用於產生具有增加的角質層水透過性的植物的分離多肽以及編碼該多肽的多核苷酸的製作方法

2023-09-17 18:32:55

專利名稱：：用於產生具有增加的角質層水透過性的植物的分離多肽以及編碼該多肽的多核苷酸的製作方法用於產生具有增加的角質層水透過性的植物的分離多肽發明領域和背景本發明涉及多核苷酸和多肽，所述多肽用於增加表達其的植物的角質層水透過性。更具體地說，本發明涉及遺傳修飾的植物，其能夠產生脫水果實，例如番茄。高等植物的氣生部分被角質層的連續胞外層覆蓋。角質層是一種聚合物基質，主要由角質單體(主要是短鏈羥化脂肪酸)和各種量的角質層蠟質(溶劑可溶的脂質)組成。不同植物物種和植物器官間的角質和蠟質組分的量和成分都極為不同(Holloway,1982)。儘管已廣泛研究了植物角質層的組成和結構以及其生物合成的生物和遺傳調節(Kolattukudy,1980;Kooraneef等，1989;Blee和Schuber,1993;Arts等，1996;Negruk等，1996;Millar等，1997;Todd等，1999;Yaphremov等，1999;Flebig等，2000;Pruitt等，2000;Wellesen等，2001;Hooker等，2002;Chen等，2003;Kuns和Samuels,2003;Kurata等，2003;Aharoni等，2OO4;Schnurr等，2004;),但控制角質層分化和/或功能的機制仍有待表徵。番茄果實角質層是具有4-10厚度的薄層，有兩種特有的結構特性(Wilson和Sterling,19%)。首先，角質沉積物以層狀結構排列一各層與表皮細胞平行地聚集。番茄果實角質層的第二種特性在於其不含任何氣孔、孔或通道。因此，番茄皮的水透過性很低，完全成熟的番茄果實保持其含水量。許多沒有氣孔(無氣孔)的其它角質層的水透過性和穿過其的水運輸機制已成為眾多研究的主題(Sch6nherr,1976a;Sch。nherr和Schmidt,1979;Riederer和Schreiber，2001)。顯然，角質和蠟質組分這二者對抵抗器官失水具有集成作用。在某些情況下，角質層厚度與穿過角質膜的水擴散成反比(Lownds等，1993)。但是，在影響植物水透過性方面角質層蠟質組分常常佔主導地位。例如，通過有機溶劑去除番茄果實角質層中角質層之上的蠟質層將其水透過性增加了300-500倍，以快速的植物脫水為證(Sch6nherr，1976b)。角質層蠟質在番茄果實中起蒸騰屏障作用的另一個證據是最近報導的編碼酶超長鏈脂肪酸(VLFA)(3-酮脂醯-CoA合酶的基因(丄eCER6,Vogg等，2004)。該基因在果實角質層蠟質主要成分VLFA的合成中起重要作用。該基因中功能突變的缺失導致葉和果實蠟質中鏈長超過C鄧的正-烷烴和醛的減少。具有丄eC五i6突變的番茄果實的特徵在於水透過性增加4倍。影響番茄果實角質層水透過性的另一個因素是在角質層表面上存在裂化現象。果實裂化已得到了更多的研究關注(Comer等，1969;Voisey等,1970;peet,1992;peet和willits,1995)。番茄果實受到3種主要類型的裂化作用^:襲i)同心裂縫(粗裂)；ii)徑向裂縫(開裂)；和iii)角質層裂縫(褐斑)(Bakker,1988)。前兩類裂縫深，延伸的裂隙穿過果實果皮，除了失水外，還可令病原體進入和果實腐敗。與徑向或同心裂縫不同，角質層裂縫是角質層的表面^:裂隙，一般只限於角質層，不穿透入果皮細胞。導致番茄果實裂化的原因和環境大部分不清楚，可能與角質層厚度(Emmons和Scott,1998)、下面表皮細胞的形狀(Conter等，1969;Emmons和Scott，1998)、果實形狀(Considine和Brown,1981)、果實大小(Koske等，1980;Emmons和Scott,1997)、果實周圍的相對溼度(Young,1947;Tukey,1959)、肥葉修剪(Ehret等，1993)以及表皮的抗張強度和延展性(Bakker,1988)有關。番茄果實中出現裂縫還具有顯著的遺傳成分，主要由野生種番茄(Z^co;era/co")在基因轉移時顯現。Fulton等(2000)描述了一種性狀"表皮網紋，，CEr),並使用高代回交QTL分析策略(採用野生型小花番茄(丄.；wv(/7orwm))報告了4個影響其的QTL。在源自普通番痴(丄.e"w/e"&w)和其它野生種如多毛番茶(厶/2/mm&w)(WO0U3708)和潘那利番茄(L.peMe服)(Monforte等，2001)雜交的番茄果實中也已報告了角質層裂縫。由於沿著裂隙出現纖維質化表層(Monforte等，2001)而產生的果實角質層中的裂縫，特別是以表皮網紋為證的目視可見的大裂縫，一般被看作是無益現象，原因是降低果實價值的美感損害(Tukey,1959)以及果實含水量的損失。但是，脫水但完整並仍連接在藤上的果實的經濟潛力高。脫水番茄產品構成了番茄產業的一個重要部分。番茄糊(tomatopaste)、蕃茄醬(ketch叩)和其它加工番茄產品的生產依賴於需要能量的脫水步驟。另外，以乾燥工藝製備"曬乾的"番茄果實，所述乾燥工藝由在太陽下或在烘箱中脫水已切開的番茄果實組成。曬乾和烘箱乾燥都可導致食物品質損失。例如，番茄在人類膳食中的其中一種主要營養成分抗壞血酸的水平在曬乾和烘箱乾燥作用下都顯著下降(Ojimelukwe,1994)。而且，在乾燥工藝前必須將番茄果實切成兩半使得不能生產完整的幹番茄果實。本發明的發明人先前已描述了使用經典遺傳育種技術獲得的、具有降低的水含量的脫水番茄(WO01/13708)。要認識到的是，經典遺傳育種技術限於種內或同一屬的密切相關種之間的基因轉移。另外，經典育種的特徵在於相對大的基因滲入，其包含與目標基因緊密連鎖的其它不需要基因。Eshed和Zamir(1985)先前已描迷了基因滲入的栽培番茄植物，其具有可能與不需要的性狀相關的遺傳背景(基因滲入系IL4-4，即產生於由端粒標記TG464延伸至著絲粒標記CT50的基因滲入；約20cM)。同樣，Monforte等(2001)已描述了來源於多毛番茄(丄./n'^Wwm)的具有相似遺傳背景的番茄植物[次近基因滲入系TA1468、TA1469、TA1476,其覆蓋並包括TG464至CT173(約10cM)],其表現出眾多作用，包括不需要的作用。因此，獲得具有增加的角質層水透過性、避免以上限制的遺傳修飾植物存在廣泛認可的需求，應當是高度有利的。發明概述按照本發明的一個方面，提供一種包含編碼多肽的核酸序列的分離多核苷酸，所述多肽具有的M酸序列與SEQIDNO:22至少88%同源，所述多肽能夠增加表達其的植物的角質層水透過性。按照下文描述的本發明優選實施方案的其它特徵，所述核酸序列如SEQIDNO:21或23所述。按照所述優選實施方案的再其它特徵，所述胺基酸序列如SEQIDNO:22所述。按照本發明的另一方面，核酸構建物包含所述分離的多核苷酸。按照所述優選實施方案的再其它特徵，所述核酸構建物還包含有效連接至所述核酸序列的啟動子。按照本發明的另一方面，宿主細胞包含所述核酸構建物。按照本發明的另一方面，遺傳修飾的植物含所述分離的多核香酸。按照本發明的另一方面，寡核苷酸能夠與所述分離的多核苷酸特異性雜交。按照本發明的另一方面，提供一種分離的多肽，其包含的胺基酸序列與SEQIDNO:22至少88%同源，所述多肽能夠增加表達其的植物的角質層水透過性。按照本發明的再另一方面，提供能夠特異性識別所述多肽的抗體。按照本發明的再另一方面，提供一種栽培的番茄植物，其具有的基因組包含來源於野生番茄(Ayco/em'co"罕p.)的基因滲入，所述基因滲入包含番茄(Z^co/erazco"^p.)染色體4的一部分，小於由端粒標記TG464延伸至著絲粒標記CT173的染色體片斷，所述基因滲入能夠增加栽培番茄植物的角質層水透過性。按照本發明的再另一方面，提供一種生產作物的脫水果實的方法，該方法包括遺傳修飾植物，以表達具有與SEQIDNO:22至少30%同源的胺基酸序列的多肽，所述多肽能夠增加表達其的植物的角質層水透過性。按照所述優選實施方案的再其它特徵，所述方法還包括使果實在植物上脫水；收集脫水果實。按照所述優選實施方案的再其它特徵，所述方法還包括在果實脫水前由作物上取下果實；隨後令果實脫水。按照本發明的另一方面，提供一種遺傳修飾的種子，其包含的分離的多核苷酸含有編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有的胺基酸序列與SEQIDNO:22至少30%同源，所述多肽能夠增加表達其的植物的角質層水透過性。按照本發明的再另一方面，提供一種遺傳修飾的果實，其包含的分離的多核苷酸含有編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有的胺基酸序列與SEQIDNO:22至少30%同源，所迷多肽能夠增加表達其的植物的角質層水透過性。按照所述優選實施方案的再其它特徵，所述核酸序列如SEQIDNO:21、23、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56所述。按照所述優選實施方案的再其它特徵，所述胺基酸序列如SEQIDNO:22、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57所述。按照本發明的再另一方面，提供一種遺傳修飾的植物，其表達的多肽具有與SEQIDNO:22至少30%同源的胺基酸序列，所迷多肽能夠增加植物的角質層水透過性。本發明通過提供能夠增加表達其的植物的角質層水透過性的多核苷酸和多肽，並通過提供用於生產脫水果實的遺傳修飾植物，成功地解決了目前已知形態的缺點。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有和本發明所屬領域一般技術人員的通常理解相同的含義。儘管可使用與本文所述類似或等同的方法和材料實施或檢驗本發明，但下文描述了合適的方法和材料。在有牴觸的情況下，以包含定義的專利說明書為準。另外，所述材料、方法和實施例僅為闡述性的，沒有限制意圖。附圖簡述僅通過示例的方式，本文參考附圖描述本發明。現在具體地討論附圖，要強調指出的是，顯示的詳解僅作為實例，並僅用於本發明優選實施方案的說明性論述目的，提出這些詳解是為了提供一般認為對本發明的原則和概念方面最有用的和最容易理解的描述。就此而言，未嘗試更詳細地表明超過基本理解本發明所需的本發明結構性細節，描述連帶附圖使本領域技術人員更清楚如何具體地實施本發明的幾種形式。在附圖中圖la-b圖示了2148群(圖la)和2149群(圖lb)中cwp(PUT)基因型對脫水率的作用。在2148群中，脫水性狀表現為完全顯性性狀，而在2149中，其表現為部分顯性的性狀。果實在紅熟時採摘，並令其在室溫脫水，以約每日一次的間隔稱重。數據表示為Log。/。重量。上標HH、HE和EE表示分離植林的基因型。圖2a-c顯示了C基因的精細圖語。圖2a-TG464分子標記的CAPS標記分析。基因組DNA由20抹根據脫水率分離的F2個體提取。使用適合於表現出兩個親本物種間多態性的TG464標記的引物進行PCR分析。PCR產物用歷"f7內切核酸酶限制性位點酶切割，並在2%瓊脂糖凝膠上電泳。+或-信號指示存在或沒有孩t裂隙和脫7J^狀況。E-普通番痴(Le腳/ewf皿)，H-多毛番痴(L./n'纖f匿)，M-Wm/ZWZEa^/X標記(Fermentas目錄號SM0191)。圖2b-C附染色體區的遺傳連鎖圖(以cM表示)，相對於著絲點位置定向。標示了潘那利番茄(L;e"e服)基因滲入系IL4.3和IL4.4(Eshed和Zamir,1995)。陰影條代表在該分析中用作脫水供體親本的近等基因系中的多毛番茄(丄./n'm^wm.)節段。圖2c-Op基因側翼染色體節段的放大。圖3a-b表示C屍基因的物理定位。圖3a-在CT61和TG464CAPS標記之間建橋的遺傳有序的連續BAC，以及根據測序BAC末端的多態性的重組體表型分析和重組體特徵。每個重組體基因型都由分為陰影(多毛番茄(L/2!'m^ww)基因型)和空(普通番茄(L.e"w/ew&w)基因型)節段的條代表。圖3b-BAC37B8中3個交換事件的放大。3個交換事件是圖3a中列出的前3個重組體。圖4圖示了來自多毛番茄(丄./n'MwfMm)的15kb基因滲入，其包含Cwp基因。使用NCBI程序TBLAST分析序列的同源可讀框。鑑別出3個同源序列，各個可讀框的方向由箭頭指示。圖5a-b圖示了發育中的番茄子房和小果中PUT(圖5a)和DBP(圖5b)基因的表達分析。如在方法章節中的描述使用在線定量PCR檢測提取的cDNA的表達，表示為相對於各個樣品中肌動蛋白基因的表達。0v,子房；開花後5-15天；IG，生綠期，MG，熟綠期；'B,花端著色期。陰影條是Cwp皿基因型，實心條是CwpEE基因型。圖6圖示了番茄基因型15天小果中PUT基因的表達分析。HH，CwpHH基因型；HE,雜合Cwp亞基因型；EE,CwpEE基因型。3種基因型選自分離型雜合群。IL4.4代表潘那利番茄(丄.pewe服)基因滲入系IL4.4(Eshed和Zamir,1985),其包含PUT的潘那利番茄(丄.pe"e〃z/)同源物。M82是IL4.4的回交普通番茄(丄.^cw/e"fww)親本。圖7a-b顯示了在35S組成型啟動子控制下表達野生番茄種So/a加w/wrZrac/2a"&sS.(先前稱為多毛番痴(i^ycopers7.cow/zZrawfwwMill.))的屍LT基因的轉基因番茄植物(T。)。圖7a顯示了雙筒顯孩t瞎、片，列出了野生型MP1番茄系(W.T.)果實以及微裂隙轉基因果實(Mpl-4)的完整表面。圖7b顯示了野生型MP1番茄系(W.T.)和另一個獨立轉基因Tq植物(MPl-l)之間的脫水率對比。果實於熟紅髮育期採摘，置於室溫(15-25。C)。圖片得自實驗開始時(To)和脫水7天後(丁7)圖8a-b顯示了PUT轉基因拷貝數對微裂隙嚴重性(評分在1-5之間，圖8a)和果實失重百分率(在室溫14天後，圖8b)的作用。由兩個獨立的轉基因(T,)分離群(每個群16個個體)收集檢測結果。每張圖顯示了各個拷貝數組個體的平均數(在各個菱形中間的水平線)、95%置信限(菱形上下界線)和分散程度。當一組三角形的底與另一組的三角形底不一致時，組間差異是顯著的。通過JMP程序進行統計。圖9a-b顯示了類似於野生型的無拷貝表達的轉基因番茄個體(X代)和表達兩個拷貝的野生番茄種5b/加ww/w6rac/w"esS.的P6T基因的轉基因番茄個體(T,代)之間的對比。圖9a-掃描電子顯微照片，(2拷貝)的個體微裂隙果實的完整表面。圖9b-無PLT基因拷貝(0拷貝)的個體以及具有兩個拷貝轉基因(2拷貝)的個體之間的脫水率對比。果實於熟紅髮育期採摘，置於室溫(15-25。C)。圖片得自實驗開始時(T。)和脫水7天後(丁7)。圖10a-b是樹狀圖，圖示了CWP1和CWP2的保守性以及單子葉和雙子葉物種的相關序列(SEQIDNO.21、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和56)。這些序列基於與CWP1的序列同源性由ESTTIGR資料庫檢索。上方標示了與CWP1的同源性百分率。圖10a-在胺基酸水平上的保守性。圖10b-在核酸水平上的保守性。圖11顯示了利用EMBL-EBI的ClustalW軟體產生的本發明CWP1家族不同蛋白成員之間的多重比對。優選實施方案的描述本發明為可用於增加植物的角質層水透過性的分離多核香酸和多肽。具體地說，本發明可用於生產脫水果實，例如番茄果實。參閱附圖和所附說明書可更好地理解本發明的原則和實施。在詳細解釋本發明的至少一個實施方案前，要理解本發明的應用不限於以下說明書陳述的或實施例例舉的細節。本發明允許有其它實施方案，或者以各種方式實施或進行。另外，要理解本文使用的措辭和術語用於描述目的，不應被理解為限制作用。能夠天然脫水但仍連接在籐上、不伴隨導致果實腐敗的降解過程的番茄品種的開發對許多果實產業(如番茄產業)是高度有價值的。Schaffer的PCT公開號WO01/13708教導了使用經典遺傳育種技術(WO01/13708)產生角質層水含量降低的脫水番茄。要認識到的是，經典遺傳育種技術限於種內或同一屬的密切相關種之間的基因轉移。另外，經典育種的特徵在於相對大的基因滲入，其包含與目標基因緊密連鎖的其它不需要基因。Eshed和Zamir(1985)先前已描述了基因滲入的栽培番茄植物，其具有可能與不需要的性狀相關的遺傳背景(基因滲入系IL4-4,即產生於由端粒標記TG464延伸至著絲粒標記CT50的基因滲入；約20cM)。同樣，Monforte等(2001)已描述了來源於多毛番茄(丄.的具有相似遺傳背景的番茄植物[次近基因滲入系(NIL)，其覆蓋TG464至CT173(〉10cM)]。在後一研究中，相對大的基因滲入伴隨不需要的園藝性狀，包括白利糖度產量、總產量和果實重量的性狀。在簡化本發明以實施的同時，本發明的發明人揭示了單個基因cwpl(也稱為put,在本文可交互使用)，其能夠增加表達其的植物的角質層水透過性。如下文和以下的實施例章節所闡述的，本發明的發明人鑑別出來源於多毛番茄(丄./^rawfwm)的果實脫水性狀的遺傳模式為單個主要基因。本發明的發明人使用基於圖i普的定位克隆策略，由野生番茄種多毛番茄(丄./2/rawmm)克隆出增加熟紅番茄果實的角質層水透過性(CWP)並導致完整果實脫水的基因。本發明的發明人表明，cwp的野生種等位基因允許該基因在發育中的番茄果實中表達，而標準的栽培普通番茄(Lescw/ewmm)等位基因不表達，可被看作是無效等位基因。他們還表明，在表達水平上存在等位基因劑量作用，雜合HE基因型的特徵在於其表達為具有兩個野生種等位基因的純合基因型的約一半。生物信息學分析表明，cwp7編碼生物功能未知的蛋白。該基因可能有助於新番茄產品以及其它作物的育種程序，因為其通過角質層控制失水量。而且，與該基因相關的微裂隙的結構表型表明了在果實角質層發育中的作用。在栽培番茄中處於35S啟動子控制下的基因表達在膨大果實中誘導形成微裂隙，這支持所提出的該基因在角質層水透過性調節中的作用。DNA印跡分析揭示了另外的番茄同源物cw/2。令人感興趣的是，該同源物作圖至番茄染色體2-l，在番茄染色體2-1中有番茄果實表皮網紋的報告QTL(Frary等，2004)。茄屬栽培胡椒(辣椒(Ca;w7cwwa朋wm))的發育中果實也在其表皮組織中表達與Lecwpl基因高度相似(87%)的cw;同源物，胡椒果實的特徵在於收穫後失水的園藝問題，以及在紅辣椒栽培品種中果實脫水的需要性狀。因此，CWP基因的同源物有可能還有助於角質層修飾和水透過性。這些結果表明，c呷基因的表達產生結構修飾的角質層(差於ff和推測其在果實膨大過程中由於彈性下降而經歷縫裂。但是，此現象僅在具有高度發育的果實角質層的果實中觀察到，例如無氣孔厚皮栽培番茄，在以較薄角質層為其特徵的野生種果實中不明顯。在栽培番茄果實發育過程中角質層組分的沉積在由生綠期向熟綠期的轉變過程中出現突然上升(Baker,1982),這是合理的，因為其與孩麼裂隙表型的觀察結果一致。非囿於理論，考慮到成熟和收穫果實的穩定性，已表明相對不透水的果實角質層的遺傳性狀在栽培番茄的進化和馴化過程中是一種良性發育。脫水性狀的遺傳控制指明了在作物進化和馴化的某些階段對無效CW/7的選擇過程。系統發生分析(圖10a-b)表明，本發明的CWP基因屬於一個較大的基因家族，其可用於控制廣泛作物的角質層水透過性。因此，本發明的一個方面提供一種包含核酸序列的分離的多核苷酸，該核酸序列編碼的多肽具有與SEQIDNO:22至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%,、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%同源的M酸序列，所述多肽能夠增加表達其的植物的角質層7jc透過性。本文使用的表述"角質層水透過性，，指角質層抑制被角質層環繞的植物組織(植物的氣生組織，例如果實)的水分蒸發的能力。要認識到的是，增加的角質層水透過性將導致被角質層環繞的組織由於增強的蒸發而產生脫水。本文使用的表述"增加角質層水透過性，，指與不表達其的相似親本栽培品種或基因型的植物相比，角質層水透過性增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%。測定角質層水透過性的方法在本領域眾所周知，詳盡地描述於以下的實施例章節(例如果實的裂隙嚴重性和失重百分率)。參見以下實施例章節的實施例5。另外，檢測角質層水透過性的方法還包括但不限於檢測穿過分離的果皮的水擴散、檢測極性孔大小和水動力學透過性(Sch6nherr,1976)。這些功能測定連同本文提供的結構性指引一起4吏得可以鑑別本發明的多核苷酸和多肽的功能同源物。同源性(例如同源性百分率)可使用任何同源性比較軟體測定，包括例如美國國家生物技術信息中心(NCBI)的BlastP軟體，例如使用默認參數。同一性(例如同源性百分率)可使用任何同源性比較軟體測定，包括例如美國國家生物技術信息中心(NCBI)的BlastN軟體，例如使用默認參數。本文使用的表迷"分離的多核苦酸"指單鏈或雙鏈核酸序列，其是分離的或以RNA序列、互補多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或複合多核香酸序列(例如以上的組合)的形式提供。本文使用的表述"互補多核苦酸序列"指使用逆轉錄酶或任何其它RNA依賴性DNA聚合酶由信使RNA的逆轉錄產生的序列。這種序列隨後可使用DNA依賴性DNA聚合酶在體內或體外擴增。本文使用的表述"基因組多核苷酸序列"指來源於(分離自)染色體的序列，因此其代表染色體的連續部分。本文使用的表述"複合多核苷酸序列"指至少部分互補並至少部分為基因組的序列。複合多核苷酸序列可包括編碼本發明多肽需要的某些外顯子序列，以及在其間插入的某些內含子序列。內含子序列可為任何來源，包括其它基因的內含子序列，通常包括保守的剪接信號序列。這種內含子序列還可包括順式作用表達調節元件。按照本發明此方面的一個優選實施方案，本發明的上述分離的多核苷酸的核酸序列如SEQIDNO:21、23、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56所述。按照本發明此方面的另一個優選實施方案，本發明的編碼多肽的胺基酸序列如SEQIDNO:22、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57所述。本發明此方面的分離的多核苷酸可使用雜交測定如下檢定在中等至嚴格雜交條件下，在寡核苷酸探針或引物存在時，溫育上述分離的多核苷酸。本文使用的術語"寡核香酸"指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的單鏈或雙鏈寡聚物或多聚物。該術語包括由天然鹼基、糖和共價核苷酸間鍵合(例如骨架)組成的寡核苷酸，以及具有起對應天然部分類似作用的非天然部分的寡核苷酸。按照本發明教導設計的寡核苷酸可按照本領域已知的任何寡核苷酸合成法產生，例如酶合成或固相合成。執行固相合成的設備和試劑可由例如AppliedBiosystems市售。還可使用用於這種合成的任何其它工具；所述寡核苷酸的實際合成完全屬於本領域技術人員的能力範圍，可通過在例如Sambrook，J.和Russell,D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual";Ausubel,R.M.等編l辱，(1994,1989),"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"I-III巻，JohnWiley&Sons,Baltimore,Maryland;Perbal,B.(1988),"APracticalGuidetoMolecularCloning,"JohnWiley&Sons,NewYork;和Gait,M,J.編輯，(1984),"OligonucleotideSynthesis"中詳述的現有方法實現；使用固相化學法例如氰乙基氨基磷酸酯來實現，後接去保護、脫鹽和利用例如自動化三苯甲基保護(trityl-on)法或HPLC純化。本發明的寡核苷酸為至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少22個、至少25個、至少30個或至少40個鹼基，可與本發明的多核苷酸序列特異性雜交。中等至嚴格雜交條件的特徵在於雜交溶液例如含10%硫酸葡聚糖、1MNaCl、1%SDS和5xl06cpm32P標記探針，於65。C進行，最終漂洗溶液為0.2xSSC和0.1。/。SDS,最終漂洗於65。C進行，而中等雜交使用以下條件實現雜交溶液含10。/。硫酸葡聚糖、1MNaCl、1%SDS和5xl06cpm32P標記探針，於65。C進行，最終漂洗溶液為lxSSC和0.1。/。SDS，最終漂洗於50'C進行。使用雜交方法，本發明的發明人能夠分離cwpl的另一個番茄同源物cwp2,其作圖至番茄果實表皮網紋的報告QTL(Frary等，2004),這支持其在角質層水透過性方面的作用。因此，本發明包含上文所述核酸序列、其片段、與其雜交的序列、與其同源的序列、編碼具有不同密碼子選擇的相似多肽的序列、特徵在於突變的改變序列，所述突變例如為一個或多個核香酸的缺失、插入或置換，或者是天然的，或者是人工誘導的，或者是隨機的，或者為把向方式。因為本發明的多核苷酸序列編碼先前未鑑別出的多肽，所以本發明還包括新多肽或其部分，其由上文所迷的分離多核苷酸及其相應的核酸片段編碼。因此，本發明還包括由本發明的多核苷酸序列編碼的多肽。這些新多肽的胺基酸序列如SEQE)NO:22、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57所述。本發明還包括這些多肽的同源物，這種同源物可與SEQEDNO:22至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多(例如100%)同源。本發明還包括上述多肽的片段和具有突變的多肽，所述突變例如為一個或多個胺基酸的缺失、插入或置換，或者是天然的，或者是人工誘導的，或者是隨機的，或者為靶向方式。本發明多肽的胺基酸序列信息可用於產生與本發明多肽特異性結合的抗體。例如，這種抗體可針對SEQIDNO:22的胺基酸序列坐標55-160。序列坐標55-160包括大部分保守序列和多重對比分析的基序(圖11)。由於在該胺基酸序列區域中的高序列同源性，預期這種抗體與本發明的各種多肽(例如SEQIDNO:22、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57)交叉反應。本發明的多核苷酸和多肽序列可用於產生具有增加的角質層水透過性的植物。例如，遺傳修飾的植物可通過在植物中表達本發明的分離的多核苷酸來產生。本文使用的術語"植物"指其中在商業上需要增加角質層水透過性的作物(全株或其部分，例如果實、種子)，例如單子葉或雙子葉作物，以及其它球果植物、蘚類或藻類植物。優選地，本發明的植物產生脫水具有商業價值的果實。這種植物的實例包括但不限於番茄、葡萄、胡椒、蘋果、桃、杏、棗、無花果、茄子、洋蔥、草莓、葫蘆、乾草植物、祠料植物、香料植物、草本植物等。為在植物細胞中表達外源多核苷酸，本發明的多核苷酸序列優選連接入適於植物細胞表達的核酸構建物中。這種核酸構建物包含順式作用調節區，例如以組成型方式或誘導型方式引導細胞中的多核苷酸序列轉錄的啟動子序列。所述啟動子對於轉化的植物/細胞可為同源的或異源的。種子^異性啟動子。、、乙、'一、^、例如，CW/7基因(或其功能片段)的新啟動子序列優選可用於本發明的核酸構建物(SEQIDNO:58)。果實特異性啟動子的其它實例描述於美國專利笫4,943,674號。定氣生暴露器官(例如葉、塊莖、種子、莖、花)或特定細胞類型(例如薄壁組織、表皮、毛狀體或維管細胞)中表達的啟動子。在種子中增強表達的優選啟動子包括phas啟動子(Geest等，PlantMol.Biol.32:579-588(1996))、GluB-l啟動子(Takaiwa等，PlantMol.Biol.30:1207-1221(1996))、，玉米醇溶蛋白啟動子(Torrent等，PlantMol.Biol.34:139-149(1997))以及油體蛋白啟動子(Sarmiento等，ThePlantJournal11:783-796(1997》。介導組成型、誘導型、組織特異性或發育期特異性表達的啟動子序列7>開於WO2004/081173。核酸構建物可為例如質粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。優選地，本發明的核酸構建物是質粒載體，更優選為雙元載體。表述"雙元載體"指攜帶Ti質粒的修飾T區的表達栽體，其在大腸桿菌和農桿菌細胞這二者中均能複製，通常在兩個邊界區之間包含植物轉化的報告基因。適於本發明的雙元栽體包括pBI2U3、pBI121、pGA482、pGAH、pBIG、pBI101(Clonetech)、pPI和pBINPLUS(參見以下的實施例章節的實施例5)或其修飾形式。本發明的核酸構建物可用於轉化宿主細胞(例如細菌、植物)或植物。本文使用的術語"轉基因的"或"轉化的"可交互使用，指克隆的遺傳物質已轉移入其中的細胞或植物。在穩定轉化中，本發明的核酸分子整合入植物基因組中，因而其代表穩定的和遺傳的性狀。在瞬時轉化中，核酸分子由被轉化但未整合入基因組中的細胞表達，因而代表暫時性狀。有多種將外源基因導入單子葉植物和雙子葉植物這二者中的方法(Potrykus,I.(1991).AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiolA205-225;Shimamoto,K.等(1989).Fertiletransgenicriceplantsregeneratedfromtransformedprotoplasts.Nature(1989)274-276)。外源DNA穩定整合入植物基因組DNA中的主要方法包括兩個主要途徑(i)^t^f霧介導W差^脊移。參見Klee,H.J.等，(1987).AnnuRevPlantPhysiol3S，467-486;Klee,H.J,和Rogers，S.G.(1989).CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,笫6巻，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes，2-25頁，J.Schell和L.K.Vasil編輯，AcademicPublishers,SanDiego,CaL;和Gatenby,A.A.(1989).RegulationandExpressionofPlantGenesinMicroorganisms,93-112頁，PlantBiotechnology,S.Rung和C.J.Arntzen編豐辱，ButterworthPublishers,Boston,Mass。(ii)苴凝D7、M焱取。參見例如Paszkowski,J.等，(1989).CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,第6巻，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes,52-68頁，J.Schell和L.K.Vasil編輯，AcademicPublishers,SanDiego,CaL;和Toriyama，K.等，(1988).Bio/Technol6,1(H2-1074(將DNA直接攝取入原生質體中的方法)。另參見Zhang等，(1988).PlantCellRep7,379-384;和Fro匪,M.E.等,(1986).Stabletransformationofmaizeaftergenetransferbyelectroporation.Nature379,791^93(通過短暫電擊植物細胞誘導的DNA攝取)。另參見Klein等，(1988).Bio/Technology6,559-563;McCabe,D.E.等,(1988).Stabletransformationofsoybean(Glycinemax)byparticleacceleration.Bio/Technology6，923-926;和Sanford,J.C.(1990).Biolisticplanttransformation.PhysiolPlant7P，206-209(通過粒子轟擊將DNA注射入植物細胞或組織中)。另參見Neuhaus，J.M.等，(1987).TheorApplGenet75,30-36;以及Neuhaus,J.M.和Spangenberg,G.C.(1990).PhysiolPlant79，213-217(使用#:量移液管系統)。參見美國專利笫5,464,765號(細胞培養物、胚或愈傷組織的玻璃纖維或碳化矽晶須轉化)。另參見DeWet,J.M.J.等，(1985)."Exogenousgenetransferinmaize(Zeamays)usingDNA國treatedpollen,"ExperimentalManipulationofOvuleTissue，G.P.Chapman等編輯，Longman,NewYork-London,197-209頁；和Ohta,Y.(1986).High-EfficiencyGeneticTransformationofMaizebyaMixtureofPollenandExogenousDNA.ProcNatlAcadSciUSA715-719(DNA與萌發花粉直接溫育)。農桿菌介導的系統包括使用含限定DNA節段的質粒載體，所述DNA節段整合入植物基因組DNA中。嫁接植物組織的方法隨植物物種和農桿菌傳遞系統而變。廣泛4吏用的方法是葉盤法，該方法可用提供啟動全林分化的良好來源的任何組織外植體實施(Horsch,R.B.等，(1988)."Leafdisctransformation."PlantMolecularBiologyManual1-9,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht)。4卜充方法4吏用農才幹菌傳遞系統和真空浸潤的組合。農桿菌系統對建立轉基因雙子葉植物尤其有用。有多種將DNA直接轉移入植物細胞中的方法。在電穿孔中，原生質體短暫暴露於強電場，打開小孔以允許DNA進入。在孩i注射中，使用微量移液器將DNA機械地注射入細胞中。在孩^立轟擊中，DNA吸附在微粒如硫酸鎂晶體或鵠顆粒上，微粒被物理加速進入細胞或植物組織中。在穩定轉化後，發生植物繁殖。最常見的植物繁殖法是播種。但是，播種繁殖再生的缺點是由於雜合性而使作物缺乏一致性，因為植物按照孟德爾法則支配的遺傳變異產生種子。換句話說，每個種子在遺傳上都是不同的，每個種子都將以其自身的特定性狀生長。因此，優選要實現的再生使再生植物具有相同性狀，並具有親本轉基因植物的特徵。再生轉化植物的優選方法是微繁殖，其提供快速一致的轉化植物再生。孩t繁殖是一種由選定親本植物或栽培品種切離的單個組織樣品培養第二代植物的方法。該方法允許大量再生具有優選組織並表達融合蛋白的植物。新生植物在遺傳上與原植物相同，並具有其全部特徵。孩t繁殖允許在短時間段內大量生產優質植物體，並提供選定栽培品種的快速繁殖，其保留了原轉基因或轉化植物的特徵。該植物克隆法的優勢包括植物繁殖速度以及所產生植物的質量和一致性。微繁殖是一個多階段方法，需要改變各階段間的培養基或培養條件。微繁殖法包括4個基本階段第1階段，初始組織培養；笫2階段，組織培養物繁殖；第3階段，分化和植物形成；和笫4階段，溫室培養和鍛鍊。在笫1階段中，建立組織培養物並證明其無汙染物。在第2階段中，繁殖初始組織培養物，直至產生足夠數量的組織樣品，以滿足生產目標。在笫3階段中，新培養的組織樣品分裂，生長成單抹幼苗。在笫4階段，轉化的幼苗轉移至溫室進行鍛鍊，在溫室中逐漸增加植物對光的耐受，以使它們可在天然環境中繼續生長。瞬時轉化可通過上述的任何直接DNA轉移法或通過使用修飾植物病毒的病毒感染來實現。已表明對植物宿主轉化有用的病毒包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、菸草花葉病毒(TMV)和杆狀病毒(BV)。使用植物病毒轉化植物描述於例如美國專利第4,855,237號(菜豆金黃花葉病毒，BGMV);EPA67,553(TMV);日本特許申請號63-14693(TMV);EPA194,809(BV);EPA278,667(BV);和Gluzman,Y.等，(1988),CommunicationsinMolecularBiology:ViralVectors,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,172-189頁。4艮病毒顆粒在許多宿主(包括植物)中表達外源DNA的用途描述於WO87/06261。用於在植物中導入和表達非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的構建闡述於以上參考文獻以及Dawson,W.0.等(1989)Atobaccomosaicvirus-hybridexpressesandlosesanaddedgene.Virology772,285-292;French,R.等(l986)Science23/,1294-1297;和Takamatsu,N.等(1990).ProductionofenkephalinintobaccoprotoplastsusingtobaccomosaicvirusRNAvector.FEBSLett房，73-76。如果轉化病毒是DNA病毒，本領域技術人員可針對病毒自身做出合適修飾。或者，所述病毒首先可克隆入細菌質粒中，以方便構建具有外源DNA的目標病毒載體。然後可由質粒中切出病毒。如果所述病毒是DNA病毒，則可將細菌複製起點連接至病毒DNA，然後通過細菌複製病毒DNA。DNA的轉錄和翻譯將產生外殼蛋白，其將殼體化病毒DNA。如果所述病毒是RNA病毒，則一般將病毒克隆為cDNA，並插入質粒中。然後使用所述質粒製備所有植物遺傳構建物。然後由質粒的病毒序列轉錄RNA病毒，接著翻譯病毒基因，以生產殼體化病毒RNA的外殼蛋白。在以上參考文獻以及美國專利第5,316,931號中論述了用於在植物中導入和表達非病毒外源核酸序列(例如包含在本發明構建物中的序列)的植物RNA病毒的構建。在一個實施方案中，提供用於插入的植物病毒核酸，其包含病毒核酸天然外殼蛋白編碼序列的缺失、非天然(外源)植物病毒外殼蛋白編碼序列以及非天然啟動子，優選非天然外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，並能夠在植物宿主中表達，包裝重組植物病毒核酸，並確保重組植物病毒核酸系統感染宿主。或者，天然外殼蛋白編碼序列可通過在其中插入非天然核酸序列而變成不可轉錄的，以產生非天然蛋白。重組植物病毒核酸構建物可包含一個或多個另外的非天然亞基因組啟動子。每個非天然亞基因組啟動子均能夠在植物宿主中轉錄或表達鄰近基因或核酸序列，且不能彼此重組和與天然亞基因組啟動子重組。另外，重組植物病毒核酸構建物可包含一個或多個順式作用調節元件，例如增強子，其結合反式作用調節子，並調節位於其下遊的編碼序列的轉錄。非天然核酸序列可鄰近天然植物病毒亞基因組啟動子插入，或者如果包含一個以上的核酸序列，則可鄰近多個天然和非天然植物病毒亞基因組啟動子插入。非天然核酸序列在宿主植物中於亞基因組控制下轉錄或表達，以生產目標產物。在第二個實施方案中，如在笫一個實施方案中一樣提供重組植物病毒核酸構建物，例外之處是將天然外殼蛋白編碼序列置於其中一個非天然外殼蛋白亞基因組啟動子附近，而不是在非天然外殼蛋白編碼序列附近。在笫三個實施方案中，提供重組植物病毒核酸構建物，其包含處於其亞基因組啟動子附近的天然外殼蛋白基因，一個或多個非天然亞基因組啟動子插入到病毒核酸構建物中。插入的非天然亞基因組啟動子能夠在植物宿主中轉錄或表達鄰近基因，且不能彼此重組和與天然亞基因組啟動子重組。非天然核酸序列可插入到非天然亞基因組植物病毒啟動子附近，使得所述序列在宿主植物中於亞基因組控制下轉錄或表達，以生產目標產物。在笫四個實施方案中，如在笫三個實施方案中一樣提供重組植物病毒核酸構建物，例外之處是天然外殼蛋白編碼序列被非天然外殼蛋白編碼序列取代。病毒栽體被表達的外殼蛋白殼體化，以產生重組植物病毒，所述外殼蛋白由如上文所述的重組植物病毒核酸構建物編碼。重組植物病毒核酸構建物或重組植物病毒用於感染合適的宿主植物。重組植物病毒核酸構建物能夠在宿主中複製、在宿主中系統擴散以及在宿主中轉錄或表達一個或多個外源基因(分離的核酸)，以生產目標蛋白。除了上述以外，本發明的核酸分子還可導入到葉綠體基因組中，由此能進行葉綠體表達。將外源核酸序列導入葉綠體基因組中的技術是已知的。該技術包括以下步驟。首先，化學處理植物細胞，以便將每個細胞的葉綠體數降至約1。然後，優選通過粒子轟擊將外源核酸導入細胞中，目標是將至少一個外源核酸分子導入葉綠體中。由本領域一般技術人員選擇能通過同源重組整合入葉綠體基因組中的外源核酸，同源重組可容易地通過葉綠體固有的酶實現。為此，所述外源核酸除了包含目標基因以外還包含至少一個來源於葉綠體基因組的核酸序列。另外，外源核酸包含選擇標記，其通過順序選擇方法用於使操作者源核酸。關於此技術的進一步細節可見於美國專利笫4,945，050號和5,693,507號，其通過引用結合到本文中。因此，多肽可通過葉綠體蛋白表達系統生產，並整合入葉綠體內膜中。本領域已知許多使作物和雜草間的基因流動最小的方法。以下是此類方法的非限制性描述[另參見美國專利申請第20040098760、20040172678號以及Daniell(2002)Nat.Biotech.20:581]。其它方法包括雄性和/或種子不育性(其阻止遠交、自生種子傳播)、閉花受精(其中授粉在開花前發生，由此防止遠交)和無配生殖(種子來自植物源且不來自有性雜交，其控制遠交和自生種子傳播。參見美國專利第6,825,397號)。母沐遽傳胞質器的母體遺傳為植物(葉綠體)和動物(線粒體)系統所共有。已提出了幾種解釋來說明此現象。它通過在個體中佔過多比例的自私胞質因子促使群侵入、另外，胞質因子的母體遺傳是防止與雄性相關的疾病或病原體有性傳播的進化機制；只有細胞核(不是胞質)在受精過程中被允許進入胚珠中[GresselJ.Mo/ecw/a屍萬/o/ogyZ"『eedCo"fro/(TaylorandFrancis,London,2002)]。它還可能是在受精後發生在植物中的雄性核基因一般抑制的延伸[AvniMo/.G飢225,273-277(簡)]。在涉及遺傳#^飾作物中間或遺傳#~飾作物和雜草之間的遠交可能性的情況下，高度需要使用葉綠體遺傳工程來促進轉基因的母體遺傳。存在於大部分被子植物中的質體遺傳的普遍模式是單親母體的，葉綠體基因組在大部分作物中是母體遺傳的。育過程中獲得，然後精細胞與雌配子在受精過程中融合。生殖細胞是花粉形成過程中不等分裂的結果，不接受任何葉綠體[Hagemann屍rato//a^wa152,57-64(1989)]。流動已在幾個植物物種中成功地被證明，包括菸草和番茄[DanielliV飢5z'o^c/2"o/16,345-348;RufJV飢Aofec/mo/.19，870-875(2001)]。儘管已轉化了幾種其它植物物種(包括馬鈴薯)的葉綠體基因組，但在這些研究中還沒有證實母體遺傳。但是，30多種轉基因已穩定地整合入葉綠體基因組中，賦予目標植物性狀，或者將轉基因葉綠體用作生物工廠，以產生功能性生物藥物或可食用疫苗或生物聚合物[Daniell7Ve"血屍/朋fScZ7,84-91(2001);DaniellCwrr.說ofec/mo/.13，136-141]。同許多其它防範策略不同，母體遺傳方法已在許多領域得到檢驗。Scott和Wilkinson[Nat.Biotechnol.17,390-392(1999)]研究了由兩個野生群收集的天然雜合體中的質體遺傳，這兩個野生群沿著34公裡的英國泰晤士河緊鄰油茱生長，評價3年當中18個野生油茱群的持久性。他們分析了幾種會影響葉綠體基因由作物向野生親緣植物移動的可變因素，包括質體遺傳模式和同域性(物種在相同區域一起出現)發生率，以量化形成混合群的機會和作物在基因滲入的農業限制之外的持久性。儘管作物和雜草物種間的同域性約為0.6-0.7%，但混交成分在3年中顯示出植物數量快速下降、種子返回並最終消失的強烈趨勢。因此，Scott和Wilkinson得出結論如果經由葉綠體基因組對植物進行遺傳工程，則基因流動應是罕見的。因此，葉綠體基因組的母體遺傳對於基因防範是一個有前景的選項。儘管質體轉化在幾種主要作物物種中仍待實現，但現已表明葉綠體遺傳工程賦予對除草劑[DaniellNat.Biotechnol.16,345-348(1998)]，昆蟲、疾病[DeGrayPlantPhysiol.127,852-862(2001)]和乾旱的抗性，以及產生抗體[DaniellTrendsPlantSci.7,84-91(2001)]、生物藥品[DaniellTrendsPlantSci.7，84-91(2001)]和可食用疫苗。近期歐洲環境署(Copenhagen,Denmark)的報告推薦葉綠體遺傳工程作為基因防範方法[EasthamGeneticallyModifiedOrganisms(GMOs):TheSignificanceofGeneFlowThroughPollenTransfer.EnvironmentalIssueReport28(EuropeanEnvironmentalAgency,Copenhagen,Denmark,2002)]。基因組不相容性－許多栽培作物具有多個基因組。這些作物基因組中僅有一個適於與雜草種間雜交。例如，小麥的D基因組與美國一種難控制雜草柱穗山羊草(Aegilopscylindrica)的D基因組相容；相反，只要具有AABB四倍體B基因組[Gressel.MolecularBiologyinWeedControl(TaylorandFrancis,London,2002)]的硬質小麥的多倍體水平沒問題，實現雜草與硬質小麥之間的種間雜交就會難得多。同樣，有可能由芥菜型油菜(Brassicajuncea)(印度芥茱或棕芥菜)的B基因組向許多野生種的油菜(萬ra孤'ca)雜草進行基因轉移；但是，迄今為止大部分遺傳工程對甘藍型油菜(Smywca""/M)實施，甘藍型油茱具有AACC四倍體基因組，因此不可能相容。轉基因性狀擴散入雜草中的風險可通過僅釋放具有不相容基因組的轉基因系而急劇下降。由於基因組信息的可用性，使得有可能通過不相容性機制工程改造出與雜草遠交的可能性降低的作物。^>7^^逸4^^^絲#斧/-化學誘導啟動子可用於基因防範策略。例如，可在除草劑噴灑大田前用化學物質誘導賦予除草劑抗性的基因瞬時表達。顯然，通過將外源基因表達限制在作物未開花的時間有可能進行遺傳隔離。這種啟動子目前是可獲得的(參見參考文獻WO97/06269)。僅在作物未處於開花期時啟動外源基因的備選方法應是在開花前物理去除基因。Keenan和Stemmer[M^.5Zofec/mo/.20,215-216(2002)]提出，這可通過化學誘導型或果實特異性啟動子來實現，以活化會在開花前切除外源基因的位點特異性重組酶如Cre的表達。這種系統可誘導Cre表達，導致位於種子(使用種子特異性啟動子)或完整植株(使用化學誘導型啟動子)中兩個/ox位點側翼的基因的去除。"^差厲凝和-另一種包含基因擴散的方法應是使雜草適合度失效，所述雜草通過基因滲入由作物基因獲得了積極的生存性狀[Gressel7>e"&說Wec/j"o/.17,361-366(1999)]。該方法稱為轉基因緩和(TM)，基於以下前提(l)串聯構建物起緊密連鎖基因的作用，其彼此的分離是極為罕見的；(2)TM性狀對作物是中性的或積極的，但對雜草有害；和(3)即便溫和有害的TM性狀也由雜草群中去除，因為這種植物在其自身之間強烈竟爭，具有大的種子產量。可由TM控制的過程的實例包括種子休眠、種子成熟和脫粒以及生長。雜草種子通常表現出二次休眠，一次收穫的種子在整個下一季和以後年份萌發，由此在降低同胞竟爭的同時最大化適合度(和防止所有雜草遭受單一處理的控制)。二次休眠的廢除對作物是中性的，但對雜草有害。Steber等已鑑別出一種擬南芥04ra&^/w/j)突變體，其對脫落酸不敏感，完全沒有二次休眠。這種與休眠相關的基因(工程過的或突變的)可用於TM[Ge"油cj149,509-521(1998)]。雜草植物的另一個特徵是其在一段時間內散播其種子，其成熟種子的大部分落粒至地面，確保連續性。結果，均一的成熟和抗落粒基因對雜草有害，但對作物是中性的，作物的種子均一成熟，不容易落粒；實際上，抗落粒基因對油菜甚至有利，油菜也具有落粒和自生雜草問題。只有無雜草的"有資格"種子才撒種，由此消除轉基因雜草種子。一般認為，改變種子離層帶的激素平衡影響落粒傾向。細胞因子過量生產可延遲落粒。近來已由擬南芥04ra6Wo戸Z力分離出57i47T^/^(9(9F基因，該基因通過延遲長角果上的瓣開裂防止種子落粒。這可能是用於密切相關的油菜的理想策略。矮化由於產生水稻和小麥的"綠色革命"變化和為印度和中國帶來糧食自足而特別有價值。但是，矮化性狀對雜草是不利的，因為它們不能再與作物竟爭光。通過防止赤黴素33的生物合成有可能得到遺傳工程過的高度降低。另外，已分離出缺陷型赤黴酸報告基因，其通過與天然受體竟爭賦予赤黴素不穩定性，由此"^秀導矮化。啟動子序列信息(例如SEQIDNO:58)使得可通過修飾栽培植物的啟動子序列產生本發明多肽表達增加的植物。因此，例如，"敲入"技術或誘變(例如化學或輻射)可用於直接或間接產生本發明多肽的表達^皮上調的植物。要認識到的是，通過將本發明的cwpl基因定位到野生番茄的番茄染色體4,並精確作圖至小於由端粒標記TG464延伸至著絲粒標記CT173的染色體片斷的基因滲入，有可能使用經典育種技術產生角質層水透過性增加的栽培番茄植物。例如，普通番茄植物可與野生番茄植物雜交。然後，令普通番茄植物的果實成熟，並收集雜合(F1)種子。然後，種植收集的Fl種子，Fl植林生長並令其自花受粉。自交可持續至少另一個代，或者Fl植林可與普通番茄親本植林雜交。使自交或回交代的果實在過了正式成熟點後仍保留在藤上，這由果實顏色的變化確定，並根據以下情況篩選(i)存在天然脫水；和(ii)上述基因滲入。例如，通過使用以下標記CT199、TG163、CT61並在覆蓋CT61和TG464的區域內，可將含野生種等位基因的最小基因滲入限於10cM以下、5cM以下、2cM以下和lcM以下。例如，可用於產生仍能增加角質層水透過性的最小基因滲入的標記包括源於圖3a所示的BAC末端的任何序列。因此，本發明還提供一種栽培番茄植物，其具有的基因組含來源於野生番茄的基因滲入，所述基因滲入含所述番茄的染色體4的一部分，小於由端粒標記TG464延伸至著絲粒標記CT173的染色體片斷，所述基因滲入能夠增加栽培番茄植物的角質層水透過性。一旦產生了本發明的栽培的和遺傳修飾的植物(如上所述)，就可如下產生脫水果實。讓果實在過了正常成熟點之後仍保留在藤上。以果皮具皺為證的脫水外觀表明果實中的水含量減少。一旦獲得脫水果實就可收集它們。或者，由藤收集果實，隨後令其脫水(例如在背景章節詳述的曬千)。因此，本發明提供在表達其的植物中控制角質層水透過性的多'核苷酸和多肽，以及使用這些多核苷酸和多肽生產有商業價值作物的脫水果實的方法。本文使用的術語"約，，指±10%。在檢驗以下的實施例時，本發明的其它目標、優勢和新特徵對本領域一般技術人員變得顯而易見，這些實施例無限制意圖。另夕卜，如上文所描繪的和下文權利要求書章節要求保護的本發明的各種實施方案和方面各自都在以下實施例中得到實驗支持。實施例現在論述以下實施例，其與上文描述一起以非限制性方式闡述本發明。一般來說，本文使用的術語和本發明中使用的實驗室方法包括分子、生物化學、孩i:生物學和重組DNA技術。這種技術在文獻中被詳盡闡明。參見例i口"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"I-III巻Ausubel,R.M.編輯，(1994);Ausubd等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"RecombinantDNA"，ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(編輯)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",1-4巻，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);如美國專利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057號所述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"I-III巻Cellis,J.E.編輯，(1994);"CurrentProtocolsinImmunology"I-III巻ColiganJ.E.編輯，(1994);Stites等(編輯)，"BasicandClinicalImmunology"(笫8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(編輯)，"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.Freeman和Co.,NewYork(1980);可用的免疫測定詳盡描述於專利和科學文獻，參見例如美國專利笫3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521號；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.編輯，(1984);"NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.,和HigginsS.J.編豐耳，(1985);"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.,和HigginsS.J.編輯，(1984);"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.編輯，(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"1-317巻，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego，CA(1990);Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);所有這些文獻都通過引用結合到本文中，如同其在本文完整陳述一樣。其它一般參考文獻貫穿本文件提供。其中的方法一般被認為是本領域周知的，提供其是為了方便讀者。其中包含的所有信息都通過引用結合到本文中。材料和方法控浙^^^^>趁矛/-如本文概述的先前所述(WO0113708)開發一組近等基因基因滲入系，其來源於回交育種程序，基於普通番茄(E)和野生種多毛番茄(H)的種間特異性雜交，通過果實脫水性狀區分。E育種系1630的植物用野生種H(LA1777)4受粉。雜合體R植物自花授粉，產生F2種子。基於其成熟時的高糖含量選擇3林F2植林。播種I3種子，培養這3林F2選擇株的每個F3植物的10林植林，在過了正規成熟和收穫期後仍讓果實保留在藤上。在F3植物中，一個植林(F3-203-10)顯示出果實脫水跡象的特徵，以果皮起皺為證。開發語系選擇程序，其由自交該F3個體，直至在針對果實脫水率深度選擇後獲得F4代組成。此後，植物與E育種系回交，該雜交的產物對4個另一代自交，產生BC1F4群。該群的脫水個體與E進行另一次回交，產生具備該性狀的雜合植物。由這些F!個體構建兩個F2群(2394和2395)。最初，選擇步驟基於果實脫水和果實角質層上微裂隙的表型。在開發出與所述性狀連鎖的分子標記之後，按照基因型進行選擇。酶切擴增多態性(CAPS)標記用作分子標記。使用由內切核酸酶切割的特異性PCR產物開發CAPS(參見下文進一步描述的"DNA分析，，)。如前所述(Miron和Schaffer,1991),植物在溫室中按照標準方法在15-1盆中生長。如下測定果實平均重量和脫水率由每抹植抹採摘和稱重5個熟紅果實，將它們置於室溫(約25。C)的淨重平臺(net-table)上，每2-3天對其稱重。通過放大鏡(2X)或雙目顯孩i鏡(10X)驗證果實角質層上微裂隙(MF)的存在情況。DA^4》浙-按照Fulton等(1995)提取基因組DNA。如下由選自高密度番茄圖i普(Tanksley等，1992)的RFLP標記開發CAPS(酶切擴增多態性)標記。含代表選定RPLP標記的番茄DNA插入片段的BlueScript質灃立載體(Stratagene)由WeizmannInstituteofScience,Rehovot,Israel的TomatoGenomeCenter惠、贈。在HebrewUniversity,Jerusalem,Israel的DNAAnalysisUnit使用T7和SP6引物(分別為SEQIDNO:1和2)對基因組DNA插入節段部分測序。按照這些序列分析結果,4吏用1.0版的PrimerExpressProgram(PerkinElmerBiosystems)設計序列特異性PCR引物。設計出總共約20個標記，檢驗這些標記，以確定普通番茄和多毛番茄親本基因型之間以及多毛番茄來源性狀不同的番茄系之間存在的多態性。以下是兩個標記TG163和TG587的PCR引物，代表染色體4上的位置。TG163F:5'-TGCAATCCCGAACATGAAGAC-3'(SEQIDNO:3)TG163R:5'國CCTTCTGGTCGCATCTGTGTCT-3'(SEQIDNO:4)TG587F:5'-TCAGGGTGAGGGGTAATAATTGAG-3'(SEQIDNO:5)TG587F:5'-GCTTAAAACTCAAGTCTCCTCGCA-3'(SEQIDNO:6)在自動化熱循環4義(MastercycleGradient,Eppendorf,Germany)中使用熱穩定性TaqDNA聚合酶(SuperNovaTaqPolymerase,JMRProducts,Kent,UK)進行擴增反應。在含10x反應《爰衝液、0.125mM的各脫氧核苷酸、0.5p的各引物、2.5單位Taq聚合酶和50-100ng番茄基因組DNA的25^終體積中進行反應。所述條件對各組引物的退火溫度和產物片段大小優化。為鑑別應在普通番茄和多毛番茄等位基因之間產生多態性的限制性內切核酸酶，在含3.5piPCR產物、1|J10x濃縮限制性酶緩衝液和l-3單位的適宜限制性內切核酸酶的10iul終體積中進行反應。消化產物在1%凝膠上分析。發現Z)ra/和歷"F7分別對TG163和TG587適合,將其用於分離群。對其它CAPS標記的設計應用類似方法。在該工作中使用的所有BACS(細菌人工染色體)都由ClemsonUniversityGenomicInstitute(Clemson,NorthCarolina,USA)4吏用TomatoHeinz1706BACLibraryFilters(LE—HBa)提供。如下所述通過放射性探針篩選TomatoBAC文庫過濾器的特異性BAC克隆，所述放射性探針使用NEBlot頂試劑盒(NewEnglandBioLabsinc.#N1500S)並按照供應商的說明標記。使用磷成像裝置(FLA-5000;FujiFilm)檢測濾器上的標記BAC菌落。使用QIAGENMaxiPlasmidPurificationKit(W2263)由匹配的大腸桿菌菌林純化BAC質粒。對於"染色體步查"法，使用SP6和T7引物測序BAC末端，並按照BAC末端序列開發PCR產物。新純化的PCR產物進行放射性標記，並用於另一輪的番茄濾器菌落檢測。將LE—HBa37B8BAC克隆(ClemsonUniversityGenomicInstitute,Clemson,NorthCarolinaUSA)亞克隆入BlueScriptIIks+載體(Stratagene)中並測序。如上所述通過開發引物並通過PCR克隆以及測序相關部分來完整測序15kb部分。使用NCBI核酸和翻譯蛋白資料庫通過使用BLAST軟體(Altschul等，1990)分析DNA序列。iA^々定f/r_PCft為V伊-為製備cDNA，如前所述(Miron等，2002)提取總RNA。總RNA用作首鏈cDNA合成的模板，首鏈cDNA的合成採用Super-scriptII擴增前系統逆轉錄酶試劑盒(GibcoBRL，LifeTechnologies,UK)於42'C按照供應商的說明進行。屍C/#/炎-用1.0版的PrimerExpressProgram(PerkinElmerBiosystems)，基於得自3個ORF的BAC測序的序列，設計具有用於在線定量PCR的短擴增子的特異性引物，所述3個ORF為l)ZINC基因，正向，5'-AATAATGCGAATCGAATCACTA-3'(SEQIDNO:7),和反向，5'-AAGGCTAAATCTCCTCCTTTCT-3'[SEQIDNO:8,擴增子140bp(SEQIDNO:9)〗，2)DBP基因，正向，5'-TGGATAAGCGGACGACTCTATTG隱3'(SEQIDNO:10),和反向，5言-CTGTTGTTTGGGAAGTGGCTTCT-3'[SEQIDNO:11,擴增子116bp(SEQIDNO:12)],3)PUT基因，正向，5'-CTCTCCTTGGCCCAAGGCTCAA-3'(SEQIDNO:13),和反向，5'-CAGCTTTAGTGGTATCTCTCATCA-3'[SEQIDNO:14,擴增子205bp(SEQIDNO:15)]。肌動蛋白用作參比基因，使用基於Genebank登錄號BF096262的以下引物正向，5'-CACCATTGGGTCTGAGCGAT-3'(SEQIDNO:16)，和反向，5'-GGGCGACAACCTTGATCTTC-3'[SEQIDNO:17,擴增子251bp(SEQIDNO:18)〗。cDNA用作定量PCR擴增的模板，PCR擴增在GeneAmp5700序列衝企測系統(PEBiosystems)上使用含AmpliTaqGold的SYBRGreenMasterMix按照生產商(PEBiosystems)的說明進行。熱循環儀的程序設定為所有反應40個循環，第一步為95。C、30秒變性，退火溫度62。C、15秒，以及延伸溫度72°C、30秒。數據採集於77°C、30秒進行。PCR產物的初步離散分析表明，在77。C以上保留的產物是特異性PCR產物。除了用於標準化的肌動蛋白引物以外，還用每組引物獲得含對數增加的已知cDNA水平的標準曲線。所有實時PCR產物都在2%瓊脂糖凝膠上檢驗，並送去測序以證明身份。全長差厲的^磬-使用以下引物Put正向，5'-GTAGTACTATATAAACCATGTGAG-3'(SEQIDNO:19)，和反向5'國CATATGTTGACATATCTAATG-3'(SEQIDNO:20)，由從HH系果實(開花後10天)中提取的cDNA擴增推定蛋白基因(/7M0的全長序列。使用T-A克隆法將全長基因[(SEQIDNO:20),930bp)克隆至pGEM-TEasyVector(promega),然後使用￡coW(NEB弁R0101)內切核酸酶亞克隆入BlueScriptIIks+栽體(Stratagene)。再使用J^o/(NEB扭R0146)和力a/(NEB#R0145)內切核酸酶將pwf基因(SEQIDNO:21)亞克隆在pBINPLUS雙元載體(Ghosh等，2002)的花椰菜35S啟動子和n-終止子位點之間。^^差厲椬浙-將含處於35S啟動子控制下的put基因的構建栽體轉化入大腸桿菌(菌抹DH5a,Stmtagene)中，然後使用Walkerpeach和Velten(1994)描述的方法再轉化入EHA105農桿菌電感受態細胞中。使用Mini-Prep試劑盒(Qiagen#12143)製備質粒，並再轉化入pBINPLUS中用於測序，以確保沒有缺失和其它克隆錯誤。使用如Meissner等(1997)描述的MicroTom栽培品種和如Barg等(1997)描迷的MP1栽培品種進行番茄轉化實驗。將轉基因插枝種植在補加1mgL'1玉米素(Duchefa#Z0917)、100mgL"卡那黴素和100mgL-1Chlaforan的Murashige和Skoog基石出培養基(Duchefa,Haarlem,TheNetherlands)上。執行培養轉化植林的標準操作規程。實施例1脫水性狀的遺傳分析基於標準小果栽培品種(1815系)和表現出脫水性狀的遠代基因滲入系(1881系)的雜交，在兩個獨立分離Fs群(2394系和2395系)中測定果皮上微裂隙(MF)夕卜觀性狀的遺傳。分離群中微裂隙外觀的分布模式符合3:1的微裂隙:標準角質層比率，2394和2395群的卡方概率值分別為0.546和0.864(以下表1)。表1分離群2394和2395中微裂隙和脫水錶型的分離模式tableseeoriginaldocumentpage36N-非脫水；Y-脫水；數量-群體中個體的數量該分布模式特徵為具有顯性/隱性等位基因關聯的單個基因遺傳。在2394群中果實脫水性狀(CWP)按照3:1比率分離，而在2395群中按照1:2:1比率分離，所述群約一半脫水，但以中間速度脫水。由此得出結論等位基因關聯是完全顯性或者是半顯性的，這取決於該群的遺傳背景(圖la-b)。由上述可得出結論果實CWP性狀作為單一基因性狀被遺傳，其在本文被稱為CV;,。CH^差厲矽;^勿斧激基於高密度番茄RFLP圖譜(Tanksley等，1"2)設計一組CAPS(酶切擴增多態性)標記。研究代表各種基因組位置的基因座，包括與網狀表皮的QTL連鎖的標記(Fulton等，2000,分別位於染色體4、6、8、12的標記TG464、TG477、CT68和TG68)，用於分析與樣t裂隙性狀的連鎖。將基於各個多態性PCR的分子標記應用於兩個親本和一組48個按所述性狀分離的F2個體。基於初始標記組將Op基因作圖到染色體4的端粒部分，以約3cM的估測距離與CT199標記連鎖(在96個配子中有2個重組事件，圖2a)。為更精細作圖染色體4端粒部分，設計另一組CAPS標記作為定位於整個該染色體節段中的標記簇。多毛番茄親本的染色體基因滲入節段位於CT163和TG464標記之間(圖2b)。該基因滲入在近等基因系中代表多毛番茄節段，該近等基因系在該分析中用作脫水供體親本。為進一步縮窄基因滲入大小，用位於CT199和TG464標記之間的基於PCR的引物研究較大的F2群(超過200個個體)。將緊密連鎖的分子標記簇(<1.5cM)定義為側接O;基因(圖2c)，基於該研究，Op基因位於TG464和CT61之間(0.5cM)。-順5該小基因滲入的定位使得可定位克隆CVp。為此，採用標記TG464和CT61，對來源於近等基因系的雜合子個體的另3500個分離子代(7000個配子)進行CAPS標記分析，顯示出12個重組體(0.34cM，相比之下在"笫一輪"精細作圖中相同標記之間為0.5cM)。使用染色體步查技術鑑別和組裝橋接連鎖標記TG464和CT61的一組5個連續BAC。簡單地講，這可通過測序BAC末端並使用BAC末端作為探針鑑別連續BAC來完成。為了相對於基因滲入定位新BAC,並產生較高解析度圖語，開發兩個物種的多態性CAP，檢驗重組體的這些新標記。5個連續BAC產生CT61和TG464CAPS標記之間的橋(圖3a)。對於12株重組植抹中的每一個，生長10抹自交子代，以合適的分離標記為基因型，分析其脫水和微裂隙外觀。在12個初始筌別的重組事件中，3個事件進一步定位於BAC37B8的兩個末端之間(圖3a-由兩條虛線限定的區域)，表明Op位於37B8BAC中。為進一步解析所述重組事件，亞克隆BAC37B8，按順序組裝較小的片段，鑑別Cwp基因位於其中的約15,000bp(15kb)的節段。(圖3b，未提供較低解析度的圖鐠和亞克隆序列重疊群數據)。實施例4候選基因的生物信息學分析將在實施例3中描述的BAC37B8中的15kb節段亞克隆入Bluescript載體(Stratagene)，測序並使用SEQUENCHER軟體包(GeneCodesCorporation)組裝。在通過BLAST程序(BLASTP,NCBI,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)分析後，15kb序列的生物信息學分析揭示了3個候選可讀框(ORP，圖4)。第一個ORF顯示出與擬南芥(^ra6/c/o/w7;y&"//"船)未知功能蛋白(GenBank登錄號NPJ89369.1)的相似性(蛋白同一性-44%,同源性-.61%)。該蛋白具有兩個結構域。第一個結構域是環指結構域(rpsBLAST-NCBIConservedDomainSearch),其是一種結合兩個4爭原子的40-60個殘基的特化型鋅指，可能涉及介導蛋白-蛋白相互作用(Borden,1998)。已在蛋白中鑑別出廣泛的功能，例如病毒複製、信號轉導和發育。其具有兩個變體C3HC4型和C3H2C3型(RING-H2型鋅指)，它們具有不同的半胱氨酸/組氨酸模式。另一個結構域是DUF23，其是功能未知的結構域。其是由存在於線蟲(Ce/egcm力和果蠅蛋白中的約300個殘基長區域組成的家族的一部分。該區域包含幾個保守半胱氨酸殘基和幾個可起催化殘基作用的帶電胺基酸。該ORF稱為"Zinc"。令人感興趣的是，番茄Zinc與擬南芥同系物的同源性不在"環指"部位，而是僅在DUF23—個部位，Zinc番茄基因沒有"環指"結構域區。第二個ORF顯示出與結合DNA的含溴區結構域的蛋白(擬南芥GenBank登錄號NP—974153.1)的相似性(蛋白同一性-37%,同源性56%)。該基因是與蛋白、DNA和染色質的乙醯化調節相關的DNA結合蛋白家族的一部分，該DNA結合蛋白家族是組蛋白乙醯轉移酶調節的一部分(Dhalluin等，2000)。我們稱該基因為"DBP"(DNA結合蛋白)。第三個ORF與僅被描述為"表達蛋白，，的蛋白(擬南芥At4g38260,GenBank登錄號NP—568038.1)具有相似性(蛋白同一性-48%,同源性-67%)。其包含未知功能的結構域(DUF833)。其是存在於真核生物、原核生物和病毒中的一個家族的一部分，功能未知。已發現一個成員在小鼠的早期胚胎形成過程中被表達(Halford等，1993)。該基因稱為"PUT"(推定的)。這3個候選基因中沒有一個顯示出與參與角質層生物合成機制已知步驟的基因的任何相似性或同源性。娛遂差厲付"》、浙為確定3個候選基因中哪一個與番茄果實角質層發育相關，檢測其Cwp等位基因不同的近等基因系中3個基因每一個的表達水平[多毛番茄脫水等位基因(HH)，和普通番茄不脫水等位基因(EE),圖5a-b]。由以下階段的子房和果實提取mRNA:開花期，開花後5-15天，以及在生綠期、熟綠期和花端著色發育期(圖5a-b)。果實標本取自用於定位克隆法的同一分離群。每個基因的表達都通過RT-PCR檢驗。DBP僅在子房期表達，在兩個基因型(HH和EE)中相等，由此表明該基因的表達與表型性狀無關(圖5b)。Zinc基因的表達在任一個基因型的任何果實期均未觀察到，同樣表明其表達與脫水性狀無關(未顯示)。只有PLT在發育中果實的幼年期表達，而且僅在具有Op的多毛番茄等位基因的脫水基因型(HH)果實中差異性表達(圖5a)。在該研究中觀察到的最高表達是在開花後15天的小果期。為了證實PUT基因的差異表達模式，分析該基因在來源於M82番茄工業栽培品種的其餘群中的表達。一個群是來源於雜合子個體的F2群，所述雜合子個體起源於脫水系(2168系)與M82確定栽培品種的雜交。我們檢查了全部3種分離基因型(HH、HE、EE)在開花後5-15天時期(在笫一個表達分析中具有最高表達水平的時期)的表達。如圖6所示，發現了PUT基因的經典Mendelian表達模式，HH基因型顯示出最高表達水平，雜合子HE個體顯示出約一半的表達水平，EE基因型無表達(圖6中的前3個條)。另夕卜，檢查PUT基因在另一個NIL(近等基因系)群基因滲入系4.4中的表達，基因滲入系4.4來源於普通番茄(M82)和另一個野生種潘那利番茄的種間雜交，包含與本文所述來源於多毛番茄的基因型類似的基因滲入(Eshed和Zamir,1994)。該群代表PUT基因的另一個野生等位基因，IL4.4的果實還顯示出微裂隙和脫水。與多毛番茄來源的群相似，含Cw/的潘那利番茄等位基因的潘那利番茄來源的基因滲入(IL4.4)表明，與M82相比，PUT基因在在幼年小果中表達(圖6,後兩個條柱)。^t這Pf/r差厲^脊差廚殺在扭浙為了表明Put基因的表達與特有的角質層發育性狀有關，開發具有處於35S啟動子控制之下的PUT基因的轉基因番茄植物(使用如所述的pBINPLUS雙元載體)。在轉基因植物中觀察到表型性狀，表明Put的表達與所述性狀相關。為了確定來源於初始轉基因植物自交的個體分離Tl植抹的基因劑量，將各個Tl植抹的5(K70顆種子播種在含100mg/ml卡那黴素的1/2MS培養基中。在發芽後，測定具有正常根的幼苗的百分率。當100%幼苗表現出正常根生長時，Tl植林被認為是轉基因純合子。約75%的T2幼苗具有正常根表明Tl植林是轉基因雜合子。儘管在本文中沒有觀察到其它比率，但其可能表明存在兩個或多個未連鎖的轉基因拷貝。分析兩個獨立Tl分離群的16個Tl個體，以確定其等位基因組成。然後使用這些分類確定PUT基因的等位基因劑量和表型性狀之間的關係。如圖7a-b所示，果實角質層上微裂隙(MF-)的表型性狀已在T。代觀察到。來自20個獨立T。轉基因個體的4抹植抹(MF1-1、MFl-4、MFl-8、MF1-12)表明，果皮上的MF水平可變。另外，這些轉基因植物顯示出高於野生型果實的脫水率(圖7b)。培養兩個分離T,群，並測試其MF的存在情況和脫水率。圖8a-b顯示了H/r轉基因拷貝數對微裂隙嚴重性(l-5之間記分，圖8a)和果實失重百分率(於室溫14天後，圖8b)的作用。如在材料和方法章節中一樣測定屍LT基因拷貝數。圖9a-b顯示了類似於野生型的無拷貝表達的轉基因番茄個體(1\代)和表達兩個拷貝的野生番茄種So/a"wm/wr&oc/w"esS.的POT基因的轉基因番茄個體(Tt代)之間的對比。圖9a-掃描電子顯^:照片，個體微裂隙果實的完整表面。圖9b-無屍LT基因拷貝(O拷貝)個體和具有兩個拷貝的個體之間的脫水率比較。這些結果清楚表明，PUT基因的表達是微裂隙和果實脫水錶型的起因。基於基因序列的系統發生分析表明，cwp是由擬南芥中3個成員代表的基因家族的一部分(圖10a-b)。有另一個番茄同源物(CWP2)顯示與Lecw;l基因30%同源，其實際上在栽培番茄中表達(ESTNo.AW621927)。令人感興趣的是，該同源物作圖至番茄染色體2-1,在番茄染色體2-1中有番茄果實表皮網紋的報告QTL(Frary等，2004)。茄屬栽培胡椒(辣椒(Ca戸zcM加a朋wm))的發育中果實也在其表皮組織中表達與Lecwpl基因高度相似(87%)的cwp同源物，胡椒果實的特徵在於收穫後失水的園藝問題以及紅辣椒栽培品種中果實脫水的需要性狀。因此，CWP基因的同源物還有可能有助於角質層修飾和水透過性。這些結果表明，c，基因的表達產生結構修飾的角質層(差f重f和7KW),推測其在果實膨大過程中由於彈性下降而經歷縫裂。但是，該現象僅在具有高度發育的果實角質層的果實中觀察到，例如無氣孔厚皮栽培番茄，在以較薄角質層為特徵的野生種果實中不明顯。在栽培番茄果實發育過程中角質層組分的沉積在由生綠期向綠熟期的轉變過程中出現突然上升，這是合理的，因為這與微裂隙表型的觀察結果一致。要認識到的是，為清楚起見而在單獨的實施方案背景中描迷的本發明某些特徵也可與單個實施方案組合提供。相反，為筒短起見而在單個實施方案背景中描述的本發明各種特徵也可單獨地或以任何合適的次組合提供。儘管已描述了本發明連同其具體實施方案，但顯然許多備選、修改和變更對本領域技術人員顯而易見。因此，有意包含所有這些屬於所附權利要求書的精神和廣泛範圍的備選、修改和變更。在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請以及GenBank登錄號都通過引用整體結合到本說明書中，其程度如同各個單獨的出版物、專利或專利申請或GenBank登錄號被明確和個別指出通過引用結合到本文中。另外，在本申請中的任何參考文獻的援引或標識都不應被解釋為認可該參考文獻可作為本發明的先有技術使用。參考文獻(本申請中提及的其它參考文獻)AharoniADixitSJetterRThoenesEArkelGPereiraA(2004)TheSHINEcladeofAP2domaintranscriptionfactorsactivateswaxbiosynthesis,alterscuticlepropertiesandconfersdroughttolerancewhenoverexpressedinArabidopsis.PlantCell(inpress).AltschulSFGishWMillerWMyersEWLipmanDJ(1990)B助iclocalalignmentsearchtool.J.Mol.BioL215:403-410.ArtsMGMKeijzarCJSteike邁aWJPereiraA(1996)MolecularcharacterizationoftheCERlgeneofArabodpsisinvolvedinepicuticularwaxbiosynthesisandpollenfertility.PlantCell7:2115-2127.Baker,(1982)In:ThePlantcuticle,Editors:D.RCutler,KL.AlvinandC.E.Price,London,AcademicPress,BakkerJC(1988)Russeting(cuticlecracking)inglasshousetomatoesinrelationtofruitgrowth.J.HorLSci.63(3):459-463,BargRPilowskyMShabtaiSCarniNAlejandroDSzechtmanBDSaltsY(1997)TheTYLCV-tolerancetomatolineMP-1ischaracterizedbysuperiortransformationcompetence.J.Exp.Bot.48(316):1919-1923.BleeESchuberF(1993)Biosynthesisofcutinmonomers:involvementofalipoxygenase/peroxygenasepathway.PlantJ.4:113-123.BordenKL(1998)RINGfingersandB-boxes:zinc-bindingprotein-proteininteractiondomains.Biochem.CellBiol.76(2-3):351-358.ChenXGoodwinSMBoroftVLLiuXJenksMA(2003)CloningandcharacterizationoftheR1^^2geneofJraftzV/opsteinvolvedincuticlemembraneandwaxproduction.PlantCell15:1170-1185.ConsidineJBrownK(1981)Physicalaspectsoffruitgrowth.PlantPhysiol.68:371-376.ConterSDBurnsEELeeperPW(1969)Pericarpanatomyofcrack-resistantandsusceptibletomatofruits.J.Amer.Soc.Hort.Sci.94:136-137.DhalluiaCCarlsonJEZengLHeCAggarwalAKZhouMM(2000)Structureandligandofahistoneacetyltransferasebromodomain.Nature399(6735):491-496.EmmonsCLWScottJW(1997)Environmentalandphysiologicaleffectsoncuticlecrackingintomato.J.Amer.Hort.Sci.122(6):797-801.EhretDLHelmerTHallJW(1993)CuticlecrackingintomatofruitJ.HortScien.68(2)195-201.Eshed，YandZamirD.(1995)nintrogressionlinepopulationofLycopersiconpennelliiinthecultivatedtomatoenablestheidentificationandfinemappingofyieldassodatedQTL.Genetics141:1147-1162.FlebigAMayfieldJAMilkyNLChauSFischerRLPraussD(2000)AlterationsinCER6，ageneidenticaltoCUTl,differentiallyaffectlong-chainlipidcontentonthesurfaceofpollenandstems.PlantCell12:2001-2008.FultonTM，ChunwongseJ，TanksleySD(1995)MicroprepprotocolforextractionofDNAfromtomatoandotherherbaceousplants.PlantMolBiolRep13:207-209.FultonTMGrandilk)SBeck-BunnTFridmanEFramptonAL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