖簡述

圖1小圖A-B 在pH 6. 0抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF變體對人Fcfoi的結合。 實施了兩次分開的實驗，其中在晶片上偶聯不同水平的Fcfoi。對於每次實驗運行，將穩態響應單位作為變體濃度的函數繪圖以評估解離常數。 圖2 在pH 6. 0抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF變體對人Fcfoi的解離常數。Kd是自圖1所示兩次不同實驗運行評估的。圖3 在pH 7. 4抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF變體對人Fcfoi的結合。將穩態響應單位作為抗VEGF變體濃度的函數作圖。圖4小圖A-D 抗VEGF野生型和抗VEGF變體對(A)人Fcfoi在pH 6. 0，(B)人Fcfoi 在pH 7. 4，(C)獼猴Fcfoi在pH 6. 0及(D)獼猴Fcfoi在pH 7. 4的結合。圖5 在pH 6. 0和25°C各種抗VEGF變體對人Fcfoi的動力學參數和單價解離常數 (Kd)。結果代表三次獨立實驗。圖6 在pH 6. 0和25°C多種抗VEGF變體對獼猴Fcfoi的動力學參數和單價解離常數(Kd)。結果代表三次獨立實驗。圖7小圖A-B 在不同pH (A)人Fcfoi和(B)獼猴Fcfoi對不同抗VEGF變體的解離速率(koff)。圖8 抗VEGF變體相對於抗VEGF野生型的人Fcfoi親和力改善的匯總。數據是自圖4和5匯總的。圖 9 小圖 A-B (1)抗 VEGF 野生型及抗 VEGF 變體(2) N434H、(3) T307Q/N434A、(4) T307Q/N434S、(5) T307Q/E380A/N434S 和(6) V308P/N434A 的 VEGF 結合。(A)抗體的 VEGF 結合是通過在37°C在經VEGF-A109包被的傳感器晶片上注射抗VEGF野生型和抗VEGF變體，使用BIAcore 3000測定的。(B) 50nM和IOOnM注射的傳感圖。使每個傳感器基線偏移4RU以得到更好的視圖。圖10 AVASTIN 、抗VEGF野生型(貝伐單抗)和抗VEGF變體的體外HUVEC增殖抑制。人臍帶血管內皮細胞(HUVEC)在存在VEGF和多種濃度的抗VEGF抗體下培養。評估培養4天後的存活力。圖11 :IV單劑5mg/kg後，抗VEGF野生型和五種抗VEGF變體在獼猴中的藥動學概況。抗體的血清濃度是通過ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差(n = 12隻動物 /組，例外是V308P/N434A組有11隻動物)。
圖12 IV單劑5mg/kg後，抗VEGF野生型和五種抗VEGF變體在獼猴中的藥動學參數。圖13 該圖顯示了抗VEGF野生型和五種抗VEGF變體在獼猴中的終末半衰期與pH 6. OFcRn親和力之間的相關性。誤差棒代表每組11或12隻動物的標準偏差。圖14小圖A-B =IV單劑0. 3或5mg/kg後，抗VEGF野生型和抗VEGF變體T307Q/ N434A在人源化VEGF轉基因小鼠中的藥動學概況。抗體的血清濃度是使用(A)VEGF捕捉 ELISA或(B)人Fc捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。圖15 IV單劑0. 3或5mg/kg後，抗VEGF野生型和抗VEGF變體T307Q/N434A在人源化VEGF轉基因小鼠中的藥動學參數。圖16小圖A-B 多劑0. 3或5mg/kg後，抗VEGF變體T307Q/N434A在人源化VEGF 轉基因小鼠中的藥動學概況。抗體在第0，3，6和9天施用。抗體的血清濃度是使用(A) VEGF 捕捉ELISA或(B)人Fc捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。圖17 在第 0，3，6 和 9 天 IV 四劑 0. 3 或 5mg/kg 後，T307Q/N434A 在人源化 VEGF 轉基因小鼠中的藥動學參數。圖18小圖A-C 抗VEGF野生型和T307Q/N434A (QA)變體在治療HM-7異種移植物 s. c植入RAG2K0 ；hum-X VEGF KI雙重純合小鼠中的功效。5mg/kg和0. 5mg/kg野生型和 T307Q/N434A變體和5mg/kg抗豚草對照每周兩次腹膜內施用。(A)HM_7腫瘤的生長曲線。 數據表述為均值士標準誤差。(B)O. 5和0. 05mg/kg處理組的HM-7腫瘤生長曲線。(C)處理結束時的血清抗VEGF抗體濃度(抗豚草的第18天和抗VEGF處理組的第21天)。濃度是使用VEGF捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。圖19小圖A-E 抗VEGF野生型和T307Q/N434A (QA)變體在治療HM-7異種移植物 s. c植入RAG2K0 ；hum-X VEGF KI雙重純合小鼠中的一項重複功效研究。5，0· 5和0. 05mg/ kg野生型和T307Q/N434A變體和5mg/kg抗豚草對照每周兩次腹膜內施用。(A) HM-7腫瘤的生長曲線。數據表述為均值士標準誤差。出)0.5和0.05!^/1^處理組的圓-7腫瘤生長曲線。數據表述為均值士標準誤差。(C)處理結束時測定的HM-7腫瘤終末重量(抗豚草的第16天，0. 05mg/kg組的第19天，和其餘組的第22天)。數據表述為均值士標準誤差。 (D)處理結束時的血清抗VEGF抗體濃度。濃度是使用人Fc捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。(E)腫瘤中相對於血液中抗體濃度之比。腫瘤抗體濃度是通過測量腫瘤溶胞物總量和腫瘤溶胞物中的抗VEGF抗體量而確定的。數據表述為均值士標準偏差。圖20小圖A-D 抗VEGF野生型和T307Q/N434A (QA)變體在治療HM_7異種移植物 s. c植入RAG2K0 ；hum-X VEGF KI雙重純合小鼠中的第三項功效研究。5，0· 5和0. 05mg/kg 野生型和T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草對照每周兩次腹膜內施用。(A)處理結束時每個組的均值腫瘤體積(第22天)。數據表述為均值士標準誤差。(B)HM-7腫瘤的終末重量。 數據表述為均值士標準誤差。(C)處理結束時的血清抗VEGF抗體濃度。濃度是使用抗人 Fc捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。(D)腫瘤中相對於血液中抗體濃度之比。腫瘤抗體濃度是通過測量腫瘤溶胞物總量和腫瘤溶胞物中的抗VEGF抗體量而確定的。數據表述為均值士標準偏差。圖21小圖A-D 抗VEGF野生型和T307Q/N434A (QA)變體在治療HT-55異種移植物s. c植入RAG2K0 ；hum-X VEGF KI雙重純合小鼠中的功效。5，0. 5和0. 05mg/kg野生型和
15T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草對照每周兩次腹膜內施用。(A)HT_55腫瘤的生長曲線。數據表述為均值士標準誤差。(B)處理結束時測定的HT-55腫瘤終末重量(第35天)。數據表述為均值士標準誤差。(C)處理結束時的血清抗VEGF抗體濃度。濃度是使用人Fc捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。(D)腫瘤中相對於血液中抗體濃度之比。 腫瘤抗體濃度是通過測量腫瘤溶胞物總量和腫瘤溶胞物中的抗VEGF抗體量而確定的。數據表述為均值士標準偏差。圖22小圖A-E 抗VEGF野生型和T307Q/N434A (QA)變體在治療Colo_205異種移植物s. c植入RAG2K0 ；hum-X VEGF KI雙重純合小鼠中的功效。5,0. 5和0. 05mg/kg野生型和T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草對照每周兩次腹膜內施用。(A) Colo-205腫瘤的生長曲線。數據表述為均值士標準誤差。(B)O. 5和0. 05mg/kg處理組的Colo-205腫瘤生長曲線。(C)處理結束時測定的Colo-205腫瘤終末重量(第38天)。數據表述為均值士標準誤差。(D)處理結束時的血清抗VEGF抗體濃度。濃度是使用人Fc捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。(E)腫瘤中相對於血液中抗體濃度之比。腫瘤抗體濃度是通過測量腫瘤溶胞物總量和腫瘤溶胞物中的抗VEGF抗體量而確定的。數據表述為均值士標準偏差。圖23小圖A-D 抗VEGF野生型和T307Q/N434A (QA)變體在治療Colo-205異種移植物中的一項重複功效研究。5，0. 5和0. 05mg/kg野生型和T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草對照每周兩次腹膜內施用。(A)Colo-205腫瘤的生長曲線。數據表述為均值士標準誤差。 (B)O. 5和0. 05mg/kg處理組的Colo-205腫瘤生長曲線。(C)處理結束時測定的Colo-205 腫瘤終末重量(第32天)。數據表述為均值士標準誤差。(D)處理結束時的血清抗VEGF 抗體濃度。濃度是使用人Fc捕捉ELISA測量的。數據表述為均值士標準偏差。圖在pH 6. 0和25°C，使用BIAcore，抗HER2(曲妥單抗)IgGlFc變體對人Fcfoi 的單價解離常數(Kd)。結果代表兩次獨立實驗。圖25 =Fcfoi在不同人腫瘤細胞系中的表達水平。每種細胞系的切106個細胞用於實驗。Raji細胞(人B細胞淋巴瘤)用作陰性對照，而可溶性人Fcfoi蛋白(其缺失ADa 跨膜和胞質區)作為陽性對照印跡。可溶性Fcfoi蛋白的稀釋液用作標準來定量Fcfoi表達水平。本文所示結果代表至少三次獨立實驗。圖沈抗HER2(曲妥單抗)IgGlFc變體對人Fcfoi的pH依賴性結合。變體是以 L251、L314、和E430處的突變構建的。結合是在6至7. 2範圍的pH使用BIAcore在25°C 測量的。確定變體相對於抗HER2 IgGl野生型的親和力之比，並作為pH的函數繪圖。圖27 小圖 A-C 在(A) pH 6.0，(Β)ρΗ 7. 1，禾口 (C)pH 7. 4，抗 HER2 (曲妥單抗)IgGl 野生型、變體 T307Q/N434A、變體 L251D/T307Q/N4;34H 和變體 L251D/T307Q/M^8L/N4;MH/ Y4361對人Fcfoi的結合。結合是使用BIAcore在25°C測量的。在圖27C中在pH 7. 4檢測不到變體L251D/T307Q/N4;34H對人FcRn的結合。圖觀在不同pH，人Fcfoi對多種抗VEGF和抗HER2變體的解離速率(k。ff)。抗 VEGF 變體為 T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434S 和 V308P/N434A。抗 HER2 變體為L251D/T307Q/M^8L/N434H/W36I。為每種變體將在不同pH的k。ff對pH進行擬合，以產生最佳擬合線的斜率(方程log(k。ff)=斜率χ pH+y-截距)。發明詳述
本發明涉及域(包括那些在抗體、融合物、和免疫粘附素中找到的)的新變體，其具有延長的體內半衰期。這些變體包含人IgG 區或其結合1 ! 的片段，其相對於野生型人IgG Fc區含有一處或多處胺基酸修飾，該修飾提高IgG 區或其片段對1 ! 的親和力。本文中描述或提到的技術和規程一般得到了本領域技術人員的充分理解，而且通常利用常規方法得以釆用，諸如例如廣泛應用的方法，記載於Sambrook et al. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y. ；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M.Ausubel,et al. eds. , (2003)) ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY(Academic Press, Inc. ) :PCR 2 :APRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson，B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))， Harlow and Lane， eds. (1988)ANTIBODIES， A LABORATORY MANUAL， and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)) ；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.，1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook (J. E. Cellis，ed.，1998)Academic Press ；Animal Cell Culture(R. I.Freshney), ed.,1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather and P. E. Roberts，1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds.，1993-8) J. Wiley and Sons ；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwel 1, eds.) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller and M. P. Calos，eds.，1987)； PCR :The Polymerase Chain Reaction，(Mullis et al. ,eds. ,1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al.，eds.，1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999) ；Immunobiology(C. A. Janeway and P. Travers，1997)； Antibodies(P. Finch，1997) ；Antibodies :A Practical Approach(D· Catty.，ed.， IRL Press，1988-1989) ；Monoclonal Antibodies :A Practical Approach(P.Shepherd and C. Dean, eds. , Oxford University Press，2000) ；Using Antibodies :A Laboratory Manual(E. Harlow and D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999) ；The Antibodies(M. Zanetti and J. D. Capra, eds.，Harwood Academic Publishers，1995)； Cancer -Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al.，eds.，J. B. Lippincott Company,1993)。除非另有定義，本文中所使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。以下文獻為本領域技術人員提供了本申請中所使用的許多術語的一般性指導:Singleton et al.，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.，J. Wiley & Sons(New York，N. Y. 1994)及 March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure 4th ed.，John Wiley & Sons(New York，N. Y. 1992)。通過述及而完整收錄本文中引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物。^X為了解釋本說明書的目的，應用以下定義，而且在任何適宜的時候，以單數使用的術語也會包括複數，反之亦然。應當理解本文中所使用的術語只是為了描述具體實施方案， 並非意圖限制。在下文所列任何定義與通過述及而收入本文的任何文件牴觸的情況中，應當以下文所列定義為準。貫穿本說明書和權利要求書，免疫球蛋白重鏈中的殘基編號方式是如Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)(通過述及明確收入本文)中的EU索引的編號方式。「如Kabat中的EU索引」指人IgG1EU抗體的殘基編號方式。如本文中使用的，術語「體內半衰期」或「抗體體內半衰期」指特定類型IgG分子或其含有Fcfoi結合位點的片段在給定動物的循環中的生物學半衰期，而且表述為分子的循環濃度降低50%所需要的時間。在某些實施方案中，當給定IgG的濃度作為時間的函數繪圖時，所述曲線通常是兩階段的，有快速的α期(其代表血管內空間和血管外空間之間所注射IgG分子的平衡)和更長的β期(其代表自血管內空間清除IgG分子)。在某些實施方案中，術語「體內半衰期」對應於IgG分子在β期中的半衰期。在某些實施方案中，給定IgG的濃度對時間曲線是三階段的，相應分配成α期和β期，及終末清除(以Y期表示)。因此，在某些實施方案中，體內半衰期對應於終末清除期或Y期的半衰期。在某些實施方案中，給定IgG的濃度對時間曲線是單階段的，有單個清除期。因此，在某些實施方案中，體內半衰期對應於單一清除期的半衰期。如本文中使用的，「親本多肽」或「野生型多肽」意指未修飾多肽、天然存在多肽、或天然存在多肽的經改造經修飾形式(其與本文公開的變體IgG相比缺少一處或多處本文公開的Fc區胺基酸修飾且在效應器功能方面不同)。親本多肽可包含天然序列Fc區或具有現有胺基酸序列修飾(諸如添加、刪除和/或替代)的Fc區。親本多肽還可包含下文所述非天然胺基酸。親本多肽可以指多肽自身、包含該親本多肽的組合物、或編碼它的胺基酸序列。親本多肽包括但不限於親本免疫球蛋白、野生型免疫球蛋白、親本抗體和野生型抗體。因而，如本文中使用的，「親本免疫球蛋白」、「親本IgG」、「野生型免疫球蛋白」或 「野生型IgG」意指未修飾免疫球蛋白、天然存在免疫球蛋白、或天然存在免疫球蛋白的經改造經修飾形式(其與本文公開的變體IgG相比缺少一處或多處本文公開的Fc區胺基酸修飾且在效應器功能方面不同)。親本免疫球蛋白可包含天然序列Fc區或具有現有胺基酸序列修飾(諸如添加、刪除和/或替代)的Fc區。親本免疫球蛋白還可包含下文所述非天然胺基酸。親本免疫球蛋白可以指免疫球蛋白自身、包含親本免疫球蛋白的組合物、或編碼它的胺基酸序列。如本文中使用的，「親本抗體」或「野生型抗體」意指未修飾抗體、天然存在抗體、 或天然存在抗體的經改造經修飾形式(其與本文公開的變體IgG相比缺少一處或多處本文公開的Fc區胺基酸修飾且在效應器功能方面不同)。親本抗體可包含天然序列Fc區或具有現有胺基酸序列修飾(諸如添加、刪除和/或替代)的Fc區。親本抗體還可包含下文所述非天然胺基酸。親本抗體可以指抗體自身、包含親本抗體的組合物、或編碼它的胺基酸序列。在某些實施方案中，「親本IgG」、「親本抗體」、「野生型IgG」、或「野生型抗體」包括但不限於已知的商業性的、重組生產的本文所述抗體。在某些實施方案中，野生型IgG是具有野生型人IgG Fc區的IgG。在某些實施方案中，野生型人IgG Fc區指缺少一處或多處本文公開的Fc區胺基酸修飾的Fc區。在某些實施方案中，野生型人IgG Fc區指具有一處或多處本文未公開的Fc區胺基酸修飾的Fc區。在某些實施方案中，野生型IgG是貝伐單抗。在某些實施方案中，野生型抗體是不含Fc區的抗體片段。在某些實施方案中，此類野生型抗體的變體IgG是Fc融合蛋白，其包含野生型抗體的Fab域片段或非抗體蛋白的一個或多個域，及包含一處或多處本文公開的Fc區修飾的Fc域片段。在某些實施方案中，野生型人 IgG Fc區指具有Fc突變L251D或L251D/434H但沒有其它本文中公開的Fc區胺基酸修飾的IgG Fc區。如本文中使用的，「變體」、「變異蛋白質」或「蛋白質變體」意指由於至少一處胺基酸修飾而與親本蛋白質不同的蛋白質。蛋白質變體可以指蛋白質自身、包含蛋白質的組合物、或編碼它的胺基酸序列。在某些實施方案中，蛋白質變體與親本多肽相比具有至少一處胺基酸修飾，例如約1處至約10處胺基酸修飾。在某些實施方案中，蛋白質變體在IgG Fc 區中具有至少2處胺基酸修飾。在某些實施方案中，蛋白質變體在IgG Fc區中具有至少3 處胺基酸修飾。本文中的蛋白質變體序列會與親本蛋白質序列優選擁有至少約80%同一性，和最優選至少約90%同一性，更優選至少約95%同一性。蛋白質變體還可包含下文定義的非天然胺基酸。術語「蛋白質變體」包括本文所述免疫球蛋白變體和抗體變體。如本文中使用的，術語「免疫球蛋白變體」、「變異免疫球蛋白」、「變體IgG」或「IgG 變體」意指由於至少一處胺基酸修飾而與親本或野生型免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。在某些實施方案中，變體IgG相對於野生型IgG在Fc區中具有至少2處胺基酸修飾。 在某些實施方案中，變體IgG相對於野生型IgG在Fc區中具有至少3處胺基酸修飾。在某些實施方案中，變體IgG是變異抗體。在某些實施方案中，變體IgG是抗VEGF抗體。在一個實施方案中，變體IgG是在抗體的Fc區中包含一處或多處胺基酸修飾的貝伐單抗變體。如本文中使用的，「抗體變體」或「變異抗體」意指由於至少一處胺基酸修飾而與親本抗體不同的抗體。在某些實施方案中，變異抗體相對於野生型抗體在Fc區中具有一處或多處胺基酸修飾。如本文中使用的，「位置」意指蛋白質的序列中的定位。位置可以連續地，或依照已確立的形式(例如Kabat中的EU索引)來編號。術語「含Fc區的多肽」或「Fe多肽」指包含整個或部分Fc區的多肽。例如，Fc多肽包括抗體、Fc融合物、分離的Fe、和Fc片段。「含Fc區的抗體」指包含Fc區的抗體。Fc區的C-末端賴氨酸(依照EU編號系統的殘基447)可以消除，例如在純化抗體的過程中或者通過重組改造編碼抗體的核酸。因此，包含具有Fc區的抗體的組合物可包含具有K447的抗體、消除了所有K447的抗體、或具有與沒有K447殘基的抗體的混合物。「胺基酸修飾」指預定胺基酸序列的胺基酸序列中的改變。例示性修飾包括胺基酸替代、插入和/或刪除。在某些實施方案中，胺基酸修飾是替代。指定位置(例如Fc區的)處的「胺基酸修飾」指指定殘基的替代或刪除，或指定殘基附近至少一個胺基酸殘基的插入。指定殘基「附近」的插入意味著其一個至兩個殘基內的插入。插入可以在指定殘基的N端或C端。「胺基酸替代，，指用另一種不同的「替換，，胺基酸殘基替換在預定胺基酸序列中的至少一個現有胺基酸殘基。一個或多個替換殘基可以是「天然存在胺基酸殘基」(即由遺傳密碼所編碼的)，並且選自下組丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬醯胺(Asn)；天冬氨酸 (Asp)；半胱氨酸(Cys)；穀氨醯胺(Gln)；穀氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)； 絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)。在某些實施方案中，替換殘基不是半胱氨酸。本文中胺基酸替代的定義還涵蓋用一種或多種非天然存在胺基酸殘基進行的替代。「非天然存在胺基酸殘基」指能夠與多肽鏈中的相鄰胺基酸殘基共價結合的、在上文所列的那些天然存在胺基酸殘基以外的殘基。非天然存在胺基酸殘基的例子包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸及其它胺基酸殘基類似物，諸如那些記載於下列文獻的，Ellman et al. Meth. Enzym. 202 :301-336 (1991)；美國專利 No. 6，586，207 ;W0 98/48032 ；WO 03/073238 ；美國公開 No. 2004-0214988A1 ；WO 05135727A2 ；WO 05/74524A2 ； J. W. Chin et al. , (2002) , Journal of the American Chemical Society 124 9026-9027 ;J. W. Chin,& P.G. Schultz, (2002)，ChemBioChem 11 :1135-1137 ;J. W. Chin, et al.，(2002)，PICAS United States of America 99 :11020_11024，都通過述及而完整收錄。「胺基酸插入」指將至少一個胺基酸摻入預定胺基酸序列。雖然插入通常會由一個或兩個胺基酸殘基的插入組成，但是本申請涵蓋更大的「肽插入」，例如約3個至約5個或甚至多達約10個胺基酸殘基的插入。所插入的殘基可以是上文所公開的天然存在的或非天然存在的。「胺基酸刪除」指從預定胺基酸序列除去至少一個胺基酸殘基。在某些實施方案中，術語「延長」、「延長的半衰期」或「延長的體內半衰期」指根據標準本領域已知方法諸如本文所述那些的檢測，與野生型IgG或具有野生型人IgG Fc區的 IgG相比，本發明的變體IgG的體內半衰期總體延長至少約25%，30%，40%，50%，60%， 70%，75%，80%，85%，90%，95%，100%，150%，200%，300%或更多。在某些實施方案中， 術語延長指變體IgG的延長的體內半衰期，其中與野生型IgG或具有野生型人IgG Fc區的 IgG相比，延長至少約1. 25Χ，1· 5Χ，1· 75Χ，2Χ，；《，4Χ，5Χ或10Χ或更多。在某些實施方案中， 野生型IgG或具有野生型人IgG Fc區的IgG是貝伐單抗。在某些實施方案中，貝伐單抗的均值半衰期是約10至12天(如在獼猴中測量的)或約20天(如在人類中測量的)。「鉸鏈區」通常定義為自人IgGl的Glu216至ftx)230的區段(Burton，Molec. Immunol. 22 161-206 (1985)) 0其它IgG同種型的鉸鏈區可以通過將第一個和最後一個形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置於相同位置而與IgGl序列對比。Fc區的「較低位置處鉸鏈區(lower hinge region) 」通常定義為緊挨著鉸鏈區 C-末端的一段殘基，即Fc區的殘基233-239。在本發明之前，FcyR結合一般歸功於IgG Fc區的較低位置處鉸鏈區中胺基酸殘基。「Clq」指包含供免疫球蛋白Fc區結合的位點的多肽。Clq與兩種絲氨酸蛋白酶即 Clr和Cls —起形成複合物Cl，即補體依賴性細胞毒性(⑶C)途徑的第一組分。人Clq可購自例如 Quidel, San Diego, Calif。術語「結合結構域」指多肽中能結合另一分子的區域。在FcR的情況中，結合結構域可以包含其多肽鏈(例如其α鏈)中負責Fc區結合的部分。一種有用的結合結構域是 FcR α鏈的胞外結構域。本文中術語「抗體」以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現出期望的生物學活性。「分離的」抗體指已經鑑定且自其天然環境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環境的汙染性成分指將會干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在有些實施方案中，將抗體純化至(1)根據例如 Lowry法的測定，抗體重量超過95%，而在有些實施方案中，重量超過99%，(2)足以通過使用例如轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部胺基酸序列的程度，或C3)根據還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍或銀染色，達到同質。既然抗體天然環境的至少一種成分不會存在，那麼分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來製備。「天然抗體」指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構成的約 150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變域(Vh)，接著是多個恆定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(VJ，而另一端是一個恆定域。輕鏈的恆定域與重鏈的第一恆定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認為特定的胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。術語「恆定域」指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相對於免疫球蛋白的其它部分，即含有抗原結合位點的可變域，具有更加保守的胺基酸序列。恆定域含有重鏈的Ch1、Ch2 和Ch3域及輕鏈的CHL域。抗體的「可變區」或「可變域」指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結構域。重鏈的可變域可以稱為「VH」。輕鏈的可變域可以稱為「VL」。這些結構域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結合位點。術語「可變的」指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用於每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性並非均勻分布於抗體的整個可變域。 它集中於輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(HVR)的三個區段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區，它們大多採取β-摺疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成β-摺疊片結構一部分的三個HVR連接。 每條鏈中的HVR通過FR區非常接近的保持在一起，並與另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, H 5 fiji, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。 11 : ^^ 接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞的細胞毒性中的參與。根據其恆定域的胺基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。如本文中使用的，術語IgG 「同種型」或「亞類」意指由其恆定區的化學和抗原特徵定義的任何免疫球蛋白亞類。根據其重鏈恆定域的胺基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恆定域分別稱作α、 δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的，一般性描述於例如 Abbas et al.，Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co.，2000)。 抗體可以是抗體與一種或多種其它蛋白質或肽共價或非共價連接而形成的更大融合分子的一部分。如本文中使用的，術語「IgG亞類修飾」意指將一種IgG同種型的一個胺基酸轉變成一種不同的、比對的IgG同種型中的相應胺基酸的胺基酸修飾。例如，因為在EU位置四6 處IgG1包含酪氨酸而IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y替代被認為是IgG亞類修飾。如本文中使用的，「非天然存在修飾」意指非同種型的胺基酸修飾。例如，因為無一 IgG在位置332處包含穀氨酸，所以IgGplgG2、IgG3、或IgG4中位置332處用穀氨酸進行的替代(332E)被認為是非天然存在修飾。術語「全長抗體」和「完整抗體」在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體。 該術語具體指重鏈包含Fc區的抗體。「裸抗體(裸露的抗體)」為本發明目的指未偶聯細胞毒性模塊或放射性標記物的抗體。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，優選包含其抗原結合區。在某些實施方案中， 抗體片段包含Fc區或部分Fc區，其包含一處或多處本文中公開的Fc區修飾。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各自具有一個抗原結合位點，及一個剩餘的「Fe」片段，其名稱反映了它易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生一個F (ab' )2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。「Fv」是包含完整抗原結合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類由緊密、非共價結合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(SCFV) 種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連接，使得輕鏈和重鏈可以在與雙鏈Fv種類類似的「二聚體」結構中相結合。正是在這種構造中，每個可變域的三個HVR相互作用而在二聚體表面上限定了一個抗原結合位點。六個HVR —起賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的三個 HVR的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，只是親和力低於完整結合位點。Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域 (CHl)0Fab'片段與Fab片段的不同之處在於重鏈CHl結構域的羧基末端增加了少數殘基， 包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對其中恆定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' ) 2抗體片段最初是作為在Fab 『片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在於一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在Vh與八結構域之間進一步包含多肽接頭， 其使得scFv能夠形成結合抗原的期望結構。關於scFv的綜述參見例如Plilckthim，於 《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer-Verlag, New York, 1994，第 269—315 頁。術語「雙抗體」指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(\)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整的記載於例如 EP 404,097 ；WO 1993/01161 ；Hudson et al.，Nat. Med. 9 :129-134(2003)；及 Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四抗體 (tetrabody)也記載於 Hudson et al.，Nat. Med. 9 129-134 Q003)。術語「單克隆抗體」在用於本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此， 修飾語「單克隆」表明抗體不是分立的抗體的混合物的特徵。在某些實施方案中，此類單克隆抗體典型的包括包含結合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序列在內的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應當理解， 所選擇的靶物結合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結合序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其在體內的免疫原性、創建多特異性抗體等，而且包含改變後的靶物結合序列的抗體也是本發明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不同，單克隆抗體製備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體製備物的優勢在於它們通常未受到其它免疫球蛋白的汙染。修飾語「單克隆」表明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特徵，不應解釋為要求通過任何特定方法來生產抗體。例如，將依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler and Milstein, Nature, 256 :495-97 (1975) ；Hongo et al. , Hybridoma,14(3) :253-260 (1995), Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988) ；Hammerling et al., 於Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y. , 1981)) > 重組DNA法(參見例如美國專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(參見例如Clackson et al.，Nature 352 :624-628(1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581-597(1992)； Sidhu et al.，J. Mol. Biol. 338(2) :299-310(2004) ；Lee et al.，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093(2004) ；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34) :12467-12472(2004)； Lee etal.，J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 O004))、及用於在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；WO 1991/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255—258(1993) ；Bruggemann et al. , Year in Immuno. 7 :33(1993)；美國專利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；和 5，661，016 ；Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg et al. , Nature 368:856-859(1994)； Morrison, Nature 368 :812-813(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14 845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 :826 (1996) ；Lonberg and Huszar,
23Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括「嵌合」抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(參見例如美國專利No. 4，816，567 ； Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，其中抗體的抗原結合區衍生自通過例如用感興趣抗原免疫獼猴而生成的抗體。非人(例如鼠)抗體的「人源化式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的HVR殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔、或非人靈長類動物的HVR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的FR殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。 可以進行這些修飾來進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環對應於非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恆定區。更多細節參見例如Jones et al., Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al. ,Nature 332 :323-329(1988) ；^P Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。還可參見例如 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 :1035-1038(1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428-433(1994)；及美國專利 No. 6，982，321 和 7，087，409。「人抗體」指擁有與由人生成的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列和/或使用本文所公開的用於生成人抗體的任何技術生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來生成，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222 :581 (1991))。還可用於製備人單克隆抗體的是以下文獻中記載的方法Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77(1985) ；Boerner et al.，J. Immunol. 147(1) :86-95 (1991)。還可參見 van Dijk and van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol.，5 :368-74 (2001)。可通過給已經修飾以應答抗原性刺激而生成人抗體但其內源基因組已經失能的轉基因動物例如經過免疫的異種小鼠(xenomice)施用抗原來製備人抗體(參見例如6，075，181和6，150，584，關於XEN0M0USE 技術)。還可參見例如 Li et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :；3557_3562 (2006)，關於經人B-細胞雜交瘤技術生成的人抗體。「物種依賴性抗體」指對來自第一哺乳動物物種的抗原的結合親和力強於對來自第二哺乳動物物種的該抗原同系物的親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體「特異性結合」 人抗原(即結合親和力(Kd)數值不超過大約1 χ 1(ΓΜ，優選不超過大約1 X 101，且最優選不超過大約1 X IO-9M),但是對來自第二非人哺乳動物物種的該抗原同系物的結合親和力比對人抗原的結合親和力弱至少大約50倍、或至少大約500倍、或至少大約1000倍。物種依賴性抗體可以是上文所定義的各種類型抗體中的任一種，但是優選人源化抗體或人抗體。術語「高變區」、「HVR」或「HV」在用於本文時指抗體可變域中序列上高度可變和/ 或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個HVR:三個在VH中(H1、H2、H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發揮獨特作用。參見例如Xu et al. ,Immunity 13: 37-45(2000) Johnson and Wu, ψ =Methods inMolecular Biology 248 :l-25(Lo, ed., Human Press, Totowa，NJ，2003)。事實上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩定的。參見例如Hamers-Casterman et al. Nature 363:446-448， (1993) ；Sheriff et al. Nature Struct. Biol. 3 :733-736, (1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補決定區(OTR)是以序列變異性為基石出的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda, MD. (1991)) ο Chothia 改為指結構環的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR與Chothia結構環之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體的使用。「接觸」 HVR是以對可獲得的複合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些HVR中每-
-個的殘基。
環 Kabat
AbM
Chothia
接觸
Ll L24-L34 L2 L50-L56 L3 L89-L97
L24-L34 L50-L56 L89-L97
L26-L32 L50-L52 L91-L96
Hl H31-H35B H26-H35BH26-H32
(Kabat編號)
Hl H31-H35 H26-H35H26-H32
(Chothia編號)
H2 H50-H65 H50-H58H53-H55
L30-L36 L46-L55 L89-L96H30-H35B
H30-H35
H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101HVR 可包括如下「延伸的 HVR" :VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。對於這些定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號的。「框架」或「FR」殘基指可變域中除本文中所定義的HVR殘基外的那些殘基。術語「依照Kabat的可變域殘基編號方式」或「依照Kabat的胺基酸位置編號方式」 及其變化形式指Kabat et al.，見上文中的用於抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號系統。使用此編號系統，實際的線性胺基酸序列可包含較少或另外的胺基酸，對應於可變域 FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52後的單一胺基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82後的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和 82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號方式可通過將抗體序列與「標準」 Kabat編號序列對比同源區來確定。Kabat編號系統一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1-107和重鏈殘基 1-113)時使用(例如 Kabat et al. , Sequences of Immunological Interest. 5thEd. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md. (1991)) 。「EU|S 號系統」或「EU索引」一般在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中的殘基時使用(例如Kabat et al.，見上文中報導的EU索引)。「如Kabat中的EU索引」指人IgG1 EU抗體的殘基編號方式。除非本文中另有說明，提及抗體可變域中的殘基編號指根據Kabat編號系統的殘基編號方式。除非本文中另有說明，提及抗體恆定域中的殘基編號指根據EU編號系統的殘基編號方式(參見例如PCT公開號W02006073941)。「親和力成熟的」抗體指在抗體的一個或多個HVR中具有一處或多處改變、導致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。在一個實施方案，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可使用本領域已知的某些規程來生成。例如，Marks et al. , Bio/Technology 10 :779-783(1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了 HVR和/或框架殘基的隨機誘變例如Barbas et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813(1994) ；Schier et al.，Gene 169:147-155(1995) ；Yelton et al.，J. Immunol. 155 :1994-2004(1995) Jackson et al.，J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995)；及 Hawkins et al.，J. Mol. Biol. 226 :889-896(1992)。「阻斷性」抗體或「拮抗性」抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗體。某些阻斷性抗體或拮抗性抗體實質或完全抑制抗原的生物學活性。「激動性抗體」在用於本文時指部分或完全模擬目的多肽的至少一項功能性活性的抗體。「生長抑制性」抗體指那些阻止或降低表達抗體所結合之抗原的細胞增殖的抗體。抗體「效應器功能」指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體 Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合和補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。術語「Fe區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C-端區域，包括天然序列Fc 區和變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為自其或ftx)230位置的胺基酸殘基至羧基末端的區段。Fc區的C-末端賴氨酸 (殘基447，依照EU編號系統)可以消除，例如在生產或純化抗體的過程中，或者通過對編碼抗體重鏈的核酸進行重組工程改造。因而，完整抗體組合物可以包括所有K447殘基都被消除的抗體群、無一 K447殘基被消除的抗體群、或者混合了有K447殘基的抗體和沒有K447 殘基的抗體的抗體群。在某些實施方案中，免疫球蛋白的Fc區包含兩個恆定域，即CH2和CH3。人IgG Fc區的「CH2結構域」(也稱為「C γ 2」結構域)通常自大約胺基酸231延伸至大約胺基酸340。CH2結構域的獨特之處在於它沒有與另一結構域緊密配對。而是，有兩個N-連接的分支的碳水化合物鏈介於完整天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。推測該碳水化合物可能提供結構域-結構域配對的替代且有助於穩定CH2結構域。Burton， Molec. Immunol. 22 :161-206(1985)。"CH3結構域」包含Fc區中CH2結構域C-端的一段殘基(即IgG的自大約胺基酸殘基341至大約胺基酸殘基447)。「功能性Fc區」擁有天然序列Fc區的「效應器功能」。例示性的「效應器功能」包括Fc受體結合；Clq結合；CDC ；ADCC ；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合，而且可以使用多種測定法來評估。「天然序列Fc區」包含與在自然界中找到的Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。天然序列人Fc區包括天然序列人IgG1 Fc區(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2 Fc區；天然序列人IgG3 Fc區；和天然序列人IgG4 Fc區；以及它們的天然存在變體(參見例如 SEQ ID NO 11 至 SEQ ID NO 17)。「變異Fc區」包含由於至少一處胺基酸修飾而與天然序列Fc區有所不同的胺基酸序列。在某些實施方案中，變異Fc區包含與天然序列Fc區的胺基酸序列相差一處或多處胺基酸替代的胺基酸序列。在某些實施方案中，變異Fc區與野生型IgG或野生型抗體的Fc 區相比具有至少一處胺基酸替代。在某些實施方案中，變異Fc區在野生型抗體的Fc區中具有兩個或更多個胺基酸替代。在某些實施方案中，變異Fc區在野生型抗體的Fc區中具有三個或更多個胺基酸替代。在某些實施方案中，變異Fc區具有至少一處、兩處或三處或更多處本文所述Fc區胺基酸替代。在某些實施方案中，變異Fc區在本文中與天然序列Fc 區和/或親本多肽的Fc區擁有至少約80%的同源性。在某些實施方案中，變異Fc區在本文中與天然序列Fc區和/或親本多肽的Fc區擁有至少約90%的同源性。在某些實施方案中，變異Fc區在本文中與天然序列Fc區和/或親本多肽的Fc區擁有至少約95%的同源性。「Fe受體」或「FcR」描述結合抗體Fc區的受體。在有些實施方案中，FcR是天然人FcR。在有些實施方案中，FcR是結合IgG抗體的FcR( γ受體)，包括屬於Fc γ RI、 FcyRII和Fc γ RIII亞類的受體，包括那些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA( 「活化受體」)和Fc y RIIB ( 「抑制受體」)，它們具有相似的胺基酸序列，區別主要在於其胞質結構域。活化受體Fc y RIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見例如DaSron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234(1997)) FcR 的綜述參見例如 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-492(1991) ；Capel etal. , Immunomethods 4 :25-34(1994)；及 de Haas et al. , J. Lab. Clin. Med. 126 330-41(1995)。術語「FcR」在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑑定的。術語「Fe受體」或「FcR」還包括新生兒受體，Fcfoi，它負責將母體IgG轉移給胎兒 (Guyer et al.，J. Immunol. 117 :587(1976)和 Kim et al.，J. Immunol. 24 :249(1994)) 並調節免疫球蛋白的體內穩態。測量對Fcfoi的結合的方法是已知的(參見例如(ihetie 1997, Hinton 2004)。測量對Fcfoi的結合的方法是已知的(參見例如Ghetie and Ward.， Immunol. Today 18(12) :592-598(1997) ；Ghetie et al. , Nature Biotechnology,15(7) :637-640(1997) ；Hinton et al.，J. Biol. Chem. 279(8) :6213-6216(2004) ；WO 2004/92219(Hinton et al·))。可測定人Fcfoi高親和力結合多肽的體內或血清半衰期，例如在轉基因小鼠中，在人中，或者在施用了具有變異Fc區的多肽的非人靈長類動物中。還可參見例如Petkova et al.International Immunology 18(12) 1759—1769U006)。「人效應細胞」指表達一種或多種FcR並行使效應器功能的白細胞。在某些實施方案中，該細胞至少表達Fc YRIII並行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞。效應細胞可以從其天然來源分離，例如血液。「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」或「ADCC」指其中結合到某些細胞毒性細胞 (例如NK細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨後用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc YRI、 Fc yRII、禾口 Fc yRIII。Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92(1991)第 464 頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No. 5，500，362或5，821，337或美國專利No. 6，737，056 (Presta)中所記載的。可用於此類測定法的效應細胞包括PBMC和NK細胞。或者/另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95 :652-656 (1998) 中所披露的。「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」指存在補體時對靶細胞的溶解。經典補體途徑的激活是由補體系統第一組分(Clq)結合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結合至其關聯抗原。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如feizzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202 =163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區胺基酸序列(具有變異Fc 區的多肽)及提高或降低的Clq結合能力的多肽變體記載於例如美國專利No. 6，194，551B1 和 W01999/51642。還可參見例如 Idusogie et al.，J. Immunol. 164 :4178-4184(2000) FcR結合親和力或ADCC活性「改變」了的多肽變體指與親本多肽或者與包含天然序列Fc區的多肽相比FcR結合活性和/或ADCC活性得到增強或減弱的多肽變體。「展示出對FcR的結合增加」的多肽變體以好於親本多肽的親和力結合至少一種FcR。「展示出對 FcR的結合減少」的多肽變體以低於親本多肽的親和力結合至少一種FcR。此類展示出對 FcR的結合減少的變體可擁有很少的或沒有顯著的對FcR的結合，例如與天然序列IgG Fc 區相比0-20%對FcR的結合。「在存在人效應細胞時比親本抗體更有效地介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)的變異Fc區的」多肽變體指在多肽變體和親本抗體在測定中使用的量基本上相同時在體外或在體內顯著更有效地介導ADCC的多肽變體。一般而言，此類變體使用本文中所披露的體外ADCC測定法來鑑定，但是涵蓋用於測定ADCC活性的其它測定法或方法，例如在動物模型中。「結合親和力」通常指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，在用於本文時，「結合親和力」指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間1 1相互作用的內在結合親和力。分子X對
28其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(Kd)，即結合常數(Ka)的倒數來表述。親和力可通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的那些。低親和力抗體通常緩慢的結合抗原且/或趨於容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結合抗原且/或趨於保持更長時間的結合。本領域知道測量結合親和力的多種方法，其中任一種都可用於本發明的目的。 下文描述了測量結合親和力的具體的示例性和例示性實施方案。在某些實施方案中，依照本發明的「KD」、「Kd」、「Kd」或「Kd值」是通過表面等離振子共振測定法使用 BIAC0RE -2000 或 BIAC0RE -3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway, NJ)於 25°C使用固定化抗原CM5晶片在約10個響應單位(RU)測量的。簡而言之，依照供應商的說明書用鹽酸N-乙基-N』 -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器晶片(CM5，BIACORE Inc.) 0用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約0. 2 μ Μ)，然後以5 μ 1/分鐘的流速注入至獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋白質。注入抗原後，注入IM乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量，於25°C以約25 μ 1/分鐘的流速注入在含0. 05% TWEEN-20的PBS (PBST)中連續稀釋的多肽，例如全長抗體。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIACORE Evaluation Software version 3. 2)通過同時擬合結合和解離傳感圖計算結合速率(k。n) 和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(Kd)以比率k。ff/k。n計算。參見例如Chen et al. , J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根據上文表面等離振子共振測定法，結合速率超過 IO6M-1S-1，那麼結合速率可使用螢光淬滅技術來測定，即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(a stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列SLM-AMINC0 分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS，pH 7.2中的20碰抗抗原抗體於251的螢光發射強度(激發= 295nm ；發射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低。0J W 「^ O-M^" (on-rate, rate of association, association rate)
或"k。n」 也可如上所述使用BIACORE -2000 或BIACORE -3000 系統(BIAcore， Inc. , Piscataway, NJ)來測定。短語「基本上相似」或「基本上相同」在用於本文時表示兩個數值之間足夠高的相似程度，以致本領域技術人員將認為在用所述數值(例如Kd值)所測量的生物學特性背景內兩個數值之間的差異具有很小的或沒有生物學和/或統計學顯著性。在某些實施方案中，作為參照/比較值的函數，所述兩個數值之間的差異例如小於約50%，小於約40%，小於約30%，小於約20%，和/或小於約10%。短語「實質性降低」或「實質性不同」在用於本文時表示兩個數值之間足夠高的差異程度，以致本領域技術人員將認為在用所述數值(例如Kd值)所測量的生物學特性背景內兩個數值之間的差異具有統計學顯著性。在某些實施方案中，作為參照/比較分子該數值的函數，所述兩個數值之間的差異例如大於約10%，大於約20%，大於約30%，大於約 40%，和/或大於約50%。就本文目的而言，「受體人框架」是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的 VL或VH框架之胺基酸序列的框架。「衍生自」人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可包含與之相同的胺基酸序列，或者可包含預先存在的胺基酸序列變化。在有些實施方案中，預先存在的胺基酸變化的數目是10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少。當VH中存在預先存在的胺基酸變化時，優選那些變化只存在於71H、73H和78H中的三個、兩個或一個位置；例如，位於那些位置的胺基酸殘基可以是71A、73T和/或78A。在一個實施方案中，VL受體人框架在序列上與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。「人共有框架」指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常見的胺基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變區序列亞型。通常，序列亞型是如 Kabat等人，見上文的亞型。在一個實施方案中，對於VL，亞型是如Kabat等人，見上文的亞型κ I。在一個實施方案中，對於VH，亞型是如Kabat等人，見上文的亞型III。「VH亞型III共有框架」包含從Kabat等人的可變重鏈亞型III中的胺基酸序列獲得的共有序列。"VL亞型I共有框架」包含從Kabat等人的可變輕鏈κ亞型I中的胺基酸序列獲得的共有序列。「純化的」意味著分子以至少95% (以重量計)、或至少98% (以包含它的樣品的
重量計)的濃度存在於樣品中。「分離的」核酸分子指與例如該核酸分子的天然來源中通常與之關聯的至少一種其它核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子進一步包括包含在通常表達該核酸分子的細胞中的核酸分子，但是所述核酸分子是以染色體外形式存在的或在染色體上的定位不同於它其天然染色體定位。術語「載體」在用於本文時意指能夠運輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是「質粒」，指其中可連接另外的DNA區段的環狀雙鏈DNA。另一類載體是噬菌體載體。 另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因表達。此類載體在本文中稱為「重組表達載體」(或簡稱為「表達載體」)。通常，在重組DNA 技術中有用的表達載體常常是質粒形式。在本說明書中，「質粒」和「載體」可互換使用，因為質粒是載體的最常用形式。如本文中使用的，「多核苷酸」或「核酸」指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和 RNA0核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經過修飾的核苷酸或鹼基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結構的修飾可以在裝配聚合物之前或之後進行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成後包含修飾，諸如偶聯至標記物。其它類型的修飾包括例如「帽」，將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等) 的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經修飾連接(例如α端基異構核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在於糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate) 基團、磷酸(phosphate)基團替換，用標準保護基團保護，或活化以製備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯至固體或半固體支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20 個碳原子的有機加帽基團模塊取代。其它羥基也可衍生成標準保護基團。多核苷酸還可含有本領域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2'-氧-甲基-、 2'-氧-烯丙基_、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環糖類似物，α-端基異構糖，差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環類似物及脫鹼基核苷類似物諸如甲基核糖核苷。可用備選連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團包括但不限於以下實施方案，其中磷酸酯用P(0)S( 「硫代酸酯」 (thi0ate))、P(S) S( 「二硫代酸酯」(dithioate))、(0)NR2( 「醯胺酯」(amidate))、P(0)R、P(O)OR'、CO 或 CH2 ( 「甲縮醛」(formacetal))替代，其中R或R'各自獨立為H或者取代或未取代的烷基 (1-20個C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。並非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用於本文中提及的所有多核苷酸，包括 RNA 禾口 DNA。「寡核苷酸」在用於本文時一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長度一般但不是必需小於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」與「多核苷酸」並不互相排斥。上文關於多核苷酸的描述平等且完全適用於寡核苷酸。表述「控制序列」指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適於原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處於功能性相互關係中，則它是「可操作連接的」。 例如，若前序列(presequence)或分泌前導(secretory leader)的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的位置促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，「可操作連接的」意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導的情況中意味著相鄰且處於閱讀狀態。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接來實現。若沒有此類位點，則依照常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。在用於本文時，表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換使用，而且所有此類名稱包括後代。如此，詞語「轉化子」和「(經)轉化細胞」包括原代受試細胞及由其衍生的培養物，不管傳代的次數。還應理解，所有後代在DNA內容上可能不是精確相同的，這是由於有意或無意的突變。包括與最初對轉化細胞所篩選的具有相同功能或生物學活性的突變後代。在意指不同的名稱時，上下文會有清楚表述。在用於本文時，「密碼子集」指用於編碼期望變異胺基酸的一套不同核苷酸三聯體序列。可以通過例如固相合成來合成一套寡核苷酸，其包括呈現密碼子集所提供的核苷酸三聯體的所有可能組合併編碼期望胺基酸組的序列。一種標準形式的密碼子命名是IUB代碼，其是本領域已知的且在本文中有記載。 密碼子集通常以3個斜體大寫字母表示，例如NNK、NNS, XYZ、DVK等等。如此，「非隨機密碼子集」在用於本文時指編碼部分、優選完全滿足本文所述胺基酸選擇標準的選定胺基酸的密碼子集。在某些位置具有選定核苷酸「簡併性」的寡核苷酸的合成是本領域眾所周知的，例如 TRIM 法(Knappek 等(1999) J. Mol. Biol. 296 :57-86) ； Garrard & Henner(1993) Gene 1 :103)。此類具有某些密碼子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成儀來合成 (可購自例如Applied Biosystems, Foster City，CA)，或者可以通過商業途徑獲得(例如購自Life Technologies, Rockville, MD)。因此，一套具有特定密碼子集的合成寡核苷酸通常包括具有不同序列(在整個序列中由密碼子集所建立的差異)的多種寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本發明使用時，具有容許與可變域核酸模板雜交的序列，而且還可以但非必須包含可用於例如克隆目的的限制酶位點。表述「線性抗體」指^ipata 等(1995) Protein Eng, 8 (10) :1057-1062 中所描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯的Fd區段(Vh-ChI-Vh-ChI),該區段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。在用於本文時，「文庫」或「庫」指眾多抗體或抗體片段序列(例如本發明的變體 IgG)，或者編碼這些序列的核酸，變異胺基酸組合方面不同的序列根據本發明方法導入這些序列。「噬菌體展示」是一種將多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術。噬菌體展示的效用在於能夠對隨機化蛋白質變體的大型文庫快速且高效分選那些能以高親和力與靶抗原結合的序列的實情。肽和蛋白質文庫在噬菌體上的展示已經用於對數以百萬計的多肽篩選那些具有特異性結合特性的多肽。多價噬菌體展示法已經用於展示小隨機肽和小蛋白，其通過與絲狀噬菌體的基因III 或基因 VIII 融合來實現。Wells and Lowman(1992)Curr. Opin. Struct. Biol. 3 :355-362, 及其中引用的參考文獻。在單價噬菌體展示中，將蛋白質或肽文庫與基因III或其一部分融合，並在存在野生型基因III蛋白時以低水平表達，使得噬菌體顆粒展示一個拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(avidity effect)相對於多價噬菌體得到了降低， 使得分選基於內在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡化了 DNA操作。Lowman and Wells (1991)Methods :Acompanion to Methods in Enzymology 3 :205_0216o「噬菌粒」是具有細菌複製起點(例如ColEl)和一個拷貝的噬菌體基因區間的質粒載體。噬菌粒可利用任何已知噬菌體，包括絲狀噬菌體和λ類噬菌體。質粒一般也包含抗生素抗性的可選擇標誌物。克隆入這些載體的DNA區段可以像質粒一起而擴增。在給容納這些載體的細胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時，質粒的複製模式變成滾環複製，以生成質粒DNA的一條鏈的拷貝，並包裝噬菌體顆粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌體顆粒。此術語包括這樣的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。術語「噬菌體載體」指包含異源基因且能夠複製的雙鏈複製型噬菌體。噬菌體載體具有容許噬菌體複製和噬菌體顆粒形成的噬菌體複製起點。噬菌體優選是絲狀噬菌體， 諸如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物，或者是λ類噬菌體，諸如λ、21、φ80、φ81、82、 似4、4；34等或其衍生物。在用於本文時，「溶劑可及位置」指源抗體或抗原結合片段重鏈和輕鏈可變區中根據抗體或抗原結合片段的結構、結構系綜(ensemble)和/或建模結構確定為潛在觸及溶劑和/或接觸分子(諸如抗體特異性抗原)的胺基酸殘基位置。這些位置通常發現於CDR中和蛋白質外部上。如本文所定義的抗體或抗原結合片段的溶劑可及位置可使用本領域已知的多種算法來確定。在一個實施方案中，溶劑可及位置是使用來自抗體三維模型的坐標而確定的，優選使用計算法程序，諸如hsightll程序(Accelrys，San Diego, CA)。溶劑可及位置還可以使用本領域已知的算法來確定(例如Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55，379 和 Connolly (1983) J. App 1. Cryst. 16，548)。溶劑可及位置的確定可使用適於蛋白質建模的軟體和自抗體得到的三維結構信息來進行。可用於這些目的的軟體包括 SYBYL Biopolymer Module軟體(Tripos Associates)。一般，若算法(程序)要求用戶輸入大小參數，計算中所使用的探針的「大小」設為半徑大約1. 4埃或更小。另外，PaCiOS(1994) Comput. Chem. 18(4) :377-386記載了使用供個人計算機用的軟體確定溶劑可及區域和面積的方法。關於參考多肽序列的「百分比(％ )胺基酸序列同一性」定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同一性目的的對比可以本領域技術範圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。本領域技術人員可決定用於對比序列的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，％胺基酸序列同一性值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech公司編寫，原始碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(USCopyright Office, Washington D. C.，20559)，並以美國版權註冊號TXU510087註冊。公眾可自Genentech公司(South San Francisco, California)得到ALIGN-2程序，或者可以自原始碼編譯。ALIGN-2程序應當編譯成在UNIX 作業系統，優選數碼UNIX V4. OD上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。在採用ALIGN-2來比較胺基酸序列的情況中，給定胺基酸序列A相對於(to)、與 (with)、或針對(against)給定胺基酸序列B的％胺基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一％胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算分數X/Y 乘 100其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的胺基酸殘基數，且其中Y是B中的胺基酸殘基總數。可以領會，若胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等，則A相對於B的％胺基酸序列同一性將不等於B相對於A的％胺基酸序列同一性。除非另有具體說明，本文中所使用的所有％胺基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。術語「VEGF」和「VEGF-A」在用於本文時指165個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子及相關的121個、189個和206個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子，如Leung等(1989) Science 246 :1306 和 Houck 等(1991)Mol. Endocrin，5 :1806 所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術語「VEGF」還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長類動物的VEGF。 有時，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。術語「VEGF」還用於指包含165個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子的胺基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申請中可能通過例如「VEGF (8-109) "VEGF (1-109) 」、
33"VEGF-Altl9」或"VEGF165」來鑑別任何此類形式VEGF。「截短的」天然VEGF的胺基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位胺基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當的對KDR和 Flt-I受體的結合親和力。"VEGF拮抗劑」指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或幹擾VEGF活性(包括但不限於其與一種或多種VEGF受體的結合)的分子。VEGF拮抗劑包括但不限於抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結合的受體分子及衍生物、抗VEGF受體抗體、VEGF受體拮抗劑(諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑)和結合 VEGF的免疫粘附素諸如VEGF Trap。如本文中所使用的，術語「VEGF拮抗劑」明確包括結合 VEGF且能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或幹擾VEGF活性的分子。如此，術語「VEGF活性」 明確包括VEGF介導的VEGF生物學活性。關於VEGF多肽或「VEGF活性」的術語「生物學活性」和「有生物學活性的」指與全長和/或截短的VEGF有關的物理/化學特性和生物學功能。在某些實施方案中，VEGF活性為誘導和/或刺激和/或促進血管發生。在某些實施方案中，VEGF活性為誘導和/或刺激和/或促進新血管形成。在某些實施方案中，VEGF活性為誘導和/或調控血管通透性。 在某些實施方案中，VEGF活性為誘導和/或刺激和/或促進內皮細胞遷移和/或內皮細胞增殖。抗VEGF中和性抗體遏制多種人腫瘤細胞系在裸鼠中的生長(Kim et al., Nature 362:841-844(1993) ；Warren et al. , J. Clin. Invest. 95 1789-1797 (1995)；
BorgStrom et al. , Cancer Res. 56 :4032-4039(1996) ；Melnyk et al. , Cancer Res. 56
921-924(1996))，而且還抑制缺血性視網膜病症的模型中的眼內血管發生(Adamis et al.，Arch. Ophthalmol. 114 :66-71(1996))。術語「抗VEGF抗體」或「結合VEGF的抗體」指能夠以足夠親和力和特異性結合VEGF的抗體，該抗體在靶向VEGF中可用作診斷劑和/或治療劑。例如，本發明的抗 VEGF抗體可在靶向和幹預其中涉及VEGF活性的疾病或疾患中用作治療劑。參見例如美國專利 6，582，959，6，703，020 ；W098/45332 ；W096/30046 ；W094/10202 ；W02005/044853 ； EP 0666868B1 ；美國專利申請 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208 禾口 20050112126 ;Popkov et al. , Journal of Immunological Methods 288 149-164(2004)；及W02005012359。所選擇的抗體通常具有針對VEGF的足夠強的結合親和力。例如所述抗體可以以介於IOOnM-IpM之間的Kd值結合hVEGF。抗體親和力可以通過例如基於表面等離振子共振的測定法(諸如BIAcore測定法，如PCT申請公開號 W02005/012359所記載的)；酶聯免疫吸附測定法(ELISA)；和競爭測定法(例如RIA)來測定。所述抗體可以進行其它生物學活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此類測定法是本領域已知的，而且依賴於所述抗體的靶抗原和預期用途。例子包括HUVEC 抑制測定法；腫瘤細胞生長抑制測定法(如例如WO 89/06692所記載的)；抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利5，500，36 ；及激動性活性或造血測定法(參見WO 95/27062) 0抗VEGF抗體通常不會結合其它VEGF 同源物，諸如VEGF-B、VEGF-C, VEGF-D或VEGF-E，也不會結合其它生長因子，諸如P1GF、 PDGF或bFGF。在一個實施方案中，抗VEGF抗體包括與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結合相同表位的單克隆抗體；重組人源化抗VEGF單克隆抗體 (參見Presta et al. (1997) Cancer Res. 57 :4593-4599)，包括但不限於稱為貝伐單抗即 "bevacizumab (BV) 」、也稱為 「rhuMAb VEGF"或"AVASTIN 』』的抗體。AVASTIN 是當前商品化的。貝伐單抗包含突變的人IgGl框架區和來自鼠抗體A. 4. 6. 1 (其阻斷人VEGF 結合其受體)的抗原結合互補決定區。貝伐單抗大約93%的胺基酸序列(包括大部分框架區)衍生自人IgGl，而大約7%的序列衍生自A4.6. 1。貝伐單抗具有約149，000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐單抗和其它人源化抗VEGF抗體進一步記載於2005 年2月沈日公告的美國專利No. 6，884，879。別的抗VEGF抗體包括G6或B20系列抗體 (例如G6-23、G6-31、B20-4. 1)，如PCT申請公開號W02005/012359所記載的。別的優選的抗體參見美國專利 No. 7，060，269，6，582，959，6，703，020 ；6，054, 297 ；W098/45332 ；WO 96/30046 ；W094/10202 ；EP 0666868B1 ；美國專利申請公開號 2006009360,20050186208, 20030206899，20030190317，20030203409 和 20050112126 ；及 Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 0004)。如本文中使用的，術語「B20系列抗體」指結合VEGF的多肽，包括抗體。B20系列多肽包括但不限於自B20抗體或美國公開號20060280747、美國公開號20070141065和/或美國公開號2007002(^67(通過述及明確將這些專利申請的內容收入本文)中記載的B20衍生抗體的序列衍生的抗體。在一個實施方案中，B20系列多肽為美國公開號20060280747、 美國公開號20070141065和/或美國公開號2007002(^67中記載的B20-4. 1。在另一個實施方案中，B20系列多肽為PCT公開號WO 2009/073160中記載的B20-4. 1. 1 (通過述及明確將其完整公開內容收入本文)。如本文中使用的，術語「G6系列多肽」指結合VEGF的多肽，包括抗體。G6系統多肽包括但不限於自G6抗體或美國公開號20060280747、美國公開號20070141065和/或美國公開號20070020267中記載的G6衍生抗體的序列衍生的抗體。如美國公開號20060280747、 美國公開號20070141065和/或美國公開號20070020267中記載的，G6系列多肽包括但不限於 G6-8、G6-23 和 G6-31。「血管發生因子」或「血管發生劑」指刺激血管發育，例如促進血管發生 (angiogenesis)、內皮細胞生長、血管穩定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子。例如，血管發生因子包括但不限於例如VEGF和VEGF家族的成員(VEGF-B、VEGF-C 和VEGF-D)、PlGF, PDGF家族、成纖維細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素)、 ephrin、德爾塔樣配體4(DLL4)、Del-Ι、酸性(aFGF)和鹼性(bFGF)成纖維細胞生長因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8 (IL-8)、L印tiη、Midkine、神經纖毛蛋白、胎盤生長因子、血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生生長因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、 Pleiotrophin(PTN)、Progranulin, Proliferin、轉化生長因子-α (TGF- α )、轉化生長因子-β (TGF-β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等。它還包括加速傷口癒合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族的成員、及 TGF-α 禾口 TGF-β。參見例如 Klagsbrun and D' Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53 217-39 ；Streit and Detmar (2003) Oncogene 22 :3172-3179 ；Ferrara & Alitalo(1999) Nature Medicine 5(12) :1359-1364 Jonini 等 Q003) Oncogene 22 :6549-6556 (例如列舉已知血管發生因子的表 1) ；Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8 :200_206。「抗血管發生劑」或「血管發生抑制劑」指或直接或間接抑制血管發生 (angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質、多核苷酸(包括例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分離的蛋白質、重組蛋白、抗體、或其偶聯物或融合蛋白。應當理解，抗血管發生劑包括那些結合併阻斷血管發生因子或其受體的血管發生活性的藥劑。例如，抗血管發生劑是上文定義的血管發生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF-A的抗體、VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt_l受體)的抗體、抗PDGFR抑制劑諸如GLEEVEC (Imatinib Mesylate)、阻斷VEGF受體信號傳導的小分子(例如PTK787/ ZK2284、SU6668、SUTENT /SU 11248 (sunitinib malate)、AMG706、或那些記載於例如國際專利申請WO 2004/113304的)。抗血管發生劑還包括天然血管發生抑制劑，例如血管他丁 (angiostatin)、內皮他丁 (endostatin)等。參見例如 Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53 :217-39 ；Streit and Detmar (2003) Oncogene 22 :3172-3179 (例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發生療法的表3) ；Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12) :1359-1364 ；Tonini ^ (2003) Oncogene 22 :6M9_6556 (例如列舉已知抗血管發生因子的表2) ；Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8 :200-206 (例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發生劑的表1)。「病症」指將會從使用本發明的組合物或方法進行的處理中獲益的任何疾患或疾病。這包括慢性和急性病症，或者包括那些使哺乳動物趨向於所討論病症的病理狀況的疾病。可使用本發明的抗體和抗體片段來治療的病症的非限制性例子包括本文中在「定義」下提供的多種疾病和病症。術語「細胞增殖性病症」和「增殖性病症」指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中，細胞增殖性病症指癌症。「腫瘤」在用於本文時指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語「癌症」、「癌性」、「細胞增殖性病症」、「增殖性病症」和「腫瘤」在本文中提到時並不互相排斥。腫瘤可以是實體瘤或者是非實體瘤或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤的例子包括白血病(例如慢性髓細胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴細胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成熟 B 細胞急性成淋巴細胞性白血病(mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、多形核細胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛細胞性白血病(hairy cell leukemia))、或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin 』 s disease))。實體瘤包括血液、骨髓、或淋巴系統以外的身體組織的任何癌症。實體瘤可進一步分成上皮細胞起源的那些和非上皮細胞起源的那些。實體瘤的例子包括結腸、乳腺、前列腺、肺、腎、肝、胰腺、卵巢、頭和頸、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、胃腸道、肛門、膽囊、唇(labium)、鼻咽、皮膚、子宮、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮膚的腫瘤。非上皮起源的實體瘤包括肉瘤、腦瘤、和骨瘤。術語「癌症」和「癌性」指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。癌症的例子包括但不限於癌，淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更具體例子包括但不限於鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、 結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端黑素瘤、結節性黑素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、小淋巴細胞性(SL) NHL、中級/濾泡性NHL、中級瀰漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、 高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積病(bulky disease)NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病(Phakomatoses)^KW (諸如與腦瘤有關的)和梅格斯(Meigs)氏症候群有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌、及相關轉移。在某些實施方案中，適合於通過本發明的變體IgG來治療的癌症包括乳腺癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、類癌(carcinoid carcinoma)、頭頸癌、卵巢癌、間皮瘤、和多發性骨髓瘤。在一些實施方案中，癌症選自下組小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、結腸直腸癌(CRC)、和肝細胞癌。還有，在一些實施方案中，癌症選自下組非小細胞肺癌、結腸直腸癌、成膠質細胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的轉移性形式。術語癌症涵蓋增殖性病症的集合，包括但不限於癌前生長、良性腫瘤、惡性腫瘤和休眠的腫瘤。良性腫瘤仍然局限於起源部位且沒有能力滲透、侵入、或轉移至遠端部位。惡性腫瘤會侵入並損害它們周圍的其它組織。它們還能獲得脫離起源部位並傳播至身體其它部分(轉移)(通常經由血流或在淋巴結所處位置經由淋巴系統)的能力。休眠的腫瘤指靜止腫瘤，其中腫瘤細胞存在但腫瘤進展在臨床上不明顯。原發性腫瘤以發生它們的組織類型來分類；轉移性腫瘤以衍生癌細胞的組織類型來分類。隨著時間消逝，惡性腫瘤的細胞變得越來越異常，而且表現出更不像正常細胞。癌細胞外觀的這種變化稱作腫瘤等級(tumor grade)，而且將癌細胞描述為完全分化的(well-differentiated)、中度分化白勺(moderately-differentiated)、不良分化白勺(poorly-differentiated)、或未分化白勺 (undifferentiated)。完全分化的細胞相當正常，表現為和類似它們起源的正常細胞。未分化的細胞指已經變得如此異常以致於不再可能確定其起源的細胞。上皮癌症一般自良性腫瘤進展至侵入前階段(例如原位癌)，至惡性癌症，其滲透基底膜並侵入上皮下基質。「發育異常」指組織、器官、或細胞的任何異常生長或發育。在某些實施方案中，發育異常是高級的或癌前的。「轉移」指癌自其原發部位傳播至身體中的其它位置。癌細胞能脫離原發性腫瘤， 滲透入淋巴和血管，經由血流而循環和在身體中其它地方的正常組織中的遠端病灶(轉移)中生長。轉移可以是局部的或遠端的。轉移是一個連續過程，視腫瘤細胞自原發性腫瘤脫落、經由血流而傳播、並在遠端部位停止而定。在新的部位，該細胞建立血供且能生長至形成危及生命的團塊。腫瘤細胞內的刺激性和抑制性分子途徑調節這種行為，而且腫瘤細胞與遠端部位中的宿主細胞之間的相互作用也是重要的。「微轉移」指自原發性腫瘤傳播至身體其它部分的少數細胞。微轉移在篩選或診斷測試中可以檢測得到或檢測不到。「非轉移的」指良性的或保留在原發部位且尚未滲透入淋巴或血管系統或滲透至原發部位以外的組織的癌症。一般而言，非轉移性癌症指作為0期、I期、或II期癌症和偶爾的III期癌症的任何癌症。將腫瘤或癌症稱作「0期」、「I期」、「II期」、「III期」、或「IV期」指示使用本領域已知的整體階段分組(Overall Stage Grouping)或羅馬數字分期(Roman Numeral Staging) 方法對腫瘤或癌症的分類。雖然實際的癌症階段取決於癌症的類型，一般而言，0期癌症為原位病灶，I期癌症為小的局限性腫瘤，II期和III期癌症是局部高級的腫瘤，其展現出涉及局部淋巴結，而IV期癌症代表轉移性癌症。每類腫瘤的具體階段是熟練臨床醫生已知的。「原發性腫瘤」或「原發性癌」指初始的癌症，而不是位於受試者身體中另一組織、 器官、或位置中的轉移病灶。「良性腫瘤」或「良性癌」指仍然局限於起源部位且沒有能力滲透、侵入、或轉移至遠端部位的腫瘤。「癌症復發」在本文中指癌症在治療後復發，而且包括癌症在原發性器官中的復發，以及遠端復發，即癌症在原發性器官以外復發。「腫瘤休眠」指一種延長的靜止狀態，其中腫瘤細胞存在但腫瘤進展在臨床上不明顯。休眠的腫瘤在篩選或診斷測試中可以檢測得到或檢測不到。「腫瘤載荷」指身體中癌細胞的數目、腫瘤的尺寸、或癌的量。腫瘤載荷也稱作腫瘤負荷。「腫瘤數目，，指腫瘤的數目。適合用本發明的抗體和抗體片段治療的非新生物狀況包括但不限於例如不想要的或異常的肥大，良性前列腺肥大，關節炎，類風溼性關節炎(RA)，銀屑病關節炎，神經變性性疾病(例如阿爾茨海默(Alzheimer)氏病，AIDS相關痴呆，帕金森(Parkinson)氏病，肌萎縮側索硬化，視網膜色素變性，脊髓性肌萎縮和小腦變性)，自身免疫性疾病，銀屑病，銀屑病斑塊，結節病，動脈粥樣硬化，動脈粥樣硬化斑塊，橋本(Hasimoto)氏甲狀腺炎，血管發生性病症，眼的疾病諸如假定的眼組織胞漿菌病症候群(presumed ocular histoplasmosis syndrome)，視網膜血管形成，糖尿病性視網膜病和其它增殖性視網膜病包括早產兒視網膜病，糖尿病性腎病，晶狀體後顯微組織增生，新生血管性青光眼，老年性黃斑變性，糖尿病性黃斑水腫，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，角膜移植片排斥， 視網膜/脈絡膜新血管形成，眼角的新血管形成(發紅)，眼新血管疾病，血管病，涉及血管上皮細胞異常增殖的狀況，血管再狹窄，格-巴(Guillain-Barre)症候群，息肉諸如結腸息肉、家族性腺瘤息肉病、鼻息肉或胃腸息肉，胃腸潰瘍，嬰兒肥厚性幽門狹窄，泌尿阻塞症候群，門內特裡埃(Menetrier)氏病，分泌型腺瘤或蛋白質流失症候群(protein loss syndrome)，纖維腺瘤，呼吸疾病，膽囊炎，神經纖維瘤病，動靜脈畸形(AVM)，腦膜瘤，血管瘤，血管纖維瘤，甲狀腺增生(包括格雷夫斯(Grave)氏病)，角膜和其它組織移植，炎性疾病，慢性炎症，肺的炎症，急性肺損傷/ARDS，敗血病/膿毒症，慢性阻塞性肺病，原發性
38肺動脈高壓，惡性肺部積液，粥樣斑，燒傷、外傷、輻射、中風、缺氧或缺血後的水腫，心肌梗死所致水腫，缺血損傷，腦缺血事件後的損傷，腦水腫(例如與急性中風/閉合性頭部損傷 /外傷有關的)，由血小板聚集引起的血栓，纖維變性性或水腫性疾病諸如肝硬化，肺纖維化，carcoidosis, throiditis,系統性高粘滯症候群，滑膜炎症(synovial inflammation)， RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成，骨相關病理學，諸如骨關節炎(OA)、佝僂病和骨質疏鬆，頑固性腹水，骨或關節發炎，骨髓發育異常症候群(Myelodysplastic Syndrome)，再生障礙性貧血，腎或肝的；T細胞介導的超敏感性疾病，佩吉特(Paget)氏病， 多囊性腎病，第三空間流體病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔症候群、燒傷、腸病)、慢性炎症諸如IBD (克萊恩(Crohn)氏病和潰瘍性結腸炎)，腎病症，腎同種異體移植物排斥，移植物抗宿主病或移植物排斥，炎性腸病，急性和慢性腎病(包括增殖性腎小球腎炎和糖尿病誘發的腎病)，腎病症候群，不希望有的或異常的組織塊生長(非癌症)， 肥胖，脂肪組織塊生長，血友病性關節，肥厚性瘢痕，毛髮生長的抑制，奧斯勒-韋伯-朗迪 (Osier ffeber-Rendu)症候群，膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生，硬皮病，沙眼，血管粘連，滑膜炎，皮膚的超敏反應，皮膚病症包括銀屑病和皮炎，溼疹，光老化(例如由UV照射人皮膚引起的)，肥厚性瘢痕形成，生殖疾患，諸如子宮內膜異位、卵巢過刺激症候群、多囊性卵巢病、先兆子癇、功能障礙性子宮出血、或月經頻多，子宮類纖維瘤，早產，腹水，心包積液 (諸如與心包炎有關的)，胸腔積液，內毒素性休克和真菌感染，某些微生物感染，包括選自腺病毒、漢坦病毒(hantaviruses)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、耶爾森氏菌屬 (Yersinia spp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的微生物病原體，和精神病學病症(例如精神分裂症、雙相型抑鬱、孤獨症、和注意力缺陷障礙)。「呼吸病」涉及呼吸系統，包括慢性支氣管炎、哮喘包括急性哮喘和變應性哮喘、囊性纖維化、支氣管擴張、變應性或其它鼻炎或鼻竇炎、α 1-抗胰蛋白酶缺陷、咳嗽、肺氣腫、 肺纖維化或過度反應性氣道、慢性阻塞性肺病、和慢性阻塞性肺疾病。「自身免疫性疾病」在本文中指源於且針對個體自身組織的非惡性疾病或病症。 自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限於炎症應答，諸如炎性皮膚病，包括銀屑病和皮炎(例如特應性皮炎和接觸性皮炎)；系統性硬皮病和硬化；與炎性腸病有關的應答(諸如克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結腸炎)；呼吸窘迫症候群(包括成人呼吸窘迫症候群 (ARDS))；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏狀況，諸如溼疹和哮喘及涉及T細胞浸潤和慢性炎性應答的其它狀況；動脈粥樣硬化；白細胞粘著缺陷；類風溼性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發性硬化；雷諾氏(Reynaud)症候群；自身免疫性甲狀腺炎；變應性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjogren)症候群；幼髮型糖尿病；通常在結核病、結節病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎中發現的與細胞因子和T-淋巴細胞介導的急性和遲發性超敏感性有關的免疫應答；惡性貧血(阿狄森氏(Addison)病)；涉及白細胞滲出的疾病衝樞神經系統(CNS)炎性病症；多器官損傷症候群；溶血性貧血(包括但不限於冷球蛋白血症或庫姆斯氏(Coombs)陽性貧血)；重症肌無力；抗原-抗體複合物介導的疾病；抗腎小球基膜病；抗磷脂症候群；過敏性神經炎；格雷夫斯氏(Graves)病；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌無力症候群；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內分泌腺病；萊特氏(Reiter)病；僵人症候群；貝切特氏 (Behcet)病；巨細胞動脈炎；免疫複合物腎炎；IgA腎病；IgM多神經病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少症等。「血管疾病或病症」在本文中指影響血管系統，包括心血管系統的各種疾病或病症。此類疾病的例子包括動脈硬化、血管再阻塞、動脈粥樣硬化、手術後血管狹窄、再狹窄、 血管閉塞或頸動脈阻塞性疾病、冠狀動脈病、心絞痛、小血管病、高膽固醇血、高血壓、和涉及血管上皮細胞增殖或功能異常的狀況。在用於本文時，「治療」(及變化形式，諸如「處理」或「處置」)指試圖改變所治療個體或細胞的自然進程的臨床幹預，可以是為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的期望效果包括預防疾病的發生或復發、緩解症狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學後果、預防轉移、減緩疾病進展的速率、改善或減輕疾病狀態、及免除或改善預後。在有些實施方案中，本發明的變體IgG用於延遲疾病或病症的發生/發展，或用於減緩疾病或病症的進展。「個體」、「受試者」、或「患者」為脊椎動物。在某些實施方案中，脊椎動物為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家畜(諸如牛)、運動動物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、靈長類、 小鼠和大鼠。在某些實施方案中，哺乳動物為人。術語「藥物配製劑」或「藥物組合物」指其形式容許活性成分的生物學活性是有效的，且不含對會施用該配製劑的受試者產生不可接受的毒性的別的成分的製備物。此類配製劑是可以無菌的。還可參見標題為劑量、配製劑、和持續時間的部分。「無菌」配製劑是無菌的或者不含所有活的微生物及其孢子。術語「有效量」或「治療有效量」指在受試者中有效治療疾病或病症的藥物量。在某些實施方案中，有效量指在必需的劑量和時間上有效實現期望的治療或預防結果的量。本發明的物質/分子的治療有效量可根據諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重及該物質/ 分子在個體中引發期望應答的能力等因素而變化。治療有效量涵蓋該物質/分子的治療有益效果勝過任何有毒或有害後果的量。在癌症的情況中，有效量的藥物可減少癌細胞的數目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，典型的是阻止)癌細胞浸潤入周圍器官； 抑制(即一定程度的減緩，典型的是阻止)腫瘤轉移；一定程度的抑制腫瘤生長；容許治療腫瘤；和/或一定程度的減輕一種或多種與病症有關的症狀。根據藥物可阻止現有癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。「預防有效量」指在必需的劑量和時間上有效實現期望的預防效果的量。通常而非必然，由於預防劑量是在疾病發作之前或在疾病的早期用於受試者的，因此預防有效量會低於治療有效量。在癌前、良性、早期或晚期腫瘤的情況中，血管發生抑制劑的治療有效量可減少癌細胞數；縮小原發性腫瘤尺寸；抑制(即一定程度的減緩，優選停止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即一定程度的減緩，優選停止)腫瘤轉移；一定程度的抑制或延遲腫瘤生長或腫瘤進展；和/或一定程度的減輕與病症有關的一種或多種症狀。就藥物可預防癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞的程度而言，它可以是抑制細胞的和/或毒害細胞的。術語「功效」在本文中以最廣義使用，而且指免疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白產生期望效果的能力。在某些實施方案中，功效指在飽和水平對免疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白觀察到的最大效果。在某些實施方案中，功效指免疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白的EC5tl 在某些實施方案中，功效指免疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白的效力。在某些實施方案中，功效指免疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白對疾病的過程或持續時間產生有益效果的能力，包括本文所述臨床好處。"EC5tl」指免疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白誘導介於基線和最大值之間半途的響應的濃度。在某些實施方案中，EC5tl代表如下的免疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白濃度，此時觀察到其最大效果的50 %。在某些實施方案中，EC50代表獲得50 %最大體內效果所需要的血漿或血清濃度。在治療癌症中的功效可通過檢測本發明的抗體、融合蛋白、偶聯分子、或組合物抑制或降低癌性細胞生長或轉移或改善或減輕一種或多種與癌症有關的症狀的能力來證明。 若施用本發明的抗體、融合蛋白、偶聯分子、或組合物後有例如癌性細胞生長或轉移的降低、一種或多種與癌症有關的症狀的改善、或死亡率和/或發病率的降低，則認為處理是治療性的。還可在體外、離體、和體內測定法中對本發明的抗體、融合蛋白或組合物測試它們降低腫瘤形成的能力。對於癌症療法，體內功效還可以例如通過評估存活的持續時間、距疾病進展的時間(TTP)、響應率(RR)、響應的持續時間、和/或生活質量來測量。還可參見題為治療功效的部分。在治療炎性病症中的功效可通過檢測本發明的抗體、融合蛋白、偶聯分子、或組合物減輕或抑制動物中的炎症或改善或減輕一種或多種與炎性病症有關的症狀的能力來證明。若施用本發明的抗體、融合蛋白、偶聯分子、或組合物後有例如炎症的減輕或一種或多種症狀的緩解，則認為該處理是治療性的。在治療或預防病毒感染中的功效可通過檢測本發明的抗體、融合蛋白、偶聯分子、 或組合物抑制病毒複製，抑制傳播或預防病毒在其宿主中存在下來，或預防、改善或減輕一種或多種與病毒感染有關的症狀的能力來證明。若施用本發明的抗體、融合蛋白、偶聯分子、或組合物後有例如病毒載量的降低、一種或多種症狀的改善或死亡率和/或發病率的降低，則認為該處理是治療性的。還可在體外和體內測定法中對本發明的抗體、融合蛋白、 偶聯分子、或組合物測試它們抑制病毒複製或降低病毒載量的能力。在治療或預防細菌感染中的功效可通過檢測本發明的抗體、融合蛋白或組合物抑制細菌複製，或者預防、改善或減輕一種或多種與細菌感染有關的症狀的能力來證明。若施用本發明的抗體、融合蛋白或組合物後有例如細菌數目的減少、一種或多種症狀的改善或死亡率和/或發病率的降低，則該處理被認為是治療性的。臨床好處可以通過評估各種終點來測量，例如一定程度地抑制疾病進展，包括減緩和完全阻滯；減少疾病發作和/或症狀的數目；縮小損害尺寸；抑制(即減輕、減緩或完全終止)疾病細胞浸潤入臨近周圍器官和/或組織；抑制(即減輕、減緩或完全終止)疾病擴散；減輕自身免疫應答，其可以但非必然導致疾病損害的消退或消融；一定程度地減輕與病症有關的一種或多種症狀；治療後無疾病呈現(例如無進展存活)的長度延長；總體存活延長；響應率升高；和/或治療後給定時間點的死亡率降低。「降低或抑制」指與參照相比降低活性、功能、和/或量。在某些實施方案中，「降低或抑制」指引起20%或更多的總體降低的能力。在另一個實施方案中，「降低或抑制」指引起50%或更多的總體降低的能力。在又一個實施方案中，「降低或抑制」指引起75%、85%、 90%、95%、或更多的總體降低的能力。降低或抑制可以指所治療的病症的症狀、轉移的存在或尺寸、原發性腫瘤的尺寸、或血管發生性病症中血管的尺寸或數目。
「可手術的」癌症指局限於原發性器官且適合於手術的癌症。「存活」(survival)指患者保持存活，包括無疾病存活(disease free survival) (DFS)、無進展存活(progress free survival) (PF S)禾口總體存活(overall survival) (OS)。存活可通過Kaplan-Meier法來評估，而且存活的任何差異可使用分層時序檢驗 (stratified log-rank test) : 計算。「無疾病存活(DR5) 」指患者自治療啟動或自初始診斷起保持一定時期活著且癌症沒有復發，諸如約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約10年、等。在本發明的一個方面， DFS依照治療意圖原則來分析，即在其指派療法的基礎上評估患者。DFS分析中使用的事件可包括局部、區域性和遠端癌症復發，繼發性癌症發生，及在沒有在先事件(例如乳腺癌復發或第二原發性癌症)的患者中死於任何原因。「總體存活」指患者自治療啟動或自初始診斷起保持一定時期活著，諸如約1年、約 2年、約3年、約4年、約5年、約10年、等。「延長存活」意味著使接受治療的患者的DFS和/或OS相對於未接受治療的患者或相對於對照治療方案(諸如只用化療劑的治療)有延長。存活在治療啟動之後或在初始診斷之後監測至少約6個月、或至少約1年、或至少約2年、或至少約3年、或至少約4年、 或至少約5年、或至少約10年、等。術語「並行」在本文中用於指使用兩種或更多種治療劑，其中至少部分施用在時間上交疊。因而，並行施用包括如下的劑量給藥方案，一種或多種藥劑的施用中斷後施用一種或多種其它藥劑。「單一療法」意指如下的治療方案，其在治療期的過程期間只包括單一治療劑來治療癌症或腫瘤。在某些實施方案中，使用變體IgG的單一療法意味著在治療期期間在沒有別的抗癌療法的情況中施用所述變體IgG。「維持療法」意指為了降低疾病復發或進展的可能性而給予的治療方案。維持療法可提供任意長度的時間，包括長至受試者終身的延長的時段。維持療法可在初始療法之後或與初始或別的療法聯合提供。用於維持療法的劑量可變化，而且可包括與其它類型的療法使用的劑量相比降低的劑量。「新輔助療法(neoadjuvant therapy) 」或「術前療法」在本文中指在手術之前給予的療法。新輔助療法的目標是提供立即的系統治療，若遵循手術後進行系統治療的標準順序，潛在根除的微轉移反而會增殖。新輔助療法還可幫助縮小腫瘤尺寸，由此容許完全切除起初可不切除的腫瘤或保留部分器官及其功能。另外，新輔助療法容許體內評估藥物功效，這可指導後續治療的選擇。「輔助療法」在本文中指在手術之後給予的療法，其中檢測不到殘餘疾病的跡象， 從而來降低疾病復發的風險。輔助療法的目標是預防癌症復發，及因此降低癌症相關死亡的機會。在本文中，「標準護理(standard of care) 」化療指常規使用來治療特定癌症的化療劑。「確定性手術1Π該術語在醫學界內使用的那樣使用。確定性手術包括例如導致腫瘤清除或切除的規程、手術或其它，包括那些導致所有明顯可見腫瘤清除或切除的。確定性手術包括例如腫瘤的完全的或治癒性的切除或完全總體切除。確定性手術包括以一個或多
42個階段進行的規程，而且包括例如多階段手術規程，其中在切除腫瘤之前實施一次或多次手術或其它規程。確定性手術包括清除或切除腫瘤，包括累及的器官、部分器官和組織，以及周圍的器官，諸如淋巴結、部分器官、或組織的規程。與一種或多種其它治療劑「聯合」施用包括同時(共同)施用和/或任何次序的
序貫施用。「長期」施用指與短期模式相反，以連續模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活性)維持較長一段時間。「間歇」施用指不是無間斷連續進行的治療，而是本質上周期性的。「載體」在用於本文時包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是PH緩衝水溶液。生理學可接受載體的例子包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如 TTOEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。「脂質體」指由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的，可用於對哺乳動物投遞藥物(諸如變體IgG)的小囊泡。脂質體的成分通常排列成雙層形式，與生物膜的脂質排列相似。術語「抗腫瘤組合物」指可用於治療癌症的組合物，其包含至少一種活性治療劑， 例如「抗癌劑」。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限於例如化療劑、生長抑制劑、細胞毒齊U、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、和其它用於治療癌症的藥劑諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如erlotinib (TARCEVA )、血小板衍生生長因子抑制劑 (例如 GLEEVEC (Imatinib Mesylate))、C0X_2 抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、幹擾素、細胞因子、能與 ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BlyS、APRIL、BCMA 或 VEGF 受體中的一種或多種靶物結合的拮抗劑(例如中和性抗體)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機化學劑等。本發明還包括它們的組合。術語「細胞毒劑」在用於本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re·、Re·、Sm153、 Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿黴素 (adriamycin)、長春花生物鹼類(vinca alkaloids)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼 (vinblastine)、依託泊昔(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法倉(melphalan)、 絲裂黴素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞。在某些實施方案中，變體IgG可以偶聯有細胞毒劑。「毒素」指能夠對細胞的生長或增殖產生有害效果的任何物質。「化療劑」指可用於治療癌症的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylating agents),諸如塞替派(thiot印a)和環磷醯胺 (cyclophosphamide) (CYTOXAN )；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates),諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzocbpa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)禾口烏 卷替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)禾口甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺 (triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(triethylen印hosphoramide)、三乙撐硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)禾口三輕甲蜜胺(trimethyIoIomelamine)；番蕩枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))； δ -9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL )；β -拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol)；秋水仙素類(colchicines)；白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物託泊替康 (topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR )、乙醯喜樹鹼、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹鹼)；苔蘚抑素(bryostatin)； callystatin ;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，Kff-2189和 CB1-TM1) ·,% (eleutherobin) ；pancratistatin ； sarcodictyin ; · til i
(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards),諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酉先胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留酉享 (phenesterine)、撥尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀 (nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne) (如加利車黴素(calicheamicin)，尤其是加利車黴素Y II和加利車黴素ω Il (參見例如 Nicolaou et al. , Angew. Chem Intl. Ed. Engl. ,33 :183-186(1994)) ；CDP323, 一種口服0-4整聯蛋白抑制劑；蒽環類抗生素((^1^1^(^11)，包括(^1^1^(^11 A;埃斯波黴素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素髮色團)、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴黴素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素 C (cactinomycin) > carabicin、洋紅霄素(carminomycin) ^ ^m ^ MM (carzinophilin) > 色黴素(chromomycin)、方文線菌素 D (dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地託比星(detorubicin)、6_ 二氮_5_氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括 ADRIAMYCIN 、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體注射劑(D0XIL )、脂質體多柔比星TLC D-99 (MY0CET )、PEG 化脂質體多柔比星(CAELYX )、和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類 (mitomycins)諸如絲裂黴素 C、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、 橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(ρ印lomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤、吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR )、替加氟(tegafur) ( UFTORAL )、 卡培他濱(capecitabine) ( XELODA )、埃坡黴素(印othilone)和5_氟尿嘧啶 (5-FU)；考布他汀(combretastatin)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶醯三穀氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6_ 巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤 (thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類， 諸如卡魯辜麗(calusterone)、丙酸屈他雄麗(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米託坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone) ；elfornithine ； 依利醋銨(elliptinium acetate)；印othilone ；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達明(Ionidamine)；美登木素生物喊類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocin)；米 ^B 月瓜月宗(mitoguazone)；米託惠酉昆(mitoxantrone)；莫口；！達酉享(mopidamol) ； 二月安硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；洛索惠酉昆(Iosoxantrone) ；2-乙基酉先月井(ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ； PSK 多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生 (razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺方寵錯(spirogermanium)； 細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone) ；2,2 『，2〃 -三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin) Α、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛 (vindesine) ( ELDISINE , FILDESIN )；達卡巴嗪(dacartazine)；甘露醇氮芥 (mannomustine) ；二漠甘露酉享(mitobronitol) ；二漠衛矛酉享(mitolactol)；喊泊漠燒 (pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( 「Ara-C")；塞替派(thiotepa)； 類紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel) ( TAXOL )、清蛋白改造的納米顆粒劑型帕利他塞(ABRAXANE )和多西他塞(doxetaxel) ( TAXOTERE );苯丁酸氮芥(chlorambucil) ；6_ 硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)
45(例如ELOXATIN )和卡鉬(carboplatin)；長春藥類(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括長春鹼(vinblastine) (VELBAN ),長春新鹼 (vincristine) (ONCOVIN )、長春地辛(vindesine) (ELDISINE , FILDESIN )、 和長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE );依託泊苷(etoposide) (VP-16)； 異環磷醯胺(ifosfamide)；米託蒽醌(mitoxantrone)；亞葉酸(Ieucovorin)；能滅瘤(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ； 二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)，包括貝沙羅汀(bexarotene) (TARGRETIN )； 二膦酸鹽類(bisphosphonates)， 諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )、依替膦酸鈉 (etidronate) ( DIDROCAL )、ΝΕ_580%、唑來膦酸/ 唑來膦酸鹽(zoledronic acid/ zoledronate) ( ZOMETA )、阿倫膦酸鹽(alendronate) ( FOSAMAX )、帕米膦酸鹽(pamidronate) ( AREDIA )、替魯膦酸鹽(tiludronate) ( SKELID )或利塞膦酸鹽(risedronate) ( ACTONEL );以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如I3KC- α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)(例如依洛替尼(erlotinib) (TARCEVA ))；和降低細胞增殖的 VEGF-A ；疫苗，諸如THERAT0PE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALLO VECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN ) ； rmRH (例如ABARELIX )； BAY439006 (sorafenib ；Bayer) ；SU-11248 (sunitinib，SUTENT , Pfizer)；哌立福辛 (perifosine), C0X-2抑制劑(如塞來考昔(celecoxib)或艾託考昔(etoricoxib))，蛋白體抑制劑(例如 PSMl) ；bortezomib ( VELCADE ); CCI-779 ;tipifarnib(Rll577)； orafenib，ABT510 ;Bcl-2 抑制劑，諸如 oblimersen sodium ( GENASENSE ); pixantrone ；EGFR抑制劑；酪氨酸激酶抑制劑；絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素 (rapamycin) (sirolimus，RAPAMUNE )；法尼基轉移酶抑制劑，諸如 lonafarnib (SCH 6636，SARASARTM)；及任何上述各項的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多種上述各項的組合，諸如CHOP(環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼和潑尼松龍聯合療法的縮寫)和 FOLFOX (奧沙利鉬(ELOXATIN )聯合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)，及任何上述物質的藥劑學可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質的組合。
本文中所定義的化療劑包括「抗激素劑」或「內分泌治療劑」，其作用於調節、降低、阻斷、或抑制能促進癌症生長的激素的效果。它們自身可以是激素，包括但不限於抗雌激素類和選擇性雌激素受體調控物類(SERM)，包括例如他莫昔芬 (tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬 (droloxifene)、4_羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、 LYl 17018、奧那司酮(onapristone)和 FARESTON 託瑞米芬(toremifene)；抑制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、 AROMASIN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR 伏羅唑(v0r0Z0le)、FEMARA 來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、 比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(tr0XaCitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常(abherant)細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如HiC-α、 Raf和H-Ras ；核酶，諸如VEGF表達抑制劑(例如ANGIOZΥΜΕ 核酸)和HER2表達抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和 VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL-2 ； LURTOTECAN 拓撲異構酶 1 抑制劑； ABARELIX rmRH ；長春瑞濱(Vinorelbine)和埃斯波黴素(Esperamicins)(見美國專利No. 4，675，187)；及任何上述物質的藥劑學可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質的組合。「生長抑制劑」在用於本文時指在體外或在體內抑制細胞(諸如表達VEGF的細胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低處於S期的細胞(諸如表達VEGF的細胞)百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處於S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新鹼(vincristine)禾口長春鹼(vinblastine))、紫杉燒類(taxanes)、 和拓撲異構酶Π抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔紅黴素 (daunorubicin)、依託泊苷(etoposide)和博來黴素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、 達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤 (methotrexate)、5_ 氣尿口密 (5-fIuorouraci 1)禾口 ara_C。更多信;窗、可參見 Mendelsohn 禾口 Israel 編，〈〈The Molecular Basis of Cancer》，第 1 章，IS為"Cell cycle regulation, oncogenes, and antieioplastic drugs", Murakaini 等X，WB Saunders, Philadelphia, 1995，例如第13頁。紫杉烷類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE ,l hone-poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL ,Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進由微管蛋白二聚體裝配成微管並通過防止解聚使微管穩定，導致對細胞中有絲分裂的抑制。「放射療法」或「放療」指使用定向伽馬射線或貝塔射線來誘發對細胞的足夠損傷，以限制細胞正常發揮功能的能力或全然破壞細胞。應當領會，本領域知道許多方式來確定治療的劑量和持續時間。典型的治療作為一次施用來給予，而典型的劑量範圍為每天 10-200個單位(戈瑞(Gray))。疾病的「病理」包括所有危及患者康樂的現象。例如，這包括但不限於異常的或不可控的細胞生長、轉移、對鄰近細胞正常機能的幹擾、細胞因子或其它分泌產物的異常水平釋放、炎性或免疫學應答的抑制或惡化、等。「小分子」在本文中定義為具有小於約500道爾頓的分子量。術語「靜脈內輸注」指以超過約5分鐘的一段時間，優選30-90分鐘，將藥物導入動物或人患者的靜脈，儘管依照本發明，靜脈內輸注或可施用10小時或更短。術語「靜脈內推注」或「靜脈內快速注射」指在約15分鐘內或更短，優選5分鐘或更短，將藥物施用到動物或人的靜脈中使得機體接受藥物。
術語「皮下施用，，指通過自藥物容器的相對較慢的、持續投遞，將藥物導入動物或人患者的皮膚下，優選在皮膚和皮下組織間的袋內。所述袋可通過夾起或拉起皮膚並遠離皮下組織來創建。術語「皮下輸注」指以一段時間，包括但不限於30分鐘或更短，或者90分鐘或更短，通過自藥物容器的相對較慢的、持續投遞，將藥物導入動物或人患者的皮膚下，優選在皮膚和皮下組織間的袋內。任選的是，輸注可通過植入動物或人患者皮膚下的藥物投遞泵的皮下植入來進行，其中所述泵以預定的一段時間，諸如30分鐘、90分鐘、或跨越治療方案持續時間的一段時間，投遞預定量的藥物。術語「皮下推注」指將藥物施用至動物或人患者的皮膚下，其中推注藥物投遞優選短於約15分鐘，更優選短於5分鐘，最優選短於60秒。施用優選在皮膚和皮下組織間的袋內，其中所述袋可通過例如夾起或拉起皮膚並遠離皮下組織來創建。術語「標記物」在用於本文時指與多肽直接或間接偶聯的可檢測化合物或組合物。 標記物自身可以是可檢測的(例如放射性同位素標記物或螢光標記物)，或者在酶標記物的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。ig^抗體是對特定抗原展現出結合特異性的蛋白質。天然抗體通常是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構成。每條輕鏈通過共價二硫鍵連接一條重鏈，而二硫化物連接的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變域(Vh)， 接著多個恆定域。每條輕鏈具有一端的一個可變域和另一端的一個恆定域；輕鏈的恆定域與重鏈的第一恆定域並列，而輕鏈可變域與重鏈可變域並列。認為特定胺基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變域之間的界面。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，抗體或免疫球蛋白可歸至不同的類。有五大類免疫球蛋白IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，而且這些中的幾項可進一步分成亞類(同種型)， 例如 IgG1, IgG2, IgG3JP IgG4 ；IgA1 和 IgA20 多種人 IgG1, IgG2, IgQ、和 IgG4 同種異型已有記載(綜述見 M.-P. LeFranc and G. LeFranc in: 「 The Human IgG Subclasses, 「 F. Shakib (ed.) ,pp. 43-78,Pergamon Press，Oxford(1990))。IgG類的不同同種型，包括 IgG」 IgG2s、IgG3JP IgG4，具有獨特的物理、生物、和臨床特性。人IgG1是最常用於治療目的的抗體，而且大多數工程改造研究在此背景中構建。本申請致力於包括胺基酸修飾的變體IgG免疫球蛋白，該胺基酸修飾改變IgG的生物學特性。本申請的變異免疫球蛋白包括包含經修飾Fc區的抗體，其展示與野生型抗體相比要長的體內半衰期。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG 的半衰期相比延長至少50%。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長至少75%。在某些實施方案中，本發明的變體IgG 的半衰期與具有野生型人IgG Fc區的IgG的半衰期相比延長至少100%。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約15天。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約20天。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約25天。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約30天。在
48某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約35天。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是至少約40天。在某些實施方案中，變體IgG是變體IgG115在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是在人類中測量的半衰期。在某些實施方案中，本發明的變體IgG的半衰期是在獼猴中測量的半衰期。抗體片段本發明涵蓋抗體片段。特別感興趣的是包含Fc區、Fc融合物和重鏈恆定區的抗體。在某些實施方案中，抗體片段是包含F區的變異免疫球蛋白(IgG)片段。抗體片段可以通過傳統手段來生成，諸如酶促消化，或者通過重組技術來生成。已經開發了用於生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science 229 :81(1985)) 然而，現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達及由大腸桿菌分泌，如此容許容易地生成大量的這些片段。可從噬菌體抗體庫中分離抗體片段。在某些實施方案中，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段並化學偶聯以形成F(ab' )2片段 (Carter等，Bio/Technology 10 :163-167 (1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab' )2片段。用於生成抗體片段的其它技術對於熟練從業人員將是顯而易見的。抗體片段還可以是「線性抗體」，例如如美國專利No. 5，641，870中所記載的。此類線性抗體可以是單特異性的或雙特異性的。人源化抗體本發明涵蓋人源化抗體。在某些實施方案中，人源化抗體是相對於野生型IgG在 Fc區中具有一處或多處胺基酸修飾的人源化變體IgG。本領域知道用於人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可具有一個或多個從非人來源引入的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常常稱為「輸入」殘基，它們通常取自「輸入」可變域。基本上可遵循Winter及其同事的方法進行人源化(Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science 239 :1534-1536 (1988))，即用(非人)高變區序列替代人抗體的對應序列。因此，此類「人源化」抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4，816，567)， 其中顯著少於完整的人可變域用非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些高變區殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點的殘基替代。用於製備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變域的選擇對於降低抗原性可能是重要的。依照所謂的「最適(best-fit)」方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知人可變域序列的整個文庫進行篩選。然後選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(參見例如 Sims 等，J. Immunol. 151 :2296 (1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 :901 (1987))。 另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用於數種不同的人源化抗體(參見例如Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 (1992) ；Presta 等，J. Immunol. 151 2623 (1993))。一般還希望的是，抗體在人源化後保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學特性。為了達到此目的，依照一種方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物的過程來製備人源化抗體。通常可獲得免疫球蛋白三維模型，這是本領域技術人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式。通過檢查這些顯示圖像能分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基並組合，從而得到期望的抗體特徵，諸如對靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區殘基直接且最實質地涉及對抗原結合的影響。人抗體在某些實施方案中，本發明的人抗體是相對於野生型IgG在Fc區中具有一處或多處胺基酸修飾的人變體IgG。人抗體可以通過如上所述聯合選自人衍生噬菌體展示庫的 Fv克隆可變域序列與已知的人恆定域序列來構建。或者，可以通過雜交瘤方法來生成人單克隆抗體。用於生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系已有記載，例如 Kozbor, J. Immunol. ,133 :3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc. , New York,1987)；及 Boerner 等，J. Immunol.，147 :86 (1991).例如，現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫後生成人抗體完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因將導致在抗原攻擊後生成人抗體。參見例如 Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551 (1993) Jakobovits等，Nature 362 255-258(1993) ；Bruggermann 等，Year in Immunol. 7 :33 (1993)。基因改組也可用於自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為「表位印記」(印itope imprinting)，如本文所述通過噬菌體展示技術得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變域用人V結構域基因全集替換，產生非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進行的選擇導致如下非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級噬菌體展示克隆中消除相應的非人鏈後恢復了抗原結合位點，即表位決定(印記(imprint))人鏈配偶的選擇。在重複該過程以替換剩餘非人鏈時，得到人抗體(參見PCT WO 93/06213，公布於1993年4月1 日)。與傳統的通過CDR移植進行的非人抗體的人源化不同，此技術提供完全人的抗體，它們不含非人起源的FR或CDR殘基。雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，雙特異性抗體是相對於野生型抗體在Fc區中具有一處或多處胺基酸修飾的雙特異性抗體。在某些實施方案中，雙特異性抗體是人抗體或人源化抗體。在某些實施方案中， 結合特異性之一針對VEGF，結合特異性之另一針對任何其它抗原。在某些實施方案中，雙特異性抗體可結合VEGF的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用於將細胞毒劑定位於表達 VEGF的細胞。這些抗體擁有VEGF結合臂和結合細胞毒劑(諸如例如肥皂草毒蛋白、抗幹擾素-α、長春花生物鹼類、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。在某些抗體中，結合特異性是對於IL-4和IL-13的。可將雙特異性抗體製備成全長抗體或包含 Fc區的抗體片段。用於構建雙特異性抗體的方法是本領域已知的。在傳統上，雙特異性抗體的重組生產基於兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種重鏈具有不同的特異性 (Millstein和Cuello，Nature 305 =537(1983)) 由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配， 這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產物產量低。類似的規程披露於WO 93/08829，公布於1993年5月13日及Traunecker等， EMBO J. 10 3655(1991)。 依照一種不同的方法，將具有期望結合特異性(抗體_抗原結合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。例如，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定域進行融合。在某些實施方案中，在至少一種融合物中存在包含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恆定區(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，並共轉染入合適的宿主生物體。在用於構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。由於免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑， 因此發現這種不對稱結構便於將期望的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露於W094/04690。關於生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh等， Methods in Enzymology 121:210(1986)。依照另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養物回收的異二聚體的百分比最大化。界面包含至少部分抗體恆定域(^3結構域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產生與大側鏈相同或相似大小的補償性「空腔」。這提供了較之其它不想要的終產物諸如同二聚體提高異二聚體產量的機制。雙特異性抗體包括交聯或「異源偶聯」抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可以與親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，此類抗體已經建議用於將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)，及用於治療HIV感染(W0 91/00360, WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交聯方法來製備異源偶聯抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起披露於美國專利No. 4，676，980。Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)記載的「雙抗體」 技術提供了構建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈恆定域 (Vh)和輕鏈恆定域(\)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此， 迫使一個片段上的Vh和\結構域與另一個片段上的互補\和Vh結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報導了通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體構建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見 Gruber 等，J. Immunol. 152 5368 (1994)。涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol. 147 60(1991)。
多價抗體多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化 (和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。 多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。在某些實施方案中，二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體將包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。在某些實施方案中，多價抗體包含(或由其組成)三個至大約八個抗原結合位點。在一個這樣的實施方案中，多價抗體包含(或由其組成)四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(例如兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或更多可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl) n-VD2-(X2)n-FC，其中VDl是第一可變域， VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，Xl和X2代表胺基酸或多肽，而η是0或1。 例如，多肽鏈可包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CHI-VH-CHI-Fc區鏈。本文中的多價抗體可進一步包含至少兩條(例如四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進一步包含CL結構域。單域抗體在有些實施方案中，本發明的抗體是包含Fc區的單域抗體(single-domain antibody)。在某些實施方案中，單域抗體相對於野生型IgG在Fc區中具有一處或多處胺基酸修飾。單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或者整個或部分輕鏈可變域的單一多肽鏈。抗體修飾在某些實施方案中，涵蓋本文所述免疫球蛋白的胺基酸序列修飾。在某些實施方案中，修飾包含對本發明變體IgG的一處或多處胺基酸修飾。在某些實施方案中，可能希望進一步改變本發明變體IgG的結合親和力、體內半衰期和/或其它生物學特性。在某些實施方案中，胺基酸修飾包含本文中未描述的Fc區中的一處或多處胺基酸修飾。變體IgG的經修飾胺基酸序列可以是通過將適宜的變化引入編碼抗體的核苷酸序列或通過肽合成製備的。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基刪除和/或插入和/或替代。可進行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構建物，倘若最終的構建物具有期望的特徵。可在製備序列時將胺基酸改變引入受試抗體的胺基酸序列。可用於鑑定抗體中作為優選誘變位置的某些殘基或區域的方法有「丙氨酸掃描誘變，，，如 Cunningham 和 Wells (1989) Science 244 1081-1085 中所述。這裡，鑑定一個殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如arg、asp、his、IysjP glu)並用中性或帶負電荷的胺基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替換，以影響胺基酸與抗原的相互作用。然後通過在或對替代位點引入更多或其它修飾，推敲對替代展示功能敏感性的胺基酸位置。由此，儘管用於引入胺基酸序列修飾的位點是預先決定的，然而突變本身的本質不必預先決定。例如， 為了分析指定位點處突變的後果，在靶密碼子或區域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，並對所表達的免疫球蛋白篩選期望的活性。

胺基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度範圍由一個殘基至包含一百或更多殘基的多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨醯殘基的抗體。抗體分子的其它插入修飾包括將抗體的N或C端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽融合。在某些實施方案中，本發明的變體IgG發生了改變以提高或降低抗體糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-連接的或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著於天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-χ-絲氨酸和天冬醯胺-χ-蘇氨酸(其中X 是除脯氨酸外的任何胺基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著於天冬醯胺側鏈的識別序列。 如此，多肽中這些三肽序列中的任一的存在產生了潛在的糖基化位點。0-連接的糖基化指將糖類N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著於羥基胺基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。 向抗體中添加或刪除糖基化位點可通過改變胺基酸序列從而創建或消除一個或多個上述三肽序列而便利地完成(用於N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始抗體的序列中添加、刪除、或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行(用於0-連接的糖基化位點)。可改變附著於變體IgG之Fc區的碳水化合物。由哺乳動物細胞生成的天然抗體典型地包含分支的、雙觸角的寡糖，其一般通過N-連接附著於Fc區CH2結構域的Asn297 (參見例如Wright等(1997) TIBTECH 15:26-32)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、 N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附著至雙觸角寡糖結構「主幹」中GIcNAc 的巖藻糖。在一些實施方案中，可以對本發明變體IgG中的寡糖進行修飾以創建具有某些別的改善特性的變體IgG。在某些實施方案中，變體IgG進一步包含第297位變成丙氨酸的胺基酸替代。例如，提供了有缺乏巖藻糖的碳水化合物結構(直接地或間接地)附著於 Fc區的抗體修飾。此類修飾可具有改善的ADCC功能(參見例如美國專利申請號US 2003/0157108(Presta，L.) ；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))。涉及 「脫巖藻糖型」或「巖藻糖缺乏型」抗體修飾的出版物的例子包括US 2003/0157108 ；WO 2000/61739 ；WO 2001/29246 ；US2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US 2004/0132140 ；US2004/0110704 ；US 2004/0110282 ；US 2004/0109865 ；WO 2003/085119 ； W02003/084570 ；WO 2005/035586 ；WO 2005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ； Okazaki 等，J. Mol. Biol. 336 1239-1249 (2004) ;Yamane_0hnuki 等，Biotech. Bioeng. 87 :614(2004)。能夠生成脫巖藻糖化抗體的細胞系的例子包括蛋白質巖藻糖化缺陷的 Lecl3CH0 細胞(Ripka 等，Arch. Biochem. Biophys. 249 :533_545 (1986)；美國專利申請號 US 2003/0157108A1, Presta, L ；及 W 2004/056312A1, Adams 等，尤其是實施例11)和敲除細胞系，諸如α-1，6-巖藻糖轉移酶基因FUT8敲除的CHO細胞(參見例如 Yamane-Ohnuki 等，Biotech. Bioeng. 87 614 (2004) ；Kanda, Y.等，Biotechnol. Bioeng., 94(4) 680-688(2006)；及 W02003/085107)。進一步提供了具有等分寡糖的抗體修飾，例如其中附著於抗體Fc區的雙觸角寡糖被GlcNAc等分。此類抗體變體可具有降低的巖藻糖化和/或改善的ADCC功能。此類抗體修飾的例子記載於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等)；美國專利 No. 6，602，684(Umana 等)；及 US 2005/0123546 (Umana 等)。還提供了在附著於 Fc 區的寡糖中有至少一個半乳糖殘基的抗體修飾。此類抗體修飾可具有改善的CDC功能。此類抗體修飾記載於例如 WO 1997/30087 (Patel 等)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及 WO 1999/22764(Raju, S.)。在某些實施方案中，本發明涵蓋了如下抗體修飾，其具有一些但非所有效應器功能，這使之成為其中抗體體內半衰期是重要的但某些效應器功能(諸如補體和ADCC)不是必需的或有害的許多應用的期望候選物。在某些實施方案中，測量抗體的Fc活性以確保只保留了期望的特性。可進行體外和/或體內細胞毒性測定法來證實CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合測定法來確認抗體缺乏Fc γ R結合 (從此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達 Fc γ RIII，而單核細胞表達 Fc y RI, Fc γ RII 和 Fc yRIII。Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92 (1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。美國專利No. 5，500，362中記載了評估感興趣分子的ADCC活性的體外測定法的非限制性實例(還可參見 Hellstrom，I·，et al. Proc. Nat，1 Acad. Sci· USA 83:7059-7063(1986)； Hellstrom, I et al. , Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 82 1499-1502(1985) ；5,821, 337 ； Bruggemann, Μ. et al. , J. Exp. Med. 166 1351-1361 (1987))。或者，可採用非放射性測定方法(參見例如ACTI 非放射性細胞毒性測定法，其用於流式細胞術(CellTechnology， Inc. Mountain View, CA)；和 CytoTox 96 非放射性細胞毒性測定法(Promega，Madison, WI))。可用於此類測定法的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可以在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al. Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)中所披露的。還可以進行 Clq 結合測定法來證實抗體不能結合Clq及從此缺乏CDC活性。為了評估補體激活，可進行CDC測定法(參見例如 Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202 163 (1996) ；Cragg, M. S. et al.，Blood 101 1045-1052 (2003)；及 Cragg,M. S.和 M. J. Glennie, Blood 103 2738-2743(2004))。還可以使用本領域知道的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期測定(參見例如 Petkova，S. B. et al.，Int，1. Immunol. 18(12) 1759-1769 (2006))。提供了另一類具有一處或多處胺基酸替代的抗體修飾。進行替代誘變的感興趣位點包括高變區，但是也涵蓋FR改變。表1中「優選替代」欄顯示了保守替代。表1中提供了稱為「例示替代」的更實質變化，或如下文參照胺基酸分類進一步描述的。可以將胺基酸替代摻入感興趣抗體，並篩選產物，例如篩選期望的活性，諸如改善的抗原結合、降低的免疫原性、改善的ADCC或⑶C、等等。 表1
原始殘基例示替代優選替代
Ala(A)Val ；Leu ；lieVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn(N)Gln ；His ；Asp, Lys ；ArgGln
Asp(D)Glu ；AsnGlu
權利要求
1.一種變體IgG，其包含如下的人IgG Fc區，相對於野生型人IgG Fc區包含依照Kabat 中的EU索引編號的胺基酸殘基251、252、307、308、378、428、430、434、和436中兩處或更多處的兩個或更多個胺基酸替代，其中所述變體IgG具有與具有野生型人IgG Fc區的IgG 的半衰期相比延長的半衰期，且其中至少兩處所述胺基酸替代是胺基酸殘基251、252、307、 308、378、428、430、434、或436處的，而且胺基酸殘基251處的胺基酸替代是用天冬氨酸或穀氨酸摘要)進行的替代，胺基酸殘基252處的胺基酸替代是用酪氨酸進行的替代，胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，胺基酸殘基308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代，胺基酸殘基378處的胺基酸替代是用纈氨酸進行的替代，胺基酸殘基 4 處的胺基酸替代是用亮氨酸進行的替代，胺基酸殘基430處的胺基酸替代是用丙氨酸或賴氨酸進行的替代，胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸、絲氨酸或酪氨酸進行的替代，而胺基酸殘基436處的胺基酸替代是用異亮氨酸進行的替代。
2.權利要求1的變體IgG，其包含胺基酸308處用脯氨酸進行的胺基酸替代和胺基酸 434處用丙氨酸進行的胺基酸替代。
3.一種變體IgG，其包含如下的人IgG Fc區，相對於野生型人IgG Fc區包含依照Kabat 中的EU索引編號的胺基酸殘基251、252、307、308、378、380、428、430、434、和436中三處或更多處的三個或更多個胺基酸替代，其中所述變體IgG具有與具有野生型人IgG Fc區的 IgG的半衰期相比延長的半衰期，且其中至少三處所述胺基酸替代是胺基酸殘基251、252、 307、308、378、380、428、430、434、或436處的，而且胺基酸殘基251處的胺基酸替代是用天冬氨酸或穀氨酸進行的替代，胺基酸殘基252處的胺基酸替代是用酪氨酸進行的替代，胺基酸殘基307處的胺基酸替代是用穀氨醯胺進行的替代，胺基酸殘基308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代，胺基酸殘基378處的胺基酸替代是用纈氨酸進行的替代，胺基酸殘基380處的胺基酸替代是用丙氨酸進行的替代，胺基酸殘基4 處的胺基酸替代是用亮氨酸進行的替代，胺基酸殘基430處的胺基酸替代是用丙氨酸或賴氨酸進行的替代，胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸、絲氨酸、酪氨酸或組氨酸進行的替代，而胺基酸殘基436處的胺基酸替代是用異亮氨酸進行的替代。
4.權利要求1或3的變體IgG，其具有比具有野生型人IgGFc區的IgG更高的對Fcfoi 的結合親和力。
5.權利要求1或3的變體IgG，其在pH6. 0具有比在pH 7. 4更高的對Fcfoi的結合親和力。
6.權利要求1或3的變體IgG，其具有相等的或比具有野生型人IgGFc區的IgG更高的功效。
7.權利要求6的變體IgG，其具有比具有野生型人IgGFc區的IgG更高的功效。
8.權利要求1或3的變體IgG，其是人的或人源化的IgG。
9.權利要求8的變體IgG，其是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。
10.權利要求1或3的變體IgG，其中所述IgGFc區是IgGlFc區。
11.權利要求1或3的變體IgG，其中所述變體IgG是抗VEGF抗體。
12.權利要求1或3的變體IgG，其包含重鏈可變域(SEQID NO 1)和輕鏈可變域(SEQ ID NO 2)。
13.一種藥物組合物，其包含權利要求1或3的變體IgG和藥學可接受載體。
14.一種試劑盒，其包含容器中的權利要求1或3的變體IgG和使用說明。
15.一種變體IgGl，其包含如下的人IgGlFc區，相對於野生型人IgGlFc區包含依照 Kabat中的EU索引編號的胺基酸殘基308和434處的胺基酸替代，其中所述變體IgGl具有與具有野生型人IgGlFc區的IgGl的半衰期相比延長的半衰期，且其中胺基酸殘基308處的胺基酸替代是用脯氨酸進行的替代，而胺基酸殘基434處的胺基酸替代是用丙氨酸進行的替代。
16.一種治療受試者中的腫瘤的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的權利要求1或3的變體IgG。
17.—種抑制受試者中的VEGF活性的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的權利要求1或3的變體IgG。
18.權利要求17的方法，其中所述VEGF活性是血管發生。
19.一種調控受試者中的血管通透性的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的權利要求1或3的變體IgG。
20.一種抑制或預防受試者中的癌細胞生長的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的權利要求1或3的變體IgG。
21.權利要求16、17、19或20的方法，其中每4周或每4周以上時間對所述受試者施用所述變體IgG。
全文摘要
提供了具有延長的體內半衰期，在Fc區中具有一處或多處胺基酸修飾的變異免疫球蛋白，及使用它們的方法。
文檔編號C07K16/32GK102245208SQ200980150204
公開日2011年11月16日 申請日期2009年10月13日 優先權日2008年10月14日
發明者亨利·B.勞曼, 伊克·A.耶昂, 玉茹·G.孟, 納波裡奧尼·弗萊拉, 莉薩·A.達米科 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司