Lcksh2特異性化合物在治療自身免疫疾病與同種異體移植排斥反應中的應用的製作方法

2023-09-14 10:05:20 2

專利名稱：Lcksh2特異性化合物在治療自身免疫疾病與同種異體移植排斥反應中的應用的製作方法
背景技術：
與src相關的淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶p56lck(lck)，可通過其獨特的氨基末端區與T淋巴細胞的CD4胞質尾區相結合。結合了lck的CD4是T細胞級聯活化作用中的基本組份，而且完整的lck SH2區/CD4複合物是T細胞對抗原產生功能性免疫應答所必需的，對lck SH2區/CD4複合物的抑制作用將導致T細胞特異性免疫抑制。
許多多肽生長因子和激素通過某種信號傳導途徑來實現其細胞中的功能。從細胞表面上這些配體的受體到胞內效應物的信號傳導通常包括特異性蛋白底物通過起調節作用的蛋白酪氨酸激酶(PTK)和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用。酪氨酸的磷酸化作用在多細胞有機體的信號傳導中也許是首要的、甚至是唯一的標誌。受體結合與胞內PTKs在免疫系統細胞中調節著細胞增殖、分化與信號發送過程。
異常的蛋白酪氨酸激酶活性已被揭示或懷疑與許多病理狀況有關，如糖尿病、動脈粥樣硬化、牛皮癬、敗血症性休克、骨質喪失、貧血、很多癌症以及其它一些增生型疾病。因此，酪氨酸激酶及其參與的信號傳導途徑是藥物設計中潛在的目標。參見Levitzki等的綜述，《科學》(Science)267卷1782-1788頁(1995)。
信號傳導途徑中的許多蛋白質以低水平存在並常常具有相反的活性。這些信號分子的特性使得細胞可以通過效應物的亞細胞定位與並列以及通過阻遏來平衡其活性而控制信號的傳導，因而傳導途徑中一個細小的變化將能起到開關作用。
信號分子通過蛋白質間相互作用而並列造成的傳導複合物的形成，是通過特異停靠區序列基元來調節的。src同源2(SH2)區是非受體PTKs、激酶靶效應物分子等多種信號分子以及癌基因蛋白中發現的近100個胺基酸的保守的非催化序列，它在上述過程中起著關鍵的作用。SH2區對於自磷酸化的PTK受體及胞內酪氨酸激酶中存在的含有磷酸化酪氨酸的短肽序列是高度特異的。
已經證實，將近60種蛋白質，儘管它們具有不同的催化或其它功能區，但都具有一個約100個胺基酸的保守序列，即SH2區。現在還未能確切地知道體內哪些生理反應是由這些SH2區逐一控制的。而且，SH2區-配體/複合物間相互作用是高度特異的，因而配體/複合物結構上細小的變化將顯著改變配體/複合物與不同的SH2區結合的選擇性。
對SH2區非選擇性的拮抗作用的後果是非常嚴重的。例如src SH2區、lck SH2區和fyn SH2區結構上相似，各區之間具有高度的保守性。對src SH2區的拮抗作用將影響骨再吸收，而對lck SH2區(在此討論的)或fyn SH2區的拮抗作用將導致免疫抑制。在需要免疫抑制誘導的長期治療中，對骨再吸收的抑制作用是很討厭的。
而且，將可能的lck SH2區的拮抗劑與所有已知的60種SH2區進行結合實驗是不切實際的。目前，尚未有已知的化合物能與lck SH2區選擇性相互作用。
因此，提供可通過拮抗lck SH2區治療自身免疫疾病和同種異體移植排斥反應而又能避免無選擇性SH2拮抗劑產生的副作用的方法和化合物是非常必需的。
如本發明所公開的，已意外地發現lck SH2區選擇性拮抗劑可通過一系列SH2區亞型的結合實驗來鑑別，這些SH2區亞型由src SH2區、lck SH2區、fyn SH2區、SHPTP2 SH2區、p85區、Grb2 SH2區和hcp SH2區組成。
從下面將給出的結合信息可看出，已意外地發現了一些可與人lckSH2區特異結合的化合物，其與人lck SH2區結合的親和力比與人srcSH2區或人fyn SH2區結合的親和力高出50倍以上，而且，這些複合物與人hcp SH2區、人Grb2 SH2區、人SH PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合的親和力比其與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上，它們對於治療自身免疫疾病和同種異體移植排斥反應是有效的。
發明概述本發明提供了一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括給予受治療者具有療效量的一種化合物。該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；(b)可與人hcp SH2區、人Grb2區、人SH-PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
本發明也提供了一種抑制同種異體移植排斥反應反應的方法，該方法包括給予受治療者以抑制同種異體移植排斥反應量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；(b)可與人hcp SH2區、人Grb2區、人SH-PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
本發明還提供了一種誘導免疫抑制的方法，該方法包括給予受治療者誘導免疫抑制量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；(b)可與人hcp SH2區、人Grb2區、人SH-PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
發明詳述按照本文的用法，術語「自身免疫疾病」指任何以過度活躍的免疫應答或錯誤地針對自身抗原的免疫應答為特徵的疾病。優選的自身免疫疾病是類風溼性關節炎。也包括其它疾病，如多發性硬化、系統性紅斑狼瘡和I型糖尿病。
按照本文的用法，術語「治療」及派生詞指預防或治療的療法。
按照本文的用法，術語「化合物」指非肽的化學化合物。
按照本文的用法，除非另外定義，術語「lck SH2區拮抗劑」指的是這樣一種化合物，(a)它可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上，優選高100倍以上，(b)它可與人hcp SH2區、人Grb2 SH2區、人SHPTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上，優選低100倍以上。
本發明提供了一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括給予受治療者具有療效量的一種化合物。該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；(b)可與人hcp SH2區、人Grb2 SH2區、人SH-PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
本發明的一個優選方面是提供了一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括給予受治療者具有療效量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上。
本發明的一個優選方面是提供了一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括給予受治療者具有療效量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上；(b)可與人hcp SH2區、人Grb2 SH2區、人SH-PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上。
本發明的一個優選方面是提供了一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括給予受治療者具有療效量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上。
本發明也提供了一種抑制同種異體移植排斥反應反應的方法，該方法包括給予受治療者以抑制同種異體移植排斥反應量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上，優選高100倍以上；(b)可與人hcp SH2區、人Grb2 SH2區、人SH PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上，優選低100倍以上。
本發明的一個優選方面是提供了一種抑制同種異體移植排斥反應反應的方法，該方法包括給予受治療者以抑制同種異體移植排斥反應量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上，優選高100倍以上。
本發明也提供了一種誘導免疫抑制的方法，該方法包括給予受治療者以誘導免疫抑制量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上，優選高100倍以上；(b)可與人hcp SH2區、人Grb2SH2區、人SH-PTP2 SH2區和人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上，優選低100倍以上。
本發明的一個優選方面是提供了一種誘導免疫抑制的方法，該方法包括給予受治療者誘導免疫抑制量的一種化合物，該化合物(a)可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上，優選高100倍以上。
利用在大腸桿菌中表達的融合蛋白的SH2區可在體外測定化合物對不同的人SH2區的抑制活性，具體方法將在實施例11中詳述。
表1和2中所列的數據顯示了所述化合物拮抗lck SH2區的能力。在實施例11的實驗中，顯示出選擇性lck SH2區拮抗活性的化合物用已知的試驗檢驗了其誘導免疫抑制活性的能力。優選的試驗包括1)IL2產生試驗-本試驗測量了T細胞在應答不同刺激時IL2的產量。最常用的T細胞是Jurkat人T細胞系。Jurkat細胞分別用a)促有絲分裂的凝集素(植物血細胞凝集素或PHA)加鈣離子載體或加伏波酯，或b)T細胞受體抗體加伏波酯刺激。以對人IL2特異的ELISA測定的IL2表示其活性水平和2)三道人混合淋巴細胞反應(MLR)-本方法能模擬對外源抗原的應答。本實驗測定了來自某個體的淋巴細胞對存在於另一個體血細胞中的外源抗原的反應。來源於三種不同供體血中的淋巴細胞(三道反應)混合在一起並在完全生長培養基中培養4-5天。通過胸腺嘧啶摻入測出的細胞增殖應答反映了其活性水平。
在這些實驗中測出的這些化合物的活性，在本領域被認為與體內治療自身免疫疾病的療效有關，也被認為與體內抑制同種異體移植排斥反應反應的效果有關，還被認為與體內誘導免疫抑制的效果有關。
因此本發明提供了一種誘導免疫抑制的方法，該方法包括給予誘導免疫抑制有效量的本文定義的一種lck SH2區拮抗劑。藥物可以通過任何常規的途徑給予需要免疫抑制的患者，其途徑包括但不限於靜脈內、肌內、口服、皮下、皮內和非腸道給藥。誘導免疫抑制的有效劑量為每kg體重約0.001-10.0mg。在0.001mg-10.0mg/kg體重間選擇的劑量是有效而無毒的。所用的劑量將以每天1～6次給予患者。
本發明中公開的誘導免疫抑制的方法也可通過使用含有本文定義的lck SH2區拮抗劑和合適的藥劑載體的藥劑組合物來實現。該組合物可含0.05mg-500mg的lck SH2區拮抗劑，並可組合成任何適合於所選給藥方式的形式。適合於口服的組合物包括固體形式，如藥丸、膠囊、粒劑、片劑和粉劑；液體形式，如溶液、糖漿、酏劑和懸液。適於非腸道給藥的組合物形式包括無菌溶液、乳劑和懸液。
本發明也提供了一種抑制同種異體移植排斥反應反應的方法，該方法包括給予抑制同種異體移植排斥反應有效量的本文定義的lck SH2區拮抗劑。藥物可以用任何常規的途徑給予剛接受同種異體移植或準備接受同種異體移植的患者，其途徑包括但不限於靜脈內、肌內、口服、皮下、皮內和非腸道給藥。抑制移植排斥反應的有效劑量大約為每kg體重0.001mg-10.0mg。在大約0.001mg-10.0mg/kg體重間所選的劑量是有效而無毒的。所用的劑量將以每天1～6次給予患者。
本發明中公開的抑制同種異體移植排斥反應的方法也可通過使用含有本文定義的lck SH2區拮抗劑和合適的藥劑載體的藥劑組合物的形式來實現。該組合物可含0.05mg-500mg的lck SH2區拮抗劑，並可組合成任何適合於所選給藥方式的形式。適合於口服的組合物包括固體形式，如藥丸、膠囊、粒劑、片劑和粉劑；液體形式，如溶液、糖漿、酏劑和懸液，適於非腸道給藥的組合物形式包括無菌溶液、乳劑和懸液。
另外，藥物可配製成無菌的固體組合物形式，在給藥的時候可用無菌的水、生理鹽水或其它合適的無菌注射用介質溶解或懸浮。載體意味著包括必需且惰性的粘合劑、懸浮劑、潤滑劑、香味劑、甜味劑、防腐劑、染色劑和包被。
最佳的給藥量容易由本領域的技術人員確定，並且它將隨所用的具體的lck SH2區拮抗劑、製劑濃度、給藥方式以及病情的進展情況而變。還需要根據所治療的具體患者的其它因素調整劑量，包括患者的年齡、體重、飲食和給藥時間。
本發明也提供了lck SH2區拮抗劑在製造用於治療自身免疫疾病的藥物中的應用。
本發明也提供了lck SH2區拮抗劑在製造用於抑制同種異體移植排斥反應反應的藥物中的應用。
本發明也提供了lck SH2區拮抗劑在製造用於誘導免疫抑制的藥物中的應用。
本發明還提供了用於治療自身免疫疾病的含lck SH2區拮抗劑的藥劑組合物。
本發明還提供了用於抑制同種異體移植排斥反應的含lck SH2區拮抗劑的藥劑組合物。
本發明還提供了用於誘導免疫抑制的含lck SH2區拮抗劑的藥劑組合物。
按照本發明使用本發明的方法，將不會出現不可接受的毒副作用。
即便沒有進一步的說明，確信，本領域的技術人員能利用以上說明最大限度地應用本發明。
因此，以下實施例僅供示例說明，而不應被理解成以任何方式對本發明的範圍進行限制。
實驗詳述除非特別指明，本文所用的符號°指℃。
L-3，5-二溴酪氨酸可用本領域已知的方法製備，例如在《甲狀腺激素和類似物，I.合成、物理性質及理論計算》(Thyoid Hormonesand Analogues.I.Synthesis，Physical.Properties and TheoreticalCalculations)E.C.Jorgensen，《激素蛋白質及肽》(HormonalProteins and Peptides)第六卷，1978，Academic Press，N.Y.一文及其引用文獻中所描述的方法。
L-3，5-二溴-N-三氟乙醯-酪氨酸甲酯(在實施例2(e)和實施例2B(b)中用到)可按下面方法製備。
將L-3，5-二溴酪氨酸(500g)懸浮在甲醇(5升)中，並向攪拌的懸浮液中通乾燥氯化氫5小時。反應混合液蒸發乾後，殘留物懸浮在水(4升)中，用40％氫氧化鈉調pH至6。收集沉澱並用水洗滌，得到L-3，5-二溴酪氨酸甲酯(467g，90％)，熔點201°-203°。所得酯(768g)懸浮在氯仿(2.7升)和乙酸乙酯(2.7升)中，在0.5小時內加入三氟乙酸酐(565g)，保持溫度低於35°。混合物放置過夜，加水(2升)，用飽和碳酸氫鈉溶液調pH至7。移出有機相，用水洗滌，用無水硫酸鎂乾燥並蒸發。殘留物用含水甲醇重結晶，得到L-3，5-二溴-N-三氟乙醯酪氨酸甲酯(786g，81％)，熔點136°-7°。
下面實施例6中用到的方案1
4-反式-氨甲基環己基羧酸1中的氨基用標準的保護基團，如丁氧羰基(Boc)基團(Boc酐、NaOH、H2O、二
烷)保護以形成2。然後用DCC等偶聯劑偶聯到開氏肟樹脂(Kaiser，E.T.、等《美國化學學會學報)》(J Am Chem Soc)1985年107卷7087-7092頁)上形成3。隨後在標準條件(25％三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷)下將胺去保護形成4。4在標準條件(如在DMF中用HBTU、NMM或在DMF或NMP中用DCC或DIC)下醯化形成5。然後用不同的胺使化合物5從樹脂上裂解形成最終所需的產物6。
化合物1到10按照下面實施例1到10製備。
實施例17-〔D，L-α-氨基-α-(4-羧苯基)乙醯氨基〕-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-頭孢-4-羧酸(化合物1)的製備
a)4-羥甲基苯甲醛溶於無水四氫呋喃(200ml)的1，4-苯二甲醛(50.0g，0.373mol)溶液在冰浴中於氮氣下滴加溶於500ml四氫呋喃中的三(叔丁氧基)氫化鋁鋰(104.0g，0.410mol)。在冰浴中攪拌半小時後，將反應混合液傾入2L冰冷的2N鹽酸中。該水溶液用四批800ml的乙醚萃取，合併的醚相用碳酸氫鈉溶液及鹽水洗並乾燥。溶劑蒸發後得到46g粗製品，用色譜(氧化鋁，乙醚洗脫〕純化後得到晶狀的題頭化合物(17.6g，35％)熔點44.5-46℃。
b)5-(4-羥甲基苯基)乙內醯脲向4-羥甲基苯甲醛(10.0g，73.5mmol)和碳酸銨(17.1g，150mmol)在110mL加熱到50℃的60％乙醇水溶液中的混合物裡，邊攪拌邊加入溶於10ml水中的氰化鈉(4.0g，81mmol)。將反應混合物攪拌並在50-60℃下加熱3小時，隨後在85℃加熱一小時。在冰浴中冷卻後，用濃鹽酸將溶液pH調至6。冷卻過夜，沉澱下來的固體經過濾、水洗、乾燥後，得到題頭化合物(11.0g，72％)熔點189-196℃。
c)4-羥甲基苯基氨基乙酸將實施例1(b)的化合物(10.9g，53mmol)和八水合氫氧化鋇(25.5g，81mmol)在125ml水中的混合物攪拌回流18小時。反應混合物冷卻後用濃硫酸酸化至pH為1。濾除硫酸鋇並將濾液的pH用碳酸鉛調升至6。濾去硫酸鉛後，濾液用硫化氫飽和並濾去硫化鉛。通過在減壓條件下與乙醇共沸，將水溶液濃縮至100mL。冷卻後，得到題頭化合物(5.2g，54％)熔點230-231℃。
d)N-叔丁氧基羰基-4-羥甲基苯基氨基乙酸向溶於160mL水的4-羥甲基苯基氨基乙酸(8.0g，44mmol)和三乙胺(8.8g，87mmol)溶液中加入溶於120mL四氫呋喃的叔丁氧基羰基疊氮化合物(6.95g，49mmol)。室溫下攪拌過夜後，反應混合物用200mL乙醚洗兩次，水相被乙醚覆蓋，用3N鹽酸將水溶液在冰浴中酸化至pH 3-3.5。酸化的溶液用乙醚抽提，合併有機抽提物用鹽水洗，乾燥、蒸發得到的油狀物用氯仿-己烷研磨，濾出固體，得到題頭化合物(7.7g，63％)熔點139-141.5℃。
e)N-叔丁氧基羰基-4-羥甲基苯基氨基乙酸甲酯硫酸二甲酯(3.1g，24mmol)和溶於10mL甲醇的二異丙胺(5.2g，40mmol)加入實施例1(e)化合物(5.6g，20mmol)溶液中。將反應混合液回流20分鐘後用2N鹽酸處理。其水溶液用乙酸乙酯抽提三次，合併的有機抽提物用5％碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗，蒸發掉有機溶劑得到油狀題頭化合物(3.2g，55％)。
f)N-叔丁氧基羰基-4-羧基苯基氨基乙酸甲酯溶於50ml丙酮的實施例1(e)化合物(0.62g，2.1mmol)的溶液於25℃下用過量的Jones試劑(8N鉻酸)處理。反應混合物於室溫下攪拌2小時。濾除綠色固體，過量的CrO3用異丙醇分解。濾液用無水硫酸鈉乾燥並用活性炭處理。濾去固狀物，濾液蒸乾後得到0.38g白色固體題頭化合物熔點126-128℃。
g)N，N′-雙(1-甲基乙基)氨基甲亞胺酸1，1-二甲基乙酯題頭化合物可根據Santini等的方法(《有機化學雜誌》(J.Org.Chem.)1994年59卷2261頁)製備。在CuCl(0.01當量)存在下，純的N，N′-二異丙基碳化二亞胺(1.0當量)與2-甲基-2-丙醇(1.15當量)室溫下反應一天。
h)N-叔丁氧基羰基-4-(叔丁氧基羰基)苯基氨基乙酸甲酯溶於無水二氯甲烷中的實施例1(f)化合物(1.0g，3.2mmol)和N，N′-雙(1-甲基乙基)氨基甲亞胺酸1，1-二甲基乙酯(1.3mg，6.5mmol)溶液在室溫下攪拌過夜。濾除二異丙脲，過量的N，N′-雙(1-甲基乙基)氨基甲亞胺酸1，1-二甲基乙酯用水分解。分層後二氯甲烷溶液用5％碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗，用無水硫酸鈉乾燥。溶劑蒸發後的殘餘物用乙醚處理。濾除殘餘的二異丙脲，有機濾液蒸發後得到油狀的題頭化合物(870mg，74％)。
i)N-叔丁氧羰基-4-(叔丁氧羰基)苯基氨基乙酸將實施例1(h)化合物(760mg，2.1mmol)在18ml 5％硫酸氫鈉水溶液、18ml 5％碳酸鈉水溶液和36ml甲醇中的溶液在室溫下攪拌5小時。用水稀釋反應液，用乙酸乙酯洗，水溶液用新鮮的乙酸乙酯覆蓋並用3N HCl酸化到pH 2。分離各層後水溶液用乙酸乙酯抽提2次以上。乙酸乙酯溶液經無水硫酸鈉乾燥、蒸發後，產生白色固體的題頭化合物(600mg，82％)熔點77-79℃。
j)7-氨基-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-頭孢烯-4-羧酸叔丁酯溶於磷酸緩衝液(pH 6.4)的7-氨基頭孢菌烷酸叔丁酯(根據Blacklock等的方法(《有機化學雜誌》(J.Org.Chem.)1989年54卷3907頁)，利用7-氨基頭孢菌烷酸與異丁烯和硫酸在1，2-二甲氧基乙烷中反應製得)、碳酸氫鈉和2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑溶液，60℃攪拌6小時。反應混合液通過鹽酸/乙酸乙酯抽提進行後處理，得到了題頭化合物。
k)7-〔D，L-α-(叔丁氧基羰基氨基)-α-〔4-(叔丁氧基羰基)苯基〕〕乙醯氨基-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-頭孢烯-4-羧酸叔丁酯實施例1(i)中的N-叔丁氧基羰基-4-(叔丁氧基羰基)苯基氨基乙酸(351mg，1mmol)、實施例1(j)中的7-氨基-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-頭孢烯-4-羧酸叔丁酯(368mg，1mmol)和DCC(212mg，1mmol)在無水二氯甲烷中的混合液在室溫攪拌3小時。濾去二環己脲並將濾液蒸乾。殘餘物用乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯溶液依次用5％碳酸氫鈉、2.5％硫酸、5％碳酸氫鈉和鹽水洗，用無水硫酸鈉乾燥。溶劑蒸發後得到0.6g粗製品。用矽膠色譜法(用30∶70乙酸乙酯/苯洗脫)純化後得到題頭化合物(430mg，61％)熔點110-112℃。
l)7-〔D，L-α-氨基-α-(4-羧基苯基)乙醯氨基〕-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-頭孢烯-4-羧酸實施例1(k)中化合物(400mg，0.57mmol)在7.2mL三氟乙酸和0.8ml苯硫酚中攪拌。反應混合物於0℃攪拌30分鐘並於室溫攪拌1小時。在40℃水浴中將溶劑蒸發後，殘餘物用乙醚研磨三次；固體產物用少量的甲醇溶解，加入乙醚使產物沉澱，得到題頭化合物(300mg)熔點170-175℃。
實施例2L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)-甲腺原氨酸(化合物2)的製備
(a)O-甲氧基苯基乙腈(23.64g)和3，6-二氯噠嗪(23.93g)溶於無水二甲基甲醯胺(50ml)，在攪拌下於2小時內緩慢分批加入氫化鈉(16.23g，50％油分散體)。反應混合物傾在過量的碎冰上用二氯甲烷抽提。分出有機相用水洗，無水硫酸鎂乾燥，活性炭過濾並蒸發至幹。殘餘物從二氯甲烷/汽油中結晶，得到1-(6-氯-3-噠嗪基)-1-(2-甲氧基苯基)-乙腈(35.5g，85％)，熔點91-92℃。
(b)得到的腈(33.5g)用濃鹽酸(200ml)、乙酸(100ml)和水(100ml)溶解並攪拌回流。6小時後蒸走溶劑，殘餘物從乙酸乙酯/汽油中重結晶，得到2-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)-苯甲醚(21.4g，77％)，熔點142°-3°。
(c)得到的噠嗪酮(15.7g)溶於三氯氧化磷(22ml)，於55°(油浴)加熱攪拌1小時。將冷卻後的混合物緩慢傾在碎冰上並用二氯甲烷抽提。分離有機層並用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，用無水硫酸鎂乾燥並蒸乾。將殘餘物與較小的一份(來自2.16g噠嗪酮)合併，用沸騰的汽油(60°-80°)抽提幾次，合併抽提物，活性炭過濾並蒸乾。得到2-(6-氯-3-噠嗪基甲基)苯甲醚(16.95g，87％)，熔點63℃。
(d)三(三氟乙酸)碘(在乙酸酐和三氟乙酸中碘(2.54g)與發煙硝酸(5ml)反應製備)的三氟乙酸酐(25ml)懸浮液，於-15℃攪拌下加入溶於三氟乙酸(20ml)和三氟乙酸酐(25ml)的上述氯噠嗪(9.39g)，保持溫度低於-15°。室溫下攪拌過夜，濃縮然後加入乙酸鈉(25g)和高氯酸鈉(15g)的水(200ml)溶液。反應混合物用氯仿抽提，有機相用無水硫酸鎂乾燥，濃縮至50ml並於攪拌下倒入乙醚(250ml)中。收集沉澱，乾燥，得到4，4′-二甲氧基-3，3′-雙(6-氯-3-噠嗪基甲基)-二苯基高氯酸碘鎓粗製品(14g)。1HNMRδ(DMSO-d6)3.80(3H，s，-OCH3)，4.20(2H，s，-CH2Ar)，7.05(1H，m，Ar-5H)，7.65(2H，m，PyH)和8.00(2H，m，Ar-2，6H)。
(e)上面的碘鹽(12.45g〕、L-3，5-二溴-N-三氟乙醯酪氨酸甲酯(8.98g)、三乙胺(4.05g)和紫青銅(1.0g)在二氯甲烷(50ml)中攪拌18小時。反應混合液過濾後，依次用乙酸水溶液、2N氫氧化鈉和水洗滌，然後用無水硫酸鎂乾燥並蒸乾。將殘餘物與較小的另一份(來自0.72g碘鎓鹽)合併，用矽膠(400g)柱色譜純化，用乙酸乙酯/汽油(60°-80°)〔1∶3〕洗脫，得到棕色泡狀L-3，5-二溴-3′-(6-氯-3-噠嗪基甲基)-O-甲基-N-三氟乙醯-1-甲腺原氨酸甲酯(4.0g)。1H NMRδ(CDCl3)3.06(2H，m，ArCH2CH)，3.84和3.93(6H，2s，-OCH3)，4.19(2H，s，ArCH2Py)，4.75(1H，m，ArCH2CH)，6.62(3H，m，ArH)，7.17(2H，m，PyH)和7.23(2H，s，ArH)。
(f)將上述二溴化合物(3.27g)溶於含乙酸鈉(0.79g)的乙酸(20ml)中，回流1.25小時。加入足夠的水(約2ml)溶解沉澱出的氯化物，將溶液蒸乾。殘餘物在水和乙酸乙酯中分配，移出有機相併用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，隨後用無水硫酸鎂乾燥並蒸乾。殘留物用乙酸乙酯/汽油(60°-80°)結晶，得到L-3，5-二溴-O-甲基-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)-N-三氟乙醯甲腺原氨酸甲酯(2.52g，79％)，熔點176°-8°。
(g)將上述噠嗪酮(2.45g)溶於無水二氯甲烷(40ml)，冷卻並在0℃攪拌。加入溶於二氯甲烷(3ml)中的三溴化硼(6.46g)，形成紅棕色沉澱。混合物在室溫攪拌1.5小時後加入碎冰。過濾混合物，收集沉澱並溶於2N氫氧化鈉(30ml)中，將溶液用蒸氣浴加熱15分鐘，然後加入乙酸至pH 5並冷卻。收集沉澱，洗滌並乾燥，得到L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)-甲腺原氨酸(1.74g，88％)，熔點278°-9°(分解)。
或者是，為反應步驟(e)在(d)中製備的高氯酸鹽，可用三氟乙酸碘鎓鹽來替代，其製備方法如下碘(159g)懸浮於三氟乙酸酐(1升)中，通氮氣攪拌，在1.5小時內加入發煙硝酸(350ml)，保持溫度在36°至40°間。隨後加入三氟乙酸酐(300ml)，混合物在氮氣流下保持40℃直至所有氮的氧化物被除去，隨後可於室溫放置過夜。在減壓條件下除去溶劑。殘餘的溶劑通過與三氟乙酸酐(2×300ml)共沸除去。然後將淺黃色殘留的固體懸浮於三氟乙酸酐(1.2升)中，攪拌並冷卻至-20°。逐滴加入溶於三氟乙酸(1.2升)的2-(6-氯-3-噠嗪基甲基)苯甲醚(600g)溶液，保持溫度在-10°至-20°間。混合物於-10°攪拌1小時，然後室溫攪拌過夜。減壓除去溶劑，並將殘餘物傾入攪拌著的硫酸鈉(3.5kg)水(20升)溶液中。用稀氫氧化鈉水溶液將混合液的pH調至pH 2左右。隨後用二氯甲烷(2×3升，1×2升)抽提，合併有機抽提物，乾燥(MgSO4)，過濾，將體積減至2升，加到激烈攪拌的乙醚(12升)中。濾除深灰色固體沉澱，用醚洗，並在真空烘箱中於40°乾燥6小時，得到4，4′-二甲氧基-3，3′-雙(6-氯-3-噠嗪基甲基)二苯基三氟乙酸碘鎓(8.14g，90％)，熔點145-147℃。
該鹽用類似於上面2(e)、(f)和(g)的方法進一步反應，得到所需的L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)甲腺原氨酸。
實施例2AL-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)甲腺原氨酸(化合物2)的製備(a)2-(6-氯-3-噠嗪基甲基)苯甲醚(按實施例2(c)製備)(2.35g)溶於無水二氯甲烷(20ml)中，攪拌下冷卻至-50°。滴加三溴化硼(3ml)。然後將溶液溫熱至室溫。0.5小時後將橙色反應混合液傾入冰/水(200ml)中並加入丙酮溶解沉澱。用二氯甲烷抽提混合物，分離有機抽提物，用水洗滌，乾燥並蒸乾。殘餘物用乙酸乙酯和汽油重結晶，得到2-(6-氯-3-噠嗪基甲基)苯酚(1.75g，80％)，熔點132°-132.5°。元素分析結果C，59.61；H，4.13；N，12.47；Cl，16.09；C11H9ClN2O理論值C，59.87；H，4.11；N，12.70；Cl，16.07％。
(b)往攪拌著的上述酚(2.4g)和脲(14g)的75％硫酸溶液中緩慢加入叔丁醇(17ml)。將混合物充分攪拌再加入叔丁醇，4小時後18ml，24小時後5ml，28小時後20ml。120小時後將反應混合液傾入水中，分離並除去有機相，用乙醚徹底抽提水相。合併乙醚抽提物用飽和鹽水洗滌，乾燥並蒸乾。殘餘物用乙醚和汽油重結晶，得到2，4二叔丁基-6-(6-氯3-噠嗪基甲基)苯酚(3.43g，94％)，熔點143.0°-143.5°。元素分析結果C，68.32；H，7.51；N，8.36；Cl，10.89；C19H25ClN2O理論值C，68.56；H，7.57；N，8.41；Cl，10.65％。
(c)將該酚(1.95g)、L-3，5-二溴-N-三氟乙醯酪氨酸甲酯(3.24g)的乙醚(100ml)溶液於室溫在氬氣中攪拌，隨後用活性二氧化錳(3×5g)處理。4小時後過濾並加入四氯化鈦(5ml)，2分鐘後將黑色溶液用水處理並用乙酸乙酯充分抽提。合併有機抽提物，用飽和鹽水洗滌，乾燥並蒸乾。殘餘物用矽膠色譜分離，用汽油和乙醚作洗脫液。得到L-3，5-二溴-5′-叔丁基-3′-(6-氯-3-噠嗪基甲基)-N-三氟乙醯甲腺原氨酸甲酯(2.31g，55％)，熔點84°-86°。
(d)將該二溴甲腺原氨酸(2.76g)和無水乙酸鈉(0.78g)的乙酸(25ml)溶液加熱回流10小時，冷卻後傾入冰水中，濾出沉澱並用乙酸乙酯溶解，乾燥並蒸乾，得到L-3，5-二溴-5′-叔丁基-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)-N-三氟乙醯甲腺原氨酸甲酯(2.4g，55％)，熔點112°-115°。
(e)該噠嗪酮(0.200g)和Hbr(1ml)的冰乙酸(20ml)溶液加熱回流3天。隨後將溶液冷卻，用水稀釋並用2N氫氧化鈉水溶液鹼化，用乙酸調pH 6。將沉澱過濾、洗滌、乾燥，得到L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)甲腺原氨酸(0.100g，65％)，熔點245°-247°(分解)。在光譜上與前面分離的物質(實施例2(g)〕相同。
實施例2BL-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-噠嗪基甲基)甲腺原氨酸(化合物2)的製備(a)三(三氟乙酸)碘(用碘(10.0g)和發煙硝酸(20.95ml)在乙酸酐和三氟乙酸中製備)的乙酸酐(50ml)溶液冷卻至-10°，滴加入2-甲氧基苯乙腈(30.0g)的三氟乙酸(60ml)和乙酸酐(30ml)溶液。滴加過程中使混合物溫度維持在0°以下，隨後於室溫下放置過夜。然後將混合液傾入充分攪拌的冰冷的乙酸鈉(100g)和高氯酸鈉(13.0g)的水(600ml)溶液中。濾出沉澱用水和乙醚洗滌，得到3，3′-二氰甲基-4，4′-二甲氧基-二苯基高氯酸碘鎓，為細小的暗黃色固體(23.6g，57％)，熔點183°-4°(自甲醇/二乙醚中)。
(b)該碘鎓鹽(22.6g)、L-3，5-二溴-N-三氟乙醯酪氨酸甲酯、三乙胺(6.1g)的二氯甲烷(300ml)溶液用紫青銅(1g)處理，混合物於室溫攪拌20小時。過濾反應液並將濾液用2N鹽酸(2×200ml)、水(2×200ml)和2N氫氧化鈉水溶液(3×200ml)洗滌。然後將有機溶液用硫酸鎂乾燥並在減壓下蒸乾。油狀殘餘物溶於二氯甲烷(30ml)並傾入汽油中。濾出固體沉澱並用二氯甲烷/汽油重結晶，得到L-3，5-二溴-3′-氰甲基-O-甲基-N-三氟乙醯甲腺原氨酸甲酯，是一種無色晶狀體，熔點148°-149°。母液通過矽膠色譜可得到另一份這種化合物(總計8.05g，31％)。
(c)該二溴甲腺原氨酸(120mg)和3，6-二氯噠嗪(31mg)的二甲基甲醯胺(2ml)溶液中加入氫化鈉(30mg，50％油分散體)，於室溫放置50分鐘。隨後用冰處理反應液，用二氯甲烷抽提水相，然後用飽和鹽水洗有機溶液，最後乾燥並蒸乾。殘餘物在製備型矽膠色譜板上層析，分離出3，5-二溴-3′-(1-(6-氯-3-噠嗪基)-1-氰甲基)-O-甲基-N-三氟乙醯甲腺原氨酸甲酯(5mg)。1HNMRδ(CDCl3)3.12(1H，m)，3.27(1H，m)，3.79(3H，s)，3.86(3H，s)，4.86(1H，m)，5.80(1H，s)，6.72(1H，dd)，6.83(1H，d)，7.04(1H，d)，7.15(1H，寬m)，7.37(2H，s)，7.50(2H，dd)。
用標準方法對此中間物進一步精細加工就得到了題頭化合物。
實施例38，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡唑並〔3，4-d〕吡啶-3-酮(化合物3)的製備
a)2-氰基-2-(4，4-亞乙二氧基亞環己基)乙酸乙酯於室溫下往1，4-環己二酮單乙二醇縮酮(25g，0.160mol)和氰乙酸乙酯(18g，0.160mol)在甲苯(400ml)中的混合液中滴加二乙胺(25g，0.337mol)。反應混合液加熱回流過夜(用Dean Stark裝置)。反應液冷卻後分配在乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉水溶液(3×)中，有機抽提物用硫酸鈉乾燥、過濾，在真空中濃縮並用乙醇重結晶得到白色固體題頭化合物(15.8g，45％)熔點80-81℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.28(q，J＝7.2Hz，2H)，4.00(s，4H)，3.18(t，J＝6.5Hz，2H)，2.85(t，J＝6.5Hz，2H)，1.89(t，J＝6.5Hz，2H)，1.82(t，J＝6.5Hz，2H)，1.35(t，J＝7.1Hz，3H)。
b)2-氨基-6，6-亞乙二氧基-4，5，6，7-四氫化苯並〔b〕噻吩-3-羧酸乙酯在0℃下往實施例3(a)化合物(10g，45.6mmol)、硫(1.6g，50.2mmol)的乙醇(164ml)懸浮液中滴加二乙胺(3.6g，50.2mmol)的乙醇(26ml)溶液。得到的溶液在0℃攪拌1小時後在室溫攪拌3.5小時。用乙酸乙酯使反應停止，並用飽和氯化銨溶液分溶，用乙酸乙酯抽提水相，有機抽提物用鹽水洗滌，合併有機抽提物，用硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中濃縮後，色譜(矽膠，5-10％梯度CH2Cl2EtOAc)分離得到油狀題頭化合物(11.3g，87％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.25(q，J＝7.1Hz，2H)，4.02(s，4H)，2.92(t，J＝6.5Hz，2H)，2.74(s，2H)，1.90(t，J＝6.6Hz，2H)，1.33(t，J＝7.1Hz，3H)。
c)7，7-亞乙二氧基-4-羥基-2-甲基-5，6，7，8-四氫化苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡啶-2-羧酸乙酯室溫下往實施例3(b)中化合物(11.2g，39.5mmol)的甲苯(307ml)溶液中加入3-乙氧基丁烯酸乙酯(12.4g，78.6mmol)和樟腦磺酸(0.78g，3.4mmol)。用Dean Stark分水器將反應混合液加熱回流3.5小時。冷卻混合液並往裡滴加新鮮配製的1M乙醇鈉溶液(49ml)，滴加完後立刻將混合液加熱回流3小時。冷卻並濾出沉澱。將所得鹽溶於甲醇(60ml)，加水(500ml)和乙酸(2ml)得到黃色固體的題頭化合物(10.4g，76％)熔點94-95℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.48(q，J＝7.1Hz，2H)，4.06(s，4H)，3.26(t，J＝6.5Hz，2H)，3.02(s，2H)，2.81(s，3H)，2.02(t，J＝6.5Hz，2H)，1.47(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ESI)m/z 350[M+H]+；C17H19NO5S元素分析理論值C，58.44；H，5.48；N，4.01；實驗值C，58.34；H，5.46；N，3.86。
d)7，7-亞乙二氧基4-三氟甲基磺醯氧-2-甲基-5，6，7，8-四氫化苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡啶-3-羧酸乙酯往實施例3(c)中化合物(5.0g，14.3mmol)的吡啶(50ml)溶液中滴加三氟甲磺酸酐(4.0g，14.2mmol)。反應混合液在0℃攪拌4小時至反應完全。反應混合液用硫酸銅水溶液(3×)洗滌，隨後用水(2×)和鹽水(2×)洗滌。將有機相蒸發，用無水硫酸鈉脫水乾燥，並減壓濃縮。經急驟層析(矽膠，1∶1己烷∶乙酸乙酯)純化得到淡黃色題頭化合物(3.7g，54％)熔點133-134℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.43(q，J＝7.2Hz，2H)，4.06(s，4H)，3.16(t，J＝6.5Hz，2H)，3.10(s，2H)，2.77(s，3H)，2.03(t，J＝6.8Hz，2H)，1.41(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ESI)m/z 482[M+H]+；C18H18F3NO7S2元素分析理論值C，44.90；H，3.77；N，2.91；實驗值C，45.03；H，3.62；N，2.89。
(e)8，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡唑並〔3，4-d〕吡啶-3-酮室溫下向實施例3(d)中化合物(2.4g，5.0mmol)的甲醇(40ml)溶液中加入一水合肼(4.1g，82.3mmol)。反應混合物加熱回流3小時。冷卻後分配在pH 7的含水緩衝液和乙酸乙酯中。用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並在真空中濃縮後，用甲醇/乙酸乙酯重結晶得到淡黃色固體的題頭化合物(0.99g，60％)。1H NMR(400MHz，d4-MeOH)δ4.05(s，4H)，3.15(t，J＝6.5Hz，2H)，3.04(s，2H)，2.82(s，3H)，2.06(t，J＝6.5Hz，2H)；MS(ESI)m/z 318[M+H]+；C15H15N3O3S·0.25H2O元素分析理論值C，55.97；H，4.85；N，13.05；實驗值C，55.85；H，4.75；N，13.30。
實施例44-〔4-(4-甲基苯甲醯)苯甲醯〕苯乙醛(化合物4)的製備
a)4-(4-甲基苯甲醯)苯甲酸甲酯在氬氣氛下於0℃用氯化鋁(8.0g，60mmol)處理溶於250ml甲苯的甲基對苯二甲醯氯(6.2g，31mmol)溶液。將攪拌的混合物加熱到35℃0.5小時後緩緩加入100g冰，隨後加入150ml乙酸乙酯、50ml濃HCl和50ml水。分層後，用100ml乙酸乙酯抽提水相兩次。合併有機部分，依次用水(2×75ml)和鹽水(1×75ml)洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮後得到白色固體。用乙酸乙酯和己烷重結晶後得到6.0g(79％)白色針狀化合物。熔點117-118℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.15(d，J＝8.35Hz，2H)，7.83(d，J＝8.30Hz，2H)，7.73(d，J＝8.18Hz，2H)，7.31(d，J＝8.04Hz，2H)，3.98(s，3H)，2.46(s，3H)；MS(ESI)m/z 255[M+H]+。
b)4-(4-甲基苯甲醯)苯甲酸4-(4-甲基苯甲醯)苯甲酸甲酯(5.00g，20.0mmol)溶於150ml2∶1的四氫呋喃/水中，在攪拌下用一水合氫氧化鋰(2.0g，48mmol)在65℃處理。0.5小時後將渾濁的反應液冷卻至室溫並用乙酸乙酯(300ml)和10％HCl(水溶液)處理。分離有機相用水(2×50ml)和鹽水(1×50ml)洗滌，用硫酸鎂乾燥、過濾並濃縮後得白色泡沫體。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.22(d，J＝8.34Hz，2H)，7.81(d，J＝8.31Hz，2H)，7.73(d，J＝8.15Hz，2H)，7.31(d，J＝8.00Hz，2H)，2.46(s，3H)。
c)4-〔4-(4-甲基苯甲醯)苯甲醯〕苯甲醚溶於250ml甲苯的實施例4(b)的化合物與乙二醯氯(21.8g，0.17mmol)反應。混合液加熱回流2小時後濃縮，並於25℃0.5mmHg壓力下放置過夜。所得固體溶於100ml苯甲醚並於0℃用氯化鋁(11.2g，84mmol)處理。混合物於70℃加熱1小時並緩慢加入100g冰，隨後加入150ml乙酸乙酯、50ml濃HCl和50ml水。分層後，水相用100ml乙酸乙酯抽提。合併有機抽提物並用水(2×75ml)和鹽水(1×75ml)洗滌，用硫酸鎂乾燥、過濾並濃縮後得到白色固體。自乙酸乙酯和己烷中重結晶得到4.6g(70％)題頭化合物，熔點167-169℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.8-7.9(m，6H)，7.77(d，J＝8.06Hz，2H)，7.32(d，J＝8.01Hz，2H)，7.0(d，J＝8.74Hz，2H)，3.92(s，3H)，2.47(s，3H)；MS(ESI)m/z 331[M+H]+。
d)4-〔4-(4-甲基苯甲醯)苯甲醯〕苯酚溶於20ml二氯甲烷的實施例4(c)的化合物(700mg，2.12mmol)溶液與氯化鋁(1.0g，7.5mmol)和7.0ml溶於二氯甲烷的1.0M三氯化硼反應，加熱回流1小時。隨後混合物用100ml二氯甲烷稀釋並依次用10％HCl(水溶液)(1×25ml)、水(1×25ml)和鹽水(1×25ml)洗滌。有機相用硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮得黑色殘餘物，用急驟層析(矽膠，用1∶1乙酸乙酯∶己烷洗脫)分離得到550mg(82％)題頭化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.8-7.9(m，6H)，7.77(d，J＝8.05Hz，2H)，7.32(d，J＝8.01Hz，2H)，6.93(d，J＝8.6Hz，2H)，2.47(s，3H)。
e)三氟甲磺酸4-〔4-(4-甲基苯甲醯)苯甲醯〕苯酯溶於THF(20ml)的實施例4(d)的化合物(320mg，1.0mmol)溶液在0℃用氫化鈉(40mg，1.67mmol)和N-苯基三氟甲磺醯亞胺(500mg，1.40mmol)處理。反應混合物溫熱至室溫，攪拌18小時，隨後分配在乙酸乙酯和鹽水中，分層後有機抽提物用硫酸鎂乾燥並蒸乾。急驟層析(矽膠，80∶20己烷∶乙酸乙酯)純化後得到題頭化合物(300mg，66％)，熔點180-181℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.96(d，J＝8.6Hz，2H)，7.89(s，4H)，7.76(d，J＝8.1Hz，2H)，7.45(d，J＝8.6Hz，2H)，7.33(d，J＝8.1Hz，2H)，2.47(s，3H)。
f)4-〔4-(4-甲基苯甲醯)苯甲醯〕苯乙醛往實施例4(e)化合物(445mg，1.0mmol)的DMF(10ml)溶液中加入烯丙基三丁基錫(0.35ml，1.12mmol)、雙(三苯膦)氯化鈀(II)(55mg，0.077mmol)和氯化鋰(125mg，2.95mmol)。反應混合物於90℃加熱1小時，冷卻至室溫，隨後分配在乙酸乙酯和鹽水中。有機相用硫酸鎂乾燥，濃縮後的殘餘物含有所要的產物3-〔4-〔4-(4-甲基苯甲醯)苯甲醯〕苯基〕-1-丙烯和含錫副產物。將此物質經急驟層析(矽膠，用95∶5己烷∶乙酸乙酯洗脫)純化，可除去大多數，但非全部含錫雜質。經第二次色譜處理(己烷中乙酸乙酯含量從5％至10％梯度洗脫)得到100mg(30％)純淨的烯。隨後於-78℃將其溶於二氯甲烷/甲醇(3∶1，16ml)。向該溶液中通臭氧5分鐘。滴五滴甲硫醚終止反應並繼續於-78℃攪拌30分鐘。蒸乾溶劑並將所得物用急驟層析(矽膠，用85∶15到75∶25己烷∶乙酸乙酯梯度洗脫)純化，得到題頭化合物(40mg，40％)，熔點188-190℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.83(s，1H)，7.88(s，4H)，7.86(d，J＝8.1Hz，2H)，4.03(s，4H)，3.73(s，3H)，3.76(t，J＝6.0Hz，2H)，3.00(s，2H)，2.80(s，3H)，2.03(t，J＝6.0Hz，2H)；MS(ESI)m/z 343[M+H]+。
實施例51，4-二甲基-8，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-1H-苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡唑並〔3，4-d〕吡啶-3-酮(化合物5)的製備
1，4-二甲基-8，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-1H-苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡唑並〔3，4-d〕吡啶-3-酮室溫下實施例3(d)中化合物(0.4g，0.83mmol)溶於甲醇(6.7ml)，與甲肼(0.16g，3.45mmol)反應，混合液加熱回流2小時。冷卻混合液，濾出沉澱，其中含有150mg 2，4-二甲基區域異構體。濾液蒸乾後用急驟層析(矽膠，用80∶20∶5乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸洗脫)純化得到黃色固體的題頭化合物(22mg)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.03(s，4H)3.73(s，3H)，3.76(t，J＝6.0Hz，2H)，3.00(s，2H)，2.80(s，3H)，2.03(t，J＝6.0Hz，2H)；MS(ESI)m/z 332[M+H]+。
實施例64-羧基-二苯酮-4-甲醯胺基-反-4-甲基環己基-N-己基甲醯胺(化合物6)的製備
a)N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基環己基羧酸於0℃將氫氧化鈉(1N，100ml，100mmol)水溶液加入4-反-氨甲基環己基羧酸(9.0g，60mmol)在二
烷(100ml)及水(100ml)中的溶液中。加入Boc酸酐(15.9g，66mmol)並將反應液溫熱至室溫，攪拌過夜，將溶液濃縮至50ml後，用EtOAc(100ml)稀釋並用KHSO4水溶液(1N)酸化至pH 2。將有機相用水(100ml)抽提兩次，並將有機物在減壓下濃縮。得到的固體用EtOAc/己烷重結晶得到9.2g+3.4g(第二批產物)白色固體(80％回收率)。MS(ES)m/e 242[M+H]+。
b)N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基環己基(開氏肟樹脂)羧酸酯開氏肟樹脂(20g，0.7mmol/g填充量，Advanced Chem Tech公司)加入到N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基環己基羧酸(5.0g，20mmol)和DCC(4.4g，20mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中並於室溫下溫和攪拌過夜。濾出並收集固體，並用二氯甲烷(5×100ml)洗滌。將樹脂重新懸浮於二氯甲烷(200ml)中並加入N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基環己基羧酸(5.0g，20mmol)和DCC(4.4g，20mmol)，於室溫下溫和地混合過夜。濾出並收集固體，用二氯甲烷(5×100ml)洗滌並在真空中乾燥。IR(KBr，cm-1)＝1820，1771，1520。
c)反-4-氨甲基環己基(開氏肟樹脂)羧酸酯N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基環己基(開氏肟樹脂)羧酸酯(20g)懸浮於二氯甲烷(100ml)並加入TFA(25ml)。反應液溫和地混合0.5小時，濾出並收集固體，用二氯甲烷(5×100ml)洗滌，在真空中乾燥過夜。IR(KBr，cm-1) ＝3150，1770，1526。
d)4-羧基-二苯酮-4-甲醯胺基-反-4-甲基環己基(開氏肟樹脂)羧酸酯反-4-氨甲基環己基(開氏肟樹脂)羧酸酯(200mg)懸浮於DMF(3.1ml)並加入N-甲基嗎啉(0.2ml)、4，4′-二苯酮二羧酸(190mg，0.7mmol)和HBTU(265mg，0.7mmol)。反應液溫和地混合3小時。濾出並收集固體，依次用DMF(3×20ml)和水(3×20ml)洗滌。重新懸浮於DMF(3.0ml)和N-甲基嗎啉(0.1ml)中，並加入4，4′-二苯酮二羧酸(0.35mmol)和HBTU(0.35mmol)，反應液溫和地混合3小時。濾出並收集固體，依次用DMF(3×20ml)、水(3×20ml)、二氯甲烷(5×20ml)洗滌後，在真空中乾燥。
e)4-羧基-二苯酮-4-甲醯氨基-反-4-甲基-環己基-N-己基甲醯胺4-羧基-二苯酮-4-甲醯氨基-反-4-甲基-環己基(開氏肟樹脂)羧酸酯(200mg)懸浮於二氯甲烷(3.0ml)中並加入己胺(0.3mmol)，反應液輕輕混合3小時後過濾，濾液在真空中濃縮得到題頭化合物MS(ES)m/e 493[M+H]+。
實施例74-硝基-苯甲醯氨-反-4-甲基-環己基-N-己基甲醯胺(化合物7)的製備
4-硝基-苯甲醯氨-反-4-甲基-環己基-N-己基甲醯氨按照實施例6(a)-(e)的方法，但是以4-硝基苯甲酸代替4，4′-二苯酮二羧酸，可得到題頭化合物MS(ES)m/e 390[M+H]+。
實施例84-乙醯氨基-苯甲醯氨基-反-4-甲基-環己基-N-1-(氨基-R-2-〔甲氧甲基〕-吡咯烷)甲醯胺(化合物8)的製備
按照實施例6(a)-(e)的方法，但是以4-乙醯氨基苯甲酸代替4，4′-二苯酮二羧酸，R-1-氨基-2-(甲氧甲基)-吡咯烷(RAMP)代替己胺，可得到題頭化合物MS(ES)m/e 331[M+H]+。
實施例94-甲醯-E-肉桂醯氨基-反-4-甲基環己基-N-(丙基)甲醯胺(化合物9)的製備
按照實施例6(a)-(e)的方法，但是以4-甲醯肉桂酸代替4，4′-二苯酮二羧酸，以丙胺代替己胺，可得到題頭化合物MS(ES)m/e 357[M+H]+。
實施例102，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡唑並〔3，4-d〕吡啶-3-酮(化合物10)的製備
a)4-羥基-2-甲基-5，6，7，8-四氫化苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡啶-2-甲酸乙酯將2-氨基-4，5，6，7-四氫化苯並〔b〕噻吩-3-羧酸乙酯(8.9g，39mmol)和3-乙氧基丁烯酸乙酯(12.4g，78mmol)溶於甲苯(300ml)，與樟腦磺酸(0.78g，3.4mmol)反應。反應混合液在Dean Stark分水器中加熱回流3小時。混合液冷卻至室溫後用新鮮配製的1M乙醇鈉(48ml，48mmol)處理。加完樣後反應液加熱回流3小時。反應液冷卻濃縮後，殘餘物溶於乙酸乙酯。加入乙酸(2ml)，溶劑蒸乾後的殘餘固體用甲醇研磨，得到灰白色固體的題頭化合物(8.4g，74％)熔點140℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.48(q，J＝7.2Hz，2H)，3.04(br s，2H)，2.81(s，3H)，2.80(br s，2H)，1.87(br s，4H)，1.47(t，J＝7.2Hz，3H)；C15H17NO3S元素分析理論值C，61.83；H，5.88；N，4.81；實驗值C，61.69；H，5.81；N，4.73。
b)4-氯-2-甲基-5，6，7，8-四氫化苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡啶-2-羧酸乙酯實施例10(a)的化合物(8.0g，27.4mmol)溶於磷醯氯(100ml)中，回流3.5小時。減壓除去磷醯氯，殘留的油狀物溶於乙酸乙酯，用5％碳酸氫鈉洗滌，用無水硫酸鈉乾燥。溶劑蒸乾後得到晶狀題頭化合物(8.5g，95％)熔點65-66℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.47(q，J＝7.1Hz，2H)，3.10(br s，2H)，2.85(br s，2H)，2.60(s，3H)，1.89(br s，4H)，1.43(t，J7.1Hz，3H)；C15H16ClNO2S·0.125H2O元素分析理論值C，57.73；H，5.25；N，4.49；實驗值C，57.69；H， 5.08；N，4.30。
c)2，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯並〔b〕噻吩並〔2，3-b〕吡唑並〔3，4-d〕吡啶-3-酮實施例10(b)的化合物(2.0g，6.4mmol)溶於甲醇(50ml)，與一水合肼(10ml)反應，混合液加熱回流16小時，反應液倒入稀鹽酸中，沉澱出黃色固體的題頭化合物(1.8g)，1H NMR(400MHz，d4-MeOH)δ3.01(br s，2H)，3.00(s，3H)，2.92(br s，2H)，2.00(br s，4H)；C13H13N3OS·HCl·0.25H2O元素分析理論值C，52.00；H，4.87；N，13.99；實驗值C，51.92；H，5.01；N，13.70。
實施例11SH2區拮抗劑功能試驗方法利用大腸桿菌中表達的融合蛋白的SH2區，在體外測量了化合物對不同的人SH2區的抑制能力。這裡用到的SH2區是人的src SH2區、Grb2 SH2區、lck SH2區、fyn SH2區、SH-PTP2 SH2區、p85 SH2區和hcp SH2區。
含有sre、lck和hcp SH2區的融合蛋白可用下面的通式表示DET1-DET2-間隔區-ek-SH2，其中DET1、DET2、間隔區、ek和SH2如下所述。DET1(「確定附加表位1」(defined epitope tag1))(SEQ ID NO1)是在1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)外殼蛋白gp 120(或gp 160)中發現的一個11胺基酸序列。針對HIV-1 gp 120(或gp 160)不同表位的單克隆抗體已為本領域所熟知，例如可參見U.S.Patent 5166050。一個優選的例子是單充隆抗體178.1(見Thiriart等，《免疫學雜誌》(J.Immunol.)143卷1832-1836頁(1989))，它是用酵母表達的HIV-1 HB10株gp 160分子免疫小鼠後製備的(Ratner等，《自然》(Nature〕313卷277-284頁(1985))。這個標記物可用於蛋白表達檢測(利用Western印跡)和蛋白質的純化(利用親和層析)，還可用於成形試驗，試驗中利用178.1抗體可俘獲或固定融合蛋白。DET2是一個6組氨酸序列標記(SEQID NO2)，它與含鎳樹脂結合可用於純化目的。間隔區(SEQ IDNO3)用於在構建物的指定位置設計一個BamHI限制位點。-ek-指一個腸肽酶蛋白酶的識別序列(SEQ ID NO4)，該酶保證了標記物從SH2區可選擇地去除，從而得到一個不含外源胺基酸的SH2區。對於晶體學研究，不含外源胺基酸的SH2區比標記蛋白更為可取。SH2指不同蛋白質的SH2區。
設計編碼每個DET1-DET2-間隔區-ek SH2的DNA序列時，在間隔區-ek-SH2區側翼引入指定的限制性酶切位點(BamHI和XbaI)，使得不同的間隔區-ek-SH2構建物很容易置換入下面的方法2或3中提到的任何一種載體中，從而得到DET1-DET2-間隔區-ek-SH2標記蛋白。編碼每個DET1-DET2-間隔區-ek-SH2構建物的DNA序列在設計中也使得完整標記的SH2區能以NdeI-XbaI片段形式轉入任何表達型載體，該載體含有一個在大腸桿菌轉錄和翻譯調控序列下遊適當位置的NdeI位點和一個與XbaI匹配的下遊克隆位點。儘管任何合適的載體都能得到相似的結果(例如pET-11a，Novagen，Inc.，)，但在本實驗中用到的載體是大腸桿菌表達型載體pEA1KnRBS3。這個載體是Shatzman，A，Gross，M和Rosenberg，M於1990年在「利用含λ噬菌體調控序列的載體進行表達」一文中描述的系列載體的衍生載體。該文收錄於紐約格林出版社和威利交叉科學出版社(Green Pubishing and Wiley-Interscience N.Y.)出版的《現代分子生物學方法》(F.A.Ausubel等編)一書16.3.1-16.3.11頁。特定的載體pEA1KnRBS3見Bergsma等，1991年《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)266卷23204-23214頁。
下面的方法描述了雞src、人src、人lck和人hcp SH2區的表達。首先，雞src SH2區以DET1-DET2-間隔區-SH2形式表達，然後，其它的SH2區插入到這個載體替換雞src，表達出DET1-DET2-間隔區-ek-間隔區SH2形式的蛋白。方法1含有標記物DET1和DET2的雞src SH2區(DET1-DET2-間隔區-SH2)的克隆與表達利用下面的引物，用本領域的技術人員熟知的方法，從含有雞src基因的cDNA克隆(p5H；Levy等，1986，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83卷4228頁)中PCR擴增出編碼標記蛋白DET1-DET2-間隔區-SH2的一段DNA序列。5′TTCCATATGAAAAGTATTCGTATTCAGCGTGGCCCGGGCCGTCACCACCACCACCACCACGGGATCCCCGCTGAAGAGTGGTACTTT 3′(SEQ ID NO17)劃線處為NdeI識別位點(5′)和BamHI識別位點(3′)。5′GGAATTCTAGATTACTAGGACGTGGGGCAGACGTT 3′(SEQID NO18)劃線處為XbaI識別位點。
PCR產物用NdeI和XbaI消化，隨後消化片段用瓊脂糖凝膠分離。將該片段與NdeI-XbaI消化的pEA1KnRBS3載體連接(Bergsma等，前文)，該載體已用瓊脂糖凝膠純化為一個6.5kbp的片段。連接反應用於轉化大腸桿菌MM294cI+(F.A.Ausubel等，前文)。用DNA測序對質粒進行了鑑定，證實其中插入了正確的片段。在λ噬菌體PL啟動子和調控系統控制下，所得的質粒編碼DET1-DET2-間隔區-SH2。從MM294cI+中純化質粒DNA並用來轉化大腸桿菌AR 120菌株。在這個宿主菌株中，向生長的培養物中加入萘啶酮酸可誘導噬菌體啟動子的表達，如F.A.Ausubel等在前文所述。含有這種質粒的AR 120經萘啶酮酸誘導後，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和考馬斯亮藍染色(F.A.Ausubel等，前文)對細胞蛋白進行分析，得到一條表觀分子量為15,000的蛋白帶；在未經誘導的細胞或雖經誘導但所含pEA1KnRBS3中缺少PCR擴增片段的細胞中均未發現此帶。Western印跡證實，誘導產生的蛋白帶可與抗DET1的單克隆抗體178.1反應。方法2含有標記物和一個腸肽酶蛋白水解斷裂位點的人src SH2區(DET1-DET2-間隔區-ek src SH2)的克隆、表達和純化用下面的引物，從含有人src基因(c-src SH2 DNA序列與Takeya，T和Hanafusa，H 1983年在《細胞》(Cell)32卷881-890頁所述完全相同)的cDNA克隆中PCR擴增出編碼ek-src SH2蛋白的DNA序列5′CGGGATCCTGGACGACGACGACAAAGCTGAGGAGTGGTATTTT3′(SEQ ID NO19)劃線處為BamHI識別位點。5′GGAATTCTAGACTATTAGGACGTGGGGCACACGGT 3′(SEQID NO20)劃線處為XbaI識別位點。
用BamHI和XbaI消化PCR產物，隨後用瓊脂糖凝膠電泳分離消化片段。該片段連接到BamHI-XbaI消化的表達型載體上，該載體含有方法1所述的標記雞src基因DET1-DET2-間隔區-SH2。在這個載體中，BamHI位點位於DET2和SH2兩個編碼區之間，而XbaI位點位於SH2編碼區3′端下遊。連接反應用於轉化大腸桿菌MM294cI+。構建物DET1-DET2-間隔區-ek-src SH2經DNA測序證實(SEQID NO5)，並如上面方法1所述在大腸桿菌AR 120菌株中誘導表達。萘啶酮酸誘導後，觀察到了被考馬斯亮藍染色、Western印跡陽性的誘導蛋白帶，其表觀分子量為16,000。
在溶菌酶存在和中性pH條件下利用超聲處理裂解細胞。離心後，可溶物用Ni++NTA柱層析。用平衡緩衝液(Tris緩衝液，pH 8，含0.5MNaCl)和含15mM咪唑的同一緩衝液洗柱後，用含25mM咪唑的平衡緩衝液可洗脫出高純度的蛋白質。用這種方法純化的SH2區，用下面的「結合實驗」發現，可以一種特異的、可飽和的方式與合適的pY肽高親和力結合，證明標記物並不影響其功能。這種表達的融合蛋白DET1-DET2-間隔區-ek-src SH2用於下面的「結合實驗」，其目的在於確定化合物選擇性抑制人src SH2區的特異性。方法3含有標記物和一個腸肽酶蛋白水解斷裂位點的人lck SH2(DET1-DET2-間隔區-ek-lck SH2)的克隆與表達。
用下面的引物，從含人lck基因(基因庫登記號M 36881)的cDNA克隆中PCR擴增出編碼蛋白ek-lck SH2的DNA序列5′CGGGATCCTGGACGACGACGACAAAGAGCCCGAACCCTGGTTCTT 3′(SEQ ID NO21)
劃線處為BamHI識別位點。5′GCTCTAGACTATTACTGGGGCTTCTGGGTCTG 3′(SEQ IDNO22)劃線處為XbaI識別位點。
PCR產物用BamHI和XbaI消化，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化片段，該片段連接到BamHI-XbaI消化的、含有方法1所述的標記雞src基因DET1-DET2-間隔區-SH2的表達型載體中。在這個載體中，BamHI位點位於DET2和SH2編碼區之間，XbaI位點位於SH2編碼區3′端下遊。因而，ek-lck SH2序列就替換了上述載體的src SH2序列。這個連接反應用來轉化大腸桿菌MM294cI+。含有DET1-DET2-間隔區-ek-lck SH2的構建物已為DNA測序(SEQ ID NO6)所證實，並如方法1所述在大腸桿菌AR 120菌株中誘導表達。萘啶酮酸誘導後，觀察到了考馬斯亮藍染色的、Western印跡陽性、表觀分子量為17,000的誘導蛋白帶。
在溶菌酶存在和中性pH條件下利用超聲波裂解細胞。離心後，可溶物用Ni++NTA柱層析。用平衡液(Tris緩衝液，pH 8，含0.5MNaCl)和含15mM咪唑的同一緩衝液洗柱後，用含25mM咪唑的平衡液洗脫出高度純化的蛋白質。用這種方法純化的SH2區，在下述的「結合實驗」中被發現可以一種特異的、可飽和的方式與合適的pY肽高親和力結合，證明標記物並不影響其功能。表達的融合蛋白DET1-DET2-間隔區-ek-lck SH2用於下面的「結合實驗」，其目的在於確定化合物選擇性抑制人lck SH2區的特異性。方法4含標記物和一個腸肽酶蛋白水解斷裂位點的人hcp SH2區(DET1-DET2-間隔區-ek-hcp SH2)的克隆與表達從人胎兒肝臟RNA中用反轉錄PCR擴增出一編碼ek-hcp SH2蛋白的DNA序列(hcp SH2 DNA序列與Shen，S-H在《自然》(Nature)(1991)352卷736-739頁中所述相同)。用Tri-Reagent(分子研究中心股份有限公司(Molecular Research CenterInc.))和反轉錄系統(Reverse Transcriptase System)(GIBCO-BRL)按廠商說明分離RNA，用下面的引物進行PCR擴增5′GAAGATCTTGGACGACGACGACAAATCCCGTGGGTGGTTTCAC3′(SEQ ID NO23)劃線處為Bgl II識別位點。5′GCTCTAGACTATTAACTAGTGGGATCGGAGCA 3′(SEQ IDNO24)劃線處為XbaI識別位點。
PCR產物用Bgl II和XbaI消化，隨後消化片段用瓊脂糖凝膠電泳分離。分離的片段連接到BamHI-XbaI消化的、含有方法2所述的標記人src基因DET1-DET2-間隔區-ek-src SH2的表達型載體中。在這個載體中，BamHI位點位於DET2和ek編碼區之間，XbaI位點位於SH2編碼區3′端下遊，因而ek-hcp SH2序列就替換了上述載體中的ek-src SH2序列。連接反應用來轉化大腸桿菌MM294cI+。含DET1-DET2-間隔區-ek-hcp SH2的構建物已為DNA測序(SEQ IDNO7)所證實，並用於轉化大腸桿菌GI 698(Invitrogen公司，聖地牙哥，加州)，按產品說明，往培養基中加入色氨酸至10mg/ml，誘導λ噬菌體啟動子的表達。30℃生長的細胞經色氨酸誘導後，觀察到了考馬斯亮藍染色的、Western印跡陽性、表觀分子量為15,000的誘導蛋白帶。
在溶菌酶存在和中性pH條件下用超聲波裂解細胞。離心後，不溶的沉澱用含8M脲的Tris緩衝液(pH 8)溶解，並結合到Ni++NTA柱上。用平衡緩衝液(Tris緩衝液，pH 8，含0.5M NaCl，8M脲，5mMBME)和含15mM咪唑的同一緩衝液洗柱。脲去除後，在5mM BME存在下蛋白質在柱中重摺疊，用含300mM咪唑的Tris緩衝液(pH 8)洗脫出純化的重摺疊的蛋白質。用這種方法純化的SH2區，在下述的「結合實驗」中發現，可以特異的、可飽和的方式與合適的pY肽高親和力結合，證明標記物不影響其功能且蛋白質已成功地重摺疊。表達的融合蛋白DET1-DET2-間隔區-ek-hcp SH2用於下述的「結合實驗」，其目的在於確定化合物選擇性抑制人hcp SH2區的特異性。
按購自Pharmacia(新澤西州)的GST基因融合試劑盒內說明製備含有構建物GST-X-SH2的融合蛋白。GST對fyn、Grb2和SH-PTP2來說是標記序列穀胱甘肽s-轉移酶表位(SEQ ID NO8)，對p85來說是標記序列穀胱甘肽s-轉移酶表位(SEQ ID NO9)。SH2指fyn、Grb2、p85和SH-PTP2的SH2區，將其表達並用穀胱甘肽Sepharose 4B(Pharmacia)進行純化，方法見《現代分子生物學方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.MAusubel等編，John Wiley and Sons股份有限公司出版，(1995)，16.7.1頁。X是一個合適的接頭，優選有6-21鹼基對，用來保持SH2構建物位於讀框和互補克隆中。就此而言，X的序列並不苛刻，本領域的技術人員很容易構建一個合適的接頭。編碼每個GST-X-SH2融合蛋白的DNA序列在設計中都使得所示限制位點(BamHI和EcoRI)在SH2區的側翼。本實驗中用的載體是大腸桿菌表達型載體，對fyn、Grb2和SH-PTP2來說是pGEX-2T(Pharmacia)，對p85來說是pGEX-3X(Pharmacia)。每種載體都使得SH2構建物帶上如下所述的額外的C末端胺基酸。
編碼人fyn(胺基酸143-252)SH2區(Yamamoto等，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83卷5459-5463頁(1986))的序列克隆到表達型載體pGEX-2T的BamHI和EcoRI位點。額外的C末端胺基酸為亮氨酸-蘇氨酸-天冬醯胺-絲氨酸-絲氨酸(SEQ ID NO10)的SH2區用本領域的技術人員熟知的PCR技術克隆產生表達的融合蛋白GST-X-fyn。這個表達的融合蛋白隨後用於下面的「結合實驗」，其目的在於確定化合物選擇性抑制人fyn SH2區的特異性。
人p85 SH2區編碼人p85(胺基酸321-440)SH2區(Skolnik，E等，《細胞》(Cell)65卷83-90頁(1991))的序列克隆到表達型載體pGEX-3X的BamHI和EcoRI位點。額外C末端胺基酸為天冬醯胺-絲氨酸-絲氨酸(SEQ ID NO11)的SH2區用本領域的技術人員熟知的PCR技術克隆產生表達的融合蛋白GST Xp85。這個表達的融合蛋白用於下面的「結合實驗」，其目的在於確定化合物選擇性抑制人p85 SH2區的特異性。
人SH-PTP2區編碼人SH-PTP2(胺基酸1-106)SH2區(Bastien，L等，《生物化學與生物物理研究通訊》(Biochem.Biophys，Res.Commun.)196卷124-133頁(1993))的序列克隆到表達型形體pGEX-2T的BamHI和EcoRI位點。額外C末端胺基酸為穀氨醯胺-苯丙氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸(SEQ IDNO12)的SH2區用本領域的技術人員熟知的PCR技術克隆產生表達的融合蛋白GST-X-SH-PTP2。這個表達的融合蛋白用於下面的「結合實驗」，其目的在於確定化合物選擇性抑制人SH-PTP2區的特異性。
人Grb2 SH2區編碼人Grb2(胺基酸58-159)SH2區(Lowenstein.E.等，《細胞》(Cell)70卷431-442頁(1992))的序列克隆到表達型載體pGEX-2T的BamHI和EcoRI位點。額外C末端胺基酸為異亮氨酸-組氨酸-精氨酸-天冬氨酸(SEQ ID NO25)的SH2區，用本領域的技術人員熟知的PCR技術克隆產生表達的融合蛋白GST-X-Grb2。用一個六核苷酸接頭在GST和SH2區之間引入甘氨酸和絲氨酸。這個表達的融合蛋白用於下面的「結合實驗」，其目的在於確定化合物選擇性抑制人Grb2 SH2區的特異性。結合實驗根據化合物選擇性地抑制SH2區與相應的特異性pY肽結合的能力來確定這些化合物與這些SH2區的結合能力。
SH2區和pY肽的結合實驗在用於ELISA的96孔板上進行。在Millipore 96孔濾板上，向親水性Durapore(孔徑0.65μm，目錄號MADVN 6550)加入2μl(50％懸液)蛋白G Sepharose(購自新澤西Pharmacia，目錄號170618-01)和2μl 2mg/ml的MAB 178.1(gp 120/SH2區融合蛋白src、lck和hcp)或0.25μl抗-GST多克隆抗血清(購自新澤西州Pharmacia)(GST/SH2區融合蛋白fyn、Grb2、p85和SH-PTP2)。向相應的孔中加入10pmol目標SH2區融合蛋白。用TBS-T(Tris緩衝鹽加0.05％吐溫20)將體積調至100μl，於室溫溫育並搖動1小時。隨後用TBS-T(4℃)洗一次，再向每孔中加入90μl TBS-T。用TBS-T將特異的pY生物素化的肽稀釋至濃度為1.0μM(這些肽可從賓夕法尼亞州的BachemBioscience公司、德克薩斯州的Genosys Biotechnologies公司和加州的California Peptide Research公司獲得)。每孔加入10μl使終濃度為0.1μM(近似於每個SH2區/肽對的Kd)，終體積為100μl。實驗板溫育至達到結合平衡(4℃搖3小時)。實驗板每孔用TBS-T(4℃)洗2次，然後每孔加入100μl SABC(鏈黴抗生物素蛋白生物素化辣根過氧化物酶複合物，購自加州Zymed公司，目錄號93-0043。每10mlTBS-T中加1滴試劑A(鏈黴抗生物素蛋白)和1滴試劑B(AH-生物素結合的辣根過氧化物酶)，37℃溫育30分鐘，然後冷卻至4℃)，於4℃溫育30-60分鐘。用TBS-T(4℃)洗板4次(250μl/孔/次)。在每孔中加入100μl 1mg/ml溶於檸檬酸緩衝液的OPD(鄰苯二胺，Sigma化學公司，密蘇裡州聖路易斯)。每孔中加入100μl 10％的硫酸終止反應，從試驗板的每孔中移出150μl加入ELISA板中，然後確定每個ELISA板的A490。
表1中(IC50)的確定每個對照或化合物都實驗兩次，取平均值，減去本底並從板中讀出沒有抑制作用的最大值。其他所有數據點都表示成最大值的百分比(或對照的百分比)。這些對照的百分比數值都用Macintosh的Kaleidagraph(最佳協同作用軟體(Synergy Software))成圖。這些圖上的曲線都是非線性曲線，且符合以下方程F(x)＝Emax/(1+Kd/濃度)A斜率)這裡Kd代表了每個曲線的IC50。
表2中(Ki)的確定每個化合物的Ki通過下面的方程(見附註)計算。這個擴展的方程必須在本實驗條件下使用，因為pY生物素化肽沒有大大過量(100×)於SH2區融合蛋白。IC50是用Kaleidagraph圖由非線性曲線擬合得到的外推值。Rtot和*D是用於本實驗的試劑的已知值。每個SH2區融合蛋白和pY生物素化肽的結合物的KD通常必須通過實驗確定。KI＝(IC50-Rtot+Rtot/2((*D/(KD+*D))+(KD/(KD+*D+Rtot/2)))/(1+*D/KD+Rtot/KD((KD+*D/2)/(KD+*D)))KI＝(μM)競爭物的KDIC50＝(μM)抑制物的IC50，通過每個SH2區的競爭選擇性實驗數據的非線性曲線擬合得出Rtot＝(μM)1個實驗(微量板)孔中SH2區總濃度*D＝(μM)每個SH2區特異性pY和生物素化肽的濃度KD＝(μM)每個SH2區特異性pY和生物素化肽的KD值IC50是50％應答或信號抑制時抑制劑的濃度KD是配體在受體/配體相互作用中的解離常數，通常等於飽和結合曲線上1/2最大值時配體的濃度。
用於上述「結合實驗」的pY肽配體如下含一氨基己酸(Aca)連接物的生物素化pY肽配體用於src、lck和fynSH2區Glu-Pro-Gln-pTyr Glu-Glu Ile Pro Ile-Tyr-Leu(SEQ ID NO13)含一氨基己酸(Aca)連接物的生物素化pY肽配體用於p85 SH2Asp-Gly-Gly-pTyr-Met-Asp-Met-Ser-Lys-AspGlu(SEQ ID NO14)含一氨基己酸(Aca)連接物的生物素化pY肽配體用於SH-PTP2 SH2Glu-Asn-Gly-Leu-Asn-pTyr-Ile-Asp-Leu-AspLeu(SEQ ID NO15)含一氨基己酸(Aca)連接物的生物素化pY肽配體用於hcp SH2Thr-Pro-Pro-His-Leu Lys-pTyr-Phe-Tyr-Phe-Val-Val-Ser-Asp-Ser-Gly(SEQ ID NO16)含一氨基己酸(Aca)連接物的生物素化pY肽配體用於Grb2 SH2Leu-Pro-Val Pro-Glu-pTyr-Ile-Asn-Gln-SerVal(SEQ ID NO26)結合實驗結果表I和II顯示了SH2拮抗劑與所示SH2區的交叉反應性。從這些表中公開的結果中，很容易辯認出那些與lck SH2區的結合親和力/抑制作用濃度比與其它SH2區結合親和力/抑制作用濃度高50倍以上的化合物。
表ISrc SH2區拮抗劑與克隆的人SH2區的交叉反應活性(IC50)化合物 SrcLck Fyn SH- p85 Grb2 HcpPTP21 6μM 6μMNI NININIX2 NI NI NI NININI0.9μM3 16.1μM22.9μM NI NININI1.2μM4 40μM 163μM NI X NINI30μM5 63μM 100μM NI NININI0.1μM620μM NI NIX NINIX77.4μM 383μM NININININI816μM 126μM NINININI＞100μM9131μM 200μM NINININI12μM10X X NINININI1.2μMNI-300μM以上仍未有抑制作用X-未檢測表IISrc SH2區拮抗劑與克隆的人SH2區的交叉反應活性(Ki)化合物 SrcLck Fyn SH- p85 Grb2HcpPTP217μM X NINININI X2NI NI NINININI X36μM 11μM NINININI X440μM 163μM NIXXNINI X528μM 149μM NINININI X613μM 50μM NINININI X720μM 320μM NINININI X812μM 360μM NININI330 X955μM 146μM NINININI X10XX XX NINININI XNI-在1000μM以下無抑制X-沒有計算XX-沒有檢測儘管上面舉例說明了本發明的優選實施方案，但應當理解本發明並不僅限於本文公開的具體說明，並保留對於在下面權利要求範圍內的所有改進的權利。
序列表(1)概括信息(i)申請人DUNNINGTON，DAMIEN(ii)發明題目LCK SH2特異性化合物在治療自身免疫病和同種異體移植排斥中的應用(iii)序列數26(iv)通訊地址(A)收件人SmithKline Beecham Corporation(B)街道709 Swedeland路(C)城市King of Prussia(D)州PA(E)國家USA(F)ZIP19406(v)計算機可讀形式(A)介質類型磁碟(B)計算機IBM兼容(C)作業系統DOS(D)軟體FastSEQ 1.5版(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號08/386,381(B)申請日1995.2.10(A)申請號08/400,220(B)申請日1995.3.7(A)申請號08/497,357(B)申請日1995.6.30(viii)律師/代理人信息(A)姓名Dustman，Wayne J(B)登記號33,870(C)參考/備案號P50323-2L1(ix)電信信息(A)電話610-270-5023
(B)傳真(C)電報(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度11胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg1 5 10(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特徵(A)長度6胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO2His His His His His His1 5(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特徵(A)長度3胺基酸
(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO3Gly Ile Leu1(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特徵(A)長度5胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Asp Asp Asp Lys1 5(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特徵(A)長度130胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無
(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala Glu Glu Trp Tyr Phe20 25 30Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala Glu35 40 45Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly50 55 60Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp Asn Ala Lys Gly Leu Asn65 70 75 80Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Ser Gly Gly Phe Tyr Ile85 90 95Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn Ser Leu Gln Gln Leu Val Ala Tyr Tyr100 105 110Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg Leu Thr Thr Val Cys Pro115 120 125Thr Ser130(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特徵(A)長度134胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源
(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Pro Glu Pro Trp Phe20 25 30Phe Lys Asn Leu Ser Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ala Pro35 40 45Gly Asn Thr His Gly Ser Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Thr Ala50 55 60Gly Ser Phe Ser Leu Ser Val Arg Asp Phe Asp Gln Asn Gln Gly Glu65 70 75 80Val Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Asn Leu Asp Asn Gly Gly Phe Tyr85 90 95Ile Ser Pro Arg Ile Thr Phe Pro Gly Leu His Glu Leu Val Arg His100 105 110Tyr Thr Asn Ala Ser Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ser Arg Pro Cys115 120 125Gln Thr Gln Lys Pro Gln130(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特徵(A)長度133胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ser Arg Gly Trp Phe His20 25 30Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr Leu Leu Lys Gly Arg Gly25 40 45Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Arg Lys Asn Gln Gly Asp50 55 60Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln Val Thr His Ile Arg Ile65 70 75 80Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala85 90 95Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln Gly Val Leu100 105 110Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys115 120 125Ser Asp Pro Thr Ser130(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特徵(A)長度224胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特徵(A)長度225胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無
(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Ser Pro Ile Leu GLy Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Pne Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly210 215 220Arg225(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特徵(A)長度117胺基酸
(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Leu Gly Arg Lys Asp1 5 10 15Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu20 25 30Ile Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Ser Leu Ser Ile Arg35 40 45Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr Lys Ile Arg50 55 60Lys Leu Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile Thr Thr Arg Ala Gln Phe Glu65 70 75 80Thr Leu Gln Gln Leu Val Gln His Tyr Ser Glu Arg Glu Arg Ala Ala85 90 95Gly Leu Cys Cys Arg Leu Val Val Pro Cys His Lys Gly Met Pro Arg100 105 110Leu Thr Asn Ser Ser115(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特徵(A)長度123胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO11Gly Met Asn Asn Asn Met Ser Leu Gln Asn Ala Glu Trp Tyr Trp Gly1 5 10 15Asp Ile Ser Arg Glu Glu Val Asn Glu Lys Leu Arg Asp Thr Ala Asp20 25 30Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ala Ser Thr Lys Met His Gly Asp Tyr35 40 45Thr Leu Thr Leu Arg Lys Gly Gly Asn Asn Lys Leu Ile Lys Ile Phe50 55 60His Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Ser Asp Pro Leu Thr Phe Ser Ser65 70 75 80Val Val Glu Leu Ile Asn His Tyr Arg Asn Glu Ser Leu Ala Gln Tyr85 90 95Asn Pro Lys Leu Asp Val Lys Leu Leu Tyr Pro Val Ser Lys Tyr Gln100 105 110Gln Asp Gln Val Val Lys Glu Asp Asn Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特徵(A)長度112胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(xi)序列描述SEQ ID NO12
Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala1 5 10 15Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg20 25 30Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn35 40 45Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp50 55 60Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr60 70 75 80Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile85 90 95Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Gln Phe Ile Val Thr Asp100 105 110(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特徵(A)長度19胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(A)名稱/鍵其他(B)位置4...4(C)其它信息磷酸化的酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO13Glu Pro Gln Tyr Glu Glu Ile Pro Ile Tyr Leu1 5 1015(2)SEQ ID NO14信息
(i)序列特徵(A)長度19胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(A)名稱/鍵其他(B)位置4...4(C)其它信息磷酸化的酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO14Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特徵(A)長度19胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(A)名稱/鍵其他(B)位置6...6(C)其它信息磷酸化的酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO15
Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特徵(A)長度23胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(A)名稱/鍵其他(B)位置7...7(C)其它信息磷酸化的酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO16Thr Pro Pro His Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Val Val Ser Asp Ser1 5 10 15Gly20(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特徵(A)長度87鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO17TTCCATATGA AAAGTATTCG TATTCAGCGT GGCCCGGGCC GTCACCACCA CCACCACCAC60GGGATCCCCG CTGAAGAGTG GTACTTT87(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特徵(A)長度38鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO18GGAATTCTAG ATTACTAGGA CGTGGGGCAG ACGTT38(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特徵(A)長度46鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO1935 CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGCTGA GGAGTGGTAT TTT46(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特徵
(A)長度38鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO20GGAATTCTAG ACTATTAGGA CGTGGGGCAC ACGGT38(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特徵(A)長度48鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO21CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGAGCC CGAACCCTGG TTCTT48(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無
(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO22GCTCTAGACT ATTACTGGGG CTTCTGGGTC TG35(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特徵(A)長度46鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO23GAAGATCTTG GACGACGACG ACAAATCCCG TGGGTGGTTT CAC46(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(iii)假想鏈無(iv)反義鏈無(v)片段類型(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO24GCTCTAGACT ATCAACTAGT GGGATCGGAG CA35(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特徵(A)長度106胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(xi)序列描述SEQ ID NO25His Pro Trp Phe Phe Gly Lys Ile Pro Arg Ala Lys Ala Glu Glu Met1 5 10 15Leu Ser Lys Gln Arg His Asp Gly Ala Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu20 25 30Ser Ala Pro Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Lys Phe Gly Asn Asp Val35 40 45Gln His Phe Lys Val Leu Arg Asp Gly Ala Gly Lys Tyr Phe Leu Trp50 55 60Val Val Lys Phe Asn Ser Leu Asn Glu Leu Val Asp Tyr His Arg Ser65 70 75 80Thr Ser Val Ser Arg Asn Gln Gln Ile Phe Leu Arg Asp Ile Glu Gln85 90 95Val Pro Gln Gln Pro Thr Ile His Arg Asp100 105(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特徵(A)長度11胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(iii)假想肽無(iv)反義肽無(v)片段類型內部的(vi)初始來源(ix)特徵(A)名稱/鍵其他(B)位置6...6(C)其它信息磷酸化的酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO26Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val1 5 10
權利要求
1.一種治療自身免疫疾病的方法，包括給予受治療者有療效量的一種化合物，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低50倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
2.權利要求1的方法，包括給予受治療者有療效量的一種化合物，該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上。
3.權利要求1的方法，包括給予受治療者有療效量的一種化合物，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低100倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上。
4.權利要求3的方法，包括給予受治療者有療效量的一種化合物，該化合物可與人lck SH2結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上。
5.一種抑制同種異體移植排斥反應反應的方法，包括給予受治療者以抑制同種異體移植排斥反應量的一種化合物，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低50倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
6.權利要求5的方法，包括給予受治療者以抑制同種異體移植排斥反應量的一種化合物，該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上。
7.權利要求5的方法，包括給予受治療者以抑制同種異體移植排斥反應量的一種化合物，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低100倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上。
8.權利要求7的方法，包括給予受治療者以抑制同種異體移植排斥反應量的一種化合物，該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上。
9.一種誘導免疫抑制的方法，該方法包括給予受治療者以誘導免疫抑制量的一種化合物，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低50倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
10.權利要求9的方法，包括給予受治療者以誘導免疫抑制量的一種化合物，該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人srcSH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上。
11.權利要求9的方法，包括給予受治療者以誘導免疫抑制量的一種化合物，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低100倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上。
12.權利要求11的方法，包括給予受治療者以誘導免疫抑制量的一種化合物，該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上。
13.一種化合物在生產用於治療自身免疫病的藥物中的用途，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低50倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
14.根據權利要求13的用途，其中該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上。
15.根據權利要求13的用途，其中該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低100倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上。
16.根據權利要求1 5的用途，其中該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上。
17.一種化合物在生產用於抑制同種異體移植排斥反應反應的藥物中的用途，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低50倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
18.根據權利要求17的用途，其中該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上。
19.根據權利要求18的用途，其中該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低100倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上。
20.根據權利要求19的用途，其中該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上。
21.一種化合物在生產用於誘導免疫抑制的藥物中的用途，該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低50倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
22.根據權利要求21的用途，其中該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高50倍以上。
23.根據權利要求21的用途，其中該化合物a.可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上；b.可與人hcp SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；c.可與人SH-PTP2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lckSH2區結合的親和力低100倍以上；d.可與人p85 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上；e.可與人Grb2 SH2區結合，其親和力比該化合物與人lck SH2區結合的親和力低100倍以上。
24.根據權利要求23的用途，其中該化合物可與人lck SH2區結合，其親和力比該化合物與人src SH2區和人fyn SH2區結合的親和力高100倍以上。
全文摘要
本發明一種治療自身免疫疾病的方法,該方法包括給予受治療者具有療效量的一種化合物,該化合物可與人lckSH2區結合,其親和力比該化合物與人src SH2區或人fyn SH2區結合的親和力高出50倍以上,而且該化合物與人hcp SH2區、人Grb2 SH2區、人SH－PTP2 SH2區或人p85 SH2區結合的親和力比其與人lck SH2區結合的親和力低50倍以上。
文檔編號A61K31/00GK1179713SQ96192916
公開日1998年4月22日 申請日期1996年2月9日 優先權日1996年2月9日
發明者D·J·杜寧頓 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司