一種產acc酶活性促生菌sc-12及其在促進植物生長中應用的製作方法
2023-09-14 17:20:45 1
一種產acc酶活性促生菌sc-12及其在促進植物生長中應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種產ACC酶活性促生菌SC-12及其在促進植物生長中應用；菌株SC-12分離自江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中，經鑑定為同溫層芽孢桿菌（Bacillus?stratosphericus），保藏號為CGMCC?No.7622；該菌在以ACC為唯一氮源條件下，其ACC脫氨酶活性為23.57μmolα-丁酮酸.mg-1pro.h-1。另外，SC-12菌株還具有產生吲哚乙酸(IAA)、耐鹽以及溶磷的特性，同時該菌對酸鹼具有良好的適應性。耐鹽條件下，菌劑SC-12能顯著促進辣椒、番茄發芽率和芽長。田間試驗結果表明，利用SC-12菌株研製的促生菌肥能夠顯著提高番茄生物量和產量。
【專利說明】—種產ACC酶活性促生菌SC-12及其在促進植物生長中應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於農業集約化生產【技術領域】，尤其涉及一種SC-12菌株在促進大棚逆境環境中辣椒、番茄等茄果類蔬菜的生長。
【背景技術】
[0002]由於設施栽培(主要是塑料大棚、日光溫室和地膜覆蓋技術)在我國蔬菜和其他重要經濟作物的反季節供給和跨地區種植中所起的重要作用，設施農業在全國各地得到了大面積的推廣應用。
[0003]溫室、大棚等栽培條件下的土壤缺少雨水淋洗，且溫度、溼度、通氣狀況和水肥管理等均與露地栽培有較大差別(殷永嫻，劉鴻雁.設施栽培下土壤中硝化、反硝化作用的研究.生態學報，1996，16(3):246-250.)，設施栽培又長期處於高集約化、高複種指數、高肥料施用量的生產狀態下，其特殊的生態環境與不合理的水肥管理措施導致了土壤次生鹽潰化、養分不平衡、土壤酸化等諸多生產問題，其中最為突出的是土壤次生鹽潰化，已成為農業生產中的重要限制因子(餘海英，李廷軒，周健民.設施土壤次生鹽潰化及其對土壤性質的影響.土壤，2005，37(6):581-586.)。土壤的鹽潰化不僅影響植物代謝和光合作用，還會降低植物對土壤養分及微量元素的攝入，由於土壤中的鐵主要以難溶性的高價氧化物等形式存在，而鹽鹼土又會進一步降低土壤可溶性鐵的含量，從而導致植物的缺綠症。因此，生長在鹽潰化土壤中的植物往往同時受到鹽脅迫的危害以及鐵缺乏的威脅。
[0004]鹽鹼地改良是一項複雜而艱巨的工作，而在當今提倡生態效益為重的前提下，生物改良措施已成為研究的熱點。植物促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR)可以通過間接產生抗生素和分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害對植物產生的不良影響，並通過解磷、固氮、產生植物激素、酶解降低乙烯水平等方式直接刺激和調節植物生長(Kloepper J ff, Schroth M N.Plant growth-promoting rhizobacteria onradishes//Proceedings of the Fourth International Conference on Plant PathogenBacteria[C], vol.2.1NRA, 1978:879 - 882)。其中，一種含 1-氨基環丙烷-1-羧酸(1-aminocyclo-propane-l-carboxylic acid, ACC)脫氨酶的PGPR受到了各國科研工作者的關注。ACC脫氨酶是一種有效降低逆境乙烯含量的外源促生物質，該酶在乾旱、鹽脅迫及重金屬汙染等逆境條件下能顯著提高農作物的抗逆性和增加產量(Glick BR, Cheng Z, CzarnyJ, Duan J.Promotion of plant growth by ACC deaminase-producing soil bacteria.European Journal of Plant Pathology, 2007，119:329 - 339)。有些微生物可以分泌 1-氨基環丙烷-1-羧酸(簡稱ACC)脫氨酶從而顯著促進植物生長，如番茄、黃瓜、辣椒等蔬菜瓜果類和小麥、豆科等糧食作物。它能水解植物體內生物合成乙烯的直接前體ACC，產生羥基丁酸和氨，阻止乙烯的釋放。當這種菌附著在種子表皮時，它能水解ACC，降低種子在逆境條件下大量產生的植物生 長抑制劑和植物衰老促進劑——乙烯的濃度，促進根伸長和植物生長(許煜泉，石榮，林志新.具有ACC脫氨酶活性及抗枯萎病菌的假單胞菌株B*8.上海交通大學學報，1999，33 (2): 206-209.)。
[0005]在實際生產中，若能篩選到既能促生、又能增強作物抗逆能力的促生菌，並在理論上揭示其作用機制，不僅能夠有效降低過量施用化肥、農藥給環境和人類健康帶來的危害，還能廣泛促進處於各種逆境環境中植物的生長，對於當前綠色可持續農業的發展具有重要的理論及實際意義。
【發明內容】
[0006]本發明提供一株新的促生菌，可在促進大棚逆境環境中辣椒、番茄等蔬菜瓜果類等生長。
[0007]本發明的技術解決方案為:本發明採用的菌株是同溫層芽孢桿菌SC-12，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏日期為2013年5月15號，保藏號為=CGMCC N0..7622。
[0008]本發明菌株SC-12系從江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中分離得到，觀察分析了該菌形態特徵、培養特徵、生理生化特性以及16SrDNA序列:
[0009]( I)菌落和菌體形態特徵以及生理生化特徵
[0010]菌株SC-12呈短杆狀，菌落黏稠半透明，表面溼潤光滑，邊緣整齊，革蘭氏染色陰性，其電鏡圖片為圖1。生理生化鑑定結果表明:菌株SC-12能充分地利用澱粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖，但不能液化明膠；甲基紅試驗、伏-普試驗、氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗均為陰性；D引哚試驗、檸檬酸鹽試驗、接觸酶試驗結果均為陽性。
[0011](2)16SrDNA 序列`
[0012]菌株SC-12的16Sr DNA核苷酸序列含有1422bp，序列如SEQ ID N0.1所示，將其與GeneBank等資料庫中進行最大同源性比較，發現SC-12的16S rDNA序列與同溫層芽孢桿菌 Bacillus stratosphericus KC172060 序列同源性達到 100%。
[0013]本發明還提供了一種促生菌肥，是將所述菌株SC-12接種到腐熟的豬糞秸杆堆肥中發酵得到，所得促生菌肥中含有SC-12菌株IX 108/g以上。
[0014]具體的方法是:將活化的權利要求1所述菌株SC-12接種到LB液體培養基中，30°C，搖床培養20h後，將發酵液按20% (千克/升)的量接種到腐熟的豬糞秸杆堆肥中，並充分混合均勻，調節堆體溼度，進行固體發酵，發酵過程中每天攪拌肥料，控制堆體溫度，發酵20天，肥料中含有SC-12菌株I X 108/g以上，即為促生菌肥。
[0015]本發明以ACC為唯一氮源採用富集定向篩選方法，從江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中分離到4株產ACC脫氨酶的植物促生菌。對其ACC脫氨酶活性大小、產IAA、產鐵載體和溶磷能力進行了測定。結果顯示，菌株SC-12產脫氨酶的能力最強，同時也具有較強的產IAA和溶磷能力。耐鹽及耐酸鹼性試驗也表明菌株SC-12對鹽具有一定的耐性，對酸鹼的耐性尤為明顯，在PH4~10範圍內正常生長。通過對其進行生理生化特性和16SrDNA序列分析，該株菌株初步鑑定為同溫層芽孢桿菌。在此基礎上，在鹽脅迫條件下，菌株SC-12對辣椒、番茄種子發芽率和芽長具有明顯的促生作用。由於菌株SC-12株具有較強的產ACC酶活力和很強的環境適應能力，對也具有明顯的促生作用。從植物根際鹽鹼土中篩選出的PGPR相對於肥沃土壤中篩出的PGPR更能適應鹽鹼環境，所以用於鹽鹼地改良、鹽鹼地綠化，更具有實用性。因此，該菌有望應用於大棚辣椒、番茄等茄果類蔬菜，提高植物對逆境的適應能力，增加產量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1SC-12菌株的透射電鏡圖；
[0017]圖2SC-12菌株的16S rDNA全序列的系統發育樹；
[0018]圖3不同硝酸鹽濃度下菌株SC-12對辣椒和番茄種子發芽率和芽長的影響。【具體實施方式】
[0019]以下結合實例對本發明作進一步的描述:
[0020]實施例1:
[0021]I材料與方法
[0022]1.1 菌種
[0023]從江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中分離。
[0024]1.2培養基
[0025]LB培養基:胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCllOg, pH7.0，去離子水IL ；
[0026]SM培養基:葡萄糖1.0g,鹿糖1.0g，檸檬酸鈉1.0g，蘋果酸1.0g，甘露醇1.0g，醋酸鈉 1.0g, KH2PO40.4g, K2HP042.0g, MgSO40.2g, CaCl20.lg, CuSO4Img, NiSO4Img, ZnS045mg,FeS045mg, MnS043mg, CoSO4Img, Na2MoO4Img, H3B032mg,生物素 2 (VB6) IOmg,硫胺(VB1) 2mg,氰鈷維生素(VB12) 0.lmg,泛酸(VB3) 5mg,葉酸2mg,核黃素5mg,煙酸5mg,蒸懼水1000mL,pH6.4。維生素過濾除菌後加入。
[0027]SMA培養基:SM培養基中加入過濾除菌的ACC，使其濃度為0.5g.L'
[0028]SMN培養基:SM培養基中加入(NH4) 2S04,使其濃度為0.5g.L'
[0029]SRSM 培養基:葡萄 H 10g/l ；Ca3 (PO4) 25g/l ； (NH4)SO40.5g/l ；KC10.2g/l ；MgSO4.7H200.3g/l ；MnSO40.004g/l ；FeS04, 0.00 2g/l ；NaC120g/l ;酵母提取物，0.5g/l ;溴甲酹紅紫0.lg/lo
[0030]1.3產1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶細菌的篩選
[0031]將菌株接入LB液體培養基中28°C搖床培養18h，離心收集菌體，將菌體用無菌水洗兩次後等量(100 U L)分別接入SM液體培養基、SMA液體培養基、SMN液體培養基(3mL)。28°C振蕩培養48h，用722分光光度計比色法測定不同處理菌懸液的0D_值，並進行比較。在SM培養基中不長，在SMA和SMN培養基中良好生長的細菌具有ACC脫氨酶活性。
[0032]1.4ACC脫氨酶活性測定
[0033]分離菌株接種於SMN培養液中搖床振蕩培養20h，4°C離心收集菌體，用SM培養液洗滌離心兩次，菌體懸浮於SM培養液，並按5%接種量接種於SMA培養液，280C 150rpm的條件下培養48h，以誘導產生ACC脫氨酶。4°C離心收集菌體，用0.lmol.L^Tris-HCl緩衝液(pH值為7.6)洗滌離心兩次，重懸浮於600 ii L0.lmol.L1Tris-HCl緩衝液(pH值為8.5)中，加入30 ii L甲苯並迅速振蕩30s以破碎細胞。
[0034]取IOOii L含甲苯的細胞提取物於1.5mL離心管中，加入10 U L0.5mol.L-1ACC M勻，30°C反應30min。加1.0mL0.56N HCl終止反應，14000rpm離心5min去除細胞碎片，吸取ImL上清液於7mL離心管中，加入0.15mL0.1%的2，4-二硝基苯肼(溶於2M HC1)，30°C反應15-30min。取出加lmL2N NaOH0以加ImL Tris-HCl緩衝液(pH值為8.5)進行同樣反應為空白管調零，以ImL濃度為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mM的a - 丁酮酸為標準溶液，測定540nm波長下吸光值。
[0035]菌體總蛋白含量採用考馬斯亮藍法測定。以ImL濃度為0、20、40、60、80和IOOmg.L—1的牛血清白蛋白為標準溶液，加5mL考馬斯亮藍G250染色液，反應5min後測定595nm波長下吸光值。ACC脫氨酶的活性以在測酶體系中每毫克蛋白每分鐘形成的a-丁酮酸的量表示，單位為 y mo I a - 丁酮酸? mg—iprotein.mirf1。
[0036]1.5菌株產鐵載體、3-吲哚乙酸(IAA)、溶磷能力的測定
[0037]鐵載體的測定方法:將分離菌株接種於MSA液體培養基中，搖床30°C 150r/min振蕩培養48h後，發酵液6000r/min離心lOmin，取1.5ml上清液加1.5mlCAS檢測液，充分混勻，靜置Ih後測定630nm波長處的吸光值(A)，以去離子水作為對照調零。另取1.5ml CAS檢測液與1.5ml未接菌的MSA液體培養基上清液充分混勻，同法測定吸光值即為參比值(Ar)。以A/Ar作定量指標。比值越小,反映鐵載體的產量越大。一般參考標準為:A/ArO~
0.2, +++++ ；0.2 ~0.4, ++++ ；0.4 ~0.6, +++ ；0.6 ~0.8, ++ ；0.8 ~1.0, +。
[0038]IAA測定方法:將色氨酸配置成2.5mg/ml的溶液，LB液體培養基分裝於試管中，每管4ml，121°C高壓滅菌後加入過濾除菌的色氨酸溶液1ml，使培養基中色氨酸的濃度為0.5mg/ml，將供試菌株接種於上述培養基中，搖床振蕩培養3天，離心取Iml上清，加50 u 110mmol/L的正磷酸，再加2ml Salkowski 』 s顯色劑，黑暗下25°C顯色30min,測定530nm波長下的吸光值。以蒸餾水代替培養液同樣反應作為對照調零，用不同濃度的IAA標準液同法作標準曲線，計算發酵液中IAA的濃度。
[0039]溶磷能力的測定方法:將待測的菌株先在LB固體培養基上活化，然後用滅菌牙籤點接種菌株至固體改良SRSM培養基上。每菌株在一個皿上接4個重複。在28°C培養箱中培養5d後觀察菌株透明圈的大小。
[0040]1.6菌種鑑定
[0041]1.6.1菌落和菌體形態觀察
[0042]在LB培養基上劃線得到單菌落，觀察單菌落邊緣形狀、大小、隆起情況、表面形態、菌落顏色、透明度、色素產生情況等。將菌株培養16_18h後，進行革蘭氏染色，並觀察革蘭氏染色的陰陽性和菌體的形態。
[0043]1.6.2生理生化鑑定:
[0044]生理生化特徵測定參考《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠等，2001)。
[0045]1.6.3分子生物學鑑定
[0046]用16S rDNA 通用引物 27F (正向引物):5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ IDN0.2);1492R (反向引物):5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID N0.3)，以分離菌株的總DNA為模板進行PCR擴增。擴增反應體積50 u 1，反應條件為94°C預變性5min ；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循環30次；最後72°C延伸IOmin0取PCR產物2.5 ii L於0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR產物送至生物公司進行純化和測序。將測序結果提交GenBank資料庫，用BLAST軟體進行比對分析。將測序結果用BLAST軟體與GenBank中得到的16S rDNA相關菌株的序列一起輸入MEGA4.0進行DNA同源性比較和排列，構建系統發育譜系圖。[0047]1.7溫度、初始pH值和鹽濃度對菌株生長的影響
[0048]將供試菌株點接於固體平板，分別在15°C、25°C、35°C、45°C的溫度下培養72h，在600nm波長下測量各處理菌液的OD值，用OD值來表示其在梯度鹽濃度培養基中培養的生物量，OD值越大，則表明生物量就越大。
[0049]用lmol.L-1的NaOH和lmol.L-1的HCl將LB培養基的pH值分別調節至4.0,5.0、
6.0,7.0,8.0,9.0,10.0。將活化的供試菌株分別點接於上述不同pH的平板上，28°C培養72h，觀察其能否生長及生長情況，方法同上。
[0050]將過夜培養的供試菌株的菌懸液接入到Ca(NO3)2濃度分別為0，50，100，150，200，250gkg^的液體LB培養基中(色氨酸濃度為0.5mg mF1)，28°C震蕩培養24h，觀察其能否生長及生長情況，方法同上。
[0051]1.8不同鹽分條件下菌株SC-12對辣椒、番茄耐鹽性的影響
[0052]將去離子水(CK)，8、16、24g/kg Ca(NO3)2溶液滅菌後加入滅菌的培養皿中(內置3~5層濾紙)，每平皿10ml。將消毒過的辣椒、番茄(70%酒精lmin，1%次氯酸鈉IOmin)，浸於 0.03mol/L MgSO4 菌懸液(OD600=0.5)或 0.03mol/L MgSO4 滅活菌懸液(CK)中 Ih 後，置於上述滅過菌的培養皿中。每天向平皿中加3mL無菌水保溼催芽(25°C-28°C )，4天後調查發芽率及芽長。每培養皿20粒種子，設置5個重複。
[0053]1.9SC-12菌肥田間促生試驗
[0054]1.9.1促生菌肥的製備將活化的菌株SC-12接種到IOOmL (500mL搖瓶)LB液體培養基中，30°C，ZOOrmirT1搖床培養20h後，將發酵液按20% (v/m)(千克/升)的量接種到腐熟的豬糞秸杆堆肥中，並充分混合均勻，調節堆體溼度，進行固體發酵，發酵過程中每天攪拌肥料，控制堆體溫度，發酵20天，肥料中含有SC-12菌株IX 108/g以上，即為促生菌肥。
[0055]1.9.2番爺育苗番爺品種為金鵬9號,選取健康飽滿的番爺種子,在75%酒精中浸泡lmin，用0.1%升汞消毒2min，用滅菌水衝洗3次後浸泡吸脹,然後鋪在裝有無菌溼潤濾紙的培養皿上，30°C催芽，直到種子露白。將種子播入育苗穴盆，栽培土為揚州大學環境科學與工程學院蚯蚓生產基地生產的蚯蚓糞育苗基質，育苗20天後選擇生長一致的移栽到大棚。
[0056]1.9.3試驗設計試驗於2013年在揚州市揚子蔬菜公司大棚內進行。大棚土壤理化性狀:有機質29.2g/kg,鹼解氮240mg/kg,速效磷140mg/kg,速效鉀240mg/kg, pH7.95,全鹽1.65g/kg和EC值為0.67mS/cm。大棚面積50 X 6m2,分3畦。每畦雙行植株距40cm，行距70cm。每行15株，共30株。田間試驗設4個處理:1.促生菌肥(10000kg ha—1) ;2.天輔有機肥(12000kg ha-1) ；3.保利複合肥(1125kg ha—1) ;4.對照。肥料施入土壤後立即淺翻15cm混勻，起壟，覆膜，移苗定植。隨機區組排列，4次重複。小區日常管理一致。於番茄採收期，在每個小區中隨機選取株掛牌於採收期進行取樣，測定植株地上部、地下部和果實鮮重、乾重和株高。
[0057]2結果與分析
[0058]2.1產1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶細菌的篩選
[0059]植物在逆境(旱、澇、鹽、重金屬等)條件下，其體內的乙烯含量會迅速增加，過量乙烯的積累會使植物生長受阻甚至死亡。Glick et al (2005) (Glick BR.Modulation ofplant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase.FEMS MicrobiologyLetter, 2005, 251:1 - 7)研究表明微生物能夠產生ACC脫氨酶，通過分解乙烯的前體物質ACC，來減少脅迫環境下乙烯在植物體內的積累，從而促進植物生長發育。本研究通過將供試菌株的細菌懸液分別等量接種於SM、SMA, SMN培養液中，以檢測菌株是否能以ACC為唯一氮源進行生長。將供試細菌接種於SM培養基可以排除菌株固氮作用引起的判斷誤差，接種於SMN培養基可以排除細菌培養和培養基配方等對菌株產ACC脫氨酶能力的判斷誤差。試驗結果表明，有多株菌在SMA培養液的生長勢明顯好於SM培養液的生長勢，表明菌株能以ACC為唯一氮源進行生長，將這些菌株命名為SC-3、SC-12、D18、D25。
[0060]2.2分離菌株ACC脫氨酶活性、產鐵載體，IAA和溶磷能力的測定[0061 ] 本研究對上文中的以ACC為唯一氮源生長的分離菌株進一步定量測定其ACC脫氨酶活性，結果見表1。結果表明，4株菌均表現出ACC脫氨酶活性，LSD多重比較結果表明，4株菌在0.05顯著水平上存在顯著差異，其ACC脫氨酶活性表現為SC-12>D18>D25>SC-3。
[0062]PGPR既可以通過解磷、產生植物激素等直接作用促進植物的生長，也可以通過分泌鐵載體和產生抗生素等間接作用提高植物的抗逆性(丁延芹，杜秉海.玉米根際細菌中PGPR的篩選及初步鑑定.土壤肥料，2001, (3):41-43.)，本實驗室通過對4株菌株產鐵載體、IAA和溶磷能力的測定，LSD多重比較結果表明，菌株SC-3和D25產IAA能力顯著大於菌株SC-12和D18 (P D25 > SC-3> D18，4株菌株均能產生鐵載體，菌株SC-12和D18產鐵載體能力較強，而菌株SC-3和D25產鐵載體能力較弱。綜合以上分析菌株SC-12對大棚逆境環境中植物的潛在促生效果可能優於其餘3株菌。以下SC-12菌株被選用於進一步的研究。
[0063]表1供試菌株ACC脫氨酶活性及產吲哚乙酸、鐵載體和精氨酸脫羧酶情況
[0064]
【權利要求】
1.一株產ACC酶活性促生菌SC-12,是同溫層芽孢桿菌(Bacillus stratosphericus),它的保藏號為CGMCC N0.7622。
2.權利要求1所述的SC-12菌株在促進大棚逆境環境中茄果類蔬菜生長中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述茄果類蔬菜是番茄、辣椒。
4.一種促生菌肥，是將所述菌株SC-12接種到腐熟的豬糞秸杆堆肥中發酵得到，所得促生菌肥中含有SC-12菌株I X 108/g以上。
【文檔編號】A01N63/00GK103642730SQ201310646842
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】王小兵, 封克, 汪曉麗 申請人:揚州大學