基因工程浮萍的製作方法

2023-09-14 13:36:10

專利名稱：基因工程浮萍的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於轉化浮萍的方法和組合物，具體涉及利用彈道轟擊和農桿菌的轉化方法。
背景技術：
浮萍是單子葉植物浮萍科(Lemnaceae)僅有的成員。4個屬和34個種均是小的、自由漂浮的淡水植物，其地理範圍跨越整個地球。Landolt，Biosystematic Investigation on the Family of DuckweedsThefamily of Lemnaceae-A Monograph Study.Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986)。儘管是已知的形態最小的植物，但大多數浮萍物種具有大得多的植物的所有組織和器官，包括根、莖、花、種子和葉。已經廣泛研究了浮萍物種，有大量文獻詳細說明它們的生態學、分類學、生活周期、代謝、病蟲害易感性、生殖生物學、遺傳結構和細胞生物學。Hillman，Bot.Review 27，221(1971)；Landolt，Biosystematic Investigation on the Family of DuckweedsThe family ofLemnaceae-A Monograph Study.Geobatanischen Institut ETH，StiftungRubel，Zurich(1986)。
浮萍的生長習性對於微生物培養方法是理想的。這種植物容易通過新葉的營養出芽而快速增殖，其肉眼可見的方式與酵母中的無性繁殖相似。浮萍通過從分生細胞營養出芽而增殖。所述分生組織區小，發現在葉的下表面上。分生組織細胞位於兩個袋中，葉中脈每端各一個袋。這個小的中脈區也是根起源和產生莖的位點，它將每片葉連接至其母葉。分生組織袋受一個組織瓣的保護。交替從這些袋中出芽。倍增時間隨物種而變，短至20-24小時。Landolt，Ber.Schweiz.Bot.Ges.67，271(1957)；Chang等，Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24，19(1977)；Datko和Mudd.，Plant Physiol.65，16(1980)；Venkataraman等，Z.Pflanzenphysiol.62，316(1970)。
浮萍的密集培養導致每單位時間最高速率的生物量的積累(Landolt和Kandeler，The family of Lemnaceae-A Monographic Study.第2卷Phytochmistry，Physiology，Application，Bibliography，Veroffentlichungen des Geobatanischen Institutes ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986)，乾重積累範圍為鮮重的6-10％(Tillerg等，Physiol.Plant.46，5，(1979)；Landolt，Ber.Schweiz.Bot.Ges.67，271(1957)；Stomp，未發表的數據)。已經報導，在不同條件下生長的一些浮萍物種的蛋白含量範圍為15-45％乾重(Chang等，Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24，19(1977)；Chang和Chui，Z.Pflanzenphysiol.89，91(1978)；Porath等，Aquatic Botany 7，272(1 979)；Appenroth等，Biochem.Physiol.Pflanz.177，251 (1982))。採用這些數值，每升培養基的浮萍蛋白生產水萍與酵母基因表達系統的數量級相同。迄今為止，尚未對於特定浮萍品系的最大生長和最大蛋白含量進行培養基組分和培養條件的系統優化。
浮萍的有性繁殖受培養基組分和培養條件的控制，包括光周期和培養密度。對於某些物種，花的誘導是常規實驗方法。植物通常自花授粉，在實驗室中，可以通過溫和振蕩培養物完成自交。通過該方法，已經法開發了Lemma gibba自交系。已經鑑定了自發突變(Slovin和Cohen，Plant Physiol.86，522(1988))，已經用化學誘變和γ射線誘變(採用EMS或NMU)，產生具有特定特徵的突變體。L.gobba的遠交是很慢的，但可以通過受控的人工授粉來進行。浮萍的基因組大小為0.25-1.63pg DNA/2C不等，染色體數範圍為20-80條，在整個浮萍屬平均約為40條(Landolt，Biosystematic Investigation on the Family ofDuckweedsThe family of Lemnaceae-A Monograph Study.Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986))。估計倍性水平範圍為2-12(出處同上)。已經用次級產物-同工酶和DNA序列，研究了浮萍屬內的遺傳多樣性。McClure和Alston，Nature 4916，311(1964)；McClure和Alston，Amer.J.Bot.53，849(1966)；Vasseur等，Pl.Syst.Evol.177，139(1991)；Crawford和Landolt，Syst.Bot.10，389(1993)。
因此，上述特性使得浮萍成為開發有效的基於植物的基因表達系統的理想選擇。
發明概述本發明涉及用於有效轉化浮萍的方法和組合物。所述方法涉及使用彈道轟擊、農桿菌或電穿孔來穩定地將目的核苷酸序列引入轉化的浮萍植株中並將其表達。以該方式，可以將任何目的基因或核酸引入浮萍植株中。也提供轉化的浮萍細胞、組織、植株和種子。
作為第一方面，本發明提供用目的核苷酸序列轉化浮萍的方法，其中所述核苷酸序列包含至少一種含基因的的表達盒，所述基因提供對選擇劑的抗性，所述方法包括以下步驟(a)提供浮萍組織靶，所述浮萍組織的細胞包括細胞壁；和(b)以足以刺入細胞壁的速度將所述核苷酸序列發射入浮萍組織靶，並在該組織的細胞中留存所述核苷酸序列，由此產生轉化的組織，其中所述核苷酸序列由微彈攜帶；並且其中通過將所述微彈發射到該組織，將所述核苷酸序列發射到該組織。
作為第二方面，本發明提供用目的核苷酸序列轉化浮萍的方法，該方法包括以下步驟(a)將浮萍植物組織用農桿菌接種，所述農桿菌包含一個包含所述核苷酸序列的載體，其中所述核苷酸序列包含至少一個表達盒，該表達盒含有提供對選擇劑抗性的基因；和(b)將該組織與該農桿菌共同培育，以產生轉化的組織。
作為第三方面，本發明提供通過電穿孔轉化浮萍的方法。
作為第四方面本發明通過上述方法提供轉化的浮萍植株和轉化的浮萍組織培養物。
作為第五方面，本發明提供轉化的浮萍植株和採用轉化的浮萍植株生產重組蛋白或肽的方法。
浮萍提供理想的基於植物的基因表達系統。浮萍基因表達系統提供可用於許多研究和商業應用的關鍵技術。對於植物分子生物學研究，總體上說，可以以酵母那樣的實驗室便利操作的分化的植物系統，提供分析所分離基因的發育和生理學作用的非常快速的系統。為此，植物分子生物學家使用諸如菸草和擬南芥屬(Abrabidopsis)的模型植物。這些植物需要用於生長的溫室或大田設備(對於植物分子生物學家通常難以獲得)。替代的基因表達系統基於微生物或細胞培養物，其中喪失了組織和發育調節的基因表達效應。異源基因表達系統也需要在插入之前重新構建目的基因，這是昂貴並且費時的方法。浮萍系統克服了這兩個問題，並且在實驗室環境中非常易於生長和維持。如果希望收穫所表達的蛋白或肽(或藉此產生的分子)，可以通過本領域已知的任何合適的技術(諸如機械研磨或裂解細胞)來完成這一點。
對於工業生產有價值的蛋白，基於浮萍的系統具有優於現有微生物或細胞培養系統的許多優點。在哺乳動物蛋白生產領域中，植株表達出與哺乳動物細胞相似的翻譯後加工，克服了與微生物細胞生產哺乳動物蛋白有關的一個主要問題。浮萍的生產也較哺乳動物細胞培養物便宜得多。其它人已經表明(Hiatt，Nature 334，469(1990))，植物系統具有裝配多亞基蛋白的能力，這是微生物系統通常缺乏的能力。植物生產治療蛋白也限制了來自在哺乳動物細胞培養和微生物系統中生產的汙染物質(包括動物病毒)的風險。汙染物是治療蛋白生產中主要關心的問題。與例如大豆和菸草的其它建議的植物生產系統不同，浮萍可以在發酵罐/生物反應器中生長，使得非常易於將該系統整合進入現有的蛋白生產工業結構之中。
作為較低成本的工業用酶和小分子的生產平臺，浮萍提供的優點在於，生產易於擴大至幾乎任何量，因為它可以採用富含營養物的廢水在大田條件下生長。在廢水中生長的基因工程浮萍系統可以產生有價值的產物，而同時淨化廢水用於重新使用。這種系統將淨資本的損失(排放廢水的治理)轉為具有積極的經濟平衡的化學生產系統或酶生產系統。浮萍優於大田作物中化學合成的優點在於，生產不需要因世界日益增加的人口而提高食品產量所需的耕地或灌溉用水。
在以下本發明的描述中更詳細地公開本發明的這些方面和其它方面。
附圖簡述

圖1顯示了未轉化的浮萍DNA和D系的的轉化浮萍DNA的DNA雜交產生的放射自顯影照片，有一個來自pBI121的含GUS基因的放射標記的3.2kb片段。道1)分離的未消化的pBI121 DNA。預期的主帶為12.8kb。較低分子量的條帶可能代表超螺旋質粒。道2)HindIII消化的pBI121 DNA。該消化使該質粒線性化，顯示出預期的12.8kb的條帶。較低分子量的條帶表明不完全的消化。道3)用HindIII和EcoRI消化的pBI121 DNA。消化是不完全的，但產生預期的條帶12.8kb(不完全消化物的左邊)、約9kb的條帶和弱的超螺旋條帶。在這種曝光中3.2kb條帶不產生可見的雜交。道4)來自未轉化浮萍的DNA，相當於產生預期的9kb和3.2kb的條帶、1拷貝雙重消化的pBI121 DNA。道5)未轉化的浮萍DNA。道6)來自轉化浮萍D系的未消化的DNA。道7)來自轉化浮萍D系的HindIII消化的DNA。道8)來自轉化浮萍D系的HindIII和EcoRI消化的DNA。
發明詳述本發明涉及轉化浮萍的方法。在優選的實施方案中，所述方法利用彈道轟擊或農桿菌，來穩定地轉化所述浮萍細胞。或者，所述方法使用電穿孔來轉化浮萍。發現本發明的方法和轉化植物可用作具有許多酵母的優點的基於植物的基因表達系統。
就本發明人所知，先前沒有穩定的浮萍基因轉移的報導，也沒有轉化浮萍植株再生的報導。在本發明的研究中，使用兩種策略來生產轉基因浮萍植株(1)通過將外源DNA直接轉移和插入分生葉細胞中，然後無性繁殖並自交，以產生轉基因浮萍(一種植物到植物系統)，和(2)轉化未分化的愈傷組織細胞，然後選擇增生的愈傷組織，並進行葉再生(一種愈傷組織到植物的系統)。Chang研究小組(Chang和Chui，Bot.Bull.Academia Sinica 17，106(1976)；Chang和Chui，Z.Pflanzenphysiol.Bd.89.S，91(1978))和Frick(Frick，J.Plant Physiology137，397(1991))早先已經分別報導了從L.gibba和L.minor產生愈傷組織的有限的組織培養系統。本研究已經通過開發再生葉和組構化的愈傷組織系統，顯著擴展了該領域的工作。
最好是，本發明利用兩種系統之一穩定轉化浮萍採用微彈攻擊的彈道轉化或農桿菌介導的轉化。儘管因為浮萍是單子葉植物，預期它們難以被農桿菌轉化，但我們意外地發現可以用農桿菌轉化浮萍。按照本發明的轉化的浮萍植株也可以通過電穿孔產生。參見例如Dekeyser等，Plant Cell 2，591(1990))；D』Halluin等，Plant Cell 4，1495(1992)；D』Halluin等的美國專利第5,712,135號。電穿孔的一個優點是，包括人造染色體在內的大片段DNA可以通過該方法轉化入浮萍。可以按照本發明轉換任何合適的浮萍細胞或組織類型。例如，可以將核酸引入組織培養物的浮萍細胞中。或者，浮萍植株小及其水生生長習性允許將核酸引入完整胚、葉、根或其它組構化組織(諸如分生組織)的浮萍細胞中。作為另一種選擇方法，可以將核酸引入浮萍愈傷組織中。
最好是，通過要求保護的方法產生的轉化浮萍植株表現出正常的形態，並且通過有性繁殖是可育的。最好是，本發明的轉化植株含有單拷貝的所轉移的核酸，所述所轉移的核酸中沒有顯著的重排。也優選的浮萍植株是，其中所轉移的核酸以低拷貝數存在(即每個轉化的細胞的該核酸不多於5個拷貝，或者不多於3個拷貝，作為另一選擇方法，少於3個拷貝)。
本文所用的術語「浮萍」是指浮萍科的成員。已知有如下4個屬和34個種的浮萍浮萍屬(Lemna)(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis，L.gibba，L.japonica，青萍(L.minor)，L.miniscula，L.obscura，L.perpusilla，L.tenera，L.trisulca，L.turionifera，L.valdiviana)；紫萍屬(Spirodela)(S.intermedia，紫萍(S.polyrrhiza)，S.punctata)；無根萍屬(Wolffia)(Wa.angusta，無根萍(Wa.arrhiza)，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglecta)和Wloffiella(Wl.caudata，Wl.denticulata，Wl.gladiata，Wl.hyalina，Wl.lingulata，Wl.repunda，Wl.rotunda和Wl.neotropica)。浮萍科的任何其它屬或種(如果存在)也是本發明的方面。優選Lemna gibba、青萍和Lemna miniscula，最優選青萍和Lemna mibiscula。可以採用Landolt (BiosystematicInvestigation on the Family of DuckweedsThe Family of Lemnaceae-A.Monograph Study.Geobatanischen Institue ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986))所述的分類方案將浮萍屬物種分類。
正如本領域技術人員明顯看出的，既然已經提供了浮萍的有效轉化，則可以將任何目的核酸用於本發明方法中。例如，可以工程改造浮萍植株，以表達抗病性和抗蟲基因、提供營養價值的基因、抗真菌、抗細菌或抗病毒基因等。或者，可以採用按照本發明的轉化浮萍，表達治療(例如獸醫用或醫用)或免疫原性(例如用於疫苗接種)肽和蛋白。
同樣，該方法可以用來轉移任何控制基因表達的核酸。例如，待轉移的核酸可以編碼反義寡核苷酸。或者，可以用一種或多種基因轉化浮萍，以複製用於化學合成的酶途徑(例如用於塑料合成)或其它工業生產(例如角蛋白酶)。所述核酸可以源自浮萍或另一生物體(即異源的).此外，可以從原核細胞或真核細胞(例如細菌、真菌、酵母、病毒、植物、哺乳動物)獲得目的核酸，或可以全合成或部分合成該核酸序列。在特優選的實施方案中，該核酸編碼分泌蛋白或肽。
優選在轉化浮萍中待表達的轉移核酸編碼蛋白激素、生長因子或細胞因子，更優選的是，編碼胰島素、生長激素(特別是人生長激素)和α-幹擾素。或者，也優選該核酸表達β-葡糖腦苷脂酶。
也優選的核酸編碼一些肽或蛋白，所述肽或蛋白因成本或邏輯的限制或這兩種原因，用現有的基因表達系統不能有效地工業生產。例如，某些蛋白不能在哺乳動物系統中表達，因為該蛋白幹擾細胞的生存力、細胞增殖、細胞分化或在哺乳動物細胞中的蛋白裝配。這類蛋白包括(但不限於)成視網膜瘤蛋白、p53、制管張素和leptin。本發明可以有利地用來生產哺乳動物調節蛋白；已知高等植物和哺乳動物之間的進化距離大，所以這些蛋白不可能干擾浮萍的調節過程。轉基因浮萍也可以用來生產大量的蛋白，諸如血清白蛋白(特別是人血清白蛋白)、血紅蛋白和膠原蛋白，這些大量的蛋白挑戰現有表達系統的生產能力。
最後，如以下更詳細描述的，可以將高等植物系統工程改造，以比哺乳動物系統更容易得多地產生(例如合成、表達、裝配)生物活性多體蛋白(例如單克隆抗體、血紅蛋白、p450氧化酶和膠原蛋白等)。本領域技術人員會認識到，術語「生物活性的」包括與天然蛋白相比其生物活性被改變(例如被抑制的或增強的)的多體蛋白，只要該蛋白具有足夠的目的活性，以用於工業生產或化學加工中。或作為治療劑、疫苗或診斷試劑。
用於在浮萍中生產生物活性多體蛋白的一個典型方法，使用含有編碼所有多肽亞基的基因的表達載體。參見例如During等(1990)PlantMocular Biology 15281；van Engelen等(1994)Plant Molecular Biology261701。然後，使用任何已知的方法(例如基因槍或農桿菌介導的轉化)將該載體引入浮萍細胞。該方法產生表達裝配該多肽蛋白所需的所有多肽的克隆細胞系。作為一個替代方法，製備編碼每種多肽亞基的獨立的載體構成物。使用每個這些載體，產生單獨的僅表達其中一個必需多肽的轉基因植物的克隆系。然後，使這些基因組植物雜交，創造在單個植株中表達所有必需多肽的子代。參見Hiatt等，(1989)Nature34276；Hiatt等的美國專利第5,202,422號和第5,639,947號。該方法的一個變化形式是製備單個的基因構成物，將來自這些構成物的DNA混合在一起，然後，採用彈道轟擊或農桿菌介導的轉化，最好採用彈道轟擊，將該DNA混合物傳遞入植物細胞中。作為再一變化形式，某些或所有所述載體可以編碼多於一個的該多體蛋白的亞基(即雜交浮萍克隆數少於該多體蛋白亞基數)。最後，在某些情況下，可能最好在一種轉化的浮萍植株中產生少於多體蛋白的全部亞基，或甚至產生單一的蛋白，例如用於工業生產或化學生產或用於診斷、治療或疫苗目的。A.表達盒按照本發明，待轉移的核酸包含於表達盒內。該表達盒包含一個連接至目的核酸或基因的轉錄起始區。這種表達盒提供有多個限制性位點，用於插入在調節區的轉錄調節下控制的一個或多個目的基因(例如一個目的基因，兩個目的基因等)。最好是，該表達盒編碼單個目的基因。在本發明的具體實施方案中，待轉移的核酸含有兩個或兩個以上的表達盒，每個表達盒編碼至少一個目的基因(最好是一個目的基因)。
該轉錄起始區(例如啟動子)對於該宿主可以是天然的或同源的或為外來的或異源的。外來的是指在引入該轉錄起始區的野生型宿主中沒有發現該轉錄起始區。本文使用的「嵌合基因」包括操作性地連接至對於該編碼序列為異源的轉錄起始區的編碼序列。
本領域已知的任何合適的啟動子均可以按照本發明使用(包括細菌、酵母、真菌、昆蟲、哺乳動物和植物的啟動子)。優選植物啟動子，最優選浮萍的啟動子。典型的啟動子包括但不限於花椰菜花葉病毒35S啟動子、冠癭鹼合成酶啟動子(例如nos、mas、ocs等)、遍在蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子、核酮糖二磷酸(RubP)羧化酶小亞基啟動子和醇脫氫酶啟動子。浮萍的RubP羧化酶小亞基啟動子是本領域已知的。Silverthrone等，(1990)Plant Mol.Biol.1549。來自感染植物(最好是浮萍)的病毒的其它啟動子也是合適的，包括但不限於從以下病毒分離出的啟動子芋花葉病毒、小球藻病毒(例如小球藻腺嘌呤甲基轉移酶啟動子；Mitra等，(1994)Plant Molecular Biology 2685)、番茄斑萎病毒、菸草脆裂病毒、菸草壞死病毒、菸草環斑病毒、番茄環斑病毒、黃瓜花葉病毒、花生stump病毒、亞麻花葉病毒等。
最後，可以選擇啟動子，以給出所需水平的調節。例如，在某些情況下，可能最好使用賦予組成型表達的啟動子(例如遍在蛋白啟動子、RubP羧化酶基因家族啟動子和肌動蛋白基因家族啟動子)。或者，在其它情況下，可能最好使用對特定環境刺激(例如熱激基因啟動子、乾旱誘導型基因啟動子、病原體誘導型基因啟動子、傷口誘導型基因啟動子和光/暗誘導型基因啟動子)或植物生產調節劑(例如來自由脫落酸、生長素、細胞分裂素和赤黴酸誘導的啟動子)應答時被激活的啟動子。作為再一選擇方法，可以選擇給出組織特異性表達的啟動子(例如根、葉和花特異性啟動子)。
轉錄盒以5』-3』轉錄方向包括一個轉錄和翻譯起始區、一個目的核苷酸序列和一個在植物中有功能的轉錄和翻譯終止區。本領域已知的任何合適的終止序列均可以按照本發明使用。終止區對於轉錄起始區可以是天然的，可以對於目的核苷酸序列是天然的，或可以得自另一來源。方便的終止區可得自根癌農桿菌的Ti質粒，諸如章魚鹼合成酶和胭脂鹼合成酶的終止區。也參見Guerineau等，Mol.Gen.Genet.262，141(1991)；Proudfoot，Cell 64，671(1991)；Sanfacon等，Genes Dev.5，141(1991)；Mogen等，Plant Cell 2，1261(1990)；Munroe等，Gene 91，151(1990)；Ballas等，Nucleic Acids Res.17，7891(1989)；和Joshi等，Nucleic Acids Res.15，9627(1987)。其它典型的終止序列是豌豆RubP羧化酶小亞基終止序列和花椰菜花葉病毒35S終止序列。其它合適的終止序列對於本領域技術人員是顯而易見的。
或者，可以在本領域已知的任何其它合適的表達盒上提供目的基因。合適時，為在轉化的植物中增強表達，可以優化所述基因。當在本發明中使用哺乳動物、酵母或細菌或雙子葉植物基因時，可以採用單子葉植物或浮萍的優選密碼子合成這些基因，以增強表達。在本領域中可得到合成植物優選基因的方法。參見例如美國專利第5,380,831號；第5,436,391號；和Murray等，Nucleic Acids Res.17，477(1989)；這些文獻通過引用結合到本文中。
該表達盒可以還含有5』前導序列。這類前導序列可以作用以增強翻譯。翻譯前導序列是本領域已知的，包括小核糖核酸病毒前導序列，例如EMCV前導序列(腦炎心肌炎病毒5』非編碼區；Elroy-Stein等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，86，6126(1989))；馬鈴薯Y病毒前導序列，例如TEV前導序列(菸草蝕紋病毒；Alloson等，Virology，154，9(1986))；人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP；Macajak和Sarnow，Nature353，90(1991))；來自亞麻花葉病毒的包膜蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMV RNA 4；Jobling和Gehrke，Nature 325，622(1987))；菸草花葉病毒前導序列(TMV；Gallie，MOLECULAR BIOLOGY OF RNA，237-56(1989))；和玉米缺綠病斑點病毒前導序列(MCMV；Lommel等，Virology 81，382(1991))。也參見Della-Cippa等，Plant Physiology84，965(1987)。已知增強翻譯的其它方法也可以利用，例如內含子等。
可以將目的外源核酸另外與編碼轉運肽的一種核酸序列操作性地連接，所述轉運肽將所編碼的目的肽或蛋白的表達導向特定的細胞區室。將高級植物細胞中蛋白積累導向葉綠體、線粒體、液泡、核和內質網(用於分泌到細胞外)的轉運肽是本領域已知的。最好是，該轉運肽將由外源核酸表達的蛋白導向葉綠體或內質網。對於分泌蛋白的正確加工，需要將蛋白導向內質網的轉運肽。將蛋白表達導向葉綠體(例如採用來自RubP羧化酶小亞基基因的轉運肽)，已經表明導致在該細胞器中非常高濃度的重組蛋白的積累。已經克隆了編碼RubP羧化酶轉運肽的浮萍核酸。Stiekma等，(1983)Nucl.Acids Res.118051-61；也參見例如Herrera-Estrella等的美國專利第5,717,084號和第5,728,925號。已經用豌豆RubP羧化酶小亞基轉運肽序列，在植物中表達哺乳動物基因並將其定向。Herrera-Estrella等的美國專利第5,717,084號和5,728,925號。或者，可以用哺乳動物轉運肽將重組蛋白表達導向例如線粒體和內質網。已經證明，植物細胞識別哺乳動物導向內質網的轉運肽。Hiatt等的美國專利第5,202,422號和第5,639,947號。
該表達盒可以含有一個以上的待轉移並在轉化植物中表達的基因或核酸序列。因此，每種核酸序列將與5』和3』調節序列操作性地連接。或者，可以提供多個表達盒。
一般而言，該表達盒將獎包含一個用於選擇轉化細胞的選擇標記基因。選擇標記基因用來選擇轉化的細胞或組織。選擇標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如編碼新黴素磷酸轉移酶II(NEO)和潮黴素磷酸轉移酶(HPT)的基因以及賦予對除草劑化合物抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼經修飾的對該除草劑不敏感的靶蛋白，或編碼將在植物中在該除草劑作用之前將其降解或解毒的酶。參見DeBlock等，EMBO J.6，2513(1987)；DeBlock等，Plant Physiol.91，691(1989)；Fromm等，BioTechnology 8，833(1990)；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2，603(1990)。例如，採用編碼突變靶酶5』-烯醇丙酮醯(enolpyuvyl)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙醯乳酸合酶(ALS)的基因，已經獲得的對glyphosphate或磺醯脲除草劑的抗性。採用編碼將相應除草劑解毒的膦絲菌素乙醯轉移酶、腈水解酶或2，4-二氯苯氧基乙酸單加氧酶的細菌基因，已經獲得了對草銨膦(glufosinate ammonium)、溴苯腈(boromoxynil)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的抗性。
對於本發明的目的，選擇標記基因包括但不限於編碼以下的基因新黴素磷酸轉移酶II(Fraley等，CRC Critical Reviews in PlantScience 4，1(1986))；氨基氰水合酶(Maier-Greiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4250(1991))；天冬氨酸激酶；二氫吡啶二羧酸合酶(Perl等，BioTechnology 11，715(1993))；bar基因(Toki等，Plant Physiol.100，1503(1992)；Meagher等，Crop Sci.36，1367(1996))；色氨酸脫羧酶(Goddijn等，Plant Mol.Biol.22，907(1993))；新黴素磷酸轉移酶(NEO；Southern等，J.Mol.Appl.Gen.1，327(1982))；潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HYG；Shimizu等，Mol.Cell.Biol.6，1074(1986))；二氫葉酸還原酶(DHFR；Kwok等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol，4552(1986))；膦絲菌素乙醯轉移酶(DeBlock等，EMBO J.6，2513(1987))；2，2-二氯丙酸脫滷素酶(Buchanan-Wollatron等，J.Cell.Biochem.13D，330(1989))；乙醯羥酸合酶(Anderson等的美國專利第4,761,373號；Haughn等，Mol.Gen.Genet.221，266(1988))；5-烯醇丙酮醯-莽草酸-磷酸合酶(aroA；Comai等，Nature 317，741(1985))；滷代芳基腈水解酶(Stalker等的WO 87/04181)；乙醯輔酶A羧化酶(Parker等，Plant Physiol.92，1220(1990))；二氫蝶酸合酶(silI；Guerineau等，Plant Mol.Biol.15，127(1990))；和32kDa光合系統II多肽(psbA；Hirschberg等，Science 222，1346(1983))。
也包括編碼的對以下物質抗性的基因氯黴素(Herrera-Estrella等，EMBO J.2，987(1983))；氨甲蝶呤(Herrera-Estrella等，Nature 303，209(1983)；Meijer等，Plant Mol.Biol.16，807(1991))；潮黴素(Waldron等，Plant Mol.Biol.5，103(1985)；Zhijian等，Plant Science 108，219(1995)；Meijer等，Plant Mol.Bio.16，807(1991))；鏈黴素(Jones等，Mol.Gen.Genet.210，86(1987))；壯觀黴素(Bretagne-Sagnard等，TransgenicRes.5，131(1996))；博來黴素(Hille等，Plant Mol.Biol.7，171(1986))；氨磺醯(Guerineau等，Plant Mol.Bio.15，127(1990)；溴苯腈(Stalker等，Science 242，419(1988))；2，4-D(Streber等，Bio/Technology 7，811(1989))；膦絲菌素(DeBlock等，EMBO.J.6，2513(1987))；壯觀黴素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research 5，131(1996))。
bar基因賦予對草銨膦型除草劑的除草劑抗性，所述除草劑諸如膦絲菌素(PPT)或雙丙氨膦等。如上所述，可以用於載體構成物中的其它選擇標記包括但不限於也賦予雙丙氨膦和膦絲菌素抗性的pat基因、賦予咪唑啉酮抗性的ALS基因、賦予潮黴素抗性的HPH或HYG基因、賦予草甘膦抗性的EPSP合酶基因、賦予對Hc-毒素抗性的Hml基因和本領域常規使用和已知的其它選擇劑。一般參見Yarranton，Curr.Opin.Biotech.3，506(1992)；Chistopherson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6314(1992)；Yao等，Cell 71，63(1992)；Reznikoff，Mol.Microbiol.6，2419(1992)；BARKLEY等，THE OPERON 177-220(1980)；Hu等，Cell 48，555(1987)；Brown等，Cell 49，603(1987)；Figge等，Cell 52，713(1988)；Deuschle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，5400(1989)；Fuerst等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，2549(1989)；Deuschle等，Science 248，480(1990)；Labow等，Mol.Cell.Biol.10，3343(1990)；Zambretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，3952(1992)；Baim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，5072(1991)；Wyborski等，Nuc.Acids Res.19，4647(1991)；Hillenand-Wissman，Topics in Mol And Struc.Biol.10，143(1989)；Degenkolb等，Antimicrob.Agents Chemother.35，1591(1991)；Kleinschnidt等，Biochemistry 27，1094(1988)；Gatz等，Plant J.2，397(1992)；Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5547(1992)；Oliva等，Antimicrob.Agents Chemother.36，913(1992)；HLAVKA等，HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY 78(1985)；和Gill等，Nature 334，721(1988)。這類說明書通過引用結合到本文中。
以上列出的選擇標記基因不意味著為限制性的。任何選擇標記基因均可以用於本發明中。
合適時，可以合成選擇標記基因和其它待轉移的目的基因和核酸，以優化在浮萍中的表達。也就是說，可以修飾所述基因的編碼序列，以增強在浮萍中的表達。設計合成的核酸，以在轉化組織和植物中較高水平地表達。優化的選擇標記基因的使用可能導致較高的轉化效率。
本領域中可得到基因合成優化的方法。可以優化核苷酸序列，以在浮萍中表達，或者可以將其修飾，以優化在單子葉植物中的表達。可以根據在浮萍中表達的蛋白中的最高頻率的密碼子，確定植物的優選密碼子。人們認識到，已經優化用於浮萍和其它單子葉植物中表達的基因可以用於本發明方法中。參見例如EP 0 359 472、EP 0385962、WO 91/16432；Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，3324(1991)和Murray等，Nuc.Acids Res.17，477(1989)等，所述文獻通過引用結合到本文中。人們還認識到，可以優化或合成該基因序列的全部或部分。換句話說，也可以採用全優化的或部分優化的序列。
已知其它序列修飾增強在細胞宿主中的表達。這些序列修飾包括消除編碼假的多腺苷酸化信號的序列、外顯子-內含子剪接位點信號、轉座子樣重複序列和其它這類充分特徵鑑定的、可能對基因表達有害的序列。可以將該序列的G-C含量調節至給定細胞宿主的平均水平，該水平根據在該宿主細胞中表達的已知基因計算。可能時，修飾該序列，以避免預定的髮夾二級mRNA結構。B.靶組織和愈傷組織本發明的方法可用來轉化浮萍植株的細胞，最好是葉細胞和分生細胞。這類細胞也包括來源於浮萍植株的任何組織的愈傷組織。用於起始愈傷組織的組織最好是分生組織。或者，該愈傷組織可以來源於任何其它葉細胞，或主要來源於能夠形成愈傷組織的任何其它浮萍組織。換句話說，能夠進行後續克隆繁殖的任何組織，無論它是通過器官發生還是胚胎發生進行克隆繁殖，均可以用來按照本發明轉化浮萍。本文所用的術語「器官發生」是指由分生中心(meristematic center)順序發育葉和根的過程。本文所用的術語「胚胎發生」是指葉和根一起以協同方式(不是順序地)發育，無論它來自體細胞還是來自配子。
該方法也可以用來轉化細胞懸液。這類細胞懸液可以由任何浮萍組織形成。
所述浮萍產生三類愈傷組織(a)緻密的半組構化(organized)的愈傷組織(命名為I型)；(b)脆性的白色未分化愈傷組織(命名為II型)；和(c)綠色的分化的愈傷組織(命名為III型)。在組織培養中，愈傷組織僅以兩種方式再生植株通過胚胎和通過苗形成(在浮萍中，葉是苗)。愈傷組織誘導的方法是本領域已知的，對於每個浮萍物種和所需類型的愈傷組織，可以優化待使用的具體條件，如在以下實施例中證明的。最好使用I型或III型愈傷組織，更優選使用I型愈傷組織，以按照本發明轉化浮萍。
通過在含有植物生長調節劑(即細胞分裂素和生長素)的培養基中培養浮萍組織，可以誘導愈傷組織。優選用於從浮萍組織誘導愈傷組織的生長素包括2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和萘乙酸(NAA)。優選的生長素濃度為1-30μM，更優選為5-20μM，再更優選為5-10μM。優選的細胞分裂素是苄基腺嘌呤(BA)或噻苯隆(TDZ)。優選的細胞分裂素的濃度為0.1-10μM，更優選為0.5-5μM，再更優選為0.5-1μM。在其它更優選的實施方案中，通過在含有BA或TDZ之一和或者2，4-D或NAA之一的培養基中培養浮萍組織，誘導愈傷組織。一般而言，低濃度的生長素或「弱」生長素(例如吲哚乙酸)促進葉的增殖，而非愈傷組織的形成，而高濃度的生長素或「強」生長素(例如2，4-D)促進愈傷組織形成。優選的愈傷組織形成基礎培養基包括N6培養基(Chu等，Scientia Sinica 18，659(1975))和Murashige和Skoog培養基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15，473(1962))，更優選Murashige和Skoog培養基。一般而言，愈傷組織誘導的頻率是可變的。在這些物種中，培養2-3周時肉眼看不到愈傷組織，在愈傷組織的大小足以用於轉化之前，可能需要4-8周的培養。愈傷組織的誘導最好進行1-10周，更優選進行2-8周，再更優選進行3-5周。對於愈傷組織的生長，優選的培養基如同用於愈傷組織誘導的培養基，但生長素的濃度降低。C.通過彈道攻擊轉化浮萍本發明的一個實施方案是用目的核苷酸序列轉化浮萍，其中該核苷酸序列含有至少一個表達盒，所述表達盒攜帶一種賦予對選擇劑抗性的基因。該核苷酸序列由微彈攜帶。就本發明人所知，先前沒有報導，通過彈道轉化產生穩定轉化的浮萍。
按照本發明的優選實施方案，該彈道轉化法包括以下步驟(a)提供作為靶的浮萍組織；(b)以足以穿刺該組織內細胞的細胞壁並將該核苷酸序列沉積在該組織細胞內的速率，將攜帶該核苷酸序列的微彈發射到該浮萍組織，藉此提供轉化的組織。在本發明的具體實施方案中，該方法還包括用選擇劑培養轉化的組織，如下所述。在再一可選擇的實施方案中，進行選擇步驟後，進行從該轉化組織再生轉化浮萍的步驟。如下所述，該技術可以用作為單獨的沉澱(溼或凍幹)的核苷酸序列實施，以取代含有該核苷酸序列的水溶液。
任何彈道細胞轉化裝置均可以用於實施本發明。Sandford等(Particulate Science and Technology 5，27(1988))、Klein等(Nature 327，70(1987))和在EP 0 270 356中公開了典型的裝置。這類裝置已經用來轉化玉米細胞(Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，4305(1988))、大豆愈傷組織(Christou等，Plant Physiol.87，671(1988)、McCabe等，BioTechnology 6，923(1988))、酵母線粒體(Johnston等，Science 240，1538(1988))和衣藻屬(Chlamydomonas)葉綠體(Boynton等，Science240，1534(1988))。
在本文提出的研究中，使用DuPont生產的市售氦基因槍(PDS-100/He)。或者，可以利用如Klein等描述配置的裝置(Nature 70，327(1987))。該裝置包括一個轟擊室，該轟擊室被高度可調的終止板(stopping plate)分為兩個獨立的區室，加速室安裝於轟擊室的上面。宏觀彈因槍粉電荷而被沿著加速室發射到終止板。終止板中有一形成的鏜孔(bore hole)，其直徑小於微彈的直徑。宏觀彈(macroprojectile)攜帶微彈，將宏觀彈瞄準鏜孔，並對著鏜孔射出。當宏觀彈被終止板終止時，微彈通過鏜孔發射。將靶組織定位在轟擊室中，使得通過鏜孔發射的微彈透過靶組織細胞的細胞壁，並將其上攜帶的目的核苷酸序列沉積在靶組織細胞中。轟擊室在使用之前部分抽空，以防止大氣摩擦力減慢微彈。該室僅被部分抽空，使得靶組織在轟擊期間不被乾燥。約400至約800毫米汞的真空是合適的。
在可選擇的實施方案中，不用微彈而達到彈道轉化。例如，可以由宏觀彈攜帶含有作為沉澱的目的核苷酸序列的水溶液(例如通過將水溶液直接置於宏觀彈的板接觸端，而不用微彈，其中通過表面張力保持水溶液)。將該溶液單獨發射到植物組織靶上(例如通過將宏觀彈以上述相同方式沿加速管發射)。其它方法包括將該核酸沉澱本身(「溼」沉澱)或冷凍乾燥的核苷酸沉澱直接置於宏觀彈的板接觸端，而不用微彈。在沒有微彈時，據信該核苷酸序列必須或者以大於由微彈攜帶所需的速度發射到組織靶上，或者使得該核苷酸序列移動較短的距離而到達靶組織(或這兩者)。
目前最好是在微彈上攜帶該核苷酸序列。已知該粒子的速度和該粒子必須移動的距離，所以可以由具有足夠密度和粘結性的任何材料形成微彈，以發射透過細胞壁，用於製造微彈的材料的非限制性實例包括金屬、玻璃、二氧化矽、冰、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和碳化合物(例如石墨、鑽石)。目前優選金屬粒子。合適金屬的非限制性實例包括鎢、金和銥。粒子的大小應該足夠小，以避免過度破壞它們在靶組織中接觸到的細胞，而粒子的大小應該足夠大，以提供透過靶組織中目的細胞所需的慣性。直徑範圍為約0.5微米至約3微米的粒子是合適的。粒子不必是球形，因為粒子表面不規則可以增加其DNA的容納量。
可以通過沉澱將該核苷酸序列固定在該粒子上。所用的精確的沉澱參數如本領域已知的，將根據諸如所用的粒子加速方法而變化。載體粒子可以可任選地用諸如聚賴氨酸的包囊劑包被，以提高固定其上的核苷酸序列的穩定性，如在EP 0 270 356(第8欄)中所述。
在彈道轟擊靶組織後，如以下E小節所述可以選擇轉化子和再生轉化的浮萍植株。D.農桿菌介導的轉化在本發明的一個實施方案中，用根癌農桿菌或毛根農桿菌，最好用根癌農桿菌，轉化浮萍。農桿菌介導的基因轉移利用根癌農桿菌或毛根農桿菌將DNA轉移入植物染色體中的天然能力。農桿菌是一種植物病原體，它將分別在根癌農桿菌或毛根農桿菌的Ti質粒和Ri質粒中稱為T-DNA的區內編碼的一組基因轉移入植物細胞中。Ti質粒轉移的典型結果是稱為根癌的腫瘤生長，其中T-DNA穩定整合入宿主染色體中。Ri質粒整合入宿主染色體DNA，產生稱為「髮根病」的疾病。通過在T-DNA中取出該基因，而不喪失DNA轉移和整合，可以除去在宿主植物中引起疾病的能力。將待轉移的DNA連接至限定整合的T-DNA終點的邊界序列。
利用工程改造的農桿菌菌株進行的基因轉移，已經成為許多雙子葉作物的常規技術。然而，在使用農桿菌轉化單子葉植物中，特別是在穀類植物中，已經經歷了相當大的困難。就本發明人所知，迄今沒有報導利用農桿菌介導的轉化產生穩定轉化的浮萍。
儘管以下的討論集中於使用根癌農桿菌以達到浮萍中的基因轉移，但本領域技術人員會認識到，這一討論同樣適用於毛根農桿菌。與根癌農桿菌的開發相似，已經開發了用毛根農桿菌的轉化，並且已經成功地用來轉化例如亞麻、龍葵(Solanum nigrum L.)和白楊。Ryals等的美國專利第5,777,200號。如Burgess等的美國專利第5,773,693號所述，最好使用解除武裝的根癌農桿菌菌株(如下所述)，然而，可以使用野生型毛根農桿菌。一個說明性的毛根農桿菌的菌株是菌株15834。
修飾用於本發明方法中的農桿菌菌株，以使其含有一種或多種目的基因、或在轉化細胞中待表達的核酸。將待轉移的核酸加入T區，其側翼為T-DNA邊界序列。本領域已知多種農桿菌菌株，特別是用於雙子葉植物轉化的菌株。這種農桿菌可以用於本發明方法中。參見例如Hooykass，Plant Mol.Biol.13，327(1989)；Smith等，Crop Science35，301(1995)；Chilton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，3119(1993)；Mollony等，Monograph Theor.Appl.Genet NY 19，148(1993)；Ishida等，Nature Biotechnol.14，745(1996)；和Komari等，The Plant Journal10，165(1996)，這些文獻的說明書通過引用結合到本文中。
除T區外，Ti(或Ri)質粒還含有一個vir區。vir區對於有效的轉化的重要的，並且看來是物種特異性的。已經開發了雙載體系統，其中受操作的解除武裝、攜帶外源DNA的T-DNA和vir功能存在於不同的質粒上。以該方式，在一個在大腸桿菌中複製的小質粒中，構建包含外源DNA(待轉移的核酸)的修飾的T-DNA區。該質粒以三親本交配接合轉移或通過電穿孔，轉移入含有毒性基因序列的匹配質粒的根癌農桿菌中。vir功能以反式供應，以將T-DNA轉移入植物基因組中。這類雙載體可用來實施本發明。
在本發明的優選實施方案中，C58衍生載體用來轉化根癌農桿菌。或者在其它實施方案中，使用超雙載體。參見例如美國專利第5,591,615號和EP 0 604 662，它們通過引用結合到本文中。已經構建了這種超雙載體，它含有來源於Ti質粒pTiBo542的超毒性區的DNA區(Jin等，J.Bacteriol.169，4417(1987))，所述Ti質粒是表現出極其高轉化效率的超毒性根癌農桿菌A281中含有的(Hood等，Biotechnol.2，702(1984)；Hood等，J.Bacteriol.168，1283(1986)；Komari等，J.Bacteriol.166，88(1986)；Jin等，J.Bacteriol.169，4417(1987)；Komari，Plant Sicence 60，223(1987)；ATCC保藏號為37394。
本領域技術人員已知的典型超雙載體包括pTOK162(日本專利申請(Kokai)第4-222527號、EP 504,869、EP 604,662和美國專利第5,591,616號，這些文獻通過引用結合到本文中)和pTOK233(Komari，Plant Cell Reports 9，303(1990)；Ishida等，Nature Biotechnology 14，745(1996)；這些文獻通過引用結合到本文中)。可以用以上文獻中提出的方法構建其它超雙載體。超雙載體pTOK162能夠在大腸桿菌和根癌農桿菌中複製。另外，該載體含有來自pTiBo542侵入區(virulenceregion)的virB、virC和virG基因。該質粒也含有一個抗生素抗性基因、一個選擇標記基因和待轉化入該植物的目的核酸。待插入浮萍基因組的核酸位於T區兩個邊界序列之間。可以構建具有pTOK162上述特徵的本發明的超雙載體。構建所述超雙載體和用於本發明的其它載體的T區，以具有插入待傳遞的基因的限制性位點。或者，通過利用體內同源重組，可以將待轉化的DNA插入該載體的T-DNA區。參見Herrera-Esterella等，EMBO J.2，987(1983)；Horch等，Science 223，496(1984)。這種同源重組依賴於這樣一個事實該超雙載體具有一個與pBR322或其它相似質粒一個區同源的區。因此，當兩種質粒在一起時，所需基因通過同源區的遺傳重組，插入該超雙載體。
任何適用於轉化浮萍的載體均可以按照本發明使用。例如，可以由缺乏vir區的雙載體攜帶異源目的核酸序列和側翼的T-DNA。然後，在解除武裝的Ti質粒或在第二雙質粒上提供vir區。作為另一選擇方法，通過新T-DNA取代原始Ti質粒T-DNA的雙重組事件，可以將異源核酸序列和T-DNA邊界序列置於Ti質粒的T-DNA位點。vir區可以由該Ti質粒供應，或在一個雙質粒上供應。作為再一選擇方法，可以如Schilperoort等的美國專利第4,940,838號所述，將異源核酸序列和側翼的T-DNA整合入細菌染色體中，vir區則可以在一個Ti質粒或一個雙質粒上供應。
本發明的農桿菌介導的轉化法可以被認為包括幾個步驟。基本步驟包括感染步驟和協同培養步驟。在某些實施方案中，在這些步驟後進行一個選擇步驟，在其它實施方案中，在這些步驟後進行一個選擇和一個再生步驟。
在感染步驟之前，可以包括一個可選的預培養步驟。該預培養步驟包括在感染步驟之前，在合適的培養基中培養愈傷組織、葉或其它靶組織。預培養的時間可以為約1-21天不等，最好為7-14天。發現這種預培養步驟防止玉米培養物轉化。參見例如EP 0 672 752。
在感染步驟中，使待轉化的細胞暴露於農桿菌。將細胞與農桿菌接觸，通常在液體培養基中接觸。如上所述，該農桿菌已被修飾以含有一個目的基因或核酸。將該核酸插入該載體的T-DNA區。本領域技術人員熟知用於本發明的一般分子生物學技術。參見例如SAMBROOKL等，MOLECULAR CLONGINGA LABORATORYMANUAL(1989)。
含有目的質粒的農桿菌最好在農桿菌主平板上維持，於約-80℃冷凍貯存。主平板可以用來接種瓊脂平板，以獲得農桿菌，然後將農桿菌懸浮於培養基中，用於感染過程。或者，在轉化之前，來自主平板的細菌可以用來接種液體培養物，該液體培養物在轉化之前生長至對數期。
用於感染步驟和協同培養步驟的農桿菌的濃度，可以影響轉化效率。同樣，非常高濃度的農桿菌可能損害待轉化組織，並導致愈傷組織應答降低。因此，用於本發明方法中的農桿菌的濃度，可以根據所用的農桿菌菌株、待轉化的組織、待轉化的浮萍物種等而變化。為了優化具體浮萍物種或組織的轉化方案，可以用不同濃度的農桿菌接種待轉化的組織。同樣，可以評估各種農桿菌濃度的標記基因表達的水平和轉化效率。儘管農桿菌的濃度可以變化，但一般使用的濃度範圍為約1×103cfu/ml至約1×1010cfu/ml，範圍優選為1×103cfu/ml至約1×109cfu/ml，再更優選利用約1×108cfu/ml至約1×109cfu/ml。
一般將待轉化組織加入液體接觸相的農桿菌懸液中，該懸液含有優化轉化效率的濃度的農桿菌。該接觸相促進使待轉化組織與農桿菌懸液的最大接觸。一般在協同培養步驟之前，讓感染進行1-30分鐘，優選進行1-20分鐘，更優選進行2-10分鐘，再更優選進行3-5分鐘。
本領域技術人員會認識到，可以優選所述條件，以達到最高水平的農桿菌感染和轉化。例如，在本發明的優選實施方案中，在感染和協同培養步驟期間，使細胞經受滲透壓(例如0.6M甘露醇)。另外，為了提高轉化效率，可以在含有生長素(諸如IAA)的培養基中培養組織，以促進細胞增殖(即，人們認為農桿菌在有絲分裂期間整合入基因組中)。作為再一選擇方法，可以使用組織創傷、真空壓力或在含有乙醯丁香酮的培養基中培養，以提高轉化效率。
在協同培養步驟中，將該轉化的細胞與農桿菌協同培養。通常，協同培養在固體培養基上進行。可以使用任何合適的培養基，諸如含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養基(Schenk和Hildebrandt，Can.J.Bot.50，199(1972))。最佳協同培養時間隨具體的組織而變化。葉與農桿菌協同培養約2-7天，優選2-5天，更優選3-5天，更優選4天。相比之下，愈傷組織與農桿菌協同培養0.5-4天，更優選1-3天，更優選2天。可以在黑暗中或在減弱的光照條件下進行協同培養，以提高轉化效率。另外，如以上接種步驟所述，可以在含有IAA或乙醯丁香酮的培養基上進行協同培養，以提高轉化效率。最後，在細胞分裂素存在下進行協同培養步驟，細胞分裂素用來增強細胞增殖。
在協同培養步驟後，可以使轉化的組織經過可選的靜息和去汙染步驟。對於靜息/去汙染步驟，將轉化細胞轉移至含有能夠抑制農桿菌生長的抗生素的第二培養基上。在缺乏任何選擇壓力的情況下進行該靜息期，以允許含有該異源核酸的轉化細胞恢復和增殖。加入抗生素以抑制農桿菌的生長。這類抑制農桿菌的抗生素是本領域已知的，包括頭孢噻肟、timetin、萬古黴素、羧苄青黴素等。抗生素的濃度將根據每種抗生素的標準而變化。例如，在固體培養基中，羧苄青黴素的濃度範圍為約50mg/l至約250mg/l，優選約75mg/l至源200mg/l，更優選約100-125mg/l。單子葉植物轉化領域的技術人員會認識到，對於特定的轉化方案可以優化抗生素的濃度，而不用過多的試驗。
優選讓靜息期培養物在黑暗或在減弱的光下靜息，最好在減弱的光下靜息。本領域已知的任何培養基均可以用於靜息期。靜息/去汙染步驟進行的時間可以是抑制農桿菌生長並在選擇之前提高轉化細胞數目所需的時間長度。通常，在選擇步驟之前，靜息/去汙染步驟進行1-6周，優選2-4周，更優選2-3周。在更優選的實施方案中，選擇時間在協同培養後的3周內開始。某些農桿菌菌株的抗生素抗性強於其它菌株。對於抗性較低的菌株，通常通過每5天等將新的去汙染培養基加入愈傷組織中，進行去汙染。對於抗性較強的菌株，可以每隔一天將較強的抗生素(例如萬古黴素)加入愈傷組織中。
在協同培養步驟或靜息/去汙染步驟後，可以按以下E小節中所述選擇轉化子並再生浮萍植株。E.轉化子的選擇和轉化浮萍植株的再生按照本發明轉化浮萍組織或愈傷組織，例如通過彈道轟擊或農桿菌介導的轉化來進行轉化，每種方法分別在C和D小節中更詳細地描述。轉化步驟後，將轉化組織暴露於選擇壓力，以選擇那些接受來自表達盒引入的異源核酸並正在表達該核酸編碼的多肽的細胞。根據含有至少一個選擇標記插入片段的細胞的優先生長，選擇用來選擇轉化子的試劑，所述選擇標記插入片段位於表達盒內並通過彈道轟擊或農桿菌傳遞。
一般而言，進行選擇轉化子(來自任何組織類型或愈傷組織)的條件是本文公開的方法的最重要的方面。轉化過程使細胞經受脅迫，而選擇過程甚至對轉化子有毒。通常，針對這種顧慮，轉化組織最初經受弱選擇，利用低濃度的選擇劑和減弱的光(例如1-5μmol/m2·sec，通過提高該選擇劑的濃度和/或提高光強，以應用的選擇梯度逐漸增加)。如果該組織看上去經受脅迫，則可以完全解除選擇壓力一段時間，然後重新施加選擇壓力。另外，可以給予轉化的組織一段「靜息」時間，如以上在D小節中所述，然後再真正施加任何選擇壓力。選擇培養基一般含有一種簡單的糖，諸如1％-3％的蔗糖，使得細胞不進行光合作用。另外，最初在減弱的光條件下進行選擇，或甚至在完全黑暗中進行選擇，以便將細胞的代謝活性保持在相對低的水平。本領域技術人員會認識到，對於每種浮萍物種或品系和對於待轉化的組織類型，可以優化進行選擇的具體條件，而不用過多的試驗。
對於選擇步驟沒有具體的時間限制。一般而言，進行選擇的時間長度足以殺傷非轉化子，並允許轉化細胞以類似於非轉化細胞的速率進行增殖，以在再生步驟之前產生足夠的愈傷組織(callul)塊。因此，對於以較慢速率增殖的細胞，選擇的時間較長。例如，I型浮萍愈傷組織增殖相對緩慢，在再生之前進行8-10周的選擇。
從轉化細胞和愈傷組織再生某些植株的方法是本領域已知的。參見例如Kamo等，Bot.Gaz.146，37(1985)；West等，The Plant Cell 5，1361(1993)；和Duncan等，Planta 165，322(1985)。對於再生浮萍，推薦幾種這些方法的改進方法。用I型和III型愈傷組織，可以最可靠地獲得轉化和選擇後的葉再生。例如，可以根據淡黃色愈傷組織表面上出現的綠色中心(形成葉的位點)，鑑別I型愈傷組織的再生。通常，在支持愈傷組織增殖的相同培養基條件下不發生浮萍的再生。最好使用貧乏的固體培養基(lean solid medium)(例如水-瓊脂或半強度Schenk和Hildebrandt培養基(含有0.5％蔗糖和0.8％瓊脂))。然而，通常需要在全強度培養基上間斷地短期培養再生浮萍愈傷組織，以維持再生細胞中的營養平衡。在某些情況下，對於緩慢再生的品系或物種，在葉再生之前，該方法可能必須重複數次。通常，不在葉再生培養基中加入植物生長調節劑(因為它們抑制葉的形成)，然而，諸如BA和硫酸腺嘌呤的細胞分裂素，對於某些物種而言可以提高葉的再生。愈傷組織培養物在延長的愈傷組織培養期間不喪失其再生葉的能力。
在再生過程中，本領域已知的任何方法均可以用來證實再生的植株事實上是用所轉移的目的核酸轉化的。例如，組織化學染色、ELISA測定、DNA雜交、RNA雜交、蛋白質雜交、PCR等可以用來檢測愈傷組織和再生植株中所轉移的核酸或蛋白。
由於已經證明浮萍可以用彈道轟擊和農桿菌轉化，因此可以使用對本文所述通用方法的改變方法，以提高效率，或以轉化對轉化可能表現出一定抗拒的品系。影響轉化效率的因素包括浮萍的物種、感染的組織、組織培養的培養基的組成、選擇標記基因、任何上述步驟的時間長度、載體的種類和光/黑暗條件。具體對於農桿菌介導的轉化，根癌農桿菌或毛根農桿菌的濃度和菌株也必須考慮。因此，可以改變這些因素和其它因素，以確定任何特定浮萍物種或品系的最佳轉化方案。人們會認識到，不是每個物種和品系都對轉化條件有同樣反應，對於本文公開的方案可能需要略微不同的修改。然而，通過改變每個變量，對於任何浮萍系均可以得到最佳方案。
提供以下實施例是為了進行說明，而不是為了限制。實施例中所用的「hr」是指小時，「sec」是指秒，「g」是指克，「mg」是指毫克，「1」是指升，「1」是指毫升，「mmol」是指毫摩爾，「mM」是指毫摩爾濃度，「μM」是指微摩爾濃度，「m」是指米，「mm」是指毫米，「BA」是指苄基腺嘌呤，「2，4-D」是指2，4-二氯苯氧基乙酸，「NAA」是指萘乙酸，而「IAA」是指吲哚乙酸。
實施例組織培養該小節提出涉及浮萍愈傷組織製備方法的實驗。許多實施例使用Lemna gibba G3作為浮萍品系，是用來優化培養參數的品系(1)基礎培養基的配製，(2)植物生長調節劑的類型和濃度，和(3)轉移方案。隨著對愈傷組織形成的了解的增加，這適用於其它浮萍物種。浮萍產生三種類型的愈傷組織(a)緻密的半組構化愈傷組織(命名為I型)；(b)脆性的白色未分化的愈傷組織(命名為II型)；和(c)綠色的分化的愈傷組織(命名為III型)。在組織培養中，愈傷組織僅以兩種方式再生植株通過胚胎和通過苗形成(在浮萍中，葉是苗)。以下提出的數據證明可以從所有已知的愈傷組織再生葉的途徑，再生轉化的浮萍植株。
實施例1對於生長素2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和細胞分裂素苄基腺嘌呤(BA)的18種組合，測試其對浮萍物種Lemna gibba G3中愈傷組織誘導的作用。
在實驗之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養基(Hoagland和Snyder，Proc.Amer.Soc.Hort.Sci.30，288(1933))中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備18等份含有3％蔗糖、0.15％ Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂的100ml Murashige和Skoog基礎培養基，其2，4-D的濃度為10、20和50μM，而BA的濃度為0、0.01、0.1、1.0、2.0和10.0μM。所有培養基的pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每100ml注入4個100mm×15mm培養皿中。
使用3個2，4-D濃度×6個BA濃度的全階乘實驗設計(總共18種處理)，每種處理有4個重複測定，每個重複測定1個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將72個平板於23℃培養27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。27天後，將浮萍組織轉移至相同類型的新鮮培養基，再於相同的溫度和光培養條件下繼續培養35天。
以愈傷組織誘導頻率(製備任何愈傷組織的葉數/總葉數)測量的結果顯示出培養62天後三種類型的愈傷組織增生。(1)緻密的白色-黃色愈傷組織鑑定並命名為「I型」。低頻率的葉，即約5％增生該類型的愈傷組織。(2)脆性的白色愈傷組織鑑定並命名為「II型」。20-40％的葉增生該類型的愈傷組織。(3)以其細胞組構化程度歸類的綠色的愈傷組織鑑定並命名為「III型」。所有增生的50％以上的葉在培養期間產生該愈傷組織類型。所有三種類型的愈傷組織均證明，在所有18種2，4-D和BA的組合下以不同的頻率增生。愈傷組織增生在20-50μM的範圍廣泛的2，4-D濃度和0.01-0.1μM的BA濃度內最強烈。
實施例2測試生長素2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和細胞分裂素苄基腺嘌呤(BA)的40種濃度，以更優化該生長素和細胞分裂素濃度，以由Lemnagibba G3的浮萍葉誘導愈傷組織。
在實驗之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備40等份含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂的100ml Murashige和Skoog培養基，其2，4-D的濃度為20、30、40、50、60、70、80、100μM，而BA的濃度為0.01、0.05、0.1、0.5和1.0μM。所有培養基的pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每100ml注入4個100mm×15mm培養皿中。
使用8個2，4-D濃度×5個BA濃度的全階乘實驗設計(總共40種處理)，每種處理有4個重複測定，每個重複測定1個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將平板於23℃培養27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。27天後，將浮萍組織轉移至相同類型的新鮮培養基，再於相同的溫度和光培養條件下繼續培養35天。
培養63天後得到的結果表明，已經增生出三種類型的愈傷組織(1)I型愈傷組織，(2)II型愈傷組織，和(3)III型愈傷組織。數值頻率數據(製備任何愈傷組織的葉數/總葉數)的回歸分析(二次反應曲面)揭示出對於不同類型的愈傷組織誘導的葉反應。II型和III型愈傷組織類型的頻率顯著受2，4-D和BA濃度的影響，然而，I型愈傷組織的頻率僅顯著受2，4-D的影響。沒有具體的2，4-D或BA的濃度證明為最佳的，在範圍廣泛的兩種植物生長調節劑的濃度下都發生愈傷組織誘導。約50％的葉產生III型愈傷組織，約25％的葉產生II型愈傷組織，而低於5％的葉產生I型愈傷組織。
實施例3測試生長素麥草畏和細胞分裂素苄基腺嘌呤(BA)的40種組合，以比較麥草畏相對於2，4-D對於浮萍種Lemna gibba G3的愈傷組織誘導的相對效力。
在實驗之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備40等份含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂的100ml Murashige和Skoog培養基，其麥草畏的濃度為10、20、30、40、50、60、80、100μM，而BA的濃度為0.01、0.05、0.1、0.5和1.0μM。所有培養基的pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每100ml注入4個100mm×15mm培養皿中。
使用8個麥草畏濃度×5個BA濃度的全階乘實驗設計(總共40種處理)，每種處理有4個重複測定，每個重複測定1個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將平板於23℃培養27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。28天後，將浮萍組織轉移至相同類型的新鮮培養基，再於相同的溫度和光培養條件下繼續培養45天。
培養73天後，觀察到三種類型的愈傷組織增生(1)I型愈傷組織，(2)II型愈傷組織，和(3)III型愈傷組織。總之，愈傷組織的增生差，並在10和20μM的麥草畏濃度上發生；高於30μM，不發生愈傷組織的增生。II型和III型愈傷組織類型對麥草畏反應而增生；極少I型愈傷組織增生。
實施例4使用兩種濃度的2，4-D結合BA，以確定是否維持愈傷組織的生長，以及是否由以Lemna gibba G3觀察到的三種類型建立愈傷組織系。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基(Schenk和Hildebrandt，Can.J.Bot.50，199(1972))中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、0.01μM BA的400ml Murashige和Skoog培養基，其2，4-D的濃度為10和40μM。所有培養基的pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每200ml等份注入8個100mm×15mm培養皿中。
使用2種處理的隨機區組實驗設計，每種處理有4個重複測定，每個重複測定1個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將這些平板於23℃培養27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。4周後，將浮萍組織轉移至相同類型的新鮮培養基，再於相同的溫度和光培養條件下繼續培養4周。
培養8周後，觀察到三種類型的愈傷組織增生(1)I型愈傷組織，(2)II型愈傷組織，和(3)III型愈傷組織。將所有三種愈傷組織類型均轉移至與它們已經在其上培養的培養基組成相同的新鮮培養基上，在相同的培養條件下繼續培養4周以進行傳代培養。培養2個月以上後，在10μM 2，4-D和0.01μM BA上的I型和III型愈傷組織建立了健康的增殖愈傷組織培養物。II型愈傷組織沒有增生。儘管以4周的傳代培養時間表可以維持愈傷組織的增生，但在傳代培養期間的第三周和第四周期間，注意到愈傷組織衰退。
實施例5用Lemna gibba G3測試維持愈傷組織增生的傳代培養時間表。在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μM BA的500mlMurashige和Skoog培養基，將pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，注入20個100mm×15mm培養皿中。
使用2種處理的隨機區組實驗設計，每種處理有2個重複測定，每個重複測定5個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將這些平板於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。2周後，將一半平板(10個平板)上的浮萍組織轉移至相同組成的新鮮培養基，再於同未轉移組織相同的條件下繼續培養。4周後，評估該組織的愈傷組織增生。三種類型的愈傷組織增生I型愈傷組織、II型愈傷組織和III型愈傷組織。與沒有轉移培養4周的浮萍組織相比，在2周時轉移的浮萍組織之間沒有觀察到愈傷組織類型或增生的差異。
從原始葉傳代培養I型和III型愈傷組織，並在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μMBA的Murashige和Skoog培養基中繼續培養。將增生愈傷組織以2周的間隔繼續傳代培養至組成相同的新鮮培養基。轉移之間較長的間隔導致2-3周之間愈傷組織健康狀況的突然衰退。當維持2周傳代培養時間表時，愈傷組織繼續增生，而不喪失活力。
實施例6測試兩種不同的基礎培養基-Murashige和Skoog基礎培養基以及Nitsch和Nitsch基礎培養基(Science 163，85(1969))，以比較其對於Lemna gibba G3愈傷組織誘導的相對效率。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備每種含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂、30μM 2，4-D和0.01μM BA的500ml的Murashige和Skoog培養基以及Nitsch和Nitsch培養基，將pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，每種培養基用來注入20個100mm×15mm培養皿中。
使用2種處理的隨機區組實驗設計，每種處理有2個重複測定，每個重複測定5個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將這些平板於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。2周後，將浮萍組織轉移至相同組成的新鮮培養基，再於相同的條件下繼續培養。
4周後，評估所有平板上組織的愈傷組織增生。Nitsch和Nitsch培養基上培養的葉不能增生顯著量的愈傷組織。該培養基上的浮萍組織是蒼白的並且已經變黃。Murashige和Skoog培養基上培養的浮萍葉增生出通常的三種類型的愈傷組織I型、II型和III型愈傷組織。
從原始葉傳代培養I型和III型愈傷組織，並在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μMBA的Murashige和Skoog培養基中繼續培養。將增生愈傷組織以2周的間隔繼續傳代培養至組成相同的新鮮培養基。轉移之間較長的間隔導致2-3周之間愈傷組織健康狀況的突然衰退。愈傷組織繼續增生，而不喪失活力。
實施例7測試三種不同的基礎培養基-Murashige和Skoog培養基、Schenk和Hildebrandt培養基和Gamborg B5培養基(Gamborg等，InVitro 12，473(1976))，以比較其對於Lemna gibba G3愈傷組織誘導和生長的相對效力。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備每種含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μM BA的500ml的三種培養基，將pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，將每個部分注入20個100mm×15mm培養皿中。
使用3種處理的隨機區組實驗設計，每種處理有2個重複測定，每個重複測定5個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將這些平板於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。2周後，將浮萍組織轉移至相同組成的新鮮培養基，再於相同的條件下繼續培養。
4周後，評估所有平板上組織的愈傷組織增生。Gamborg B5培養基上培養的葉蒼白，並且存在黃色衰退的葉。沒有發生可察覺的愈傷組織增生。Schenk和Hildebrandt培養基上培養的葉為深綠色，增生出異常的葉，沒有發生可察覺的愈傷組織增生。Murashige和Skoog培養基上培養的浮萍葉增生出通常的三種類型的愈傷組織I型、II型和III型愈傷組織。
從原始葉傳代培養I型和III型愈傷組織，並在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μMBA的Murashige和Skoog培養基中繼續培養。將增生愈傷組織以2周的間隔繼續傳代培養至組成相同的新鮮培養基。轉移之間較長的間隔導致2-3周之間愈傷組織健康狀況的突然衰退。愈傷組織繼續增生，而不喪失活力。
實施例8用四種不同的基礎培養基-Murashige和Skoog培養基(MS)、Schenk和Hildebrandt培養基(SH)、Nitsch和Nitsch培養基(NN)和Gamborg B5培養基(B5)，以比較其支持Lemna gibba G3 II型愈傷組織在液體培養基中增生的效力。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，製備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μMBA的500ml Murashige和Skoog培養基，將pH均調至5.8，於121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，並注入20個100mm×15mm培養皿中。
為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將20個平板於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。2周後，將浮萍組織轉移至組成相同的新鮮培養基，再於相同的條件下繼續培養。
4周後，用II型愈傷組織接種用於愈傷組織懸浮培養的液體培養基。對於懸浮愈傷組織的建立，製備每種含有3％蔗糖、10μM 2，4-D和0.01μM BA的100ml的四種基礎培養基MS、SH、NN和B5。將培養基的pH均調至5.8，將4個25ml的等份置於125ml燒瓶中，將所有16個燒瓶的培養基於121℃高壓滅菌18分鐘。冷卻後，每個燒瓶用1-2小片II型脆性白色愈傷組織接種。將燒瓶用鋁箔包裹，於23℃培養2周，同時在黑暗中以100rpm恆定振蕩。
2周後，評估燒瓶的愈傷組織增生。用Murashige和Skoog培養基和Nitsch和Nitsch培養基，注意到微量的生長。將燒瓶再培養2周，不更換培養基，注意到沒有進一步的愈傷組織增生。
實施例9用廣泛代表浮萍科的跨15個種的32個浮萍品系，以確定用Lemnagibba G3開發的用於愈傷組織誘導的方法和培養基，是否外推至整個科。表I列出了所測試的品系。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，使用6種基礎培養基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt(Schenk和Hildebrandt，Can.J.Bot.50，199(1972))、Nitsch和Nitsch、N6(Chu等，ScientiaSinica 18，659(1975))、Gamborg B5和Hoagland的培養基。使用已知引發L.gibba G3愈傷組織增生的兩種植物生長調節劑的組合30μM2，4-D和0.02μM BA、以及5μM 2，4-D和2μM BA。對於每個品系，製備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂的200ml每種基礎培養基。將這200ml分為2個100ml的等份，用每等份製備兩種植物生產調節劑濃度。將所有培養基的pH均調至5.8，培養基於121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，並且每個100ml的等份注入4個100mm×15mm培養皿中。
對於每個測試的浮萍品系，使用6種培養基×2種植物生長調節劑的組合、12種處理的隨機區組實驗設計。設計重複4次，每個重複測定1個培養皿，每個培養皿6片葉。對於浮萍屬、(Spirodela)和(Wolfiella)種的較大的葉，將6個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上，以誘導愈傷組織。對於無根萍屬內的品系，小葉從技術上講不能將單獨的葉置於平板，將小叢的葉用作實驗單位。將平板於23℃培養4-5周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。此時，評價這些葉的一般健康狀況(通過顏色(綠色至黃色)和增生活力來判斷)和三種類型愈傷組織起始的頻率I型、II型和III型。
結果表明不同浮萍種對愈傷組織誘導培養基的反應性的變化。一般而言，浮萍屬和無根萍屬內的種和品系的反應性最強。Lemna gibba的所有5個品系均顯示出在含有5μM 2，4-D和2μM BA的MS、B5和N6培養基上不同程度的愈傷組織誘導。青萍的兩個品系遵循相同的型式，相對於Lemna gibba品系愈傷組織誘導程度更大。Lemnaminiscula的兩個品系表現出高頻率的愈傷組織誘導，白色愈傷組織的增生與青萍或Lemna gibba有些不同。Lemna aequinoctialis在最高生長素濃度下顯示出卷葉和膨脹(swelling)，但沒有觀察到真正的愈傷組織培養物的增生，表明所用的生長素濃度不夠高。Lemma valdiviana未顯示愈傷組織誘導。在無根萍屬的種中，無根萍在含有5μM 2，4-D和2μM BA的B5培養基上顯示出少量愈傷組織增生。Woffiabrasiliensis和Wollfia columbinana在補充5μM 2，4-D和2μM BA的Hoaglands培養基上顯示出愈傷組織的誘導。無根萍屬的其餘種Wolffiaaustralinana沒有顯示出愈傷組織誘導，儘管葉表現出膨脹和略微異常的生長。Wolffiella和紫萍屬的種沒有顯示出愈傷組織誘導。紫萍屬種的葉在較高濃度的2，4-D上不存活，而在較低濃度下生長不好。該型式的反應與以下解釋一致紫萍屬對生長素比浮萍屬和無根萍屬的種更敏感，並且較低的生長素濃度應該用於後續的實驗，以誘導愈傷組織形成。
表I屬 種 品系名稱 來源的國家Spirodela polyrrhiza7970 美國4240 中國8652 中國8683 肯亞Spirodela punctata 7488 美國7776 澳大利亞Spirodela intermedia7178Wolffia arrhiza 7246 南非9006 日本Wolffia austrliana7267 塔斯馬尼亞7317 澳大利亞Wolffia brasiliensis 7397 委內瑞拉7581 委內瑞拉8919 委內瑞拉Wolffia columbiana7153 美國7918 美國Wolffella lingulata 8742 阿根廷9137 巴西Wolffella neotropica7279 巴西8848 巴西Wolffella oblongata 8031 美國8751 阿根廷Lemna aequinoctialis7758 美國Lemna gibba G3美國6861 義大利77848405 法國8678 喀什米爾Lemna minor 8744 阿爾巴尼亞8627 丹麥Lemna miniscula 6600 加利福尼亞6747 加利福尼亞Lemna valdiviana8821 阿根廷8829 阿根廷實施例10對4種生長素-萘乙酸(NAA)、2，4-D、吲哚乙酸(IBA)和麥草畏，測試它們在SH、MS和N6三種不同的基礎培養基上由L.gibbaG3葉誘導愈傷組織形成的能力。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，測試3種基礎培養基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt和N6。使用苄基腺嘌呤作為細胞分裂素，其濃度為1μM。生長素的濃度隨生長素的類型而變。對於相對強的生長素-2，4-D和麥草畏，濃度為0、1、5、10和20μM。對於弱的生長素NAA和IBA，濃度為0、5、10、20和50μM。對於每種培養基的劑量反應實驗，製備含有BA的2升基礎培養基，並將pH調至5.8。將體積等分為20個100ml的等份。向每個這些等份，加入適量的生長素，並將培養基調至0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂。將培養基於121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，並且每個100ml的等份注入4個100mm×15mm培養皿中。
使用3種培養基×4種生長素×5個濃度組合的60種處理的隨機劑量反應實驗設計。設計重複2次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將平板於23℃培養5周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。5周後，測量由每種原始葉產生的浮萍組織的鮮重，並且目視檢查這些組織群體的誘導的愈傷組織數和產生的愈傷組織類型。
在結果中見到許多傾向。首先，低生長素濃度和弱生長素促進葉的增生。這種增生大於生長素不存在時觀察到的增生。當葉增生時，愈傷組織誘導的頻率低。在高生長素濃度下或用較強的生長素，觀察到葉捲曲並且增生大大降低。愈傷組織的形成與葉捲曲有關。生長素類型的排名(從最大捲曲至最小捲曲)如下2，4-D、麥草畏、NAA和IBA。B6和MS均支持愈傷組織形成，而SH不支持愈傷組織形成。N6支持的增殖大於MS。在N6上需要比MS培養基更高濃度的生長素，以引發愈傷組織形成。對於緻密的I型愈傷組織的誘導，2，4-D、麥草畏和NAA在MS培養基上均表現出某種程度的愈傷組織誘導，在N6培養基上，僅2，4-D和麥草畏產生愈傷組織。在含有10μM NAA的MS培養基上觀察到最大程度的愈傷組織誘導。
實施例11對4種細胞分裂素苄基腺嘌呤(BA)、細胞分裂素(kinetin)、噻苯隆(TDZ)和2-iP，測試它們在SH、MS和N6三種不同的基礎培養基上由L.gibba G3葉誘導愈傷組織形成的能力。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。為了誘導愈傷組織，測試3種基礎培養基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt和N6。使用2，4-D作為生長素，其濃度為20μM。所用的細胞分裂素的濃度為0、0.05、0.1、0.5、1和5μM。對於每種培養基的劑量反應實驗，製備含有2，4-D的2400ml基礎培養基，並將pH調至5.8。將體積等分為24個100ml的等份。向每個這些等份，加入適量的細胞分裂素，並將培養基調至0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂。將培養基於121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，並且每個100ml的等份注入4個100mm×15mm培養皿中。
使用3種培養基×4種細胞分裂素×6個濃度組合的72種處理的隨機劑量反應實驗設計。設計重複2次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿5片葉。為了誘導愈傷組織，將5個單獨的浮萍葉背軸面向下置於每個培養基平板上。將平板於23℃培養5周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。5周後，測量由每種原始葉產生的浮萍組織的鮮重，並且目視檢查這些組織群體的誘導的愈傷組織數和產生的愈傷組織類型。
在結果中見到許多傾向。在所有處理中，由於20μM 2，4-D的濃度太高，所以沒有發生葉的增生。在所有處理中葉捲曲均明顯。MS和N6顯示出愈傷組織誘導，而MS明顯更出色。在SH培養基上沒有發生愈傷組織誘導。在範圍廣泛的濃度下，TDZ在MS培養基上產生最大頻率的愈傷組織誘導。在I型和II型愈傷組織誘導之間存在消長關係。當I型愈傷組織誘導高時，II型愈傷組織的誘導低。
實施例12因為青萍的品系8744和8627比L.gibbba品系表現出更大的愈傷組織誘導和更快的愈傷組織增生(參見實施例9和表I)，所以對於青萍進行了培養條件的進一步優化。所測試的用於愈傷組誘導的變量包括a)篩選基礎培養基的組成，b)生長素類型和濃度的篩選，和c)細胞分裂素的類型和濃度篩選。
在基礎培養基的篩選中，測試三種培養基Schenk和Hildebrandt、Murashige和Skoog以及Frick開發的F培養基(Frick，(1991)J.Plant Physiol.137397-401)。用於這些實驗的原種葉在使用之前，在補充24μM 2.4-D和2μM 2iP的F培養基上培養2周。按實施例8製備愈傷組織誘導培養基。分離葉，切除根，在置於愈傷組織誘導培養基之前，將迫使一半葉通過濾過器(按照Frick的方法)，將一半葉整個放置。這些葉在實施例8中給出的條件下培養6周，此時評價培養物愈傷組織誘導的存在與否、愈傷組織增生的程度和愈傷組織的基本形態。
Murashige和Skoog培養基表現出對青萍的愈傷組織誘導最好。Schenk和Hildebrandt培養基不能產生愈傷組織，而在F培養基上愈傷組織的誘導最小。在放置之前迫使葉通過篩網，對愈傷組織誘導沒有作用。
在生長素類型和濃度的實驗中，測試了2，4-D、NAA、IBA和麥草畏四種生長素，每種生長素四種濃度2、5、10和20μM，測試它們由青萍品系8744和8627誘導愈傷組織形成的能力。所用的基礎培養基是MS，培養基和實驗方案是基本上按照實施例10的培養基和方案。將該實驗中所用的葉在置於愈傷組織誘導培養基之前，在3種不同的培養條件下培養2周1)無植物生長調節劑的SH培養基，2)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的F培養基，和3)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的SH培養基。分離葉，切除根，然後置於誘導培養基上。這些葉在實施例8中給出的條件下培養6周，此時評價培養物愈傷組織誘導的存在與否、愈傷組織增生的程度和存在的愈傷組織的基本形態。
在誘導生長素或者是NAA或者是IBA的任何處理中，均未觀察到愈傷組織誘導。對於品系8744，在或者5μM或者10μM濃度的2，4-D處理中，觀察到大量的愈傷組織誘導，5μM 2，4-D產生的誘導最好。在最高的麥草畏濃度20μM下，也觀察到愈傷組織誘導。對於青萍品系8627，在2，4-D和麥草畏上也觀察的愈傷組織誘導，但是濃度較低。對於2，4-D，最大量的愈傷組織誘導在1和5μM下觀察到，5μM下產生的誘導最好。麥草畏對於愈傷組織誘導的有用的濃度是5和10μM。愈傷組織的形成僅來自先前在無植物生產調節劑的Shenk和Hildebrandt培養基上培養的葉，與愈傷組織誘導處理無關。
在細胞分裂素類型和濃度的實驗中，測試了BA、細胞分裂素、2-iP和噻苯隆四種細胞分裂素，每種測試5種濃度0.05、0.1、0.5、1和5μM，測試它們由青萍品系8744和8627誘導愈傷組織形成的能力。所用的基礎培養基是MS，培養基和實驗方案是基本上按照實施例11的培養基和方案。將該實驗中所用的葉在置於愈傷組織誘導培養基之前，在3種不同的培養條件下培養2周1)無植物生長調節劑的SH培養基，2)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的F培養基，和3)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的SH培養基。分離葉，切除根，然後置於誘導培養基上。這些葉在實施例8中給出的條件下培養6周，此時評價培養物愈傷組織誘導的存在與否、愈傷組織增生的程度和愈傷組織的基本形態。
對於品系8744，用或者0.5μM或者1μM的或者2-iP或者噻苯隆，觀察到大量的愈傷組織誘導。只有在放置於愈傷組織誘導培養基之前在F培養基上培養的葉，才觀察到愈傷組織誘導。對於青萍品系8627，用或者2-iP或者噻苯隆觀察到愈傷組織誘導，但其濃度較低，為或者0.1μM或者0.5μM。在該品系中，用0.5μM和1μM的BA，也觀察到愈傷組織誘導。
實施例13用青萍的品系8627和8744，測試基礎培養基組成對愈傷組織增生和長期建立的作用。
測試MS、F培養基和半強度SH三種基礎培養基組成維持健康的愈傷組織生長的能力。所有培養基均含有3％蔗糖，並用0.4％Didco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite凝膠化。MS培養基補充1μM 2.4-D、2μM BA；半強度SH培養基補充1μM BA；而F培養基補充9μM 2，4-D和1μM 2-iP。在如實施例12中的先前的愈傷組織誘導培養基上來自增生的品系8744和品系8627的愈傷組織培養物，均用於該實驗。將愈傷組織培養2周的傳代培養時期，並記錄其生長、顏色和一般健康狀況。
對於青萍品系8744，補充1μM BA的半強度SH證明對於維持愈傷組織生長和健康狀況最好，產生的愈傷組織顯示出多個區的組構化和異常的葉再生。在該培養基上也存在顏色由綠色至淡黃色的多個區域。在MS或F培養基上培養愈傷組織，導致非常快的增生，鮮重每6天增加1倍。在這兩種培養基上增生的愈傷組織表現出相當少的組構化和葉再生。對於品系8627，基礎培養基幾乎沒有影響，在所有3種培養基上愈傷組織的增生同樣好。關於品系8744，當在補充1μM的半強度SH培養基上生長時，愈傷組織表現出更多的組構化。
實施例14因為青萍比Lemna gibbba表現出更大的愈傷組織誘導，對另外三種青萍品系進行另一篩選(它們的葉生長速率和蛋白含量均優越)，以確定用於由青萍品系8744和8627誘導愈傷組織的方案否可外推至這些新的品系。所述品系命名為青萍品系7501、8626和8745。
按照前述實施例中開發的愈傷組織誘導系統補充3％蔗糖、5μM 2.4-D和2μM BA並用0.4％Didco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite凝膠化的Murashige和Skoog基礎培養基，用於愈傷組織誘導。在置於愈傷組織誘導培養基之前，在缺乏植株生長調節劑並補充1％蔗糖的的液體SH培養基上培養葉。將葉置於愈傷組織誘導培養基上，並記錄5周後愈傷組織誘導的相對頻率和愈傷組織增生的相對速率。
對於品系8626和8745，在5周誘導期間沒有發生愈傷組織誘導，然而，後續的培養確實產生低頻率的愈傷組織增生。來自品系8626和8745的愈傷組織的形態和顏色，與由8744和8627增生的愈傷組織相當相似，並且當轉移至愈傷組織維持培養基時增生相當好。品系7501顯示出低頻率的愈傷組織誘導，在形態方面愈傷組織與由品系8626和8745產生的愈傷組織的相似。
實施例15因為在第一次篩選中，Lemna minuscula表現出相當大的愈傷組織誘導(參見實施例9)，所以用Lemna minuscula品系6600和6747重複愈傷組織誘導。製備愈傷組織誘導培養基，並按實施例14中所述培養葉。
Lemna minuscula品系6600和6747均顯示出非常高頻率的愈傷組織誘導，事實上從每片葉均增生愈傷組織。在這些品系中愈傷組織起始快速，在平板接種後2-3周第一次觀察到愈傷組織。愈傷組織的顏色為蒼白色，增殖比由青萍品系8744或8626產生的愈傷組織慢(參見實施例14)。
實施例16根據前述實施例中所述的研究，用於浮萍屬中愈傷組織誘導和生產的優選方法如下。
通過在合適培養基上培養，並在特定的發育階段操縱植物生長調節劑類型和濃度，以促進愈傷組織形成、生長和再生為完全分化的植株，完成了由浮萍植株進行的愈傷組織誘導、生長和葉再生。通常，對於浮萍屬內的種，用於愈傷組織誘導的優選培養基是N6和MS，更優選MS。在一種生長素和一種細胞分裂素存在下培養葉，優選的生長素是NAA和2，4-D，優選的細胞分裂素是BA和TDZ。這些植物生長調節劑的濃度的變化範圍寬。對於生長素，優選的濃度為5-20μM，最優選5-10μM，對於細胞分裂素，優選的濃度為0.5-5μM，最優選0.5-1μM。在含有兩種植物生長調節劑的培養基上將葉培養3-5周的誘導時間，在此期間愈傷組織增生。
對於愈傷組織的生長，優選的培養基如用於愈傷組織誘導的培養基，但所述生長素的濃度降低。對於生長素，優選的濃度為1-5μM，對於細胞分裂素，優選的濃度為0.5-1μM。對於愈傷組織誘導，傳代培養時間也從愈傷組織誘導的4-5周減少至長期愈傷組織生長的2周。可以在或者用瓊脂、Gelrite、或這兩者的組合(優選的組合為0.4％Difco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite)凝膠化的固體培養基或者在液體培養基上維持愈傷組織的生長。採用該方法，可以在無限時期內將愈傷組織培養物維持在健康狀態。
實施例17無根萍屬內的品系對誘導愈傷組織的植物生長調節劑的濃度反應方式與浮萍屬內品系的反應方式相似。因此，選擇無根萍屬品系，進一步研究其增生愈傷組織的能力。
對於7246、8853、9000、9006四個無根萍品系和7393、7581、7591和8319四個Wolffia brasiliensis品系，測試其對植株生長調節劑反應增生愈傷組織的能力。所用的基礎培養基是補充3％蔗糖、5μM 2，4-D、BA和細胞分裂素(kinetin)各5μM和65μM苯基硼酸的MS。平板接種培養物，並在愈傷組織誘導培養基上培養5周，然後記錄愈傷組織的增生。
在5周培養期間，由任何測試的品系均未獲得愈傷組織增生。然而，愈傷組織誘導前的形態容易出現在幾個品系中，包括無根萍8853、9000、9006和Wolffia brasiliensis 7581。這些品系的葉增厚明顯，這是在愈傷組織形成明顯之前在葉中常常觀察到的一種反應，表明所用的生長素濃度不足以支持愈傷組織增生。
轉化該小節包括涉及用於實際的基因轉移方法的實驗。有三個部分(1)用基因槍轉化葉，(2)用浮萍葉進行農桿菌介導的轉化，和(3)用浮萍愈傷組織進行的農桿菌介導的轉化。葉轉化實驗用來優化影響實際基因轉移的參數(a)細菌的生長，(b)乙醯丁香酮的包含，(c)細菌濃度，(d)重新懸浮細菌的溶液和滲透壓休克的作用，(e)用於葉和愈傷組織的協同培養培養基，(f)接種的時間長短，(g)葉和愈傷組織的協同培養時間，和(h)協同培養期間的光條件。用葉開發的方案適用於轉化採用優化組織培養步驟獲得的愈傷組織培養物。正是採用這種轉化的愈傷組織，來進行選擇，然後通過再生以獲得轉化的葉。基因槍介導的轉化實施例18使Lemna gibba G3的葉經過微載體轟擊，以測試其表達外源基因構成物的能力。
對於葉的增生，製備60ml補充3％蔗糖和0.8％瓊脂的高鹽培養基(De Fossard，TISSUE CULTURE FOR PLANT PROPAGATORS 132-52(1976))，將其pH調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，用來倒6個60mm×15mm培養皿。每個培養皿接種一片葉。於23℃將葉培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。
對於轟擊，製備1.6μm金微載體，按照生產商(Bio-Rad)的基因槍方案，在該微載體上沉澱來自質粒pRT99的DNA。質粒pRT99(Topfer等，Nucleic Acid Res.16，8725(1988))編碼新黴素磷酸轉移酶基因和β-葡糖醛酸酶基因(GUS；Jefferson等，EMBO J.6，3901(1987))，這兩種基因均在CaMV35S啟動子的控制之下。
將浮萍葉背軸面向上，用DNA包被的微載體以四個氦壓力水平轟擊800、600和400 lbs/平方英寸。轟擊後24小時，按照Stomp的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載於GUSPROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)作為底物，進行GUS活性的組織化學染色。GUS陽性染色中心的頻率與用於轟擊的壓力成正比，在800psi處理中發現最大數目的表達GUS的細胞，頻率範圍為4-20個染色細胞/葉。在所有處理中，轟擊導致一半以上的葉破壞。
實施例19使Lemna gibba G3的葉經過微彈轟擊，以測試微載體大小對外源基因表達頻率的影響。
對於葉的增生，製備200ml補充3％蔗糖和0.8％瓊脂的高鹽培養基，將其pH調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，用來倒20個60mm×15mm培養皿。每個培養皿接種一片葉。所有葉均於23℃培養2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。在400、800和1200psi 3個氦壓力下，用DuPont製造的PDS-100/He基因槍，測試1.0和1.6μm兩種微載體大小。製備金微載體，按照生產商(Bio-Rad)提供的方法，在該微載體上沉澱pRT99 DNA。
轟擊後24小時，按照Stomp的組織化學染色方法(Histochemicallocalization of beta-glucoronidase，載於GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編碼1991))，分析轟擊的浮萍葉的GUS表達。在用1.6μm微載體和800psi氦壓力下，發現GUS表達頻率最大。GUS陽性事件的數目範圍為每片葉1-21個。
實施例20由通過彈道轟擊轉化的浮萍愈傷組織，再生轉基因浮萍植株。如以下實施例42中所述，培養I型愈傷組織培養物。通常，在MS培養基(實施例42中所述的MS培養基)上的轟擊面上，均勻鋪上20-30個直徑約2-4mm的浮萍愈傷組織塊。使用實施例18和實施例19所述的金粒子(直徑為1.6μM)和轟擊(800psi的氦壓力)。用於轟擊的DNA由一種表達質粒組成，該表達質粒含有目的基因(例如GUS、另一標記基因、編碼哺乳動物蛋白的一種基因或編碼細菌、真菌、植物或哺乳動物酶的一種基因)和編碼一種選擇標記基因的基因(例如nptII(卡那黴素抗性)、hptII(潮黴素抗性)、sh ble(zoecin抗性)和bar(膦絲菌素抗性))以及基因表達所必需的其它序列(例如啟動子序列、終止序列)。在800 lbs/平方英寸下轟擊後，愈傷組織在黑暗中培養2周(或如果需要，使用較長時間)，然後在3-5μmol/m2·sec的光強下培養4-6周。每2周將愈傷組織轉移至新鮮培養基上，轟擊2-4周後，向培養基加入選擇劑。抗性愈傷組織的選擇繼續進行8-16周，直至產生完全抗性的愈傷組織。按實施例42中所述，進行轉基因葉和植株的再生。用浮萍葉以農桿菌進行轉化實施例21採用兩種不同的協同培養的培養基-Schenk和Hildebrandt培養基和Murashige和Skoog培養基，用Lemna gibba G3的浮萍葉測試浮萍對根癌農桿菌的敏感性。
使用根癌農桿菌菌株AT656和無毒力的根癌農桿菌菌株A136，接種浮萍葉。菌株AT656由菌株EHA105(Hood等，Transgenic Res.2，208(1993))構建，菌株AT656在解除武裝的pTiBo542質粒上含有pTiBo542 vir區。在雙質粒pCNL56(Li等，Pl.Mol.Biol.20B，1037(1992))攜帶該T-DNA。該雙質粒衍生自pBIN19並經修飾，攜帶在胭脂鹼合成酶啟動子和胭脂鹼合成酶終止子控制下的新黴素磷酸轉移酶基因和在mas2』-CaMV35S啟動子和章魚鹼合成酶終止子控制下的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因(Janssen和Gardner，Plant Mol.Biol.14，61(1989))。GUS編碼區在該基因的編碼序列內含有一個內含子，以防止GUS的細菌表達(Vancanneyt等，Mol.Gen.Genet.220，245(1990))。菌株A136衍生自廣泛宿主範圍的菌株C58。當C58在高於30℃的溫度下生長時，喪失其Ti質粒，變為無毒力的A136。這兩種菌株AT656和A136於28℃在AB基本培養基(Chilton等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA71，3672(1974))上生長過夜，該基本培養基用1.6％瓊脂固化，並補充100μM乙醯丁香酮。
在實驗之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養基中於23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備500ml含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。也製備含有3％蔗糖和0.6％瓊脂的Murashige和Skoog培養基，將pH調至5.8，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。向這兩種培養基中，加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，使最終的培養基濃度為20mg/L。每種冷卻的培養基倒20個100mm×15mm培養皿。對於每種細菌菌株，在使用之前至少1小時，將來自一個100mm×15mm培養皿的細菌在100ml以下溶液(Hiei等，The Plant J.6，271(1994))中重新懸浮Gamborg B5鹽、Murashige和Skoog維生素、甘氨酸(8mg/L)、天冬氨酸(266mg/L)、精氨酸(174mg/L)、穀氨醯胺(876mg/L)、酪蛋白胺基酸(500mg/L)、蔗糖(6.85％)、葡萄糖(3.6％)和乙醯丁香酮(20mg/L)。製備該溶液，將pH調至5.8，在加入細菌之前過濾除菌。
使用2種細菌菌株×2種協同培養培養基的全階乘實驗設計(總共4種處理)，每個設計重複5次，每次重複有2個培養皿，每個培養皿20片葉。對於接種，將浮萍葉浮於細菌溶液中數分鐘。對於協同培養，將葉轉移至如上所述的或者Schenk和Hildebrandt培養基或者Murashige和Skoog培養基上。將葉於23℃下培養4天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。然後將葉轉移至新鮮培養基上，該新鮮培養基除缺乏乙醯丁香酮並且向該培養基中加入500mg/L替卡西林-克拉維酸和50mh/L硫酸卡那黴素外，組成相同。
用按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載於GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))的GUS活性的組織化學染色，證實葉中的基因轉移。進行接種A136的葉的染色，作為測試細菌接種的葉的內源GUS活性的對照。在接種後10天進行的染色表明，在A136接種的對照中無GUS染色，而在接種AT656的葉中染色頻率高，與用於協同培養的哪種基礎培養基-MS或SH無關。觀察到轉化頻率高於原始接種葉的70％，表明在這些葉中某處有GUS陽性細胞。
實施例22採用Lemna gibba G3的葉，測定創傷對協同培養後GUS表達頻率的影響。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備1升含有3％蔗糖、0.6％瓊脂、20μM 2，4-D、2μM BA和20mg/L乙醯丁香酮的Murashige和Skoog培養基，將pH調至5.8，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，最終的培養基濃度為20mg/L。由該冷卻的培養基倒40個100mm×15mm培養皿。
對於接種，使用根癌農桿菌菌株AT656，將其於28℃在含有50mg/L硫酸卡那黴素和20mg/L乙醯丁香酮的AB基本培養基(Chilton等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71，3672(1974))上生長過夜。按實施例21中所述，重新懸浮來自一個100mm×15mm培養皿的細菌，用於接種。
使用2種創傷處理×2種細菌接種的全階乘實驗設計(總共4種處理)，每個設計重複5次，每次重複有2個培養皿，每個培養皿20片葉。對於創傷處理，從SH培養基上取出數叢浮萍葉，置於潮溼的無菌濾紙上。將各叢浮萍葉分為單片葉，將葉背軸面向上，以兩種方式之一對葉製造創傷1)橫向跨葉中心切割，由此切口從左至右通過相鄰的分生組織區，或2)在中心的二邊切割，由此切口縱向通過每個分生組織區。對於細菌處理，將兩類創傷的葉浮於1)重新懸浮的AT656中或2)無細菌的重新懸浮流體中。對於接種，將葉保持飄浮10-30分鐘。
對於協同培養，將葉轉移至如上所述的含有3％蔗糖、20μM2，4-D、2μM BA和100μM乙醯丁香酮和0.6％瓊脂的Murashige和Skoog培養基上。將葉於23℃下培養4天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。按照Stomp等的方法(Histochemicallocalization of beta-glucoronidase，載於GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將葉亞樣品染色檢測GUS 。接種後4天協同培養的葉的染色表明，創傷的方向不影響葉的GUS染色頻率，其平均值為約70％。用無細菌的細菌重懸浮溶液接種的創傷的葉，即對照，沒有顯示出GUS染色。分生組織區內染色的葉數平均約為40％。
實施例23採用Lemna gibba G3的葉，測定創傷葉在細菌懸浮培養基中接種的時間對協同培養後GUS表達頻率的影響。
在實驗之前，在125ml燒瓶中的25ml培養基中，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Hoagland培養基中於23℃生長至葉密度約為120片葉，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備1500ml含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，最終的培養基濃度為20mg/L。由該冷卻的培養基倒60個100mm×15mm培養皿。
使用具有4種接種時間處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複3次，每次重複有5個培養皿，每個培養皿25片葉。對於接種，使用根癌農桿菌菌株AT656，將其於28℃在含有50mg/L硫酸卡那黴素和20mg/L乙醯丁香酮的AB基本培養基上生長過夜。按實施例21中所述，重新懸浮來自一個100mm×15mm培養皿的細菌，用於接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷，然後轉移至細菌懸液，溫育15、30、45或60分鐘。對於協同培養，將葉轉移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協同培養基上。將所有60個平板均於23℃下培養6天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。在4天時間內進行3次重複。在協同培養後2、3和6天，取來自每個接種時間(15、30、45或60分鐘)的協同培養葉的亞樣品。按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載於GUSPROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將亞樣品葉染色檢測GUS表達。在表II中給出了結果。
表II協同培養時間 接種時間 重複次數 總葉數 染色數2天 15 127 2730 127 2745 128 2660 128 263天 15 230 2930 228 2845 225 2460 227 266天 15 327 2430 326 2245 323 2160 330 28儘管在2天時創傷的莖端上明顯有GUS染色，但分生組織區內的染色在協同培養2天時不明顯。在3天的協同培養時分生組織染色最大，至協同培養6天時下降。浮萍葉在細菌重懸浮溶液中的接種時間確實對協同培養後總的GUS表達頻率無顯著影響。
實施例24採用Lemna gibba G3的葉，測定農桿菌菌株和外源基因構成物對協同培養後GUS表達頻率的影響。
使用兩種根癌農桿菌菌株AT656和C58sZ707pBI121。C58sZ707pBI121是一種解除武裝的廣泛宿主範圍的、其中已經轉移了pBI121的C58菌株(Hepburn等，J.Gen.Microbiol.131，2961(1985))。雙質粒pBI121衍生自pBIN19，其T-DNA編碼在胭脂鹼合成酶啟動子和胭脂鹼合成酶終止子控制下的新黴素磷酸轉移酶基因和在CaMV35S啟動子和章魚鹼合成酶終止子控制下的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因。將AT656在含有50mg/L硫酸卡那黴素的AB基本培養基上劃線接種，將C58sZ707pBI121在含有500mg/L鏈黴素、50mg/L壯觀黴素和50mg/L硫酸卡那黴素的AB基本培養基上劃線接種。這兩種細菌菌株均於28℃下培養過夜。
在實驗之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Hoagland培養基中於23℃生長4周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備500ml含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，最終的培養基濃度為20mg/L。由該冷卻的培養基倒20個100mm×15mm培養皿。
使用2種細菌菌株處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複2次，每次重複有5個培養皿，每個培養皿25片葉。按實施例21所述，每個菌種都重新懸浮來自一個AB平板的細菌，用於接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷，然後轉移至細菌懸液，溫育15-30分鐘。對於協同培養，將葉轉移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協同培養基上。將所有20個平板均於23℃下培養6天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。在協同培養後6天時，取葉的亞樣品，並染色檢測GUS表達。用AT656，在取樣的13個浮萍葉叢中的12個顯示出GUS染色，然而在分生組織區中沒有觀察到染色。用C58sZ707pBI121，所有的浮萍葉叢均顯示出廣泛的染色。
對於所有其餘葉，在轉移至含有硫酸那黴素的新鮮培養基後，繼續培養1周。對於協同培養後的轉移，製備含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。將替卡西林克拉維酸和硫酸卡那黴素兩種抗生素以過濾除菌溶液，加入冷卻的培養基中，最終的培養基濃度分別為500mg/L和2mg/L。用冷卻的培養基倒60個100mm×15mm培養皿。
1周後，記錄葉在卡那黴素上的生長和GUS表達。增生的葉表現出對卡那黴素的3類反應(1)由原始的與細菌菌株AT656協同培養產生的葉的約20％，在卡那黴素存在下表現出旺盛的生長，而由原始的與細菌菌株C58sZ707pBI121協同培養產生的葉的約30％，在卡那黴素存在下表現出旺盛的生長，(2)另一組葉明顯地沒有增生，葉綠素褪色並趨於死亡，(3)中間一組葉在卡那黴素存在下表現出一些增生，但葉半褪色，表明對卡那黴素敏感。GUS染色的結果表明，在原始的協同培養葉中，活性酶仍以高頻率存在。
實施例25採用Lemna gibba G3的葉，測定農桿菌菌株、外源基因構成物和葉的預處理對協同培養後GUS表達頻率的影響。
使用兩種根癌農桿菌菌株AT656和EHA101pJR1。EHA101pJR1是一種二元根癌農桿菌菌株，它含有一種解除武裝的pTiBo542質粒和一種小雙質粒，pTiBo542質粒含有野生型菌株Bo542的超毒性區，而所述小雙質粒具有在醇脫氫酶1增強的CaMV35S啟動子控制下的潮黴素磷酸轉移酶基因基因和如在AT656中構建的一個β-葡糖醛酸酶基因。將這兩種菌株在含有50mg/L卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上劃線接種，並於28℃培養過夜。
使浮萍葉在含有1％蔗糖、含有或不含有10μM吲哚乙酸(IAA)的液體Schenk和Hildebrandt培養基中生長，該濃度的吲哚乙酸足以提高增生速率。使葉在125ml燒瓶中25ml等份的培養基中於23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備500ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂、20mg/L乙醯丁香酮以及含有或不含有10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液以及乙醯丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至合適的終濃度。由該冷卻的培養基倒20個100mm×15mm培養皿。
使用2種細菌菌株處理×2種葉生長培養基的隨機區組實驗設計，每個設計重複5次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20片葉。按實施例21所述，分別重新懸浮每種菌株的細菌，用於接種。為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷，然後轉移至或者AT656或者EHA101pJR1d細菌懸液，溫育10-15分鐘。對於協同培養，將葉背軸面向下轉移至如上所述含有1％蔗糖、0.8％瓊脂和100μM乙醯丁香酮以及含有或不含有10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養基。
將葉於23℃下協同培養4天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。將來自4種處理中每種的兩個平板的葉染色以檢查GUS表達。表III顯示了GUS染色的結果。
表III培養基菌株 總葉數總染色數SHAT65661 12SHEHA101pJR1 62 4SH+IAAAT65666 32SH+IAAEHA101pJR1 68 2無論IAA存在與否，與EHA101pJR1協同培養的葉中顯示GUS表達的葉頻率低得多。用含有IAA的培養基檢測IAA在溫育培養基中的作用，得到48％的協同培養葉顯示出GUS表達，相比之下在無IAA的培養基上協同培養葉的20％顯示出GUS表達。
實施例26採用Lemna gibba G3的葉與細菌菌株AT656協同培養5個不同的時間12.5、18.5、40.5、82和112小時，以測定協同培養時間對協同培養後GUS表達的影響。
使浮萍葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備750ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂、10μM吲哚乙酸和20mg/L乙醯丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至最終的培養基濃度。由該冷卻的培養基倒30個100mm×15mm培養皿。在含有50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用細菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用5種培養時間處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複6次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿60片葉。按實施例21所述重新懸浮細菌，用於接種。為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷。然後將葉轉移至細菌重懸浮溶液，溫育約10-15分鐘。對於協同培養，將葉背軸面向下轉移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt培養基。協同培養這些葉，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。
在適當的時間，從每個培養皿(6個樣品)取出10片葉，進行GUS表達的組織化學染色。表III給出了GUS染色的結果表IV時間(hr) 總葉數 總染色數12.5 61018.5 61040610827524112 6725協同培養時間對具有GUS表達的葉頻率具有顯著作用。在40小時之前，檢測不到GUS表達。至3.5天(82小時)時，容易檢測到GUS表達。較長時間的協同培養不顯著提高在浮萍葉中GUS表達的頻率、強度或組織相關模式。結論是，3.5-4天是在浮萍葉中得到最大基因轉移頻率的最短協同培養時間。
實施例27使用在AB基本培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基和甘露醇穀氨醯胺Luria液體培養基這三種不同的細菌培養基上生長的菌株AT656的細菌，來協同培養Lemna gibba G3的葉，Lemna gibba G3的葉在協同培養之前已經用或不用吲哚乙酸、在光中和黑暗中進行了生長，以測定這些處理對協同培養後GUS表達的影響。
在125ml燒瓶中，使Lemna gibba G3的葉在25ml等份的含有1％蔗糖和含有或不含有10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備900ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂、含有或不含有10μM吲哚乙酸以及20mg/L乙醯丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至合適的最終培養基濃度。由所述冷卻的培養基倒36個100mm×15mm培養皿。製備三種細菌培養基1)含有1.6％瓊脂的AB基本培養基(AB)、含有1.6％瓊脂的Difco。馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)和含有1.6％瓊脂的甘露醇穀氨醯胺(Roberts和Kerr，Physiol.Plant Path.4，81(1974)Luria液體培養基(MGL；Miller，EXPERIMENTS IN MOLECULAR GENETICS433(1972))，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的硫酸卡那黴素和乙醯丁香酮的溶液，分別至50mg/L和20mg/L的最終培養基濃度。在這三種培養基上用AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用3種細菌培養基×2種植物培養基×2種光條件處理的全階乘實驗設計(總共12種處理)，每個設計重複3次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20-25片葉。按實施例21所述，分別重新懸浮每種培養基的細菌，用於接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷。然後將葉轉移至細菌重懸浮溶液，溫育約10-15分鐘。接種後，將葉轉移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt協同培養基上。協同培養這些葉4天，光周期為16hr光/8hr黑暗、光強約為40μmol/m2·sec進行光處理，或者置於完全黑暗中進行黑暗處理。協同培養後，按照Stomp等的方法(Histochemicallocalization of beta-glucoronidase，載於GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將所有葉染色以分析GUS表達。表V給出了GUS染色的結果表V細菌 植物 光或 總葉數 總染色數 染色的培養基培養基黑暗 分生組織數DPA SHD63 60 5PDA SHL67 66 8MGL SHD66 65 7MGL SHL70 65 9ABSHD58 58 7ABSHL62 60 6DPA SH+IAAD61 61 14PDA SH+IAAL68 63 14MGL SH+IAAD62 61 11MGL SH+IAAL46 39 2ABSH+IAAD62 61 6ABSH+IAAL58 53 3細菌培養基對協同培養4天後GUS表達頻率有顯著的作用。AB培養基產生的GUS表達頻率最低，而PDA產生的GUS表達頻率最高。在培養之前使葉在吲哚乙酸上生長，提高了協同培養後GUS表達的頻率。在未用吲哚乙酸進行生長的葉的處理中，在協同培養期間存在光不顯著影響協同培養後GUS表達的頻率，然而，在所用的葉在吲哚乙酸存在下生長的處理中，在黑暗中協同培養確實提高GUS表達的頻率。在含有吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養基上生長的所有浮萍葉中，來自PDA和MGL的平均頻率得到在分生組織中約17％的GUS表達頻率。
實施例28檢查6種協同培養時間和在協同培養期間存在或缺乏光對協同培養後GUS表達的影響。
使Lemna gibba G3的葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養基上於23℃生長17天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備150ml含有1％蔗糖、1％瓊脂、10μM吲哚乙酸和20mg/L乙醯丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至最終培養基濃度。所述培養基用來倒6個100mm×15mm培養皿。在含有50mg/L硫酸卡那黴素和200mg/L乙醯丁香酮的AB基本培養基上用根癌農桿菌菌株AT656劃線接種，並於23℃生長過夜。
使用6種協同培養時間處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複6次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿30片葉。按實施例21所述，重新懸浮來自一個培養皿的細菌，用於接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷。然後將葉轉移至細菌重懸浮溶液溫育10分鐘。為了協同培養，將葉轉移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協同培養基上。以鋁箔包裹三個平板，以實現全黑暗，將平板於23℃培養6種時間13、23、36、49、73.5和93小時，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。協同培養合適的時間後，從6個平板(3個樣品黑暗和3個樣品光照)中的每個取5片葉，並按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載於GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))進行染色以分析GUS表達。
結果表明，至協同培養後23小時時，GUS表達變為明顯，僅在莖的受損端檢測到表達。至36小時時，在創傷周圍和莖受損端的細胞中檢測到染色。總體來說染色更強，然而在黑暗中培養的葉中染色強度的水平更高。至49小時時，在黑暗與光處理中，染色強度和染色模式的差異明顯。在黑暗中培養的葉染色更強，然而，在光處理和黑暗處理之間，顯示GUS表達的葉頻率和表達GUS的分生組織區的頻率的差異不顯著。至73.5小時時，在黑暗處理和光處理之間，染色模式和染色頻率沒有顯著差異，只是在黑暗處理中受傷組織的染色更普遍。至93小時(約4天)時，檢測到表達GUS的分生組織區數更多，黑暗處理一定優於光處理。在受傷細胞中仍存在強染色。
實施例29使用Lemna gibba G3的葉，以測定細菌重懸浮溶液、這些溶液的滲透勢和葉創傷對協同培養後GUS表達頻率的影響。
使葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備1800ml含有1％蔗糖、0.8％未洗滌的瓊脂和20mg/L乙醯丁香酮的Schenk和Hilderbrandt(SH)培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。向高壓滅菌的冷卻的培養基加入過濾除菌的熱不穩定的乙醯丁香酮溶液。所述冷卻的培養基用來倒72個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的AB基本培養基上用農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用12種細菌重懸浮溶液×2種創傷處理的全階乘實驗設計(總共24種處理)，每個設計重複3次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20片葉。對於2種不同的細菌重懸浮溶液1)Gamborg B5鹽、Murashige和Skoog維生素、甘氨酸(8mg/L)、天冬氨酸(266mg/L)、精氨酸(174mg/L)、穀氨醯胺(876mg/L)、酪蛋白胺基酸(500mg/L)、蔗糖(6.85％)、葡萄糖(3.6％)和乙醯丁香酮(20mg/L)，和2)含有1％蔗糖的Schenk和Hildebrandt培養基，每種溶液各具有5種不同的甘露醇濃度0、0.2、0.4、0.6和0.8M；測試這2種溶液的10種組合的基因轉移的效力。另外，測試其它兩種溶液3) Gamborg B5鹽、Murashige和Skoog維生素、甘氨酸(8mg/L)、天冬氨酸(266mg/L)、精氨酸(174mg/L)、穀氨醯胺(876mg/L)、酪蛋白胺基酸(500mg/L)和乙醯丁香酮(20mg/L)，和4)含有蔗糖(6.85％)、葡萄糖(3.6％)和乙醯丁香酮(20mg/L)的Schenk和Hildebrandt培養基。所有細菌重懸浮溶液在使用之前均過濾除菌。在使用之前至少1小時，將來自一個AB平板的細菌重懸浮於100ml 12種重懸浮溶液中的每一種中。
測試在接種之前受傷葉的重要性。對於或者受傷或者未受傷的葉，從叢中分離出單片葉。對於受傷葉，將葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區內刺傷。未受傷的葉在分離為單片葉後未接受進一步的處理。
對於接種，將120片葉，即60片受傷葉和60片未受傷葉，浮於12種細菌重懸浮溶液的每一種上10分鐘，受傷葉與未受傷葉分別接種。對於協同培養，將葉轉移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt培養基上。所有處理均在黑暗中協同培養4天。協同培養4天後，隨機挑出每種處理的2個平板，染色分析GUS表達。
結果表明，無論是何種培養基，0.6M甘露醇均產生協同培養後GUS表達的最高頻率。較簡單的Schenk和Hildebrandt培養基的配方效果很好，使用Gamborg B5鹽的更複雜的培養基配方效果也很好。創傷產生顯示GUS表達的葉頻率的可測量、但統計學上不顯著的提高，不提高分生組織區中染色的頻率。
實施例30使用Lemna gibba G3的葉，以測定接種期間細菌濃度對協同培養後GUS表達的影響。
在使用之前，在125ml燒瓶中，使浮萍葉在25ml等份含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備750ml含有1％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙醯丁香酮和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮和吲哚乙酸的溶液，以獲得最終的培養基濃度。用所述冷卻的培養基倒30個100mm×15mm培養皿。在含有1.6％Difco細菌培養用瓊脂、20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的半強度馬鈴薯葡萄糖瓊脂-甘露醇穀氨醯胺Luria肉湯培養基上，用農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用10種細菌濃度處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複3次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20片葉。按實施例21所述重新懸浮來自一個培養皿的細菌，用於接種。該細菌溶液構成「未稀釋的」樣品，並作為連續稀釋製備以下稀釋液的起始溶液1/3、10-1、1/33、10-2、1/333、10-3、1/3333、10-4和10-5。1/3稀釋液的OD540nm為1.006，這相當於1.6×109細菌/ml。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，並用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷。然後轉移至10種不同的細菌重懸浮溶液濃度中的每一種，溫育約10-15分鐘。對於協同培養，將葉背軸面向下轉移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協同培養基。將葉子23℃在黑暗中協同培養4天。協同培養後，按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載於GUSPROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))對所有葉進行染色以分析GUS表達。
結果表明，在所有細菌濃度中，GUS表達頻率變化為10倍。在測試的最高細菌濃度下觀察到最高的GUS表達頻率。在高於10-3的稀釋度下，沒有檢測到GUS表達。
實施例31使用Lemna gibba G3的葉，以採用優化的轉化方案測試4種協同培養基對GUS表達的影響。
使葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養基中於23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，使用4種培養基1)含有20μM2，4-D和0.1μM BA的Murashige和Skoog培養基(MS)(MS1)，2)含有20μM 2，4-D和1μM BA的MS培養基(MS2)，3)含有1μM 2，4-D和2μM BA的MS培養基(MS3)，和4)Schenk和Hilderbrandt培養基(SH)。對於每種培養基，製備100ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂、含適當植物生長調節劑的培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向每種冷卻的培養基中加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。用每種培養基倒4個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用細菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用4種培養基處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複4次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20片葉。對於接種，在使用之前1小時，將來自一個培養皿的細菌重懸浮於100ml過濾除菌的含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮的pH5.6 SH培養基中。為了接種，從叢中分離出單片葉，將其浮於重懸浮的細菌中8-10分鐘。對於協同培養，將葉背軸面向下轉移至如上所述的協同培養基(MS1、MS2、MS3、SH)上。將葉於23℃在黑暗中協同培養4天。協同培養後，對所有葉進行染色以分析GUS表達。
在所有處理中，顯示GUS表達的葉頻率範圍為80-90％。協同培養基對該頻率沒有顯著影響。GUS染色的強度由弱至強。染色與根尖、莖、莖受損端和傷口、分生組織區和葉緣相聯繫。
實施例32通過操作接種前的葉細胞分裂速率、農桿菌生長的培養基、協同培養參數的優化，完成用農桿菌的葉轉化，所述協同培養參數包括諸如乙醯丁香酮的次級代謝物、農桿菌的濃度、接種流體的重量摩爾滲透壓濃度、協同培養時期的長短和協同培養時期的光強。
根據前述實施例中所述的研究，葉轉化和選擇的優選方法如下。通常，使葉在含有提高葉增生速率的生長素的培養基上生長，所述生長素優選NAA、IBA和IAA，優選濃度範圍為0.2-1μM。使農桿菌在無豐富營養補充物且包含諸如乙醯丁香酮的次級代謝物的培養基上生長，優選的培養基是馬鈴薯葡萄糖瓊脂和甘露醇穀氨醯胺Luria肉湯。用接種流體的組合物測定轉化頻率，優選的流體是補充0.6M甘露醇和100μM乙醯丁香酮的MS或SH基礎鹽。農桿菌懸浮於該接種流體中的濃度，也影響轉化頻率，優選的濃度約為1×109細菌/ml。接種時間可以變化，優選的時間範圍為2-20分鐘。協同培養時間也影響轉化頻率，優選的時間為3-4天。在光或黑暗條件下進行協同培養，優選在黑暗(例如減弱的光)中進行。
轉化葉的生長也取決於優選的條件。MS和SH是優選的培養基。用合適的高濃度(通常為100-500mg/L)的合適抗生素、感染組織的頻繁轉移、每2-4天轉移至含有抗生素的新鮮培養基的優選方法，進行葉的感染農桿菌的去汙染。對於3-6周的初始靜息/恢復期，最好是在低光強下培養，優選光強範圍為1-5μmol/m2·sec。
在可變的時間，最好是在接種後1-3周，可以開始根據在選擇劑的存在下生長進行選擇。也優選在降低的光水平和低選擇劑濃度下的初次選擇，光水平為1-5μmol/m2·sec，根據特定選擇劑的毒性研究確定適於選擇劑的低濃度範圍。對於硫酸卡那黴素，通常的範圍為2-10mg/L 。
實施例33用以Lemna gibba G3開發的轉化方案，對來自10個浮萍種內的品系的葉Lemna trisulca 7315、青萍7101、Lemna japonica 7427、Lemna turionifera 6601、Lemna gibba G3、Lemna valdiviana 7002、Lemna aequnicitalis 7001、Lemna miniscula 6711、Lemna obscura7325和Spirodela punctata 7273，測試其在協同培養後得到GUS表達的能力。
在125ml燒瓶中，使Lemna gibba G3以外的所有浮萍品系在25ml等份含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基上生長。使Lemna gibba G3在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養基上生長。所有浮萍培養物均於23℃下培養，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。對於協同培養，製備400ml含有1％蔗糖、0.9％瓊脂和20mg/L乙醯丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。向冷卻的培養基中加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，以獲得最終的培養基濃度。用冷卻的培養基倒10個100mm×15mm培養皿。在與半強度甘露醇穀氨醯胺Luria肉湯培養基的半強度馬鈴薯葡萄糖瓊脂(這兩種培養基均含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素)上，用根癌農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用10種浮萍品系處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複1次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20-25片葉。按實施例21所述，重懸浮來自一個培養皿的細菌。
對於接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織內製造創傷，將葉轉移至細菌懸浮液，溫育約10分鐘。為了協同培養，將葉轉移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協同培養基上，於23℃在黑暗中培養4天。
協同培養後，將葉染色以分析GUS表達。在測試的10個品系中，8個品系顯示出GUS表達，其模式與L.gibba G3的模式相同，頻率範圍為14-80％。
實施例34採用以L.gibba G3開發的轉化方案，對來自浮萍科4個屬的20個浮萍品系，測試其在與農桿菌菌株AT656協同培養後得到GUS表達的能力。這20個品系是Wolffiella lingulata品系8742和9137、Wl.neotropica品系7279和8848、Wl.oblongata品系8031和8751、無根萍品系7246和9006、Wa.australiana 7317、Wa.brasiliensis品系7397、7581和8919、Wa.columbiana品系7121和7918、Spirodela intermedia 7178、紫萍品系7960和8652、S.punctata品系7488和7776以及L.gibba G3。
在實驗之前，所有品系均在含有1％蔗糖的pH5.6 Schenk和Hildebrandt培養基上生長2周。對於協同培養，製備1500ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂和20mg/L乙醯丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌30分鐘並冷卻。向冷卻的培養基中加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，以獲得最終的培養基濃度。用冷卻的培養基倒60個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用細菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。為了接種，在使用前至少1小時，將來自一個培養皿的細菌重懸浮於在使用前過濾除菌、含有0.6M甘露醇、20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的Schenk和Hildebrandt培養基中。
使用20種浮萍品系處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複3次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20片葉。對於接種，從叢中分離出紫萍屬和Wolfiella品系和L.gibba G3的單片葉。對於無根萍屬品系，葉以叢進行接種，因為它們的尺寸小，使得單片葉分離困難。為了進行接種，將每個浮萍品系的葉浮於細菌懸浮溶液中2-5分鐘。對於協同培養，將葉從細菌溶液轉移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt協同培養基上。對於紫萍屬和Wolfiella品系和L.gibbaG3，將20片單獨的葉轉移至3個重複培養皿的每個中；對於無根萍屬品系，將20叢小葉轉移至3個重複平板的每個上。所有品系均於23℃在黑暗中協同培養4天。
協同培養後，將來自每個品系的2個平板染色以分析GUS表達。染色結果表明，除一個種外的所有測試種和這些種內的大多數浮萍品系，在協同培養4天後均得到某些GUS表達。在測試的4個無根萍屬種中，全部顯示出不同頻率的GUS表達。Wolffia brasiliensis的3個品系表現出最高頻率的GUS表達，範圍為50-75％。在Wolfiella屬內的6個品系中，GUS表達的頻率較低，範圍為5-12％。3個紫萍屬種的2個種得到10％和35％的GUS表達；第三個沒有顯示出GUS表達。用作陽性對照的Lemna gibba G3的GUS表達頻率約為50％。用愈傷組織培養物進行農桿菌的轉化實施例35用以L.gibba G3葉開發的優化轉化方案，由Lemna gibba G3葉產生的I型愈傷組織用來測試其產生GUS表達的能力，並測試真空滲濾的作用。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、5μM 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和2μM苄基腺嘌呤(BA)的固體Murashige和Skook培養基培養葉，產生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導和所有後續培養均於23℃下進行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導4周後，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養基上，分別培養I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上，直至增生足夠的愈傷組織用於實驗。
對於協同培養，製備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的最終培養基濃度。將冷卻的培養基用來倒16個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用2種真空滲濾處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複4次，每次重複有2個培養皿，每個培養皿10個愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時，將細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養基中。用和不用真空滲濾進行細菌接種。不用真空滲濾時，將小塊的I型愈傷組織置於細菌溶液中10分鐘，然後吸乾並轉移至如上所述的MS協同培養基。用真空滲濾時，將愈傷組織置於細菌溶液中，施加10英寸汞的真空10分鐘，然後將愈傷組織吸乾並轉移至MS協同培養基。所有培養皿在黑暗中於23℃進行協同培養。
協同培養4、6和9天後，分別對約40、20和20塊愈傷組織染色以分析GUS表達。結果表明，愈傷組織塊顯示GUS表達的頻率不隨真空滲濾處理而變化，該頻率也不隨協同培養的時間而變化。在所有時間點不用真空滲濾時，GUS染色範圍為25-78％，用真空滲濾時，該頻率範圍為25-74％。GUS染色的強度從深藍色變為淺藍色，與處理無關。
實施例36測試4種不同的協同培養基對與農桿菌菌株AT656協同培養後I型愈傷組織的GUS表達頻率的影響。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基培養Lemna gibba G3的葉，產生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導和所有後續培養均於23℃下進行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導4周後，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養基上，分別培養I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上，直至增生足夠的愈傷組織用於實驗。
對於協同培養，測試4種培養基含有20μM 2，4-D和0.1μM BA的Murashige和Skook培養基(MS)(MS1)、含有20μM 2，4-D和1μMBA的MS培養基(MS2)、含有1μM 2，4-D和2μM BA的MS培養基(MS2)和無植物生長調節劑的Schenk和Hildebrandt培養基(SH)。製備50ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂的每種培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻，向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將所述培養基用來倒24個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用4種協同培養基處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複2次，每次重複有1個培養皿，每個培養皿20個愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時，將來自一個培養皿細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的過濾除菌的SH培養基中。對於接種，I型愈傷組織塊置於細菌溶液中8分鐘，吸乾，然後轉移至4種不同的協同培養基上。所有平板均在黑暗中於23℃進行協同培養4天。協同培養後，按照Stomp等的方法(Histochemical localization ofbeta-glucoronidase，載於GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將所有愈傷組織染色以分析GUS表達。
協同培養基對顯示出GUS表達的愈傷組織塊頻率沒有顯著影響。在所有處理中，GUS表達頻率的範圍為70-85％。GUS表達的強度有變化，染色範圍由深藍色至淺藍色。
實施例37測試2天和4天這兩種不同的協同培養時間對與農桿菌菌株AT656協同培養後I型愈傷組織的GUS表達頻率的影響。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基培養Lemna gibba G3的葉，產生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導和所有後續培養均於23℃下進行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導4周後，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養基上，分別培養I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上，直至增生足夠的愈傷組織用於實驗。
對於協同培養，製備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基(MS)，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養基用來倒16個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用2種協同培養時間處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複2次，每次重複有4個培養皿，每個培養皿10個愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時，將細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養基中。對於接種，I型愈傷組織塊置於細菌溶液中。對於協同培養，將愈傷組織塊吸乾，然後轉移至如上所述的MS協同培養基。所有平板均在黑暗中於23℃協同培養或者2天或者4天。協同培養或者2天或者4天後，將所有愈傷組織染色以分析GUS表達。
結果表明，GUS表達的頻率不隨協同培養時間而變化。在所有處理中，GUS表達頻率的範圍為50-70％。GUS染色的強度的範圍由深藍色至淺藍色。然而，在協同培養4天後，存在嚴重的細菌過度生長，發現該細菌覆蓋物抑制GUS染色。
實施例38用不同的基因構成物，以用另一種農桿菌菌株C58sZ707pBI121測試I型愈傷組織協同培養方案的效力。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基培養Lemna gibba G3的葉，產生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導和所有後續培養均於23℃下進行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導4周後，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養基上，分別培養I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上，直至增生足夠的愈傷組織用於實驗。
對於協同培養，製備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基(MS)，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養基用來倒16個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮、500mg/L硫酸鏈黴素、50mg/L壯觀黴素和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株C58sZ707pBI121劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用1種細菌菌株處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複4次，每次重複有4個培養皿，每個培養皿10個愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時，將來自一個培養皿的細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養基中。對於接種，I型愈傷組織塊置於細菌溶液中8-10分鐘。對於協同培養，將愈傷組織塊吸乾，然後轉移至如上所述的MS協同培養基。所有平板均在黑暗中於23℃協同培養2天。協同培養後，從每個重複的一個平板選擇2個愈傷組織塊(總共8塊)，將其染色以分析GUS表達。
所有愈傷組織塊均顯示出GUS表達，範圍由深藍色至淺藍色。前2周將其餘的愈傷組織從MS協同培養基轉移至含有500mg/L頭孢噻肟的相同MS培養基，此後將這些愈傷組織轉移至含有頭孢噻肟和羧苄青黴素各500mg/L的相同MS培養基，以根除組織的細菌汙染物。將所有愈傷組織以2周的間隔，轉移至含有頭孢噻肟和羧苄青黴素的新鮮MS培養基。每次轉移時，將愈傷組織塊的亞樣品染色以分析GUS表達。GUS表達的頻率略有下降，但仍很高，70-95％的愈傷組織塊表現出某些GUS表達。目視檢查抗生素培養基上的愈傷組織，表明培養4周後沒有顯示出細菌汙染物。
實施例39測試II型愈傷組織和III型愈傷組織在農桿菌菌株AT656存在下協同培養後得到GUS表達的能力。
通過於23℃在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μM BA的固體Murashige和Skook培養基培養Lemna gibba G3的葉，產生兩種愈傷組織類型，培養的光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。4周後，從原始葉分離出II型愈傷組織和III型愈傷組織，並將其轉移至含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μM BA的固體Murashige和Skook培養基，用於在相同的溫度和光條件下維持愈傷組織。將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上，直至增生足夠的愈傷組織用於實驗。
在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。對於協同培養，製備200ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、10μM 2，4-D和0.02μM BA的Murashige和Skook培養基(MS)，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養基用來倒8個100mm×15mm培養皿。
使用2種愈傷組織類型處理的隨機區組實驗設計。接種40塊綠色愈傷組織，均勻轉移至4個培養皿，也接種9塊白色愈傷組織，均勻轉移至4個培養皿。為了接種，在使用前至少1小時，將細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養基中。對於接種，將綠色愈傷組織塊和白色愈傷組織塊浸入細菌溶液中2-5分鐘。對於協同培養，將愈傷組織塊吸乾，然後以塊轉移至如上所述的MS協同培養基上。所有愈傷組織均在黑暗中於23℃協同培養2天。
協同培養後，隨機挑出所有白色愈傷組織和每個平板的3個綠色愈傷組織塊，將其染色以分析GUS表達。在9個白色愈傷組織塊中，7塊表現出不同強度的GUS表達。在12塊綠色愈傷組織中，6塊表現出不同強度的GUS表達。
實施例40將從Lemna gibba的兩個不同的快速生長品系(品系6861和7784)和青萍的一個品系建立的I型愈傷組織與AT656協同培養，以測定用Lemna gibba G3所建立的方法的轉化頻率。
在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株AT656劃線接種，並於28℃生長過夜。對於協同培養，製備200ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂、10μM 2，4-D和0.02μM BA的Murashige和Skook培養基(MS)，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養基用來倒8個100mm×15mm培養皿。
為了接種，在接種前至少1小時，將細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養基中。對於接種，將來自3個不同浮萍品系和來自L.gibba G3(陽性對照)的約10-15塊I型愈傷組織浸入細菌溶液中2-5分鐘。對於協同培養，將愈傷組織塊吸乾，然後以塊轉移至如上所述的MS協同培養基的兩個平板(對於每個浮萍品系)。所有愈傷組織均在黑暗中於23℃協同培養2天。
協同培養後，隨機挑出2個Lemna gibba品系的所有愈傷組織塊和來自青萍品系的3塊愈傷組織，將其染色以分析GUS表達。在協同培養後2周，所有愈傷組織塊均顯示出GUS染色細胞的多個小點，這與成功轉化一致。用葉的選擇實施例41用Lemna gibba G3的葉，測試三種協同培養基對表達GUS並在卡那黴素選擇培養基上生長的葉的拯救的影響。
使用前，將葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養基培養。細菌菌株AT656於28℃在含有20mg/L乙醯丁香酮和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上生長過夜。使用3種固體培養基用於協同培養1)含有1％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙醯丁香酮和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養基(SH)，2)含有3％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙醯丁香酮和50μM 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的Murashige和Skook培養基(MS)，和3)含有3％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙醯丁香酮、5μM 2，4-D、10μM萘乙酸、10μM赤黴酸和2μM苄基腺嘌呤的Murashige和Skook培養基。製備所述培養基，將pH調至5.6(SH)或5.8(兩種MS類型)，高壓滅菌，冷卻，加入作為過濾除菌溶液的熱不穩定組分乙醯丁香酮、吲哚乙酸和赤黴酸，將所述培養基注入100mm×15mm培養皿。每種培養基製備20個培養皿(500ml)。
使用3種協同培養基處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複4次，每次重複有5個培養皿，每個培養皿20片葉。為了接種，按實施例21所述，重懸浮來自一個培養皿的細菌。
對於接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，並用無菌解剖刀在分生組織區內製造創傷。將葉轉移至細菌懸浮溶液中，溫育10分鐘。對於協同培養，將葉轉移至如上所述的三種協同培養基上。將所有平板在黑暗中於23℃協同培養5.5天。
協同培養5.5天後，將每種培養基2個平板的葉染色，以分析GUS表達。結果表明，GUS表達在很大程度上存在於在Schenk和Hildebrandt培養基協同培養的葉上。將來自每種培養基的其它18個平板(18個平板×3種培養基＝54個平板)的其餘葉，轉移至組成相同、但無乙醯丁香酮、含有500mg/L替卡西林-克拉維酸的固體和液體培養基。將來自3個平板的葉轉移到含有25ml液體培養基的3個燒瓶中，並於23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。將15個固體培養基平板上的葉分為2組1)將來自10個原始平板的葉轉移至12個新平板上，並在黑暗中溫育(12個平板)，2)將來自5個原始平板的葉轉移至6個新平板，並在低於5μmol/m2·sec的減弱光條件下培養。
生長11天後，取葉的亞樣品，染色以分析GUS表達。結果表明，仍存在GUS表達，該表達與光處理或培養基處理無關。無論是何種培養基，在減弱光下培養的所有葉均顯示出最高強度的GUS表達。在黑暗中培養的葉顯示出中等水平的GUS表達，在光下培養的葉顯示出非常低的水平。在Schenk和Hildebrandt培養基上培養的葉表現出最高頻率的GUS陽性組織，然而，GUS表達與新擴增的葉無關。
在配製用於誘導愈傷組織的Murashige和Skook培養基上，染色模式限於單個細胞和非常小的區域。含有2，4-D、NAA、GA3和BA的MS培養基上葉表現出比在僅含有2，4-D的MS培養基上培養的葉的染色強。在黑暗中，在含有調節以誘導愈傷組織的植物生長調節劑的兩種基於MS的培養基上，不發生愈傷組織形成，但在減弱光下，在含有2，4-D、NAA、GA3和BA的MS培養基上已經開始形成愈傷組織。根據這些結果，從實驗中停止使用Schenk和Hildebrandt培養基上的葉。將在黑暗中MS培養基的所有剩餘葉轉移至減弱光條件下，繼續培養。將所有組織保持在相同培養基製劑上，但轉移至含有替卡西林克拉維酸的新鮮培養基上，並在減弱光條件下繼續培養約5周。
協同培養後7周，將所有其餘組織再次轉移至新鮮培養基上，並在該新鮮培養基中加入或者10mg/L(約25％的組織)或者2mg/L(約75％的其餘組織)的硫酸卡那黴素。1周後，將來自兩種卡那黴素處理的組織亞樣品染色，以分析GUS表達。存在三種類型的染色1)與原始協同培養的葉相關的染色，2)與I型愈傷組織相關的染色，和3)與III型愈傷組織相關的染色。愈傷組織染色頻率不高，估評每100個協同培養的葉中5-8片葉產生卡那黴素抗性培養物。在減弱光下，再繼續培養和傳代培養所述組織5周。
12周後，所有其餘組織均來自含有2，4-D、NAA、GA3和BA的MS培養基上的培養物。將組織轉移至含有1μM 2，4-D、2μMBA、0.15g/L Gelrite、0.4g/L Difco細菌培養用瓊脂、500mg/L替卡西林-克拉維酸和10mg/L硫酸卡那黴素的Murashige和Skook培養基。將熱不穩定的組分過濾除菌，並加入高壓滅菌的冷卻的培養基中。將由每片原始協同培養的葉增生的健康組織轉移至單個培養皿中。將所有組織於23℃下培養，從減弱的光強變為約40μmol/m2·sec的全光強，光周期為16hr光/8hr黑暗。此時，將組織的小亞樣品染色，以分析GUS表達，結果顯示出與III型愈傷組織相關的低GUS染色頻率。2周後，目視觀察明顯看出，向全光的轉移已經增強了卡那黴素抗性愈傷組織與卡那黴素敏感性愈傷組織的分離。通過將所有活組織轉移至新鮮培養基上，將愈傷組織在卡那黴素上的生長再繼續進行4周(總共16周)。
在協同培養後16周和20周之間，建立了卡那黴素抗性愈傷組織系。通過在光下10mg/L卡那黴素上生長，特徵鑑定這些緻密的I型愈傷組織和III型愈傷組織培養物。由360個原始協同培養葉，增生了8個卡那黴素抗性愈傷組織系。由於研製出這8個系，將該愈傷組織的亞樣品轉移至含有0.5％蔗糖的半強度Schenk和Hildebrandt培養基上，以再生葉。在這8個系中，在缺乏卡那黴素的情況下，有3個再生的葉，在卡那黴素存在下不發生葉的再生。染色時，這些葉中沒有一個顯示出GUS表達。愈傷組織培養物的選擇和轉化葉的再生
實施例42測試I型愈傷組織在農桿菌菌株C58sZ707pBI121存在下協同培養後得到GUS表達和硫酸卡那黴素抗性培養物的能力。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基培養Lemna gibba G3的葉，產生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導和所有後續培養均於23℃下進行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導4周後，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養基上，分別培養I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上，直至增生足夠的愈傷組織用於實驗。
對於協同培養，製備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基(MS)，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養基用來倒20個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮、500mg/L鏈黴素、50mg/L壯觀黴素和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株C58sZ707pBI121劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用1種細菌菌株處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複1次，每次重複有20個培養皿，每個培養皿約10個愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時，將細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養基中。為了接種，I型愈傷組織塊置於細菌溶液中。對於協同培養，將愈傷組織塊吸乾，然後轉移至如上所述的MS協同培養基。所有愈傷組織塊均在黑暗中於23℃協同培養2天。協同培養後，將一個愈傷組織塊亞樣品進行組織化學染色以分析GUS表達。結果顯示出不同強度的高頻率的GUS表達。
將約200個其餘愈傷組織塊轉移至去汙染培養基。為了進行去汙染，製備500ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體MS培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的含頭孢噻肟的溶液，至500mg/L的最終培養基濃度。用冷卻的培養基倒20個平板。將每個平皿約10個愈傷組織塊轉移至20個去汙染培養基的培養皿上。所有培養皿均在黑暗中於23℃培養。每周將愈傷組織塊傳代培養至相同的新鮮培養基上，在相同條件下培養愈傷組織。第5周時，將愈傷組織的小亞樣品染色，以分析GUS表達。存在高頻率和不同強度的表達。
第5周時，將其餘愈傷組織塊轉移至選擇培養基上。為了進行選擇，製備500ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂、補充1μM 2，4-D和2μM BA的MS，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的含頭孢噻肟、羧苄青黴素和硫酸卡那黴素的溶液，分別至500、500和2mg/L的最終培養基濃度。用冷卻的培養基倒20個培養皿。將約9-10個愈傷組織塊轉移至選擇培養基的20個培養皿。所有愈傷組織均於23℃培養，光周期為16hr光/8hr黑暗，減弱的光強約為3-5μmol/m2·sec。培養1周後，將愈傷組織轉移至相同的培養基上，只是卡那黴素濃度增加至10mg/L。在相同培養條件下再繼續愈傷組織培養1周，傳代培養至相同組成的新鮮培養基上一次。在該2周的卡那黴素選擇期結束時，約25％的原始愈傷組織塊顯示出健康的愈傷組織生長，其餘的生長下降。
第7周時，將其中最健康的64個愈傷組織塊轉移至固體MS，該固體MS含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D、2μM BA、羧苄青黴素和頭孢噻肟各500mg/L、以及10、20、40和80mg/L四種不同濃度的硫酸卡那黴素，製備160ml的所述培養基，其pH調至5.6，高壓滅菌並冷卻。加入過濾除菌的所述熱不穩定抗生素的溶液至合適的濃度。用冷卻的培養基倒16個60mm×15mm培養皿。將約4個愈傷組織塊轉移至每個平板上，製備具有每種卡那黴素濃度的4個平板(每個卡那黴素濃度16個愈傷組織塊)。在減弱的光下於23℃繼續培養。以每周1次的間隔，將4個平板，即每種卡那黴素濃度一個平板，轉移至40μmol/m2·sec的較高光強下。第9周時，無論是何種光條件，將所有愈傷組織轉移至組成與先前的傳代培養相同的新鮮培養基。至第12周時，將所有愈傷組織置於40μmol/m2·sec的較高光強下。再繼續進行愈傷組織培養4周(至第16周)，以2周的間隔傳代培養至新鮮培養基。
第16周時，將其餘健康愈傷組織的小亞樣品染色以分析GUS表達。所有健康的愈傷組織塊均顯示出GUS表達，整個愈傷組織塊顯示出均勻的染色，表明表達GUS的愈傷組織與非表達的愈傷組織分離。至此大多數愈傷組織死亡，但超過10％的愈傷組織顯示出不同程度的健康愈傷組織增生。鑑定出A、B和C三個愈傷組織系，將其轉移至促進葉再生的培養基上。在選擇培養基上進一步傳代培養生長中的愈傷組織塊時，又鑑定出6個愈傷組織系D-I，將其轉移至再生培養基上。在含有10mg/L卡那黴素的培養基上發現9個系中的8個系。例外是D系，它在40mg/L卡那黴素上生長良好。在後續的傳代培養時，A、B、D、F、H和I運6個愈傷組織系繼續生長。
鑑定的9個系中的2個系繼續再生葉，染色時它們為GUS表達陽性，並且在存在或缺乏卡那黴素時容易增生。為了再生，由100ml蒸餾水與0.4％Difco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite製備水瓊脂(water agar)，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌18分鐘。用該培養基倒10個60mm×15mm培養皿。將來自A、D、F、H和I系的小塊愈傷組織轉移至每種培養基的2個培養皿上。將愈傷組織於23℃培養，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強為40μmol/m2·sec。在水瓊脂上繼續進行愈傷組織培養6周，以2周的間隔傳代培養至新鮮的水瓊脂上。至第6周時，來自所有系的愈傷組織均轉為黃色和褐色。在第6周結束時，將愈傷組織轉移至或者固體或者液體、含有0.5％蔗糖和0.8％Difco細菌培養用瓊脂(僅固體培養基用)的半強度Schenk和Hildebrandt培養基。4-6周後，愈傷組織已經形成綠色的結節，這些結節分化為厚的葉樣結構。由於葉可以脫離愈傷組織塊，因此將它們轉移至含有1％蔗糖的全強度Schenk和Hildebrandt培養基，於23℃下培養，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強為40μmol/m2·sec。這些葉在液體SH培養基上無限增生。這些葉在含有或不含有卡那黴素的SH培養基上增生同樣好。在卡那黴素存在下未觀察到葉的褪色。定期取葉亞樣品，染色以分析GUS表達。所有的葉均顯示出GUS表達。
為了證實轉化，對從A系和D系分離的DNA進行DNA雜交分析。採用Doyle和Doyle的CTAB法(Amer.J.of Botany 75，1238(1988))，從未轉化的L.gibba G3和從轉化的A系和D系製備浮萍DNA製備物。用限制性酶EcoR1和Hind III分別消化以及用這兩種酶一起消化分離的DNA，在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳分離片段。按照Sambrook的方法將該凝膠印跡至尼龍膜上。SAMBROOK等，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL(1989)。對於探針，用Sambrook的鹼SDS法(同上)，分離來自pBI121的質粒DNA。用限制性酶EcoR1和Hind III消化12.8kb的質粒DNA，產生包含β-葡糖醛酸酶基因的3.2kb片段和含新黴素磷酸轉移酶基因的一個約9kb片段。從瓊脂糖凝膠上分離這兩個片段，採用Prime-a-Gene試劑盒(Promega)，通過隨機引物進行放射標記。採用這些探針，將攜帶未轉化浮萍DNA和或者來自轉化系A或者來自轉化系D的DNA的印跡，進行雜交。在雜交箱中，於65℃過夜進行雜交反應。在0.1X SSC、0.1％SDS的嚴格條件下洗滌膜。然後將印跡與BIOMAX MS膠片(Kodak)接觸，並於-70℃放射自顯影曝光2天。
雜交實驗的結果表明，GUS和NPTII雜交DNA存在於浮萍A系和D系中，但在來自未轉化浮萍的DNA中不存在(圖1顯示D系的結果)。轉化浮萍DNA的雙重消化於預期的分子量處產生雜交。單消化表明，雜交與預料之外分子量的DNA片段相關，表明，該雜交DNA不來自細菌，而是整合入植物DNA中。用標記的毒性區探針探測相同的印跡顯示缺乏雜交，表明所述陽性GUS和NPTII信號來自植物，而非來自細菌。
實施例43測試I型愈傷組織在農桿菌菌株C58sZ707pBI121存在下協同培養後得到GUS表達和硫酸卡那黴素抗性培養物的能力。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基培養Lemna gibba G3的葉，產生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導和所有後續培養均於23℃下進行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導4周後，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養基上，分別培養I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上，直至增生足夠的愈傷組織用於實驗。
對於協同培養，製備750ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養基(MS)，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。用冷卻的培養基倒30個100mm×15mm培養皿。在含有20mg/L乙醯丁香酮、500mg/L鏈黴素、50mg/L壯觀黴素和50mg/L硫酸卡那黴素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農桿菌菌株C58sZ707pBI121劃線接種，並於28℃生長過夜。
使用1種細菌菌株處理的隨機區組實驗設計，每個設計重複1次，每次重複有30個培養皿，每個培養皿約5個愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時，將細菌重懸浮於含有0.6M甘露醇和20mg/L乙醯丁香酮pH5.8的過濾除菌的MS培養基中。為了接種，將I型愈傷組織塊置於細菌溶液中。對於協同培養，將愈傷組織塊吸乾，然後轉移至如上所述的MS協同培養基。所有愈傷組織塊均在黑暗中於23℃協同培養2天。協同培養後，將一個愈傷組織塊亞樣品進行組織化學染色以分析GUS表達。結果顯示出高頻率的GUS表達。
將約150個其餘愈傷組織塊轉移至去汙染培養基。為了進行去汙染，製備750ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體MS培養基，將pH調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的含頭孢噻肟和羧苄青黴素的溶液，每種至500mg/L的最終培養基濃度。用冷卻的培養基倒30個平板。將約5個愈傷組織塊轉移至30個去汙染培養基培養皿的每個平板上。愈傷組織在黑暗中於23℃培養。每周將愈傷組織塊傳代培養至相同的新鮮培養基上，在相同條件下培養愈傷組織。
第5周時，開始選擇卡那黴素抗性愈傷組織系。為了進行選擇，製備750ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體MS培養基，將pH調至5.8，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。加入過濾除菌的含頭孢噻肟、羧苄青黴素和卡那黴素的溶液，分別至500mg/L、500mg/L和2mg/L的最終培養基濃度。用冷卻的培養基倒30個平板。將約5個愈傷組織塊轉移至30個去汙染培養基培養皿的每個平板上。愈傷組織在黑暗中於23℃培養。
第6周和第7周時，將愈傷組織轉移至含有濃度增至10mg/L的卡那黴素的相同新鮮培養基上。於23℃在黑暗中繼續培養。第8周開始時，提高卡那黴素濃度。製備組成與先前的傳代培養的培養基組成相同的Murashige和Skook培養基，一半的培養基含有10mg/L的卡那黴素，而另一半含有40mg/L的卡那黴素。將約一半的其餘愈傷組織轉移至每種卡那黴素濃度上。也改變培養的光條件。所有愈傷組織均於23℃培養，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強為約3-5μmol/m2·sec。愈傷組織在這些培養基和培養條件下維持2周。在減弱光的水平下2周後，將愈傷組織轉移至含有或者10mg/L或者40mg/L卡那黴素的組成相同的新鮮培養基上，將光強升至40μmol/m2·sec。以2周傳代培養制度，將愈傷組織在相同的培養基和培養條件下維持。
至第12周時，約10％的愈傷組織保持健康和生長。在餘下的15個增生愈傷組織系中，一半在10mg/L卡那黴素上生長，其餘一半在40mg/L上生長。對6個系的愈傷組織小亞樣品進行組織化學染色，表明在愈傷組織的數個區中有GUS表達。
按照實施例42的步驟進行葉再生。當在存在或缺乏硫酸卡那黴素的情況下生長時，葉的增生正常，沒有觀察到葉的褪色。葉也顯示出強的GUS組織化學染色。DNA雜交分析表明存在預期片段大小的GUS基因和新黴素磷酸轉移酶基因的DNA序列，而不存在來自vir區的DNA序列。按實施例42所述，進行合適的限制性酶分析，結果與外源基因整合入植物基因組中的發現一致。
實施例44根據前述實施例，優選以下方法，用於用農桿菌轉化浮萍愈傷組織，然後進行選擇和再生轉化植株。整體來說，青萍具有特別有活力愈傷組織系統，這使得易於由該物種再生植株。
通常，愈傷組織轉化、選擇和葉再生依賴於一個建立的很好的愈傷組織系統和許多對於該方法每個步驟優化的參數。按實施例16中所述，維持旺盛生長的愈傷組織培養物。按實施例32中所述，培養(在含有合適抗生素和100μM乙醯丁香酮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上)和重懸浮農桿菌，只是優選的重懸浮培養基是MS，而非SH。通過將愈傷組織塊浸入重懸浮的細菌溶液中最少3-5分鐘，接種愈傷組織塊，將其吸乾以去除過多的流體，將其植於由MS組成的協同培養基上，該培養基補充了為促進愈傷組織生長而優化的生長素和細胞分裂素和100μM乙醯丁香酮。接種的愈傷組織在黑暗中培養2天。
協同培養後，將愈傷組織轉移至含有抗生素的新鮮培養基上，以給培養物去除感染的農桿菌的汙染。優選的培養基是含有3％蔗糖、1μM 2，4-D、2μM BA、用0.15％Gelrite和0.4％Difco細菌培養用瓊脂凝膠化以及抗生素的MS。愈傷組織在3-5μmol/m2·sec的減弱光下培養。每2-5天，最好是每3天，將愈傷組織轉移至組成相同的新鮮培養基上。總的恢復期持續2-3周，3-6次傳代培養。
在恢復期後進行愈傷組織選擇。將愈傷組織轉移至補充1μM2，4-D、2μM BA、3％蔗糖、0.4％Difco細菌培養用瓊脂、0.15％Gelrite和10mg/L硫酸卡那黴素的MS培養基上。愈傷組織在3-5μmol/m2·sec的減弱光下培養，每2周轉移至組成相同的新鮮培養基上。愈傷組織以該方式維持4-6周。然後愈傷組織在40μmol/m2·sec的全光下在相同培養基上培養。當愈傷組織在選擇劑上表現出旺盛的生長，則認為選擇是完全的。
將在選擇劑存在下在愈傷組織維持培養基顯示出旺盛生長的愈傷組織，轉移至再生培養基上，以形成器官和產生植株。一般而言，浮萍在貧乏的培養基上再生。對於青萍，該培養基是含有1％蔗糖的半強度SH培養基；對於L.gibba，該培養基是水瓊脂。通常，選擇劑不存在於再生培養基中。愈傷組織在全光下在再生培養基上培養2-4周直至出現葉。將完全器官發生的葉轉移至含有1-3％蔗糖、無植物生長調節劑的液體SH培養基中，在全光下培養，以進一步進行克隆增殖。
實施例45測試光強和硫酸卡那黴素濃度對青萍愈傷組織培養物轉化頻率的影響。
在愈傷組織誘導之前，在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中培養青萍的葉，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強為約40μmol/m2·sec。用青萍品系8744的葉，按實施例14中所述完成愈傷組織的誘導。在協同培養之前，愈傷組織在含有3％蔗糖、1μM 2，4-D、2μM BA、0.4％ Difco細菌培養用瓊脂和0.15％ Gelrite的MS培養基上維持13周。在此13周的協同培養期間，將愈傷組織每2周傳代培養至新鮮培養基上。
帶有來自如實施例21中所述的菌株AT656的含T-DNA雙質粒的農桿菌菌株C58sz707，在含有50mg/L硫酸卡那黴素、50mg/L壯觀黴素和500mg/L鏈黴素的PDA上於28℃培養2天。對於協同培養，製備含有3％蔗糖、1μM 2，4-D、2μM BA、0.4％Difco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite的固體MS培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘並冷卻。向冷卻的培養基加入過濾除菌的乙醯丁香酮溶液，至100μM的終濃度。用冷卻的培養基倒8個100mm×15mm培養皿。
在接種之前至少1小時，將農桿菌重懸浮於過濾除菌的含有0.6M甘露醇和100mg/L乙醯丁香酮的pH5.6 MS培養基中，以用於接種。為了接種，將約160塊I型愈傷組織浸入細菌溶液中2-5分鐘，每批20塊愈傷組織。對於協同培養，將愈傷組織塊吸乾，然後作為塊轉移至協同培養基，每個100mm×15mm培養皿20個愈傷組織塊。所有接種的愈傷組織均在23℃於黑暗中培養2天。
對於選擇，製備200ml含有1μM 2，4-D、1μM BA、3％蔗糖、500mg/L羧苄青黴素、500mg/L頭孢噻肟、10mg/L硫酸卡那黴素、0.4％Difco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite的MS培養基，將pH調至5.6，於121℃高壓滅菌20分鐘，倒8個100mm×15mm培養皿。在倒平板之前，將抗生素作為過濾除菌的溶液加入冷卻的高壓滅菌的培養基中。將協同培養的愈傷組織塊轉移至新鮮的選擇培養基，每個培養皿20個愈傷組織塊。在低於5μmol/m2·sec的減弱光下培養80個愈傷組織塊(4個平板)，將其它80個愈傷組織塊(4個平板)轉移至40μmol/m2·sec的較高光強下。每周將愈傷組織傳代培養至新鮮的含抗生素的培養基上，進行3周。第4周時，將來自每種光處理的一半(40個愈傷組織塊)愈傷組織轉移至新鮮培養基，在該培養基中，卡那黴素濃度從10mg/L升至40mg/L。將其餘40個愈傷組織塊轉移至維持10mg/L原始卡那黴素濃度的新鮮培養基。在相同的減弱光或全光條件下和低或高卡那黴素濃度下的培養，再繼續進行2周，每周進行傳代培養。接種後6周時，將所有樣品轉移至新鮮培養基，並在全光強下培養。從此時開始，以2周的間隔進行傳代培養。
在卡那黴素上培養12周後，將旺盛生長的愈傷組織轉移至新鮮的再生培養基上。葉再生培養基由含有1％蔗糖、0.4％Difco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite的半強度Schenk和Hildebrandt培養基組成。每2周將愈傷組織塊轉移至組成相同的新鮮培養基上。轉移至再生培養基後3-6周，從愈傷組織塊再生出葉。
由該實驗再生出兩個轉化的克隆葉系。這兩個系均顯示出GUS組織化學染色，用甲基傘形酮-葡糖醛酸(MUG)作為底物，在溶液測定(soluble assay)中，具有不同水平的GUS酶活性(可提取蛋白的0.31％和0.14％)，用ELISA測定測量，具有可檢測水平的新黴素磷酸轉移酶。DNA雜交分析證實在高分子量DNA中存在外源DNA序列，該高分子量DNA用合適的限制性酶消化時，產生預期的片段大小。用代表原始農桿菌毒性區的DNA序列重新探測剝離的印跡(strippedblot)，不能得到可檢測的雜交。
實施例46用來自品系8627的青萍愈傷組織培養物，測試青萍基因型對轉化葉拯救頻率的影響。
按實施例45所述，進行接種之前的愈傷組織維持、用於接種的細菌菌株、細菌生長、細菌重懸浮、愈傷組織接種步驟和在黑暗中協同培養2天。
對於卡那黴素選擇，在協同培養後，將180個愈傷組織塊轉移至含有1μM 2，4-D、2μM BA、500mg/L羧苄青黴素、500mg/L頭孢噻肟和10mg/L硫酸卡那黴素的MS培養基。所有愈傷組織均在低於5μmol/m2·sec的減弱光水平下培養。接種後第2周時，一半的愈傷組織塊轉移至新鮮的選擇培養基，在該培養基中，卡那黴素濃度從10mg/L升至40mg/L，將其餘一半愈傷組織塊轉移至含有10mg/L硫酸卡那黴素的新鮮選擇培養基。繼續每周進行傳代培養至接種後第5周，此時，每2周進行傳代培養。
為了再生轉化葉，將在卡那黴素上生長旺盛、且於12周後用組織化學染色顯示出GUS表達的愈傷組織系，轉移至含有半強度Schenk和Hildebrandt培養基的葉再生培養基，所述半強度Schenk和Hildebrandt培養基含有1％蔗糖、0.4％Difco細菌培養用瓊脂和0.15％Gelrite。3-4周後，在再生培養基上再生出葉。再生的葉在含有1％蔗糖的SH培養基上維持。
在該實驗中再生出3個轉化的克隆葉系。所有3個系均顯示出GUS組織化學染色，通過MUG測定測量，顯示出可變水平的GUS活性(可提取蛋白的0.2-0.3％)，而在ELISA測定中測量，顯示出可檢測水平的新黴素磷酸轉移酶。用DNA雜交分析證實，外源DNA序列轉化並整合入浮萍DNA中。
實施例47也測試培養基組成對由青萍愈傷組織培養物再生葉的影響。測試了7種培養基配方(1)水瓊脂，(2)含有100μM硫酸腺嘌呤的水瓊脂，(3)含有10μM BA的水瓊脂，(4)含有10μM BA和1μM IBA的水瓊脂，(5)半強度SH，(6)含有10μM BA的半強度SH，和(7)含有10μMBA和1μM IBA的半強度SH。該實驗使用來自按實施例12的先前愈傷組織誘導培養基中增生的品系8744和品系8627的愈傷組織培養物。愈傷組織在7種不同培養基上培養8周，持續觀察葉的發育。
僅在半強度SH處理上得到葉再生。當半強度SH僅補充10μMBA時，愈傷組織的生長比植於無植物生長調節劑的半強度SH上的愈傷組織生長快，然而，再生的時間比在半強度SH上的時間長。將IBA加入培養基中，對愈傷組織再生葉的時間和能力沒有影響。
實施例48用人類β-血紅蛋白基因構成物和一種P450氧化酶構成物，測試用於哺乳動物基因表達的浮萍系統的效率。
使用兩種農桿菌菌株，接種青萍品系8627的I型愈傷組織。對於β-血紅蛋白轉化，使用攜帶pGV3850、pTVK291、pSLD343種質粒的菌株C58 C1。pTKV291含有來自pTiBo542的超毒性G基因。pSLD34是一種農桿菌雙質粒，衍生自pBIN19，包含CaMV35S啟動子控制下的新黴素磷酸轉移酶基因和由超級mac啟動子驅動的人類β-血紅蛋白基因。
對於P450氧化酶轉化，使用攜帶pGV3850、pTVK291和pSLD34三種質粒的菌株C58 C1。所述T-DNA載於雙質粒pSLD35上，該質粒與pSLD34結構類似，除了pSLD35不具有β-血紅蛋白基因，卻具有編碼人P450氧化酶、氧化還原酶和細胞色素B5三種蛋白的DNA序列。每個基因都由一個超級mac啟動子驅動。pSLD35質粒包含潮黴素和卡那黴素選擇標記基因。
使用具有2種細菌菌株×2種早期選擇期間的光強×2種選擇期間的卡那黴素濃度的基本實驗設計(總共8種處理)的7個實驗，每個設計重複3次，每次重複有2個培養皿，每個培養皿10個愈傷組織塊。在這些實驗中，使用由青萍品系8627和8744和Lemna gibba品系G3產生的愈傷組織培養物。按實施例45所述，進行接種之前的愈傷組織維持、用於接種的細菌菌株、細菌生長、細菌重懸浮、愈傷組織接種步驟和在黑暗中協同培養2天，只是在接種之前，細菌在含有50mg/L卡那黴素、50mg/L慶大黴素、100mg/L羧苄青黴素和100μM乙醯丁香酮的PDA上生長。
對於卡那黴素選擇，在協同培養後，將愈傷組織塊轉移至含有1μM 2，4-D、2μM BA、500mg/L羧苄青黴素、500mg/L頭孢噻肟和10mg/L和40mg/L兩種濃度的卡那黴素的MS培養基。在培養期間，將愈傷組織培養物再分為，在每種卡那黴素濃度上，一半的愈傷組織塊在減弱光下培養，而另一半在全光下培養。在協同培養後前4周內，以1周間隔，將愈傷組織傳代培養至組成相同的新鮮培養基。第5周時，所有培養物均在全光強下再培養6周，每2周傳代培養至新鮮培養基。
按實施例42和實施例47中所述，用適於由L.gibba G3或青萍品系再生葉的培養基，完成葉再生。3-4周後，在再生培養基上再生出葉。再生的葉在含有1％蔗糖的SH培養基上維持。
在所有實驗中，拯救了超過20％的轉化克隆葉系。與40mg/L相反，用10mg/L卡那黴素作為選擇濃度，發現更多的系。在選擇期間減弱的光強證明是有利的。所有系均顯示出在卡那黴素上的旺盛的愈傷組織生長，通過ELISA實驗測定，具有可檢測水平和可變水平的新黴素磷酸轉移酶蛋白。通過本領域已知的方法，例如分別用DNA雜交、RNA雜交和蛋白雜交，在穩定轉化的浮萍植株中檢測出存在P450氧化酶和β-血紅蛋白DNA、RNA和/或蛋白。
本說明書中提及的所有出版物和專利申請均代表本發明所涉及領域技術人員的水平。所有出版物和專利申請均通過引用結合到本文中，其程度與單個出版物或專利申請具體和單獨地表示結合到本文中中的程度相同。
儘管為了清楚除地理解，通過說明和實施例在某些細節中描述了前述的發明，但很明顯，可以在所附的權利要求書的範圍內實施某些改變和修改。
權利要求
1.用目的核苷酸序列轉化浮萍的方法，其中所述核苷酸序列包含至少一個表達盒，所述表達盒包含一個賦予對選擇劑抗性的基因，所述方法包括以下步驟(a)提供浮萍組織靶，所述浮萍組織的細胞包括細胞壁；和(b)以足以穿透細胞壁並將所述核苷酸序列沉積在所述組織的細胞內的速度，將所述核苷酸序列發射至所述浮萍組織靶，藉此產生轉化的組織，其中所述核苷酸序列由微彈攜帶；並且其中通過將所述微彈發射至所述組織，而將所述核苷酸發射至所述組織。
2.按照權利要求1的方法，還包括用所述選擇劑培養轉化的組織的步驟。
3.按照權利要求2的方法，還包括再生轉化的浮萍植株的步驟。
4.按照權利要求1的方法，其中所述組織是愈傷組織。
5.按照權利要求1的方法，其中所述組織是分生組織。
6.按照權利要求1的方法，其中所述組織是葉組織。
7.按照權利要求1的方法，其中所述浮萍組織選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
8.按照權利要求1的方法，其中所述浮萍組織選自青萍、Lemnaminiscula和Lemna gibba的一個物種。
9.按照權利要求1的方法，其中所述微彈包括金屬粒子。
10.按照權利要求1的方法，其中所述微彈包括直徑為約0.5微米至約3微米的金屬粒子。
11.按照權利要求1的方法，其中提供許多微彈，每個微彈均具有固定其中的所述核苷酸序列，並且每個微彈均被發射至植物組織靶上。
12.按照權利要求1的方法，其中所述核苷酸序列編碼選自以下的一種蛋白或肽胰島素、生長激素、α-幹擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網膜細胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
13.按照權利要求1的方法，其中所述核苷酸序列編碼一種多體蛋白的至少一個蛋白或肽亞基。
14.用目的核苷酸序列轉化浮萍的方法，所述方法包括以下步驟(a)用包含一種載體的農桿菌接種浮萍植物組織，所述載體包含所述核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含至少一個表達盒，而所述表達盒包含一種賦予對選擇劑抗性的基因；和(b)將所述組織與農桿菌協同培養，以產生轉化的組織。
15.按照權利要求14的方法，還包括在包含足以抑制農桿菌生長的抗生素的培養基中，培養所述轉化組織的步驟。
16.按照權利要求14的方法，還包括在包含所述選擇劑的培養基中培養所述轉化組織的步驟。
17.按照權利要求16的方法，還包括從所述轉化組織再生轉化浮萍植株的步驟。
18.按照權利要求14的方法，其中所述組織是愈傷組織。
19.按照權利要求14的方法，其中所述組織是分生組織。
20.按照權利要求14的方法，其中所述組織是葉組織。
21.按照權利要求14的方法，其中所述浮萍組織選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
22.按照權利要求14的方法，其中所述浮萍組織選自浮萍屬。
23.按照權利要求14的方法，其中所述浮萍組織選自青萍、Lemna miniscula和Lemna gibba的一個物種。
24.按照權利要求14的方法，其中所述農桿菌是根癌農桿菌。
25.按照權利要求14的方法，其中所述農桿菌是毛根農桿菌。
26.按照權利要求14的方法，其中所述載體是超級雙載體。
27.按照權利要求14的方法，其中所述載體是C58衍生載體。
28.按照權利要求14的方法，其中賦予對選擇劑抗性的所述基因選自neo、bar、pat、ALS、HPH、HYG、EPSP和Hml。
29.按照權利要求14的方法，其中所述核苷酸序列包含兩個目的基因。
30.按照權利要求14的方法，其中所述核苷酸序列編碼選自以下的一種蛋白或肽胰島素、生長激素、α-幹擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網膜細胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
31.按照權利要求14的方法，其中所述核苷酸序列編碼選自以下的一種多體蛋白的至少一個蛋白或肽亞基血紅蛋白、膠原蛋白、P450氧化酶和單克隆抗體。
32.用目的核苷酸序列轉化浮萍細胞的方法，其中所述核苷酸序列包括至少一個表達盒，所述表達盒包含賦予對選擇劑抗性的一種基因，所述方法包括通過電穿孔將所述核苷酸序列引入浮萍細胞的步驟。
33.按照權利要求3的方法產生的轉化的浮萍組織培養物。
34.按照權利要求17的方法產生的轉化的浮萍組織培養物。
35.按照權利要求3的方法產生的轉化的浮萍植株。
36.按照權利要求17的方法產生的轉化的浮萍植株。
37.按照權利要求32的方法產生的轉化的浮萍植株。
38.轉化的浮萍植株，包含摻入其基因組中的一種異源目的核酸。
39.按照權利要求38的轉化的浮萍植株，其中所述目的核酸的側翼為摻入其基因組中的T-DNA邊界序列。
40.按照權利要求39的轉化的浮萍植株，其中所述浮萍植株包含少於5個拷貝的所述異源目的核酸。
41.按照權利要求39或39的轉化的浮萍植株，其中所述浮萍植株選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
42.按照權利要求39的轉化的浮萍植株，其中所述其中所述浮萍植株選自浮萍屬。
43.按照權利要求39的轉化的浮萍植株，其中所述浮萍植株選自青萍、Lemna miniscula和Lemna gibba的一個物種。
44.按照權利要求39的轉化的浮萍植株，其中所述所述核酸包含至少一個表達盒，所述表達盒包含一種賦予對選擇劑抗性的基因。
45.按照權利要求44的轉化的浮萍植株，其中所述賦予對選擇劑抗性的所述基因選自neo、bar、pat、ALS、HPH、HYG、EPSP和Hml。
46.按照權利要求39的轉化的浮萍植株，其中所述核酸包含兩個目的基因。
47.按照權利要求39的轉化的浮萍植株，其中所述核酸編碼選自以下的一種蛋白或肽胰島素、生長激素、α-幹擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網膜細胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
48.按照權利要求39的轉化的浮萍植株，其中所述核酸編碼選自以下的一種多體蛋白的至少一個蛋白或肽亞基血紅蛋白、膠原蛋白、P450氧化酶和單克隆抗體。
49.生產重組蛋白或肽的方法，包括以下步驟(a)培養表達至少一種異源蛋白或肽的轉化浮萍植株；和(b)從浮萍培養物中收集至少一種蛋白或肽。
50.按照權利要求49的方法，其中所述轉化浮萍植株在廢水中生長。
51.按照權利要求49的方法，其中所述轉化浮萍植株表達並裝配一種多體蛋白的所有亞基。
52.按照權利要求51的方法，其中所述多體蛋白選自膠原蛋白、血紅蛋白、P450氧化酶和單克隆抗體。
53.按照權利要求49的方法，其中所述轉化浮萍植株在生物反應器容器中生長。
54.按照權利要求49的方法，其中生產一種重組蛋白或肽。
55.按照權利要求49的方法，其中所述至少一種異源蛋白或肽是一種治療蛋白或肽。
56.按照權利要求49的方法，其中所述至少一種蛋白或肽選自胰島素、生長激素、α-幹擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網膜細胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
57.按照權利要求49的方法，其中所述至少一種異源蛋白或肽是一種酶。
60.按照權利要求49的方法，其中所述至少一種異源蛋白或肽從所述轉化浮萍植株分泌。
58.按照權利要求49的方法，其中所述浮萍植株選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
59.按照權利要求49的方法，其中所述浮萍植株選自青萍、Lemna miniscula和Lemna gibba的一個物種。
全文摘要
提供用於有效轉化浮萍的方法和組合物。最好是所述方法包括通過或者彈道轟擊或農桿菌進行的轉化。以該方式,可以將任何目的基因或核酸引入浮萍植株並在其中表達。亦提供轉化的浮萍植株、細胞、組織。亦公開了轉化的浮萍植物組織培養物和由轉化的浮萍植株生產重組蛋白和肽的方法。
文檔編號C12P21/00GK1272762SQ98806897
公開日2000年11月8日 申請日期1998年8月11日 優先權日1997年8月12日
發明者A·M·斯託普, N·拉漢達裡 申請人:北卡羅萊納州立大學