選擇轉化細胞的方法

2023-09-14 11:16:45 2

專利名稱：選擇轉化細胞的方法
背景技術：
本申請要求2006年6月6日申請的美國臨時專利申請60/811,190的優先權，在此將其公開內容全部引入作為參考。
1.發明領域 本發明總地涉及植物生物技術領域。更具體地，本發明涉及使用生長素樣除草劑作為選擇劑來選擇轉化植物細胞的方法。
2.相關領域的描述 目前全世界已有超過80.0百萬公頃的土地上生長著轉基因作物。通過轉基因提供的改良性狀顯著提高了生產力，並且在許多情況中降低了對可能潛在汙染環境的除草劑和殺蟲劑的依賴。然而，為了使轉基因作物在市場是持續競爭性的，需要增加新價值的性狀。
在轉基因植物的產生中，特別重要的步驟是轉基因細胞的選擇。這是因為在任何已知的轉化實驗方案中通常只有小百分比的細胞得到轉化。使用選擇標記基因能夠使得從那些不含標記基因的細胞中選擇出含有標記基因的細胞。在單個植物中堆疊多個轉基因的嘗試中，這變得尤為困難，因為需要多個選擇標記基因。此外，儘管之前已經描述了多種選擇標記，但是許多沒有給予任何特定農藝學價值的性狀，並且因此不必要使得規章批准複雜化。或者，必需採用勞動密集型步驟來嘗試從給定的轉基因植物中培育出選擇標記。因此，具有選擇標記和性狀雙重功能的選擇標記基因是尤其有價值的。
用於植物轉化的常用選擇標記基因是新黴素磷酸轉移酶II，從Tn5分離的並給予對卡那黴素的抗性(Fraley等，1983)，以及潮黴素磷酸轉移酶，其給予對抗生素潮黴素的抗性(Vanden Elzen等，1985)。給予抗生素抗性的細菌來源的其他選擇標記基因包括慶大黴素乙醯基轉移酶，鏈黴素磷酸轉移酶，氨基糖苷-3』-腺苷醯轉移酶和博來黴素抗性決定簇(Hayford等，1998；Jones等，1987；Svab等，1990；Hille等，1986)。
用於植物轉化的不是細菌來源的其他選擇標記基因也是可用的。這些基因包括，例如，小鼠二氫葉酸還原酶，植物5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶和植物乙醯乳酸合成酶(Eichholz等，1987；Shah等，1986；Charest等，1990)。在一些殺蟲劑中，選擇標記基因給予抗性的是草甘膦，草銨膦或溴苯腈(Comai等，1985；Gordon-Kamm等，1990；Stalker等，1988)。
之前已經從各種原核和真核生物體中分離出編碼使除草劑和其他排外(xenophobic)化合物失活的酶的基因。在一些情況中，這些基因已經在遺傳上工程化，用於在植物中成功的表達。通過該方法，已經研發了對除草劑2，4-二氯苯氧基乙酸(Streber和Willmitzer，1989)，溴苯腈(Stalker等，1988)，草甘膦(Comai等，1985)和草丁膦(DeBlock等，1987)耐受的植物。儘管這些植物已經證明了在商業情況中的價值，需要耐受其他除草劑的植物來避免對任何單種除草劑的過度依賴和增加用於控制雜草的管理難度的選擇。
除了上述除草劑，存在模擬或作用類似稱為生長素的天然植物生長調節劑的生長素樣除草劑。生長素樣除草劑似乎影響細胞壁可塑性和核酸代謝，這可以導致不受控制的細胞分裂和生長。由生長素樣除草劑引起的傷害症狀包括莖幹和葉柄的偏上性彎曲和扭曲，葉子翹曲和捲曲以及異常的葉形和脈絡。
麥草畏是生長素樣除草劑的一個實例並且用作出土前和出土後除草劑，用於控制一年生和多年生闊葉雜草以及玉米，高粱，小粒穀類作物，牧草，乾草，牧場，甘蔗，蘆筍，草坪和草籽作物種的幾種窄葉雜草(Crop Protection Reference(作物保護參考)，1995)。非常不幸地，麥草畏傷害許多商業作物，並且雙子葉植物，如大豆，棉花，豌豆，馬鈴薯，向日葵和canola，對除草劑特別敏感。儘管存在這種情況，生長素樣除草劑在控制雜草生長中是非常有效的，並且因此是農業中的重要工具。通過雜草對其他除草劑的耐受性的產生強調了這一點。
最近，從給予麥草畏耐受性的嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)分離出麥草畏單加氧酶(DMO)的基因(US專利申請20030135879)。DMO涉及除草劑麥草畏(3，6-二氯-鄰甲氧基苯甲酸)轉化成非毒性的3，6-二氯水楊酸。該基因在表達DMO基因的植物中提供了對麥草畏的耐受性。然而，迄今為止使用分離的選擇標記基因只選擇了含有該基因的轉化體，能夠使用DMO基因作為直接選擇標記的技術還沒有得到描述。需要使用選擇標記使得產生對生長素樣除草劑耐受的植物複雜化，因為對所用的轉化載體需要另外的基因並且還具有調控障礙。
因此，本領域中需要新的選擇標記基因和新的除草劑耐受基因。特別需要的是一種細胞的選擇方法，該細胞表達可以直接選擇的給予麥草畏和其他生長素樣除草劑耐受性的基因。具有標記和性狀雙重功能的選擇標記基因將消除研發產品過程中與製備和追蹤兩個表達單位相關的成本並將促進具有有價值新性狀的植物的產生。
發明概述 在一個方面中，本發明提供了選擇轉化植物細胞的方法，其包括步驟a)將含有用編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸轉化的轉基因植物細胞的植物細胞群接觸含有含量為抑制缺乏多核苷酸群的細胞生長的生長素樣除草劑的培養基，其中多核苷酸含有選自以下的核酸序列(1)編碼SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲醯胺和42℃條件下與SEQ IDNO7核酸序列的補體雜交的核酸序列，(4)與SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)編碼與SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列；和b)基於由轉化細胞呈現的對生長素樣除草劑的耐受性從植物細胞群中選出轉化的植物細胞。可以將細胞群接觸含有生長素樣除草劑的培養基任何允許選擇轉基因細胞的時間量。在特定的實施方案中，這可以包括至少1-3小時或可以不確定地進行，例如，持續數十或甚至數百天。在一個實施方案中，該方法可以在步驟a)之前和/或在步驟a)和步驟b)之間包括在缺乏生長素樣除草劑的培養基上培養植物細胞群。缺乏生長素樣除草劑的培養基可以含有細胞分裂素，如6-苄基氨基嘌呤(BAP)。在特定的實施方案中，6-苄基氨基嘌呤的濃度為約10mg/l培養基或更低，包括約8、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1和約0.5mg/l或更低。
在本發明特定的實施方案中，編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸沒有在遺傳上連接麥草畏單加氧酶以外的選擇或篩選標記基因。編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸可以可操縱地連接葉綠體轉運肽。本發明的方法還可以進一步包括步驟從轉化的植物細胞再生轉基因植物。在本發明的特定方面中，轉化的植物細胞來自雙子葉或單子葉細胞。雙子葉植物的實例包括苜蓿，豆類，花椰菜，捲心菜，胡蘿蔔，花菜，棉花，豌豆，油菜籽和大豆，單子葉植物包括玉米，洋蔥，水稻，高粱和小麥。在特定的實施方案中，植物是棉花，大豆或雙低油菜(canola植物)。
在特定的方面中，生長素樣除草劑選自苯氧基羧酸化合物，苯甲酸類化合物，吡啶羧酸化合物，喹啉羧酸化合物和草除靈(benazolinethyl)化合物。在一個實施方案中，苯氧基羧酸化合物選自2，4-二氯苯氧基乙酸，4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸和(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸。在特定的實施方案中，2，4-二氯苯氧基乙酸化合物，4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸和/或(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸以約0.001mg/l至約10mg/l的濃度包含於培養基中，包括，例如，約0.01mg/l至約10mg/l，約0.01mg/l至約5mg/l，約0.1mg/l至約5mg/l，約1mg/l至約5mg/l，約1mg/l至約10mg/l，約5mg/l至約10mg/l和約0.1mg/l至約3mg/l。在其他實施方案中，苯甲酸類化合物是麥草畏(3，6-二氯-鄰甲氧基苯甲酸)並且以約0.001mg/l至約10mg/l的濃度包含於培養基中，包括，例如，約0.01mg/l至約10mg/l，約0.01mg/l至約3mg/l，約0.001mg/l至約0.1mg/l，約1mg/l至約10mg/l，約2mg/l至約10mg/l和約0.001mg/l至約1mg/l。在特定的實施方案中，培養基含有至少兩種生長素樣除草劑，例如，麥草畏和2，4-二氯苯氧基乙酸。在本發明的方法中，細胞群可以包括子葉外植體，並且通過土壤桿菌介導的轉化來製備轉化的植物細胞。
在另一個方面中，本發明提供了含有編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸並且能夠在含有0.01mg/l麥草畏的培養基中生長的轉基因植物細胞，其中麥草畏單加氧酶沒有在遺傳上連接選擇或篩選標記基因，並且其中編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸包括選自以下的核酸序列(1)編碼SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲醯胺和42℃條件下與SEQ IDNO7核酸序列的補體雜交的核酸序列，(4)與SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)編碼與SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。在特定的實施方案中，將細胞限定為通過在此公開的選擇方法所製備的。本發明還提供了含有這樣細胞的組織培養物。組織培養物包括培養基中的細胞，該培養基含有含量為抑制與缺乏多核苷酸的轉基因植物細胞基因型相同的植物細胞生長的生長素樣除草劑。本發明進一步提供了從轉基因植物細胞再生的轉基因植物。
附圖簡述 以下的附圖形成本發明說明書的一部分並且包括來進一步證明本發明的特定方面。通過參考這些附圖中的一個或多個並結合在此所示特定實施方案的詳述可以更好地理解本發明。


圖1.大豆外植體對麥草畏的應答，添加或未添加BAP。(A)在不含麥草畏(左)或含有0.1mg/l麥草畏(右)的培養基上，13DAT。(B)用土壤桿菌(Agrobacterium)接種外植體並且共培養3天，然後在含有0(左上)，0.1(中上)，0.5(右上)，1.0(左下)，5.0(中下)和10(右下)mg/l麥草畏的培養基上培養，11DAT(14DAI)。(C)還是用土壤桿菌接種外植體並且共培養3天，然後在含有不同水平的麥草畏並結合BAP的培養基上培養。從左至右0，0.1，1.0和5.0mg/l麥草畏。從上至下0，1.0，3.0，5.0mg/l BAP。
圖2.使用麥草畏選擇的實驗中(Exp508)具有GFP+小芽(上)或部分(下)的外植體實例。在可調的明視野下(左)或用於檢測GFP表達的UV光下(右)在45DAI攝取圖片。
圖3.來自麥草畏選擇的CGP-陽性情況。(A)在可調解剖顯微鏡下在29DAI觀察到小芽。(B)如在用於檢測GFP的螢光下所觀察的，相同的芽顯示出CFP-表達。(C)A&B中的小芽發育成有抵抗力的伸長的芽(箭頭)，48DAI。
圖4.在含有0.01(左)，0.02(中間)和0.05mg/l麥草畏的培養基上培養的外植體的應答，23DAT(29DAI)。
圖5.將分開的有抵抗力的芽在液體生根培養基上培養，培養基中含有作為支持材料的小玻璃珠(A)，幾乎所有的芽產生了根。(B)半固體培養基也可以用於根誘發。
圖6.(A)幼小的大豆花來自具有CP4和GUS基因的轉基因植物(上)和通過麥草畏選擇用pMON73691轉化的並且還攜帶GFP基因的植物(下)。(B)在裝配有螢光的解剖顯微鏡下觀察相同的兩朵花來檢測GFP表達。在用含有DMO和GFP基因的pMON73691轉化的花上觀察到GFP表達。(C，D)打開相同的用pMON73691轉化的花，以在各個花的結構中顯示GFP表達。
圖7.用帶有不同構建體的土壤桿菌接種後在含有0.01mg/l麥草畏的選擇培養基上培養大豆外植體，這些構建體含有用不同CTP驅動的不同形式的DMO基因。(A)pMON73696，DMO-w，帶有CTP1。(B和D)pMON73698，DMO-c，帶有CTP1。(C)pMON73691，DMO-c，帶有CTP2。各自在39(A&B)和54DAI(C&D)攝取圖片。通過圖A和C中的箭頭來表示有抵抗力的芽。
圖8.顯示出野生型擬南芥(Arabidopsis)對培養基中各種濃度麥草畏的敏感性。
圖9.顯示出用編碼DMO的多核苷酸轉化的麥草畏耐受性擬南芥植物的復原。
發明詳述 在一方面中，本發明提供了用生長素樣除草劑如麥草畏來選擇轉化細胞的方法。本發明克服了現有技術中的缺陷之前需要將給予生長素樣除草劑耐受性的基因結合分開的選擇標記基因，以復原轉化體。直接選擇消除了對外源選擇標記基因的需求，這種需求使轉化程序和隨後轉基因植物的上市批准複雜化。轉基因細胞的有效選擇是至關重要的，因為在轉化實驗方案中通常只有少量細胞得到轉化。然後在支持植物再生的培養基中培養暴露於選擇劑而存活的細胞，來產生轉基因植物。特別是使用編碼麥草畏單加氧酶(DMO)的核酸，本發明可以選擇和形成對生長素樣除草劑呈現出耐受性的轉基因植物，這可以應用於含有除草劑耐受性植物的區域中，用於有效的雜草控制。
例如，可以通過以下的方法來進行根據本發明的轉化細胞的選擇首先將編碼DMO的多核苷酸分子引入選定的目標植物組織中；將含有轉化植物細胞的細胞接觸含有含量為抑制與不含DMO編碼多核苷酸的轉化植物細胞相同基因型的植物細胞生長的生長素樣除草劑的培養基；並選擇能夠在培養基中生長的植物細胞。因此，可以從大群的非轉基因細胞中選出轉基因細胞。在示例性的實施方案中，可以通過包括更多的物質如生長調節劑來改進選擇培養基。可以將組織維持於含有生長調節劑的基礎培養基上，直至獲得足夠的組織來開始植物再生工作，或重複幾輪人工選擇後，直至組織的形態學適於再生，通常至少2周，然後轉移至有助於成熟成植物的培養基中。可以在該培養基上每2周轉移培養物。發芽表示應該轉移至缺乏生長調節劑的培養基的時間。
各種植物組織可用於轉化。在特定的實施方案中，植物細胞來自植物外植體，指的是從能夠被轉化並隨後再生成轉基因植物的植物上切除的部分。典型的外植體包括細胞懸浮液、分生組織、成熟或未成熟的胚芽、幹胚芽、溼胚芽、乾燥的胚芽、種子、愈傷組織、子葉、子葉結、葉子或莖幹。
一旦已經選擇出轉基因細胞，並從其生長出組織，可以使用各種測試證實再生組織或植物中外源DNA或「轉基因」的存在。這樣的測試包括，例如，「分子生物」測試包括，例如，DNA和RNA印跡以及PCRTM；「生化」測試，如檢測蛋白質產物的存在，例如，通過免疫方法(ELISA和蛋白質印跡)或通過酶功能；植物部分測試，如葉或根測試；此外還有，通過分析整個再生植物的基因型。
A.核酸和重組構建體 1.麥草畏單加氧酶(DMO) 在本發明的一個實施方案中，將表達麥草畏單加氧酶(DMO)多肽的DNA構建體用作植物細胞中的選擇標記基因。在此按照SEQ IDNO2，4，6，8，10或12來提供示例性DMO多肽。按照SEQ ID NO1，3，5，7，9或11來提供編碼這些序列的示例性核酸。因此，在本發明的一個實施方案中，將這些序列用於轉化細胞的選擇。如本領域公知的，可以容易地製備和使用這些序列的同源序列和衍生物。例如，可以使用編碼與SEQ ID NO2，4，6，8，10或12所提供的多肽具有至少70％序列同一性的DMO多肽的核酸，包括與這樣的序列至少約75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的同一性。還可以使用與SEQ ID NO1，3，5，7，9或11所提供的核酸序列呈現出至少70％序列同一性的核酸，包括與這樣的序列至少約75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的同一性。在一個實施方案中，使用GCG Wisconsin Package(Accelrys，San Diego，CA)，MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228S.Park St.，Madison，Wis.53715)的序列分析軟體包測定同一性，使用預設參數。這樣的軟體通過比對相似性或同一性的程序來匹配相似的序列。
可以通過本領域公知的技術來獲得表達DMO多肽的多核苷酸分子。根據標準方法可以容易地製備具有降解生長素樣除草劑能力的DMO的變體並測試活性。還可以通過本領域已知的技術來鑑定這樣的序列，例如，從合適的生物體來鑑定，這樣的生物體包括降解生長素樣除草劑如麥草畏的細菌(U.S.專利No.5,445,962；Krueger等，1989；Cork和Krueger，1991；Cork和Khalil，1995)。分離DMO序列的一種方法是通過核酸雜交，例如，與從來源生物體構建的文庫雜交，或通過RT-PCR，基於公開的DMO使用來自來源生物體的mRNA和引物。因此，本發明包括在嚴謹條件下與在此所述的DMO編碼序列雜交的核酸的用途。本領域技術人員理解可以通過提高鹽濃度和降低溫度來使得條件不太嚴謹。因此，可以容易地操縱雜交條件，並因此通常是根據所需的結果可選擇的方法。高嚴謹條件的實例是5×SSC，50％甲醯胺和42℃。通過在這樣的條件下洗滌，例如，10分鐘，可以除去在這些條件下沒有與特定目標序列雜交的那些序列。因此，本發明的一個實施方案包括在5×SSC，50％甲醯胺和42℃的洗滌條件下持續10分鐘與選自SEQ ID NO1，3，5，7，9或11雜交的DMO編碼序列的用途。
SEQ ID NO1顯示了來自嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)的DMO，為了在雙子葉植物中表達使用擬南芥(Arabidopsis thaliana)密碼子選擇進行了優化。SEQ ID NO2中給出了預測在位置2，3，112各自具有Ala，Thr，Cys的多肽。SEQ ID NO3顯示了另一種為了在雙子葉植物中表達而優化的嗜麥芽假單胞菌DMO，並編碼SEQ ID NO4的多肽，預測在位置2，3，112各自具有Leu，Thr，Cys。SEQ ID NO5顯示了雙子葉植物優化DMO的編碼序列，SEQ ID NO6為多肽，預測在位置2，3，112各自具有Leu，Thr，Trp。SEQ ID NO7和8顯示了DMO的編碼和多肽序列，預測在位置2，3，112各自具有Ala，Thr，Cys。SEQ ID NO9和10顯示了雙子葉植物優化DMO的編碼序列和多肽序列，預測在位置2，3，112各自具有Ala，Thr，Trp。SEQ ID NO11和12顯示了來自嗜麥芽假單胞菌的DMO的編碼序列和多肽序列(US專利申請No20030135879)。
還可以根據本領域公知技術使用已知的DMO多肽序列在化學上合成變體。可以在自動化DNA合成儀中通過磷醯亞胺酸酯(phosphoamidite)化學合成DNA序列。化學合成具有多個優勢。特別地，化學合成是理想的，因為表達DNA序列的宿主偏好的密碼子可以用來優化表達。不是所有的密碼子都需要改變來獲得提高的表達，但是優選至少將宿主中很少使用的密碼子改變成宿主偏好的密碼子。通過將高於約50％，最優選至少約80％的密碼子改變成宿主偏好的密碼子可獲得高水平的表達。許多宿主細胞的密碼子偏好是已知的(PCTWO 97/31115；PCT WO 97/11086；EP 646643；EP 553494；以及U.S.專利Nos5,689,052；5,567,862；5,567,600；5,552,299和5,017,692)。可以通過本領域已知的方法推斷出其他宿主細胞的密碼子偏好。此外，使用化學合成，可以容易地改變DNA分子或其編碼的蛋白的序列，例如，以優化表達(例如，消除影響轉錄或翻譯的mRNA二級結構)，在方便的點添加獨特的限制位點和刪除蛋白酶分裂位點。
可以對蛋白質的多肽序列如在此提供的DMO序列進行修飾和改變，同時保持酶活性。以下是基於改變蛋白質的胺基酸來形成等價物，或甚至改良的修飾多肽和相應編碼序列的討論。在本發明特定的實施方案中，可以以這種方式改變DMO序列並用於本發明的方法中。通過改變DNA序列的密碼子來實現胺基酸的改變。
例如，已知可以用特定的胺基酸替代蛋白質結構中的其他胺基酸，而沒有可測量地失去與底物分子上的結構如結合位點相互結合的能力。因為蛋白質相互作用的能力和性質限定了蛋白質的生物功能活性，因此可以在蛋白質序列中形成特定的胺基酸序列置換，並且當然可以在基礎DNA編碼序列中進行置換，而仍然獲得具有類似特性的蛋白質。因此，考慮了可以在在此所述的DMO肽序列和相應的DNA編碼序列中進行各種改變，而沒有可測量地失去它們的生物效用或活性。
在進行這樣的改變時，可以考慮胺基酸的親水性(hydropathic)指數。本領域通常能理解親水性(hydropathic)胺基酸指數在給予蛋白質相互作用的生物功能中的重要性(Kyte等，1982)。認可了胺基酸的相對親水性(hydropathic)特徵有助於所得到蛋白質的二級結構，這隨後限定了蛋白質與其他分子的相互作用，其他分子例如為酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原等。基於它們的疏水性和電荷特徵已經給每個胺基酸指定了親水性(hydropathic)指數(Kyte等，1982)，這些為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；穀氨酸鹽(-3.5)；穀氨醯胺(-3.5)；天冬氨酸鹽(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領域已知胺基酸可以由其他具有相似親水性(hydropathic)指數或分值的胺基酸替代並仍然得到具有相似生物活性的蛋白質，即，仍然獲得生物功能上等價的蛋白質。在進行這樣的改變時，優選親水性(hydropathic)指數在±2內的胺基酸置換，特別優選在±1內的那些，更特別優選的是在±0.5內的那些。
本領域還可以理解可以基於親水性有效地進行類似胺基酸的置換。U.S.專利4,554,101描述了蛋白質的最大局部平均親水性，如通過其鄰接胺基酸的親水性支配的，與蛋白質的生物特性相關。如U.S.專利4,554,101中所述的，已經將以下的親水性值指定給胺基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸鹽(+3.0±1)；穀氨酸鹽(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；穀氨醯胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解胺基酸可以替代另一個具有相似親水性值的並仍然獲得生物上等價的蛋白質。在這樣的改變中，優選親水性值在±2以內的胺基酸置換，特別優選在±1之內的那些，±0.5之內的那些甚至更特別地優選。考慮了這些和各種前述特徵的示例性置換是本領域技術人員公知的，並包括精氨酸和賴氨酸；穀氨酸鹽和天冬氨酸鹽；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；以及纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。
2.轉化構建體 通常將根據本發明用作選擇標記的DMO編碼多核苷酸引入細胞中，作為含有DMO有效表達必需的表達控制序列的構建體。可操縱地連接表達控制序列與編碼序列的方法是本領域公知的(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989)。表達控制序列是以任何方式涉及轉錄控制的DNA序列。合適的表達控制序列及其使用方法是本領域公知的。特別地，可以使用啟動子，使用或不用增強子序列，5』-未翻譯片段，用於蛋白質或RNA產物靶向植物細胞器的轉運或信號肽，特別是靶向葉綠體，以及3』未翻譯片段，如多腺苷酸化位點。本領域技術人員將知道各種增強子，啟動子，內含子，轉運肽，靶向信號序列，以及5』和3』未翻譯片段(UTR)可用於有效的植物表達載體的設計中，如公開於例如U.S.專利申請公開2003/01403641中的那些。
適用於本發明和其他用途的啟動子是本領域公知的。描述這樣的啟動子的實例包括U.S.專利6,437,217(玉米RS81啟動子)，U.S.專利5,641,876(水稻肌動蛋白啟動子)，U.S.專利6,426,446(玉米RS324啟動子)，U.S.專利6,429,362(玉米PR-1啟動子)，U.S.專利6,232,526(玉米A3啟動子)，U.S.專利6,117,611(組成型玉米啟動子)，U.S.專利5,322,938，5,352,605，5,359,142和5,530,196(35S啟動子)，U.S.專利6,433,252(玉米L3油質蛋白啟動子)，U.S.專利6,429,357(水稻肌動蛋白2啟動子以及水稻肌動蛋白內含子)，U.S.專利5,837,848(根特異性啟動子)，U.S.專利6,294,714(光誘導型啟動子)，U.S.專利6,140,078(鹽誘導型啟動子)，U.S.專利6,252,138(病原體誘導型啟動子)，U.S.專利6,175,060(磷缺乏誘導型啟動子)，U.S.專利6,635,806(γ-coixin啟動子)和U.S.專利申請系列No.09/757,089(玉米葉綠體醛縮酶啟動子)。可以發現使用的其他啟動子是胭脂鹼合成酶(NOS)啟動子(Ebert等，1987)，章魚鹼合成酶(OCS)啟動子(在根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導質粒上攜帶其)，花椰菜花葉病毒屬的啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等，1987)，CaMV35S啟動子(Odell等，1985)，玄參花葉病毒35S啟動子(Walker等，1987)，蔗糖合成酶啟動子(Yang等，1990)，R基因符合啟動子(Chandler等，1989)和葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子等。用於本發明中特別有益的啟動子是CaMV35S，FMV35S，PCISV，AtAnt1和P-AGRtu.nos啟動子(請參閱表1)。
通過使用編碼轉運肽的序列可以獲得用於異源基因表達的益處。轉運肽通常指的是連接目標蛋白時指導蛋白到達特定的組織，細胞，亞細胞位置或細胞器的肽。實例包括，但不限於，葉綠體轉運肽，核靶向信號和液泡信號。葉綠體轉運肽在本發明中特別有用，用於指導DMO酶的表達到達葉綠體。預期通過植物細胞細胞中發現的降解麥草畏的內源還原酶和鐵氧還蛋白有助於DMO功能。植物葉綠體特別富含還原酶和鐵氧還蛋白。因此，在產生轉基因麥草畏耐受性植物的優選實施方案中，可以使用編碼肽的序列，將知道麥草畏降解加氧酶進入葉綠體中。可替換地或另外地，還可以在細胞中表達異源還原酶和/或鐵氧還蛋白。
優選可以將編碼葉綠體靶向序列的DNA置於DMO編碼序列的上遊(5』)，但也可以置於編碼序列的下遊(3』)，或同時在編碼序列的上遊和下遊。特別地，可以將葉綠體轉運肽(CTP)工程化來融合待靶向植物葉綠體中的蛋白質的N-端。作為前體物質從核基因表達出許多葉綠體定位蛋白並通過進入步驟過程中除去CTP來靶向葉綠體。可以從這樣的多肽的一級胺基酸序列鑑定出有用的CTP。葉綠體蛋白的實例包括核酮糖-1，5-二磷酸鹽羧化酶的小亞基(RbcS2)，鐵氧還蛋白，鐵氧還蛋白氧化還原酶，捕光複合物蛋白1和蛋白II，以及硫氧還蛋白F。已經在體內和體外證明了可以通過使用與CTP的蛋白融合體將無葉綠體蛋白靶向葉綠體並且CTP足以將蛋白靶向葉綠體。例如，引入合適的葉綠體轉運肽，如擬南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS(Klee等，1987)和矮牽牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等，1986)，已經顯示出將異源EPSPS蛋白序列靶向轉基因植物中的葉綠體。其他示例性葉綠體靶向序列包括玉米cab-m7信號序列(Becker等，1992；PCT WO97/41228)和豌豆穀胱甘肽還原酶信號序列(Creissen等，1991；PCT WO97/41228)。在本發明中，AtRbcS4(CTP1)，AtShkG(CTP2)，AtShkGZm(CTP2合成的)和PsRbcS以及其他的公開於U.S.臨時申請系列No.60/891,675中，例如，關於DMO多肽的表達是特別有益的(例如，SEQ ID NO17-28，用於CTP的肽序列和編碼它們的核酸序列)。
作為翻譯前導序列的5』UTR是位於基因的啟動子序列和編碼序列之間的DNA遺傳成分。翻譯前導序列存在於翻譯起始序列的完全加工的mRNA上遊。翻譯前導序列可以影響初級轉錄物加工成mRNA，mRNA穩定性或翻譯效率。翻譯前導序列的實例特別包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導序列(U.S.專利No.5,362,865)，植物病毒外殼蛋白前導序列，植物核酮糖前導序列(Yurner核Foster，1995)。在本發明中，特別發現益處的5』UTR是GmHsp，PhDnaK，TEV和L-Atnos(請參閱表1)。
3』非翻譯序列，3』轉錄終止片段或多腺苷酸化片段意思是連接和位於結構多核苷酸分子下遊的DNA分子，並包括提供能夠影響轉錄，mRNA加工或基因表達的多腺苷酸化信號和其他調控信號的多核苷酸。多腺苷酸化信號在植物中起作用來促成多腺苷酸核苷酸添加至mRNA前體物質的3』端。多腺苷酸化序列可以源自天然基因，源自各種植物基因，或源自T-DNA基因。3』轉錄終止片段的實例是胭脂鹼合成酶3』片段(nos3』；Fraley等，1983)。舉例說明了不同的3』非翻譯片段的用途(Ingelbrecht等，1989)。來自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等，1984)和T-AGRtu.nos(Rojiyaa等，1987，Genbank登錄號E01312)對於用於本發明中特別有益。
可以將DMO-編碼多核苷酸分子表達單位連接表達單位中的第二個多核苷酸分子，該表達單位含有用於篩選/分選標記或用於給予所需性狀的基因的遺傳成分。通常用於篩選推測的轉化細胞的基因包括β-葡糖苷酸酶(GUS)，β-牛乳糖苷酶，螢光素酶和氯黴素乙醯基轉移酶(Jefferson，1987；Teeri等，1989；Koncz等，1987；De Block等，1984)，綠色螢光蛋白(GFP)(Chalfie等，1994；Haseloff等，1995；和PCT申請WO 97/41228)。將通過StLS1破壞的AvGFP用於工作實施例中，用於獲得植物細胞中的表達(請參閱表1)。
第二個多核苷酸分子包括，但不限於，提供與植物形態學，生理學，生長和發育，產量，營養提高，疾病或害蟲抵抗力或環境或化學耐受性相關的所需特徵的基因並可以包括含有以下特徵的遺傳成分除草劑抵抗力(U.S.專利6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；5,463,175)，提高的產量(U.S.專利RE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；5,716,837)，昆蟲控制(U.S.專利6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658，5,880,275；5,763,245；5,763,241)，真菌疾病抵抗力(U.S.專利6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；6,506,962)，病毒抵抗力(U.S.專利6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；5,304,730)，線蟲抵抗力(U.S.專利6,228,992)，細菌性疾病抵抗力(U.S.專利5,516,671)，植物生長和發育(U.S.專利6,723,897；6,518,488)，澱粉產生(U.S.專利6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)，改良的油產生(U.S.專利6,444,876；6,426,447；6,380,462)，高油產生(U.S.專利6,495,739；5,608,149；6,483,008；6,476,295)，改良的脂肪酸含量(U.S.專利6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；6,459,018)，高蛋白質產生(U.S.專利6,380,466)，果實成熟(U.S.專利5,512,466)，提高的動物和人類營養(U.S.專利6,723,837；6,653,530；6，5412，59；5,985,605；6,171,640)，生物聚合物(U.S.專利RE37,543；6,228,623；5,958,745和U.S.專利申請No.US20030028917)，環境應激抵抗力(U.S.專利6,072,103)，藥物肽和分泌肽(U.S.專利6,812,379；6,774,283；6,140,075；6,080,560)，提高的加工性狀(U.S.專利6,476,295)，提高的消化率(U.S.專利6,531,648)，低棉子糖(U.S.專利6,166,292)，工業化酶生產(U.S.專利5,543,576)，提高的風味(U.S.專利6,011,199)，氮固定(U.S.專利5,229,114)，雜種種子產生(U.S.專利5,689,041)，纖維產生(U.S.專利6,576,818；6,271,443；5,981,834；5,869,720)和生物燃料產生(U.S.專利5,998,700)。這些或其他遺傳成分，方法和轉基因中的任何一種可以用於本發明中，這是本領域技術人員根據本發明的公開內容將可以得知的。
或者，第二個多核苷酸分子可以通過引起內源基因表達靶向抑制的RNA編碼分子影響上述的植物特徵或基因型，例如，通過反義，抑制RNA(RNAi)或共抑制介導的機制。RNA還可以是催化性RNA分子(即，核酶)，工程化來分裂所需的內源mRNA產物。因此，編碼影響目標基因型或形態學改變的轉錄RNA分子的任何多核苷酸分子可以用於本發明的實踐中。
可以在土壤桿菌中與攜帶T-DNA轉移和整合功能的第二個質粒一起的第一個質粒的右緣(RB)和左緣(LB)片段之間的T-DNA上提供表達單位。構建體還可以含有質粒主鏈DNA片段，這提供了在細菌細胞中的複製功能和抗生素選擇，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)複製起點如ori322，寬範圍宿主複製起點，如oriV或oriRi，以及選擇標記的編碼片段，如Spec/Strp，編碼給予壯觀黴素或鏈黴素抗性的Tn7氨基糖苷乙醯基轉移酶(aadA)，或慶大黴素(Gm，Gent)選擇標記基因。對於植物轉化，宿主細菌菌株通常是根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)ABI，C58或LBA4404。然而，植物轉化領域中技術人員抑制的其他菌株也可以用於本發明中。
3.轉基因細胞的製備 可以通過本領域已知的任一種將轉基因引入細胞中的技術來實現轉化植物細胞(參見，例如，Miki等，1993)。認為這樣的方法的實例實際上包括將DNA引入細胞中的任何方法。已經描述的方法包括電穿孔，如U.S.專利No.5,384,253中所說明的；微炮彈轟擊，如U.S.專利No.5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861和6,403,865中所說明的；土壤桿菌介導的轉化，如U.S.專利No.5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840和6,384,301中所說明的；以及原生質體轉化，如U.S.專利No.5,508,184中所說明的。通過應用如這些的技術，根據本發明實際上可以穩定地轉化和選擇任何植物品種的細胞，並使這些細胞發育成轉基因植物。
最廣泛使用的將表達載體引入植物的方法是基於農桿菌的天然轉化系統(例如，Horsch等，1985)。根癌農桿菌(A.tumefaciens)和髮根農桿菌(A.rhizogenes)是植物致病的土壤細菌，其在遺傳上轉化植物細胞。根癌農桿菌和髮根農桿菌的Ti和Ri質粒各自攜帶負責植物遺傳轉化的基因(例如，Kado，1991)。各種參考文獻提供了關於農桿菌載體系統和農桿菌介導的基因轉移方法的描述，包括Gruber等，上文，Miki等，上文，Moloney等，1989和U.S.專利No.4,940,838和5,464,763。其他自然地與植物相互作用的細菌，如中華根瘤菌(Sinorhizobium)，根瘤菌(Rhizobium)和中生根瘤菌(Mesorhizobium)，可以進行改良來介導基因轉移至各種不同的植物中。通過獲得無害的(disarmed)Ti質粒和合適的二元載體，使得這些植物相關的共生細菌能勝任基因轉移(例如，Broothaerts等，2005；U.S.專利申請11/749,583)。
B.組織培養和培養基 根據本發明，可以通過使用含有抑制缺乏DMO多肽表達的細胞生長含量的生長素樣除草劑的培養基來選擇轉基因細胞。「培養基」指的是用於使細胞在體外生長的各種營養混合物，即，在完整的活生物體之外生長。培養基通常是大部分細胞類型生長需要的各種成分(鹽，胺基酸，生長調節劑，糖，緩衝劑)的懸浮劑。然而，每種特定的細胞類型需要用於生長的特定範圍的成分比例，並且甚至更特定的用於最佳生長的配方範圍。用允許細胞類型生長的各種培養基開始的培養物中的細胞生長速率也將不同。
可以通過首先在出芽培養基上隨後在生根培養基上培養外植體來實現再生轉化植物細胞。根據本發明，這些培養基除了營養素和生長調節劑以外通常還包括生長素樣除草劑如麥草畏作為選擇劑。對於每種植物系統可以實施和優化各種培養基和轉移需求，用於轉基因植物的轉化和復原。因此，可以用營養上等價的成分，或轉基因情況的相似選擇和復原方法來改變或替代本發明中公開的這些培養基和培養條件，並且仍然落入本發明的範圍內。
將營養培養基製成液體，但是也可以通過將液體加入能夠提供固體支持的材料中來固化。瓊脂是最常用於該目的的。Bactoagar，Hazelton瓊脂，Gelrite和Gelgro是適於組織培養中植物細胞生長的特定類型的固體支持物。一些細胞類型將在液體懸浮液中或在固體培養基上生長並分裂。
受體細胞目標包括，但不限於，分生組織細胞，愈傷組織，未成熟胚芽和配子細胞，如小孢子花粉，精子和卵細胞。在特定的實施方案中，可以使用從其可以再生轉基因植物，包括能繁殖的轉基因植物的任何細胞。例如，轉化未成熟胚芽後選擇和啟動愈傷組織，隨後再生轉基因植物。未成熟胚芽的直接轉化消除了受體細胞培養物長期發育的需要。分生組織細胞(即，能夠連續細胞分裂並且特徵在於未分化細胞學外觀的植物細胞，通常在植物中的生長點和組織中發現，如根尖，莖端，側芽等)也可以用作受體植物細胞。由於它們未分化的生長和用於器官分化的能力以及全能性，可以將單個轉化的分生組織細胞復原成整個轉化的細胞。
體細胞是各種類型的。胚芽發生細胞是體細胞的一個實例，可以誘導其通過胚芽形成再生成植物。非胚芽發生細胞是通常以這樣的方式沒有應答的那些。
可以使用將細胞群內的受體細胞富集的特定技術。例如，II型愈傷組織發育，接著人工選擇和培養脆弱的胚芽發生組織，通常導致受體細胞的富集，用於例如微炮彈轉化中。
可以在使用各種轉化方法進行植物細胞轉化後進行培養物的選擇。以下工作實施例中描述了農桿菌轉化後的選擇。此外，如下提供了用於通過微炮彈轟擊製得的轉化細胞選擇的示例性程序 1.將組織(懸浮液)塗布於濾器上，微炮彈轟擊，然後將濾器轉移至培養基。在2-7天後，將濾器轉移至選擇培養基。轟擊後大約3周，從濾器挑選組織作為新鮮選擇培養基上分開的愈傷組織塊。
2.與以上1中的相同，除了在轟擊後將懸浮液放回液體中-接受液體選擇7-14天，然後以低密度吸移至新鮮選擇平板上。
3.直接放置在培養基或濾器上的同時轟擊愈傷組織。在顆粒轟擊1-14天後，將細胞轉移至選擇培養基。以兩周的間隔將濾器上的組織轉移至新鮮選擇培養基中1-3次。然後將愈傷組織短暫地放入液體中，用於將組織以低密度分散於選擇平板上。
4.在DNA引入後一至七天時將愈傷組織轉移至選擇平板上。將組織作為小的愈傷組織單位在選擇平板上亞培養，直至鑑定轉化體。
在特定的實施方案中，在培養物中生長後選擇受體細胞。將培養的細胞生長於固體支持物上或以液體懸浮液的形式生長。在任一種情況中，可以以培養基的形式給細胞提供營養素，並且控制環境條件。存在多種類型的由胺基酸，鹽，生長調節劑和維生素構成的組織培養基。本發明實施中所用的大部分培養基具有相似的成分，而根據已知的組織培養時間，培養基的成分組成和比例可以不同。例如，各種細胞類型通常在超過一種類型的培養基中生長，但根據生長培養基將呈現出不同的生長速率和不同的形態學。在一些培養基中，細胞存活但不能。通常還基於所選的物種或細胞類型來優化培養基組成。
之前已經描述了適於植物細胞培養的各種類型的培養基。以下將限定這些培養基的實例。在一些實施方案中，優選使用含有較低氨/硝酸鹽比例的培養基如N6，通過將細胞維持於能夠持續分裂的原胚狀態來促進受體細胞的傳代。在本發明的特定實施方案中，使用Woody植物培養基(WPM)(Lloyd和McCown，1981)。
細胞培養物的維持方法有助於它們作為轉化受體細胞來源的用途。轉移至新鮮培養基的細胞的人工選擇，轉移至新鮮培養基的頻率，培養基的組成和環境因素，包括但不限於，光質量和含量以及溫度，都是維持用作受體細胞來源的愈傷組織和/或懸浮液培養物的因素。在富集培養物內的受體細胞中，將愈傷組織在不同培養條件之間交替是有益的。例如，可以在懸浮液培養物中培養細胞，但是以規律的時間間隔轉移至固體培養基。在固體培養基上生長一定時間後，可以人工選擇細胞，用於返回至液體培養基。重複這一轉移至新鮮培養基的次序可以用來富集受體細胞。將細胞培養物通過1.9mm篩網對於維持愈傷組織或懸浮液培養物的易碎性和使用該細胞類型時富集可轉化細胞而言是有用的。
C.轉基因植物 一旦選擇了轉基因細胞，可以使用本領域的公知技術將細胞再生成轉基因植物。隨後可以分析轉化的植物來測定DNA構建體上所含的特定目標核酸的存在或不存在。分子分析可以包括，但不限於，DNA印跡(Southern，1975)，RNA印跡分析，蛋白質印跡分子或PCR分析，免疫診斷方法和田地評價。可以進行這些和其他公知方法來證實由所公開方法產生的轉化植物的穩定性。這些方法是本領域技術人員公知的(Sambrook等，1989)。
可以產生耐生長素樣除草劑的轉基因植物。特別地，可以用本發明的DNA構建體轉化目前已知的受到生長素樣除草劑傷害的經濟上重要的植物，包括作物，果樹以及觀賞植物和樹木，使得它們變成耐除草劑的。可以轉化目前認為對生長素樣除草劑耐受性的植物，以提高它們對除草劑的耐受性。特別地發現可以用於本發明中的植物實例包括，但不限於，苜蓿(alfalfa)，豆類(beans)，花椰菜(broccoli)，捲心菜(cabbage)，胡蘿蔔(carrot)，花菜(cauliflower)，芹菜(celery)，棉花(cotton)，黃瓜(cucumber)，茄子(eggplant)，生菜(lettuce)，甜瓜(melon)，豌豆(pea)，胡椒(pepper)，南瓜(pumpkin)，蘿蔔(radish)，油菜籽(rapeseed)，菠菜(spinach)，大豆(soybean)，倭瓜(squash)，番茄(tomato)，西瓜(watermelon)，玉米(corn)，洋蔥(onion)，水稻(rice)，高粱(sorghum)，小麥(wheat)，黑麥(rye)，黍米(millet)，甜菜(sugarcane)，燕麥(oat)，黑小麥(triticale)，柳枝稷(switchgrass)和草坪(turfgrass)。
一旦產生了含有轉基因的轉基因植物，可以通過雜交將轉基因引入與第一個植物性別相適的任何植物中，不需要直接轉化第二個植物。因此，如在此所用的術語「後代」表示根據本發明產生的親本植物的任何一代的後代，其中後代包括根據本發明製得的選定DNA構建體。因此「轉基因植物」可以是任何一代的。「雜交」植物提供了相對於起始植物系具有一個或多個添加的轉基因或等位基因的植物系，如在此所述的，將雜交定義為通過將起始系與含有本發明的轉基因或等位基因的供體植物系雜交導致特定序列引入植物系的技術。為了實現這，例如，進行以下步驟(a)種植第一個(起始系)和第二個(含有所需轉基因或等位基因的供體植物系)親本植物的種子；(b)使第一個和第二個親本植物的種子生長成帶花的植物；(c)用第二個親本植物的花粉給第一個親本植物的花授粉；和(d)採收在帶有已受精花的親本植物上產生的種子。
D.定義 如在此所用的，術語「轉化的」指的是其中已經引入了外源多核苷酸分子如構建體的細胞，組織，器官或生物體。可以將引入的多核苷酸分子整合至受體細胞，組織，器官或生物體的基因組DNA，使得通過隨後的後代經過遺傳得到引入的多核苷酸分子。「轉基因」或「轉化」細胞或生物體還包括細胞或生物體的後代，以及從雜交中使用這樣的轉基因植物作為親本的育種程序中產生的後代，並且從外源多核苷酸分子的存在產生改變的基因型。
可以通過在含有生長素樣除草劑的植物組織培養基中培養植物細胞來實現將轉化的植物細胞「接觸」含有生長素樣除草劑的組織培養基。
「組織培養基」指的是用於支持非土壤環境中的植物生長和發育的液體，半固體或固體培養基。本領域技術人員已知的合適植物組織培養基包括基於MS的培養基(Murashige和Skoog，1962)或基於N6的培養基(Chu等，1975)，補充了其他植物生長調節劑，如生長素，細胞分裂素，激動素，ABA和赤黴素。其他培養基添加劑可以包括但不限於胺基酸，大量元素，鐵，微量元素，肌醇，維生素和有機物，碳水化合物，未限定的培養基成分，如酪蛋白水解產物，含有或不含合適的膠凝劑，如瓊脂形式的，如低熔點瓊脂糖或

如果需要製備半固體或固體培養基。本領域技術人員熟知各種組織培養基，得到合適地補充時，支持植物組織生長和發育並且適於植物轉化和再生。可以作為商業製劑購買這些組織培養基或定製和改良。這樣的培養基的實例包括但不限於Murashige和Skoog(1962)，N6(Chu等，1975)，Linsmaier和Skoog(1965)，Uchimiya和Murashige(1962)，Gamborg’s培養基(Gamborg等，1968)，D培養基(Duncan等，1985)，McCown’sWoody植物培養基(McCown和Lloyd，1981)，Nitsch和Nitsch(1969)，以及Schenk和Hildebrandt(1972)或因此補充的這些培養基的衍生。本領域技術人員知道培養基和培養基補充劑，如用於轉化和再生素營養素和生長調節劑，並且對於目標植物，可以優化其他培養條件，如孵育過程中的光強度，pH和孵育溫度。
「生長素樣除草劑」也稱為生長素類(auxinic)或生長調節劑除草劑或4組除草劑(基於它們的作用模式)。這些除草劑模擬或作用類似稱為生長素的天然植物生長調節劑。生長素包括天然激素，如吲哚乙酸和萘乙酸，兩者都引起植物中的細胞伸長。生長素類(auxinic)除草劑的作用模式在於它們似乎影響了細胞壁的可塑性和核酸代謝，這可以導致不受控制的細胞分裂和生長。生長素樣除草劑的組包括四個化學家族苯氧基類，羧酸(或吡啶)類，苯甲酸類和最新的家族喹啉(quinaline)羧酸類。苯氧基羧酸類苯氧基類除草劑是最常見的並且從二十世紀四十年代發現(2，4-二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)開始就用作除草劑了。其他實例包括4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)，2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(2，4-DP)，(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(2，4，5-T)，2-(2，4，5-三氯苯氧基)丙酸(2，4，5-TP)，2-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)-N-苯基丙醯胺(稗草胺)，(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸(MCPA)，4-(4-氯-鄰甲苯氧基)丁酸(MCPB)和2-(4-氯-2-甲基苯氧基)丙酸(MCPP)。
吡啶羧酸類第二大化學家族是羧酸除草劑，也稱為吡啶類除草劑。實例包括3，6-二氯-2-吡啶羧酸(Clopyralid)，4-氨基-3，5，6-三氯-2-吡啶羧酸(毒莠定)，(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(綠草定)和4-氨基-3，5-二氯-6-氟-2-吡啶氧基乙酸(氟草煙)。苯甲酸類實例包括3，6-二氯-鄰甲氧基苯甲酸(麥草畏)和3-氨基-2，5-二氯苯甲酸(choramben)。喹啉羧酸類第四種並且最新的生長素類(auxinic)除草劑化學家族是喹啉羧酸家族。實例包括3，7-二氯-8-喹啉羧酸(quinclorac)。這種除草劑是獨特的，因為它還控制一些草籽，這與基本上只控制闊葉或雙子葉植物的其他生長素樣除草劑不同。該類別中的其他除草劑是7-氯-3-甲基-8-喹啉羧酸(quinmerac)。
「生長素樣除草劑作用」意思是由生長素樣除草劑引起的傷害症狀。這些包括莖幹和葉柄的偏上性彎曲和扭曲，葉子翹曲和捲曲以及異常的葉形和脈絡。所有這些除草劑移位，其中一些移位超過其他的。這些除草劑中的一些具有土壤活性，一些可以在土壤中存留相當長的時間段。由於它們的作用，將它們廣泛用於許多作物上，包括小粒穀類作物，玉米，水稻和其他飼料作物，草坪，牧場，非作物和工業場所。
可以通過本發明中所述的方法來實現「選擇」耐生長素樣除草劑的轉化植物細胞。簡而言之，用含有DMO編碼多核苷酸分子轉化起始細胞群中的至少一些植物細胞。將所得到的植物細胞群置於含有選定濃度的生長素樣除草劑的培養基中，使得轉化的植物細胞生長，而未轉化的細胞不生長。可以以經驗為根據地測定生長素樣除草劑的合適濃度。在選擇前，可以在沒有生長素樣除草劑的培養基上培養外植體。這樣的培養基稱為延遲培養基。可以將外植體置於延遲培養基上，使其在置於選擇培養基之前生長一段時間。可以根據特定的生長素樣除草劑和外植體系統來優化選擇方案。通常使用多步驟選擇，並且在每個步驟中可以使用不同含量的選擇劑。
「耐受性」意思是將轉化植物細胞置於含有防止未轉化細胞存活和再生成植物的水平的生長素樣除草劑的培養基中時能夠存活並再生成植物。「耐受性」還表示在施加抑制未轉化植物生長含量的生長素樣除草劑後，轉化細胞能夠生長。
實施例 包括以下的實施例來說明本發明的實施方案。本領域技術人員應當知道以下實施例中公開的技術表示發明人發現的在本發明的實踐中能良好地起作用的技術。然而，根據本發明的公開內容，本領域技術人員應當知道可以在公開的特定實施方案中進行許多改變而仍然獲得類似或相似的結果，沒有脫離本發明的概念，精神和範圍。更具體地，將清楚化學上和生理上都相關的特定試劑可以替代在此描述的試劑，而將獲得相同或相似的結果。認為本領域技術人員清楚的所有這些相似的替代和改變在所附權利要求限定的本發明的精神，範圍和改變之內。
實施例1 DMO編碼多核苷酸構建體的製備 製備幾種二元載體，用於測試DMO編碼多核苷酸選擇轉化大豆細胞的能力。表1中給出了用於製備二元載體的遺傳成分，並包括CaMV35S啟動子和增強子(U.S.專利No.5,322,938；5,352,605；5,359,142；和5,530,196)；來自大豆(Glycine max)Hsp17.9基因的GmHsp未翻譯前導序列(U.S.專利5,659,122)；來自Aequorea victoria的GFP蛋白的頭126.3胺基酸的AvGFPI編碼片段(U.S.專利5,491,084；6,146,826)，在胺基酸65具有絲氨酸至蘇氨酸的變化並且對於植物表達是優化的；來自馬鈴薯(Solanum tuberosum)LS1基因的StLS1第二內含子(Eckes等，1986)；對於植物表達優化的來自Aequorea VictoriaGFP蛋白最後112.6胺基酸的AvGFPII編碼片段(U.S.專利5,491,084；6,146,826)；來自根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂鹼合成酶基因的T-Atnos3』未翻譯片段(Rojiyaa等，1987，GenBank登錄號E01312)；FMV玄參花葉病毒35S啟動子(U.S.專利6,051,753；5,378,619)；來自矮牽牛(Petunia hybrida)Hsp70基因的PhDnaK未翻譯前導序列(U.S.專利5,362,865)；和擬南芥(Arabidopsis)SSU1A轉運肽的AtRbcS4(CTP1)編碼片段。後一成分包括轉運肽，成熟蛋白的24個胺基酸，和轉運肽最後6個胺基酸的重複序列(U.S.專利5,728,925)。還使用的是擬南芥(Arabidopsis thaliana)5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)轉運肽的AtShkG(CTP2)編碼片段。該序列是從野生型序列變化而來的(Klee等，1987)，因為最後的密碼子從GAG(穀氨酸)變成TGC(半胱氨酸)。使用了AtShkGzmcodon(CTP2syn)序列，其與AtShkG(CTP2)相同，但使用玉米(Zea mays)密碼子對植物表達進行了優化(參見WO04009761的SEQ ID NO14)。使用了來自嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)的麥草畏單加氧酶的PmDMOCys112Atcodon片段(US專利申請20030115626)，在位置112具有半胱氨酸並使用擬南芥密碼子(SEQ ID NO1，3，7)對雙子葉植物表達優化。還用於構建體設計的是用於來自嗜麥芽假單胞菌的麥草畏單加氧酶的PmDMOTrp112Atcodon編碼片段(US專利申請20030115626)，在112位置具有色氨酸(Trp)並使用擬南芥密碼子(SEQ ID NO5，9)對轉子葉植物表達優化；來自豌豆(Pisum sativum)RbcS2-E9基因的PsRbc23』多腺苷酸化片段(Coruzzi等，1984)；來自擬南芥的腺嘌呤核苷酸易位體1基因的At/Ant1啟動子/內含子；工程化用於植物中表達的非天然產生的aroA-CP4的AtaroA-CP4編碼片段(U.S.專利5,633,435)；來自菸草蝕刻RNA病毒的TEV5』未翻譯前導序列(Carrington和Freed，1990)；來自豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基和成熟rubisco蛋白(Coruzzi等，1984)；來自根癌農桿菌pTiT37胭脂鹼合成酶基因的L-At.nos5』未翻譯片段(GenBank登錄號V00087；Bevan等，1983)，和用於花生褪綠條紋病病毒的全長轉錄物的PC1SV啟動子。後一序列在直接重複片段中具有雙倍的179nt，重複片段之間為6nt，接著為含有TATA盒的70bp片段(US專利5,850,019)。表2中概述了不同的CTP和DMO-編碼多核苷酸分子變體。

表2.二元載體中所用的葉綠體轉運肽和DMO編碼多核苷酸 在pMON73690，pMON73691，pMON73696和pMON73698的情況中，將DMO編碼多核苷酸分子連接選擇標記GFP，並在相同的T-DNA上提供，以顯示DMO編碼多核苷酸分子可以與另一個基因一起使用。在pMON58498，pMON84254和pMON73724的情況中，通過將它們分開在兩個T-DNA上，使DMO編碼多核苷酸分子沒有與其他轉基因連接(選擇標記或農藝學性狀基因)。
實施例2 選擇方法的研發 如下所示的將大豆[Glycine max(L.)Merrill]cv.A3525的成熟種子浸透、滅菌並在室溫發芽。可以容易地使用的其他大豆基因型實例包括，但不限於，Jack，Williams，Bert，Thorne，Granite，Lambert，Chapman和Kunitz。簡而言之，將幹種子(約770g)在2L從可購得的Clorox製得的200ppm次氯酸鈉溶液中浸泡3分鐘。排出溶液並將種子放置約2h。然後將2L豆類滅菌/發芽培養基加入種子中。約9-10h後，將種子準備手工切除外植體。豆類發芽培養基含有以下以mg/L計的成分--NH4NO3240，KNO3505，CaCl2·2H2O176，MgSO4·7H2O493，KH2PO427，H3BO31.86，Na2MoO4·2H2O0.216，MnSO4·H2O5.07，ZnSO4·7H2O2.58，FeSO4·7H2O2.502，KI0.249，Na2EDTA.2H2O3.348，CuSO4·5H2O0.0008，CoCl2·6H2O0.0008，B11.34，B30.5，B60.82，Bravo(75％ WP；Diamond Shamrock Company，Cleveland，Ohio)30，克菌丹(50％WP；Micro Flo Company，Lakeland，FL)30，Cefotaxime125，和蔗糖25000，pH5.8。
對於外植體的機械切除，用2L 200ppm次氯酸鈉溶液將種子處理15分鐘。排出溶液後，用2L無菌將種子衝洗1分鐘。用於機械切除的機器和方法描述於US專利申請公開20050005321中。簡而言之，將浸泡過的種子通過機器中的三套滾筒，無菌蒸餾水隨之流動，將其碾碎。收集子葉、種皮和外植體(胚軸)的混合物並通過手工或使用自動篩選裝置來篩選，以收集外植體。用0.05％乙醇將外植體漂洗1min，接著用無菌蒸餾水漂洗兩次，用於除去更多的碎片。
將上述的二元載體移動至解除的(disarmed)根癌農桿菌菌株C58中(ABI)。如下製備用於注射的農桿菌接種物將250ml含有50mg/l卡那黴素(Sigma，St.Louis，MO)和75mg/l壯觀黴素(Sigma，St.Louis，MO)的LB培養基(Luria-Bertani；Difco，Detroit，MI)接種0.5ml甘油中的農桿菌儲備菌(Acros Organics，Geel，Belgium)並在200rpm28℃大約振蕩20-22h，直至OD660達到0.8至1.0。然後將農桿菌培養液在3500rpm(約3565g)2-4℃離心25min。除去上清液後，將農桿菌沉澱物重懸浮於接種培養基中，該培養基含有2/5x大量營養素，1/10x微量營養素和Gamborg’s B5培養基的維生素，補充3.9g/l MES(Sigma，St.Louis，MO)，和30g/l葡萄糖(Phyto Technology Laboratories，ShawneeMission，KS)，pH5.4。將農桿菌細胞懸浮液的密度調節至0.30至0.35的OD660後，將硫辛酸(Sigma，St.Louis，MO)加入農桿菌懸浮液中至0.25mM的終濃度。
如下進行農桿菌介導的注射和外植體的共培養將約100個切除的外植體分散於無菌培養容器PLANTCON(MP Biomedicals，LLC，Irvine，CA)的蓋子中。將五ml農桿菌接種物加入每個PLANTCON蓋子中的外植體中。然後將外植體在超聲波儀(Ultrasonic MultiCleaner，Model W-113，Honda，Japan)中超聲波處理20sec。將一片割成PLANTCON底大小的Whatmann#1濾紙(Whatman Inc.，Clifon，NJ)置於PLANTCOND的底部。將外植體從蓋子轉移至含有農桿菌接種物的濾紙上。然後在Percival培養器中孵育PLANTCON，以16h亮(約85-90μE)和8h暗光周期並在23℃孵育2至4天，用於共培養。
在2-4天共培養階段後，首先在轉移至含有麥草畏的選擇培養基之前，在沒有麥草畏的培養基(延遲培養基)上培養外植體。直至從延遲培養基轉移至選擇培養基，將外植體保持於用於共培養的相同PLANTCON中，但是將10或12ml延遲培養基加入每個PLANTCON中。或者，將外植體轉移至新的PLANTCON中，每個含有一片高壓處理的氈製品(Jo-Arm Fabrics & Crafts，Madidon，WI)和30ml延遲培養基。延遲培養基含有改良的木本植物培養基(Lloyd和McCown，1981)，補充1或5mg/l BAP(6-苄基氨基嘌呤)，200mg/l羧苄青黴素(Phyto Technology Laboratories，Shawnee Mission，KS)，200mg/l頭孢噻肟(Hospira，Lake Forest，IL)和100mg/l羧噻吩青黴素(Duchefa，The Netherlands)。BAP可以幫助維持生長素樣細胞分裂素比例，因為麥草畏是一種生長素除草劑，並且促進從頂端分生組織產生多個枝條。可以用於本發明實踐中的其他合適細胞分裂素包括腺嘌呤細胞分裂素(例如，激動素，玉米素，苄基腺嘌呤(即，6-苄基氨基嘌呤)，腺嘌呤和苯脲細胞分裂素(例如，N，N』-二苯脲)和噻苯隆(TDZ)。
在液體培養基中或在半固體培養基上進行選擇。選擇培養基是缺少BAP的延遲培養基並含有不同濃度的麥草畏。對於在液體培養基中的選擇，將50或60ml選擇培養基和一片具有五個平行裂縫的泡沫海綿(Wisconsin Foam Products，Madison，WI)置於每個Plantcon中。將二十五個外植體植入向上位置的裂縫中，使得頂端分生組織面朝上。每兩至三周，用新鮮培養基替代老的培養基。
通過將4g/l AgarGel(Sigma，St.Louis，MO)加入液體培養基中來製備半固體培養基。為了在半固體選擇培養基上的選擇，將外植體單獨植入PLANTCON中的培養基中。在選擇和枝條發育的後期(大約在選擇培養基上4周)，任選將20ml液體選擇培養基覆蓋半固體培養基上。外植體在選擇培養基上培養約4至5周後，具有張開的三小葉植物葉的伸長枝條開始發育。當大約和超過2cm長時，從最初的外植體上分離這些耐受性枝條，並轉移至液體或半固體根誘導培養基。
用於根誘導的培養基與用於枝條發育的相同，並且還補充了麥草畏來降低逃逸的頻率。或者，將補充0.01mg/l麥草畏的豆類生根培養基(BRM)用於根誘導。該培養基含有1/2強度的MS鹽，MS維生素，100mg/l肌醇，100mg/l半胱氨酸，30mg/l蔗糖和100mg/l替卡西林(Ticarcilin)，並用8g/l洗過的瓊脂固化。對於在液體培養基中的根誘導，將足夠小的玻璃珠(Inotech Biosystems International Inc.，Dottikon，Switzerland)和60ml生根培養基置於每個PLANTCON中，使得培養基和珠子處於相同的水平。將高達九個分離的枝條插入每個PLANTCON中用於液體根誘導或半固體培養基的珠子中。幾乎所有枝條在1-2周中在生根培養基上產生根(圖5)。然而，只有將延伸並旺盛生長的其中保留了現有的和新發育葉子的那些枝條轉移至土壤，用於生長至成熟。將所有培養物保持於螢光下，使用16h的光周期，約20-70μE的光強度，27-28℃，直至將R0植物轉移至土壤中。
在一個研究中，在含有0.01至0.1mg/l麥草畏的選擇培養基中選擇用pMON73691轉化的大豆細胞(圖1A&B；圖4)。從生長於含有0.05或0.1mg/l麥草畏的選擇培養基上的外植體長出的枝條沒有生長很多並最終褪色，沒有獲得耐受性枝條。然而，在含有0.01mg/l麥草畏的選擇培養基中，從800個外植體中收集到30個麥草畏耐受性枝條。這些中的十二個在生根培養基上形成了根並將其轉移至土壤中。測試了這些中十個的DMO編碼多核苷酸，發現七個是陽性的。在0.02mg/l的麥草畏水平，收集到很少的耐受性枝條。這些結果表明0.01mg/l或更低的麥草畏濃度對於選擇麥草畏耐受性枝條是最有效的。本領域技術人員可以容易地改變該水平，用於特定的研究，然而，這將取決於外植體的性質，構建體和其他變量。
為了證明含有連接基因的耐受性枝條的選擇，選擇後，將植物可表達的DMO編碼核酸連接植物可表達的GFP-編碼核酸並引入細胞中。接種(DAI)後45天檢測培養物的GFP表達。在幾個外植體上觀察到GFP-陽性的小芽，表明這些芽源自用連接的DMO編碼多核苷酸分子轉化的細胞(圖2)。這些芽中的幾個發育成GFP陽性枝條，並且對於GFP基因是陽性的(圖3，6)。這些結果證明了DMO編碼多核苷酸分子可以用作選擇標記，而且用於含有並表達連接基因的轉化體的復原。通過pMON73691轉化的R0植物的自花授粉來證實後代中通過遺傳得到了GFP轉基因。收集未成熟的R1種子(約4mm長)，並切成兩半來暴露子葉組織。在裝備有螢光的解剖顯微鏡下檢測種子的子葉組織中的GFP表達。
還在Oasis生長培養基，即填料(plugs)(Smithers-Oasis NorthAmercia，Kent，OH，USA)中實現了生根。將總共102個麥草畏-選擇的枝條插入Oasis填料中，用於誘導生根。填料周圍為含有0.01mg/l麥草畏的液體培養基。將填料中的枝條保持於28℃和16-h光照的培養室中。三十個枝條產生了根並顯示出對麥草畏的抵抗力，顯示了相對展開的新葉片。通過侵入者測試檢測帶有根的植物，並且發現19個植物含有DMO和GUS兩種基因。液體培養基上的逃逸率為約33％，這比在半固體培養基中誘導根時的53％逃逸率低得多。枝條的陰性基因型，即，在液體培養基比在半固體培養基中可以更快地看到翹曲的葉子。這表明液體選擇培養基中的生根對於消除逃逸是一種更有效的方法。
實施例3 轉化大豆植物的分子分析 為了證實獲得麥草畏耐受性植物是DMO編碼多核苷酸轉移的結果，從每個R0或R1植物收集葉片組織，提取DNA，並通過InvaderTM技術(Third Wave Technologies，Madison，WI)和DNA印跡分析證實DMO編碼基因的存在，使用來自Roche的非放射性探針試劑盒(Indianapolis，IN)。
對於Invader測試，使用的引物是初級探針5』-acggacgcggagATGCTCAACTTCATCGC-3』(SEQ ID NO13)和Invader寡聚5』-TCCGCTGGAACAAGGTGAGCGCGT-3』(SEQ ID NO14)。初級引物中小寫字母的序列是分裂的5』flap序列，並且不與目標序列互補。
對於DNA印跡分析，使用897bp的DNA片段來製備探針。使用正向引物5』-GTCGCTGCCCTGCTTGATATT-3』(SEQ ID NO15)和反向引物5』-CGCCGCTTCTAGTTGTTC-3』(SEQ ID NO16)來擴增897bp DNA片段。對0.01mg/l麥草畏枝條選擇的總共12個枝條轉移至土壤。通過Invader和/或DNA分析測試了十個植物。這些中的七個顯示出存在DMO編碼核酸(表3)。這些中的幾個對於GFP-編碼多核苷酸也是陽性的，證實了使用DMO編碼核酸作為選擇標記用於收集含有連接基因的轉化體的能力。
表3.通過Invader和/或DNA分析測試R0植物的DMO編碼核酸。
實施例4 用DMO編碼多核苷酸分子變體轉化的麥草畏耐受性植物的選擇 使用兩個DMO編碼多核苷酸分析變體來獲得麥草畏耐受性植物。第一個變體在胺基酸位置112具有半胱氨酸(DMOCys112；pMON73698)，而第二個在胺基酸位置112具有色氨酸(DMOTrp112；pMON73696)。使用兩個變體的選擇獲得了麥草畏耐受性枝條(圖7)。選擇並且枝條和生根誘發後，將生根的植物轉移至土壤，用於生長至成熟，並通過InvaderTM和/或DNA印跡分析證實DMO編碼基因的存在。發現用pMON73696轉化的幾個植物在R0和R1代中對DMO基因是陽性的，表示使用本發明方法的種系轉化。
表4.用DMO編碼核酸變體轉化的麥草畏耐受性枝條的選擇。
實施例5 用結合不同葉綠體轉運肽的DMO編碼多核苷酸分子轉化的麥草畏耐受性植物的選擇 已知不同的葉綠體轉運肽(CTP)以不同的效率將外源多肽靶向葉綠體。因此，通過用DMO編碼多核苷酸分子轉化大豆外植體來測試不同類型CTP的效果，通過CTP2(pMON73691)或CTP1(pMON73698)來靶向或不靶向葉綠體(pMON73690)。如表5中所示的，通常，用含有CTP2或CTP1的構建體收集枝條(請參閱圖7)。將生根的植物轉移至土壤中，用於生長至成熟，並通過InvaderTM和/或DNA分析來測試DMO編碼核酸的存在。發現用pMON73691轉化的幾個植物在R0和R1代中對於DMO基因是陽性的，表明使用本發明方法的種系轉化。
在溫室研究中分析18個DAT時，還發現攜帶PCISV/RbcS/DMO-Wdc/Nos或PCISV/CTP2nat/DMO-Cnative/Nos表達單位的幾個轉基因植物對於麥草畏處理是耐受性的，處理以1lb/A(Clarity，BASF)，以V3-4。
表5.用結合不同葉綠體轉運肽的DMO編碼核酸轉化的麥草畏耐受性植物的選擇 實施例6 結合農藝學性狀基因使用作為選擇標記的DMO編碼多核苷酸分子 DMO編碼多核苷酸分子作為選擇標記的一個有益作用是收集含有遺傳上連接基因的轉化體，例如，給予改良的農藝學性狀。通過用具有2-DNA的pMON58498轉化大豆外植體證明了這種能力，第一個T-DNA具有DMO編碼多核苷酸分子，第二個T-DNA具有用於草甘膦耐受性的CP4基因。將半固體培養基上選擇的轉基因植物轉移至土壤中，並通過InvaderTM和/或DNA分析測試來顯示DMO和CP4核酸的存在。
儘管DMO和CP4-編碼多核苷酸分析都可以用作選擇標記，顯示了可以單獨使用麥草畏選擇來選擇含有CP4轉基因的轉化體。如表6中所示的，從兩個處理各自再生的植物中除了一個都具有DMO和CP4基因。因此，該研究證明了使用DMO作為選擇標記用於收集農藝學基因的能力。可以理解可以以這種方式選擇在遺傳上連接選擇DMO標記的任何基因，如引入基因組中的，例如，以50cM內存在，並且這樣的基因不必定需要引入相同的載體上。
表6.DMO作為選擇標記結合農藝學性狀基因的用途 實施例7 含有DMO編碼多核苷酸分子的植物對其他生長素樣除草劑的耐受性 進行分析來測定具有DMO編碼多核苷酸的大豆植物是否能夠使麥草畏以外的其他生長素樣除草劑失活。通過將各種濃度的其他生長素樣除草劑的市售製劑施加至含有DMO的植物組織或植物來進行這，其他的生長素樣除草劑如2，4-D(Helena，Collierville，TN)，MCPA(Agriliance，St.Paul，MN)，綠草定(GARLON 3A；Dow Elanco，Indianapolis，IN)，clopyralid(STINGER；Dow Elanco，Indianapolis，IN)，毒莠定(TORDON 22K；Dow Elanco，Indianapolis，IN)，或Banvel或Clarity(BASF，Raleigh，NC)。
如上所述，對於稱為情況1-4的情況，使用DMO編碼多核苷酸通過農桿菌介導的大豆外植體轉化獲得轉基因大豆植物。將非轉基因系用作對照。將非轉基因和轉基因大豆種子植入含有Redi-earthTM(Scotts-Sierra Horticultural Products Co.，Marysville，Ohio)的3.5英寸方形塑料罐中。將罐子置於35英寸×60英寸玻璃纖維灌溉盤中的毛細管席上，用於測試階段過程中的噴灌和/或地下灌溉，使得維持用於植物生長的最佳土壤水分。用100gm/cu.ft含量的Osmocote(14-14-14緩慢釋放；Scotts-Sierra Horticultural Products Co.，Marysville，Ohio)給罐子施肥，以在溫室測試的過程中維持植物生長。將植物生長於27℃/21℃白天/夜晚溫度的溫室中，使用25％-75％的相對溼度，以模擬晚春的季節生長條件。提供14h最小光周期，按照需要，使用約600μE的補充光。
使用Teejet9501E平的扇形噴嘴(Spraying Systems Co，Wheaton，IL)，使用履帶式噴霧器進行所有除草劑的施加，使用最小24psi(165kpa)的空氣壓力設定。將噴霧嘴保持在高出用於噴霧的植物材料頂部約16英寸的高度。噴霧體積為10加侖/英畝或93升/公頃。當植物達到V-3階段時進行施加。在隨機的分組設計中建立所有的試驗(根據含量來隨機化)，每個處理4至6個重複，這取決於植物質量，利用率，並說明每個溫室限制內已經發生的任何環境變化。
在處理後大約4，14，18和21天(DAT)在視覺上確定溫室試驗中所有處理過的植物，以相對於未處理對照植物0至100％的等級來評價損傷，零表示「沒有」損傷，100％表示「完全」損傷或死亡。使用掌上計算機收集數據並使用標準統計學方法來分析。表9中顯示的結果清楚地表明轉基因大豆相對於非轉基因系對其他生長素樣除草劑如2，4-D和MCPA的耐受性。
表7.在V3後25DAT應用不同生長素樣除草劑對非轉基因或轉基因大豆植物相對於未處理對照的百分比損傷。*

*％損傷表示為ANOVA平均比較。**活性酸等價物克數/公頃 該實施例顯示了轉基因大豆植物呈現出對其他生長素樣除草劑的耐受性，表明了麥草畏和其他生長素樣除草劑如2，4-D和MCPA很可能具有共同的失活機理。在綠草定，chlopyralid和毒莠定的情況中，在該研究中280g ae/ha的施加量顯示出太嚴厲，因此，在大多數情況中希望降低濃度來減少植物傷害。該結果表明生長素樣除草劑可以用於選擇用DMO多核苷酸分子轉化的植物細胞，尤其是在對麥草畏非常敏感的植物情況中，例如，棉花。可以使用檢驗格網的處理接著觀察處理過的植物組織來優化給定條件下用於選擇的生長素樣除草劑的合適濃度。這樣網格的實例分析了約0.001mg/l至約10mg/l濃度的作用，包括0.01，0.1，1.0，2.0和5.0mg/L。
還對攜帶DMO基因的轉基因大豆植物測試了另一種生長素樣除草劑Butyrac 200(2，4-DB；Albaugh)，測試植物對該除草劑的耐受性。作為發芽後處理來施加除草劑，以三個施加量對兩個轉基因大豆情況進行施加，並與非轉基因系比較所有三個施加量的總作物損傷280g/ha(0.25lb/a)，561g/ha(0.5lb/a)和841g/ha(0.75lb/a)(參見表8)。兩個轉基因大豆系顯示出對2，4-DB低水平的耐受性。該實施例證明了麥草畏耐受性大豆對低水平的2，4-DB也是耐受的，並且在控制由相同或鄰近區域的噴霧偏差引起的損傷中應當是有用的，以防止作物損耗，並且在除草劑傳送設備不完全洗滌後呈現出對殘餘水平的2，4-DB的耐受性。
表8.將2，4-DB施加至非轉基因或轉基因大豆植物16DAT時相對於未處理對照的百分比損傷
實施例8 DMO基因作為選擇標記對抗其他生長素樣除草劑的用途 用帶有pMON73691(含有DMO和GFP基因)的農桿菌菌株ABI接種新鮮分離的大豆外植體(沒有子葉的成熟胚軸)。與農桿菌在23℃以及16-h光和8-h暗的光周期下共培養3-d後，在液體延遲培養基中培養外植體，該培養基含有補充了5mg/lBAP，200mg/l羧苄青黴素，200mg/l頭孢噻肟和100mg/l羧噻吩青黴素的改良木本植物培養基。將外植體在延遲培養基上培養4天。然後將它們轉移至PLANTCON中的液體選擇培養基中。選擇培養基和延遲培養基相同，除了添加了各種水平的2，4-D(0.01，0.1，1.0或2.0mg/L)或0.01mg/L麥草畏，如以下的表9中所示的。每個PLANTCON含有60ml選擇培養基和一片具有5個裂縫的泡沫海綿。將二十五個外植體均勻地插入裂縫中。將培養物維持於28℃以及16-h光和8-h暗的光周期下，並在裝備的無菌顯微鏡下定時檢測，來檢測GFP表達組織。在接種後48天(DAI)時，對用0.01mg/L麥草畏，0.01，0.1或1.0mg/L2，4-D處理的外植體數量觀察表達GFP(GFP+)的芽或幼小的枝條，但是沒有觀察用2mg/L 2，4-D處理的外植體。對用1或2mg/L 2，4-D處理的外植體觀察到大範圍愈傷組織發育。用0.01或0.1mg/L的2，4-D處理中，外植體具有大範圍的枝條生長，並且少數具有伸長的GFP+枝條。
表9.使用DMO作為選擇標記和2，4-D作為選擇劑的實驗概述 實施例9 用DMO編碼多核苷酸轉化但沒有延遲步驟的麥草畏耐受性植物的選擇 在三個研究中產生了含有DMO基因但沒有延遲選擇步驟的轉基因植物。作為實例，用帶有pMON73696的農桿菌感染並共培養外植體。共培養階段後，將外植體在含有5mg/l BAP和0.01mg/l麥草畏的液體培養基上培養4天，然後轉移至含有0.01mg/l麥草畏的液體或半固體選擇培養基上。如表10中所示的，從農桿菌共培養後立即使用選擇的處理(717-2和757-2)中獲得麥草畏耐受性枝條。
表10.用DMO編碼多核苷酸轉化而沒有延遲步驟的麥草畏耐受性植物的選擇 實施例10 作為擬南芥選擇標記的DMO的用途 首先測試擬南芥對不同水平麥草畏的敏感性。將野生型擬南芥變種哥倫比亞種子播種於含有各種水平麥草畏的植物組織培養基上。圖8顯示了野生型擬南芥對培養基中1.0mg/L非常敏感。然後使用floral dip方法(Clough和Bent，1998)，用含有DMO多核苷酸的構建體轉化擬南芥植物。將R1種子播種於含有高達4mg/L麥草畏的培養基上。例如，圖9顯示了用pMON73696轉化後回收麥草畏耐受性植物(由箭頭顯示)。發現這些麥草畏耐受性植物含有一個或多個DMO核苷酸拷貝，如通過InvaderTM測試所確定的。該實施例證明了DMO在產生其他植物物種的麥草畏耐受性植物中的用途。
***** 根據本發明的公開內容不需要過度實驗就能製得和進行在此公開和要求的所有組合物和/或方法。儘管根據優選實施方案已經描述了本發明的組合物和方法，本領域技術人員將清楚可以對組合物和/或方法以及在此所述方法的步驟或步驟的次序進行改變，而沒有脫離本發明的概念，精神和範圍。更具體地，將清楚化學和生理上都相關的特定試劑可以替代在此所述的試劑，而獲得相同或相似的結果。認為所有這些本領域技術人員顯而易見的相似替代和改變在所附權利要求限定的精神，範圍和概念之內。
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權利要求
1.選擇轉化植物細胞的方法，所述方法包括以下步驟
a)將含有用編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸轉化的轉基因植物細胞的植物細胞群接觸含有含量為抑制缺乏該多核苷酸的細胞群的細胞生長的生長素樣除草劑的培養基，其中多核苷酸含有選自以下的核酸序列(1)編碼SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲醯胺和42℃條件下與SEQ IDNO7核酸序列的補體雜交的核酸序列，(4)與SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)編碼與SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列；和
b)基於由轉化細胞呈現的對生長素樣除草劑的耐受性從植物細胞群中選出轉化的植物細胞。
2.權利要求1的方法，包括在步驟a)之前和/或在步驟a)和步驟b)之間在缺乏生長素樣除草劑的培養基上培養植物細胞群。
3.權利要求2的方法，其中缺乏生長素樣除草劑的培養基含有細胞分裂素。
4.權利要求2的方法，其中缺乏生長素樣除草劑的培養基含有6-苄基氨基嘌呤(BAP)。
5.權利要求4的方法，其中6-苄基氨基嘌呤的濃度為約10mg/l培養基或更低。
6.權利要求1的方法，其中編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸沒有在遺傳上連接麥草畏單加氧酶以外的其他選擇或篩選標記基因。
7.權利要求1的方法，進一步包括步驟
d)從轉化的植物細胞再生能繁殖的轉基因植物。
8.權利要求1的方法，其中轉化的植物細胞來自雙子葉或單子葉植物。
9.權利要求8的方法，其中雙子葉植物選自苜蓿，豆類，花椰菜，捲心菜，胡蘿蔔，花菜，芹菜，棉花，黃瓜，茄子，生菜，甜瓜，豌豆，胡椒，南瓜，蘿蔔，油菜籽，菠菜，大豆，倭瓜，番茄和西瓜。
10.權利要求8的方法，其中單子葉植物選自玉米，洋蔥，水稻，高粱，小麥，黑麥，黍米，甜菜，燕麥，黑小麥，柳枝稷和草坪。
11.權利要求1的方法，其中編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸可操縱地連接葉綠體轉運肽。
12.權利要求1的方法，其中生長素樣除草劑選自苯氧基羧酸化合物，苯甲酸類化合物，吡啶羧酸化合物，喹啉羧酸化合物和草除靈化合物。
13.權利要求12的方法，其中所述苯氧基羧酸化合物選自2，4-二氯苯氧基乙酸，(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸和4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸。
14.權利要求13的方法，其中培養基中含有濃度為約0.001mg/l至約10mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸化合物。
15.權利要求12的方法，其中所述苯甲酸類化合物是麥草畏(3，6-二氯-鄰甲氧基苯甲酸)。
16.權利要求15的方法，其中培養基中含有濃度為約0.001mg/l至約10.0mg/l的麥草畏。
17.權利要求1的方法，其中培養基含有至少兩種生長素樣除草劑。
18.權利要求17的方法，其中培養基含有麥草畏和2，4-二氯苯氧基乙酸。
19.權利要求1的方法，其中細胞群包括子葉外植體。
20.權利要求19的方法，其中通過農桿菌介導的轉化來製備轉化的植物細胞。
21.含有編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸並且能夠在含有0.01mg/l麥草畏的培養基中生長的轉基因植物細胞，其中麥草畏單加氧酶沒有在遺傳上連接選擇或篩選標記基因，並且其中編碼麥草畏單加氧酶的多核苷酸包括選自以下的核酸序列(1)編碼SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲醯胺和42℃條件下與SEQ ID NO7核酸序列的補體雜交的核酸序列，(4)與SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)編碼與SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。
22.含有權利要求21的細胞的組織培養物。
23.權利要求22的組織培養物，其中組織培養物包括在含有生長素樣除草劑的培養基中的所述細胞，所述生長素樣除草劑的含量為抑制植物細胞的生長或促進與缺乏多核苷酸的轉基因植物細胞相同基因型的異常生長。
24.從權利要求21的植物細胞再生的轉基因植物。
全文摘要
本發明提供了選擇轉基因細胞的方法。本發明涉及意想不到的發現使用生長素樣除草劑作為選擇劑可以從非轉基因細胞中直接選出表達給予生長素樣除草劑如麥草畏耐受性基因的細胞。以這種方式，可以直接產生對生長素樣除草劑呈現出耐受性的植物，而不需要分開的選擇標記。
文檔編號C12N15/82GK101460626SQ200780021025
公開日2009年6月17日 申請日期2007年6月5日 優先權日2006年6月6日
發明者Y·萬, R·J·布林克, P·C·C·馮 申請人:孟山都技術有限公司