酶促方法和酶的製作方法

2023-09-14 17:57:15 1

專利名稱：酶促方法和酶的製作方法
技術領域：
提供的是採用編碼肽酶的核苷酸、用於肽酶表達的構建體和包含此種構建體的細 胞、以及所得到的肽酶來鑑定身體惡臭形成的調節劑的方法。核苷酸編碼其為肽酶的蛋白質。肽酶涉及惡臭形成，並且可以在鑑定身體惡臭形 成的調節劑特別是抑制劑的方法中採用。這些抑制劑具有阻止或減少身體特別是人體上的 惡臭形成的能力。背景自20世紀50年代以後，已知由頂泌腺分泌的汗液是沒有氣味的，並且不希望有的 汗味僅通過細菌作用而產生。因此，得出結論汗液包含惡臭前體，並且惡臭物通過細菌對所 述前體的酶促作用而釋放。身體惡臭特別包括腋臭是由於3類主要化合物硫烷基醇、不飽和酸或羥化酸和 類固醇。本文描述的方法用於鑑定阻止硫烷基醇形成的抑制劑。申請人:先前鑑定了關於不飽和或羥化酸的惡臭前體，和形成其的氨基醯化酶 (「AMRE」)(EP 1258531)。AMRE酶可以用於篩選惡臭形成酶的抑制劑，並且從而鑑定阻止 或減少身體惡臭的化合物。對於硫烷基醇的釋放，申請人鑑定了源自棒狀桿菌屬物種(Corynebacteriumsp.) Ax20的胱硫醚裂合酶和前體化合物(A.Natsch等人，Chemistry & Biodiversity 2004，1058)。Starkenmann 等人假定源自溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)的不 同裂合酶從不同前體即式Fill的前體中釋放硫烷基醇(W02006079934)。 雖然一般認為葡萄球菌屬細菌不涉及惡臭形成至主要程度，但Fill的化合物(在 實施例中「cys-gly-綴合物」)看起來促成身體惡臭。序列SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4作為其假定基因產物，被先前在序列資料庫中 公開，但蛋白質功能、催化活性及其在惡臭產生中的牽涉是未知的。申請人:目前已令人驚訝地鑑定了第三種類型的酶(肽酶包括但不限於SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4)，其從前體I (例如，但不限於Fill的化合物)，或備選地，從在下文中描 述的各種其他底物中釋放前體II，並且連同先前鑑定的胱硫醚_ 0 -裂合酶的作用最終形 成硫烷基醇惡臭物(比較

圖1)。新類型的肽酶和先前由申請人描述的裂合酶都存在於棒狀桿菌中。不希望受 理論束縛，一般公認高度不愉快的惡臭主要通過棒狀桿菌從新鮮汗液中釋放。申請人:顯示不存在能從前體I特別是但不限於化合物Fill中釋放惡臭物的棒狀 桿菌屬物種Ax20提取物的單一級份。這證實棒狀桿菌屬物種提取物中不存在可以切割前體I的單一酶(比較下文顯示的實施例，特別是實施例11)。進一步地，申請人顯示2種酶 介導前體I特別是但不限於Fill的化合物的切割首先肽酶(例如但不限於，SEQ IDN0 2 或NO 4)切割在gly和cys殘基之間的二肽，並且隨後3 -裂合酶從由肽酶形成的cys-綴 合物(FIV)中釋放惡臭物(比較下文顯示的實施例，特別是實施例12)。

前體I (Fll) 例如cys-gly-綴合物(Fill)
源自棒狀 桿菌的肽酶
源自在TO2006079934中假定的葡萄球 菌的p-裂合酶硫烷基醇惡臭物(FV)
源自描述於Natsch等人，2004的棒狀杆 菌的胱硫醚-p-裂合酶
前體II
例如cys-綴合物(FIV)圖1前體I和II反應生成硫烷基醇惡臭物；從前體I到前體II的反應由新近鑑 定的肽酶執行。經鑑定的類型的酶用作備選篩選靶，以鑑定由硫烷基醇惡臭物的惡臭形成的抑制 劑。
前體I (生理學相關底物)具有通式FII
其中Rl選自由甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基組成的烷烴殘基組
並且其中R2和R3獨立地選自H和甲基。
因此，硫烷基醇惡臭物具有通式FV
其中Rl選自由甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基組成的烷烴殘基組並且其中R2和R3獨立地選自H和甲基。如下文在節段「肽酶底物」中詳述的，肽酶還將使式FI的非生理學底物反應，這對 於篩選目的有用。該類型的肽酶是特別有利的，因為，不希望受理論束縛，它不僅存在於最相關屬的 細菌中，這種類型的肽酶看起來還在惡臭形成酶促反應中執行限速步驟，並且經鑑定的抑制劑因此可以預期是特別有效的。再進一步地，再次不希望受理論束縛，肽酶(SEQ ID NO 2和SEQID NO 4)的2個 實施方案都屬於與先前鑑定的AMRE酶相同的酶類別(金屬肽酶)，所述AMRE酶形成惡臭的 不飽和或羥化酸，並且用肽酶篩選(包括但不限於，SEQ ID 2和SEQ ID 4的酶)可能導致 發現還針對涉及形成惡臭的不飽和酸或羥化酸的金屬肽酶活性的抑制劑，並且因此同時有 效減少2個類別的惡臭物形成。概述提供的是下述(1)鑑定身體惡臭形成的調節劑的方法，該方法包括步驟⑴使肽酶與肽酶底物和至少一種測試試劑接觸；和(ii)測定至少一種測試試劑對肽酶介導的反應速率的影響，其中肽酶具有從式Fill的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中肽酶包含下述保守的部分序列胺基酸105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG，胺基酸150和180之間的EGSEEXG，胺基酸205 和 255 之間的 HSGXXGGXAPDA，胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。(2)條款(1)的方法，其中步驟(i)中的肽酶底物是式FI的化合物 其中X選自S和0，並且其中R1是選自H和甲基的殘基，並且其中R2是選自直鏈 或分支C1至C10烷基、直鏈或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的殘基。在條款(2)的備選實施方案中，X是S。
(3)條款(1)的方法，其中底物是選自S-苄基-Cys-Gly、0-苄基-Ser-Gly、 (1-(2_羥乙基)-1_甲基丁基)-L-半胱氨醯基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、0_苄 基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala_Gly、Ala-Ala 和 Pro-Ala 的化合物。在條款(3)的備選實施方案中，底物是選自S-苄基-Cys-Gly、0-苄基-Ser-Gly、 (1-(2_羥乙基)-1_甲基丁基)-L-半胱氨醯基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala和0_苄 基-Ser-Ala的化合物。在條款(3)的備選實施方案中，底物是選自Pro-Gly、Ala_Gly、Ala-Ala、Pro-Ala 的化合物。(4)條款(1)至(3)中任一項的方法，其中使另外的酶胱硫醚裂合酶與底物 和測試試劑並行或順次溫育，並且其中在步驟(ii)中，測試試劑對通過肽酶和裂合酶 的切割的影響通過在其反應產物的至少一種的形成中的改變進行測定，所述反應產物的至 少一種任選地選自硫醇反應產物和羥基反應產物。(5)試劑盒包括(i)如本文所描述的特別是如在條款⑴下限定的肽酶，和(ii)由該肽酶切割的底物化合物，用於組合使用以鑑定作為所述肽酶和惡臭形成的調節劑的測試試劑。在條款(5)的一個具體實施方案中，底物化合物是式FI的化合物 其中X選自S和0，並且其中R1是選自H和甲基的殘基，並且其中R2是選自直鏈 或分支C1至C10烷基、直鏈或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的殘基。在條款(5)的另一個實施方案中，式FI的所述底物化合物選自S-苄基-Cys-Gly、 0-苄基-Ser-Gly、(1_ (2_羥乙基)甲基丁基)_L_半胱氨醯基-甘氨酸、S-苄 基-Cys-Ala、0-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala 和 Pro-Ala。在條款(5)的另外一個實施方案中，式FI的所述底物化合物選自S-苄 基-Cys-Gly、0-苄基-Ser-Gly、(1_(2_羥乙基)甲基丁基)_L_半胱氨醯基-甘氨酸、 S-苄基-Cys-Ala、0_ 苄基-Ser-Ala。在條款(5)的另外一個實施方案中，式FI的所述底物化合物選自Pro-Gly、 Ala-Gly、Ala-Ala 禾口 Pro-Ala。(6)在其切割其底物的能力方面抑制如本文所限定的特別是在條款⑴下的肽酶 的方法，其中使肽酶與肽酶抑制劑接觸。(7)用於阻止或減少身體惡臭形成的條款(6)的方法，其中將肽酶抑制劑應用於 身體表面，並且其中肽酶是如本文所描述的特別是但不限於在條款(1)下的肽酶。
(8)條款(7)的方法，其中化合物以包含至少一種賦形劑的皮膚病學可接受的組 合物形式應用。(9)用於製備具有針對身體惡臭形成的效應的個人護理產品的方法，其中將肽酶 抑制劑加入個人護理產品製劑中，並且其中肽酶是如本文所描述的特別是但不限於在條款 (1)下的肽酶。(10)包含肽酶底物和分離的肽酶的組合物，其中肽酶是如本文所描述的特別是但不限於在條款⑴下的肽酶；其中肽酶底物是如本文所描述的特別是但不限於在條款⑵或(3)中任一項或其 具體實施方案任何一個中的肽酶底物。(11)條款(10)的組合物，其中肽酶是選自分離形式、包含功能肽酶的製劑形 式、在合適宿主細胞中的異源表達形式、表達肽酶的傑氏棒狀桿菌(Corynebacterium jeikeium)形式、和表達肽酶的傑氏棒狀桿菌K411形式的形式。(12)分離的肽酶，其中肽酶是如本文所描述的特別是但不限於在條款⑴下的肽 酶，並且其中肽酶與選自SEQ ID N0:2和SEQ ID NO :4的序列同源，具有至少40%的 序列同一性。(13)條款(12)的分離的肽酶，其中肽酶與選自SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4的 序列同源，具有至少80 %的序列同一性。在其他實施方案中，序列同一性是至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %。(14)編碼肽酶的核苷酸，其中肽酶是如本文所描述的特別是但不限於在條款(1) 下的肽酶，其選自通過序列同一性測定的與SEQ ID NO 1的核苷酸序列實質性同源的核苷酸，當翻譯成相對應蛋白質時，不引起胺基酸改變的SEQ ID NO 1的保守修飾變體的 核苷酸，通過雜交測定的與SEQ ID NO 1實質性同源的核苷酸，其中通過序列同一性測定的實質性同源的核苷酸具有至少80%的序列同一性。在其他實施方案中，序列同一性是至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %。(15)條款(16)的分離的核苷酸，其中所述分離的核苷酸構成表達載體的部分。(16)條款(16)的分離的核苷酸，其中表達載體構成用表達載體轉染的宿主細胞 的部分。(17)形成肽酶的方法，其包括下述步驟在足以表達的條件下培養包括編碼肽酶 的表達載體的宿主細胞，從而形成肽酶，並且任選地從細胞中將其回收，其中肽酶是如本文 所描述的特別是但不限於如在條款(1)下的肽酶。詳述下述段落詳細描述了肽酶及其變體，其底物，其反應產物，其在鑑定身體惡臭的調 節劑和抑制劑中的用途，包括各種篩選測定法和如何執行它們，包括可以使用的細胞，使用 純化肽酶的測定法，肽酶轉錄測定法，關於肽酶的表達系統，肽酶的超表達，肽酶構建體轉 染到細胞內，肽酶蛋白質回收，肽酶調節劑，肽酶底物鑑定，結合測定法，鑑定調節劑的試劑 盒，經鑑定的調節劑的證實，大規模篩選測定法，測試試劑文庫，測試試劑類型，個人護理產
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肽酶和實質性同源的序列在本文描述的方法中有用的肽酶(或編碼其的核苷酸)可以選自SEQ ID NO 2的 肽酶(或關於編碼其的核苷酸SEQ ID N0:1), SEQ IDN0 :4的肽酶(或關於編碼其的核苷 酸SEQ ID NO :3)，和與SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :4實質性同源的肽酶(或關於編碼 其的核苷酸SEQ IDN0:1和/或SEQ ID NO :3)，並且保留功能，即肽酶結合如本文描述的底 物/惡臭物前體和/或反應/切割所述底物/惡臭物前體(或在核苷酸的情況下，如果它 們編碼此種肽酶，那麼它們視為功能的)。例如，但不限於，肽酶或編碼肽酶的核苷酸可衍生 自天然存在的棒狀桿菌或可從人腋窩中分離。實質性同源的肽酶包含下述保守的部分序列塊(字母指單字符胺基酸編碼，並且 X是20種普通胺基酸中的任何一種，並且所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的 肽酶的N末端開始編號胺基酸105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG，胺基酸150和180之間的EGSEEXG，胺基酸205 和 255 之間的 HSGXXGGXAPDA，胺基酸385和425之間的GGSIPL。對於編號，使用實質性同源的肽酶的天然存在序列，或在編號前，如對於技術人員 顯而易見的，在序列的編號中校正或不考慮任何加入的標記、融合序列或相似，以便使其與 以其天然存在形式的序列一致，即不包含將影響編號的此種或相似的改變。保守序列塊也在下圖中顯示。 圖2 顯示保守序列塊的SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4的序列比對鑑定的肽酶SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4從棒狀桿菌屬物種Ax20 (SEQ ID NO: 2)和傑氏棒狀桿菌(SEQ ID NO 4)中分離，更特別地從棒狀桿菌屬物種Ax20，DSM 14267和傑氏棒狀桿菌1(4110^11吐等人2005，了 Bacteriol. 187(13) 4671-82)中分離，所述DSM 14267 與紋帶棒(Corynebacterium striatum)或 Corynebacteriumglaucum 最緊密 BT 2001 ^ 4 ^ 26 UWt^iu InternationalDepository Authority DSMZ-German Collection of Microorganismsand Cell Cultures, D-38124 Braunschweig(登i己號 DSM 14267)。Ax20 (DSM 14267)從人腋窩中分離，並且根據生物化學測試(APICoryne測試試劑 盒，BioMerieux, France)與紋帶棒狀桿菌最緊密相關，基於全長16S rRNA基因的序列分 析，它與源自物種Corynebacterium glaucum的類型菌株最緊密相關。傑氏棒狀桿菌已知用於機會性感染，特別是在免疫妥協患者中。K411從人腋窩中 分離。它是人皮膚菌群的需要脂質的和多藥抗性的細菌物種，其已識別為醫院病原體。如本文所使用的，術語肽酶可以指Ax20肽酶(SEQ ID NO 2)、K411肽酶(SEQ ID NO 4)、或如本文所描述的與其實質性同源的肽酶。在它們需要Zn離子的存在作為輔因子的範圍內，肽酶分類為金屬肽酶。它們與先 前鑑定的釋放不飽和或羥化酸惡臭物並且也是鋅依賴性的金屬肽酶(AMRE)功能上相關。 編碼肽酶的核苷酸序列已得到分離且測序(SEQ ID N0:1,SEQ ID NO :3)。可以將每種肽酶 基因序列引入合適的表達載體中，並且通過在所需微生物或細胞中的異源表達用於產生肽 酶。序列SEQ ID NO 1和2 (源自Ax20)沒有被在先描述，且SEQ IDN0 4的經分離的 肽酶沒有被在先描述。在體內，肽酶存在於細胞內，並且可以通過細胞包膜的機械破碎從細胞中釋放。因 此，肽酶可以從細胞提取物中分離，特別是由衍生自生物體的細胞獲得的細胞提取物，所述 生物體選自野生型棒狀桿菌菌株。棒狀桿菌包括例如但不限於，棒狀桿菌屬物種、紋帶棒狀桿菌、Corynebacterium glaucum、傑氏棒狀桿菌、棒狀桿菌屬物種Ax 20、傑氏棒狀桿菌K411、乾燥棒狀桿菌 (Corynebacterium xerosis)、Corynebacterium appendicis、Corynebacterium coyleae、 Corynebacterium mucifaciens、Corynebacterium riegelii 禾口 Corynebacterium tuberculostearicum0野生型棒狀桿菌菌株的良好來源是人腋窩，如本領域眾所周知的，從其中可以培 養且分離細菌菌株。所有上述棒狀桿菌都從人腋窩中分離或存在於人腋窩中，表達惡臭形成酶並且能 夠形成惡臭。肽酶可以以完整細胞形式、或以分離形式例如作為粗提取物、或以純化形式使用。 例如，粗提取物可以通過細胞的機械破碎形成。任選地，肽酶可以是純化的。備選地，肽酶 可以如本文所描述的重組形成。實質性同源的肽酶蛋白質包括此種蛋白質，其中底物結合和/或催化部分由源自 不同物種的等位基因變體的相關部分替換，例如另一種人腋窩衍生的細菌，包括但不限於 棒狀桿菌屬的細菌。此外，實質性同源的肽酶核苷酸或多肽序列可以通過保守突變和/或點突變形 成，並且包括如下文詳述的任何保守修飾變體。
就核苷酸序列而言，保守修飾的變體意指編碼一致或實質上一致的胺基酸序列的 核苷酸(保守置換胺基酸，即賴氨酸轉變成精氨酸，並且進一步的實例如在下文中所解釋 的)。由於遺傳密碼的簡併性，在序列中不同但功能上一致的大量核苷酸編碼任何給定 多肽/蛋白質。此種核苷酸變化是「沉默變化」，這是保守修飾變化的一個種類。編碼多肽 的每個核苷酸序列也描述了核苷酸的每個可能沉默變化。因此，可以修飾核苷酸中的每個 密碼子(除通常是關於甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG，和通常是關於色氨酸的唯一密碼子 的TGG外)，以產生功能上一致的核苷酸序列，其將產生一致多肽。因此，編碼多肽的核苷酸 的每個沉默變化隱含在每個給定核苷酸序列中。就胺基酸序列而言，胺基酸置換可以使用重組基因技術的已知方案引入，包括 PCR、基因克隆、cDNA的定點誘變、宿主細胞轉染、和體外轉錄，其可以用於將此種改變引入 肽酶序列。變體隨後可以就肽酶活性進行篩選。提供功能上相似的胺基酸的保守置換表 是本領域眾所周知的。例如，選擇保守置換的一個示例性指導包括(原殘基後為示例性置 換):ala/gly ^ ser ；arg/lys ；asn/gln^chis ；asp/glu ；cys/ser ；gln/asn ；gly/asp ；gly/ ala 或 pro ；his/asn 或 gin ；ile/leu 或 val ；leu/ile 或 val ；lys/arg 或 gin 或 glu ；met/ leu 或 tyr 或 ile ；phe/met 或 leu 或 tyr ；ser/thr ；thr/ser ；trp/tyr ；tyr/trp 或phe ；val/ ile 或 leu。備選示例性指導使用下述6個組，各自包含是關於彼此的保守置換的胺基酸1) 丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E) ；3)天冬醯胺(N)、穀氨 醯胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸 (V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另一個備選指導允許所有荷電胺基酸作為關於彼此的保守置換，無論它們是正的 還是負的。此外，改變、添加或缺失編碼序列中的單個胺基酸或小百分比(例如高達26%、或 高達20%、或高達10% )胺基酸的個別置換、缺失或添加也視為保守修飾變化。實質性同源的核苷酸或多肽序列具有下文指出的序列同一性程度，同時保留如本 文限定的多肽對底物的催化活性。序列同一性％ 實質性同源的核苷酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性％。實質性同源的多肽序列具有至少40 %、至少42 %、至少50 %、至少60 %、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性％。值得注意的是，當比較肽酶Ax20(SEQ ID N0:1和N0:2)和肽酶K411(SEQ ID NO: 3和NO 4)時，兩者都具有對相同生理學底物的相同催化活性，基於其胺基酸序列，它們的 同一性是42 %，並且基於其核苷酸序列，它們的同一性是55 %。序列同一性％的計算如下測定。BLAST(基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool))是由在 http://www. ncbi.nlm.nih. rov處可獲得的程序blastn採用的啟發搜索算法。為了測定核苷酸查詢序列針對另一種核苷酸序列的同一性％，使用Blastn，使用BLAST版本2. 2. 1. 3的預設參數，包括EXPECT(用於報告針對資料庫序列的匹配的統計顯著 性閾值)10、和DUST過濾。為了測定多肽查詢序列針對另一種多肽序列的同一性％，使用Blastp，使用 BLAST版本2. 2. 1. 3的預設參數，包括EXPECT 10、和DUST過濾。實質性同源的核苷酸序列包括但不限於，在下文詳述的嚴格雜交條件下，與本文 描述的一種或多種肽酶核苷酸序列或與其互補體選擇性雜交的序列。嚴格條件是42°C的溫度下在由50%甲醯胺、5XSSC和SDS組成的溶液中，和 65°C下洗滌於由 0. 2XSSC 和 0. SDS(1XSSC = 0. 15M NaCl、0. 015 M Na3 檸檬酸鹽 pH 7. 0)組成的溶液中。背景雜交可能由於例如待篩選的基因組DNA文庫中存在的其他核苷酸序列而發 生。與用靶DNA觀察到的特異性相互作用相比較，強度小2倍或任選地強度小10倍的 信號視為背景。相互作用的強度可以例如通過放射性標記探針如用32P進行測量。如本文所使用的，術語「分離的」意指取自某物源於其的環境並且轉移至不同環 境，包括完整細胞的環境並且將其轉移至細胞裂解物。「純化形式」意指就其他蛋白質和/或核酸汙染物(w/w)而言，超過80%，例如但 不限於超過90%、超過95%、超過98%、超過99%或更多。肽酶底物肽酶底物(例如但不限於前體I) 一般可以描述為二肽衍生物。底物的實例包括 但不限於，簡單二肽例如ala-ala和ala-gly。與肽酶具有最高親和力的底物是cys-gly和 cys-ala t行生物,特別是 L-cys-L-gly 禾口 L-cys-L—ala t行生物,其中 cys-gly 或 cys-ala 殘 基的S原子如本文所描述的是烷基化的。cys-gly衍生物可以是天然存在的例如但不限於前體I，或合成類似物包括但不 限於S-苄基-Cys-Gly。給定二肽衍生物是否是肽酶底物可以通過下述容易地測定使其與SEQ ID N0:2 或SEQ ID NO :4肽酶溫育，並且測定所述底物是否通過如本文所描述的肽酶進行酶促反應。底物包括但不限於與酶具有高親和力的底物，其可以具有下文顯示的式
FI並且其中X選自S和0，並且其中R1是選自H和甲基的殘基，並且其中R2是選自 直鏈或分支C1至C10烷基、直鏈或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的殘基。有用底物的具體組是式FI的底物，其中X是S，R1是甲基，並且R2是選自直鏈或 分支C1至C10烷基、直鏈或分支C1至C10烷醇、苯基和苄基的殘基。
就R2殘基而言，"CI至CIO烷基」包括但不限於甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己 基、庚基、辛基、壬基和癸基；並且「C1至C10烷醇」包括但不限於，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、 戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇，以及任選任何分支形式的烷基或烷醇。生理學相關底物是在上文中作為「前體I」指出的那些，並且具有式FII 其中Rl是選自由甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基組成的烷基殘基，並且其中R2和R 3獨立地選自H和甲基。肽酶底物的具體實例包括但不限於S-苄基-Cys-Gly、0_苄基-Ser-Gly、 (1- (2-羥乙基)-1-甲基丁基)-L-半胱氨醯基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、0_節 基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala、Pro-Ala。它們的化學結構顯示於下表中。
肽酶反應產物用肽酶的酶促反應的產物是對於 衍生物，游離甘氨酸和S-取代的cys或0氨酸和S-取代的cys或0-取代的ser衍生物。最終惡臭物產物僅在所得到的肽酶的酶促反應產物(例如前體II)暴露於裂 合酶時形成，其通過所述裂合酶切割以釋放硫烷基醇。提供的新型構建體和產物(DNA、載體、重組細菌、蛋白質/肽酶)在並不限於就肽 酶反應的抑制劑篩選時是有用的。調節劑和抑制劑的鑑定其為抑制劑的調節劑有利地加入產品(特別是個人護理產品包括但不限於除臭 劑)中，以阻止身體惡臭形成。類似地，在下文中描述的篩選方法可以用於鑑定其他調節劑 例如增強劑，其將在此種產品中避免。為了鑑定調節劑，使肽酶及其底物暴露於合適濃度的至少一種測試試劑(潛在調 節劑)，所述合適濃度例如但不限於lnm至ImM、或10nm至lOmicroM。隨後通過本領域眾所周知的方法例如但不限於，通過如本文所描述的方法，監控 調節劑對酶促切割/反應速率的作用。通過離析物切割速率或產物形成速率(後者包括次級產物)測定酶促切割/反應 速率的改變。例如，通過監控底物消失的速率、或底物的切割產物出現的速率(例如，游離氨基 酸反應產物包括但不限於gly或ala出現的速率)，測定切割/反應速率。在潛在調節劑的高流通量篩選的一個實施方案中，通過用胺_基團衍生劑衍生遊 離Na基團來測量游離L-gly或L_ala的釋放，其在與胺基團反應後形成生色團或螢光分 子。在這點上有用的可以是螢光胺(Fluka，Buchs，Switzerland)的使用，以在與L_gly或 L-ala反應後形成螢光分子。最後，L-gly-底物的切割可以與對照反應相比較，並且從而可 以定量測試化合物影響特別是抑制反應的潛力。如果將作用於肽酶反應產物的裂合酶或另一種酶同樣加入反應，那麼備選地 或另外地，可以監控惡臭物(硫烷基醇)或其他釋放的硫分子出現的速率。監控速率中的 改變指示測試試劑和潛在調節劑對酶的作用。當與在無抑制劑測試試劑的情況下的反應或 預定標準速率相比較時，通過切割產物形成的較低速率或游離胺基酸釋放的較低速率或硫 分子形成的較低速率來鑑定抑制劑。切割/反應速率可以通過例如但不限於下述方法進行監控通過高效液相色譜法 (HPLC)或薄層色譜法(TLC)或毛細管電泳分析底物或形成的游離胺基酸或其他切割產物； 在使游離胺基酸與螢光探針(例如但不限於螢光胺)反應後的螢光分光光度法；在使游離 硫分子與螢光探針(例如但不限於單溴二胺(monobromobimane))反應後的螢光分光光度 法；釋放硫分子的氣相色譜法；或通過生物化學測試檢測反應產物。有用的肽酶包括但不限於，SEQ ID NO 2的肽酶和SEQ ID NO 4的肽酶。SEQ ID N0:4的肽酶具有比SEQ ID NO :2的肽酶更低的活性，但作為篩選靶或驗證篩選命中和/或 在不同細菌物種中篩選廣泛範圍活性的抑制劑仍是非常有用的。這些篩選可以順次或並行 執行，使用這兩種酶在一個反應孔中。與採用如本文所描述的肽酶的篩選方法並行或順次地，還可以使用另外的惡臭形 成酶，例如但不限於，裂合酶和AMRE中的一種或多種。為此，裂合酶和/或AMRE可 以與肽酶及其底物和測試試劑並行或順次進行溫育，並且通過硫烷基醇(由肽酶和裂
19合酶釋放)和/或羧酸或穀氨醯胺(由AMRE釋放)的形成中的改變，測定測試試劑對酶的 切割/反應速率的作用。備選地，可以測定反應離析物的反應速率中的改變。肽酶SEQ ID N0:2、肽酶SEQ ID NO :4和實質性同源物中的一種或多種的經鑑定的 抑制劑是希望的除臭劑成分，因為它們抑制在從沒有氣味的汗液中釋放硫化學物中的限速 步驟。特別有利的是抑制超過一種棒狀桿菌肽酶的抑制劑，例如但不限於肽酶SEQ ID NO 2和肽酶SEQ ID NO :4 二者，並且因此將提供針對許多不同棒狀桿菌屬物種的廣譜活性。本文在下文實施例中的結果顯示裂合酶僅切割cys-綴合物，而不切割Fill 的前體I，指出裂合酶單獨無法負責腋窩分泌中數量上最豐富的底物的切割。相比之 下，源自從人測試受試者的腋窩中分離的棒狀桿菌屬物種Ax 20的含肽酶的提取物的確從 Fill的前體I (在實施例中cys-gly綴合物)中釋放硫烷基醇惡臭物，並且這種反應通過 金屬肽酶抑制劑鄰二氮雜菲終止。這是令人驚訝的，因為W02006079934假定0 -裂合酶切 割Fill的前體I。它推斷細胞提取物包含除裂合酶外涉及Fill的前體I切割的另一 種酶。但因為如本文實施例中顯示的，不存在能從Fill的前體I中釋放惡臭物硫揮發物的 Ax20細胞提取物的單一級份，並且再次如本文實施例中顯示的，因為單一級份在0 _裂合 酶的存在下能從Fill的前體I中釋放惡臭物硫揮發物，所以推斷2種酶順次從Fill的前 體I中釋放惡臭物，即肽酶釋放gly，並且從而形成0 -裂合酶的底物，所述0 -裂合酶再按 序釋放硫分子。在測定法中使用的細胞合適的細菌細胞包括天然表達肽酶的所有棒狀桿菌，例如但不限於，棒狀 桿菌屬物種、棒狀桿菌屬物種Ax 20、紋帶棒狀桿菌、Corynebacterium glaucum、傑 氏棒狀桿菌、傑氏棒狀桿菌K411、乾燥棒狀桿菌、Corynebacterium appendicis、 Corynebacteriumcoyleae>Corynebacterium mucifaciens>Corynebacterium riegelii 禾口 Corynebacterium tuberculostearicum。備選地，肽酶可以在宿主菌株中異源表達，所述宿主菌株例如但不限於，細菌菌株 (包括但不限於大腸桿菌(E. coli)菌株)、酵母菌株、或真核細胞系(包括但不限於，昆蟲 細胞、哺乳動物細胞、兩棲動物細胞和蠕蟲細胞)。這些宿主菌株用合適載體進行轉化，所述 合適載體攜帶編碼肽酶的核苷酸序列和關於宿主的相關控制元件，如本領域眾所周知的。用於表達肽酶的載體構建體可以以本身已知的方式來產生，使用聚合酶鏈反 應(PCR)以擴增源自棒狀桿菌的染色體DNA的編碼區，並且在驗證序列後，將編碼序列 亞克隆到合適載體內。合適載體是商購可得的，例如出自Invitrogen(Groningen，The Netherlands)的載體。有用的載體是載體pET_3a (Studier和Moffatt，1986)。將所得到 的質粒轉化到合適的大腸桿菌宿主菌株內。載體-宿主菌株組合的適合性依賴於所選擇的 宿主菌株，對於其載體與之相容或就其進行最佳化(例如將載體pET-3a轉化到宿主菌株 BL21(DE3)內)。備選地，各種表達載體/宿主系統可以用於包含且表達編碼肽酶的序列。這些包 括例如不同微生物，包括用重組噬菌體、質粒或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；用酵母表達 載體轉化的酵母；用病毒表達載體(例如杆狀病毒)或用細菌表達載體(例如PBR322質 粒)感染的昆蟲細胞系統。酵母表達系統可以用於產生肽酶。包含組成型或誘導型啟動子例如a因子、醇氧化酶和PGH啟動子的許多載體，可以在酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或畢赤 酵母(Pichia pastoris)中使用。此外，此種載體指導表達蛋白質的分泌或細胞內保留，並 且使得外源序列能夠整合到宿主基因組內用於穩定繁殖。對於異源蛋白質在昆蟲細胞系例如鱗翅目昆蟲杆狀病毒的衍生物中的表 達，可以使用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleo-virus, AcMNPV)。在該系統中，外源基因表達由非常強的晚期病毒啟動子多角體蛋 白或P10啟動子指導，並且最佳化重組蛋白質的表達和回收的廣泛多樣載體是可用的。這 些載體使得能夠以高水平表達膜結合的和分泌的蛋白質。許多載體是商購可得的，例如，出 自 Invitrogen 的 InsectSelect System0使用純化肽酶的測定法對於使用基於細胞的測定法備選地，使用本領域眾所周知的方法從在上文中描述 的肽酶表達細胞中純化肽酶，並且隨後執行酶促測定法通常更簡單，所述酶促測定法使純 化肽酶、其底物和測試試劑體外接觸，並且如本文所描述的測定肽酶反應速率中的改變。任 選地，結果可以如本文所描述的使用可源於人腋窩的棒狀桿菌在體內加以驗證。肽酶轉錄測定法對於基於細胞的測定法或酶促測定法備選地，可以執行鑑定作用於基因轉錄水平 的調節劑的測定法。將測試試劑加入肽酶表達野生型棒狀桿菌中。在有限時間(例如，30 分鐘至8小時)後，通過洗滌細菌細胞或通過經由離心收穫細胞來去除測試試劑。細菌細 胞隨後就肽酶量進行分析，並且使這個值與未暴露於測試試劑的對照細胞相比較。抑制劑 減少由細菌形成的肽酶量，並且因此降低其形成惡臭的潛力。細菌細胞的肽酶量可以這樣 測定通過活性測定法使用如本文所描述的方法和底物，或通過產生針對肽酶包括但不限 於SEQ ID 2或SEQ ID4的特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)進行測定，並且隨後使 用合適的免疫學檢測方法，例如但不限於，免疫斑點印跡、蛋白質印跡、或酶聯免疫吸附測 定法(ELISA)，以特異性檢測細菌細胞中的肽酶。關於肽酶的表達系統為了表達編碼所需蛋白質的cDNAs，一般將合適cDNA亞克隆到表達載體內，所述 表達載體包含指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子、和核糖體結合位點用於翻譯起始。 合適的細菌啟動子是本領域眾所周知的，例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.) 和沙門氏菌屬(Salmonella)，並且用於此種表達系統的試劑盒是商購可得的。相似地，關於 哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核生物表達系統是商購可得的。真核生物表達載體可 以是例如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或逆轉錄病毒載體。表達盒還應包含在結構基因下遊的轉錄終止區以提供有效終止。終止區可以得自 與啟動子序列相同的基因或可以得自不同基因。對於蛋白質的表達，可以使用本領域眾所周知的用於在真核或原核細胞中表達的 常規載體。載體的實例包括細菌表達載體，例如質粒包括基於PBR322的質粒、基於pBAD的 質粒、pSKF和pET23D、以及融合表達系統例如GST和LacZ。包含源自真核生物病毒的調節元件的表達載體一般在真核生物表達載體中使用， 例如SV40載體、巨細胞病毒載體、乳頭狀瘤病毒載體、和衍生自EB病毒的載體。其他示例 性真核生物載體包括 pMSG、pAV009/A\ pMT010/A\ pMAMneo-5、杆狀病毒 pDSVE、pcDNA3. 1、pIRES和任何其他載體，允許在SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠 乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白質啟動子、或顯示對於在真核細胞 中的表達有效的啟動子指導下表達蛋白質。某些表達系統具有提供基因擴增的標記，例如胸苷激酶、潮黴素B磷酸轉移酶、二 氫葉酸還原酶等。一般在表達載體中包括的元件還可以包括在大腸桿菌中起作用的複製子、允許選 擇具有重組質粒的細菌的編碼藥物抗性的基因、和允許插入真核生物序列的在質粒非必需 區中的獨特限制位點。所選擇的具體藥物抗性基因並不是關鍵的，本領域已知的許多藥物 抗性基因中的任何都是合適的。原核生物序列任選如此選擇，使得需要時，它們不幹擾DNA 在真核生物細胞中的複製。在細菌系統中，肽酶cDNA片段可以單獨或作為融合蛋白表達，其中使目的肽酶蛋 白質與大腸桿菌周質麥芽糖結合蛋白質(MBP)融合，其中MBP包括其信號肽與肽酶的氨基 末端連接。將野生型肽酶cDNA或MBP 肽酶融合cDNA亞克隆到合適質粒例如pBR322內， 其中在大腸桿菌中，肽酶表達由lac野生型啟動子驅動。載體-宿主菌株組合的具體實例是在菌株大腸桿菌DH5aPR0(ClonteCh，Palo Alto，CA，USA)中的載體 pPROTet. E133 或在大腸桿菌菌株 TOP 10 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands)中的載體 pBAD-myc-his-A。表達載體和宿主菌株的其它實例在T. Maniatis等人(MolecularCloning，cold spring Harbor Laboratory, 1982)中描:^i。在體外轉錄和翻譯是表達肽酶的另一種備選方法。肽酶的超表達肽酶可以通過將其置於強組成型啟動子例如CMV早期啟動子的控制下進行 超表達。備選地，超表達可以在誘導型啟動子的控制下達到，例如但不限於，在載體 pBAD-myc-his-A中的阿拉伯糖啟動子或在下文中描述的T_rex系統中。肽酶表達載體構建體轉染到細胞內標準轉染方法可以用於產生表達大量蛋白質的細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞 系。可以使用用於將核苷酸序列引入宿主細胞內的任何已知方法。僅需要所使用的具 體基因工程操作能夠將相關基因成功引入能夠表達目的蛋白質的宿主細胞內。這些方法可 以涉及將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遺傳材料引入宿主細胞內，並且包 括磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、血漿載體、病毒載體等的 使用。例如，但不限於，可以使用T-Rex 表達系統(Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)。 所述T-Rex 系統是四環素調節的哺乳動物表達系統，其使用源自大腸桿菌TnlO-編碼的四 環素(Tet)抗性操縱子的調節元件。在T-Rex 系統中的四環素調節基於四環素與Tet阻 遏子的結合和控制目的基因表達的啟動子的去阻遏。轉染後，轉染細胞可以使用本領域眾所周知的標準培養條件進行培養。對於技術 人員顯而易見的是，不同細胞需要不同培養條件包括合適溫度和細胞培養基。肽酶蛋白質回收
22
需要時，蛋白質可以使用標準技術從細胞中回收。例如細胞可以機械或通過滲透 壓休克爆裂開。所得到的粗酶可以就此使用，或可以例如通過實施沉澱和色譜法步驟與細 胞碎片、細胞蛋白質、細胞核酸和細胞汙染物中的一種或多種分開，所述色譜法步驟包括但 不限於離子交換、疏水相互作用、反相和尺寸排阻色譜法步驟。在每個步驟後，經洗脫的蛋 白質可以通過包括但不限於過濾和超濾的方法得到進一步純化和/或濃縮。備選地，重組 蛋白質可以從重組細胞已在其中進行培養的培養基中回收(條件是肽酶已連同提供輸出 到培養基內的序列一起表達)。可以通過測定法鑑定的調節劑肽酶活性的調節劑且特別是抑制劑可以如下文所述進行鑑定。以下為在本文描述的方法中待鑑定的試劑的定義。調節劑是影響下述中的一種或多種的增加或減少的試劑底物與肽酶的結合、底 物(例如但不限於，惡臭物前體)與惡臭物或第二種惡臭物前體的反應。調節劑其自身可以 在底物結合位點處或以其他位點與肽酶結合，並且可以以不同速率或完全不切割或反應， 或可以與底物結合併且從而影響其反應/切割速率。調節劑包括各種類型的化合物，包括小分子、肽、蛋白質、核苷酸、抗體或其片段。 這些可以衍生自各種來源，包括合成或天然、天然材料的提取物，例如源自動物、哺乳動物、 昆蟲、植物、細菌或真菌細胞材料或培養細胞、或此種細胞的條件培養基。底物是與肽酶結合且由其切割或反應的試劑。抑制劑是與在無抑制劑的情況下的底物結合相比較，減少底物與肽酶的結合，和/ 或減少底物的反應/切割速率，和/或減少總體肽酶活性的調節劑。增強劑與在無增強劑的情況下的底物結合相比較，增加底物與肽酶的結合，和/ 或增加底物的反應/切割速率，和/或增加總體肽酶活性。肽酶結合底物和反應/切割底物以形成第二種前體且最終形成惡臭物的活性或 活性的改變可以通過在下文中描述的方法進行測定。底物鑑定為了鑑定底物，使測試試劑與肽酶一起溫育，並且通過如本文所描述的分析方法 跟蹤反應產物的形成或潛在底物的消失。被肽酶反應的任何化合物都定義為底物。為了評 估底物與其他已知底物相比較的親和力，使連續稀釋的底物與固定濃度的肽酶一起溫育， 並且測定在給定時間後在每個底物濃度下的切割速率。基於所得到的曲線，測定生物化學 參數(通過一個肽酶分子每秒切割的分子底物中的最大反應速率)和Km(給出其中酶以 50%最大反應速率活性的底物濃度的米氏常數)。低Km指示肽酶對於其底物的高親和力， 並且因此具有低Km和高的底物是對於酶特別良好的底物。然而，對於篩選測定法，也可 以使用具有高Km和低vmax的底物。鑑定調節劑的試劑盒試劑盒，例如篩選試劑盒或高流通量篩選試劑盒，包括分離肽酶(源自野生型或 重組細胞)或表達肽酶的重組細胞，或與其實質性同源的序列；並且包括肽酶的底物，例如 但不限於S-苄基-Cys-Gly、0_苄基-Ser-Gly、(1_ (2_羥乙基)甲基丁基)_L_半胱氨 醯基「甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、0-苄基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala、Pro_Ala。底物以合適濃度提供，例如ImicroM至10mM、或lOmicroM至ImM、例如50microM至 ImM、或 50microM 至 500microMo任選試劑盒組分可以包括用於培養提供的重組細胞的合適培養基和培養裝置，以 使細胞在例如微量滴定板中生長，這些任選組分對於技術人員將是容易獲得的。試劑盒可以如下使用(i)使表達肽酶的重組細胞生長，或備選地，提供分離肽酶，(ii)在以合適濃度的肽酶底物的存在下加入至少一種測試試劑，和(iii)通過對比存在和不存測試試劑下的應答，測定底物/其一種或多種產物被 肽酶切割/反應的速率的改變，或底物與肽酶結合中的改變，並且從而鑑定測試試劑為調 節劑。特別地，對於使用經分離的肽酶的試劑盒(i)將任選地以約1納摩爾至約5毫摩爾濃度的測試試劑加入包含肽酶的測定法 緩衝液中，(ii)在允許測試試劑與肽酶結合的限定預溫育時間段後(任選地，0至15分鐘)， 加入以合適濃度的選擇底物，(iii)通過對比存在和不存測試試劑下的應答，測定底物/其一種或多種產物被 肽酶切割/反應的速率的改變，或底物與肽酶結合中的改變，並且從而鑑定測試試劑為調 節劑。可以執行相似測定法，其中肽酶不是以分離的形式，而是以細胞提取物形式，或以 完整原核或真核細胞形式提供(i)使表達肽酶蛋白質的重組細胞在培養中生長，(ii)在以合適濃度的底物的存在下，將任選地以約1納摩爾至5毫摩爾的測試試 劑加入培養基中，(iii)通過對比存在和不存測試試劑下的應答，測定底物/其一種或多種產物被 肽酶切割/反應的速率的改變，或底物與肽酶結合中的改變，並且從而鑑定測試試劑為調 節劑。例如但不限於，步驟(iii)可以根據在上文中描述的任何一種方法進行。這可能 需要特異性選擇或相適應的重組細胞，這也在上文中描述。經鑑定的調節劑的證實如下文詳述的，通過使用測試人實驗組對嗅樣品的簡單感官實驗，可以容易地證 實通過在上文中描述的方法鑑定的調節劑。樣品已暴露於肽酶和裂合酶，並且包含作 為底物的下式FI的化合物和任何形成的酶促反應產物。 其中X選自S，並且其中Rl是選自H和甲基的殘基，並且其中R2是選自C1至C10 烷基、C1至C10烷醇、苯基和苄基的殘基。與不含調節劑的陰性對照相比較，樣品由實驗組嗅，以證實調節劑調節例如抑制 惡臭形成。大規模篩選測定法在上文中描述的測定法充分適合於在文庫中篩選調節肽酶活性的試劑。測定法可以設計為通過使測定法步驟自動化並且給測定法提供源自任何方便來 源的化合物來篩選大型化學文庫，其一般並行運行(例如，在機器人測定法中在微量滴定 板上以微量滴定形式)。測定法可以在高流通量篩選方法中運行，其涉及提供包含大量潛在調節劑的組合 化學或肽文庫。此種文庫隨後在上文中描述的一種或多種測定法中篩選，以鑑定顯示在上 文中描述的活性的這些文庫試劑(特別是化學種類或亞類)。因此鑑定的調節劑可以直接 使用，或可以充當引導以通過製備且測試衍生物鑑定其它調節劑。合成化合物文庫從許多公司包括Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex(Princeton, N. J.) > BrandonAssociates(Merrimack, N. H.)禾口 Microsource (NewMilford, Conn.)商購可得。結合測定法對於通過測量離析物和直接或間接產物(例如但不限於，底物/前體I、前體II、 惡臭物)的增加或減少來測量切割/反應速率中的改變的上文所描述的功能方法備選地， 底物結合可以通過測量底物與肽酶的結合的結合測定法進行測定，所述結合測定法是本領 域眾所周知的。調節劑與肽酶多肽的結合可以例如但不限於通過測量光譜學特徵(例如熒 光、吸收或折射指數)中的改變、流體動力學方法(採用例如形狀)、色譜法、測量肽酶多肽 的可溶性性質進行測定。測試試劑文庫組合化學文庫是通過化學合成或生物學合成，通過使許多化學製品「構建塊」例如 試劑相組合產生的不同化合物的集合。例如，線性組合化學文庫例如多肽文庫這樣形成通 過使一組化學構建塊(胺基酸)以每種可能方式相組合給定化合物長度(即，多肽化合物 中的胺基酸數目)。通過化學構建塊的此種組合混合可以合成數百萬種化合物。罕見的化學文庫可從Aldrich (Milwaukee，Wis.)獲得。以細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫是例如從Pan Laboratories (Bothel 1, Wash.)或MycoSearch (NC)商購可得的，或通過本領域眾所周知的方法容易地產生。另外，天然和合成產生的文庫和化合物通過常規化學、物理和生物化學方 法容易地進行修飾。其他文庫包括蛋白質/表達文庫，源自天然來源包括例如生物、植物、動物、細菌 的cDNA文庫，表達一種或多種多肽的隨機或系統突變變體的文庫，在用於表達一種細胞或 組織的mRNA含量的病毒載體中的基因組文庫。在高流通量測定法中，可以在單天中篩選高達數千種不同調節劑或底物。特別地， 微量滴定板的每個孔可以用於運行針對選擇的潛在調節劑/底物的分開測定法，或如果待 觀察濃度或溫育時間效應，每5-10個孔可以測試單一調節劑。因此，單塊標準微量滴定板 可以測試約100種調節劑。如果使用1536孔板，那麼單塊板可以容易地測試約100至約 1500種不同化合物。可以測試數塊不同板/天；測定法篩選高達約6，000-20, 000不同化 合物是可能的。可以在測定方法中就其肽酶調節效應進行測試的測試試劑類型測試試劑可以是任何試劑，包括小化合物、化學聚合物、生物聚合物、肽、蛋白質、 糖、碳水化合物、核酸和脂質。試劑可以是合成化合物、化合物混合物、天然產物或天然樣品 例如植物提取物、培養上清液或組織樣品。個人護理產品鑑定的酶抑制劑/惡臭消除劑可以加入各種產品中，以阻止身體惡臭。例如個人 護理產品包括但不限於，除臭劑、止汗劑、洗劑、乳霜、軟膏、粉劑、潤膚露(body lotion)、 油膏(unguent)、肥皂、洗髮水、精製香精、花露水(eau de Cologne)、淡香水(eau de toilet)。個人護理產品可以是有香味的或可以是無香味的。此種產品通常包含本領域眾 所周知的許多賦形劑。個人護理產品的惡臭消除劑效應可以通過刪去鑑定為肽酶增強劑的 任何成分得到進一步改善。鑑定的調節劑/抑制劑可以加入水溶液、乳液、醇溶液、矽溶液、油或蠟中。核酸和蛋白質序列在上文中描述的構建體和方法中採用的序列可以在下文中列出的序列表中找 到SEQ ID N0 1 源自棒狀桿菌屬物種Ax20的肽酶的核苷酸序列SEQ ID NO 2 源自棒狀桿菌屬物種Ax20的肽酶的胺基酸序列SEQ ID NO 3 源自傑氏棒狀桿菌K411的肽酶的核苷酸序列SEQ ID NO 4 源自傑氏棒狀桿菌K411的肽酶的胺基酸序列SEQ ID N0 :5 源自棒狀桿菌屬物種Ax20的0 -裂合酶的核苷酸序列SEQ ID NO 6 源自棒狀桿菌屬物種Ax20的0 -裂合酶的胺基酸序列現在隨後為用於舉例說明上述主題的一系列實施例。下述實施例僅是舉例說明性 的，並且不應解釋為以任何方式限制本文描述的包括多肽、核酸/核苷酸、表達載體、宿主 細胞、方法、試劑盒和個人護理產品的主題。
實施例所有實施例使用衍生自棒狀桿菌特別是棒狀桿菌屬物種Ax20( 「Ax20」)， DSM 14267 和傑氏棒狀桿菌 K411( 「K411」)(Tauch 等 2005，J Bacteriol. 187(13)
264671-82)的 DNA 序列，所述 DSM 14267 已於 2001 年 4 月 26 日提交給 International DepositoryAuthority DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures, D-38124 Braunschweig (登記號 DSM 14267)。在實施例中，cys-gly-綴合物指下述二肽化合物 在實施例中的CYS-綴合物指下述化合物 實施例中的「3-裂合酶」指在Natsch 等人 2004，Chemistry &Biodiversity, 1, 1058中描述的裂合酶。裂合酶基因(metC基因，1134bp)的完全開放讀碼框可在登 記號 AY646680(gi |51556860 |gb|AY646680. 1 [51556860])下從 Genebank 獲得。它還包括 在序列表中(SEQ ID NO :5，核苷酸序列，和SEQ ID N0:6，蛋白質序列)。「AMRE」或「AMRE酶」是「腋窩惡臭釋放酶」的縮寫，並且指定由Natsch在EP1258531 中描述的惡臭的酸釋放酶Na-醯基-穀氨醯胺-氨基醯化酶。AMRE胺基酸序列是EP 1258531中的SEQ ID NO :1，AMRE基因的開放讀碼框是EP1258531中的SEQ ID NO :5。它 的異源表達在EP1258531的實施例6中描述。實施例1肽酶(SEQID NO 2)的分離細胞提取物如下形成通過離心收穫Ax20的過夜培養物，並且重懸浮於小體積的 緩衝液A(50mM NaCl ；50mM NaH2P04/K2HP04 ；pH 7)中，用 10倍體積的玻璃珠(425-600 u m, Sigma, St-Louis, USA)修正，並且通過使它們以最大速度渦旋30分鐘進行機械破碎。使 裂解物離心，並且保存上清液。所得到的棒狀桿菌屬物種Ax20細胞提取物隨後經過下 述柱進行順次分級1.苯基-瓊脂糖(疏水作用色譜法)，2.Mono-Q(強陰離子交換)， 3. Mono-P (弱陰離子交換)和4. Superdex200 (凝膠過濾)。使每個級份的樣品與0 -裂合酶和與cys-gly-綴合物同時進行溫育，並且通過對 於游離SH基團特異的螢光測試來測定3-硫烷基-3-甲基-己醇的釋放為此通過加入0. 5 體積包含0. 5mM單溴二胺(monobromobimane)的NaC03緩衝液(0. lM，pH8. 8)終止酶反應， 從而使游離巰基衍生。隨後在 Flex-station (Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)上 測量螢光，用385nm的激發波長和480nm的發射波長。在每個純化步驟中發現單重峰活性(3-硫烷基-3-甲基-己醇釋放的)，指明僅一 種酶涉及釋放反應。在這4個純化步驟後，在SDS-Page-凝膠上分離該製劑。切割對於活性級份獨特 的凝膠條帶並且從而獲得所述肽酶。實施例2
某因(SEQ ID NO 1)的克降和編碼核酸序歹丨I (SEQ ID NO 2)的分離對實施例1中獲得的肽酶實施胰蛋白酶消化和肽序列分析。基於這些分離的肽序 列，設計引物以通過聚合酶鏈反應擴增基因的部分序列，使用棒狀桿菌屬物種Ax20的基因 組DNA作為模板。隨後用棒狀桿菌屬物種Ax20的染色體文庫通過染色體步移分離完整基因序列。從而，獲得如SEQ ID NO 1中所示的肽酶序列的完整開放讀碼框。實施例3Ax20肽酶的異源表汰、產牛和純化通過PCR使用特異性引物從棒狀桿菌屬物種Ax 20的染色體DNA擴增肽酶(SEQ ID N0:1)的開放讀碼框(0RF)。使0RF連接成編碼6x組氨酸-標記的序列，並且克隆到表 達載體(pET-3a，Studier和Moffatt，1986)內。隨後將所得到的質粒轉化到大腸桿菌菌株 (BL21(DE3))內。備選地，將不含6x組氨酸-標記的0RF克隆到相同載體內。含或不含6x組氨酸-標記的重組大腸桿菌菌株在NZCYM培養基(酪蛋白水解物 10. 0g ；NaCl 5.0g;酪蛋白胺基酸(DifCO)1.0g;酵母提取物 5.0g;MgS04x7 H20 2. 0g ；麥 芽糖2. 0g ；蒸餾水1000. 0ml)中生長，用IPTG (異丙基-3 -D-硫代半乳糖吡喃糖苷)誘導， 並且在4小時後，通過在磷酸鹽緩衝液(lOOmM，pH7)中3次經過弗氏壓碎器裂解細胞。通 過在10' 000g下離心15分鐘使細胞裂解物澄清。為了純化酶，將澄清的細胞裂解物加載到Ni-NTA親和柱(Qiagen，Hilden， Germany)上。該柱用包含20mM咪唑的緩衝液進行洗滌，並且最後用具有漸增濃度的 100-250mM咪唑的緩衝液洗脫。所得到的洗脫物包含如通過SDS page顯示的> 95%純度 的重組酶。實施例4K411肽酶(SEQ ID NO 4)的異源表達和產生如對於SEQ ID NO :2所描述地表達、產生且純化源自棒狀桿菌K411的SEQ ID NO:
4肽酶。實施例5Ax20和K411肽酶的活性收穫如實施例3和4中所述形成的50ml重組大腸桿菌培養物，重懸浮於終體積 3ml的磷酸鹽緩衝液中，並且隨後用超聲處理破裂。通過離心使可溶性提取物澄清。使所得 到的提取物的不同稀釋物與cys-gly-綴合物(ImM)以及在過量裂合酶的存在以及不 存在下進行溫育。作為陰性對照，使用源自用空載體轉化的大腸桿菌的澄清細胞裂解物，和 具有cys-gly-綴合物但不含0 -裂合酶的細胞裂解物。該表顯示了如用實施例1中描述的螢光測試測定的以mM表示的惡臭物(3_硫烷 基-3-甲基-己醇)的釋放。如下表中所示，參見第2至4列，惡臭物(3-硫烷基-3-甲基-己醇)僅通過用包 含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的質粒轉化的重組大腸桿菌菌株(表達SEQ ID NO :2/Ax20 或SEQ ID N0:4/K411肽酶)並且僅在0 _裂合酶的存在下從cys-gly-綴合物中釋放。K411肽酶以比Ax20肽酶更低的效率切割cys-gly-綴合物(參見第5列)。
這顯示SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :3的分離的核苷酸序列編碼具有相關酶促活性 的肽酶。如顯示的，組氨酸標記對肽酶活性不具有任何顯著作用。實施例6Ax20肽酶的底物特異性使如實施例3中所述形成的重組Ax20肽酶(親和柱純化的經標記的酶)與不同 化合物特別是潛在候選的二肽底物一起溫育，以表徵底物特異性且鑑定用於篩選測定法的 底物(例如，以篩選調節劑包括抑制劑)。下表列出了測試化合物(大多數二肽由其縮寫名稱指示，例如ala-gly用於丙氨 酸-甘氨酸二肽)並且指出它們是否由肽酶切割。Z指示在肽的N末端處的苄氧-羰基保 護基團。切割通過薄層色譜法進行測定。量是定性的，其中(+++)指示在1小時的溫育過程中ImM溶液通過0. 1 u g/ml肽酶 > 80%的切割；(++)指示在1小時的溫育過程中ImM溶液通過1 y g/ml肽酶的完全切割， 和(+)指示在1小時的溫育過程中ImM溶液通過1 P g/ml肽酶的部分切割(20-80% )，和 (「)指示不存在任何切割。
實施例7鑑定肽酶調節劑/抑制劑的方法通過添加重組Ax20肽酶(SEQ ID NO 2)切割肽底物Pro_Gly釋放獨特的游離NH2 基團，所述游離NH2基團可以通過螢光胺(FluramTM，Fluka，BuChS，Switzerland)進行衍生。使測試化合物(例如，潛在的酶抑制劑)溶解於二甲基亞碸(DMS0)中，例如在微 量滴定板的個別孔中。將溶解於磷酸鹽緩衝液中的Ax20肽酶加入微量滴定板的個別孔(1 U g/ml肽酶) 中，並且溫育5分鐘以允許可能存在的抑制劑的平衡和與肽酶結合。將溶解於磷酸鹽緩衝液中的底物Pro-Gly加入每個孔中的測試化合物/肽酶混合 物中，以給出ImM的終濃度。備選地，可以使用另一種底物化合物。有用的底物包括Ala-Ala、Ala-Gly、 Cys-gly-綴合物和S-苄基-Cys-Gly。如果使用這些化合物，那麼代替通過螢光測定法，通 過測定所形成的游離甘氨酸(通過薄層色譜法(TLC)或通過高效液相色譜法(HPLC))來執 行切割的檢測。在37 °C下60分鐘的溫育時間後，通過加入溶解於乙腈中的Fluram至ImM的 Fluram終濃度和25% v/v的乙腈終濃度使從Pro_Gly中釋放的甘氨酸的游離NH2基團衍 生，並且在 5 分鐘溫育後，在 Flex-station (Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)上測 定螢光，用381nm的激發波長和470nm的發射波長。對照並行運行，並且實施相同操作。陽 性對照包含無抑制劑的DMS0，陰性對照不包含底物。抑制％基於與陽性對照(0%抑制/100%活性)的比較進行計算。因此鑑定的活
性抑制劑的實例顯示於下表中。
該表中的結果顯示化合物Pro-Gly是用於高流通量篩選的有用底物。存在的唯一 NH2基團是通過由肽酶切割釋放的Gly中的，允許極佳的信噪比。抑制劑通常通過至少50 %抑制的抑制進行鑑定，例如在ImM、lOOmicroM、 lOmicroMUmicroM或更低的濃度下。實施例7b#用各種鑑定周節齊II /抑泡丨齊I丨的方法實施例7可以如所述的執行，除替換肽酶且使用SEQ ID N0 4 (K411肽酶)或SEQ ID NO :4或SEQ ID N0:2(Ax20肽酶)的同系物中的一種或多種外。實施例7c鑑定H有廣泛抑泡li普^Iflttti周節布丨/ ^ffell^lfi^Tffe實施例7可以如所述的執行，除順次或並行使用選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 2的同系物中的2種或更多種肽酶外。當並行執行時，酶促 反應可以使用相容緩衝液在相同孔中執行。
這具有鑑定作用於肽酶的化合物且鑑定具有針對各種細菌菌株的廣泛抑制活性 的抑制化合物的優點。實施例8鑑定針對肽酶和/或P _裂合酶有活件的肽酶調節劑/抑制劑的方法該實施例作為如實施例7中描述的篩選測定法的備選方法執行，伴隨下述修飾。作為底物，使用cys-gly-綴合物或如具有在上文中所述的底物結構的化合物。這些包括(S-苄基)-cys-gly、(S-苄基)-cyS-ala、或任何S-取代的cys-gly或 cys-Ala綴合物，例如，S_乙基-、S_丙基-、S_ 丁基-、S_戊基-、S_己基-、S_苯基-cys-gly
—cys—ala。備選地，使用經取代的ser-ala或ser-gly衍生物，其在絲氨酸的0H基團上取代。 與半胱氨酸一樣在絲氨酸上的相同廣泛多樣的取代基是可能的。對於下文顯示的結果，使用(S-苄基)-cys-gly。以0. 1 ii g/ml濃度的肽酶(SEQ ID NO 2)與以5 y g/ml濃度的3 -裂合酶組合使 用；使2種酶同時溶解於相同磷酸鹽緩衝液中。同時篩選0 -裂合酶和肽酶的抑制劑具有更有效篩選的優點(即同時鑑定肽酶或 3 「裂合酶或兩者的抑制劑)。隨後，進一步分析每個篩選「命中」(惡臭物釋放的調節/抑 制)，以分別測定肽酶活性和/或0-裂合酶活性。代替通過加入Fluram使綴合物的游離NH2基團衍生，通過加入溶解於NaC03緩衝 液(lOOmM，pH 8. 8)的單溴二胺(Fluka，Buchs, Switzerland)以給出 0. 5mM 至 ImM 的終濃 度，使通過這兩種酶的順次作用從綴合物中釋放的游離SH基團衍生。在5至15分鐘溫育 後，在 Flex-station (Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)上測量螢光，用 385nm 的激 發波長和480nm的發射波長。備選地，使用其他巰基衍生劑包括N- (9-吖啶基)馬來醯亞胺和在359/440nm處 的螢光檢測。因此鑑定的活性肽酶抑制劑顯示於下表中。
實施例9鑑定針對一種或多種肽酶(SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 4)和AMRE有活件的 廣譜調節劑/抑制劑的方法在實施例7或8的另外步驟中，鑑定的肽酶抑制劑就其針對AMRE酶(Natsch在 EP1258531中描述的Na-醯基-穀氨醯胺-氨基醯化酶)的調節效應進行測試，從而鑑定涉 及惡臭釋放的這兩種金屬肽酶的雙重抑制劑。備選地，步驟可以在酶的存在下同時並行執行。如EP1258531的實施例6中所述形成AMRE。結果在下表中列出。
因此，結果證實可以用如所述的測定法組合鑑定針對超過一種惡臭形成酶活性的 活性抑制劑，在這種情況下金屬螯合劑，從而允許鑑定廣譜調節劑/抑制劑的有效測定法。實施例10當用Ax20細朐,裂合_或P -裂合_切害I丨時，cys-Rly-綴合物切害I丨中的差異使測試化合物(Cys-綴合物(ImM)或Cys-Gly-綴合物(ImM))與0 -裂合酶一起
溫育o還使測試化合物(cys-綴合物(ImM)或cys-gly-綴合物(ImM))與天然包含SEQ ID NO 2肽酶的野生型菌株棒狀桿菌屬物種Ax20提取物一起溫育。如實施例1中所述制 備野生型菌株棒狀桿菌屬物種Ax20細胞提取物。當調整至0D 4的光密度時，使所得到的 提取物稀釋至與原始培養物具有的相同體積。使底物與提取物一起溫育24小時。
通過氣相色譜法測量切割，以測定以mM表示的3_硫烷基_3_甲基-己醇的釋放。
結果顯示於下表中。 結果顯示僅cys綴合物而不是cys-gly-綴合物由重組裂合酶切割，指出 3-裂合酶無法切割腋窩分泌中的主要底物(參見上表的第2行)。然而，從人測試受試者的腋窩中分離的源自棒狀桿菌屬物種Ax 20的提取物的確 從這兩種綴合物中釋放3-硫烷基-3-甲基-己醇(參見上表的第3行)。實施例11分離的棒狀桿菌屬物種Ax20提取物級份無法釋放惡阜物使用Mono-Q陰離子交換柱使如實施例1中所述得自棒狀桿菌屬物種Ax20的細胞 提取物分級。所得到的級份與cys-gly-綴合物分開溫育，並且如實施例1中所述測量3-硫 烷基-3-甲基-己醇(惡臭物)的釋放。結果顯示不存在能夠從cys-gly-綴合物中釋放3-硫烷基-3-甲基-己醇的棒 狀桿菌屬物種Ax20提取物的單一級份。這證實在棒狀桿菌屬物種提取物中不存在可以從 cys-gly-綴合物中釋放惡臭物的單一酶。實施例12當與13 -裂合酶相組合時，棒狀桿菌屬物種提取物級份釋放惡臭物如實施例11中所述形成棒狀桿菌屬物種Ax20細胞提取物的級份。使每個級份與0 -裂合酶和與cys-gly-綴合物一起溫育。如上文在實施例1中 所述測量3-硫烷基-3-甲基-己醇(惡臭物)的釋放。結果顯示單一級份在0 -裂合酶的存在下從cys-gly-綴合物中釋放3-硫烷 基-3-甲基-己醇。其他級份或裂合酶其自身不能釋放惡臭物。連同實施例11的結果，這證實2種酶介導cys-gly-綴合物的切割首先肽酶切割 在gly和cys殘基之間的二肽，並且隨後0 -裂合酶順次從由肽酶形成的cys-綴合物中釋 放惡臭物。實施例3由棒狀桿菌提取物的惡臭釋放受肽酶抑制劑抑制如實施例1中所述形成源自棒狀桿菌屬物種Ax20和傑氏棒狀桿菌K411的提取 物。向提取物批次中加入鄰二氮雜菲(0. 5mM)——金屬肽酶抑制劑或Complete (無 EDTA)——蛋白酶抑制劑混合物(Rochebiochemicals，Switzerland ；使用如由製造商指示 的濃度)，其包含廣泛特異性絲氨酸和天冬氨酸_肽酶抑制劑但不含金屬肽酶抑制劑，並且溫育10分鐘。隨後將cys-綴合物或cys-gly-綴合物(ImM)——惡臭物3_硫烷基_3_甲基-己 醇的所述兩種前體，加入包含不同抑制劑的棒狀桿菌屬物種Ax20或傑氏棒狀桿菌K411提 取物中。如實施例12和13中所述測量惡臭物3-硫烷基-3-甲基-己醇的釋放，這指示棒 狀桿菌細菌裂解物中的酶活性。結果(與不加入抑制劑的反應相比較，3-硫烷基-3-甲基_己醇釋放的抑制％ )
在下表中指出。 如實施例10中所示，用棒狀桿菌屬物種Ax20提取物溫育從這兩種綴合物誘導顯 著惡臭物釋放，並且傑氏棒狀桿菌K411提取物也切割這兩種底物，儘管以較低速率。當使用源自棒狀桿菌屬物種的提取物時，金屬肽酶抑制劑鄰二氮雜菲的添加不抑 制Cys-綴合物切割(0%抑制)，但抑制cys-gly-綴合物切割(100%抑制)。類似地，對於 傑氏棒狀桿菌提取物，對於cys-綴合物不存在顯著抑制，但存在cys-gly-綴合物的高抑制 (93% )。這顯示cys-gly-綴合物(而不是cys-綴合物)的切割由對通過金屬肽酶抑制劑 鄰二氮雜菲的抑制敏感的酶介導。這還指示裂合酶反應(Cys-綴合物的切割)不受鄰二氮雜菲阻斷，而僅 cys-gly鍵的切割得到抑制，並且顯示在源自棒狀桿菌的提取物中的金屬肽酶專一地催化 這種反應。對不同絲氨酸和天冬氨酸-肽酶具有廣泛特異性的蛋白酶抑制劑的混合物 (Complete )不顯著阻斷任一綴合物的切割，顯示絲氨酸/天冬氨酸_肽酶不涉及惡臭物 的釋放。儘管肽酶、核苷酸、表達載體、宿主細胞、方法和試劑盒已在上文結合特定舉例說 明性實施方案進行描述，但應當理解可以使用其他相似實施方案，或可以對所述實施方案 進行修飾和添加用於執行一種或多種相同功能。此外，公開的所有實施方案不一定在備選 方案中，因為各種實施方案可以相組合以提供所需特徵。可以由本領域普通技術人員進行 變化，而不背離公開內容的精神和範圍。因此，核苷酸、多肽/肽酶、表達載體、宿主細胞、方 法和試劑盒不應限制於任何單個實施方案，而是以依照附加權利要求所述的寬度和範圍解 釋。
權利要求
鑑定身體惡臭形成的調節劑的方法，所述方法包括步驟(i)使肽酶與肽酶底物和至少一種測試試劑接觸；和(ii)測定所述至少一種測試試劑對所述肽酶介導的反應速率的影響，其中所述肽酶具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性其中所述肽酶與選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的多肽序列同源，具有至少40％的序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列胺基酸105和150之間的ERDGRWYGRGXADCKG，胺基酸150和180之間的EGSEEXG，胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA，胺基酸385和425之間的GGSIPL；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。FPA00001091833300011.tif
2.權利要求1的方法，其中步驟⑴中的所述肽酶底物是式FI的化合物 其中X選自S和0，並且其中Rl是選自H和甲基的殘基，並且其中R2是選自直鏈或分 支Cl至ClO烷基、直鏈或分支Cl至ClO烷醇、苯基和苄基的殘基。
3.權利要求1的方法，其中所述底物是選自S-苄基-Cys-Gly、0-苄基-Ser-Gly、 (l-(2-羥乙基)-l-甲基丁基)-L-半胱氨醯基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、0-苄 基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala 和 Pro-Ala 的化合物。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中使另外的酶胱硫醚-β-裂合酶與所述底物 和測試試劑並行或順次溫育，並且其中在步驟(ii)中，所述測試試劑對通過所述肽酶和 β-裂合酶的切割的影響通過在其反應產物的至少一種的形成中的改變進行測定，所述反 應產物的至少一種任選地選自硫醇反應產物和羥基反應產物。
5.試劑盒包括 ⑴肽酶，和(ii)由所述肽酶切割的底物化合物，用於組合使用以鑑定作為所述肽酶和惡臭形成的調節劑的測試試劑，其中所述底物化合物任選是式FI的化合物 其中X選自S和0，並且其中Rl是選自H和甲基的殘基，並且其中R2是選自直鏈或分 支Cl至ClO烷基、直鏈或分支Cl至ClO烷醇、苯基和苄基的殘基，並且其中任選地式FI的所述底物化合物選自S-苄基-Cys-Gly、O-苄基-Ser-Gly、 (l-(2-羥乙基)-l-甲基丁基)-L-半胱氨醯基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄 基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala 禾口 Pro-Ala，其中所述肽酶具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性。其中所述肽酶包含下述保守的部分序列 胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
6.在其切割其底物的能力方面抑制肽酶的方法，其中使所述肽酶與肽酶抑制劑接觸， 並且其中所述肽酶具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列 胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
7.根據權利要求6用於阻止或減少身體惡臭形成的方法，其中將肽酶抑制劑應用於身 體表面，其中所述肽酶具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列 胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
8.根據權利要求7的方法，其中所述化合物以包含至少一種賦形劑的皮膚病學可接受 的組合物形式應用。
9.用於製備具有針對身體惡臭形成的效應的個人護理產品的方法，其中將肽酶抑制劑 加入個人護理產品製劑中；其中所述肽酶具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列 胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
10.包含肽酶底物和分離的肽酶的組合物， 其中所述肽酶底物是式FI的化合物 其中X選自S和0，並且其中Rl是選自H和甲基的殘基，並且其中R2是選自直鏈或分 支Cl至ClO烷基、直鏈或分支Cl至ClO烷醇、苯基和苄基的殘基；其中任選地式FI的所述底物化合物選自S-苄基-Cys-Gly、0_苄基-Ser-Gly、 (1-(2_羥乙基)-1_甲基丁基)-L-半胱氨醯基-甘氨酸、S-苄基-Cys-Ala、O-苄 基-Ser-Ala、Pro-Gly、Ala-Gly、Ala-Ala 禾口 Pro-Ala ；其中所述肽酶是具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性的肽酶 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列 胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
11.權利要求10的組合物，其中所述肽酶是選自分離形式、包含功能肽酶的製劑 形式、在合適宿主細胞中的異源表達形式、表達肽酶的傑氏棒狀桿菌(Corynebacterium jeikeium)形式、和表達肽酶的傑氏棒狀桿菌K411形式的形式。
12.分離的肽酶，其中所述肽酶與選自SEQID NO :2和SEQ ID NO :4的序列同源，具有 至少40%的序列同一性；其中所述肽酶具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
13.權利要求12的分離的肽酶，其中所述肽酶與選自SEQID NO 2和SEQ ID NO 4的 序列同源，具有至少80%的序列同一性。
14.編碼肽酶的核苷酸，其選自通過序列同一性測定的與SEQ ID NO 1的核苷酸序列實質性同源的核苷酸； 當翻譯成相對應蛋白質時，不引起胺基酸改變的SEQ ID NO :1的保守修飾變體的核苷酸；通過雜交測定的與SEQ ID NO 1實質性同源的核苷酸； 其中通過序列同一性測定的實質性同源的核苷酸具有至少80%的序列同一性； 其中所述肽酶具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列 胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
15.權利要求14的分離的核苷酸，其中所述分離的核苷酸構成表達載體的部分。
16.權利要求15的分離的核苷酸，其中所述表達載體構成用所述表達載體轉染的宿主 細胞的部分。
17.形成肽酶的方法，其包括下述步驟在足以表達的條件下培養包含編碼所述肽酶 的表達載體的宿主細胞，從而形成所述肽酶，並且任選地從細胞中將其回收，其中所述肽酶 具有從式FIII的底物化合物中釋放甘氨酸的催化活性 其中所述肽酶與選自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的多肽序列同源，具有至少40%的 序列同一性；其中所述肽酶包含下述保守的部分序列 胺基酸 105 和 150 之間的 ERDGRWYGRGXADCKG， 胺基酸150和180之間的EGSEEXG， 胺基酸205和255之間的HSGXXGGXAPDA， 胺基酸385和425之間的GGSIPL ；並且其中所述胺基酸從以其天然存在 形式的實質性同源的肽酶的N末端開始編號，並 且字母指單字符胺基酸編碼，並且X是20種普通胺基酸中的任何一種。
全文摘要
提供的是採用肽酶鑑定身體惡臭形成的調節劑且特別是抑制劑的方法、肽酶和相對應核苷酸序列、表達載體、轉染宿主細胞、形成肽酶的方法和阻止身體惡臭的方法。
文檔編號C12N9/52GK101855361SQ200880111031
公開日2010年10月6日 申請日期2008年10月8日 優先權日2007年10月10日
發明者A·內切, R·艾姆特 申請人:奇華頓股份有限公司