一種提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法
2023-09-14 05:02:50
專利名稱：一種提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法
技術領域：
本發明涉及一種可提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法，特別是水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5的信號肽編碼序列以及利用該序列於轉基因植物的研究與應用，將該序列與異源重組蛋白融合，可明顯的提高目標蛋白在轉基因植物種子中的表達量，屬於生物基因工程技術領域。
背景技術：
利用轉基因技術在植物中表達異源重組基因，以提高抗逆性、增加產量和改善品質等已成為現代農業生物技術研究開發的重點與熱點。尤其是近年來，利用植物這一廉價生產系統作為生物反應器，來大量生產重組的編碼具重要功能的異源蛋白、醫用活性多肽或疫苗、抗體、工業用酶或蛋白質等，是目前植物基因工程發展的一個重要領域之一，其研究與開發方興未艾，有可能形成一個低投入、高產出的新興生物技術產業。但是，在植物生物反應器研究中存在一個較為突出的問題，即重組蛋白的表達量極低，某些蛋白還不能穩定積累下來，如在轉基因植物中表達的重組抗原的量一般只佔總可溶性蛋白的0.01-1％。因此，建立高效穩定的新型植物生物反應器技術體系歷來是該領域研究的重點與難點。細胞代謝合成的蛋白質在植物與動物中貯存的方式有所不同；因此，要實現重組的醫用蛋白(一般都為非植物來源)在轉基因植物細胞中高效表達與穩定積累，也需要遵循與植物本身蛋白一致的表達與貯存規律。除了對重組蛋白基因的密碼子進行修改外，另一關鍵技術，便是要應用受體植物來源的基因表達調控元件和目標蛋白靶向序列。其中，使用組織特異性基因表達的啟動子及其相關靶向調控元件，尤其是種子特異性表達基因的啟動子及其N-端的信號肽編碼序列，被認為是實現異源重組蛋白在植物特定的組織中高效表達的有效途徑。
種子貯藏蛋白是植物種子中的一種富含成分，其編碼基因的表達往往具有極嚴格的組織與時空特異性，而且還含有特定的蛋白靶向調控元件。這些基因在翻譯形成蛋白前體時，其氨基末端都含有一段信號肽(signal peptide，SP)序列，長度隨物種和貯藏蛋白種類的不同而有所不同，它們在貯藏蛋白及其mRNA分子的定位及運輸中起重要作用。在植物貯藏蛋白基因轉錄出成熟mRNA後，翻譯形成含信號肽的前體蛋白，此時該前體蛋白由信號肽序列牽引定向地轉移到粗糙型內質網腔內，隨後這一信號肽序列從前體蛋白上被剪除下來，以便貯藏蛋白能正確地加工(Coleman等1995)。除了在目標蛋白的正確定向中具有決定作用外，信號肽序列在調控基因表達水平上也具有重要的作用(Boehm等2000)。信號肽序列的上些特性已在轉基因植物研究中獲得了很好的應用。例如，利用水稻穀蛋白Gt3的信號肽序列可將入細胞巨化病毒的糖蛋白B成功地定位在轉基因菸草種子中的蛋白貯藏囊泡中(Wright等2001)；人的溶菌酶基因在水稻穀蛋白Gt1基因啟動子及其信號肽序列控制下，可特異性地在轉基因水稻種子中高效表達(Huang等2002)；而菜豆肌動蛋白內質網特異的信號肽序列可明顯增強大腸桿菌輔酶Q在轉基因菸草中的轉錄與隨後的表達量。由此可見，貯藏蛋白的信號肽序列對於在轉基因植物中外源蛋白的表達與沉積是有積極作用的。
醇溶蛋白是禾穀類作物中主要的種子貯藏蛋白。水稻醇溶蛋白(prolamin)是水稻種子中僅次於谷蛋白的第二大類種子貯藏蛋白，佔胚乳總蛋白的5-10％，在水稻種子中合成後，可定向地沉積到蛋白體II中。水稻醇溶蛋白的分子量較小，但種類較多，至少可分為三類10KDa、13KDa和16KDa，但以13KDa的為最多。從蛋白或DNA序列上分析，同一分子量大小的醇溶蛋白多肽間有70％的同源性；不同分子量大小多肽間的同源性較小，而13KDa與16KDa多肽間有47％的同源性，但10KDa多肽與13KDa多肽之間完全不同源。雖然不同組分的水稻醇溶蛋白在序列上有較大的差異，但每個醇溶蛋白基因在合成前體蛋白時，在其氨基末端都含有由18-24個胺基酸組成的信號肽序列，該信號肽序列的存在對於醇溶蛋白表達的穩定及其定位是非常重要的。已有的研究表明，水稻醇溶蛋白mRNA上與信號肽對應的序列在將該mRNA定位到特定的內質網膜上的過程中起著決定作用(Mitsukawa和Tanaka 1991)；Choi等(2000)最近的研究指出，將水稻醇溶蛋白基因中的信號肽編碼序列除去，可有正常的醇溶蛋白轉錄本產生，但卻檢測不到最後的蛋白。OsRP5是水稻醇溶蛋白家族的成員之一，其編碼蛋白的分子量為13KDa，其前體蛋白的氨基末端含有由19個胺基酸組成的信號肽序列。該基因的基因組序列已被克隆(GenBank登記號為AF156714)。對該基因的表達特性研究表明，OsRP5基因只有發育的水稻胚乳中特異性地表達。發明人的前期研究已表明，該基因啟動子可指導外源基因在轉基因水稻的胚乳中特異性高效表達。但在本發明之前，尚沒有OsRP5蛋白信號肽序列在調控異源重組蛋白在轉基因植物中表達的研究。
發明內容
本發明的目的是要一種提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法，通過先製備可用於提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的信號肽編碼序列，再將該序列轉化進入作物或植物細胞中再生植株，從而提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中的表達量。
本發明的技術方案是這樣的一種提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法，其特徵是將OsRP5基因信號肽編碼序列與異源重組蛋白基因編碼序列連接在一起構建成融合蛋白基因，融合蛋白基因再與種子特異性表達啟動子連接並克隆到植物的載體上，轉化進入植物細胞中，從該轉化細胞再生出植株，結實生產種子，採用Northern blot和Western blot技術檢測異源重組蛋白在轉基因植物種子中的表達量。所述的信號肽編碼序列有57位鹼基的核酸，該核酸編碼水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信號肽，共19個胺基酸殘基。所述的核酸具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
信號肽編碼序列表SEQ ID NO.1Sequence nameOsRP5_SP，水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5信號肽編碼序列Length57bpTypeDNA CDSSource水稻(Oryza sativa)atg aag atc att ttc gta ttt gct ctc cttMet Arg Ile Ile Phe Val Phe Ala Leu Leugct att gtt gca tgc aac gct tct gcaAla Ile Val Ala Cys Asn Ala Ser Ala本發明利用轉基因技術在植物中表達異源重組基因，提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中的表達量，方法科學簡單先進。將包括SEQ IDNO.1的OsRP5基因信號肽編碼序列與異源重組蛋白基因編碼序列連接在一起，構建成融合蛋白基因，再與相關的種子特異性表達啟動子連接並克隆到可用於轉化植物的載體上；通過轉基因技術將構建的嵌合基因轉化進入作物或植物細胞中，從該轉化細胞再生出植株，經自交或人工授粉結實生產種子；採用Northern blot和Western blot等技術檢測異源重組蛋白在轉基因植物種子中的表達量，相比於未使用OsRP5基因信號肽編碼序列的構建，目標蛋白的表達量明顯提高。
所述的轉基因植物包括轉基因植物細胞或將轉化的植物細胞培育成植株，以及由這些轉基因植株的有性或無性繁殖的後代。
所述的目標蛋白可以包括任何在生產上的有應用價值的蛋白或酶，編碼該蛋白的基因可以來自植物、人、動物或微生物。
圖1為RPG和RPSG轉基因水稻植株未成熟種子總RNA的Northern雜交分析。上圖為Northern雜交結果，下圖顯示總RNA中的28S核糖體RNA。總RNA分別抽提自轉基因水稻植株(RPG-1~RPG-5，RPSG-1~RPSG-7)或武香粳9號未轉化植株(標記為W)的未成熟種子(~12DAP)，其中RPSG轉基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有醇溶蛋白的信號肽編碼序列。雜交所用的探針為地高辛標記的反義GUS編碼區片段。
圖2為RPG和RPSG轉基因水稻植株成熟種子總蛋白的Western雜交分析。胚乳總蛋白分別抽提自轉基因水稻植株(RPG-2~RPG-9，RPSG-2~RPSG-6)或武香粳9號未轉化植株(標記為W)的成熟種子，其中RPSG轉基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有醇溶蛋白的信號肽編碼序列。每個泳道所加的總蛋白量一致，各為30微克，蛋白經SDS-PAGE分離後，轉印到硝酸纖維素膜上，然後用抗GUS蛋白的特異抗體進行雜交分析。箭頭所指即為GUS蛋白。
具體實施例方式
以下分四個最佳步驟進一步闡明本發明的具體實施方式
。實施例所述內容不構成對本發明權利要求範圍的限制。
1、水稻醇溶蛋白OsRP5基因啟動子及其信號肽編碼序列的克隆根據已發表的水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5基因的核苷酸序列，設計併合成了三個引物P1(5』-TCAAGCTTTGAACGGGCAGAACCGGTC-3』)、P2(5』-CCGGATCCTTTTGTAG GATTCTACTACTATGCTTC-3』)和P3(5』-GACCATGGCAGAAGCGTTGCATGCAACAA-3』)。其中正向引物P1位於OsRP5基因ATG上遊1.1kb處(不含ATG序列)，在引物5』末端加接上了HindIII酶切位點(下劃線)；反向引物P2位於ATG上遊-1至-22位鹼基處(以翻譯起始位點為+1位，下同)，在其5』末端加接上Bam HI酶切位點；另一反向引物P3位於ATG下遊+35~+57位鹼基處，在其5』末端加接上Nco I酶切位點。為了能在引物P3的5末端加上一個酶切位點而又不影響其讀碼框，在加入Nco I位點時，將+55至+57位的GCA密碼子改為GCC，但其編碼的胺基酸仍未改變。以引物P1和P2配對用於擴增OsRP5基因5』末端非翻譯區1.1kb長的啟動子區序列(稱為OsRP5_PRO片段)；引物P1和P3配對用於擴增包括5』末端非翻譯區1.1kb和起始密碼子下遊57個bp在內的5』上遊區序列(稱為OsRP5_PRO+SP片段)，起始密碼子下遊57bp序列為OsRP5基因的信號肽(signal peptide，SP)編碼序列。PCR反應程序為95℃、5min；95℃、50sec，55℃、50sec，72℃、1min 30sec，30個循環；72℃、10min。用於PCR的DNA模板為抽提自粳稻品種武運粳8號葉片的總DNA。經測序分析，OsRP5_PRO片段為OsRP5基因ATG上遊-1075到-1位的啟動子區序列，全長1075bp；OsRP5_PRO+SP片段為從-1075到+57位鹼基之間的序列，全長1132bp。其中，OsRP5基因起始密碼子下遊57bp序列，即該基因的信號肽編碼序列見序列表SEQ ID NO.1中。
2、OsRP5信號肽編碼序列與GUS融合基因的構建為檢測上述所克隆兩個調控無片段指導外源基因在轉基因植物種子中的表達效率，並進一步研究OsRP5蛋白信號肽序列對於外源蛋白在轉基因植物種子胚乳中表達後的影響，分別將OsRP5_PRO和OsRP5_PRO+SP片段與GUS(β-半乳糖苷酸酶)報告基因編碼區、胭脂鹼(NOS)基因終止子序列構建成嵌合基因。將OsRP5_PRO+SP片段經HindIII和Nco I雙酶切，替代雙元載體pCAMBIA1301中GUS編碼區上遊的35S啟動子，即構建成雙元載體p13RPSG。該載體中，在OsRP5_PRO啟動子與GUS基因編碼區(保留有自己的ATG序列)之間即含有OsRP5基因的信號肽編碼序列，信號肽編碼序列與GUS編碼區序列組成一個融合基因，經測序證明兩者的讀碼框都沒有發生改變。
同時，為比較OsRP5基因信號肽編碼序列對GUS基因表達的影響，又構建了只含有OsRP5基因啟動子(OsRP5_PRO片段)的GUS嵌合基因，構建流程如下。首先用限制性內切酶Sac I和Eco RI從質粒pBI121上切下270bp長的NOS終止子，克隆進雙元載體pCAMBIA1300的相應位點中，構建成質粒pC1300/NOS。再從雙元載體pIG121Hm(Hiei等1994)上用Bam HI和Sac I切下並回收2.0kb長的GUS基因編碼區序列，將其克隆進質粒pC1300/NOS的相應位點中，形成質粒pC1300/GN。進一步用Hind III和Bam HI雙酶切OsRP5_PRO片段，連接入質粒pC1300/GN的相應酶切位點中，構建成含OsRP5_PRO啟動子與GUS報告基因相融合的質粒p13RPG。
3、OsRP5信號肽編碼序列與GUS融合基因導入水稻獲轉基因植株將上述實施例2中所構建的兩個雙元載體經凍融法導入根癌農桿菌菌株EHA105感受態細胞中，按申請人已建立的農桿菌介導轉化水稻的程序(劉巧泉等，植物生理學報，1998)將所構建的兩個GUS融合基因中導入水稻中。取開花後12~15天的水稻品種武香粳9號未成熟種子經70％乙醇表面消毒2min後，於含2％活性氯的NaClO溶液中消毒90min以上，並不時搖動，用無菌水衝洗4～5次，然後用解剖刀和鑷子剝出幼胚並培養於愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織，經4-7天預培養後誘導出的初生愈傷組織用於農桿菌介導的轉化實驗。將在超低溫保存的根癌農桿菌菌種於含50mg/l卡那黴素的YEB半固體培養基上活化後，挑取單菌落接種到3ml含50mg/l Km的YEB液體培養基中，於28℃振搖培養過夜；第2天按1％接種量轉接入40ml含50mg/l Km的AB液體培養基中，於28℃、250rpm繼續培養6~8hr。將新鮮的培養液於6000rpm、4℃離心5min，收集菌體並重懸於10~15ml的AAM(含100~400μmol/l乙醯丁香酮)液體培養基中，立即用於與水稻受體材料的共培養轉化。將各種適宜的水稻受體材料浸沒在新鮮的AAM農桿菌菌液中15～30min，間或搖動幾次。然後將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉移到N6D2C共培養培養基上，於26-28℃黑暗條件下共培養3天。3天後，切去胚芽並轉入選擇培養基上進行選擇培養。10～14天後長出的新鮮愈傷組織再轉移到新的選擇培養基上繼續篩選2代(10~14天/代)，然後選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到分化培養基上分化小苗(12hr光照/天)，再生的小苗經生根壯苗後移入網室或人工氣候室盆栽。兩個融合基因構建中，各獲得了20個以上的獨立轉化子，含OsRP5_PRO+GUS融合基因的轉基因植株稱為RPG1、RPG2和RPG20等，而含OsRP5_PRO_SP+GUS融合基因的轉基因植株稱為RPSG1、RPSG2和RPSG20等。每個轉化子含有2-6個轉基因水稻植株。轉基因水稻植株移栽入大田後，絕大多數能正常生長、開花並結實。
所有轉基因植株經PCR和Southern雜交分析證明GUS融合基因已整合進轉基因水稻的基因組中，整合位點從1至4個不等，RPG與RPSG兩類轉基因水稻植株中的整合情況相似。
4、OsRP5信號肽編碼序列與GUS融合基因在轉基因水稻胚乳中的表達在轉基因水稻開花後12天左右，從每一植株上收取40粒左右未成熟種子，提取總RNA，並用與GUS基因編碼區序列特異的反義DNA探針進行Northern雜交分析，結果顯示在兩類轉基因水稻植株未成熟種子中都有較高的GUS基因的轉錄本(圖1)。從雜交信號的強弱判斷，雖然在不同轉化子間的表達量有較大的差異，但從總體情況分析，在RPSG轉基因水稻中，與OsRP5信號肽序列融合的GUS嵌合基因的表達水平明顯高於RPG轉基因水稻種子中GUS嵌合基因(即不含信號肽序列、只含OsRP5啟動子序列的GUS嵌合基因)的轉錄水平，說明有信號肽序列的存在，可提高外源基因的轉錄能力(圖1)。
在轉基因水稻成熟後，收取成熟種子，從其胚乳中提取種子總蛋白，用抗GUS的特異抗體進行Western雜交分析，結果也顯示在兩類轉基因水稻成熟種子中都有GUS蛋白的積累(圖1)。與Northern雜交的結果相類似，在不同轉基因水稻種子中GUS蛋白的表達量有所不同，但從總體趨勢分析，在RPSG轉基因水稻中GUS蛋白的積累量明顯高於RPG轉基因水稻種子中的(圖2)。
OsRP5基因ATG上遊的啟動子序列可引導外源基因在轉基因水稻胚乳中高表達，當在GUS基因編碼區前加上其信號肽編碼序列時，不僅可明顯促進GUS融合基因的轉錄效率，而且可使最終的蛋白產物表害量也明顯增多。對Northern和Western雜交中各雜交信號進行掃描定量比較分析，在RPSG轉基因水稻種子中GUS蛋白的表達量比RPG轉基因水稻種子中的要高5-10倍。
權利要求
1.一種提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法，其特徵是將OsRP5基因信號肽編碼序列與異源重組蛋白基因編碼序列連接在一起構建成融合蛋白基因，融合蛋白基因再與種子特異性表達啟動子連接並克隆到植物的載體上，轉化進入植物細胞中，從該轉化細胞再生出植株，結實生產種子，在該轉基因植物種子中表達有目標重組蛋白，採用Northern blot和Western blot技術檢測異源重組蛋白在轉基因植物種子中的表達量。
2.根據權利要求1所述的一種提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法，其特徵是所述的信號肽編碼序列有57位鹼基的核酸，該核酸編碼水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信號肽，共19個胺基酸殘基。
3.根據權利要求2所述的一種提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法，其特徵是所述的核酸具有的核苷酸序列Sequence nameOsRP5_SP，水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5信號肽編碼序列Length57bpTypeDNA CDSSource水稻(Oryza sativa)atg aag atc att ttc gta ttt gct ctc cttMet Arg Ile Ile Phe Val Phe Ala Leu Leugct att gtt gca tgc aac gct tct gcaAla Ile Val Ala Cys Asn Ala Ser Ala。
4.根據權利要求1和3所述的轉基因植物包括轉基因植物細胞或將轉化的植物細胞培育成植株，以及由這些轉基因植株的有性或無性繁殖的後代。
5.根據權利要求1所述的重組蛋白可以包括任何在生產上的有應用價值的蛋白或酶，編碼該蛋白的基因可以來自植物、人、動物或微生物。
全文摘要
本發明公開了一種水稻貯藏蛋白的信號肽編碼序列，以及利用該序列提高異源重組蛋白在轉基因植物種子中表達量的方法。該序列來自於水稻醇溶蛋白家族的成員之一OsRP5基因，包含SEQ ID NO.1的序列共有57位鹼基的核酸，該核酸編碼水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信號肽，共19個胺基酸殘基。藉助於包含SEQ ID NO.1序列的OsRP5信號肽編碼序列，將異源重組蛋白編碼序列與其構建成融合基因，並導入植物中，可以顯著地提高目標蛋白在轉基因植物種子中的表達量。
文檔編號C12N15/82GK1693469SQ20051003904
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月21日 優先權日2005年4月21日
發明者劉巧泉, 王紅梅, 辛世文, 顧銘洪 申請人:揚州大學