高效氮循環細菌人工篩選及在水生態修復和水處理中的應用的製作方法
2023-09-14 04:36:50 2
專利名稱：高效氮循環細菌人工篩選及在水生態修復和水處理中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物人工篩選技術領域，涉及微生物人工篩選及其在環境治理中的應用，更具體的說，是高效氮循環細菌人工篩選及在水生態修復和水處理中的應用。
背景技術：
湖泊，河流等水體的汙染和富營養化是中國乃至世界上許多地區危及人類健康，制約社會經濟可持續發展的嚴峻生態環境問題。環境監測部門的調查表明，我國七大水系、湖泊、水庫、部分地區地下水和近岸海域受到不同程度的汙染，其中富營養化問題尤為突出，滇池、太湖等天然水體先後暴發了大面積的水華。治理富營養化問題已是當今我國水環境面臨的重大問題，是國家亟待解決的重大科學和技術難題，也是當代資源環境科學的熱點。迄今已有的研究表明，引起水體富營養化的各類營養物質中，氮、磷是主要的限制性因子。因此解決水體富營養化問題的關鍵之一就在於控制水體的氮的含量一方面制定嚴格的排放標準，在排入水體前對生活汙水和工業廢水進行治理，控制排放源；一方面需對已經汙染的水體進行修復。
對於生活汙水和工業廢水的治理目前國內外的研究和應用的最多的是生物脫氮法，其中又以固定化生物脫氮技術綜合治理效果最佳，但是現今的研究技術主要存在以下缺點硝化-反硝化過程難以在時間和空間上統一，脫氮效果差，造成生物脫氮這一多步驟生物催化反應受基質傳遞速率、底物和產物抑制等限制。目前，國內外已有通過聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉、光致交聯樹脂等多聚體化合物將硝化菌和反硝化菌混合包埋的研究(曹國民，趙慶詳，龔劍麗，張彤，固定化微生物在好氧條件下同時硝化和反硝化，環境工程，2000，18(5)17-19)，能在一定程度上實現同步硝化反硝化。但關於將四種氮循環細菌(氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌)同時進行吸附增殖固定化的研究，目前僅李正魁等有過研究(李正魁，濮培民，固定化增殖氮循環細菌群SBR法淨化富營養化湖水，核技術，2001，24(8)674～679)，取得了較好的脫氮效果。但是對四種高效氮循環細菌的篩選和富集方面仍需改進。
對於氮汙染型富營養化水體的治理，國際、國內湖泊界和環境科學界科學工作者已經採用了許多治理措施，目前已有的技術有物理方法底泥疏浚、引水衝淤，機械除藻等，治標不治本，處理效果易出現反覆；化學方法營養鹽控制、投加化學藥劑控制藻類生長等，易引發二次汙染，同時可能惡化水體水質，破壞水體生態系統的自淨能力和自我調控能力；生物方法生物調控、水生態修復、生態工程等，這種方法能夠從根本上修復水體的自淨能力，實現生態平衡，並且基本上不產生二次汙染，其中又以水生態修復和生態工程為最佳。
但是，水生態修復的應用面臨的主要難題是較低水溫的影響。現有生態修復技術採用的水生高等植物常為一年生或秋冬枯萎的多年生植物，在秋冬季節基本喪失水體淨化能力，而低溫對微生物活動的抑制作用更為強烈，15℃時硝化細菌硝化速率顯著下降，僅為30℃時的50％左右，10℃時反硝化細菌的反硝化速率極大下降。
水體的高度均一化。在富營養化水體中，原有水生態系統已受到破壞，水體的空間異質性差，缺乏相互分異的氧化-還原微環境，僅僅在水-沉積物界面存在明顯的相互分異的氧化-還原微環境。水體的硝化-反硝化所致的氮素釋放活動十分微弱。這種近似荒漠化的水體環境，給引種水生植物帶來了極大的生存壓力，直接阻礙了健康水生態系統的修復與穩定。
水生態系統的修復，要求較為穩定的水體環境。較大的水流流速，波動的水溫、外界擾動較大的水體生態環境等等，都是阻礙水生態修復順利進行的因素。
汙染治理不徹底，汙染物只是被在形態上被轉變與簡單遷移並未徹底從水體中去除。如張清敏等研製了一種修復水環境的微生態菌製劑(張清敏，王蘭，胡國臣等，修復養殖水環境的微生態菌製劑及其製備方法，專利申請號200410019818.4)，具有該製劑適應性強，活菌數高，對養殖水生環境修復效果好，但是其主要效果在於穩定氨態氮(NH4+-N)，並保持在一定水平上，並沒有將過剩的氮素徹底地從汙染水體中去除。
目前對於湖泊、水庫等天然水體水生態修復和生態工程技術主要以水生植物的修復和水生生物恢復為主，包括水生魚類(生物調控技術)、底棲動物等，基本沒有考慮到水生態系統中除了水生植物、水生動物之外的另一個重要環節的微生物的作用。如張治等發明了一種富營養化小水體的生態修複方法，主要由菹草、黑藻、馬來眼子菜、輪藻、狐尾藻等組成(張治，周忠良，林晨，呂亞佳等，富營養化淺水小水體的生態修複方法，專利申請號03115845.5)對各種水生植物淨化富營養化水體的作用進行了專利申請保護，但卻沒有對水生微生物對淨化水質的作用進行闡述。
發明內容
1、要解決的技術問題現有技術提供的高效氮循環細菌的篩選和富集仍不能滿足水生態修復和水處理的要求，本發明提供一種高效氮循環細菌的人工篩選，篩選出能較好的用於水生態修復和水處理的高效氮循環細菌。該高效氮循環細菌的人工篩選用於水生態修復和水處理時，可以提高菌種的篩選速度，加快氮素汙染物的轉化，較好的對氮汙染型富營養化水體進行生態修復。
2、技術方案高效氮循環細菌人工篩選，其主要包括以下步驟(a)在天然水體中水生植物生長根區採集含有土著氮循環細菌的水樣；(b)分別配製氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養基，接入水樣置於搖床上培養，進行擴培；(c)再分別配置固體培養基，將四種擴培後的菌種轉至平板培養；根據平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的分別進行富集培養，中間進行鏡檢觀測；(d)用初步分離的方法再次分離純化，將分離純化後的菌種投放待測水樣中進行轉化試驗，分別測N的轉化率，以轉化率高的菌為優選菌。
步驟(b)中可以根據需要配製氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養基的一種或幾種。步驟(b)和步驟(c)中的四種細菌培養基的確定以使四種細菌分別擴培為目的。
高效氮循環細菌人工篩選在水生態修復和水處理中的應用，其步驟包括(e)將所述的高效氮循環細菌人工篩選得到的高效氮循環細菌進行富集；
(f)將富集後的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌優選菌混合後，投入製備好的載體進行固定化；(g)將製備好的固定化氮循環細菌置入廢水處理裝置中進行廢水處理或將固定化氮循環細菌用特製裝置置入自然水體中，對自然水體進行生態修復。
步驟(e)中採用連續進水方式對優選菌進行富集培養，分別按照氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌分類配製液體培養基，通過恆流泵控制進量，通過溶解氧探頭監測各種氮循環細菌富集過程中的DO值，溫度保持在28±1℃，定期收集，在0～4℃溫度條件下，7000r～12000r/min離心分別得到氨化、硝化、亞硝化和反硝化細菌。
氮循環細菌優勢菌富集培養裝置包括培養基貯罐、恆流泵、恆溫培養箱。
進行水生態修復時，步驟(g)中可以在自然水體中布設浮島，浮島懸掛固定化氮循環細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環細菌載體放置於具有網眼的容器中，使得固定化細菌能夠接觸水體，從而通過這種方式將固定化氮循環細菌釋放到自然水體中，對自然水體進行生態修復。
大多數富營養化湖泊水體的空間異質性差，缺乏相互分異的氧化-還原微環境，僅僅在水與沉積物界面存在明顯的相互分異的氧化-還原微環境。從宏觀上看，應用固定化氮循環細菌技術，由於採用具有特殊微孔結構的固定化載體，構成了載體內外相互分異的硝化-反硝化微環境，這樣便提供了一種存在於釐米尺度上的人工製造的氧化-還原界面。這種人工微環境在自然水體中的存在類似於自然水體中水-沉積物界面具有的硝化-反硝化功能，人為營造了一種具有良好水氣通道和硝化-反硝化微孔立體結構界面的微環境，將僅存在於自然水體中水-沉積物界面的氧化-還原微環境從平面擴展到了立體空間。載體的這種人工微環境在自然水體中的存在，彌補了目前富營養化湖泊水體中因大量水生高等植物衰亡導致的水體均一性增加、非均一性(異質性)減少而使氧化-還原環境惡變及水體自淨能力下降的不足。由於固定化載體在水體中的布設起到了一種在類似於荒漠化的均一性自然水體中引入一種人工製造的非均一性的劇烈的氧化-還原環境，大大增加了水體的硝化-反硝化能力，增加了水體氮素的轉化效果。另一方面，從微觀上來說，隨著氮循環細菌從載體中向水體釋放和擴散，水體中的氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌、反硝化細菌數量大大增加，水體中的有機氮經氮循環細菌氨化作用轉化為氨氮和氣態的NH3，氨氮在載體表面富氧區被氧化成硝態氮，硝態氮在固定化載體內部缺氧區被反硝化細菌還原為氣態氮並進入大氣，水體中不同形態的氮營養鹽正是在生態工程實驗區水體中氮循環細菌釋放區域數量分布上的差異，在水域內交替進行硝化-反硝化的過程中逐漸被去除。
應用實施時對生態工程實際布設區的周邊自然環境與汙染源進行調查，確定鄰近水體的流態與進水水質，確定工程區的具體分布，並開始進行工程區水體水質監測。當工程區水體水質和水溫確定已經能夠保證水生高等植物生長時，向人工浮島引種水生高等植物。水生高等植物的引種，使水體中增加了許多根際微生態系統，而固定化氮循環細菌的釋放，又使水生高等植物根際細菌明顯增加，從而強化了氮循環細菌-水生植物互利共生淨化實驗區水質效果。
3、有益效果本發明通過改進菌種的篩選和富集方法，得到除氮效果更好的高效氮循環細菌。這些高效氮循環細菌應用於生活汙水、工業廢水的治理以及對富營養化水體的生態修復時，增強了生態工程-固定化技術對惡劣環境的耐受能力，克服以往技術在秋冬季節基本失效或被迫停止的缺點，實現了生態工程在較低溫度下的連續運行。增加了固定化氮循環細菌-水生植物互利共生淨化實驗區水質效果。通過氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌的作用，使自然水體、生活汙水、工業廢水中各種形態的氮按照氮循環反應逐步被去除，反應終產物主要為氮氣，避免了對氮汙染的治理僅僅成為氮素離子形態的轉變和簡單遷移。對氮素去除具有明顯的效果。
四
圖1為高效氮循環細菌人工篩選流程示意圖；圖2為氮循環細菌優勢菌的富集培養裝置結構示意圖；圖3為各種氮循環細菌培養基的成分組成；圖4-氮循環細菌1號革蘭氏陽性菌株(氨化細菌)形態圖；圖5-氮循環細菌2號革蘭氏陰性菌株(硝化細菌)形態圖；圖6-氮循環細菌3號革蘭氏陰性菌株(亞硝化細菌)形態圖；
圖7-氮循環細菌4號革蘭氏陰性菌株(反硝化細菌)形態圖。
五具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發明實施例11.採集細菌水樣在湖泊等水體中的各種水生高等植物生長區，用已滅菌的無菌試管(15×1.5cm)伸入水面以下20～30cm水層取樣，取樣後立即封口，在實驗室待接種。
2.第一次擴培分別配製硝化細菌、反硝化細菌、亞硝化細菌、氨化細菌培養基各200ml，(其中硝化細菌的培養基成分為NaNO31g，Na2CO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.4g，H2O 1000ml，pH值8.2；亞硝化細菌培養基成分為(NH4)2SO40.2g，K2HPO40.1g，MgSO40.05g，NaCl 0.2g，FeSO40.04g，CaCO30.5g，H2O 100ml，pH值7.2；氨化細菌的培養基成分為牛肉膏4.5g，蛋白腖9.0g，NaCl 4.5g，H2O 1000ml，pH值7.2～7.4；反硝化細菌培養基成分為KNO32g，檸檬酸鈉5g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.2g，H2O 1000ml，pH值7.2～7.6。每種培養基分別裝入兩個250ml錐形瓶中，每瓶100ml，121℃溼熱滅菌20min，無菌條件下向每個錐形瓶中接入5ml水樣，置於搖床上28℃培養48h，並觀察菌種生長狀態。
3.初步分離分別配置各種菌的固體培養基，將擴培後的菌種進行平板劃線分離，每瓶液體培養基劃4個平板。28℃培養48h，注意觀察菌種生長狀況。
4.富集根據平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的分別進行富集培養。這些單個微生物有可能是同種微生物，也有可能是不同種微生物。28℃培養48h，中間進行鏡檢觀測。
5.分離純化方法同初步分離
6.檢測轉化效果將分離純化後的菌種投放待測水樣中進行轉化試驗，分別測N的轉化率，以轉化率高的菌為優選菌，標記待混合。
7.第二次富集採用附圖2氮循環細菌富集裝置分別對分離純化後的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌進行第二次富集，以備固定化氮循環細菌之用。實驗裝置包括液體培養基貯存罐(1)、恆流泵(2)、溶解氧探頭和溶解氧控制器(4)、恆溫培養箱(3)和氮循環細菌搜集罐(5)。溫度保持在28±1℃，pH值控制在7.2～8.5之間。基本富集流程如下分別按照氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌分類配製液體培養基，通過恆流泵控制進量，其中富集氨化細菌時pH控制在7.2～7.4之間，富集硝化細菌時pH控制在8.3～8.6之間，富集亞硝化細菌時pH控制在7.1～7.3之間，富集反硝化細菌時pH控制在7.2～7.6之間；通過溶解氧探頭監測各種氮循環細菌富集過程中的DO值；氨化、硝化、亞硝化細菌富集時控制溶解氧5.0～8.0之間，反硝化細菌富集時控制溶解氧在1.0以下；各種氮循環細菌富集時溫度保持在28±1℃，定期收集，在0～4℃溫度條件下，7000r～12000r/min離心分別得到氮化、硝化、亞硝化和反硝化細菌備用。
8.固定化優選菌將富集後的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌優選菌混合後，投入製備好的載體進行固定化。
實施例2高效固定化氮循環細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)應用於湖泊、水庫等水體的富營養化生態工程和生態修復(以貴陽紅楓湖為例)應用實施方法A.製備固定化氮循環細菌(包括固定化氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌)B.對生態工程實際布設區的周邊自然環境與汙染源進行調查，確定鄰近水體的流態與進水水質，確定工程區的具體分布，並開始進行工程區水體水質監測。在紅楓湖上流5600m2水域內，建設全年高效淨化水質的生態工程區域，在生態工程區內布設4個25m2剛性浮島和2個100m2軟體浮島，每一個生態浮島懸掛一個固定化氮循環細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環細菌載體放置於特製的具有網眼的容器中，使得固定化細菌能夠接觸水體，並置於水面之下20～30cm處。採用固定化氮循環細菌作為貴陽紅楓湖生態工程區的先鋒種群，運用固定化高效氮循環細菌轉化實驗區水體氮素，另外通過載體的微孔結構形成的硝化-反硝化環境轉化實驗區水體氮素汙染物；同時，載體中氮循環細菌的釋放增加生態工程實驗區單位體積水體中的氮循環細菌數量，並初步增加了水體中的硝化-反硝化界面，增強了實驗區水體的氮素釋放活動，為下一步引種水生高等植物創造了條件。
C.監測工程區水體水質和水溫，當確定已經能夠保證水生高等植物生長時，向人工浮島引種水生高等植物。水生高等植物的引種，使水體中增加了許多根際微生態系統，而固定化氮循環細菌的釋放，又使水生高等植物根際細菌明顯增加，從而強化了氮循環細菌-水生植物互利共生淨化實驗區水質效果。
高效氮循環細菌人工篩選應用於湖泊、水庫等天然水體的富營養化生態工程和生態修復與其它技術相比有以下明顯優點A)採用固定化細菌技術，增強生態工程-固定化技術對惡劣環境的耐受能力，克服以往技術在秋冬季節基本失效或被迫停止的缺點，實現了生態工程在較低溫度下的連續運行。
B)固定化氮循環細菌運行一定時間後在載體微孔中形成溶解氧梯度分布、表面好氧、內部厭氧的環境，使氮循環細菌在載體呈上梯度分布，為連續硝化-反硝化反應提供了條件；同時，在均一化水體中，載體的存在引入了大量硝化-反硝化界面，極大地增強了水體的不均一性，提供了湖泊、水庫等水體硝化與反硝化條件，增強了硝化-反硝化效果。
C)因固定化氮循環細菌生長與繁殖較快，並向周圍水體擴散，使引種的水生高等植物根際微生物數量比無固定化氮循環細菌人工浮島處水生高等植物根際微生物高1～2個數量級，增加了固定化氮循環細菌-水生植物互利共生淨化實驗區水質效果。
D)固定化氮循環細菌作為先鋒物種改善了荒漠化水體的水質，為水生高等植物等的引種提供了條件。
E)本方法以固定化氮循環菌的釋放為基礎，而釋放出的氮循環菌將隨水流進入下遊水體，促進下遊水體的氮素釋放，並抑制大腸桿菌等有害菌群的生長，增強全流域的自淨能力與生態系統的穩定性。
F)採用高效固定化氮循環細菌治理水體中氮汙染，反應終產物主要為氮氣，而不是停留在有害的中間產物狀態，避免了對氮汙染的治理僅僅成為氮素離子形態的轉變和簡單遷移。
經過固定化氮循環細菌治理後，實驗區總氮、非離子氨和亞硝酸鹽氮分別比工程前明顯降低，工程後排入紅楓湖的非離子氨＜0.02mg/L，NO2--N≤0.1mg/L，工程後Chla平均值僅為3.5ug/L，達到了生態工程修復水體的效果。
實施例3高效固定化氮循環細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)應用於河流等流動水體(以貴陽後午灣為例)具體實施方案A.在天然水體水生植物生長根區取水樣待接種B.按實施例1進行擴培、初步分離、富集、純化、二次富集後，得到高效的硝化細菌、亞硝化細菌、氨化細菌、反硝化細菌。其中硝化細菌的培養基成分為NaNO31.1g，Na2CO31.2g，NaCl 0.7g，K2HPO40.6g，MgSO40.6g，FeSO40.5g，H2O 1000ml，pH值8.5；亞硝化細菌培養基成分為(NH4)2SO40.3g，K2HPO40.2g，MgSO40.06g，NaCl 0.3g，FeSO40.05g，CaCO30.6g，H2O 100ml，pH值7.5；氨化細菌的培養基成分為牛肉膏5.0g，蛋白腖10.0g，NaCl 5.0g，H2O 1000ml，pH值7.6；反硝化細菌培養基成分為KNO32.1g，檸檬酸鈉5.2g，K2HPO41.1g，KH2PO41.1g，MgSO40.3g，H2O 1000ml，pH值7.8。
C.將四種氮循環細菌混合投入載體中，製成高效的固定化氮循環細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)D.對後午灣的周邊自然環境與汙染源進行調查，確定鄰近水體的流態與進水水質，確定工程區的具體分布，並開始進行工程區水體水質監測。
E.在後午灣建立生態工程實驗區，實驗區分為對照區、固定化氮循環細菌實驗區，水生植物+固定化氮循環細菌實驗區，將20kg固定化氮循環細菌分為5kg，5kg，5kg，5kg四部分，分別用生態浮島布置於固定化氮循環細菌實驗區與水生植物+固定化氮循環細菌實驗區的兩端，每一個生態浮島懸掛一個固定化氮循環細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環細菌載體放置於特製的具有網眼的容器中，並置於水面之下20～30cm處，使得固定化細菌能夠接觸水體。
F.載體中氮循環細菌的釋放增加單位體積水體中的氮循環細菌數量，並初步增加了水體中的硝化-反硝化界面，增強了生態工程試驗區水體的氮素釋放活動，為下一步引種水生高等植物創造了條件。
G.監測工程區水體水質，當確定已經能夠保證水生高等植物生長時，向人工浮島引種水生高等植物。水生高等植物的引種，使水體中增加了許多根際微生態系統，強化了氮循環細菌的處理效果。而固定化氮循環細菌的釋放，又使水生高等植物根際細菌明顯增加；且隨著水流的運動，氮循環細菌進一步向下遊擴散，促進下遊水體的氮素擴散，增強全流域的自淨能力。
應用效果應用本方法釋放氮循環細菌對後午灣試驗區內水生植物根區細菌數量有明顯的影響，生態浮島內水生植物根區的反硝化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和氨化細菌數量均在4至6個數量級之間，明顯高於無生態浮島內的水生植物根區細菌數，平均高1～2個數量級，其中反硝化細菌、亞硝化細菌和氨化細菌MPN值達極顯著水平(P＜0.01)；F檢驗結果表明，出水處反硝化細菌MPN值均極顯著高於進水處MPN值(P＜0.01)；方差分析表明，上敞水區、下敞水區、距固定化氮循環細菌10cm、30cm處，以及出水處的亞硝化細菌MPN值均極顯著高於進水處亞硝化細菌MPN值(P＜0.005)；試驗區內各處的氨化細菌MPN值均極顯著高於進水處的氨化細菌MPN值(P＜0.005)；釋放的硝化細菌數在試驗區內各處均明顯高於進水處，其中距固定化氮循環菌人工浮島10cm處的硝化細菌數最高，其MPN值極顯著高於進水處(P＜0.001)。試驗期間，下遊水域中氮循環細菌數也明顯高於進水處。
經過固定化氮循環細菌治理後，實驗區總氮、亞硝酸鹽氮、非離子氨分別比工程前明顯降低，TN、NO3-、NH3從工程前的最高值4.613mg/L、0.075mg/L、0.15mg/L工程後分別下降為0.21mg/L，0.008mg/L，和0.05mg/L，表明採用高效固定化氮循環細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化細菌)技術對應用於河流等流動水體的氮素去除具有明顯的效果。
實施例4高效固定化氮循環細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)應用於處理溫度變化範圍廣的廢水(能適應80℃的高溫，並在7℃的冬季水體中仍能保持活性)a在天然水體水生植物生長根區取水樣待接種b按實例1進行擴培、初步分離、富集、純化、二次富集後，得到高效的硝化細菌、亞硝化細菌、氨化細菌、反硝化細菌。其中硝化細菌的培養基成分為NaNO30.8g，Na2CO30.9g，NaCl 0.4g，K2HPO40.4g，MgSO40.4g，FeSO40.3g，H2O 1000ml，pH值8.0；亞硝化細菌培養基成分為(NH4)2SO40.1g，K2HPO40.1g，MgSO40.04g，NaCl 0.1g，FeSO40.03g，CaCO30.4g，H2O 100ml，pH值7.0；氨化細菌的培養基成分為牛肉膏4.0g，蛋白腖8.0g，NaCl 4.0g，H2O 1000mlpH值7.0；反硝化細菌培養基成分為KNO31.8g，檸檬酸鈉4.8g，K2HPO40.8g，KH2PO40.8g，MgSO40.1g，H2O 1000ml，pH值7.0。
c將四種氮循環細菌混合投入載體中，製成高效的固定化氮循環細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)d將固定化氮循環細菌投入廢水處理裝置中，當實驗湖水溫度下降至7℃時，出水的TN、NH4+-N的去除率分別比進水下降55.6％和58.9％，雖然呈現出一定的溫度效應，但此結果表明固定化氮循環細菌在冬季低溫條件下仍保持了較高的除氮能力；當實驗湖水升到50℃時，載體內所含氮循環細菌MPN值比游離細菌高4個數量級；當實驗水溫上升到80℃高溫時，載體內氮循環細菌仍保持了一定數量的存活數。
實施例5高效固定化氨化-硝化細菌應用於處理高濃度氮汙染廢水a取汙水處理廠中好氧段水樣和硝化汙泥，用待處理廢水進行馴化，得到高效氨化細菌和硝化細菌。
b將氨化細菌和硝化細菌按實例1分別進行二次富集後，混合投入載體中，製成高效的固定化氨化-硝化細菌。
c將固定化氨化-硝化細菌投入汙水處理裝置中，進水總氮(TN)為112mg/l，銨氮(NH4+-N)為60.5mg/L。工藝運行條件為缺氧攪拌3h，曝氣7h，沉澱排水3h，滯留時間為13h。實驗溫度為(28±1)℃。結果表明，經過30d連續淨化試驗，合成廢水經過高效固定化氨化-硝化細菌處理後，TN、NH4+-N濃度均有不同程度下降，淨化效果逐步明顯，試驗第10天，每批次出水的TN和NH4+-N的去除率穩定在75％和92％左右。
實施例6高效固定化硝化-反硝化細菌應用於處理生活汙水a取汙水處理廠好氧段硝化汙泥，用人工廢水馴化後得到高效硝化細菌b取汙水處理廠厭氧段反硝化汙泥，用人工廢水馴化後得到高效反硝化細菌c將得到的硝化細菌和反硝化細菌混合後固定化，製成高效固定化硝化-反硝化細菌。投入汙水處理裝置中，進水CODCr為240mg/L，BOD5為98mg/L，銨氮(NH4+-N)為23mg/L，pH值為6～9，控制滯流時間為8h，缺氧攪拌2h，曝氣6h。經處理後汙水CODCr去除率達78％，NH4+-N的去除率高達95％。
實施例7高效固定化硝化細菌應用於處理廢水中的NH4+-N。
a.取汙水處理廠好氧段硝化汙泥，用人工廢水馴化後得到供試硝化細菌。
b.將固定化硝化細菌投入汙水處理裝置中，進水NH4+-N為60.5mg/L，曝氣時間為9h，沉澱、排水、閒置、進水時間共3h。結果表明，在30d的連續運行過程中，開始時NH4+-N的去除率逐日升高，10d後穩定達到每周期去除銨態氮95％。同時在進水時CODCr為340.7mg/L條件下，經過15d的連續運行，CODCr的去除率穩步增加到90％左右。
實施例8高效固定化反硝化細菌應用於處理廢水中的硝酸鹽a取汙水處理廠生物脫氮缺氧段汙泥，用合成廢水(含甲醇、硝酸鈉、硝酸鉀及適量KH2PO4、NaMoO4等，控制pH值為8)馴化65d，得到反硝化菌。
b將固定化反硝化細菌投入汙水處理裝置中，在30d的連續運行過程中，NO3-態N的去除率穩定增加，20d後達到良好的去除效果，硝酸鹽的去除率達78.5％並進入穩定的運行狀態即在第20～30d的運行過程中硝酸鹽的去除率穩定在78.5％左右。
實施例9高效氨化-硝化-亞硝化固定化細菌應用於處理高負荷有機質廢水a取汙水處理廠好氧段硝化汙泥，按實例1進行分離純化，用人工廢水馴化後分別得到高效氨化細菌、硝化細菌和亞硝化細菌。
b將得到的氨化細菌、硝化細菌和亞硝化細菌混合後固定化，製成高效固定化氨化-硝化-亞硝化細菌。投入汙水處理裝置中，進水CODCr為473.8mg/L，經高效固定化氨化-硝化-亞硝化細菌處理後，出水CODCr大幅度降低，去除率達到76％。
權利要求
1.一種高效氮循環細菌人工篩選，其主要包括以下步驟(a)在天然水體中水生植物生長根區採集含有土著氮循環細菌的水樣；(b)分別配製氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養基，接入水樣置於搖床上培養，進行擴培；(c)再分別配置固體培養基，將四種擴培後的菌種轉至平板培養；根據平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的分別進行富集培養，中間進行鏡檢觀測；(d)用初步分離的方法再次分離純化，將分離純化後的菌種投放待測水樣中進行轉化試驗，分別測N的轉化率，以轉化率高的菌為優選菌。
2.根據權利要求1所述的高效氮循環細菌人工篩選，其特徵在於步驟(b)中可以根據需要配製氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養基的一種或幾種。
3.根據權利要求2所述的高效氮循環細菌人工篩選，其特徵在於所述的步驟(b)和步驟(c)中的四種細菌培養基的確定以使四種細菌分別擴培為目的。
4.一種高效氮循環細菌人工篩選在水生態修復和水處理中的應用，其步驟包括(e)將權利要求1所述的高效氮循環細菌人工篩選得到的高效氮循環細菌進行富集；(f)將富集後的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌優選菌混合後，投入製備好的載體進行固定化；(g)將製備好的固定化氮循環細菌投入廢水處理裝置中進行廢水處理或將固定化氮循環細菌投入到自然水體中對自然水體進行生態修復。
5.根據權利要求4所述的高效氮循環細菌人工篩選在水生態修復和水處理中的應用，其特徵在於步驟(e)中採用連續進水方式對優選菌進行富集培養，分別按照氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌分類配製液體培養基，通過恆流泵控制進量，通過溶解氧探頭監測各種氮循環細菌富集過程中的D0值，溫度保持在28±1℃，定期收集，在0～4℃溫度條件下，7000r～12000r/min離心分別得到氨化、硝化、亞硝化和反硝化細菌。
6.根據權利要求5所述的高效氮循環細菌人工篩選在水生態修復和水處理中的應用，其特徵在於氮循環細菌優勢菌富集培養裝置包括培養基貯罐(1)、恆流泵(2)、恆溫培養箱(3)。
7.根據權利要求4～6所述的高效氮循環細菌人工篩選在水生態修復和水處理中的應用，其特徵在於步驟(g)中可以在自然水體中布設浮島，浮島懸掛固定化氮循環細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環細菌載體放置於具有網眼的容器中，使得固定化細菌能夠接觸水體，從而通過這種方式將固定化氮循環細菌釋放到自然水體中，對自然水體進行生態修復。
全文摘要
本發明屬於微生物人工篩選技術領域，涉及微生物人工篩選及其在環境治理中的應用。高效氮循環細菌人工篩選，其步驟為(a)採集含有土著氮循環細菌的水樣；(b)分別配製氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養基，進行擴培；(c)將四種擴培後的菌種轉至平板培養；然後進行富集培養，中間進行鏡檢觀測；(d)分離純化，以轉化率高的菌為優選菌。本發明增強了生態工程－固定化技術對惡劣環境的耐受能力，克服以往技術在秋冬季節基本失效或被迫停止的缺點，實現了生態工程在較低溫度下的連續運行。通過四種細菌的作用，使自然水體、生活汙水、工業廢水中各種形態的氮按照氮循環反應逐步被去除，對氮素去除具有明顯的效果。
文檔編號C12N1/20GK1693449SQ20051003883
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月12日 優先權日2005年4月12日
發明者李正魁, 濮培民, 寧安, 洪宇寧 申請人:南京大學