抗瘧疾的疫苗接種方法

2023-09-15 12:20:55

專利名稱：抗瘧疾的疫苗接種方法
相關申請的交叉引用本申請基於2002年10月23日提交的美國臨時申請S.N.60/420,265(Attorney Docket No.4012.6001)和2003年2月13日提交的美國臨時申請S.N.60/447,026(Attorney Docket No.4012.6002)，並要求其權利。本申請基於這些臨時申請的整個公開內容，並在此處將其併入為參考。
背景技術：
瘧疾是熱帶和亞熱帶最嚴重的公共健康問題之一。在發展中世界，每年有300到500百萬人新感染瘧原蟲，高達2.7百萬人死於瘧疾(110)。惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)是負責瘧疾所致的大多數死亡的瘧原蟲物種。
惡性瘧原蟲的生命周期存在4個分離的階段，其中有3個存在於人體內。一般地見115。在第一階段，在唾腺中攜帶傳染性子孢子的蚊子從人處獲取血液，並在吸血時將這些子孢子傳遞到人的血流中。一旦進入肝臟實質細胞，子孢子便複製形成裂殖子。在第二階段，裂殖子穿行於血流，感染紅細胞(RBCs)。紅細胞被裂殖子充滿後就會破裂，釋放出感染新的紅細胞的後代。貧血是這一階段感染的常見症狀。最後，這些紅細胞中的一些也將產生雄性和雌性配子體(第三階段)。在最後的階段，未感染的蚊子以感染的人為食，攝入配子體。在蚊子中，雌性配子體的受精最終導致傳染性子孢子的產生，從而完成周期。
當病原體如惡性瘧原蟲進入人體，身體通過激活免疫系統而產生應答。首先產生一般性應答，之後是病原體特異的應答。病原體特異的應答以侵入的病原體獨特的抗原為目標。病原體特異的應答的兩個主要的武器是細胞和體液應答。CD8+和CD4+T細胞參與細胞免疫應答。具體的是，CD8+T細胞產生γ幹擾素(IFN-γ)之類的細胞因子，γ幹擾素對免疫系統的其它組分(如巨噬細胞)具有多種刺激效果。一種特殊的CD8+T細胞——細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)特異地殺死在其表面表達病原體抗原的感染細胞。相反，CD4+T細胞或T輔助細胞促進細胞毒性T淋巴細胞的發育並誘導B細胞分裂並最終產生抗體。T輔助細胞可以被分成兩個亞類——TH1和TH2 CD4+T細胞，根據它們產生的細胞因子的類型而鑑別。病原體特異的免疫應答的第二個武器由體液應答組成，其中B細胞複製、分化、並最終產生直接結合病原體的抗體。抗體對於包被沒有與任何宿主細胞相聯繫的病原體特別有用。然後，吞噬細胞(如巨噬細胞)吞沒抗體包被的病原體。
就瘧疾感染而言，病原體特異性免疫應答的不同武器在惡性瘧原蟲生命周期的特定階段最為有效。當傳染性子孢子穿行到肝臟並進入肝細胞時，該子孢子變為細胞內病原體，在感染的細胞外只花費很少的時間。在這一階段，CD8+T細胞和CD4+T細胞特別重要，因為這些T細胞和它們的細胞因子產物(如γ-IFN)主要負責殺死感染的宿主細胞。來自NavalMedical Research Center(NMRC)瘧疾項目和其它實驗室的大量數據表明鼠瘧疾中細胞內肝臟寄生蟲的消除依賴於針對肝臟階段寄生蟲所表達的肽的CD8+T細胞應答(45)。CD8+T細胞的耗竭將廢除抵禦裂殖子攻擊的保護作用(27，31，90，93，108)並且向首次用於實驗的動物過繼轉移CD8+T細胞可以賦予保護作用(56，85，87，109)。
DNA疫苗誘導細胞介導的免疫應答，包括抗原特異的CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)和偏向Th1的CD4+T細胞應答，它們是抵禦細胞內病原體和腫瘤的主要保護機制(6，11，45，63，104，106)。然而，迄今DNA疫苗被證明對於在人中誘導保護性免疫應答而言不是最佳的。
相反，當瘧疾感染達到第二階段並感染紅細胞後，感染性裂殖子不僅在紅細胞內複製，而且在血流中自由循環。由於兩個原因，抗體應付感染的這一階段最為有效。首先，CTLs需要感染的宿主細胞在稱為MHC-I的特殊蛋白質上呈遞抗原。紅細胞不表達MHC-I，因此降低了CTLs的效力。其次，如上所討論的，抗體介導沒有與宿主細胞發生關係的病原體的吞噬。因此，在感染的第二階段，B細胞和刺激B細胞的CD4+T細胞對於抗擊感染而言都是重要的。
針對惡性瘧原蟲的人免疫應答的複雜性，以及具有階段特異的蛋白質表達的多階段寄生蟲生命周期，導致開發針對惡性瘧原蟲的疫苗的困難。但是，仍然需要瘧疾疫苗。
惡性瘧原蟲的子孢子階段已經被鑑定為瘧疾疫苗的潛在目標。子孢子主要的表面蛋白質被稱作環子孢子蛋白(CS蛋白)。已克隆、表達並測序了來自7G8株的蛋白質(21)。其特徵在於具有中心免疫顯性的重複區，該重複區包含重複37次的4肽Asn-Ala-Asn-Pro，但是被4個次要的重複Asn-Val-Asp-Pro所點綴。在其它株中，主要和次要重複區的數量以及它們的相對位置有所變化。此中心部分的兩側是由非重複性胺基酸序列所組成的N和C端部分，非重複性胺基酸序列被稱為CS蛋白質的非重複部分。
Vical，Inc.San Diego，CA和Naval Medical Research Center開發了一種含有表達惡性瘧原蟲環子孢子蛋白(PfCSP)基因的質粒的基於DNA的疫苗(47)。該疫苗由以每毫升2500μg的濃度含於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)的裸DNA組成。所述質粒含有編碼完整PfCSP基因的全長基因，具有由CMVIE基因的增強子和啟動子控制的表達、並具有CMV IE基因的5』非翻譯區和牛生長激素基因的轉錄終止子(64)。為了增強抗原在哺乳動物細胞中的表達和分泌，將編碼人組織纖維酶原激活物蛋白(hTPA)前導肽的序列加到編碼序列的5』端。含於PfCSP質粒的兩個開放閱讀框編碼卡那黴素抗性蛋白和hTPA前導區/PfCSP融合蛋白質(40)。PfCSP質粒不含有已知的病毒或致癌蛋白質編碼序列。該質粒含有6261個核苷酸鹼基對並具有4.07X106 gmu的分子量(假定DNA的平均鹼基對為650gmu)。
使用克隆的DNA的片段構建PfCSP DNA質粒，克隆的DNA的片段使用標準分子遺傳技術從純化的質粒獲得。所述質粒產生於用卡那黴素選擇培養基培養的細菌(大腸桿菌(E.coli)細胞。發酵細菌細胞後純化質粒DNA。
在臨床試驗開始之前，在NMRC進行了PfCSP DNA疫苗的臨床前免疫原性研究。具體地，在通過免疫印跡分析評估抗原表達之後，將PfCSP質粒瞬時轉染進培養的哺乳動物細胞。還在小鼠和非人靈長類中測試了質粒誘導抗原特異的抗體和CTL應答的能力(40，105)。在小鼠模型中的研究證明了在用質粒DNA免疫之後抗原特異的CTL和抗體應答的誘導(30)。如其它系統中報導的，研究進一步確立了免疫的肌內(IM)路徑對於CD8+Th1免疫應答的誘導是最佳的(30)。此外，隨後的研究表明，經由IM路徑以單獨的PfCSP質粒或與另外四種編碼其它紅細胞前肝臟階段惡性瘧原蟲蛋白質的質粒組合的PfCSP質粒免疫的所有六隻恆河猴(Rhesus monkey)都具有可檢測的抗原特異的CTL和/或抗體應答(106)。
在用於臨床試驗之前，進行了廣泛的臨床前安全性研究。這些研究包括1)經由靜脈(IV)路徑或IM路徑施用的質粒DNA的小鼠組織分布研究；2)在小鼠和兔中的反覆劑量安全性研究；和3)小鼠中的質粒DNA整合研究(67，75)。這些研究被概括如下。
質粒分布研究Parker等人評估了小鼠不同組織中的質粒分布(75)。小鼠經由IV或IM接受一次劑量的PfCSP質粒，該劑量是推薦給人的最高mg/kg劑量的25倍。在以下時間點收穫組織並使用PCR評估質粒DNA的存在IV施用後的1小時、兩天和4周，以及IM施用後的2天、4周和8周。IM施用後的1小時發現質粒DNA分布於所有組織。到IM施用後的兩天，只在骨髓、血液和注射位點發現質粒，在注射位點具有最高水平。到IM施用後的1周，只在注射位點檢測到質粒DNA。IV施用後，發現PfCSP DNA質粒以低水平分布於除性腺和腦外的所有組織。IV施用後4周，只在一個動物的肺中檢測到DNA質粒。
反覆劑量安全性研究Parker等人也致力於在小鼠和兔中給予反覆劑量的該疫苗的安全性(75)。在小鼠的反覆劑量安全性研究中，在28天的時期內，動物接受8次反覆的IM注射PfCSP DNA質粒，劑量為1.0μg、10μg和100μg(累積劑量基於mg/kg相當於建義的人劑量的5-500倍)。沒有異常的血液學或血清化學、異常的組織病理學、或誘導針對dsDNA的抗體或抗核抗體的跡象。在兔子的反覆劑量安全性研究中，動物接受6次每周一次的IM質粒注射，劑量為150μg和450μg。如在鼠中的研究，再次沒有異常的血液學或血清化學、異常的組織病理學、或針對dsDNA的抗體或抗核抗體的誘導的跡象。因此，Parker的研究表明PfCSP質粒的分布遍布於宿主組織，該質粒在這些組織中的一些保留長久的時期，並且該質粒用於人是安全的，因為當將其施用於志願者後沒有出現副反應。
整合研究Martin等人評估了是否PfCSP質粒整合進宿主染色體DNA(67)。向各小鼠注射單次劑量的質粒DNA，在注射後的第30和60天，以靈敏度為每微克DNA 1-10拷貝的PCR分析來分析組織。總體而言，沒有提供質粒整合的證據，並暗示如果存在質粒DNA向基因組DNA的整合，其水平是極低的，比預期的自發突變水平低幾千倍。
研究人員證實了PfCSP疫苗的安全性之後，NMRC開展了兩個一期臨床試驗。在第一個試驗中，健康的、從未感染過瘧疾的成年志願者於1997與1998年之間接受了PfCSP DNA疫苗(33、62、105、106)。總共入選了20名志願者，在20μg、100μg、500μg和2500μg的4個劑量組中每組分配5名志願者，以一月的間隔給以3次劑量。如Le等人所描述的，所有這些劑量都具有良好的耐受性，沒有出現劇烈或嚴重的不良事件(62)。出現了4個中度的不良事件；所有這些不良事件都被認為不可能與疫苗的施用有關。最普通的抱怨是注射位點的疼痛和觸痛。這是溫和的，持續不超過48小時，並且不需要藥物治療。沒有志願者具有任何顯著的血清生物化學異常。
20個被試者都沒有出現對於抗dsDNA抗體的誘導或ANA(抗核抗體)效價從基線的增加。Wang等人通過針對風乾子孢子的間接螢光抗體測試(IFAT)和針對重組和合成肽的酶聯免疫吸附測定(ELISA)進行評估，證明沒有志願者發展出了抗PfCSP抗體。但是，20個志願者中有11位具有抗原特異的、遺傳限制的CTL活性。具體而言，CTL反應是CD8+T細胞依賴的、肽特異的和遺傳性HLA-限制的，因為沒有或幾乎沒有與對照肽一起孵育的自體靶的識別或與特異肽一起孵育的I型HLA-錯配靶的識別。此外，DNA-誘導的CTLs被多種HLA等位基因遺傳性限制(105，107)。CTL陽性是劑量相關的。在其餘9個自願者中，在每次免疫之後進行的任何試驗中均沒有檢測到CTLs。
在開始於1999年4月的第二個臨床試驗中，通過三種路徑，在0、4和8周用PfCSP DNA疫苗免疫14名健康成年志願者，三種路徑分別為常規針頭IM(肌內)、Biojector_IM和Biojector_IM(劑量的70％)加ID(皮內)(劑量的30％)。Biojector_是一種無針頭的噴射注射裝置。考慮到研究的規模小，志願者的HLA多樣性被限制在這一群體中最普通的I型HLA亞型——HLA A2，以允許遺傳性限制的CTL反應的組間比較。參與這一研究的志願者中的10位隨後參與了使用本發明方法的其它實驗。這一實驗和它的結果被進一步描述於以下「實施例」部分。
總體而言，該疫苗是安全和良好耐受的。志願者沒有經歷任何與疫苗有關的劇烈或嚴重的不良事件(AEs)。沒有志願者經歷了與通過所測試的3種路徑中任何一種施用PfCSP疫苗有關的顯著實驗室異常(33)。
就針對疫苗的免疫反應而言，通過針對風乾子孢子的IFAT和針對重組和合成肽的ELISA評估，沒有志願者發展出了抗PfCSP抗體(107)。PfCSP特異的抗體的缺乏在某種程度上是令人吃驚的，因為Biojector噴射注射裝置和ID路徑免疫都與動物模型中改善的抗體產生有關(1，37，62)。通過IFN-γ在ELISPOT試驗中測量T細胞應答。為了完成這些試驗，使用了包括PfCSP質粒編碼的CSP蛋白質的T細胞表位的肽。
注射針IM組的所有4名志願者在17.6％(26/148)的試驗中響應7/9的肽。Biojector IM組的所有5名志願者在26.5％(49/185)的試驗中響應9/9的肽。Biojector IM/ID組5名志願者中的4人在17.3％(32/185)的試驗中響應7/9的肽。14名志願者中有8人具有可檢測到的CTL應答。在這8人中，有兩人在注射針IM組(在總共的5/126試驗中響應4/7的肽)，3人在Biojector IM組(在總共的11/168試驗中響應6/8的肽)，3人在Biojector IM/ID組(在總共的14/162試驗中響應6/6的肽)(107)。總體而言，這些試驗確定了Biojector IM路徑接種對於誘導抗原特異的IFN-γ應答而言是最有效的，Biojector IM或IM/ID路徑對於誘導抗原特異的CTL應答而言是最有效的。
總之，通過對肽-特異的、遺傳性限制的、CD8+T細胞依賴的CTL活性的測量和通過對IFN-γ產生的測量(105，107)，這兩個臨床試驗證明PfCSP多核苷酸疫苗能夠引起抗原特異的、遺傳性限制的CD8+T細胞應答。當在施用最後一次PfCSP多核苷酸疫苗之後一年測試時，來自第二個臨床實驗的自願者在上述測量中沒有表現出任何CD8+抗原特異的T細胞應答。
如以上所討論的，除了CD8+T細胞應答外，針對PfCSP蛋白質的任何肽的抗體在控制瘧疾感染中也扮演著重要的角色(1，78，99)。雖然許多PfCSP DNA疫苗的受者發展出了CD8+抗原特異的T細胞應答，但是沒有人發展出了任何抗-CSP的特異性抗體。相反，研究人員已經證明RTS，S能夠引起對CSP的強抗體應答(53，99，100)。RTS，S也是有效的TH-1型細胞和體液免疫的誘導物，其中RTS，S-特異的CD4+T細胞應答主要集中在Th2R免疫顯性多態區(61)。
施用兩次或3次RTS，S劑量，對於在最後一次免疫後的兩到3周用惡性瘧原蟲攻擊的自願者，有超過60名志願者(平均44％)受到保護(8，54，99)，並且在最後一次免疫後為70％的半免疫甘比亞人提供了特繼兩個月的保護(8)。然而，這一保護的持續時間短(8，100)。用RTS，S免疫誘導抗PfCSP抗體和CD4+T細胞依賴的IFN-γ應答，但是沒有檢測到CD8+T細胞依賴的CTL或IFN-γ應答(61)。
本發明本發明提供新的疫苗方法，所述方法使用含有編碼至少一種第一瘧疾抗原的多核苷酸的引發疫苗(priming vaccine)引發(prime)免疫應答，然後使用含有至少一種包含至少一種第二瘧病抗原的多肽的加強疫苗(boosting vaccine)來加強(boost)引發的應答，其中所述第二瘧病抗原與引發疫苗的至少一種第一瘧疾抗原具有至少一種共同的表位。這一組合為目前的抗瘧疾接種策略提供了3點重要的改進。
首先，兩種異源疫苗的組合激活免疫系統的兩種武器——CD8+T細胞、CD4+T細胞和抗體。具體而言，基於使用PfCSP疫苗或RTS，S疫苗的臨床試驗結果，任一種疫苗都不能單獨建立可持續的激起CD8+T細胞、CD4+T細胞和針對CSP的抗體的免疫應答。本發明通過組合該兩種疫苗而改善這一結果，由此引起所有3種類型的應答。具體而言，PfCSP疫苗引發CD8+T細胞應答，RTS，S疫苗加強此T細胞應答。因為RTS，S疫苗也引起抗CSP抗體和CD4+T細胞，所以產生的針對CSP的免疫應答包括CD8+和CD4+T細胞應答和抗體應答。我們稱這一總體的接種策略——用一種疫苗引發，然後用與引發疫苗共享至少一種共同表位的不同疫苗來加強——稱為「引發/加強」策略。
本發明對現有接種策略的第二個重要改進在於使用蛋白質疫苗在人中刺激CD8+T細胞應答的事實。本發明的方法通過使用基於蛋白質的疫苗來加強T細胞應答，基於蛋白質的疫苗迄今被認為對於刺激CD8+T細胞應答是無效的(61)。
最後，本發明提供的對現有抗瘧疾接種策略的第三個重要的改進是它在兩個方面拓寬了免疫應答。首先，通過DNA引發/RTS，S加強誘導了組成更寬的產生IFN-γ的T細胞群體(Tcl和Th1)，因為使用DNA引發引起了CD4+T細胞依賴的CD8+1型(Tcl)和CD4+1型(Th1)IFN-γ應答，而單獨的RTS，S只誘導CD4+T細胞依賴的Th1 IFN-γ應答。第二，當單獨施用時，PfCSP疫苗引發-確定的CD8+T細胞群體。同樣，RTS，S疫苗僅引發-確定的CD4+T細胞群體和製造一套確定的抗體的B細胞。然而，當組合後，產生的CD8+T細胞應答不僅覆蓋最初由PfCSP疫苗引發的表位，該應答還覆蓋在此PfCSP引發接種後最初未鑑定到的其它表位。根據本領域對蛋白質疫苗已有的了解，蛋白質疫苗會加強並拓寬已建立的CD8+T細胞應答的概念是出乎意料的。
發明簡述本發明涉及通過免疫人來抵禦瘧疾的方法，包括步驟a)通過施用含有編碼至少一種瘧疾抗原的多核苷酸的引發疫苗引發免疫應答；和b)通過隨後施用含有至少一種多肽的加強疫苗來加強引發的免疫應答，其中所述多肽包含至少一種與引發疫苗的一種或多種瘧疾抗原共有至少一種相同表位的瘧疾抗原，從而激起針對瘧疾的細胞免疫應答和體液免疫應答。
在本發明的一個實施方案中，引發疫苗編碼存在於加強疫苗中的同樣多肽。在其它實施方案中，引發疫苗編碼存在於加強疫苗中的瘧疾抗原的一部分，或者存在於加強疫苗中的多肽是引發疫苗編碼的瘧疾抗原的一部分。在另一個實施方案中，所述疫苗共享至少一種瘧疾T細胞表位。而在另一個實施方案中，所述疫苗共享至少一種瘧疾CD8+T細胞表位。在一個替代的實施方案中，兩種疫苗共享幾種瘧疾表位。
任何導致瘧疾的病原體均可以被用於本發明的方法。在一個實施方案中，病原體是惡性瘧原蟲。在其它實施方案中，病原體可以是間日瘧原蟲(P.vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)或三日瘧原蟲(P.malariae)。同樣，本發明的方法可以使用在病原體生命周期的任何階段表達的任何瘧疾抗原。在一個實施方案中，引發疫苗編碼並且加強疫苗含有一種或多種在病原體的前紅細胞階段(包括肝臟階段)表達的抗原。而在另一個實施方案中，引發疫苗的多核苷酸編碼在感染的肝臟階段表達的環子孢子蛋白的至少一部分並且加強疫苗含有環子孢子蛋白的至少一部分。還在另一個實施方案中，引發疫苗的多核苷酸編碼基本上全部的環子孢子蛋白並且加強疫苗含有一部分的環子孢子蛋白。CS蛋白的最小部分是含有至少一個表位或幾個表位的免疫原性部分。在一個特定的實施方案中，引發疫苗含有PfCSP並且加強疫苗含有RTS，S。在另一實施方案中，引發疫苗是PfCSP疫苗並且加強疫苗是RTS，S疫苗。
本發明還提供含有如這裡所描述的引發和加強疫苗的藥物試劑盒。
本發明還提供如這裡所描述的引發和加強疫苗在製備用於預防或減輕瘧疾嚴重性的疫苗中的用途。
因此，本發明提供編碼至少一種瘧疾抗原，特別是CS蛋白或它的片段的多核苷酸——作為引發疫苗——以及含有至少一種瘧疾抗原，特別是CS蛋白或它的片段的多肽——作為加強疫苗——在製造用於瘧疾的引發-加強疫苗中的用途。在一個特定的實施方案中，多核苷酸為DNA質粒的形式，優選表達全長的CS蛋白或它的片段。編碼CS蛋白或片段的多核苷酸可以處於本領域已知的異源啟動子的控制之下。在一個實施方案中，啟動子為HCMV IE啟動子，任選地包括外顯子1。在一個特定的實施方案中，加強疫苗的多肽是含有CS蛋白羧基端部分的雜合蛋白質，所述部分為例如羧基端部分的至少160個胺基酸，任選地排除羧基末端12個胺基酸。引發和加強組合物中的任一種或兩者都可以含有額外的瘧疾抗原或其它抗原。
在根據本發明的這一方面的一個實施方案中，引發疫苗包含編碼全長CS蛋白的多核苷酸，該多核苷酸存在於異源啟動子控制下處於DNA質粒中，並且加強疫苗含有與Th1誘導佐劑(特別是含有QS21、3D-MPL和水包油乳劑的佐劑)組合的RTS，S。可以以藥物試劑盒形式提供引發和加強疫苗。
本發明對之前沒有暴露過導致瘧疾的病原體或已經有所暴露但是沒有被完全保護的人提供部分的、增強的或完全的保護。本發明也可以被用於降低發生瘧疾感染的機會、降低人感染後患病的機會、降低人感染後疾病(如發燒)的嚴重性、降低感染者中的寄生蟲濃度，或在人暴露於瘧疾寄生蟲時降低瘧疾的死亡率。在瘧疾成為地方流行病的區域，即使部分的保護也是有利的。例如，導致約30％的人口被保護的疫苗治療策略可能對一個社區具有重要的影響。
附圖簡述


圖1顯示僅在DNA引發之後(Fig.la)、僅在用RTS，S加強之前(Fig.lb)和在RTS，S加強之後(Fig.lc)，每個陽性被試者和每種陽性肽的CTL應答。黑帶表示含有測試肽和正確的MHC呈遞的樣品。點帶(stippled bar)表示含有對照肽和正確的MHC呈遞的樣品。條紋帶(stripled bar)表示含有測試肽但未有正確的MHC呈遞的樣品。用表達PfCSP的ALVAC對取自DNA引發之後(a)、加強之前(b)，或第一劑(志願者號6＝V6)或第二劑(V2、3、8和9)RTS，S後第二周(c)的新鮮PBMCs體外刺激7天，並且在5小時的鉻釋放分析中，針對與實驗的8-10胺基酸的PfCSP衍生肽或對照肽(HLA-A*0201限制的HIV gag)(MHC+對照)一起孵育的I型HLA-匹配的靶(MHC+肽)或錯配的靶(非MHC+肽)進行分析。只有當以實驗和對照肽脈衝的靶細胞的裂解百分數差異≥10％(其時，效應細胞與靶細胞的比例(E∶T)至少為2)時，才認為應答是陽性的。以單一的E∶T比例(20∶1或40∶1)提供各種肽與其同時評估的對照的裂解百分數。
圖2表徵分別在誘導和效應期涉及體外IFN-γ應答的T細胞。使用來自以3劑單獨的PfCSP DNA(V1和V5)或兩劑單獨的RTS，S(V 19、V21和V22)免疫的志願者的凍結PBMCs進行ELISPOT試驗，該PBMC或者用對照Dynabeads處理，或者臨在用肽(a)Flu M A2、(b)TT-DR、(c)PfCSP DR.363或(d)PfCSP DR.316培養之前耗竭CD4+或CD8+T細胞。平行地，在緊接用測試於ELISPOT試驗的相同肽組培養36小時後的同一研究時間點，通過實時PCR測量來自相同志願者的選擇性富集的T細胞群體(CD4+/CD45RA+、CD4+/CD45RA-、CD8+/CD45RA+和CD8+/CD45RA-)的IFN-γmRNA表達水平(e)。
圖3顯示通過實時PCR IFN-γ測量的T細胞亞群中的IFN-γmRNA表達水平。研究了從兩名經3劑PfCSP DNA(單獨的DNA)引發及兩劑RTS，S疫苗(DNA/RTS，S)加強後的志願者(V1和V5)中獲得的冰凍細胞。細胞與PfCSP DR.363肽一起孵育36小時，並被選擇性富集和評估IFN-γmRNA表達。DNA免疫之後，在志願者V1的CD45RA-亞群和志願者V5的CD45RA+亞群的CD4+T細胞中，而不是在CD8+T細胞中IFN-γmRNA表達適度(5-10倍)上調。RTS，S加強與兩名志願者的上調CD4+T亞群中(而不是CD8+T細胞中)IFN-γ mRNA表達水平的顯著(80-100倍)增加相關。
圖4顯示對肽DR.316的IFN-γ應答由第一劑RTS，S後的DNA誘導模式(僅有CD8+Tcl)向再次施用RTS，S疫苗後的兩種模式的混合(CD8+Tcl和CD4+Th1)轉變。在用來自志願者V2的細胞進行的離體ELISPOT中，第一劑RTS，S後通過在培養之前耗竭CD4+和CD8+T細胞，顯著降低IFN-γ應答(DNA誘導的IFN-γ應答的特徵)。在第二劑的RTS，S疫苗之後，只有CD4+T細胞耗竭才顯著降低活性。平行地，在效應期通過實時PCR測得(b)第一劑RTS，S後IFN-γmRNA表達水平在CD8+而不是CD4+T細胞中上調，第二劑RTS，S後在CD8+和CD4+T細胞中都上調。「2wkp1」指第一劑後兩周，「2wkp2」指第二劑後兩周。
圖5顯示DNA引發的/RTS，S加強的志願者中的抗體IFAT效價。在第一次RTS，S劑量之前，DNA引發(+)和未引發(-)的、具有(+)和不具有(-)抗HbsAg抗體的志願者中，抗體效價以幾何平均值+/-SE(95％的置信區間)表示。在用RTS，S第一次和第二次免疫之後進行了抗體分析。除了在第一次劑量後的第二周，DNA-/HBsAg+志願者比DNA+/HBsAg+具有顯著更高的效價(P＜0.02)外，在任何組之間效價沒有顯著的差異。
發明詳述如這裡所闌釋的，通過用含有編碼至少一種瘧疾抗原的多核苷酸的引發疫苗免疫人受者可以引發抗瘧病感染的多手段免疫應答，然後通過用含有至少一種多肽的加強疫苗免疫可以對此應答進行加強，其中所述多肽包含至少一種與引發疫苗的一種或多種瘧疾抗原具有至少一種相同表位的瘧疾抗原。令人吃驚的是，使用多肽疫苗，本免疫方法加強和拓寬了引發的應答。
「疫苗」是含有施用於被試者時能誘導免疫應答的分子的物質的組合物。疫苗可以含有多核苷酸分子、多肽分子和碳水化合物分子，以及其衍生物和組合，如糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物-蛋白質綴合物、兩種或多種多肽或多核苷酸的融合物等等。如本領域人員能夠容易的理解的，疫苗可以進一步含有稀釋劑、佐劑、載體或它們的組合(83)。
可以單獨或組合使用任何接種的方法或路徑來向人受者傳遞多核苷酸疫苗或蛋白質疫苗。施用的路徑包括靜脈內、肌內、皮下、皮內或黏膜。傳遞的方式可以變化，例如，可以經由IV、IM、皮下或ID路徑給人注射。可以經由黏膜路徑給人受者接種。可另選的是，可以經由無針頭的手段進行傳遞，如使用無針頭的「基因槍」，如Biojector_，或其它噴射注射裝置，或經由生物轟擊法傳遞。多核苷酸可以以含有PfCSP疫苗的DNA的細菌，或含有PfCSP疫苗的DNA的病毒傳遞。
適當的病毒載體的實例包括單純皰疹病毒載體、痘苗病毒或甲病毒載體和逆轉錄病毒，包括慢病毒、腺病毒和腺相關病毒。在一個實施方案中，這些載體是複製缺陷型病毒載體。本領域技術人員了解使用這些病毒的基因轉移技術。例如，可以使用逆轉錄病毒載體來將本發明多核苷酸穩定整合進宿主基因組，雖然可能並不建義這類重組。相比，複製缺陷型腺病毒載體保持為游離型並因此允許瞬時表達。
在一個特定的實施方案中，用作肝臟載體的腺病毒是複製缺陷型人或猿腺病毒。通常這些病毒含有E1缺失，可以生長於轉化了E1基因的細胞系。適當的猿腺病毒是例如從黑猩猩分離的病毒。適合用於本發明的病毒實例包括C68(也被稱為Pan 9)(美國專利No 6083 716，在此引入為參考)和Pan 5、6和Pan 7(WO 03/046124，在此引入為參考)。因此，可以對這些載體進行操作以插入本發明的異源基因，以便能夠表達基因產物。這類重組腺病毒載體的使用製劑和製作詳細公開於引入為參考的WO03/046142。
疫苗可以由分開的組分組成。如這裡所使用的，「分開的組分」指的是這樣一種情形，其中所述疫苗實際上含有兩種分開施用給被試者的分離的疫苗。就此意義而言，由分開組分組成的疫苗可以被視為含有分開的疫苗組分的試劑盒或包裝。例如，在本發明的上下文中，包裝可以含有多核苷酸疫苗組分和多肽疫苗組分。
當存在於疫苗中的一種或多種抗原導致被接種的受試者對該一種或多種抗原產生免疫應答時，疫苗「誘導」了免疫應答。如通過免疫系統的激活所證實的，被接種的受試者將產生免疫應答，所述免疫系統的激活包括疫苗抗原特異的T細胞、疫苗抗原特異的B細胞、疫苗抗原特異的抗體和細胞因子的生成。可以通過若干方法測量產生的免疫應答，這些方法包括ELISPOT、ELISA、鉻釋放試驗、細胞內細胞因子染色、FACS分析和MHC四聚體染色(以鑑定肽特異的細胞)。技術人員也可以使用這些方法來測量初次免疫應答和二次免疫應答。
「抗原」是能夠在暴露於抗原的被試者體內引起免疫應答的物質。抗原通常是多肽並且是宿主免疫應答的焦點。「表位」或「抗原決定簇」是T細胞和抗體特異性結合的抗原部位。抗原可以含有多個表位。
本發明方法中使用的引發疫苗含有編碼以下討論的瘧疾抗原的多核苷酸。引發疫苗可以是單獨的DNA或者是處於細菌或病毒內的外源啟動子控制下的DNA。引發疫苗的多核苷酸存在於適當的遞送載體，如質粒或其它載體，如細菌或病毒載體中。多核苷酸可以處於適當的啟動子(如來自HCMV IE基因的啟動子)的控制之下。以有效引發針對瘧疾抗原的免疫應答的量施用引發疫苗。如這裡所使用的，當抗原被呈遞給T細胞或B細胞時，發生了免疫應答的「引發」。作為結果，在隨後的再一次的免疫應答中，引發的細胞作為記憶細胞可以再次應答同樣的抗原。因此，引發造成初次免疫應答並建立免疫記憶。本領域技術人員將意識到初次免疫應答是最初暴露於處於特殊背景中(如病原體或疫苗中)的抗原時的適應性免疫應答。然而，本領域技術人員也會意識到本發明並不限於在免疫學幼稚個體中使用引發疫苗。相反，也可以在已經暴露過抗原但沒有接受過引發疫苗的個體中產生引發。
「有效的」引發劑量可以在0.01μg至50mg的DNA之間變化。可另選的是，劑量可以間於1μg至10mg DNA或2.5mg至5mg DNA之間。在使用多肽加強疫苗之前可以施用一次多核苷酸疫苗。在另一實施方案中，可以施用幾次引發疫苗。接種的「有效」次數可以介於1到5次劑量。可另選的是，在施用加強疫苗之前，劑量的次數可以介於1到3劑或1到2劑。
「多核苷酸」通常指任何多聚核糖核苷酸(RNA)或多聚脫氧核糖核苷酸(DNA)，它們可以是未修飾的或修飾的RNA或DNA。多核苷酸包括(並不限於)單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA、及單鏈和雙鏈區混合的RNA。多核苷酸也包括含有DNA和RNA的雜合分子，該分子可以是單鏈，或更常見的雙鏈或單鏈和雙鏈區的混合物。此外，「多核苷酸」涉及含有RNA或DNA或RNA和DNA二者的3鏈區。多核苷酸也包括為了穩定性或其它原因而含有一個或多個修飾鹼基的DNA或RNA，和具有修飾骨架的DNA或RNA。「修飾」的鹼基包括如三苯甲基化鹼基和稀有鹼基，如次黃嘌呤核苷。可以對DNA和RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸」包括通常在自然界中發現的化學、酶或代謝修飾的多核苷酸形式，以及病毒和細胞特徵性的DNA和RNA的化學形式。寡核苷酸是相對短的多核苷酸。
多核苷酸序列的「片段」是指比參照序列短，但是保留被認為與參照多核苷酸序列相同的生物功能或活性的序列。片段編碼參照多核苷酸序列編碼的參照多肽的至少一個表位。如這裡所使用的，當用於描述多核苷酸或多肽時，「基本上全部的」指若非較小的核苷酸鹼基或胺基酸殘基缺失，編碼或代表完全的全長多核苷酸或多肽的分子。
本發明方法所使用的加強疫苗可以包含含有至少一種以下討論的瘧疾抗原多肽的融合蛋白質。在此疫苗中使用的多肽可以分離自天然來源，以重組蛋白產生於外源生物(如細菌)，或經由化學手段合成。加強疫苗可以進一步含有額外的非瘧疾多肽，以增強瘧疾多肽的免疫原性。例如，可以使用部分或全部的B肝病毒表面抗原。引發疫苗和加強疫苗共享至少一種共同的瘧疾表位。
根據本發明，用於加強疫苗的合適的融合蛋白可以包含含有基本上全部的CS蛋白C端部分、4個或更多個串聯重複的免疫顯性區、B肝病毒表面抗原(HbsAg)的雜合蛋白。所述雜合蛋白包含含有與CS蛋白C端部分基本同源的至少160個胺基酸的序列。在一個實施方案中，CS蛋白可以從C端缺少最後的12個胺基酸。適宜的雜合蛋白包括基本相應於惡性瘧原蟲7G8的210-398胺基酸的惡性瘧原蟲CS蛋白部分，該蛋白部分在框架內經由線性接頭與HbsAg的N端融合。接頭可以包含來自HbsAg的preS2的一部分。
另一個實施方案是命名為RTS，S的雜合顆粒，該顆粒描述於這裡引入為參考的美國專利5,928,902和國際專利申請WO 93/10152。此雜合物的組成為1.)由核苷酸1059至1061編碼的來自釀酒酵母TDH3基因序列的甲硫氨酸殘基(71)；2.)來自通過用於構建雜合基因的克隆方法創造的核苷酸序列(1062至1070)的3個胺基酸——Met Ala Pro；3.)由核苷酸1071至1637編碼的、代表惡性瘧原蟲7G8株環子孢子蛋白(CSP)210至398胺基酸的一段189個胺基酸的鏈(21)；4.)由通過用於構建雜合基因的克隆方法創造的核苷酸1638至1640編碼的胺基酸(Arg)；5.)由核苷酸1641至1652編碼的、代表B肝病毒(adw血清型)pre S2蛋白4個羧基端殘基的4個胺基酸——Pro Val Thr Asn(103)；和6.)由核苷酸1653至2330編碼的、規定B肝病毒(adw血清型)S蛋白的一段226個胺基酸的鏈。
以有效「加強」針對瘧疾抗原的引發免疫應答的量施用加強疫苗。如這裡所使用的，「加強」免疫應答指在通過最初暴露於抗原而已被引發(致敏)的(即已被暴露的)被試者中誘導二次免疫應答。二次免疫應答以激活和擴增特異的記憶T細胞和B細胞為特徵。因此，對特異免疫應答的加強可以通過誘導免疫細胞在隨後暴露於該抗原後增殖和分化，而提高引發的免疫應答。如下所討論的，PfCSP疫苗的全長CS蛋白含有9個T細胞表位，而RTS，S含有5個T細胞表位(61)。其中有4個RTS，S表位存在於PfCSP疫苗中。例如，當施用時，引發疫苗引發抗瘧疾CD8+T細胞。而加強疫苗可以實現一種或多種以下效果誘導CD4+T細胞、誘導抗瘧疾抗體、加強由引發疫苗引發的CD8+T細胞的活性，和誘導未在最初的引發免疫應答中原初鑑定的額外的CD8+T細胞。加強疫苗還可以誘導CD4+T細胞並誘導抗瘧疾抗體。加強免疫應答在本領域也被稱為「回憶」免疫應答。
「有效的」加強劑量可以介於1μg到100μg或介於10μg到75μg或介於40μg到60μg的範圍。在另一個實施方案中，加強劑量可以是50μg。而在另一個實施方案中，加強劑量可以是25μg。加強疫苗可以被施用1次或多次。加強給藥的「有效」次數可以介於1到5劑加強疫苗。可另選的是，向人受者的給藥次數可以介於1到3劑或1到2劑。在另一實施方案中，DNA疫苗和蛋白質疫苗都可以用於加強初次免疫應答。
「多肽」指任何含有兩個或多個通過肽鍵或修飾的肽鍵(即肽等排物)彼此連接的胺基酸的多肽。「多肽」既指短鏈，通常稱為肽、寡肽或寡聚物，也指長鏈，通常稱為蛋白質。多肽可以含有正常由密碼子編碼的胺基酸之外的胺基酸。
多肽包括由天然方法(如轉錄後加工)或本領域眾所周知的化學修飾技術修飾的胺基酸序列。這類修飾在基礎教材中被充分描述，並且在專著和大量研究文獻中描述得更為詳細。修飾可發生於多肽的任何位置，包括肽骨架、胺基酸側鏈和氨基或羧基端。這些修飾可以在給定多肽的若干位點以相同或不同的程度存在。而且，給定的多肽可以含有許多類型的修飾。多肽可以作為泛素化的結果而被分支，並且它們可以在分支或沒有分支下環化。環化的、分支的和分支的環化多肽可以產生於轉錄後的天然加工或可以通過人工方法製造。修飾包括乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、生物素化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂或脂衍生物的共價附著、磷脂醯肌醇的共價附著、交聯、環化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯的形成、胱氨酸的形成、焦穀氨酸的形成、甲醯化、γ-羧化、糖基化、GPI錨的形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解過程、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸化、轉運RNA介導的向蛋白質加入胺基酸(如精氨醯化)和泛素化(79、82、94、113)。
多肽序列的「片段」是指比參照序列短，但是保留被認為與參照多肽相同的生物功能或活性的多肽序列。這類活性可以包括如刺激免疫應答的能力。片段保留參照多肽的至少一個表位。多肽的「部分」指的是參照多肽的胺基酸序列的子集。可以通過其在多肽中的相對位置來描述一個部分，例如C端部分或N端部分。
本發明可以使用任何瘧疾抗原，如顯示於表A和表B的抗原。
表A前RBC抗原

表BRBC期抗原

「環子孢子蛋白」或「CSP」是瘧疾子孢子表面的主要表面多肽。已經克隆測序並表達了來自惡性瘧原蟲7G8株的CSP(PfCSP)(21)。來自其它瘧疾寄生蟲的其它CSPs也已被描述了特徵並含於表A。
如這裡所使用的，「RTS，S」指一種特定的瘧疾抗原並代表本發明的一個實施方案。RTS，S及其產生更詳細的描述於在此引入為參考的美國專利No.5,928,902和國際專利申請WO 93/10152。
「拓寬」指增加T細胞應答的組成(repertoire)。在這種情況下，通過DNA引發/RTS，S加強誘導了具有更寬的組成(repertoire)的產生IFN-γ的T細胞群體(Tcl和Th1)，因為使用DNA免疫/引發激起了CD4+T細胞依賴的CD8+1型(Tcl)和CD4+1型(Th1)IFN-γ應答，而單獨的RTS，S僅誘導CD4+T細胞依賴的Th1 IFN-γ應答。技術人員可以通過抗原特異的檢測試驗來檢測拓寬的免疫應答。例如，技術人員可以使用ELISPOT、MHC四聚體染色或鉻釋放CTL試驗來確定T細胞群的所有組成成分。
「拓寬」也指增加將與免疫應答發生反應的表位的範圍。除了最初引發的免疫細胞外，未曾引發的或數量小到不能被檢測到的免疫細胞也被誘導擴增和激活。因此，拓寬的免疫應答不僅放大了原初的引發應答，也包含並非初次應答的一部分的對新表位的應答。技術人員可以通過使用抗原特異的檢測試驗來檢測拓寬的免疫應答。例如，技術人員可以使用ELISPOT或MHC四聚體染色來確定與初次免疫應答反應的所有表位組成並將此組成和與二次免疫應答反應的所有表位組成相比較。如果二次免疫應答比初次免疫應答與更大數量的表位反應，則二次免疫應答已被拓寬。
「CD8+T細胞」代表一類以具有CD8細胞表面標記為特徵的T淋巴細胞。CD8+T細胞是MHCI型限制的「CTLs」或「抑制性T細胞」。
「CD4+T細胞」代表一類以具有CD4細胞表面標記為特徵的T淋巴細胞。CD4+T細胞是MHCII型限制的T淋巴細胞。存在兩種類型的CD4+T細胞，被稱為1型或2型「輔助性T細胞」。
如上討論的，通過抗原與免疫系統細胞的相互作用，產生了針對抗原的免疫應答。產生的免疫應答可以被粗略的分為兩個極端的類別，即體液或細胞介導的免疫應答(傳統上分別以保護的抗體機制和細胞效應子機制為特徵)。這些類應答已被命名為Th1型應答(細胞介導的應答)和Th2型免疫應答(體液應答)。極端的Th1型免疫應答可以以抗原特異的、單元型-限制的CTLs的產生和天然殺傷細胞應答為特徵。在小鼠中，Th1型應答常常以IgG2a亞型抗體的產生為特徵，而在人中這些相應於IgGl型抗體。Th2型免疫應答的特徵在於產生廣譜免疫球蛋白同種型，包括小鼠中IgG1、IgA和IgM。
位於這兩種類型的免疫應答的發展背後的驅動力是細胞因子，一些鑑定的蛋白質信使，其幫助免疫系統的細胞並操縱最終的免疫應答向Th1或Th2應答發展。因此，高水平的Th1型細胞因子傾向於支持針對給定抗原的細胞介導的免疫應答的誘導，而高水平的Th2型細胞因子傾向於支持針對抗原的體液免疫應答的誘導。重要的是記住Th1和Th2型免疫應答的區別並不是絕對的。實際上，個體將支持被描述為主要的Th1或主要的Th2的免疫應答。然而，常常方便地按照Mosmann和Coffman(70)在鼠CD4+T細胞克隆中的描述來考慮細胞因子家族。傳統上，Th1型應答與通過T淋巴細胞的INF-γ和IL-2的產生有關。其它通常與Th1型免疫應答的誘導直接相關的細胞因子不由T細胞產生，如IL-12。相對的，Th2型應答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)的分泌有關。
用於本發明的適當佐劑包括鋁鹽，如氫氧化鋁膠體(alum)或磷酸鋁，但也可以是鈣、鐵或鋅鹽，或可以是醯化酪氨酸的不溶懸浮液，或醯化的糖、多糖的陽離子或陰離子衍生物、Polyphosphazenes、或montanide脂質體。
在用於本發明的疫苗製劑中，在PfCSP質粒的情況下，可以施用或不施用佐劑。在RTS，S的情況下，佐劑組合物可以誘導優先Th1應答。此外，還可以誘導其它應答，包括其它體液應答。
某些疫苗佐劑尤其適於刺激Th1或Th2型細胞因子應答。傳統上，接種或感染後免疫應答的Th1∶Th2平衡的最好指示包括用抗原再刺激後對T淋巴細胞體外產生的Th1或Th2細胞因子的直接測量，和/或抗原特異的抗體應答的IgG1∶IgG2a比例的測量。因此，Th1型佐劑是一種刺激分離的T-細胞群體在接受抗原體外再刺激後產生高水平的Th1型細胞因子的佐劑，該佐劑還誘導與Th1型同種型相關的抗原特異性免疫球蛋白應答。例如，可以被配製來產生適合用於本發明中的佐劑的Th1型免疫刺激劑，可以包括單磷醯脂A，特別是3-脫-O-醯化的單磷醯脂A(3D-MPL)。3D-MPL是眾所周知的由Ribi Immunochem，Montana生產的佐劑。化學上通常提供3-脫-O-醯化的單磷醯脂A與4、5或6醯化鏈的混合物。其可以通過GB 2122204B教導的方法純化和製備，該參考文獻也討論二磷醯脂A和它的3-O-脫醯化變體的製備。已經描述了其它純化和合成的脂多糖(USPat.6,005,099，42，43、EP 0 729 473 B1、EP 0549 074Bl)。在一個實施方案中，3D-MPL是具有直徑小於0.2μm的小粒徑的顆粒製劑形式，其製作方法公開於EP 0 689 454。
皂苷類化合物是可以被用於本發明的Th1免疫刺激劑的另一例子。皂苷類化合物是眾所周知的佐劑(60)。例如，Quil A(來自南美QuillajaSaponaria Molina樹皮)和它的級分被US Pat.5,057,540、EP 0 362 279 B1和Kensil(52)描述。溶血皂苷QS21和QS17(HPLC純化的Quil A級分)已經被描述為有效的全身性佐劑(systemic adjuvant)，它們的產生方法公開於US Pat.5,057,540和EP 0 362 279 B1。這些參考文獻也描述了作為有效佐劑的QS7(Quil A的非溶血性級分)在全身性疫苗中的用途。Kensil等人進一步描述了QS21的用途(51)。QS21與聚山梨醇酯或環糊精的組合也已為人所知(WO 99/10008)。包含Quil A的級分，如QS21和QS7的顆粒佐劑系統描述於WO 96/33739和WO 96/11711。
免疫刺激劑的另一例子是含有未甲基化的CpG二核苷酸(「CpG)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在於DNA中的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的縮寫。本領域已知CpG是通過全身性和黏膜路徑施用的佐劑(WO96/02555、EP 468520,23,68)。曾經觀察到卡介苗(bacillus Calmette-Guerin，BCG)的DNA部分能夠發揮抗腫瘤效果。在進一步的研究中，合成的來自BCG基因序列的寡核苷酸表現出能夠誘導免疫刺激性效果(體內和體外都如此)。這些研究的作者作出結論包含中心CG基序的某些迴文序列攜帶這一活性。之後Krieg(57)闡釋了CG基序在免疫刺激中的中心作用。詳細的分析已表明CG基序必須處於一定的序列背景中，並且這些序列在細菌DNA中常見，而很少存在於脊椎動物DNA中。免疫刺激性序列常常是嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶；其中CG基序沒有被甲基化，但是還已知其它未甲基化的CpG序列也具免疫刺激性，並且可以被用於本發明。
在某些6核苷酸的組合中，可以存在迴文序列。在同一寡核苷酸中可以以一種基序的重複或不同基序的組合的形式而存在若干這些基序。一種或多種這樣的含有免疫刺激性序列的寡核苷酸的存在可以激活多種免疫亞群，包括天然殺傷細胞(產生γ幹擾素並具有溶細胞活性)和巨噬細胞(Wooldrige等人，1997)。其它含有未甲基化CpG但不具有這一共有序列的序列現在也已被證實具有免疫調節性。當配製成疫苗時，CpG通常在游離溶液中與游離抗原一起被施用(WO96/02555,68)或與抗原共價綴合(WO 98/16247)，或與如氫氧化鋁之類的載體一起配製(肝炎表面抗原)(9，23)。
上述這些免疫刺激劑可以與載體一起配製，所述載體如脂質體、水包油乳劑，和/或金屬鹽，包括鋁鹽(如氫氧化鋁)。例如，3D-MPL可以與氫氧化鋁(EP 0 689454)或水包油乳劑(WO 95/17210)一起配製。QS21與含有膽固醇的脂質體(WO 96/33739)、水包油乳劑(WO 95/17210)或alum(WO98/15287)一起配製可能是有利的；CpG可以與alum(9，23)或其它陽離子載體一起配製。
也可以使用免疫刺激劑的組合，如單磷醯脂A和皂苷衍生物的組合(WO 94/00153、WO95/17210、WO 96/33739、WO 98/56414、WO98/05355、WO 99/12565、WO 99/11241)或如描述於WO94/00153的QS21和3D-MPL的組合。可另選的是，本發明還可使用CpG加皂苷(如QS21)的組合。因此，適當的佐劑系統包括如單磷醯脂A(如3D-MPL)與鋁鹽的組合。另一實施方案組合單磷醯脂A與皂苷衍生物，如公開於WO 94/00153的QS21和3D-MPL的組合，或如公開於WO 96/33739的低反應原性組合物，其中QS21在含有膽固醇的脂質體(DQ)中被淬滅。而WO 95/17210中描述了另一在水包油乳劑中包含QS21、3D-MPL和生育酚的佐劑製劑。在另一實施方案中，CpG寡核苷酸被單獨或與鋁鹽一同使用。額外的佐劑和/或載體組合的實例包括3D-MPL+DQ中的QS21、Alum+3D-MPL、Alum+DQ中的QS21+3D-MPL、Alum+CpG、3D-MPL+DQ中的QS21+水包油乳劑，和CpG。
在另一個實施方案中，組合3D-MPL和QS21，具有或不具有CpG。QS21∶3D-MPL的比例可以為大約1∶10至10∶1；1∶5至5∶1；或1∶1。在一個實施方案中，D MPL∶QS2 1的比例為2.5∶1至1∶1。通常，對於人類給藥而言，QS21和3D MPL將在疫苗中以1 pig-200 4g的範圍存在，如每劑1-1004g或10～Lg-50～tg。通常水包油將包含2至10％的鯊烯、2至10％的α生育酚和0.33至3％的Tween80。鯊烯α生育酚的比例等於或小於1，因為這樣提供更穩定的乳劑。還可以以1％水平存在Span85。在某些情況下，本發明的疫苗含有穩定劑可能是有利的。
與含有CS蛋白或它的免疫原性部位(任選地在如RTS，S之類的雜合蛋白中)的本發明多肽加強疫苗一起使用的佐劑，可以含有3D-MPL和QS21的組合併具有或不具有CpG。
前面的一般性描述和以下的詳細描述都僅是示例性和解釋性的，並不對所要求的本發明構成限制。此外，本發明並不被限制於所描述的特定實施方案，這些實施方案本身當然可以變化。另外，用於描述特定實施方案的術語並無限制性意圖，因為本發明的範圍僅受其權利要求的限制。
關於數值範圍，除非在上下文中另外明確的指出，否則本發明包括介於所述範圍的上限和下限間的每一居間值，準確到下限單位的至少十分之一。此外，本發明包括任何其它陳述的居間值。另外，除非從所述範圍中具體排除，本發明還包括排除所述範圍的上限和下限之一或二者的範圍。
除非另有定義，否則這裡使用的所有技術和科技術語的意思為本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的意思。本領域的普通技術人員還將意識到，任何與這裡描述的方法和材料相似或等價的方法和材料也可以用於本發明的實踐和測試。此外，這裡提及的所有出版物被引入為參考。
必須指出，如這裡和附屬的權利要求所指出的，除非在上下文中另有明確的指出，否則單數形式「一」(「a」)，「或」，和「此」(「the」)包括複數指示物。因此，例如，就「一種被試多肽」而言包括多種這類多肽，就「此試劑」而言包括一種或多種試劑和本領域技術人員已知的它的等價物，等等。
此外，除非另有指示，在說明書和權利要求中使用的所有表示成分的量、反應條件、％純度、多肽及多核苷酸長度等的數字被術語「大約」所修飾。因此，在說明書和權利要求中列出的數字參數是可以根據需要的本發明的性質而改變的近似值。至少不企圖限制等同原則在權利要求範圍上的應用，每一個數字參數至少應該根據報導的有效數字，應用常規近似技術來理解。但是，在具體實施例中列出的數值是儘可能的精確報導。然而，任何數值均固有地含有某些來自其實驗測量的標準偏差的誤差。
以下實施例進一步說明了本發明。它們僅是舉例說明本發明並公開本發明某些實施方案的多種有利特性。以下實施例不應該被理解為是對本發明的限制。
實施例實施例1用RTS，S疫苗加強已引發的抗-PfCSP應答為此項研究招募了24名HLA-A*0201陽性志願者。為了可以進行遺傳限制性T細胞反應的組間比較，志願者的HLA多樣性被限制為該群體中最常見的I型HLA亞型。這些志願者中先前無人接觸過瘧疾。這24名受試者中，有10名參加過上述的第二項PfCSP疫苗臨床試驗。在此試驗過程中，這些志願者已接受總共三劑PfCSP DNA疫苗(VCL-2510，由Vical，Inc(SanDiego，CA)如前所述製備(62))，劑量是2500μg/劑，每劑間隔4周(62)。因此，在這一試驗中，這10名志願者在接受加強的RTS，S疫苗前12-14個月接受他們最後一劑DNA疫苗。剩餘的14名志願者事先未接受PfCSPDNA疫苗，因此用作未引發的對照。所有24名志願者在用PfCSP DNA疫苗和RTS，S疫苗二者免疫接種前在抗PfCSP、HIV、HBV核心抗原、HCV、痘苗病毒和dsDNA的抗體方面都是陰性的。10名DNA引發的志願者中的6名和14名未引發的對照中的8名為抗HBsAg抗體陽性的。
所有24名志願者在0周和8周時通過左側三角肌肌肉內注射接受兩劑RTS，S疫苗。RTS，S疫苗包含與B型肝炎表面抗原(HBsAg)融合的惡性瘧原蟲(NF54/3D7)CSP蛋白的第207-395位胺基酸(8)。簡而言之，RTS，S蛋白是一種雜合物，包含基本上全部的CS蛋白的C端部分、4個或更多個串聯重複的免疫顯性區和HBsAg。有關RTS，S製備的一般性描述參閱WO 93/10152和美國專利5,928,902，它們均全文收編於此作為參考。
產生的重組RTS，S蛋白表達於酵母中(99)並與免疫刺激劑單磷醯脂A和QS21(在水包油乳劑中)(Glaxo SmithKline Inc，Rixensart，比利時)組合製備RTS，S疫苗。具體而言，凍幹製劑包含RTS，S沉澱和佐劑稀釋劑。沉澱包含RTS，S(50μg)和作為防凍劑的乳糖(3.15％)。佐劑稀釋劑包含MPL(50μg)、QS-21(50μg)和油/水乳劑。產生的疫苗製劑在1ml體積的乳劑中包含50μg的RTS，S並在注射前30分鐘製備。三名HLA不匹配的志願者不接受PfCSP DNA疫苗和RTS，S疫苗。從這三名志願者中獲取的樣品用作此試驗中的陰性對照。未引發的組中的一名志願者在第一次免疫接種後從試驗中退出。
在全長PfCSP序列的上遊區中包含許多T細胞表位，包括在PfCSPDNA疫苗中，但不存在於RTS，S疫苗中。但在這兩種疫苗之間有足夠的重疊來保證將RTS，S疫苗作為潛在的「加強」疫苗施用給先前用PfCSP DNA疫苗免疫過的志願者的正確性。具體而言，RTS，S包括與未融合的HBsAg共表達於酵母中的、與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)融合的PfCSP的一部分，其中包含具有19個NANP重複的高度保守區和CSP的羧基端(36)。PfCSP疫苗的全長CS蛋白包含9個T細胞表位，而RTS，S包含5個T細胞表位(61)。RTS，S表位中有4個出現於PfCSP疫苗中。
實施例2-7詳述了隨後用來自各名志願者的血樣進行的分析。簡而言之，對於接受PfCSP DNA疫苗引發的志願者在其接受最後一劑PfCSP DNA疫苗後12-14個月，而對於所有志願者在第一和第二劑RTS，S疫苗後第1周、2周和6周，研究T細胞反應。在免疫接種之前和每劑RTS，S疫苗施用後第2、4、6和8周檢測抗體。
實施例2CTL反應如上所述，單獨用RTS，S疫苗進行免疫接種在人體內誘發了抗體和CD4+T細胞依賴性IFN-γ反應，但還未有報導說會在人體內引起抗原特異性CTL(61)。為了確定DNA誘發的記憶CTL是否能通過用RTS，S疫苗加強來進行回憶以及加強後的應答是否比最初的DNA引發的應答更寬，檢測了不同志願者中抗原特異性CTL的細胞毒活性。在用RTS，S免疫之前1-2周和第一劑和/或第二劑RTS，S免疫後1或2周從DNA引發或未引發的志願者的血液中收集外周血單核細胞(PBMC)。然後將這些PBMC用於鉻釋放試驗中檢測抗原呈遞靶細胞的裂解(105)。
如前所述進行體外鉻釋放測定(105)。具體而言，為了產生效應細胞，用表達PfCCSP的ALVAC(vCP182)以5pfu/個細胞的量在37℃感染總PBMC中的20％90分鐘。漂洗2次後，將這些PBMC與剩餘的PBMC混合併一起培養7-10天。48小時後加入重組的人IL-2(Cetus，Emeryville，CA)(20U/ml)。靶細胞是用10μg/ml的PfCSP特異性CTL表位或對照肽敏化過夜的自體或MHC錯配的PHA blast。用常規的6小時鉻釋放測定法檢測CTL活性。裂解百分率定義為(實驗組釋放量-培養基對照釋放量)/(最大釋放量-培養基對照釋放量)×100。通過從與實驗肽共保溫的靶細胞的裂解百分率中減去與陰性對照HIV gag A2-限制性肽一起培養的靶細胞的裂解百分率得到特異性裂解的百分率。只有在同一測定中對於至少2的效應子靶(E∶T)比率，免疫接種後特異性裂解百分率≥10％且免疫接種前的特異性裂解百分率＜10％，CTL反應才被認為是陽性的。
純度為80-95％的合成肽用於CTL靶細胞的敏化並獲自ChironTechnologies(Clayton Victoria，澳大利亞)。使用了8種來自PfCSP且包括在RTS，S序列中的肽。這8種肽包括4種9-10個胺基酸長的確定的CTL I類MHC限制性表位。這4種CTL表位受HLA-A*0201(肽A2.319；胺基酸殘基319-327，YLNKIQNSL；SEQ.ID.NO.1)、-A*0101(肽A1.310；胺基酸殘基310-319，EPSDKHIKEY；SEQ.ID.NO.2)、-A*0301(肽A3/11.336；胺基酸殘基336-345，VTCGNGIQVR；SEQ.ID.NO.3)和-B*3501(肽B35.353；胺基酸殘基353-360，KPKDELDY；SEQ.ID.NO.4)所限制。其它4種肽是DR結合肽DR.316(胺基酸殘基316-335，IKEYLNKIQNSLSTEWSPCS；SEQ.ID.NO.5)、DR.318(胺基酸殘基318-332，EYLNKIQNSLSTEW；SEQ.ID.NO.6)、DR.363(胺基酸殘基363-383，DIEKKICKMEKCSSVFNVVNS；SEQ.ID.NO.7)和DR.346(胺基酸殘基346-365，IKPGSANKPKDELDYANDIE；SEQ.ID.NO.8)，它們如前所述是15-20個胺基酸長(107)。Glaxo SmithKline Inc(Rixensart，比利時)提供了一個具有13種PfCSP衍生肽的集合和一個具有20種HBsAg衍生肽的集合，長度均為15個胺基酸。13種PfCSP肽的胺基酸序列如下NEEPSDKHIKEYLNK(SEQ.ID.NO.9)、DKHIKEYLNKIQNSL(SEQ.ID.NO.10)、EYLNKIQNSLSTEWS(SEQ.ID.NO.11)、IQNSLSTEWSPCSVT(SEQ.ID.NO.12)、STEWSPCSVTCGNGI(SEQ.ID.NO.13)、PCSVTCGNGIQVRIK(SEQ.ID.NO.14)、CGNGIQVRIKPGSAN(SEQ.ID.NO.15)、QVRIKPGSANKPKDE(SEQ.ID.NO.16)、PGSANKPKDELDYEN(SEQ.ID.NO.17)、KPKDELDYENDIEKK(SEQ.ID.NO.18)、LDYANDIEKKICKME(SEQ.ID.NO.19)、DIEKKICKMEKCSSVF(SEQ.ID.NO.20)和ICKMEKCSSVFNVVN(SEQ.ID.NO.21)。來自流感基質蛋白質的肽(第58-66位殘基，GILGFVFTL，HLA-A2.1；SEQ.ID.NO.22)或破傷風毒素通用性T輔助細胞表位P30(第947-969位殘基，FNNFTVSFWLRVPKVSASHLET，DR-和DP-限制性；SEQ.ID.NO.23)用作陽性對照(74)。來自HIV gag蛋白質的肽(第77-85位殘基，SLYNTVATL，HLA-A2.1限制性；SEQ.ID.NO.24)或惡性瘧原蟲蛋白Exp-1(第82-96位殘基，AGLLGNVSTVLLGGV，DR限制性；SEQ.ID.NO.25)用作陰性對照。
通過用RTS，S加強來回憶DNA誘導的記憶型CTL在臨施用RTS，S疫苗前檢測DNA引發或未引發的志願者中無CTL。在14名只接受RTS，S疫苗的未引發志願者中都未檢測到CTL反應。在10名DNA引發的志願者中有5名檢測到抗原特異性和遺傳限制性CTL反應(
圖1c)。5名有反應者之一在施用第一劑RTS，S後一周有了CTL(V6)，其它幾名都是在施用第二劑RTS，S後有了CTL。DNA引發的志願者中CTL反應頻率(7/113次測定，6.2％)顯著高於未引發志願者中的CTL反應頻率(0/125次測定，0％)(P＝0.0047)。所述CTL反應頻率比得上在12-14個月之前接受了3劑PfCSP DNA疫苗的15名志願者中只用DNA免疫接種後觀察到的CTL反應頻率(30/458次測定，6.6％)(107)。
在已用DNA引發並用RTS，S加強的志願者中CTL的強度(magnitude)(特異性裂解百分率的範圍[幾何平均值]11.4-28.1[15.4])也與單獨用DNA免疫接種誘發的CTL強度(10.5-90.0[15.6])在同一範圍內。RTS，S疫苗不包含在先前兩項研究(105，107)中與最高的應答普遍性相關的CD8+T細胞表位。
檢測到針對存在於RTS，S序列中的所有4種確定的PfCSP特異性I類MHC限制性表位的CTL反應。在5名CTL陽性反應者中，4名具有針對HLA-A2-限制性表位A2.319的CTL，1名對HLA-A1-限制性表位A1.310(V2)有反應，在4名A2.319反應者中有兩名分別對HLA-A3和HLA-B7-限制性表位A3.336(V8)和B7.285(V9)有反應。未檢測到定向於報導過的CD4+CTL表位DR.318(序列EYLNKIQNSLSTEWS；SEQ ID NO.26)的CTL，所說表位DR.318中包含CD8+CTL表位A2.319(下劃線標示處)(69)。在未接受PfCSP DNA但接受了2劑RTS，S疫苗的14名志願者中也未檢測到CTL活性。在這些志願者中CTL活性的缺乏符合先前研究中顯示的單獨施用此疫苗不能誘導CD8+T細胞活性(即，CTL活性)的結果。
在第二和第三劑PfCSP DNA免疫接種後2周和6周、RTS，S加強前約一年進行檢測時，5名用RTS，S疫苗加強後具有陽性CTL反應的DNA引發的志願者中有3名先前未檢測到針對同一表位的CTL活性(107)。相反，在只用DNA免疫接種後，5名志願者中有2名先前就檢測到了針對RTS，S中所含肽的CTL活性。這兩名志願者不對RTS.S加強產生應答。
RTS，S加強的CTL反應比DNA引發的CTL反應更寬在用RTS，S疫苗加強後具有陽性CTL反應的5名DNA引發的志願者中，有3名(V3、V6和V8)在經RTS，S加強後對DNA引發後未有反應的表位產生了反應。具體而言，只有當免疫接種後的特異性裂解百分率比兩種陰性對照(MHC+對照和非MHC+肽)的背景高10％或更多時，CTL反應才被認為是陽性的。V3和V6中，在用PfCSP疫苗進行DNA引發後對表位A2.319無CTL反應(
圖1a和1b)。不過，在用RTS，S加強後，兩名志願者都顯示出了對此表位的CTL反應(
圖1c)。V8在DNA引發後對表位A2.319和A3.336無CTL反應，但是在用RTS，S疫苗加強此名引發的志願者後，出現了對這些表位的CTL反應(
圖1a、1b和1c)。
如上所述，本領域的技術人員不認為以蛋白為基礎的疫苗可以有效刺激CTL反應。同樣的，RTS，S作為一種以蛋白質為基礎的疫苗，迄今為止仍被認為對於刺激CD8+T細胞反應而言是無效的(61)。與已知的相反，以上數據清楚的證實了在DNA引發後，RTS，S可激發對於新CTL表位的CTL反應。
用卡方檢驗、Fisher確切檢驗(雙側)或Student的t-檢驗(雙側)分析肽特異性IFN-γ(在下面)和CTL反應的頻率和強度。用成對樣品的t-檢驗比較T細胞亞群中IFN-γ mRNA表達水平的比例。顯著性水平為P值＜0.05。
實施例3對PfCSp的T細胞IFN-γ應答用如下的標準ELISPOT試驗評估IFN-γ反應。如前所述(107)在10μg/ml肽存在的條件下體外刺激36小時後用ELISPOT測定產生IFN-γ的PfCSP-特異性細胞的數目。用自動斑點計數系統(Scanalytics，Fairfax，VA)清點孔中相應於產生細胞因子的細胞的斑點數目(斑點形成細胞；SFC)。反應表示為SFC/106PMBC的平均數，如果符合以下條件就被認為是顯著的1)含實驗肽的孔中細胞的平均數目顯著大於含對照肽的孔(p＜0.05，student’s T檢驗)；2)淨SFCs/孔(試驗肽孔中的平均SFC數目減去對照肽孔中的平均SFC數目)≥5個SFC/孔；和3)刺激指數(試驗肽孔中的平均SFC數目與對照肽孔中平均SFC數目的比率)大於2.0。此外，如果免疫接種前獲取的細胞對如上所述的PfCSP-特異性肽有陽性反應，免疫接種後對同一種肽的這種反應就不被認為是陽性的。
用於此處時，IFN-γ ELISPOT中的「陽性反應者頻率」是對於特定肽的測試呈陽性的志願者的數目除以試驗組中志願者的總數。「陽性IFN-γ ELISPOT試驗的頻率」是對肽的陽性反應數除以對於此肽進行的測試的總數。例如，如果在10名患者中每一個人身上進行6種肽的測試，測試總數就是60。如果36次測試是陽性的，那麼陽性試驗的頻率是60次中有36次陽性。「IFN-γ反應的強度」由每一百萬PBMC中SFC的數目表示。
在第一劑和第二劑RTS，S疫苗施用之前1-2周和之後1、2和6周分離PBMC用於ELISPOT測定中。在這些測定中，將PBMC與如實施例2中所述的8種規定的PfCSP肽(4種包含I型HLA限制性表位的9個胺基酸長的肽，4種15-20個胺基酸長的肽，後4種中每種都包含II型限制性表位，其中3種還包含I型限制性表位)和RTS，S序列中所含的13種PfCSP肽的集合一起保溫。這些肽在上文的實施例2中也進行了進一步的詳述。
DNA引發過或未引發過的志願者在RTS，S免疫接種前沒有可檢測到的PfCSP特異性IFN-γ反應。在只用僅含I型MHC限制性表位的9個胺基酸長的肽進行的測定中，在免疫接種後的任何時間都未檢測到IFN-γ反應。這些是與實施例2中所述相同的肽。在第一次免疫後，在10名DNA引發過的志願者中有6名對所有4種15-20個胺基酸長的PfCSP肽呈陽性IFN-γ反應，而相比之下，在14名未引發過的志願者中只有2名對一種這樣的肽呈陽性IFN-γ反應(p＝0.019)(表1)。陽性反應者是對這4種肽中至少一種起反應的志願者。此外，在引發組中的反應者對所有4種被測試的肽起反應，而未引發組中的反應者只對4種被測試肽中的一種起反應。無論受試者的HBsAg抗體情況如何，DNA引發組中的反應頻率顯著高於未引發組中的(陽性試驗次數/總試驗次數20/116[18.1％]對4/164[2.4％]，p＝0.00001)。
表1 對PfCSP特異性肽的IFN-γ反應的總頻率和強度

*第一次免疫後，在DNA引發過的志願者中陽性反應者的數目顯著高於未引發志願者中的陽性反應者數目(6/10對2/14，p＝0.019)。
第二次施用RTS，S疫苗後，在10名DNA引發過的志願者中的8名和14名未引發過的志願者中的11名檢測到了IFN-γ反應(表1)。儘管在施用第二劑RTS，S疫苗後兩組在反應者的數目方面沒有差異(見陽性試驗數目/總試驗數目(％))，但DNA引發過的志願者中總陽性試驗數目在統計學上顯著高於未引發的志願者中的(陽性試驗次蜘總試驗次數61/238[25.6％]對44/320[13.8％]，p＝0.0004)(表1)。根據陽性試驗的頻率所顯示的，總陽性試驗數目中的這種差異與志願者的Hbs Ag抗體情況直接相關。第二次RTS，S免疫接種後，在HBsAg抗體陽性受試者中DNA引發過的志願者中陽性試驗的數目明顯高於未引發的志願者中的(23/72[31.9％]對11/84[13.1％]，p＝0.0078)，但在HbsAg抗體陰性受試者中則並非如此(37.5％對40.3％陽性試驗)。
在表位水平比較DNA引發過的和未引發過的組對肽DR.316、DR.318和DR.363的IFN-γ反應。DR.316和DR.318包含重疊的CD4+和CD8+T細胞表位，而DR.363則只包含CD4+T細胞表位(107)。
如表2中所顯示的，施用第一劑RTS，S疫苗後，在10名DNA引發過的志願者中有4名檢測到了對肽DR.316的IFN-γ反應，而14名未引發的志願者則均無反應(p＝0.0095)，施用第一劑和第二劑RTS，S疫苗後，在10名DNA引發過的志願者中有6名檢測到了對肽DR.316的IFN-γ反應，而13名未引發的志願者中有5名有此反應(p＝0.35)。當總體考慮所有測試時(在施用第一和第二劑RTS，S疫苗後)，DNA引發組的陽性試驗頻率較高(陽性試驗數/總試驗數，17/60對8/81，p＝0.0046)，但IFN-γ反應的強度無差異(SFC的範圍11.9-106.3[33.0]對17.5-58.1[28.4]，p＝0.21)。
表2表位水平針對PfCSP的IFN-γ反應頻率

此外，如表2中所示，施用第一劑RTS，S疫苗後，在10名DNA引發過的志願者中有3名檢測到了對不含DR.316頭兩個胺基酸的肽DR.318的IFN-γ反應，而14名未引發的志願者則均無反應(p＝0.028)，施用第一劑和第二劑RTS，S疫苗後，在10名DNA引發過的志願者中有6名檢測到了對肽DR.318的IFN-γ反應，而13名未引發的志願者中有1名有此反應(p＝0.0069)。在第一劑和第二劑RTS，S疫苗接種後進行的ELISPOT測定總體顯示DNA引發過的組具有較高的陽性試驗頻率(陽性試驗數/總試驗數，14/60對1/81，p＜0.00003)。考慮到在只接受RTS，S疫苗的組裡對這種肽只有一個的反應，因此不可能比較反應的強度。
施用第一劑RTS，S疫苗後，在10名DNA引發過的志願者中有3名檢測到了對不含已知的CD8+T細胞表位的肽DR.363的IFN-γ反應，而14名未引發的志願者中有2名有此反應(p＝0.35)，施用第一劑和第二劑RTS，S疫苗後總體在10名DNA引發過的志願者中有4名檢測到了對肽DR.363的IFN-γ反應，而14名未引發的志願者中有9名有此反應(p＝0.24)(表2)。在第一劑和第二劑RTS，S疫苗接種完成後進行的測定顯示DNA引發過的組與只施加了RTS，S的組之間陽性試驗頻率沒有明顯的差異(陽性試驗數/總試驗數，8/60對18/81，p＝0.178)。但在施加第二劑RTS，S後，未引發的志願者中IFN-γ反應的強度顯著高於DNA引發過的志願者中的反應強度(SFC的範圍13.1-58.8[幾何平均值26.4]/106個細胞對14.0-140.6[幾何平均值47.9]/106個細胞，p＝0.004)。
類似的，在施加完兩劑RTS，S疫苗後，DNA引發組和只施加RTS，S的組中陽性反應受試者的頻率無差異(8/10對11/13)。見表1。DNA引發組中的受試者比只接受RTS，S疫苗的志願者對顯著更多的測試肽有反應。在10名DNA引發過的志願者中8名有反應的人中，一名對所有4種15-20個胺基酸長的測試肽起反應，1名對3種肽起反應，5名對兩種肽起反應，只有1名對一種肽起反應。在13名未引發過的志願者中11名有反應的人中，1名對3種肽起反應，2名對兩種肽起反應，8名只對一種肽起反應(2/8對DR.316有反應和6/8對DR.363有反應)。總而言之，8名DNA引發過的志願者中的7名和11名未引發過的志願者中的3名對至少兩種被測試肽有反應(p＝0.0094)。
實施例4對HBsAg的T細胞IFN-γ應答RTS，S是PfCSP的一部分和B型肝炎表面抗原(HBsAg)的融合蛋白。使用於佐劑中的RTS，S進行免疫接種在攜帶抗HBsAg抗體的受試者中誘發T細胞反應的效率明顯較低。這種效果在DNA引發過的志願者中則不顯著得多。因為HBsAg抗體的狀態對四種15-20個胺基酸長的肽的應答有明顯影響，我們擴展了試驗內容。通過在第一次和第二次RTS，S免疫後所有的試驗時間點在PBMC中同時用一組13種PfCSP肽(pPfCSP)和一組19種HBsAg肽如上所述進行ELISPOT測定，比較對於PfCSP和HBsAg的IFN-γ反應。在幼稚的、未經DNA引發的受試者中，HBsAg組分對於T細胞反應而言是免疫顯性的(HBsAg陰性的未引發志願者中對PfCSP有反應者為0/6名而對HBsAg有反應者為6/6名，HBsAg陽性的未引發志願者中對PfCSP有反應者為1/8名而對HBsAg有反應者為7/8名)，但PfCSP DNA的引發似乎平衡了這種免疫優勢，使T細胞反應朝向PfCSP(表3；HBsAg陰性且引發過的志願者中對PfCSP有反應者為2/4名而對HBsAg有反應者為2/4名，HBsAg陽性且引發過的志願者中對PfCSP有反應者為4/6名而對HBsAg有反應者為6/6名)。
表3 HBsAg血清反應陽性和血清反應陰性的志願者之間IFN-γ反應的頻率和強度對肽集合DNA引發過的志願者未引發過的志願者的反應 HBsAg(+) HBsAg(-)P值HBsAg(+) HBsAg(-) P值頻率[陽性反應者/總志願者(％)]第一次免疫接種pPfCSP 4/6(66.7) 2/4(50.0) 0.6 1/8(12.5) 0/6(0)0.37pHBsAg 6/6(100.0) 2/4(50.0) 0.05 7/8(87.5) 6/6(100.0)0.37P值0.12 1.00 0.003 0.0005第二次免疫接種後pPfCSP5/6(83.0) 3/4(75.0) 0.753/7(42.9) 5/6(83.0) 0.14pHBsAg5/6(83.0) 3/4(75.0) 0.757/7(100.0) 6/6(100.0)-P值 1.001.000.018 0.3頻率[陽性試驗數/總試驗數(％)]第一次免疫接種後pPfCSP4/15(26.7) 2/11(18.2) 0.61 2/23(8.7) 0/15(0)-pHBsAg12/15(80.0) 3/11(27.3) 0.00716/23(69.6) 9/15(60.0)*0.54P值 0.0034 0.610.00002 -第二次免疫接種後pPfCSP9/18(50)7/12(58.3) 0.653/21(14.3) 12/18(66.7)0.0008pHBsAg12/18(66.7) 7/12(58.3) 0.6416/21(76.2) 17/18(94.4)*0.12P值 0.311.000.00006 0.035強度[淨SFC/106PBNC(幾何平均值)]第一次免疫接種後pPfCSP19.5-52.2(33.7) 53.1-82.5(66.2) 0.2335.6-54.4(44.0) neg -pHBsAg13.5-80.0(37.7) 21.3-144.4(46.0)0.5413.1-222.9(60.1)13.1-132.5(33.9)*0.013P值 0.410.780.052-第二次免疫接種後pPfCSP18.1-68.8(33.8) 11.7-122.5(37.9) 0.1125.0-54.4(37.6) 17.5-125.6(46.1) 0.09pHBsAg18.8-131.3(52.8)17.9-215.0(57.6) 0.3420.0-278.8(62.3)12.5-317.5(97.3)*0.013P值 0.024 0.290.0032 0.0001*來自未引發組的HBsAg血清反應陽性的志願者在第二次免疫後對HBsAg的IFN-γ反應的頻率和強度都比第一次免疫後明顯增加，P值分別為0.035和0.00003。
在未引發過的志願者中，無論他們是否具有抗HBsAg抗體，所有受試者都對HBsAg有高的IFN-γ反應(表3和4；參閱未引發過的志願者)。如表3中所示，在施加第一劑RTS，S疫苗後，已存在抗HBsAg抗體的受試者對HbsAg肽集合的反應強度明顯高於無這些抗體的受試者的反應強度(SFC/106PBMC的範圍[幾何平均值]13.1-222.9[60.1]對13.1-132.5[33.9]，p＝0.013)。不過，在第二次RTS，S疫苗免疫後，這兩組之間IFNγ的強度就沒有差異了(參閱反應強度資料)。與第一次RTS，S疫苗免疫後相比，第二次RTS，S疫苗免疫後，HBsAg抗體陰性受試者中對HBsAg的反應顯著增加(表3)。具體而言，兩次RTS，S疫苗免疫後陽性試驗的頻率是17/18，而第一次RTS，S免疫後則為9/15(p＝0.035)(見表3的腳註)。而IFN-γ反應的強度是12.5-317.5[幾何平均值＝97.3]，只免疫一次的IFN-γ反應強度是13.1-132.5[幾何平均值＝533.9](p＝0.024)(參閱表3的腳註)。第二次RTS，S免疫後，HbsAg抗體陰性受試者中SFC的數目明顯高於HbsAg抗體陽性受試者中SFC的數目(12.5-317.5[97.3]對20.0-278.8[62.3]，p＝0.013)(表3)。
如表3中所提供的，對PfCSP的IFN-γ反應顯示出與對HbsAg的反應的不同模式。一次RTS，S疫苗免疫後，14名未引發過的志願者中有13名對HBsAg有反應，其中包括8名HBsAg陽性志願者中的7名和所有的6名HBsAg陰性志願者。相反，在這14名受試者中只有1名對PfCSP起反應(p＝0.0049)，此名起反應者是8名HBsAg陽性志願者之一，而所有6名HBsAg陰性志願者均無此反應。總而言之，按照第一和第二劑RTS，S免疫後檢測的陽性反應者和陽性試驗的頻率，在所有未用DNA引發的志願者中RTS，S誘發的對PfCSP的IFN-γ反應顯著低於它所誘發的對HBsAg的反應，在原先已存在抗HBsAg抗體的受試者中甚至更低(表3)。參見對於未引發的志願者的p值。同樣的，在HBsAg抗體陽性(p＜0.05-0.0032)和抗體陰性受試者(p＝0.0001)中，每一次免疫接種後IFN-γ反應的強度也更低(表3)。參見表3中反應強度部分標出的p值。這些資料證實，在未引發的受試者中，RTS，S引發了對PfCSP和對HBsAg的T細胞反應，對HBsAg的反應顯著強於對PfCSP的反應(表4)。
在DNA引發過且HbsAg抗體陽性的志願者中，第一劑RTS，S免疫後對HBsAg的陽性試驗的數目高於對PfCSP的陽性試驗的數目(12/15對4/15，p＝0.0034)(表3)。不過，在施用第二劑RTS，S疫苗後，在HBsAg抗體陽性的志願者中對PfCSP的陽性試驗的頻率與對HBsAg的陽性試驗的頻率無差異。參閱針對DNA引發過的志願者的頻率數據。在DNA引發過且HbsAg抗體陰性的志願者中，這些頻率在第一劑和第二劑RTS，S疫苗接種後無差異。無論HbsAg抗體的情況如何，在第一劑RTS，S疫苗接種後對PfCSP和HbsAg的反應強度是相似的(表3)。但在DNA引發過且HBsAg抗體陽性的受試者中施用第二劑RTS，S後，與對PfCSP的反應強度相比，對HBsAg的反應強度顯著增加(SFC/106PBMC的範圍[幾何平均值]18.1-68.8[33.8]對18.8-131.3[52.8]，p＝0.024)。這些結果表明，如果施用多劑RTS，S疫苗，最終對HBsAg的反應會比對PfCSP的反應佔優勢。
實施例5DNA疫苗在人體中誘發了Tc1(CD8+)和Th1(CD4+)型反應，而RTS，S只誘發了Th1反應單獨用PfCSP DNA疫苗或單獨用RTS，S疫苗能誘發IFN-γ反應，所以在施用第二劑RTS，S疫苗後，在兩組中IFN-γ反應就陽性反應者而言是相當的(8/10對11/14)(表1)。不過，如前所報導的，單獨用PfCSP DNA疫苗或單獨用RTS，S疫苗誘導的IFN-γ反應隨不同的T細胞亞群而定。DNA免疫誘導了CD4+和CD8+T細胞依賴型IFN-γ反應(107)，而RTS，S只誘導了CD4+T細胞依賴型反應(61)。
用來自單獨用DNA、單獨用RTS，S免疫的志願者或來自DNA引發/RTS，S加強的志願者的PBMC，分別通過ELISPOT和實時PCR對體外誘導期和效應期中IFN-γ反應的T細胞譜進行了表徵。
用PBMC進行ELISPOT試驗，在與肽一起培養之前用抗CD4+或抗CD8+包被的Dynabeads M-450(Dynal，Inc.，Great Neck，NY)耗竭PBMC中的CD4+或CD8+T細胞。在選擇性富集的T細胞群中用實時PCR測定IFN-γ mRNA表達水平CD4+/CD45RA+、CD4+/CD45RA-、CD8+/CD45RA+和CD8+/CD45RA-T細胞。在這些測定中，以含10％人AB血清的2ml完全RPMI培養基中有3×106個細胞/孔的量在24孔板中將凍存的PBMC培養過夜進行復甦，然後用短肽(9-10個胺基酸A2肽序列GILGFVFTL；SEQ IDNO.27)刺激2小時，或用長肽(15-20個胺基酸)刺激4小時，肽濃度均為10μg/ml。然後，用MACS MultiSort試劑盒針對CD8+或CD4+T細胞收穫並富集PBMC，然後使富集的CD4+或CD8+T細胞通過CD45RAMicroBeads(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分離CD45RA+和CD45RA-細胞。
為了用實時PCR對IFN-γmRNA定量，用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從富集的T細胞亞群中分離總RNA。用隨機六聚物和TaqMan逆轉錄試劑盒(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)從總RNA中合成cDNA。在ABI PRISM 7700序列檢測儀(Perkin-Elmer)上用TaqMan PCR試劑盒按照製造商的說明書通過實時PCR對IFN-γmRNA進行相對定量。設計用於擴增IFN-γ和GAPDH mRNA的引物、探針和標準物並進行內部標準化。在ABI PRISM7700序列檢測儀(Perkin-Elmer)上用TaqMan PCR試劑盒按照製造商的說明書通過實時PCR對IFN-γ mRNA進行相對定量。設計用於擴增IFN-g和GAPDH mRNA的引物(hIFN-g-F，TTGGTGATGATTTGAACATTGGA，SEQ.ID.NO.28；hIFN-g-R，CCCAGTTCCTGCAGAGTAGAAAA，SEQ.ID.NO.29；hGAPDH-F，5』GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，SEQ.ID.NO.30；hGAPDH-R，GAAGATGGTGATGGGATTTC，SEQ.ID.NO.31)、探針(hIFN-g探針TGTCACTTGCAAACACACAGCTTGTCGAA，SEQ.ID.NO.32；hGAPDH探針CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC，SEQ.ID.NO.33)並按製造商的說明進行內部標準化。對於每個試驗樣品都進行GAPDH擴增作為內源性的對照來解釋加入各反應的總RNA的量和質的差異。熱循環條件是50℃2分鐘和95℃10分鐘，然後進行50個循環的2步PCR(95℃15秒和60℃1分鐘)。所有樣品均以三等份試樣進行擴增。確定與靶mRNA水平負相關的循環閾值(Ct)為這樣的循環數，在此循環數報導分子螢光發射增加到閾值水平以上。以GAPDH基因的表達值為基礎對兩個不同樣品之間靶基因的表達進行標準化。
為了鑑定體外IFN-γ反應的誘導期涉及哪些T細胞亞群，在進行ELISPOT測定之前將耗竭後的T細胞群與限定的PfCSP肽一起保溫。並行的，將PBMC與用於ELISPOT測定相同的肽一起保溫後通過實時PCR在T細胞群的富集亞群中測定IFN-γ的mRNA表達水平，從而了解真正分泌IFN-γ的效應T細胞。檢測對肽DR.363(只含II型限制性CD4+T細胞表位)和DR.316(含重疊的I型和II型限制性CD4+和CD8+表位)的反應，從而比較通過不同疫苗遞送體系針對PfCSP的IFN-γ反應的潛在機制。同時還並行測定了對來自流感基質蛋白質(Flu M A2)的HLA-A2限制性、免疫顯性和保守的CD8+T細胞表位以及對來自破傷風毒素(TT-DR)的HLA-DR限制性CD4+T細胞表位的反應，從而提供了不同表位、試驗和志願者之間的內在統一標準。
對Flu M A2肽的IFN-γ反應的體外誘導是CD8+T細胞依賴型而非CD4+T細胞依賴型的，因為在PBMC臨培養之前耗竭CD8+而非CD4+T細胞完全終止或顯著降低了所有17名受試個體中的IFN-γ反應，無論他們接受的是哪一類型的抗瘧疾疫苗(圖2a)。相反，在所有被測試的3名陽性反應者中，對於肽TT-DR的反應則完全是CD4+而非CD8+T細胞依賴型的(圖2b)。
用實時PCR檢測到的4種富集的T細胞群(CD4+/CD45RA+、CD4+/CD45RA-、CD8+/CD45RA+和CD8+/CD45RA-)中的IFN-γmRNA表達水平與獲自ELISPOT試驗的結果一致。用Flu M A2肽刺激後，主要在CD8+T細胞中IFN-γ mRNA上調(圖2e標準)。IFN-γ mRNA表達水平在CD8+T細胞中提高6.8倍(範圍，3.4-12.9倍)，相比之下，在CD4+T細胞中提高了2.2倍(範圍，0.98-7.58倍)(p＝0.03)。在CD8+T細胞中IFN-γ mRNA上調的百分率超過CD4+T細胞中的，平均為78％(範圍62-99％)。相反，用TT-DR刺激後主要在CD4+T細胞中IFN-γmRNA上調(圖2e標準)。IFN-γ mRNA水平在CD4+T細胞中提高7.6倍(範圍，2.4-18.3)，相比之下，在CD8+T細胞中提高了2.2倍(範圍1.1-4.6)(p＝0.02)。CD4+T細胞中IFN-γ mRNA上調的百分率超過CD8+T細胞中的，平均為79％(在74-100％之間)。這些結果表明CD8+T細胞是針對Flu M A2肽的IFN-γ反應的功能效應器，而CD4+T細胞則是針對TT-DR肽的效應器。
通過與上述兩個標準平行地進行測定，我們闡明了用DNA PfCSP疫苗或RTS，S疫苗誘導的針對兩種不同PfCSP肽(DR.363和DR.316)的IFN-γ反應的T細胞譜。與DR.363包含CD4+T細胞表位而不含CD8+T細胞表位的事實一致的是，用耗竭後的T細胞群進行的ELISPOT測定結果顯示，在只接受了PfCSP DNA疫苗(2/2被測試者，V1和V5)或只接受了RTS，S疫苗(6/6被測試者)的志願者中，對肽DR.363的IFN-γ反應完全是CD4+T細胞依賴型的(圖2c)。通過ELISPOT測定發現，富集的T細胞群中IFN-γ mRNA表達水平與T細胞依賴性相關。在PfCSP DNA和RTS，S疫苗免疫的志願者中IFN-γ mRNA主要在CD4+T細胞中上調(圖2eDR.363)。在5名DNA免疫過的受測試志願者中，IFN-γ mRNA水平在CD4+T細胞中提高5.3倍(範圍，2.6-11.5)，相比之下，在CD8+T細胞中提高了1.7倍(範圍，0.99-3.2)(p＝0.014)。在CD4+T細胞中IFN-γ mRNA上調超過CD8+T細胞中的，為74％(範圍，64-91％)。在4名RTS，S免疫過的受測試志願者中觀察到同一模式(圖2e)，IFN-γ mRNA水平在CD4+T細胞中提高9.2倍(範圍，2.9-53.5)，相比之下，在CD8+T細胞中提高了0.9倍(範圍，0.6-1.1)，在CD4+T細胞中IFN-γ mRNA上調超過CD8+T細胞中的，為86％(範圍，73-98％)。這些結果提供了第一手證據，表明除了CD8+T細胞依賴型IFN-γ反應之外，DNA PfCSP疫苗在人體中誘發了PfCSP特異且CD4+T細胞依賴型的IFN-γ反應。
對DR.316(重疊的CD4+和CD8+T細胞表位)的IFN-γ反應在只接受PfCSP DNA疫苗或只接受RTS，S疫苗的志願者中依賴於T細胞的不同亞群。如以前所報導的(107)，在只接受DNA(V1)(圖2d)的志願者中反應既是CD4+又是CD8+T細胞依賴型的(107)，相比之下，在只接受RTS，S疫苗的志願者中則反應只是CD4+而非CD8+T細胞依賴型的(3/3受測試的志願者)(圖2d)。此外，在DNA免疫的志願者中IFN-γ mRNA主要是在CD8+T細胞中上調(圖2eDR.316)，儘管ELISPOT的測定顯示反應既是CD4+又是CD8+T細胞依賴型的。
IFN-γ mRNA表達水平在CD8+T細胞中提高64.7倍，相比之下，在CD4+T細胞中提高了0.36倍，在CD8+T細胞中IFN-γ mRNA上調超過CD4+T細胞中的，為99.6％。相反，在RTS，S疫苗免疫的志願者中IFN-γmRNA的轉錄主要是在CD4+T細胞中上調(圖2eDR.316)。IFN-γmRNA表達水平在CD4+T細胞中提高24.7倍(範圍，5.3-176.7倍)，相比之下，在CD8+T細胞中提高了2.5倍(範圍，1.1-5.6倍)。在CD4+T細胞中IFN-γ mRNA上調超過CD8+T細胞中的，為86％(範圍，69-98％)。這些結果表明，通過DNA免疫接種，CD4+T細胞只在IFN-γ反應的體外誘導期中被涉及，CD8+T細胞是針對DR.316的真正分泌IFN-γ的細胞。相反，在RTS，S疫苗免疫的受試者中，這些結果表明CD4+T細胞是針對同一種肽(DR.316)產生IFN-γ的效應T細胞。
實施例6DNA-引發/RTS，S加強拓寬了產生IFN-γ的T細胞群的組成在DNA引發過的志願者中通過RTS，S疫苗加強，勾畫出回憶的產生IFN-γ的T細胞群的組成。在只用PfCSP DNA疫苗或只用RTS，S疫苗免疫的志願者中對肽DR.363(不含CD8+T細胞表位)的IFN-γ反應只是CD4+T細胞依賴型的。DNA引發過的組在RTS，S加強後在2/3的反應者(V1和V5)中檢測到對DR.363的同一類型反應。驚人的是，經RTS，S加強後，通過CD4+T細胞中IFN-γ mRNA表達水平估量的反應強度在志願者V1中提高了94.9倍，在V5中提高了46.7倍，相比之下，在只用DNA免疫3次後，在V1中只增加了7.6倍，而在V5中只增加了12.5倍。見圖3中的「只施用DNA」的柱子。與DNA免疫接種後的情況相比，RTS，S加強後V1中反應的強度高了12.5倍，而在V5中高了3.7倍(圖3；比較「只施用DNA」的柱和「DNA/RTS，S」柱)。
只接受PfCSP DNA疫苗或只接受RTS，S疫苗的志願者對肽DR.316的IFN-γ反應取決於不同的T細胞亞群。DNA誘發的反應在誘導期既是CD4+T細胞依賴型又是CD8+T細胞依賴型的，但在效應期則只是CD8+T細胞依賴型的。檢測效應期時，在用肽刺激後對T細胞群進行耗竭。相反，RTS，S誘發的反應則在誘導期和效應期都只是CD4+T細胞依賴型的。因此，並不令人驚訝的是，DNA引發過的志願者在RTS，S加強後對DR.316的反應是單獨用DNA或RTS，S免疫的志願者中觀察到的兩種模式的混合(圖2d)。
在體外誘導期，第一次RTS，S免疫後3/5的反應者(4/6次測定)中檢測到了對DR.316的CD4+和CD8+T細胞依賴型IFN-γ反應。第二次RTS，S免疫後4/6的反應者(7/12次測定)中檢測到了完全的CD4+T細胞依賴型但只是部分CD8+T細胞依賴型的IFN-γ反應。耗竭CD8+T細胞不終止IFN-γ的產生(圖4a)，表明在RTS，S加強後，CD4+T細胞與CD8+T細胞一樣產生IFN-γ。同時，在效應期，IFN-γ mRNA表達水平不僅在CD8+T細胞中上調(8/8反應者)，也在CD4+T細胞中上調(第一次RTS，S免疫後有4/8名反應者，第二次免疫後有6/8名反應者)，相比之下，在只用DNA免疫的志願者中只在CD8+T細胞中上調，而在只用RTS，S免疫的志願者中只在CD4+T細胞中上調(圖2e用DR.316比較V1(DNA)和V22(RTS，S))。
總而言之，在用RTS，S加強後，8名反應者中有6名的CD8+和CD4+T細胞中都檢測到了IFN-γ mRNA的上調，在CD4+T細胞中IFN-γ mRNA上調的範圍是3.0-28.3倍(幾何平均值為6.6倍)，在CD8+T細胞中IFN-γmRNA上調的範圍是4.0-281.03倍(幾何平均值為19.7倍)。在CD4+T細胞中IFN-γ mRNA的上調百分率超過CD8+T細胞中的，為23.5％(範圍，6.5-45.1％)。此處的結果證明，經RTS，S加強後，DNA引發過的志願者中的DR.316特異性CD4+T細胞不僅作為CD8+T細胞產生IFN-γ的T輔助細胞(DNA誘導的IFN-γ反應的一個特徵)，而且還是產生IFN-γ的效應細胞(RTS，S誘導的IFN-γ反應的特徵)(表5)。
以上數據證實了在DNA引發-RTS，S加強的志願者中的CD8+T細胞依賴型IFN-γ反應，但在未引發的志願者中則無此反應。這些數據還證實了對同一表位的CD4和CD8依賴型IFN-γ反應。基於IFN-γ反應對不同T細胞亞群的依賴性，肽DR.316被鑑定為CD4和CD8重疊表位。
表4 RTS，S免疫後在DNA引發過和未引發過的組之間IFN-γ反應的比較

反應性得分的標準基於有關以下因素的統計學顯著性的增加(p＜0.05)(1)陽性反應者的頻率，(2)陽性試驗的頻率，和(3)與基線相比陽性反應的強度，以及(4)在第二次免疫後與第一次免疫後進行比較的IFN-γ反應的顯著性增加。-，無反應；+/-，增加但在統計學上不顯著；+、++、+++和++++分別表示在4種標準的1、2、3或4種中的顯著增加。
實施例7在DNA引發過/RTS，S加強的志願者中的抗體反應在用RTS，S免疫之前和第一次RTS，S免疫後2、4、6和8周以及第二次免疫後1、2、4和6周檢測抗空氣乾燥的惡性瘧原蟲子孢子的抗體反應。如前所述(33)用間接的螢光抗體試驗(IFAT)測定抗體效價。正如所預計的，儘管在組間抗體反應有一些變化，但抗體效價仍然極好(圖5)。在第二次RTS，S免疫後4周效價達到最高，幾何平均效價在5120-20480之間。不過，除了一個例外之外，在任何時間點針對整個子孢子的抗體效價沒有統計學上的顯著差異。第一次免疫後兩周，在從未接受過PfCSP且具有抗HBsAg抗體(DNA-/HB+)的志願者組中IFAT測定的抗體的幾何平均效價是3225，比在已接受過PfCSP且具有抗HBsAg抗體(DNA+/HB+)的志願者中的幾何平均效價718.4高(p＝0.02)。這主要是由於DNA-/HB+組中一名志願者的高效價10240造成的，他在6周後，即恰好在預定的第二次RTS，S免疫之前退出了這項研究。在第二次RTS，S免疫後兩組間未出現統計學上的顯著性差異。
結論針對類似惡性瘧原蟲、結核分枝桿菌和HIV等感染的有效且可持久的疫苗的開發過程已被證實了比預計的要更緩慢、更困難和複雜。本發明的以上分析證明了用PfCSP DNA引發並以RTS，S加強可以導致通過免疫系統的細胞和體液免疫誘發反應。而且，在攜帶抗HBsAg抗體的受試者中，那些用PfCSP引發過的受試者在施用RTS，S佐劑疫苗後產生了比從未接受過PfCSP DNA的志願者顯著更好的T細胞反應。由於免疫或感染，瘧疾疫苗或其它疫苗的大部分接受者具有抗HBsAg抗體，這可能為這種引發加強的免疫策略提供重要優勢。
這種分析顯示，通過在最後一次DNA接種後12-14個月時用RTS，S加強，在50％的志願者中回憶了DNA引發的PfCSP特異性CTL反應，表明DNA疫苗對於誘髮長壽記憶型T細胞反應非常有效。在注射RTS，S後具有回憶CTL反應的5名志願者中有2名在只用DNA免疫後未檢測到CTL，說明用DNA疫苗進行免疫對於在這些受試者中誘導記憶型CTL是有優勢的，但可能對於誘發效應T細胞反應則還不是最佳的(38，92)。由於在只接受了RTS，S的未引發志願者中未檢測到CTL反應，所以RTS，S不能引發PfCSP-特異性CTL，但具有加強DNA疫苗所引發的CTL反應的能力。DNA引發的PfCSP特異性IFN-γ反應也被RTS，S強烈加強，尤其是在第一劑免疫後。10名DNA引發過的志願者中有6人具有針對所有4種測試肽的IFN-γ反應，而在未引發過的志願者中只有兩人對4種肽中的僅一種有反應。施加兩次RTS，S後，儘管反應的頻率和強度沒有顯著的差異，DNA引發過的志願者中表位水平的IFN-γ反應寬度顯著大於未引發的志願者中的。8名DNA引發過的志願者中有7名，而11名未引發過的志願者中只有3名對至少2種測試肽有反應(p＝0.0094)。
結果還顯示了DNA引發/RTS，S加強可以拓寬產生IFN-γ的T細胞群的組成。DNA引發開啟了兩種產生IFN-γ的T細胞譜(1)針對重疊的CD4+/CD8+T細胞表位(DR.316和DR.318)的CD4+T細胞依賴型CD8+類型1反應，和(2)針對DR限制性CD4+T細胞表位(DR.363)的CD4+類型1IFN-γ反應。另一方面，單獨施用RTS，S只誘發了CD4+類型1 IFN-γ反應(圖2)。至於DR.316，一種重疊的CD4+/CD8+T細胞表位，單獨施用DNA誘發了針對此肽的CD4+依賴型CD8+類型1反應，而單獨施用RTS，S誘發了針對此肽的CD4+類型1反應。不過，用DNA引發和用RTS，S加強同時誘發了針對DR.316的兩種模式的IFN-γ反應(圖4，表4)。此外，RTS，S刺激了針對DNA引發後未檢測到的新CTL表位的CTL反應。
CD4+T細胞可能對CD8+T細胞產生IFN-γ起到了旁觀者輔助功能。通過在體外用肽刺激PBMC之前和之後在耗竭後的或富集後的T細胞群中分別平行進行ELISPOT測定和實時PCR，以上結果證實了這種假設。肽刺激之前或之後對產生IFN-γ的細胞數目和IFN-γ mRNA表達水平的比較勾勒了單獨施用DNA疫苗和單獨施用RTS，S疫苗誘發的IFN-γ反應中涉及的功能性T細胞譜。
這裡的結果提示了DNA引發可以將加強後的反應定向於已引發的抗原。對於用RTS，S進行免疫，這一點似乎尤為重要。用HBsAg作為載體設計RTS，S，它會增強T細胞對瘧疾抗原PfCSP的反應。基線水平攜帶抗HBsAg抗體的受試者事先已用B型肝炎疫苗免疫。在撒哈拉沙漠以南的非洲傳遞的抗瘧疾疫苗預期會有這樣的靶群體，該靶群體明顯天然暴露於HBsAg中或事先用HBsAg免疫接種。
DNA引發過和未引發過的志願者之間對PfCSP的IFN-γ反應的比較顯示出在那些已存在抗HBsAg抗體的受試者中有顯著的差異(表1、3和5)。就各個體對HBsAg和PfCSP的IFN-γ反應的平行比較顯示了在所有未用DNA引發的志願者中RTS，S誘導的對PfCSP的IFN-γ反應顯著低於對HbsAg的反應，在先前已存在抗HBsAg的受試者中甚至更低。儘管13/14的對照志願者在一劑RTS，S免疫後對HBsAg起反應，但對PfCSP的IFN-γ反應卻只在14名受試者中的一人中檢測到。另一方面，在DNA引發過的志願者中對主幹抗原的反應對於誘導對PfCSP的IFN-γ反應只有微弱的影響或無影響，因為在用RTS，S加強後HBsAg血清反應陽性和血清反應陰性的受試者之間對PfCSP的IFN-γ反應的頻率和強度是相當的(表5)。這些結果證實了DNA引發T細胞反應並使其定向於特異抗原，並平衡期望的免疫性和背景應答。無論其抗HBsAg的血清反應性如何，DNA引發過的志願者對PfCSP和HBsAg二者具相當的IFN-γ反應；未引發的志願者對HBsAg的IFN-γ反應顯著高於對PfCSP的反應(表4)。
目前有相當多的研究致力於產生重組融合蛋白質和表達靶蛋白的重組病毒及細菌。在許多案例中，對於HBsAg、痘苗、脊髓灰質炎病毒和傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)而言，被免疫的個體將具有預先存在的抗這些疫苗主幹組分的抗體。在攜帶抗這些疫苗主幹組分(如HBsAg)的抗體的受試者中，與單獨用重組蛋白質引發的情況相比，用編碼靶蛋白的DNA引發顯著增強了對這些蛋白質的T細胞免疫反應，這一事實可能是此引發加強的免疫策略的一個優點。
表5抗原特異性IFN-γ反應的T細胞群組成

用DNA作為疫苗載體引發免疫反應可以使最初的T細胞反應集中於重組免疫原上，這僅僅是因為那是表達於DNA疫苗中的唯一外源蛋白。儘管作為疫苗載體而言，重組RTS，S或痘病毒可能本質上比DNA載體更具有免疫原性，但病毒感染的細胞可以產生許多與重組免疫原競爭T細胞免疫優勢的病毒來源表位。許多接受疫苗的受試者最可能已天然暴露過載體抗原，或已接受過在重組病毒或蛋白質中含此抗原的其它疫苗接種，因此針對載體抗原的效應反應將幹擾針對特異抗原的T細胞反應的誘發。
在此研究中，通過DNA引發/重組蛋白質加強的免疫策略，在人類志願者中同時實現了抗原特異性CD4+輔助細胞、CD8+T細胞依賴型CTL和IFN-γ反應以及Th1型CD4+T細胞依賴型IFN-γ反應。此策略能誘導免疫反應的兩個武器，為預防性和治療性疫苗提供了獨一無二的優越性。
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從此處公布的本發明的詳述和實踐中本領域技術人員顯而易見本發明的其它實施方案。說明書和實施例均只起例證性說明的作用，以下權利要求才指出了本發明真正的範圍和精神。
序列表110葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司(GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS，S.A.)由海軍部長代表的美利堅合眾國(THE UNITED STATES OF AMERICA REPRESENTED BY THESECRETARY OF THE NAVY)120抗瘧疾的疫苗接種方法13004012.0374-00304140
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15060/447,0261512003-02-1315060/420,2651512002-10-2316033170PatentIn Ver.2.121012119212PRT213人工序列220
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223人工序列的描述合成的引物
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權利要求
1.通過免疫人以抵抗導致瘧疾的病原體的方法，包括a)通過以有效建立應答的引發劑量施用含有編碼至少一種第一瘧疾抗原的至少一種多核苷酸的引發疫苗，在人體中引發免疫應答；並b)通過隨後以有效加強引發的免疫應答的加強劑量施用含有至少一種多肽的加強疫苗在人體內加強引發的免疫應答，其中所述多肽包含至少一種與所述至少一種第一瘧疾抗原共有至少一種表位的第二瘧疾抗原，其中引發疫苗的施用引發了CD8+T細胞，而加強疫苗的施用引起對引發的CD8+T細胞的回憶，拓寬引發的CD8+T細胞應答，並導致抗瘧疾CD8+T細胞、抗瘧疾CD4+T細胞和抗瘧疾抗體的產生。
2.權利要求1的方法，其中第二瘧疾抗原含有第一瘧疾抗原的全部或部分。
3.權利要求1的方法，其中引發劑量介於0.01μg至50mg。
4.權利要求3的方法，其中引發劑量為2500μg。
5.權利要求3的方法，其中在施用第二疫苗之前，引發劑量被施用1到5次。
6.權利要求1的方法，其中加強劑量介於1μg至100μg。
7.權利要求6的方法，其中加強劑量是50μg。
8.權利要求6的方法，其中加強劑量是25μg。
9.權利要求1的方法，其中通過選自IM、IV、ID、皮下、黏膜、重組細菌、重組病毒，或基因槍，或其組合的方法來施用引發疫苗。
10.權利要求1的方法，其中通過選自IM、IV、ID、皮下、黏膜、重組細菌、重組病毒，或基因槍或其組合的方法來施用加強疫苗。
11.權利要求1的方法，其中CD8+T細胞包括細胞毒性T淋巴細胞。
12.權利要求1的方法，其中第一瘧疾抗原包含至少環子孢子多肽的一個片段。
13.權利要求1的方法，其中第二瘧疾抗原包含至少環子孢子多肽的一個片段。
14.權利要求1的方法，其中引發疫苗包含PfCSP。
15.權利要求1的方法，其中加強疫苗包含RTS，S。
16.權利要求1的方法，其中第一瘧疾抗原包含基本上全部的環子孢子蛋白，並且第二瘧疾抗原包含RTS，S。
17.權利要求1的方法，其中導致瘧疾的病原體是惡性瘧原蟲。
18.用於權利要求1的方法的疫苗，其包含分開的組分含有編碼至少一種第一瘧疾抗原的至少一種多核苷酸的引發組合物和含有至少一種進一步包含至少一種第二瘧疾抗原的多肽的加強組合物。
19.權利要求18的疫苗，其中多核苷酸編碼基本上全部的環子孢子蛋白。
20.權利要求18的疫苗，其中引發組合物含有PfCSP並且加強組合物含有RTS，S。
21.權利要求18的疫苗，其中含有RTS，S的組合物還含有佐劑。
22.用於免疫人以抵抗導致瘧疾的病原體的試劑盒，其包含a)含有編碼至少一種第一瘧疾抗原的至少一種多核苷酸的引發疫苗；和b)由至少一種進一步包含至少一種第二瘧疾抗原的多肽組成的加強疫苗，所述至少一種第二瘧疾抗原與所述至少一種第一瘧疾抗原共有至少一種表位，其中引發疫苗的施用引發CD8+T細胞，而加強疫苗的施用引起對引發的CD8+T細胞的回憶，拓寬引發的CD8+T細胞應答，並導致抗瘧疾CD8+T細胞、抗瘧疾CD4+T細胞和抗瘧疾抗體的產生。
23.權利要求22的試劑盒，其中引發疫苗含有PfCSP。
24.權利要求22的試劑盒，其中加強疫苗含有RTS，S疫苗。
25.用於免疫人以抵抗導致瘧疾的病原體的試劑盒，其包含a)含有至少一種編碼基本上全部的CS蛋白或其片段的多核苷酸的引發疫苗；和b)含有至少一種包含基本上全部的CS蛋白或其片段的多肽的加強疫苗。
26.權利要求25的試劑盒，其中引發疫苗含有PfCSP。
27.權利要求25的試劑盒，其中加強疫苗含有包含基本上全部的CS蛋白的C-端部分、4個或更多個串聯重複的免疫顯性區和來自B肝病毒的表面抗原(HbsAg)的雜合蛋白。
28.權利要求27的試劑盒，其中加強疫苗含有RTS，S和Th1誘導性佐劑。
29.一種疫苗，其包含分開的組分含有至少一種編碼基本上全部的CS蛋白或其片段的多核苷酸的引發組合物和含有至少一種包含基本上全部的CS蛋白或其片段的多肽的加強組合物。
30.權利要求29的疫苗，其中引發組合物含有PfCSP。
31.權利要求29的疫苗，其中加強組合物含有包含基本上全部的CS蛋白的C-端部分、4個或更多個串聯重複的免疫顯性區和來自B肝病毒的表面抗原(HbsAg)的雜合蛋白。
32.權利要求31的疫苗，其中加強組合物含有RTS，S和Th1誘導性佐劑。
33.通過免疫人以抵抗導致瘧疾的病原體的方法，包括a)通過以有效建立免疫應答的引發劑量施用含有至少一種編碼基本上全部的CS蛋白質或其片段的多核苷酸的引發疫苗，在人體中引發免疫應答，b)通過隨後以有效加強引發的免疫應答的加強劑量施用含有至少一種包含基本上全部的CS蛋白或其片段的多肽的加強疫苗，在人體中加強引發的免疫應答。
34.權利要求33的方法，其中引發疫苗含有PfCSP。
35.權利要求33的方法，其中加強疫苗含有包含基本上全部的CS蛋白的C-端部分、4個或更多個串聯重複的免疫顯性區和來自B肝病毒的表面抗原(HbsAg)的雜合蛋白。
36.權利要求35的方法，其中加強疫苗含有RTS，S和Th1誘導性佐劑。
37.權利要求33的方法，其中加強劑量介於0.01μg至50mg。
38.權利要求37的方法，其中引發劑量為2500μg。
39.權利要求37的方法，其中在施用第二疫苗之前，引發劑量被施用1到5次。
40.權利要求33的方法，其中加強劑量介於1μg至100μg。
41.權利要求40的方法，其中加強劑量是50μg。
42.權利要求40的方法，其中加強劑量是25μg。
43.權利要求33的方法，其中通過選自IM、IV、ID、皮下、黏膜、重組細菌、重組病毒，或基因槍或其組合的方法，施用引發疫苗。
44.權利要求33的方法，其中通過選自IM、IV、ID、皮下、黏膜、重組細菌、重組病毒，或基因槍或其組合的方法，施用加強疫苗。
全文摘要
本發明涉及通過疫苗接種抗瘧疾感染的方法。本發明方法涉及利用基於DNA的疫苗引發抗瘧疾免疫應答和用基於蛋白質的疫苗加強該應答。本發明方法也涉及通過用基於蛋白質的疫苗進行加強來拓寬所產生的免疫應答。
文檔編號A01N43/04GK1713817SQ200380103878
公開日2005年12月28日 申請日期2003年10月22日 優先權日2002年10月23日
發明者S·L·霍夫曼, R·王, J·E·愛潑斯坦, J·D·科恩 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司, 由海軍部長代表的美利堅合眾國